CN101112358B - 葡激酶肌肉注射剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了葡激酶肌肉注射剂及其制备方法，所述的葡激酶肌肉注射剂，含有：(a)0.5-40mg/ml葡激酶；(b)3-15mM磷酸盐。它使用方便，可用于治疗和预防。本发明还公开了一种低抗原性的重组葡激酶及其制备方法和用途。

Description

葡激酶肌肉注射剂及其制备方法 

技术领域

本发明涉及药物制剂领域，尤其涉及溶栓药物肌肉注射剂及其制备方法。 

背景技术

目前用于溶栓的药物主要有尿激酶(uk)，链激酶(sk)和组织型血纤溶酶原激活剂(t-PA)。其使用于溶栓的治疗，都是采用静脉滴注或推注，或推注与滴注相结合。也有直接注入血管的栓体周边等方法，使血药浓度短时间内达到高峰。对急性血栓如心肌梗死治疗可及时发挥作用，抢得宝贵的时间，得到治疗效果。但对慢性的动静脉血栓治疗，由于长时间滴注不方便而不适用。 

溶栓新药葡激酶(Staphylokinase，Sak)具有纤维蛋白特异性，在临床上，使用推注与滴注结合，将其用于急性心肌梗死血栓病人，再通率可达到80％。文献报道，Steen Vandersdueren等用r-sak治疗周身动脉血栓，血管内先推注1mg或2mg，随后以每小时0.5或1.0mg滴注给药8个多小时，再通率达67.5％。但上述治疗方法烦琐、过程长，而且不适于需较长时间给药的病人。目前，市售的r-sak为冷冻干燥针剤，用于治疗急性心肌梗死血栓病人时，滴注给药30钟分完成；用于动静脉血栓治疗时，需滴注给药8个多小时。 

Sak是异体蛋白，用于人体有较强的免疫原性。大多数病人给药两周后出现中和抗体，并且抗体水平逐渐上升，可以维持数月之久，从而阻碍了Sak的反复使用(Declerck PJ et al.Thromb Haemost.71.129-133(1994))。 

因此，本领域迫切需要提供一种免疫原性低的重组葡激酶及其新剂型，它使用方便，适于需长时间给药的病人，从而能避开长时间滴注的烦琐过程，并能提供更有效的预防治疗。 

发明内容

本发明的目的是提供一种葡激酶的新剂型及其制备方法和用途。 

本发明的另一个目的是提供一种免疫原性低的重组葡激酶。 

在本发明的第一方面，提供了一种葡激酶肌肉注射剂，它含有： 

(a)0.5-40mg/ml葡激酶； 

(b)药学上可接受的溶剂或辅料。 

在另一优选例中，所述的葡激酶肌肉注射剂含有：1-10mg/ml葡激酶。 

在另一优选例中，所述的注射剂还含有5-12mM磷酸盐，较佳地含有3-15mM磷酸盐。 

在另一优选例中，上述注射剂的规格为1ml、2ml、或4ml。 

在另一优选例中，所述的注射剂的pH为6.5-7.5。 

在另一优选例中，所述的注射剂是固体形式，它含有0.5-400mg葡激酶和3-150mmol磷酸盐，在加入肌肉注射用溶剂后，会复溶形成含有(a)0.5-40mg/ml葡激酶；(b)3-15mM磷酸盐的溶液剂型。 

在另一优选例中，上述葡激酶肌肉注射剂中所含的葡激酶是天然葡激酶或重组葡激酶。 

在另一优选例中，上述葡激酶肌肉注射剂中所含的葡激酶是低抗原性重组葡激酶或其PEG化衍生物。 

在另一优选例中，上述的葡激酶肌肉注射剂中所含的葡激酶是缺失了野生型葡激酶N端的17-22个氨基酸。 

在另一优选例中，上述的葡激酶肌肉注射剂中所含的葡激酶与野生型葡激酶相比，其免疫原性为野生型葡激酶的10％或更低，所述的免疫原性的测定方法为：将一定量活性相当的野生型葡激酶，和低抗原变体葡激酶与不同量野生型葡激酶的抗体在体外作中和试验，中和后计算残存量。 

在另一优选例中，上述的葡激酶肌肉注射剂中所含的低抗原性重组葡激酶的核酸序列为SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3，其相应的氨基酸序列为SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6。 

在另一优选例中，所述的低抗原性重组葡激酶的核酸序列为SEQ ID NO：2，其相应的氨基酸序列为SEQ ID NO：5。 

在另一优选例中，所述的低抗原性重组葡激酶的分子量为5,000-25,000道尔顿。 

在本发明的第二方面，提供了一种上述的葡激酶肌肉注射剂的制备方法，它包括步骤： 

(i)将葡激酶溶于药学上可接受的注射用溶剂中，形成含0.5-40mg/ml葡激酶的葡激酶肌肉注射溶液； 

(ii)将上述的注射溶液分装于容器中，形成葡激酶肌肉注射剂。 

在另一优选例中，在步骤(i)和(ii)之间还包括步骤：调节pH为6.5-7.5和进行除菌处理。 

在另一优选例中，所述的步骤(i)为将葡激酶和磷酸盐溶于药学上可接受的注射用溶剂中，形成含0.5-40mg/ml葡激酶和3-15mM的磷酸盐的葡激酶肌肉注射溶液。 

在另一优选例中，除菌处理后制剤经冷冻干燥。 

在本发明的第三方面，提供了一种组合物的用途，所述的组合物包含(a)0.5-40mg/ml葡激酶；(b)药学上可接受的溶剂或辅料，所述的组合物可用于制备预防或治疗血栓的肌内注射药物。 

在另一优选例中，所述的组合物包括(a)0.5-40mg/ml葡激酶；(b)3-15mM磷酸盐；(c)药学上可接受的溶剂或辅料。 

在另一优选例中，上述组合物中所含的葡激酶缺失了野生型葡激酶N端的17-22个氨基酸。 

在本发明的第四方面，提供了一种低抗原性重组葡激酶，所述的葡激酶缺失了野生型葡激酶N端的17-22个氨基酸。 

在另一优选例中，所述的低抗原性重组葡激酶，与野生型葡激酶相比，其免疫原性为野生型葡激酶的10％或更低，所述的免疫原性的测定方法为：将一定量活性相当的野生型葡激酶，和低抗原变体葡激酶与不同量野生型葡激酶的抗体在体外作中和试验，中和后计算残存量。 

在另一优选例中，所述的低抗原性重组葡激酶与野生型葡激酶相比，其免疫原性为野生型葡激酶的5％或更低。 

在另一优选例中，所述的低抗原性重组葡激酶的氨基酸序列选自：SEQ IDNO：4、5或6。 

在另一优选例中，所述的葡激酶由核苷酸序列为SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的核酸所编码。 

在另一优选例中，提供一种治疗或预防血栓的方法，是给需要治疗的对象 通过肌肉注射方式给予0.5-40mg/人份剂量的葡激酶。 

据此，本发明提供了一种免疫原性低的重组葡激酶及其肌肉注射剂，它使用方便，适于需长时间给药的病人，从而避开了长时间滴注的烦琐过程，并能提供更有效的预防治疗。 

附图说明

图1显示了家兔肌注重组葡激酶(r-sak)后血中r-sak活性检测情况。 

图2显示了Δ21-Sak和Δ22-Sak突变体和野生型纯Sak用不同稀释度兔抗Sak血清中和后(其Sak活性相当3μg/ml)残存Sak活性曲线。 

图3显示了野生型葡激酶和低抗原变体葡激酶(由Δ20-Sak突变体得到)与不同量野生型葡激酶的抗体在体外中和后残存Sak活性曲线。 

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究意外地发现，通过缺失，设计突变点，得到低抗原性的葡激酶突变体基因(SEQ ID NO：1、2或3)，由于葡激酶极易穿透毛细血管进入血液，在将重组葡激酶制成肌肉注射剂进行给药时，与滴注等给药方式相比既避开了长时间滴注的繁琐过程，使用非常方便，而且可有效用于需低剂量长时间给药的病人。 

天然葡激酶是金黄色葡萄球菌溶原性噬菌体合成的一种蛋白，由136个氨基酸组成。Sak本身不是酶，在人血浆中与纤溶酶原(plasminogen，plg)形成1∶1的复合物，该复合物被血块表面痕量的纤溶酶(plasmin，plm)激活为Sak·plm，Sak·plm能高效激活血浆中的plg形成plm，plm催化血栓主要基质纤维蛋白凝块降解，从而溶解血栓。在血浆中，Sak·plm很快被α2-抗纤溶酶抑制，而当sak.plg通过赖氨酸结合位点与纤维蛋白结合后，α2-抗纤溶酶对Sak·plm的抑制速度会下降100倍。在正常血浆中，Sak的活力很低，不影响正常血液组份；当血液中出现纤维蛋白凝块的血栓时，在血栓周围Sak活力近百倍地提高。因此Sak是一种高效特异的溶栓剂，使用安全。 

低抗原性重组葡激酶 

如本发明所用，术语“低抗原性重组葡激酶”和“重组葡激酶低抗原性突变体”可互换使用，都是指由天然葡激酶基因的缺失突变体编码，且用于人体时其免疫原性较天然葡激酶低的人工重组葡激酶。 

本发明还涉及上述低抗原性重组葡激酶多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此低抗原性重组葡激酶多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些低抗原性重组葡激酶多核苷酸的变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。 

在优选例中，本发明构建了天然葡激酶的缺失突变体Δ20-Sak，Δ21-Sak或Δ22-Sak(SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3)。 

在本发明的优选例中，一种低抗原性重组葡激酶缺失了天然葡激酶N端17-22个氨基酸。 

更佳地，本发明的低抗原性重组葡激酶含有SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。 

本发明还包括所述低抗原性葡激酶蛋白的衍生物和类似物。如本文所用，术语“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然葡激酶蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。 

在本发明中，还包括具有与本发明低抗原性葡激酶蛋白相同功能以及相同或相近抗原性的、SEQ ID NO：4、5或6序列的变异形式。这些变异形式包括(但 并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为10个以内，较佳地为5个以内，更佳地为3个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括葡激酶蛋白的活性片段和活性衍生物。 

本发明还提供所述低抗原性葡激酶蛋白的类似物。这些类似物葡激酶缺失体的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。 

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。 

制备低抗原性重组葡激酶 

本发明提供的低抗原性重组葡激酶可以用本领域熟知的方法获得。例如其步骤包括：葡激酶基因克隆的构建、在宿主中的表达、工程菌的发酵、表达产物的分离纯化。 

本发明的低抗原性重组葡激酶核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。 

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其有关的序列连接到载体中，再转化宿主细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。 

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。 

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。 

应用PCR技术扩增DNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。 

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或葡激酶蛋白编码序列经基因工程方法得到的工程菌株，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。 

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的葡激酶缺失体多肽。一般来说有以下步骤： 

(1)用本发明的编码葡激酶缺失体多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞； 

(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞； 

(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。 

本发明中，葡激酶缺失体多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56：125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans，J Bio Chem.263：3521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。 

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含葡激酶缺失体编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Mol ecular Cloning，aLaboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。 

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。 

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。 

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。 

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。 

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的缺失体多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。 

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内存在于细胞质中、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化 重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、高速离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。 

肌肉注射剂 

本发明的葡激酶肌肉注射剂可以是溶液形式。 

通常，本发明的葡激酶肌肉注射液剂型含有：(a)0.5-40mg/ml葡激酶；(b)3-15mM磷酸盐以及(c)药学上可接受的注射用溶剂(如水、生理盐水、甘露醇或人血白旦白等)。较佳地，它含有：(a)1-10mg/ml葡激酶；(b)5-12mM磷酸盐，优选钠盐。 

葡激酶肌肉注射剂的pH为6.5-7.5，较佳地为6.5-7.2，更佳地为7.0。 

本发明的葡激酶肌肉注射剂还可以是固体形式，例如冻干粉剂。通常，本发明的固体注射剂剂型含有0.5-40mg葡激酶和3-150mmol磷酸盐。 

本发明所述的固体剂型在加入肌肉注射用溶剂后，会复溶形成上述的溶液剂型，即(a)0.5-40mg/ml葡激酶；(b)3-15mM磷酸盐。 

可用于本发明葡激酶肌肉注射剂中的活性成分葡激酶可以是天然葡激酶或重组葡激酶，优选重组葡激酶；所述的重组葡激酶包括通过基因突变产生的各种突变体，以及PEG化的葡激酶各种衍生物。特别优选低抗原性葡激酶突变体。 

本发明可以用本领域熟知的方法将葡激酶PEG衍生化。 

葡激酶的分子量没有特别限制，通常分子量为5,000-25,000道尔顿，优选10,000-15,000道尔顿。 

本发明提供的葡激酶肌肉注射剂的一种优选配方中含有：低抗原性重组葡激酶和药学上可接受的辅料。所述的低抗原性重组葡激酶的核酸序列为SEQ IDNO：1，氨基酸序列为SEQ ID NO：4，分子量约13100道尔顿；所述的药学上可接受的辅料选自：磷酸盐、甘露醇、氯化钠中的一种或多种，其中的磷酸盐优选钠盐。更佳地，本发明提供的葡激酶肌肉注射剂的配方中含有：(a)0.5-40mg/ml低抗原性重组葡激酶；(b)3-15mM磷酸盐；(c)药学上可接受的注射用溶剂。和药学上可接受的辅料。 

注射剂中还可以含有注射剂领域常规的额外添加剂，例如等渗调节剂、镇 痛剂，只要这些添加剂不对葡激酶的活性造成不利影响。 

制备肌肉注射剂 

本发明的葡激酶肌肉注射剂可以用常规的制药方法和设备制造。 

一种优选的葡激酶肌肉注射剂的制备方法包括步骤：将适量的葡激酶和磷酸盐溶于蒸馏水中，制成含0.5-40mg/ml葡激酶和3-15mM的磷酸盐的葡激酶肌肉注射液，将pH调节为合适的范围(如6.5-7.5)，然后分装合适的容器(如规格为1ml、2ml、5ml或10ml安瓿等)中，并经冷冻干燥。 

可用于本发明葡激酶肌肉注射剂中的活性成分葡激酶可以是天然葡激酶或重组葡激酶，优选重组葡激酶；所述的重组葡激酶包括通过基因突变产生的各种突变体，以及PEG化的葡激酶各种衍生物。特别优选低抗原性葡激酶突变体。 

一种优选的制备葡激酶肌肉注射剂的方法包括步骤：将适量的抵抗原性重组葡激酶和药学上可接受的辅料溶于蒸馏水中，将pH调节为合适的范围(如6.5-7.5)，然后分装合适的容器(如规格为1ml、2ml、5ml或10ml安瓿等)中，并经冷冻干燥。所述的低抗原性重组葡激酶的核酸序列为SEQ ID NO：2，氨基酸序列为SEQ ID NO：5，分子量为13100道尔顿；所述的药学上可接受的辅料选自：磷酸盐、甘露醇、氯化钠中的一种或多种，其中的磷酸盐优选钠盐。 

一种更优选的制备葡激酶肌肉注射剂的方法为：将分离纯合格的抵抗原性重组葡激酶，制成含0.5-40mg/ml抵抗原性重组葡激酶和3-15mM的磷酸盐的葡激酶肌肉注射液，将pH调节为合适的范围(如6.5-7.5)，然后分装合适的容器(如规格为1ml、2ml、5ml或10ml安瓿等)中，并经冷冻干燥。 

上述的葡激酶肌肉注射剂可用于制备治疗血栓的药物，注射剂量通常1-5ml。葡激酶的用量通常为一天一次，0.5-40mg/次/50kg体重，至痊愈为止。 

上述的葡激酶肌肉注射剂可用于制备预防血栓的药物，注射剂量通常1-5ml。葡激酶的用量通常为0.5-20mg/次/50kg体重。 

本发明的主要优点在于： 

1.低抗原性重组葡激酶免疫原性低，副作用小，提高了葡激酶应用过程中的安全性； 

2.避开了长时间滴注的繁琐过程，使用方便，适于需长期滴注给药的病人； 

3.葡激酶在血液中同样能达到治疗的有效浓度，血药浓度可维持较长时间，有利于动静脉血栓的治疗； 

4.由于肌内注射给药方式较滴注简便，因此可用于一些潜在的血栓高危人群，从而去除血管中的小血栓，起到预防血栓的作用。 

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。 

实施例1 

制备低抗原性重组葡激酶 

对葡激酶的生物信息学分析结果显示，Sak含有三个互不重叠的抗原决定簇，其中两个抗原决定簇的具体位置已经阐明。本实施例中，造成葡激酶基因的缺失，导至其空间结构的改变，从而影响葡基酶的抗原性，得到低抗原性葡激酶。 

现以缺失天然葡激酶N端21个氨基酸为例。 

构建抵抗原重组葡激酶基因 

引物设计如下： 

P15’-CAC GAA TTC ATG GGC CCG TAT TTG ATG GTA-3’ 

P25’-CAC GGA TCC TTA TTT CTT TTC ATA AAC AAC CTT-3’ 

通过PCR得到突变体基因，PCR的反应步骤为： 

将DNA模板，缓冲液，dNTP，引物P1和P2加后用重蒸水补足50微升，热变性7分钟。加Taq DNA聚合酶进入循环。 

温度控制如下： 

96℃       30秒 

55℃       40秒 

72℃       60秒 

30次循环，然后72℃延伸10分钟 

将经PCR扩增的目的基因Δ21-Sak(SEQ ID NO：1)经纯化，用EcoRI，BamH I 双酶切，和相同酶切的质粒载体pBV220连接，转化到大肠杆菌E.coliDH5a中，获得转换菌株。该转换菌株经分离单菌纯化，抽取工程菌株质粒DNA进行双酶切，从琼脂糖电泳观察，有外源DNA存在。测定序列。 

菌体培养 

使用高浓度肉汤(Tartof和Hobbs1987)。以1％接种量接种培养过夜的种子液，在32℃，通气良好条件下，培养4小时，到生长对数期，升高培养温度到42℃热诱导3小时后，离心4000rpm 20分钟，去上清，收集菌体，用1OmM的磷酸缓冲液10倍体积做成悬液，经高压匀浆泵破碎，离心10000rpm 15分钟，取上清进行分离纯化.经过俩次柱层析，得到纯品。低抗原性重组葡激酶即Δ21-Ssk由115个氨基酸组成，分子为13100道尔顿。 

低抗原性的测定方法使用体外抗原-抗体中和法：将一定量活性相当的野生型葡激酶，和低抗原变体葡激酶与不同量野生型葡激酶的抗体在体外作中和试验，中和后计算残存量(图2)。 

结果表明，对3μg/ml，Sak活性，野生型Sak用1∶120稀释度抗血清就可除去，而对Δ21-Sak要用1∶5稀释度抗血清才能除去，两者之间相差24倍。突变株Δ21得到的葡激酶抗原性比野生型大大降低。 

成品的分离、纯化 

将菌体悬浮于10mM的磷酸缓冲液中，经高压匀浆泵破碎，高速离心10000rpm 15分钟，去沉淀，上清液经离子交换层析，(介貭为SP SepharoseFF)洗脱，再经第二个层析柱，(介质为Phenyl Sepharose)纯化，得到低抗原性葡激酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO：5，由115个氨基酸组成，分子量约13100道尔顿。 

实施例2-3 

制备低抗原性重组葡激酶 

用与实施例1类似的方法得到了缺失天然葡激酶N端20和22个氨基酸的低抗原性葡激酶，突变体基因分别为Δ20-Sak(SEQ ID NO：1)和Δ22-Sak(SEQ IDNO：3)；其氨基酸序列分别为SEQ ID NO：4(116个氨基酸组成，分子量约13200道尔顿)和SEQ ID NO：6(114个氨基酸组成，分子量约13000道尔顿)。 

分别进行低抗原性的测定，结果见图2和图3。 

结果表明，突变株Δ20和突变株Δ22得到的葡激酶与突变株Δ21得到的 葡激酶一样具有低抗原性。 

实施例4-6 

制备葡激酶肌肉注射剂 

	实施例4	实施例5	实施例6
				实施例1制得的重组葡激酶(mg)	5	25	150
磷酸钠盐(mmol)	15	50	75

将重组葡激酶(分子量约13100道尔顿)和磷酸钠盐溶解在5ml注射用水中，制得葡激酶肌肉注射剂。 

实施例7 

给家兔肌肉注射葡激酶 

将实施例4制得的重组葡激酶肌肉注射剂(500μg/2.5kg)，通过后腿肌注方式注入家兔后腿，家兔大致的体重为2.2-2.5kg左右、兔龄为4-5个月，共五次9只。 

不同时间从耳静脉采血样，用纤维蛋白原平板检测重组葡激酶的活性，结果见表1、图1。 

表1家兔肌注r-sak后血中r-sak活性检测(肌注剤量200μg/kg) 

采样时间	活性(ng/ml)
		30分	126
60分	278
		120分	300
180分	448
		240分	232
300分	168
		380分	84
420分	60
		480分	48
540分	110

结果表明，从30分钟开始，血浆中就出现重组葡激酶的活性。一直维持到九个小时。 

实施例8 

给大白鼠肌肉注射葡激酶 

将实施例4制得的重组葡激酶肌肉注射剂(80μg/0.33kg)，通过后腿肌注方式注入大白鼠后腿，大白鼠大致体重为0.23-0.33kg/只，共6只。不同时间从尾静脉采血样，用纤维蛋白原平板检测重组葡激酶的活性，结果见表2。 

表2 大白鼠肌注r-sak(200μg/kg)后，血中r-sak活性检测 

采样时间	活性(溶圈直径)
		30分	10.1
60分	12.0
		120分	10.1
180分	10.1
		240分	10.1
300分	--、

结果表明，血样中也检测到重组葡激酶的活性。 

实施例9 

给小白鼠肌肉注射葡激酶 

将实施例4制得的重组葡激酶肌肉注射剂(10μg/0.03kg)，通过后腿肌注方式注入小白鼠后腿(小白鼠大致体重为0.03kg/只，鼠龄约2个月，共8只)，不同时间从尾静脉采血样，用纤维蛋白原平板检测重组葡激酶的活性，结果见表3。 

表3 小白鼠肌注r-sak(200μg/kg)后，血中r-sak活性检测 

采样时间	活性(溶圈直径mm)
		30分	6.4
60分	5.3
		120分	/

180分	/
		240分	/
300分	/
		360分	/

结果表明，与大白鼠后腿注射重组葡激酶相似，血样中也检测到重组葡激酶的活性。 

对比例1 

给家兔肌肉注射r-TPA 

家兔后腿肌注组织型血纤溶酶原激活剤(r-TPA)(6mg/3.1kg)(家兔购自复旦医学院动物房)。不同时间从耳静脉采血样，用纤维白原平板检测组织型血纤溶酶原激活剤的活性，结果见表4。 

对比例2 

给家兔肌肉注射链激酶 

家兔后腿肌注射链激酶(1.5mg/3.2kg)，(购自复旦医学院动物房)。不同时间从耳静脉采血，用纤维蛋白原平板检测重组链激酶的活性，结果见表4。 

对比例3 

给家兔肌肉注射尿激酶 

家兔后腿肌肉注射尿激酶(1.5mg/3.3kg仍至2.5mg/2.7kg)(购自复旦医学院动物房)，不同时间从耳静脉采血样，用纤维白原平板检测尿激酶的活性，结果见表4。 

表4 不同纤溶酶原激活剤肌注家兔后，血中出现溶纤活性状况 

	对比例1	对比例2	对比例3	实施例5
					纤溶酶原名称	r-TPA	r-SK	UK	r-SAK
血中溶纤活性	-	-	-	+

结果表明，未检测到组织型血纤溶酶原激活剤的活性，未能明显检测到重组链激酶的活性，也未检测到尿激酶的活性。而r-SAK分子量小，具有和其它纤溶酶原激活剤不同特性，有可穿透微血管的能力。 

对比例4 

给大白鼠、小白鼠肌肉注射链激酶 

大白鼠后腿肌注重组链激酶(2.5mg/0.33kg)，和小白鼠肌注链激酶(80μ/33g)的结果与家兔肌注链酶一样的结果。用纤维蛋白原平板也未能明显检测到重组链激酶的活性。 

实施例10 

重组葡激酶注射用冻干剂 

用离子交换，疏水层析分离获得无热源，纯度符合制检要求的重组葡激酶，经超滤调整葡激酶浓度，并含适宜的离子浓度和合适的pH.除菌后加入保护剤如人血白蛋白或甘露醇等物。分装冷冻干燥。存于4℃。 

实施例11-13 

制备葡激酶肌肉注射剂 

	实施例11	实施例12	实施例13
				实施例1制得的重组葡激酶(mg)	40	10	25
磷酸钠盐(mmol)	15	20	30
				注射用水(ml)	1	2	10

将重组葡激酶(分子量约13100道尔顿)和磷酸钠盐溶解在注射用药用溶剤中，制得葡激酶肌肉注射剂。 

实施例14-16 

制备葡激酶肌肉注射剂 

	实施例14	实施例15	实施例16
				实施例1制得的重组葡激酶(mg)	40	10	25
磷酸钠盐(mmol)	15	20	30
				氯化钠(mg)	4	6	8

将重组葡激酶(分子量约13100道尔顿)和磷酸钠盐溶解在注射用药用溶剤中，制得葡激酶肌肉注射剂。 

实施例17-19 

制备葡激酶肌肉注射剂 

	实施例17	实施例18	实施例19
				实施例1制得的重组葡激酶(mg)	40	10	25
磷酸钠盐(mmol)	15	20	30
				甘露醇(mg)	20	30	40

将重组葡激酶(分子量约13100道尔顿)和磷酸钠盐溶解在注射用药用溶剤中，制得葡激酶肌肉注射剂。 

实施例20-22 

制备葡激酶肌肉注射剂 

	实施例20	实施例21	实施例22
				实施例1制得的重组葡激酶(mg)	40	10	25
氯化钠(mg)	15	20	30

将重组葡激酶(分子量约13100道尔顿)和磷酸钠盐溶解在注射用药用溶剤中，制得葡激酶肌肉注射剂。 

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 

序列表 

<110>中国科学院上海生命科学研究院 

<120>葡激酶肌肉注射剂及其制备方法 

<130>060135 

<160>8 

<170>PatentIn version 3.3 

<210>1 

<211>348 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<221>misc_feature 

<223>葡激酶Δ20突变株基因序列 

<400>1 

acaggcccgt atttgatggt aaatgtgact ggagttgata gtaaaggaaa tgaattgcta     60 

tcccctcatt atgtcgagtt tcctattaaa ectgggacta cacttacaaa agaaaaaatt    120 

gaatactatg tcgaatgggc attagatgcg acagcatata aagagtttag agtagttgaa    180 

ttagatccaa gcgcaaagat cgaagtcact tattatgata agaataagaa aaaagaagaa    240 

acgaagtctt tccctataac agaaaaaggt tttgttgtcc cagatttatc agagcatatt    300 

aaaaaccctg gattcaactt aattacaaag gttgttatag aaaagaaa                 348 

<210>2 

<211>345 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<221>misc_feature 

<223>葡激酶Δ21突变株基因序列 

<400>2 

ggcccgtatt tgatggtaaa tgtgactgga gttgatagta aaggaaatga attgctatcc     60 

cctcattatg tcgagtttcc tattaaacct gggactacac ttacaaaaga aaaaattgaa    120 

tactatgtcg aatgggcatt agatgcgaca gcatataaag agtttagagt agttgaatta    180 

gatccaagcg caaagatcga agacacttat tatgataaga ataagaaaaa agaagaaacg    240 

aagtctttcc ctataacaga aaaaggtttt gttgtcccag atttatcaga gcatattaaa    300 

aaccctggat tcaacttaat tacaaaggtt gttatagaaa agaaa                    345 

<210>3 

<211>342 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<221>misc_feature 

<223>葡激酶Δ22突变株基因序列 

<400>3 

ccgtatttga tggtaaatgt gactggagtt gatagtaaag gaaatgaatt gctatcccct     60 

cattatgtcg agtttcctat taaacctggg actacactta caaaagaaaa aattgaatac    120 

tatgtcgaat gggcattaga tgcgacagca tataaagagt ttagagtagt tgaattagat    180 

ccaagcgcaa agatcgaagt cacttattat gataagaata agaaaaaaga agaaacgaag    240 

tctttcccta taacagaaaa aggttttgtt gtcccagatt tatcagagca tattaaaaac    300 

cctggattca acttaattac aaaggttgtt atagaaaaga aa                       342 

<210>4 

<211>116 

<212>PRT 

<213>人工序列 

<220> 

<221>MISC_FEATURE 

<223>葡激酶Δ20突变株的氨基酸序列 

<400>4 

Thr Gly Pro Tyr Leu Met Val Asn Val Thr Gly Val Asp Ser Lys Gly 

1               5                   10                  15 

Asn Glu Leu Leu Ser Pro His Tyr Val Glu Phe Pro Ile Lys Pro Gly 

            20                  25                  30 

Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys Ile Glu Tyr Tyr Val Glu Trp Ala Leu 

        35                  40                  45 

Asp Ala Thr Ala Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val Glu Leu Asp Pro Ser 

    50                  55                  60 

Ala Lys Ile Glu Val Thr Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys Lys Lys Glu Glu 

65                  70                  75                  80 

Thr Lys Ser Phe Pro Ile Thr Glu Lys Gly Phe Val Val Pro Asp Leu 

                85                  90                  95 

Ser Glu His Ile Lys Asn Pro Gly Phe Asn Leu Ile Thr Lys Val Val 

            100                 105                 110 

Ile Glu Lys Lys 

        115 

<210>5 

<211>115 

<212>PRT 

<213>人工序列 

<220> 

<221>MISC_FEATURE 

<223>葡激酶Δ21突变株的氨基酸序列 

<400>5 

Gly Pro Tyr Leu Met Val Ash Val Thr Gly Val Asp Ser Lys Gly Asn 

1               5                   10                  15 

Glu Leu Leu Ser Pro His Tyr Val Glu Phe Pro Ile Lys Pro Gly Thr 

            20                  25                  30 

Thr Leu Thr Lys Glu Lys Ile Glu Tyr Tyr Val Glu Trp Ala Leu Asp 

        35                  40                  45 

Ala Thr Ala Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val Glu Leu Asp Pro Ser Ala 

    50                  55                  60 

Lys Ile Glu Val Thr Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys Lys Lys Glu Glu Thr 

65                  70                  75                  80 

Lys Ser Phe Pro Ile Thr Glu Lys Gly Phe Val Val Pro Asp Leu Ser 

                85                  90                  95 

Glu His Ile Lys Asn Pro Gly Phe Asn Leu Ile Thr Lys Val Val Ile 

            100                 105                 110 

Glu Lys Lys 

        115 

<210>6 

<211>114 

<212>PRT 

<213>人工序列 

<220> 

<221>MISC_FEATURE 

<223>葡激酶Δ22突变株的氨基酸序列 

<400>6 

Pro Tyr Leu Met Val Asn Val Thr Gly Val Asp Ser Lys Gly Asn Glu 

1               5                   10                  15 

Leu Leu Ser Pro His Tyr Val Glu Phe Pro Ile Lys Pro Gly Thr Thr 

            20                  25                  30 

Leu Thr Lys Glu Lys Ile Glu Tyr Tyr Val Glu Trp Ala Leu Asp Ala 

        35                  40                  45 

Thr Ala Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val Glu Leu Asp Pro Ser Ala Lys 

    50                  55                  60 

Ile Glu Val Thr Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys Lys Lys Glu Glu Thr Lys 

65                  70                  75                  80 

Ser Phe Pro Ile Thr Glu Lys Gly Phe Val Val Pro Asp Leu Ser Glu 

                85                  90                  95 

His Ile Lys Asn Pro Gly Phe Asn Leu Ile Thr Lys Val Val Ile Glu 

            100                 105                 110 

Lys Lys 

<210>7 

<211>30 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<221>misc_feature 

<223>引物 

<400>7 

cacgaattca tgggcccgta tttgatggta                             30 

<210>8 

<211>33 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<221>misc_feature 

<223>引物 

<400>8 

cacggatcct tatttctttt cataaacaac ctt                         33 

Claims (9)

1.一种葡激酶肌肉注射剂，其特征在于，它含有：

(a)0.5-40mg/ml葡激酶；

(b)药学上可接受的溶剂或辅料；

所述的葡激酶是低抗原性重组葡激酶；所述的低抗原性重组葡激酶的核酸序列为SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3，其相应的氨基酸序列为SEQID NO：4，SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6。

2.如权利要求1所述的葡激酶肌肉注射剂，其特征在于，它含有：1-10mg/ml葡激酶。

3.如权利要求1所述的葡激酶肌肉注射剂，其特征在于，与野生型葡激酶相比，其免疫原性为野生型葡激酶的10％或更低，所述的免疫原性的测定方法为：将一定量活性相当的野生型葡激酶，和低抗原变体葡激酶与不同量野生型葡激酶的抗体在体外作中和试验，中和后计算残存量。

4.如权利要求1所述的葡激酶肌肉注射剂，其特征在于，所述的低抗原性重组葡激酶的分子量为5,000-25,000道尔顿。

5.一种如权利要求1所述的葡激酶肌肉注射剂的制备方法，其特征在于，它包括步骤：

(i)将葡激酶溶于药学上可接受的注射用溶剂中，形成含0.5-40mg/ml葡激酶的葡激酶肌肉注射溶液；

(ii)将上述的注射溶液分装于容器中，形成葡激酶肌肉注射剂；

所述的葡激酶是低抗原性重组葡激酶；所述的低抗原性重组葡激酶的核酸序列为SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3，其相应的氨基酸序列为SEQID NO：4，SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在步骤(i)和(ii)之间还包括步骤：调节pH为6.5-7.5和进行除菌处理。

7.一种组合物的用途，所述的组合物包含(a)0.5-40mg/ml葡激酶；(b)药学上可接受的溶剂或辅料，其特征在于，所述的组合物可用于制备预防或治疗血栓的肌内注射药物；

所述的葡激酶是低抗原性重组葡激酶；所述的低抗原性重组葡激酶的核酸序列为SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3，其相应的氨基酸序列为SEQID NO：4，SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6。

8.一种低抗原性重组葡激酶，其特征在于，所述的葡激酶的氨基酸序列选自：SEQ ID NO：4、5或6。

9.如权利要求8所述的低抗原性重组葡激酶，其特征在于，与野生型葡激酶相比，其免疫原性为野生型葡激酶的10％或更低，所述的免疫原性的测定方法为：将一定量活性相当的野生型葡激酶，和低抗原变体葡激酶与不同量野生型葡激酶的抗体在体外作中和试验，中和后计算残存量。

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