CN100999727A - 肿瘤和免疫相关的调控因子Caspase－10/G - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新的肿瘤和/或免疫相关的调控因子Caspase－10/G蛋白，以及其片段、类似物和衍生物。本发明还涉及所述多核苷酸和蛋白的制法和用途。本发明的Caspase－10/G蛋白在肿瘤中表达升高，因此可以作为一种肿瘤标志物。本发明的蛋白为一步深入地研究细胞凋亡机制提供了新的途径，并且为肿瘤药物的开发提供了新的靶点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和医学领域，具体地说，本发明涉及新的具有抗肿瘤功能的蛋白以及编码所述蛋白的多核苷酸。本发明还涉及此多核苷酸和蛋白的制法和用途，以及含该蛋白的组合物。
背景技术
癌症在人类疾病中是仅次于心血管系统疾病的第二大死亡原因。据估计，发达国家中约有三分之一的人会在他们生命历程的不同阶段患上癌症，其中近四分之一的患者最终死于癌症。另据世界卫生组织2003年报告，目前每年新增癌症患者1000万人，死亡约700万人。与1990年相比，全球癌症患者的发病率增长了19％，死亡率增长了18％。因此，发展抗癌药物一直是生物医药企业争相竞争的阵地。随着分子医学和分子生物学的发展，人们认识到，癌症的发生与细胞凋亡的失控密切相关。细胞凋亡是由基因控制的细胞自主有序的一种细胞死亡形式。正常情况下，细胞凋亡对于胚胎的发育和保持个体稳态相当重要，一旦调节细胞凋亡的程序存在缺陷，体内聚集大量不死的细胞就会导致肿瘤、自身免疫疾病等发生，而过度凋亡则可能引起心血管疾病、AIDS、神经退行性病变和神经肌肉疾病等发生。
目前临床上众多的抗肿瘤药物，如TNF-a等，其抗肿瘤效果都与诱导肿瘤细胞出现凋亡有关。随着肿瘤发生机制的不断阐明，如何有效的促进肿瘤细胞的凋亡又不影响正常细胞的生存，成为抗肿瘤药物发展的方向。然而国内生物医药企业由于缺乏完整的药物开发平台和研发体系等原因，开发具有自主知识产权的新药遇到很大困难，生产的抗肿瘤药物几乎全是仿制品。在当今激烈国际竞争和仿制药物受到限制情况下，开发出具有原创性的药物靶点和新药，是企业寻求长久生存和发展的根本途径。传统的抗肿瘤药物大多属于细胞毒性药物，其临床效果取决于细胞对药物的敏感性，存在治疗范围较窄，对实体瘤效果较差，不良反应大，长期服用容易出现耐药性等局限性，并且传统的抗肿瘤小分子药物调节细胞凋亡的程度有限。因此，从肿瘤细胞发生与凋亡信号转导的分子机制入手，调节特定的信号分子，干预信号转导，直接促进肿瘤细胞的凋亡的研究，势必会推动抗肿瘤靶点的寻找和新型抗肿瘤药物的开发，为获得具有自主知识产权的药物和药物靶标奠定坚实的基础。
Caspase即半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶，是经典的细胞凋亡分子，目前，人类Caspase家族至少包括14个成员。根据Caspase家族成员之间大小亚单位的同源性，可分为3组：炎症组：Caspase-1、-4、-5、-12、-13和-14；凋亡起始组：Caspase-2、-8、-9和-10；凋亡效应组：Caspase-3、-6和-7。炎症组和起始组的Caspase酶原都具有长的原域(Pro-domain)，其中包含有死亡效应域(death effector domain，DED)或Caspase招募域(caspaserecruitment domain，CARD)，它们与死亡结构域(death domain，DD)同属于死亡域超家族。在Caspase激活的过程中，这些区域都发挥着重要的作用。Caspase能够通过破坏或激活细胞内一些关键性的酶，引起DNA断裂，破坏细胞骨架而引起细胞凋亡，通过Caspase联级信号途径在细胞凋亡的启动、发展、终止等过程中起着决定性的作用。除与凋亡密切相关外，Caspase在免疫系统方面参与了自身免疫性胸腺细胞、T细胞和B细胞的阴性选择，促使免疫细胞的成熟，参与T细胞介导的细胞毒等作用，此外，Caspase还参与一些神经变性疾病的发生。Caspase的差异性表达，突变，调节机制出现紊乱等现象在肿瘤中屡见不鲜。
Caspase是调节细胞凋亡和其他功能如炎症的重要因子，同时又属于蛋白酶类，因此成为目前药物开发的极好靶点，抑制或者诱导Caspase活性均是调节细胞凋亡的有效途径，而最常用的还是抑制Caspase活性。目前所开发的大多数的Caspase酶抑制剂都是广谱抑制剂，既可以影响炎症过程，也可以影响凋亡，而有些疾病例，如致死率很高的败血症其本身就同时涉及炎症和淋巴细胞过度凋亡这两个病理过程。因此，以Caspase为靶标的药物可望研发成为治疗肿瘤、自身免疫疾病、神经变性疾病的药物。例如，一种称为VX470(Pralnacasan)的药物，能够特异性抑制Caspase-1，从而可以抑制炎症反应，用来治疗类风湿性关节炎，目前已经进入II期临床试验。另一广谱Caspase抑制剂药物IDN-6556已经进入人体实验，可以保护肝细胞过度凋亡，用于治疗肝炎、器官移植等。目前已经发现的各种Caspase家族的成员的序列都是已知的，比如caspase9在Genbank中登录号为U56390，caspase10/D的登录号为AF111345。
Caspase-10属于Caspase家族，是细胞凋亡中重要的起始因子之一，在死亡受体(death receptors，DRs)引起的细胞凋亡中起重要作用[Wang等，PNAS，2001，13884-13888]。
目前已知Caspase-10具有6个不同形式的可变性剪接体。Caspase-10分子含有两个重复的死亡效应域，以及保守的半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶结构域(Casp domain)。在受凋亡信号刺激时，Caspase-10通过死亡效应域被招募到死亡诱导信号复合体(death-inducing signaling complex，DISC)中，并发生切割，将死亡效应域留在DISC复合物中，而蛋白酶结构域继续切割为大小两个亚基，从而Caspase-10被激活[Sprick等EMBO J，2002，4520-4530]。Caspase-10的原结构域对于Caspase-10与DISC复合物成分相互作用中起关键作用，通过与DISC复合物中的接头分子FADD(Fas-associated death domainprotein)发生作用，启动了细胞凋亡的发生[Sprick等EMBO J，2002，4520-4530]。
Caspase-10功能部分缺陷或调节失常与一些肿瘤的发生密切相关。例如，肺癌与乳腺癌细胞中常伴随Caspase-10蛋白表达的缺陷[Kischkel等，J BiolChem，2001，46639-46646]；此外，成神经细胞瘤、骨肉瘤、眼癌、横纹肌肉瘤等来源的细胞中也常伴随Caspase-10蛋白表达的缺陷[Harada等，CancerRes，2002，5897-5901]；非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin”s lymphoma)、胃癌病人都能检测到Caspase-10基因突变[Shin等，Blood，2002，4094-4099；Park等，Oncogene，2002，2919-2925]。这些表明，在死亡受体信号通路中，Caspase-10功能一旦存在缺陷，细胞凋亡就会受到影响从而有利于肿瘤的发生。此外，Caspase-10在免疫系统的稳态调节也具有重要作用，Caspase-10基因的突变与II型自身免疫淋巴增生性综合症(autoimmunelymphoproliferative syndrome type II)的发生密切相关[Wang等，Cell，1999，47-58]。
尽管目前已经发现了Caspase-10的6个不同形式的可变性剪接体，但是，仍然需要探索和研究新的Caspase家族成员，以期进一步深入地研究细胞凋亡机制，为肿瘤的改善和治疗提供新的途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的肿瘤和/或免疫相关的调控因子Caspase-10/G蛋白，以及其片段、类似物和衍生物。
本发明的另一目的是提供编码所述蛋白的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供生产所述蛋白的方法以及所述蛋白和编码序列的用途。
在本发明的第一方面，提供一种分离的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-10/G(Caspase-10/G)多肽，它选自下组：
(1)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；
(2)具有诱导凋亡功能的SEQ ID NO：2的保守性变异多肽、活性片段、或活性衍生物。
在本发明的一个优选例中，该多肽选自下组：
(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；
(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有诱导凋亡功能的由(a)衍生的多肽。
在本发明的第二方面，提供一种分离的多核苷酸，它编码前面所述的多肽。
在本发明的另一优选例中，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。
在本发明的另一优选例中，该多核苷酸含有SEQ ID NO：1中157-900位的序列。
在本发明的第三方面，提供一种载体，它含有前面所述的多核苷酸。
在本发明的第四方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它选自下组：
(a)用所述的载体转化或转导的宿主细胞；
(b)用所述的多核苷酸转化或转导的宿主细胞。
在本发明的第五方面，提供一种天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-10/G蛋白的制备方法，该方法包含步骤：
(a)在表达条件下，培养所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-10/G蛋白。
在本发明的第六方面，提供一种能与所述的多肽特异性结合的抗体。
在本发明的第七方面，提供所述的多肽或其编码基因的用途，用于
(1)制备调节细胞凋亡的药物；
(2)筛选调节细胞凋亡的化合物；
(3)制备治疗自身免疫疾病或炎症的药物；或
(4)筛选抑制自身免疫疾病或炎症的化合物。
在本发明的第八方面，提供一种检测样品中是否存在天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-10/G蛋白的方法，所述方法包括：
将样品与天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-10/G蛋白特异性结合的抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-10/G蛋白。
在本发明的第九方面，提供一种筛选促进细胞凋亡的化合物的方法，所述方法包括步骤：
(a)在测试组中，向过表达天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-10/G的细胞培养物中添加待筛选的候选物，并检测培养物中细胞凋亡状况；
(b)将步骤(a)测试组中细胞凋亡状况与对照组中细胞凋亡状况进行比较，对照组的细胞为过表达天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-10/G但不加入候选物的细胞，
如果测试组中的细胞凋亡状况在统计学上高于(优选显著高于，比如高30％或以上，更佳地高50％或以上，最佳地高80％或以上)对照组，就表明该候选物是促进细胞凋亡的化合物。
在本发明的一个优选例中，还提供了一种调节细胞凋亡的化合物的用途，用于制备免疫调节药物或肿瘤药物。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1，非特异性退火的示意图，上面为引物序列，下面对应染色体序列。
图2，Blastn搜索EST数据库结果。
图3，7个Caspase-10可变剪接体的基因结构示意图。其中，N-端功能前区即prodomain。
图4，7个Caspase-10剪接体蛋白序列比对。
图5，Caspase-10/G在人的直肠癌肿瘤组织中的RT-PCR结果，其中选取三个个体，每个个体包括一对样品：N(正常组织)，MT(肿瘤组织)。电泳图中从左到右，相邻泳道为一对。
图6，在293细胞中NF-κB荧光素酶活性测试。caspase-10/G能显著增加NF-κB报告基因活性。
图7，Caspase-10/G能够引起Hela细胞的凋亡，图中A，B，C，D分别表示空载体、RIP阳性对照、Caspase-10/D(Casp10/D)及Caspase-10/G(Casp10/G)转染的细胞。其中，膜联蛋白即annexin。
图8，Hela细胞中转染各质粒的三次细胞调亡结果分析柱形图，取表2中三次平均值，获得柱形图。相对于对照(Mock)，*P＜0.05，**P＜0.01。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首先预测并分离到天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-10(Caspase-10)的一个新的可变性剪接体，本发明中命名为Caspase-10/G。经验证，Caspase-10/G在能够引起细胞凋亡，在一些肿瘤组织中有高表达，还与炎症有关。基于此完成了本发明。
本发明人采用生物信息学的知识，充分利用人类基因组计划已完成的人类基因组序列，鉴于基因本身的结构特征，结合序列表达标签，成功预测并克隆到所述新的可变性剪接体。鉴于GenBank数据库中已经存在Caspase-10/A、B、C、D、E和Caspase-10/F共6个剪接体，所以本发明人将新的剪接体命名为Caspase-10/G。
Caspase-10/G仅含有两个重复的死亡效应域而不含有保守的蛋白酶结构域(具体参见实施例2)，在人的一些肿瘤组织中有高表达(具体参见实施例3)，说明Caspase-10/G是一种潜在的肿瘤标志物。Caspase-10/G在能够引起细胞凋亡(见实施例5)。在293T细胞中，Caspase-10/G能够激活NF-κB细胞信号通路(具体参见实施例4)，说明Caspase-10/G参与了非细胞凋亡过程，并与炎症关联。本发明人认为这一过程可能由于Caspase-10/G与NF-κB细胞通路中关键因子RIP、NIK、TRAF2等发生了相互作用所致[Shikama等，Eur.J.Immunol，2003，1998-2006]。
综上所述，本发明人认为一方面Caspase-10/G通过参与形成DISC复合物负调控Caspase-10全长的活性，在死亡受体(Fas，DR3，DR4/5等)引起的促凋亡与抗凋亡效应之间维持一种平衡；另一方面，Caspase-10/G通过激活NF-κB信号通路，参与了非细胞凋亡方面的生理功能，诸如免疫系统和炎症的调节等。Caspase-10/G的存在为通过干扰与之密切相关的DISC复合体或NF-κB通路在治疗肿瘤、自身免疫疾病和炎症等方面提供了一个探索的方向。
在本发明中，术语“Caspase-10/G”“Caspase-10/G蛋白”或“Caspase-10/G多肽”可互换使用，都指基本上具有Caspase-10/G蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的多肽或蛋白质。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的Caspase-10/G蛋白。这些术语还包括含有或不含有信号肽的Caspase-10/G蛋白。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和蛋白质是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或蛋白质如从天然状态中与存在的其他物质中分开，则为分离纯化。
如本文所用，“分离的Caspase-10/G多肽蛋白质基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术(尤其是FPLC)分离纯化出Caspase-10/G蛋白。
本发明的蛋白质可以是重组蛋白质、天然蛋白质、合成蛋白质，优选重组蛋白质。本发明的蛋白质可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白质可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的蛋白质还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括Caspase-10/G蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然Caspase-10/G蛋白相同的生物学功能或活性的蛋白质。本发明的蛋白质片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白质，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白质，或(iii)成熟蛋白质与另一个化合物(比如延长蛋白质半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的蛋白质，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此蛋白质序列而形成的蛋白质(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白质的序列或酶原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“Caspase-10/G蛋白”指具有Caspase-10/G蛋白活性的SEQID NO.2序列的蛋白质。该术语还包括具有与Caspase-10/G蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸残基如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸残基取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸残基也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括Caspase-10/G蛋白的活性片段和活性衍生物。
该蛋白质的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与Caspase-10/GDNA杂交的DNA所编码的蛋白质以及利用抗Caspase-10/G蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白质。本发明还提供了其他蛋白质，如包含Caspase-10/G蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的蛋白质外，本发明还包括了Caspase-10/G蛋白序列的可溶性片段。通常，该片段具有Caspase-10/G蛋白序列的至少约10个连续氨基酸残基，通常至少约30个连续氨基酸残基，较佳地至少约50个连续氨基酸残基，更佳地至少约80个连续氨基酸残基，最佳地至少约100个连续氨基酸残基。
发明还提供Caspase-10/G蛋白的类似物。这些类似物与天然Caspase-10/G蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白质包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白质并不限于上述例举的代表性的蛋白质。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的蛋白质的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白质的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白质。这种修饰可以通过将蛋白质暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白质。
在本发明中，“Caspase-10/G保守性变异蛋白质”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸残基所替换而形成蛋白质。这些保守性变异蛋白质最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
| 最初的残基 | 代表性的取代 | 优选的取代 |
| Ala(A) | Val；Leu；Ile | Val |
| Arg(R) | Lys；Gln；Asn | Lys |
| Asn(N) | Gln；His；Lys；Arg | Gln |
| Asp(D) | Glu | Glu |
| Cys(C) | Ser | Ser |
| Gln(Q) | Asn | Asn |
| Glu(E) | Asp | Asp |
| Gly(G) | Pro；Ala | Ala |
| His(H) | Asn；Gln；Lys；Arg | Arg |
| Ile(I) | Leu；Val；Met；Ala；Phe | Leu |
| Leu(L) | Ile；Val；Met；Ala；Phe | Ile |
| Lys(K) | Arg；Gln；Asn | Arg |
| Met(M) | Leu；Phe；Ile | Leu |
| Phe(F) | Leu；Val；Ile；Ala；Tyr | Leu |
| Pro(P) | Ala | Ala |
| Ser(S) | Thr | Thr |
| Thr(T) | Ser | Ser |
| Trp(W) | Tyr；Phe | Tyr |
| Tyr(Y) | Trp；Phe；Thr；Ser | Phe |
| Val(V) | Ile；Leu；Met；Phe；Ala | Leu |
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟蛋白质的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO：2的成熟蛋白质的多核苷酸包括：只编码成熟蛋白质的编码序列；成熟蛋白质的编码序列和各种附加编码序列；成熟蛋白质的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码蛋白质的多核苷酸”可以是包括编码此蛋白质的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或蛋白质的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的蛋白质的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少60％，较佳地至少70％，更佳地至少80％，最佳地至少90％同源性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的同源性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的蛋白质与SEQ IDNO：2所示的成熟蛋白质有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码Caspase-10/G蛋白的多聚核苷酸。
本发明中的蛋白质和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
本发明的Caspase-10/G核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得到有关序列。也可直接通过RT-PCR的方法扩增得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白质(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白质序列中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki等，Science 1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或Caspase-10/G蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述蛋白质的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的Caspase-10/G蛋白。一般来说有以下步骤：
(1).用本发明的编码Caspase-10/G蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，Caspase-10/G蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7的表达载体；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含Caspase-10/G蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞的动物细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：原生质体法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的蛋白质。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白质。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白质沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的Caspase-10/G蛋白有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：用于筛选促进或对抗Caspase-10/G蛋白功能的抗体、蛋白质或其它配体。用表达的重组Caspase-10/G蛋白筛选蛋白质库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激Caspase-10/G蛋白功能的蛋白质分子。
另一方面，本发明还包括对Caspase-10/G编码DNA或是其片段编码的蛋白质具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于Caspase-10/G蛋白或片段。较佳地，指那些能与Caspase-10/G蛋白或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制Caspase-10/G蛋白的分子，也包括那些并不影响Caspase-10/G蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的Caspase-10/G蛋白结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab”或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的Caspase-10/G蛋白或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达Caspase-10/G蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的各类抗体可以利用Caspase-10/G蛋白的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用蛋白质合成仪合成。与Caspase-10/G蛋白的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
利用本发明Caspase-10/G蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与Caspase-10/G蛋白发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。通常，建立适用于高通量筛选的分子和细胞水平筛选模型并进行高通量筛选等相关研究工作。应用E.coli或Baculovirus表达系统，克隆与表达
Caspase-10/G蛋白 或其活性片段，分离纯化重组蛋白，并应用这些重组的Caspase-10/G蛋白，建立适用于高通量筛选的分子水平筛选模型。通过对大量来源于传统中草药的粗提物和纯化合物的筛选，寻找有效的活性部位或纯化合物。活性指导从有效的活性部位中分离单体。应用高通量筛选获得小分子抑制剂，检测对Caspase-10/G抑制效果，确定小分子抑制剂对Caspase-10/G的特异性。并应用高通量筛选获得的小分子抑制剂检测细胞水平抑制效果。
本发明Caspase-10/G蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、或拮抗剂等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明Caspase-10/G蛋白或其拮抗剂或激动剂，以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约0.1纳克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的蛋白质还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的Caspase-10/G蛋白施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约1微克/天，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约1微克/天-约0.5毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
一种检测样品中是否存在Caspase-10/G蛋白的方法是利用Caspase-10/G蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与Caspase-10/G蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在Caspase-10/G蛋白。
Caspase-10/G蛋白的多核苷酸可用于Caspase-10/G蛋白相关疾病的诊断和治疗。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列或DNA芯片上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用Caspase-10/G蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测Caspase-10/G蛋白的转录产物。
本发明还提供了一种检测肿瘤的试剂盒，它含有特异性扩增Caspase-10/G的引物对和/或Caspase-10/G特异性抗体。此外，还可含有特异性探针和/或PCR缓冲液等。
表达分析结果表明，Caspase-10/G基因在肿瘤组织中高表达，在正常细胞中不表达或表达量很低。因此，Caspase-10/G可能是一个有效的肿瘤标志物，在众多的癌症的诊断和治疗中发挥作用。
鉴于Caspase-10/G可能是一个肿瘤细胞特有的免疫排斥性抗原，分泌到体液中。因此，血样或尿液中的Caspase-10/G的直接测定除了可以作为肿瘤的辅助诊断和愈后的观察指标之外，也可作为肿瘤早期诊断的依据。
除了作为诊断手段，Caspase-10/G在肿瘤的外科手术上也有很大的应用价值，有助于确定肿瘤的浸润的深度，具体边缘及隐藏的部分。放射免疫指导外科(radioimmunoguided surgery，RIGS)是将标记放射性同位素标记的肿瘤相关抗原的抗体，注射到体内进行显像分析，它可以准确定位肿瘤浸润的范围。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明的Caspase-10/G是一种新的肿瘤和免疫相关凋亡因子，同时又属于蛋白酶类，因此是药物开发的极好靶点，抑制或者诱导Caspase-10/G活性是调节细胞凋亡的有效途径。
(2)有利于建立针对Caspase-10/G的药物筛选模型，寻找能调节Caspase-10/G活性的小分子化合物，为疾病的诊断、治疗带来新途径。
(3)本发明的Caspase-10/G在人肿瘤组织中的表达要高于在正常组织中的表达，因而可以作为一种有效的肿瘤标志物。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
除非另外说明，常规的PCR、酶切、连接，感受态细胞的制备、质粒转化和提取、免疫沉淀、酵母双杂交等操作，以及常规的试剂及使用方法参照分子克隆实验指南中所描述的。
实施例1、Caspase-10/G基因的获得
在研究caspase-10基因时，本发明人应用PCR技术，通过如下引物在人的Jurkat cDNA文库中意外地获得大约800bp的DNA片段，并回收PCR产物，连接T-easy载体。
正向引物(SEQ ID NO：3)：
5’ggccaatccggccatgaaatctcaaggtcaacattggtattc 3’
反向引物(SEQ ID NO：4)：
5’ggcctctaaggccctatattgaaagtgcatccaggggcacag 3’
其中斜体部分是为了下游克隆方便而使用的SfiI酶切接头序列。经测序，获得一个793bp的片段，该片段3’端具有一段长54bp的特异序列，在已知的其他6个Caspase-10剪接体中不含有。比对染色体组序列发现，该特异序列存在于一个新的外显子中，并发现该特异序列的获得是由于反向引物与模板发生了非特异性退火所致，见图1。
由于54bp的特异序列缺乏EST支持，所以为寻找这个新的Caspase-10剪接体的完整编码区(ORF)，本发明人在含有54bp序列的外显子上进行延伸，规则是：出现gt之前序列不会被剪切而进入内含子中(内含子典型的结构特点是gt…ag规则)。
然后，用延伸后的序列进行blastn搜索EST数据库，发现延伸的序列获得两条EST的支持，分别是BU657322和AW190618，由此进一步支持了这个新的Caspase-10剪接体的存在。Blastn搜索EST数据库的结果见图2。
根据上述EST重新设计如下引物扩增Caspase-10/G，获得一个1127bp的序列(具体见实施例2中SEQ ID NO：1)。
上游引物(SEQ ID NO：5)：
5’ agcaagtcttgaagtctcttcccaag 3’
下游引物(SEQ ID NO：6)：
5’ ggaggtgttaccatttcttttaattaa 3’
由于GenBank数据库已经存在Caspase-10/A，B，C，D，E，F 6个可变剪接体，所以本发明人将该新的剪接体命名为Caspase-10/G。
实施例2、Caspase-10/G基因的序列分析
PCR扩增得到的Caspase-10/G核苷酸序列全长1127bp，其中包含744bp的ORF，具体序列如下(SEQ ID NO：1)：
AGCAAGTCTTGAAGTCTCTTCCCAAGCAAATGGGAGCTTCTTTGGACCTTGGAGCACACAGAGGATT
CTACTTTCTTTAAAACTTTGTTTTCAGGCAATTTCCCTGAGAACCGTTTACTTCCAGAAGATTGGTG
GAGCTTGATCTGAAGGCTGGCC
ATGAAATCTCAAGGTCAACATTGGTATTCCAGTTCAGATAAAAAC
TGTAAAGTGAGCTTTCGTGAGAAGCTTCTGATTATTGATTCAAACCTGGGGGTCCAAGATGTGGAGA
ACCTCAAGTTTCTCTGCATAGGATTGGTCCCCAACAAGAAGCTGGAGAAGTCCAGCTCAGCCTCGGA
TGTTTTTGAACATCTCTTGGCAGAGGATCTGCTGAGTGAGGAAGACCCTTTCTTCCTGGCAGAACTC
CTCTATATCATACGGCAGAAGAAGCTGCTGCAGCACCTCAACTGTACCAAAGAGGAAGTGGAGCGAC
TGCTGCCCACCCGACAAAGGGTTTCTCTGTTTAGAAACCTGCTCTACGAACTGTCAGAAGGCATTGA
CTCAGAGAACTTAAAGGACATGATCTTCCTTCTGAAAGACTCGCTTCCCAAAACTGAAATGACCTCC
CTAAGTTTCCTGGCATTTCTAGAGAAACAAGGTAAAATAGATGAAGATAATCTGACATGCCTGGAGG
ACCTCTGCAAAACAGTTGTACCTAAACTTTTGAGAAACATAGAGAAATACAAAAGAGAGAAAGCTAT
CCAGATAGTGACACCTCCTGTAGACAAGGAAGCCGAGTCGTATCAAGGAGAGGAAGAACTAGTTTCC
CAAACAGATGTTAAGACATTCTTGGAAGCCTTACCG
注：下划线部分为ORF序列，黑框部分为Caspase-10/G特有序列
Caspase-10/G蛋白共含有247个氨基酸，序列如下(SEQ ID NO：2)：
MKSQGQHWYS SSDKNCKVSF REKLLI IDSN LGVQDVENLK FLCIGLVPNK KLEKSSSASD 60
VFEHLLAEDL LSEEDPFFLA ELLYI IRQKK LLQHLNCTKE EVERLLPTRQ RVSLFRNLLY 120
ELSEGIDSEN LKDMIFLLKD SLPKTEMTSL SFLAFLEKQG KIDEDNLTCL EDLCKTVVPK 180
LLRNIEKYKR EKAIQIVTPP VDKEAESYQG EEELVSQTDV KTFLEALPEG VFVFLNEGDR 240
GNSPDDL 247
Caspase-10/G和其他6个caspase-10可变剪接体的基因结构图如图3所示。其中A-F指目前已知的6个caspase-10可变剪接体。方块1-12代表caspase-10的十二个外显子，包括caspase-10/G自身特有的外显子x，位于caspase-10原有的第五个外显子和第六个外显子之间。
采用clustalw(1.82)软件(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)对7个Caspase-10剪接体蛋白序列进行比对，获得如图4结果。
从图4可以观察到，Caspase-10/G仅含有两个重复的死亡效应域而不含有保守的蛋白酶结构域。
实施例3、Caspase-10/G的组织分布
本发明人以Caspase-10/G的特异引物进行RT-PCR，以确定Caspase-10/G在人直肠正常组织和直肠肿瘤组织中的表达情况。
上游引物(SEQ ID NO：7)：
5’ATGAAATCTCAAGGTCAACATTGGTATTC 3’
下游引物(SEQ ID NO：8)：
5’CAGGTCATCTGGCGAGTTTCCACGGTCTCCTTC 3’
从RT-PCR结果来看，表明caspase-10/G人直肠癌肿瘤组织中的表达要高于在正常组织中的表达。具体结果见图5，其中选取三个个体，每个个体包括一对样品：N(正常组织)，MT(肿瘤组织)。电泳图中从左到右，相邻泳道为一对。
并且，经试验在其它多种人体组织中也有类似的情况。
实施例4、Caspase-10/G对NF-κB信号通路的影响
NF-κB是调节多种炎性因子基因表达的枢纽，也是细胞凋亡相关的，多种因素可以诱导NF-κB的活化，包括TNF-α等。
本发明人选用293T细胞株，建立了应用荧光素酶作为报告基因检测哺乳动物细胞NF-κB活性的筛选平台，利用报告基因与靶基因共转染途径，检测报告基因荧光素酶活性，以发现对筛选通路有影响的功能基因，发现与肿瘤及自身免疫病的相关基因。其中荧光素酶的表达及活性就会依赖于细胞内NF-κB转录因子的激活或抑制。研究中发现caspase-10/G能激活NF-κB报告基因活性，而caspase-9对此无激活作用。具体实施如下：
通过常规方法，首先从Jurkat cDNA文库中分别获得caspase 9及caspase-10/G基因全长，PCR产物回收后进行酶切，再连接于含有HA的真核表达载体pCDEF-HA(pCDEF载体参见美国专利US20020076415A1，用常规方法将HA基因克隆到pCDEF载体的BamHI和EcoRI酶切位点中即得到pCDEF-HA)的HA片段后，获得质粒pCDEF-HA-caspase 9，及pCDEF-HA-caspase-10/G。其中caspase-10/G的引物序列如下：
正向引物(SEQID NO：9)：
5’AAAGGCCAATCCGGCCATGAAATCTCAAGGTCAACATTGGTATTCCAG 3’
反向引物(SEQ ID NO：10)：
5’AAAGGCCTCTAAGGCCCTACAGGTCATCTGGCGAGTTTCCACG 3’
将293T细胞以8×104/500μl的密度接种至24孔皿，培养24小时后用Lipofectamine 2000试剂(购自Invitrogen公司)及推荐方法进行转染。每孔总的转染质粒量0.5μg，包括0.1μg NF-Kb报告基因质粒(pNF-κB-Luc，购自Clonetech)和0.4μg的目的质粒(pCDEF-HA-caspase 9，及pCDEF-HA-caspase-10/G)，每个样品作3个重复孔以消除实验误差；设立pCDEF-HA空载体作为空白对照(MOCK)。转染后24小时，吸干培养液，24孔板中每孔加入100μl的1×PBL缓冲(buffer)裂解液，在摇床上振荡10-15分钟。置于冰上后，取出5μl裂解液，加入发光管中，在生物发光检测仪上进行检测。PBL buffer与荧光素酶检测底物均来自“Promega Dual-luciferase assaysystem”(购自Promega公司)。
结果显示，caspase-10/G能显著增加NF-κB报告基因活性，而caspase-9对此无激活作用，与对照相比caspase-10/G能使NF-κB报告基因活性提高28.15倍，见图6。
由于NF-κB是调节多种炎性因子基因表达的枢纽，也是细胞凋亡相关的，从而表明caspase-10/G也与细胞凋亡调节、自身免疫及炎症反应相关。
实施例5、Caspase-10/G在Hela细胞中对细胞凋亡的影响
RIP能与Fas和TNFR-1两种受体结合，其在细胞中的过表达可引起细胞凋亡。Caspase-10/D是caspase 10的一个剪接体，以往的研究已证明其在细胞中的过量表达也可引起细胞调亡。因此本实施例中将这两个蛋白作为调亡是否严重的阳性对照。
首先通过PCR技术从Jurkat cDNA文库中获得RIP及Caspase-10/D(Casp10/D)的基因全长，PCR产物回收后进行酶切，再连接于真核表达载体pCDEF-HA中HA片段之后，获得质粒pCDEF-HA-RIP，及pCDEF-HA-caspase-10/D。将Hela细胞以3×105/2ml的密度接种至6孔皿中，培养24小时后用Lipofectamine 2000试剂(购自Invitrogen)进行转染。各转染质粒均使用2μg，Mock对照使用pCDEF-HA空载体，阳性对照使用pCDEF-HA-RIP，及pCDEF-HA-caspase-10/D。转染后5小时进行细胞换液，24小时后收获细胞，离心后以1×结合缓冲液(bindingbuffer，10mM HEPES，140mM NaCl，2.5mM CaCl2，pH7.4)洗涤两次，最后重悬于100μl 1×结合缓冲液(binding buffer)中，每管加5μl的PE-Annexin V和10μl 7-AAD(均购自Becton Dickinson公司)，混匀后于室温避光染色15分钟，流式细胞仪用FL3-FL2检测细胞凋亡情况，采用CellQuest软件进行凋亡分析，实验结果见图7。
为保证结果可靠性，共进行三次实验，结果见表2及图8，图8为取表2中三次平均值，获得柱形图。
表2 Hela细胞中转染各质粒的三次细胞调亡结果
| Mock | Casp10/D | Casp10/G | RIP | ||
| 1 | 早期 | 13.35 | 34.41 | 25.25 | 68.67 |
| 晚期 | 4.64 | 3.16 | 3.53 | 3.09 | |
| 凋亡 | 17.99 | 37.57 | 28.78 | 71.76 | |
| 2 | 早期 | 14.68 | 32.44 | 26.68 | 65.73 |
| 晚期 | 3.61 | 4.64 | 4.59 | 3.13 |
| 凋亡 | 18.29 | 37.08 | 31.27 | 68.86 | |
| 3 | 早期 | 12.84 | 42.14 | 27.56 | 61.78 |
| 晚期 | 5.08 | 0.56 | 4.06 | 0.67 | |
| 凋亡 | 17.92 | 42.7 | 31.62 | 62.45 | |
| 平均 | 18.06667 | 39.1166667 | 30.5566667 | 67.69 |
由上述结果可以看出，Caspase-10/G在Hela细胞中具有诱导凋亡的作用。
实施例6兔抗Caspase-10/G蛋白抗体的制备
选择Caspase-10/G特异性的一段氨基酸序列作为人工抗原的多肽组成，氨基酸序列如下：EGVFVFLNEGDRGN(SEQ ID NO：11)，并通过反相HPLC纯化。将此肽段与血蓝蛋白(KLH)偶联，取体重为2公斤左右的雄性新西兰大耳兔一只。以上述2mg肽-KLH复合物加福氏完全佐剂，在兔颈部皮下多点注射。饲养半个月后，再次以上述肽-KLH复合物加福氏完全佐剂，在兔颈部皮下或皮内多点注射。
以后每隔三周用肽-KLH复合物加福氏不完全佐剂(1∶1)皮下及皮内多点注射，共注射5次，最后一次每只静脉注射1mg，以加强免疫。免疫注射后耳缘静脉取血测定抗血清效价。最后一次注射1周后，大耳兔颈静脉放血，4℃静置过夜，2,000转离心3分钟。上层血清即为兔抗Caspase-10/G蛋白抗体。
杂交结果显示，抗Caspase-10/G蛋白抗体可与Caspase-10/G蛋白专一性地结合。
实施例7筛选促进细胞凋亡的化合物的方法
本实施例用于筛选促进细胞凋亡的化合物，Hela细胞培养物的准备以及凋亡的检测方法如实施例5。
建立测试组：Hela细胞培养物，其中添加待筛选的候选物；
建立对照组：Hela细胞培养物，其中不添加待筛选的候选物。
检测测试组中Hela细胞培养物的细胞凋亡状况，并与对照组中细胞凋亡状况进行比较。
如果测试组中的细胞凋亡状况在统计学上高于(比如高30％及以上)对照组，就表明该候选物是促进细胞凋亡的化合物。
实施例8检测样品中是否存在Caspase-10/G蛋白的方法
利用实施例6制备的兔抗Caspase-10/G蛋白抗体，对检测的组织样品进行免疫组织化学或者Western blot鉴定，观察检测的组织样品中是否存在Caspase-10/G蛋白。
利用实施例3中的方法，在RNA水平上检测组织样品中是否存在Caspase-10/G蛋白。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>上海睿星基因技术有限公司
<120>肿瘤和免疫相关的调控因子Caspase-10/G
<130>053608
<160>11
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1127
<212>DNA
<213>智人
<400>1
agcaagtctt gaagtctctt cccaagcaaa tgggagcttc tttggacctt ggagcacaca 60
gaggattcta ctttctttaa aactttgttt tcaggcaatt tccctgagaa ccgtttactt 120
ccagaagatt ggtggagctt gatctgaagg ctggccatga aatctcaagg tcaacattgg 180
tattccagtt cagataaaaa ctgtaaagtg agctttcgtg agaagcttct gattattgat 240
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gatctgctga gtgaggaaga ccctttcttc ctggcagaac tcctctatat catacggcag 420
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cgacaaaggg tttctctgtt tagaaacctg ctctacgaac tgtcagaagg cattgactca 540
gagaacttaa aggacatgat cttccttctg aaagactcgc ttcccaaaac tgaaatgacc 600
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tgcctggagg acctctgcaa aacagttgta cctaaacttt tgagaaacat agagaaatac 720
aaaagagaga aagctatcca gatagtgaca cctcctgtag acaaggaagc cgagtcgtat 780
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ctcctggagc ttggcaaagg ctgggcaaac gcccacctga agactatgca ggcaatcagg 960
acatgacaca gagccgggag aggcctgctc ttcggctctg ccctgaacct cattcggcag 1020
gtggaggtat ttaggcattt gagggaatct cagctttggg aggccacttt gtaagtgatc 1080
ttaagagatt aagtacatcc ttaattaaaa gaaatggtaa cacctcc 1127
<210>2
<211>247
<212>PRT
<213>智人
<400>2
Met Lys Ser Gln Gly Gln His Trp Tyr Ser Ser Ser Asp Lys Asn Cys
1 5 10 15
Lys Val Ser Phe Arg Glu Lys Leu Leu Ile Ile Asp Ser Asn Leu Gly
20 25 30
Val Gln Asp Val Glu Asn Leu Lys Phe Leu Cys Ile Gly Leu Val Pro
35 40 45
Asn Lys Lys Leu Glu Lys Ser Ser Ser Ala Ser Asp Val Phe Glu His
50 55 60
Leu Leu Ala Glu Asp Leu Leu Ser Glu Glu Asp Pro Phe Phe Leu Ala
65 70 75 80
Glu Leu Leu Tyr Ile Ile Arg Gln Lys Lys Leu Leu Gln His Leu Asn
85 90 95
Cys Thr Lys Glu Glu Val Glu Arg Leu Leu Pro Thr Arg Gln Arg Val
100 105 110
Ser Leu Phe Arg Asn Leu Leu Tyr Glu Leu Ser Glu Gly Ile Asp Ser
115 120 125
Glu Ash Leu Lys Asp Met Ile Phe Leu Leu Lys Asp Ser Leu Pro Lys
130 135 140
Thr Glu Met Thr Ser Leu Ser Phe Leu Ala Phe Leu Glu Lys Gln Gly
145 150 155 160
Lys Ile Asp Glu Asp Asn Leu Thr Cys Leu Glu Asp Leu Cys Lys Thr
165 170 175
Val Val Pro Lys Leu Leu Arg Asn Ile Glu Lys Tyr Lys Arg Glu Lys
180 185 190
Ala Ile Gln Ile Val Thr Pro Pro Val Asp Lys Glu Ala Glu Ser Tyr
195 200 205
Gln Gly Glu Glu Glu Leu Val Ser Gln Thr Asp Val Lys Thr Phe Leu
210 215 220
Glu Ala Leu Pro Glu Gly Val Phe Val Phe Leu Asn Glu Gly Asp Arg
225 230 235 240
Gly Asn Ser Pro Asp Asp Leu
245
<210>3
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
<400>3
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aaaggcctct aaggccctac aggtcatctg gcgagtttcc acg 43
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<212>PRT
<213>人工序列
<400>11
Glu Gly Val Phe Val Phe Leu Asn Glu Gly Asp Arg Gly Asn
1 5 10
Claims (10)
1.一种分离的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-10/G多肽，其特征在于，它选自下组：
(1)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；
(2)具有诱导凋亡功能的SEQ ID NO：2的保守性变异多肽、活性片段、或活性衍生物。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽选自下组：
(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；
(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过1-10个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有诱导凋亡功能的由(a)衍生的多肽。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它编码权利要求1所述的多肽。
4.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。
5.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它选自下组：
(a)用权利要求4所述的载体转化或转导的宿主细胞；
(b)用权利要求3所述的多核苷酸转化或转导的宿主细胞。
6.一种权利要求1所述的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-10/G蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包含步骤：
(a)在表达条件下，培养权利要求5所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-10/G蛋白。
7.一种能与权利要求1所述的多肽特异性结合的抗体。
8.权利要求1所述的多肽或其编码基因的用途，其特征在于，用于
(1)制备调节细胞凋亡的药物；
(2)筛选调节细胞凋亡的化合物；
(3)制备治疗自身免疫疾病或炎症的药物；或
(4)筛选抑制自身免疫疾病或炎症的化合物。
9.一种检测样品中是否存在天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-10/G蛋白的方法，其特征在于，包括：
将样品与天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-10/G蛋白特异性结合的抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-10/G蛋白。
10.一种筛选促进细胞凋亡的化合物的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)在测试组中，向过表达天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-10/G的细胞培养物中添加待筛选的候选物，并检测培养物中细胞凋亡状况；
(b)将步骤(a)测试组中细胞凋亡状况与对照组中细胞凋亡状况进行比较，对照组的细胞为过表达天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-10/G但不加入候选物的细胞，
如果测试组中的细胞凋亡状况在统计学上高于对照组，就表明该候选物是促进细胞凋亡的化合物。
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2006
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Cited By (2)
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20070718 |