CN1511952A

CN1511952A - 一种重组葡激酶

Info

Publication number: CN1511952A
Application number: CNA021590753A
Authority: CN
Inventors: 杜永峰; 左新文
Original assignee: YONG'AN SHIJI SOFTWARE TECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd BEIJING
Current assignee: YONG'AN SHIJI SOFTWARE TECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd BEIJING
Priority date: 2002-12-31
Filing date: 2002-12-31
Publication date: 2004-07-14

Abstract

本发明涉及一种重组葡激酶(Sak)基因的构建及其表达产物的制备方法，属生物技术领域。本发明所述Sak为N端缺失15个氨基酸残基的Sak衍生物，由121个氨基酸组成。改良后的Sak基因在大肠杆菌中高效表达，表达水平比成熟葡激酶表达量提高10％；比活比成熟葡激酶提高约20％；经分离纯化获得单一组份Sak制品，其表达产物具有分子量小、专一性高、溶栓速度快等特点，适宜工业化生产。可用于急性心肌梗塞和脑栓等血栓性急病的治疗和预防。

Description

一种重组葡激酶

技术领域

本发明涉及一种用于溶解血栓的葡激酶突变株(121)的构建及其表达产物的分离纯化方法，属生物技术领域。

背景技术

葡激酶(Staphylokinase，Sak)是来源于金黄色葡萄球菌分泌的一种蛋白质。1948年Lack C.H首先发现其具有溶解血栓的能力，由于天然Sak分泌水平较低及当时纯化工艺的落后，制约了Sak发展。80年代随着基因工程技术的发展，Sak的核苷酸序列被解析，并确认了它的溶栓机理。Sak象链激酶(SK)一样，首先与纤溶酶原结合形成复合物，去催化纤溶酶原转化为纤溶酶，然后对血纤维蛋白进行水解。Sak优先选择与血栓上的纤溶酶原结合，水解其中的血纤维蛋白，当血浆中不存在血栓时，血纤维蛋白溶酶则被血浆中的α-AP中和，不降低凝血系统中的纤维蛋白原，不易引起全身性溶血。由于Sak具有很强的溶栓专一性，曾先后被国内外多家实验室克隆，如中国专利94112105、95111222、97105988、97103921、98102132、00111627、00111628、99804195和00112673均为成熟的Sak(136个氨基酸组成)。

本发明的目的就是提供一种表达水平和活性均比成熟葡激酶提高的工程菌株；为此，我们通过在N端缺失不同氨基酸的方法，通过PCR扩增，最后获得了在成熟葡激酶N端缺失15个氨基酸残基的表达水平和活性均提高的新型葡激酶。其具有专一性强、溶栓速度快等特点。

发明内容

本发明所述的重组葡激酶突变株与中国专利94112105、97105988、97103921、98102132、00111627、00111628、99804195、00112674、和00112673报道的均不相同，中国专利所报道的均为成熟的葡激酶由136个氨基酸组成，而本发明提供的Sak是由121个氨基酸组成的，表达水平和活性均提高的葡激酶突变株，是一种新型的葡激酶。

本发明构建的葡激酶工程菌CGMCC0871，具有45％以上的表达量，并以可溶性形式表达。表达产物经分离纯化获得高纯度葡激酶制品，经临床研究表明葡激酶与尿激酶(UK)、链激酶(SK)、组织纤溶酶原激活剂(t-PA)相比，具有分子量小、专一性强、溶栓速度快等特点，其可用于急性心肌梗塞，脑栓塞、肺栓塞等疾病的治疗和预防。

本发明所要解决的技术问题是：提供一种分子量小、专一性强、溶栓速度快的新型重组葡激酶(121)基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列；提供一种高效表达工程菌菌株的制备方法；提供该重组葡激酶与适当赋形剂的药用组合物；同时提供该重组葡激酶与适当赋形剂的药用组合物的用途。

本发明目的是通过以下技术方案来实现：

以本实验室构建的成熟Sak(pSAK136)DNA为模板，采用引物I和引物II经PCR扩增，获得含有约380bp的葡激酶基因DNA片段，该基因DNA片段和表达载体pBV220(pBV220质粒见《病毒学报》，1990，6(2)：111-116。)质粒，分别以EcoRI和BamHI酶切；再将酶切后的上述质粒和葡激酶基因DNA片段用T4DNA连接酶连接，获得含有Sak(121)基因的pDS03质粒DNA，再转化入大肠杆菌DH5α宿主细胞中，构建成高表达的葡激酶(121)工程菌菌株CGMCC0871。

本发明提供的技术方案一为：

本发明质粒pDS03构建过程中所采用的引物为：

引物I为5′CACGAATTCATGAGTTATTTTGAACCAACA 3′；

引物为：5′CACGGATCCCTATTTCTTTTCAATAACAACCTT 3。

本发明PCR反应为：

dd.H₂O 31μl

10xPCR缓冲液 5μl

dNTP(2.0mmol) 4μl

P-1(20pmol) 2μl

P-2(20pmol) 2μl

模板DNA(pSAK136) 5μl

Pfu DNA聚合酶(2.0u/μl) 1μl

振荡、稍加离心，92℃变性3分钟。放入PCR扩增仪，按以下步骤进行反应：

94℃ 10秒

55℃ 30秒

72℃ 60秒

共30个循环，然后72℃延伸10分钟。

本发明重组葡激酶(121)表达质粒的构建为：

将PCR扩增Sak121基因片段以EcoRI-BamHI双酶切后，以相同的限制性内切酶酶切的表达载体pBV220重组，转化大肠杆菌DH5α，涂于LB(含Amp)平板上，37℃培养过夜。提取质粒(方法见《分子克隆操作指南》1986)，以EcoRI-BamHI双酶切，走1.5％琼脂糖凝胶电泳检查，似含Sak121基因特征片断者，为表达质粒pDS03。经自动序列分析仪测定了其核苷酸序列为：AGT TAT TTT GAA CCA ACA GGC CCG TAT TTG ATG GTAAAT GTG ACT GGA GTT GAT GGT AAG GGA AAT GAA TTGCTA TCC CCT CGT TAT GTC GAG TTT CCT ATT AAA CCTGGG ACT ACA CTT ACA AAA GAA AAA ATT GAG TAC TATGTC GAA TGG GCA TTA GAT GCG ACA GCA TAT AAA GAGTTT AGA GTA GTT GAA TTA GAT CCA AGC GCA AAG ATCGAA GTC ACT TAT TAT GAT AAG AAT AAG AAA AAA GAAGAA ACG AAG TCT TTC CCT ATA ACA GAA AAA GGT TTTGTT GTC CCA GAT TTA TCA GAG CAT ATT AAA AAC CCTGGA TTC AAC TTA ATT ACA AAG GTT GTT ATA GAA AAGAAA

本发明重组葡激酶(121)高效表达工程菌株的鉴定方法为：

将葡激酶121工程菌CGMCC0871挑取单菌落分别接种在5ml的LB(Amp)液体培养基中30℃振荡培养4h，42℃继续培养3h，各取1ml培养液，4℃，10000rpm，离心1min，去上清，沉淀加入100μl的2xSDS-PAGE电泳缓冲液100℃煮沸5min，室温12000rpm，离心5min。对照为pBV220/DH5α或诱导前培养液以同样方法处理。取样10μl，走SDS-PAGE电泳，电泳结束后，将SDS-PAGE电泳凝胶切开。一组用于考马斯亮蓝染色，可见诱导样品在分子量14.0KD处有非常浓集的区带，而对照样品pBV220/DH5α和诱导前培养液无此区带。经电泳凝胶成像扫描分析，Sak121蛋白约占菌体总蛋白的45％以上。

另一组凝胶以Western Blot的方法，将SDS-PAGE凝胶用半干胶转移仪转移在硝酸纤维素膜(NC)上，通过特异试剂(抗体)作为探针，对靶物质进行检测。首先在下电极板上依次放上湿滤纸2张，NCl张，凝胶，湿滤纸2张，盖上电极板，电压60V，30分钟。转移结束后，取出NC用TTBS封闭1小时；加入溶有一抗(兔抗葡激酶抗体)的新鲜配置的TTBS(0.1ml/cm²膜面积)，室温过夜；用TTBS漂洗3次，各10分钟，以除去过量的一抗；加入二抗(羊抗兔IgG，HRP)的新鲜配置的TTBS(0.1ml/cm²膜面积)，室温孵育2小时，用TTBS漂洗3次，各10分钟，以除去未结合的二抗；以DAB(3，3’一二氨基联苯胺盐酸盐)室温显色，在分子量约14.0KD处有一条非常浓集的区带，而对照样品pBV220/DH5α和诱导前培养液无此区带。表明葡激酶突变株121具有高效表达能力。

本发明提供的技术方案二为：

重组葡激酶(121)产物的分离纯化：

经发酵液、离心收集菌体、高压溶浆离心收集细胞裂解上清液，以截流量100KD膜包，在8℃以下进行超滤，去掉约40％的杂蛋白。然后上Q-Sepharose F.F柱进行分离纯化每升发酵液可获得该纯品500mg以上；经SDS-PAGE和HPLC分析，纯度均在98％以上。以人血纤维蛋白平板法，测定重组葡激酶(121)蛋白质的生物活性，其比活为6.0×10⁵IU/mg。

附图说明

图1：重组葡激酶pDS03表达质粒的构建图谱

图2：重组葡激酶(121)核苷酸序列分析图谱

具体实施方案

本发明是以本实验室克隆的成熟葡激酶基因(pSAK136)为模板，经PCR扩增，将扩增出的葡激酶(121)基因片段插入表达载体pBV220质粒，转化大肠杆菌，构建成新的重组葡激酶工程菌菌株CGMCC0871。该表达产物具有免疫原性降低的与成熟葡激酶相同的药用价值，可用于心肌梗塞、脑栓塞、肺栓塞等血栓性疾病的治疗和预防。

下面结合实施例证详细说明本发明的制备方法：

实施例一

1、引物设计：

根据已知葡激酶核苷酸序列，设计一对引物，用该引物扩增出的葡激酶基因片段，为在成熟的葡激酶基因前缺失15个氨基酸残基的葡激酶基因片段。

引物I：5′CACGAATTCATGAAGGGCGATGACGCGAGT；

引物II：5′CACGGATCCTATTTCTTTTCAATAACAAC。

2.PCR反应：

dd.H₂O 31μl

10xPCR缓冲液 5μl

dNTP(2.0mmol) 4μl

P-1(20pmol) 2μl

P-2(20pmol) 2μl

模板DNA(Sak136DNA) 5μl

Pfu DNA聚合酶(2.0u/μl) 1μl

94℃ 10秒

55℃ 30秒

72℃ 60秒共30个循环，然后72℃延伸10分钟。取5μl PCR反应物，以1.2％琼脂糖电泳检查，可见380bp左右的DNA片断。

3、重组葡激酶(121)表达质粒的构建：

将PCR扩增Sak121片段以EcoRI-BamHI双酶切后，以相同的限制性内切酶酶酶切的表达载体pBV220重组，转化大肠杆菌DH5α，涂于LB(含Amp)平板上，37℃培养过夜。提取质粒，以EcoRI-BamHI双酶切，走1.5％琼脂糖凝胶电泳检查，似含Sak121基因特征片断者，为表达质粒pDS03(如图1所示)。经自动序列分析仪测定了其核苷酸序列(如图2所示)。

4、重组葡激酶(121)高效表达工程菌株的鉴定：

将葡激酶121工程菌CGMCC0871挑取单菌落分别接种在5ml的LB(Amp)液体培养基30℃振荡培养4h，42℃继续培养3h，各取1ml培养液，4℃，10000rpm，离心1min，去上清，沉淀加入100μl的2xSDS-PAGE电泳缓冲液100℃煮沸5min，室温12000rpm，离心5min。对照为pBV220/DH5α或诱导前培养液以同样方法处理。取样10μ1，走SDS-PAGE电泳，电泳结束后，将SDS-PAGE电泳凝胶切开。一组用于考马斯亮蓝染色，可见诱导样品在分子量14.0KD处有非常浓集的区带，而对照样品pBV220/DH5α和诱导前培养液无此区带。经电泳凝胶成像扫描分析，Sak121蛋白约占菌体总蛋白的45％以上，比成熟葡激酶表达量提高约10％。

另一组凝胶以Western Blot的方法，将SDS-PAGE凝胶用半干胶转移仪转移在硝酸纤维素膜(NC)上，通过特异试剂(抗体)作为探针，对靶物质进行检测。首先在下电极板上依次放上湿滤纸2张，NCl张，凝胶，湿滤纸2张，盖上电极板，电压60V，30分钟。转移结束后，取出NC用TTBS封闭1小时；加入溶有一抗(兔抗葡激酶抗体)的新鲜配置的TTBS(0.1m1/cm2膜面积)，室温过夜；用TTBS漂洗3次，各10分钟，以除去过量的一抗；加入二抗(羊抗兔IgG，HRP)的新鲜配置的TTBS(0.1m1/cm2膜面积)，室温孵育2小时，用TTBS漂洗3次，各10分钟，以除去未结合的二抗；以DAB(3，3’一二氨基联苯胺盐酸盐)室温显色，在分子量约14.0KD处有一条非常浓集的区带，而对照样品pBV220/DH5α和诱导前培养液无此区带。表明葡激酶突变株121具有高效表达能力。

实施例二

一种重组葡激酶(121)产物的分离纯化

1、收获：

发酵液经4℃，10000rpm，离心10分钟，收集菌体。以20mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)悬浮，洗菌体一次，以同样条件离心，收集菌体。

2、高压溶浆：

将离心收集菌体，以湿重菌体100g加入1000ml 20mM磷酸盐(pH8.0)缓冲液悬浮，用高压溶浆仪破碎细胞，4℃，15000rpm离心20分钟，收集上清。用SDS-PAGE检测上述细胞裂解液，可见在分子量14KD处有一很粗的区带，经扫描分析含量约45％，由此可见，表达产物为可溶性。

3、超滤：

将高压溶浆离心收集上清液，以截流量100KD膜包，在8℃以下进行超滤截留，可去掉约40％的杂蛋白，使粗酶液的纯度达到80％以上。

4、Q-Sepharose F.F柱层析：

将以分子截流量100KD超滤滤出液(葡激酶粗蛋白)，上经20mM磷酸盐(pH8.0)缓冲液平衡层析柱(Φ7.5×20cm)，并用此缓冲液充分洗涤至基线，再用含有0.25M NaCl的上述缓溶液洗脱目的峰。经蛋白质定量测定，每升发酵液经分离纯化可得纯品500mg以上；SDS-PAGE和HPLC分析，纯度均在98％以上。

5、活性鉴定(人血纤维蛋白平板法)：

5.1纤维蛋白平板的制备

称取125mg琼脂糖，加入23ml生理氯化钠溶液，煮沸溶解，60℃水浴平衡，加凝血酶14μ1(100IU/ml)，纤溶酶原280μl(0.5mg/ml)，要边加边摇匀，加2.2ml人纤维蛋白原(6mg/ml)，不停地摇匀，混匀后立即到平板(直径9cm)，水平放置充分凝固后4℃放置至少30分钟待用。

5.2标准品和待见样品的稀释

标准品用生理氯化钠溶液稀释成以下5个稀释度(IU/ml)：1000，250，62.5，15.6，3.9，待检样品根据标示量稀释至大约100IU/ml，或1μg/ml的浓度，待用。

5.3打孔及点样

在形成的纤维蛋白平皿内打孔(直径2mm)，每孔点样10μl，每个待检样品和标准品各点2个孔，37℃湿盒(在饭盒内加少量水以保持一定的湿度)水平放置24小时。

5.4 结果计算

纵横两次量取溶圈直径，以各个稀释度的活性的对数(x)为横坐标，以溶圈直径的平均数(4次量取的数值)的对数为纵坐标(y)，按生物统计学方法分析结果，并求得y＝a+bx中的a和b及线性回归系数r值，根据待检样品的溶圈直径可求得待检样品的活性。

经测定，葡激酶121蛋白质的生物活性，其比活为6.0×10⁵IU/mg，比成熟的葡激酶活性5.0x x10⁵IU/mg高20％左右。

本发明构建的重组葡激酶的高效表达工程菌株为：pDS03/DH5α。菌株已由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行了保藏：

保藏地址：北京市海淀区中关村北一条13号

保藏日期：2002年12月27日

保藏编号：No.0871

分类命名：大肠埃希氏菌

Claims

1、一种重组葡激酶，其特征在于其编码的核苷酸序列为：AGT TAT TTT GAA CCA ACA GGC CCG TAT TTG ATG GTAAAT GTG ACT GGA GTT GAT GGT AAG GGA AAT GAA TTGCTA TCC CCT CGT TAT GTC GAG TTT CCT ATT AAA CCTGGG ACT ACA CTT ACA AAA GAA AAA ATT GAG TAC TATGTC GAA TGG GCA TTA GAT GCG ACA GCA TAT AAA GAGTTT AGA GTA GTT GAA TTA GAT CCA AGC GCA AAG ATCGAA GTC ACT TAT TAT GAT AAG AAT AAG AAA AAA GAAGAA ACG AAG TCT TTC CCT ATA ACA GAA AAA GGT TTTGTT GTC CCA GAT TTA TCA GAG CAT ATT AAA AAC CCTGGA TTC AAC TTA ATT ACA AAG GTT GTT ATA GAA AAGAAA

2、根据权利要求1所述重组葡激酶，其特征在于其编码的氨基酸序列为：Ser Tyr Phe Glu Pro Thr Gly Pro Tyr Leu Met ValAsn Val Thr Gly Val Asp Gly Lys Gly Asn Glu LeuLeu Ser Pro Arg Tyr Val Glu Phe Pro Ile Lys ProGly Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys Ile Glu Tyr TyrVal Glu Trp Ala Leu Asp Ala Thr Ala Tyr Lys GluPhe Arg Val Val Glu Leu Asp Pro Ser Ala Lys IleGlu Val Thr Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys Lys Lys GluGlu Thr Lys Ser Phe Pro Ile Thr Glu Lys Gly PheVal Val Pro Asp Leu Ser Glu His Ile lys Asn ProGly Phe Asn Leu Ile Thr Lys Val Val Ile Glu LysLys

3、根据权利要求1所述重组葡激酶，其高效表达工程菌株为：pDS03/E.coli(CGMCC0871)。

4、根据权利要求3所述的重组葡激酶，其构建该葡激酶衍生物的高效表达工程菌的方法为：以本实验室构建的成熟葡激酶(pSAK136)DNA为模板，将扩增出葡激酶(121)基因片段，与表达载体pBV220重组，转化宿主菌大肠杆菌DH5α，获得了高效表达工程菌菌种CGMCC0871。

5、权利要求1所述的重组葡激酶的制备方法。

6、权利要求1所述的重组葡激酶的适当赋形剂的药用组合物。

7、根据权利要求6所述的药用组合物在治疗心脑血管疾病方面的用途。