CN110545837A - 与自体诱导物相关的通路在诱导凋亡和抗感染治疗中的应用 - Google Patents
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Abstract
TNFR1‑FADD‑caspase8‑caspase3通路抑制剂在用于治疗由自体诱导物引起的、与免疫系统相关的疾病的药物的制备中的用途,用于筛选用于治疗由自体诱导物引起的、与免疫系统相关的疾病的药物的方法,以及治疗由自体诱导物引起的与免疫系统相关的疾病的方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药,更具体地涉及TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路抑制剂在用于治疗由自体诱导物引起的、与免疫系统相关的疾病的药物的制备中的用途,用于筛选用于治疗由自体诱导物引起的、与免疫系统相关的疾病的药物的方法,以及用于治疗与免疫系统相关的疾病的方法。
背景技术
群体感应(QS)是原核生物中的基于化学的通信机制。由选择个体释放的QS自体诱导物被群体内的其他成员的细胞内受体感测到,导致群体的集体等基因自体诱导物的合成和与宿主共生的同步活动、致病性、和生物膜形成。铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa,简称PA,又称绿脓杆菌)是导致严重机会性感染的病原体。在PA中,LasR-LasIQS回路使用N-3-氧代-十二酰基-高丝氨酸内酯(3OC12 HSL或3OC)作为自体诱导物,该自体诱导物代表了一组成员众多的自体诱导物,它们的主要不同在于酰基链的长度。虽然QS设计为一个独立的微生物回路,它对哺乳动物宿主,从细胞死亡的诱导、转录调控、免疫调节、到炎症和免疫细胞死亡,有广泛的影响。
由于TLR和NLR不参与其信号传导,QS分子如何调解不同宿主反应仍然是不确定的。
发明内容
本发明的实施方式寻求至少在某种程度上解决现有技术中存在的至少一个问题,或者向消费者提供一种有用的商业选择。
在此,本发明人发现了一个意想不到的机制,即,真核细胞膜特有的有序脂质结构域在存在HSL的情况下是可以溶解的。这又导致TNF受体1(TNFR1)被强制排出到细胞膜的无序相。位置移动的TNFR1在活细胞膜上表现出更高的运动速度和更扩展的迁移轨迹,导致更高程度的自发三聚化和TNFR1信号传递而无需外部配体。这种分布的变化驱动caspase8-caspase3轴激活和凋亡性细胞死亡的整个过程。这些发现提出一种关于真核细胞如何感知微生物的代谢产物的先前未知的机制。
根据本发明的第一方面的实施方式,提供了TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路抑制剂在用于治疗由自体诱导物引起的、与免疫系统相关的疾病的药物的制备中的用途。根据这些实施方式,自体诱导物,比如3OC12 HSL,能激活免疫细胞TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路,然后诱导免疫细胞凋亡,并引起与免疫系统相关的疾病。而且,本发明人发现,TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路抑制剂在治疗由自体诱导物引起的、与免疫系统相关的疾病时显示出显著的治疗效果。
根据本发明的实施方式,上面提到的用途可以具有以下附加特征中的至少一个:
根据本发明的实施方式,所述自体诱导物来自铜绿假单胞菌。根据这些实施方式,本发明人发现,TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路抑制剂在治疗由来自铜绿假单胞菌的自体诱导物引起的、与免疫系统相关的疾病时显示出更显著的治疗效果。
根据本发明的实施方式,所述与免疫系统相关的疾病是与铜绿假单胞菌感染相关的疾病。通过实验发现,TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路抑制剂在治疗与铜绿假单胞菌感染相关的疾病时显示出更显著的治疗效果。
根据本发明的实施方式,所述TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路抑制剂是选自下组的至少一种抑制剂:TNFR1抑制剂、TNFR1三聚化抑制剂、FADD抑制剂、caspase抑制剂。本发明人发现,TNFR1抑制剂、TNFR1三聚化抑制剂、FADD抑制剂、caspase抑制剂能够有效地阻断被自体诱导物激活的TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路。TNFR1抑制剂、TNFR1三聚化抑制剂、FADD抑制剂、caspase抑制剂在治疗由自体诱导物引起的、与免疫系统相关的疾病时显示出更显著的治疗效果。
根据本发明的实施方式,所述TNFR1三聚化抑制剂包括:(a)、针对TNFR1的竞争性抑制剂肽;或者(b)、表达(a)的核酸或构建体。已经发现,阻断TNFR1三聚化能够有效抑制TNFR1激活。还发现针对TNFR1的竞争性抑制剂肽或者表达该肽的核酸或构建体是有效的TNFR1三聚化抑制剂。针对TNFR1的竞争性抑制剂肽或者表达该肽的核酸或构建体在治疗由自体诱导物引起的、与免疫系统相关的疾病时显示出显著的治疗效果。
根据本发明的实施方式,所述针对TNFR1的竞争性抑制剂肽是类TNFR T2(TNFR-like T2)。通过实验发现,类TNFR T2在抑制TNFR1三聚化时显示出更显著的效果。
根据本发明的实施方式,所述TNFR1抑制剂包括选自下组的至少一种:TNFR1表达抑制剂、TNFR1突变诱导剂、TNFR1功能抑制剂、TNFR1功能类似物。以上所示的TNFR1抑制剂能够抑制TNFR1表达或抑制TNFR1激活,然后有效防止自体诱导物引起的细胞凋亡。
根据本发明的实施方式,所述FADD抑制剂包括选自下组的至少一种:FADD表达抑制剂、FADD突变诱导剂、FADD功能抑制剂、FADD功能类似物。以上所示的FADD抑制剂能够抑制FADD表达或抑制FADD激活,然后有效防止自体诱导物引起的细胞凋亡。
根据本发明的实施方式,所述caspase抑制剂包括选自下组的至少一种:Z-VAD、Z-DEVD、Z-IETD、Emricasan、对caspase具有特异性的shRNA、通过激活RIP1诱导从caspase通路偏离的物质。以上所示的caspase抑制剂能够抑制caspase表达或抑制caspase激活,然后有效防止自体诱导物引起的细胞凋亡。
根据本发明的实施方式,所述自体诱导物是C8~12烷基酰基高丝氨酸内酯或其衍生物。通过实验发现,C8~12烷基酰基高丝氨酸内酯或其衍生物可以诱导免疫细胞凋亡和严重引起与免疫系统相关的疾病。TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路抑制剂在治疗由C8~12烷基酰基高丝氨酸内酯或其衍生物引起的、与免疫系统相关的疾病时显示出显著的治疗效果。
根据本发明的实施方式,所述自体诱导物是C12烷基酰基高丝氨酸内酯或其衍生物。本发明人发现,TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路抑制剂在治疗由C12烷基酰基高丝氨酸内酯或其衍生物引起的、与免疫系统相关的疾病时显示出更显著的治疗效果。
根据本发明的第二方面的实施方式,提供了一种用于筛选用于治疗由自体诱导物引起的、与免疫系统相关的疾病的药物的方法,包括:(1)、使候选化合物与免疫细胞接触;(2)、在所述接触之前和之后,确定下列中的至少一种:(a)、细胞表面TNFR1的三聚化水平;(b)、TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路的激活水平,其中,所述细胞表面TNFR1的三聚化水平的降低或所述TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路的激活水平的降低表示所述候选化合物是用于治疗由自体诱导物引起的、与免疫系统相关的疾病的药物。根据这些实施方式,上面描述的方法可以有效地筛选由自体诱导物引起的、与免疫系统相关的疾病的药物。
根据本发明的实施方式,上面提到的方法可以具有以下附加特征的至少一个:
根据本发明的实施方式,所述自体诱导物是C8~12烷基酰基高丝氨酸内酯或其衍生物。通过实验发现,C8~12烷基酰基高丝氨酸内酯或其衍生物可以显著诱导TNFR1三聚化和激活TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路。该用于筛选用于治疗由自体诱导物(特别是由C8~12烷基酰基高丝氨酸内酯或其衍生物)引起的、与免疫系统相关的疾病的药物的方法得到的结果更可靠。该方法更灵敏。
根据本发明的实施方式,所述自体诱导物是C12烷基酰基高丝氨酸内酯或其衍生物。发现,该用于筛选用于治疗由C12烷基酰基高丝氨酸内酯或其衍生物引起的、与免疫系统相关的疾病的药物的方法得到的结果更加可靠得多。该方法更加灵敏得多。
根据本发明的第三方面的实施方式,提供了一种治疗由自体诱导物引起的、与免疫系统相关的疾病的方法的用途,包括:将TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路抑制剂给药于需要治疗的对象。根据这些实施方式,自体诱导物,比如3OC12 HSL,能激活免疫细胞TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路,然后诱导免疫细胞凋亡,并引起与免疫系统相关的疾病。而且,本发明人发现,将TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路抑制剂给药于需要治疗的对象,在治疗由自体诱导物引起的、与免疫系统相关的疾病时显示出显著的治疗效果。
根据本发明的实施方式,上面提到的用途可以具有以下附加特征中的至少一个:
根据本发明的实施方式,所述自体诱导物来自铜绿假单胞菌。根据这些实施方式,本发明人发现,TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路抑制剂在治疗由来自铜绿假单胞菌的自体诱导物引起的、与免疫系统相关的疾病时显示出更显著的治疗效果。
根据本发明的实施方式,所述与免疫系统相关的疾病是与铜绿假单胞菌感染相关的疾病。通过实验发现,TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路抑制剂在治疗与铜绿假单胞菌感染相关的疾病时显示出更显著的治疗效果。
根据本发明的实施方式,所述TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路抑制剂是选自下组的至少一种抑制剂:TNFR1抑制剂、TNFR1三聚化抑制剂、FADD抑制剂、caspase抑制剂。本发明人发现,TNFR1抑制剂、TNFR1三聚化抑制剂、FADD抑制剂、caspase抑制剂能够有效地阻断被自体诱导物激活的TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路。TNFR1抑制剂、TNFR1三聚化抑制剂、FADD抑制剂、caspase抑制剂在治疗由自体诱导物引起的、与免疫系统相关的疾病时显示出更显著的治疗效果。
根据本发明的实施方式,所述TNFR1三聚化抑制剂包括:(a)、针对TNFR1的竞争性抑制剂肽;或者(b)、表达(a)的核酸或构建体。已经发现,阻断TNFR1三聚化能够有效抑制TNFR1激活。还发现针对TNFR1的竞争性抑制剂肽或者表达该肽的核酸或构建体是有效的TNFR1三聚化抑制剂。针对TNFR1的竞争性抑制剂肽或者表达该肽的核酸或构建体在治疗由自体诱导物引起的、与免疫系统相关的疾病时显示出显著的治疗效果。
根据本发明的实施方式,所述针对TNFR1的竞争性抑制剂肽是类TNFR T2。通过实验发现,类TNFR T2在抑制TNFR1三聚化时显示出更显著的效果。
根据本发明的实施方式,所述TNFR1抑制剂包括选自下组的至少一种:TNFR1表达抑制剂、TNFR1突变诱导剂、TNFR1功能抑制剂、TNFR1功能类似物。以上所示的TNFR1抑制剂能够抑制TNFR1表达或抑制TNFR1激活,然后有效防止自体诱导物引起的细胞凋亡。
根据本发明的实施方式,所述FADD抑制剂包括选自下组的至少一种:FADD表达抑制剂、FADD突变诱导剂、FADD功能抑制剂、FADD功能类似物。以上所示的FADD抑制剂能够抑制FADD表达或抑制FADD激活,然后有效防止自体诱导物引起的细胞凋亡。
根据本发明的实施方式,所述caspase抑制剂包括选自下组的至少一种:Z-VAD、Z-DEVD、Z-IETD、Emricasan、对caspase具有特异性的shRNA、通过激活RIP1诱导从caspase通路偏离的物质。以上所示的caspase抑制剂能够抑制caspase表达或抑制caspase激活,然后有效防止自体诱导物引起的细胞凋亡。
根据本发明的实施方式,所述自体诱导物是C8~12烷基酰基高丝氨酸内酯或其衍生物。通过实验发现,C8~12烷基酰基高丝氨酸内酯或其衍生物可以诱导免疫细胞凋亡和严重引起与免疫系统相关的疾病。TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路抑制剂在治疗由C8~12烷基酰基高丝氨酸内酯或其衍生物引起的、与免疫系统相关的疾病时显示出显著的治疗效果。
根据当前公开的实施方式,所述自体诱导物是C12烷基酰基高丝氨酸内酯或其衍生物。本发明人发现,TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路抑制剂在治疗由C12烷基酰基高丝氨酸内酯或其衍生物引起的、与免疫系统相关的疾病时显示出更显著的治疗效果。
上述本发明的发明内容部分并非试图描述本发明的每个公开的实施方式或每种实施方案。随后的附图和具体实施方式部分更具体地举例说明实施方式。
本发明的实施方式的其他方面和优点有一些将在后面的说明中给出,有一些从后面的说明变得显而易见或者从本发明的实施方式的实施中获悉。
附图说明
通过下面参照附图的描述,本发明的实施方式的这些和其他方面和优点将变得显而易见和更容易理解,在附图中:
图1示出3OC12 HSL抑制T细胞激活(作为细胞凋亡的结果);
图2示出3OC12 HSL诱导哺乳动物细胞的外源性凋亡;
图3示出3OC12 HSL诱导人细胞中的caspase 8和caspase 3剪切;
图4示出FADD对于3OC12 HSL诱导的凋亡是必不可少的;
图5示出caspase 8或TNFR1缺失部分地补救3OC12 HSL诱导的细胞凋亡;
图6示出3OC12 HSL引起耐凋亡细胞中的NFκb激活;
图7示出3OC12 HSL在质膜中富集;
图8示出3OC12 HSL破坏质膜的结构并诱导TNFR1自动三聚化;
图9示出3OC12 HSL促进TNFR1三聚化但不促进FAS三聚化;
图10示出人TNFR1结构域图示;
图11示出3OC12 HSL诱导TNFR1移动到非脂筏区域;
图12示出TNFR1胞外结构域中的关键氨基酸的突变对3OC12 HSL诱导的TNFR1三聚化的影响;
图13示出存在3OC12 HSL时的脂质结构域;
图14示出MβCD对质膜上的TNFR1的行为具有类似于3OC12 HSL的影响;
图15示出3OC12 HSL诱导的外源性凋亡促进了PA感染并改变了质膜上的其它受体的行为;
图16示出在没有3OC12 HSL的情况下,TNFR1信号传导通路对于急性PA感染的严重程度是不重要的;以及
图17示出Emricasan阻断人THP-1细胞系和小鼠脾细胞中3OC12-HSL的细胞凋亡作用。
具体实施方式
下面将结合具体实施方式对本发明作进一步说明。在此参照附图描述的实施方式是解释性的、说明性的、并用于一般地理解本发明。实施方式不应当被解释为限制本发明。相同或相似的元件和具有相同或相似功能的元件在整个说明书中用相同的附图标号表示。
此外,在本文中使用术语如“第一”和“第二”是为了描述方便,并不旨在指示或暗示重要性或显著性的相对大小。
TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路抑制剂的用途
根据本发明的第一方面的实施方式,提供了TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路抑制剂在用于由治疗由自体诱导物引起的、与免疫系统相关的疾病的药物的制备中的用途。
其中TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路是指,通过TNFR1激活,FADD被召回到内细胞膜并与TNFR1的胞内结构域相关联。FADD又与caspase-8相关联,将caspase-8激活。然后,被激活的caspase-8剪切pro-Caspase-3而生成成熟的Caspase-3,用于下游的凋亡性细胞死亡。根据这些实施方式,自体诱导物,比如3OC12 HSL,能激活免疫细胞TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路,然后诱导免疫细胞凋亡,并引起与免疫系统相关的疾病。而且,本发明人发现,TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路抑制剂在治疗由自体诱导物引起的与免疫系统相关的疾病时显示出显著的治疗效果。
根据本发明的一个实施方式,自体诱导物来自铜绿假单胞菌。铜绿假单胞菌(PA)是导致严重机会性感染的病原体。在PA中,LasR-LasI QS回路使用N-3-氧代-十二酰基-高丝氨酸内酯(3OC12 HSL或3OC)作为自体诱导物,该自体诱导物代表了一组成员众多的自体诱导物,它们的主要不同在于酰基链的长度。根据这些实施方式,本发明人发现,铜绿假单胞菌(PA)导致TNF受体1(TNFR1)被强制排出到细胞膜的无序相。移动位置后的TNFR1在活细胞膜上表现出更高的运动速度和更扩展的迁移轨迹,导致更高程度的自发三聚化和TNFR1信号传递而无需外部配体。这种分布的变化驱动caspase8-caspase3轴激活和凋亡性细胞死亡的整个过程。本发明人发现,在治疗由来自铜绿假单胞菌的自体诱导物引起的、与免疫系统相关的疾病和与铜绿假单胞菌感染相关的疾病时,TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路抑制剂显示出更显著的治疗效果。
根据本发明的一些实施方式,TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路抑制剂是选自下组的至少一种抑制剂:TNFR1抑制剂、TNFR1三聚化抑制剂、FADD抑制剂、caspase抑制剂。
根据本发明的一个实施方式,TNFR1三聚化抑制剂包括:(a)、针对TNFR1的竞争性抑制剂肽,比如类TNFR T2;或者(b)、表达(a)的核酸或构建体。其中,针对TNFR1的竞争性抑制剂肽是这样的合成或重组的多肽:其可以干扰TNFα与TNFR1的结合以降低TNFR-1配体诱导的三聚化。还发现,针对TNFR1的竞争性抑制剂肽或者表达该肽的核酸或构建体是有效的TNFR1三聚化抑制剂。在治疗由自体诱导物引起的、与免疫系统相关的疾病时,针对TNFR1的竞争性抑制剂肽或者表达该肽的核酸或构建体显示出显著的治疗效果。
根据本发明的一个实施方式,TNFR1抑制剂包括选自下组的至少一种:TNFR1表达抑制剂、TNFR1突变诱导剂、TNFR1功能抑制剂、TNFR1功能类似物。其中,TNFR1表达抑制剂是用于抑制TNFR1表达的物质,包括但不限于NFκb通路抑制剂。其中,TNFR1突变诱导剂是用于诱导TNFR1功能丧失性突变的物质,包括但不限于用于诱导TNFR1棕榈酰化的物质。其中,TNFR1功能抑制剂是抑制TNFR1激活的物质,包括但不限于对TNFR1具有特异性的抗体。其中,TNFR1功能类似物是TNFR1的竞争性拮抗剂。以上示出的TNFR1抑制剂可以抑制TNFR1表达或抑制TNFR1激活,从而有效地防止自体诱导物引起的细胞凋亡。
根据本发明的另一个实施方式,FADD抑制剂包括选自下组的至少一种:FADD表达抑制剂、FADD突变诱导剂、FADD功能抑制剂、FADD功能类似物。其中,FADD表达抑制剂是用于抑制FADD表达的物质。其中,FADD突变诱导剂是用于诱导FADD功能丧失性突变的物质。其中,FADD功能抑制剂是抑制FADD激活的物质,包括但不限于显性阴性FADD和NSC 47147(小分子抑制剂)的表达。其中,FADD功能类似物是FADD的竞争性拮抗剂。以上示出的FADD抑制剂可以抑制FADD表达或抑制FADD激活,从而有效地防止自体诱导物引起的细胞凋亡。
根据本发明的另一个实施方式,caspase抑制剂包括选自下组的至少一种:Z-VAD、Z-DEVD、Z-IETD、Emricasan、对caspase具有特异性的shRNA、通过激活RIP1诱导从caspase通路偏离的物质。其中,通过激活RIP1从caspase通路偏离是指,取决于细胞类型,RIP1激活可导致与NFκb相关的细胞信号传导和激活处理后的细胞的MAPK信号传导,而不是常规的与细胞死亡相关的细胞凋亡信号传导。以上示出的caspase抑制剂可以抑制caspase的表达或抑制caspase的激活,从而有效地防止自体诱导物引起的细胞凋亡。
根据本发明的实施方式,自体诱导物是C8~12烷基酰基高丝氨酸内酯或其衍生物。通过实验发现,C8~12烷基酰基高丝氨酸内酯或其衍生物,特别是C12烷基酰基高丝氨酸内酯或其衍生物,可以诱导免疫细胞凋亡和引起与免疫系统相关的严重疾病。TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路抑制剂在治疗由C8~12烷基酰基高丝氨酸内酯或其衍生物(特别是C8烷基酰基高丝氨酸内酯或其衍生物)引起的、与免疫系统相关的疾病时显示出显著的治疗效果。
此外,根据本发明的另一个更大方面的实施方式,提供了用于治疗由自体诱导物引起的、与免疫系统相关的疾病的方法的用途,包括:将TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路抑制剂给药于需要治疗的对象。如上所述,自体诱导物,比如3OC12 HSL,能够激活免疫细胞TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路,然后诱导免疫细胞凋亡,并引起与免疫系统相关的疾病。此外,发明人还发现,将TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路抑制剂给药于需要治疗的对象,在治疗由自体诱导物引起的与免疫系统相关的疾病时表现出显著的治疗效果。
其中,所述自体诱导物,所述与免疫系统相关的疾病和所述TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路抑制剂都如前所述。
如本文中所使用的,术语“对象”指动物。通常,所述动物是哺乳动物。对象还指例如,灵长类动物(例如,人,男性或女性)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠、鱼、鸟等。在某些实施方式中,对象是灵长类动物。在另一些其它实施方式中,对象是人。
如本文中所使用的,术语任何疾病或不适的“治疗”是指所有过程,其中可以是疾病或不适进展的减缓、中断、中止、控制或停止,但并不必然意味着所有疾病症状的完全消除,以及上述状况的预防性治疗,尤其是对易患这种疾病或不适的患者。在一些实施方式中,“治疗”是指疾病或不适的改善(即,减缓、中止或减少疾病的发展或其临床症状中的至少一种)。在另一些实施方式中,“治疗”是指缓解或改善至少一种身体参数,包括那些患者可能不能辨别的身体参数。在另一些实施方式中,“治疗”是指调节疾病或不适,无论是从身体上(例如,使可辨别症状稳定),还是从生理上(例如,使身体参数稳定),或者两者皆有。在其它实施方式中,“治疗”是指预防或延缓疾病或不适的发作、发展或进展。
如本文中所使用的,术语“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指能够引发个体的生物学或医学应答(比如,降低或抑制酶或蛋白质的活性,或者改善症状,减轻症状,减缓或延缓疾病的发展,或者预防疾病,等等)的本发明的化合物的量。在一个非限制性实施方式中,术语“治疗有效量”是指当本发明的化合物给药至对象时。在其它实施方式中,术语“治疗有效量”是指,当给药至细胞、或器官、或非细胞的生物材料、或介质时,能够至少部分地减少或抑制TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路激活,或者至少部分降低或抑制TNFR1三聚化的本发明的化合物的有效量。
如本文中所使用的,术语化合物的“给药”或“给予”应被理解为是指对有需要的个体提供本发明的抑制剂的化合物或化合物的前体药物。应当认识到,本领域的技术人员可以用有效量的抑制剂的化合物治疗目前患有与免疫系统相关的疾病的患者。
如本文所使用的术语“组合物”旨在涵盖包含指定量的指定成分的产品,以及直接或间接地由指定量的指定成分的组合获得的任何产品。相对于药物组合物,该术语意在涵盖包含活性成分和构成载体的惰性成分,以及直接地或间接地,从任意两种或多种成分的组合、络合或聚集,或者从一种或多种成分的解离,或者从一种或多种成分的其他类型的反应或相互作用得到的任何产品。因此,本发明的药物组合物涵盖通过将化合物和药学上可接受的载体混合而制成的任何组合物。
用于筛选药物的方法
根据本发明的另一大方面的实施方式,提供了用于筛选用于治疗由自体诱导物引起的、与免疫系统相关的疾病的药物的方法,包括:(1)使候选化合物与免疫细胞接触;(2)在所述接触之前和之后,确定下列中的至少一种:(a)、细胞表面TNFR1的三聚化水平;(b)TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路的激活水平,其中,所述细胞表面TNFR1的三聚化水平的降低或所述TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路的激活水平的降低表示所述候选化合物是用于治疗由自体诱导物引起的、与免疫系统相关的疾病的药物。根据这些实施方式,上面描述的方法可以有效地筛选用于治疗由自体诱导物引起的与免疫系统相关的疾病的药物。
根据本发明的实施方式,自体诱导物是C8~12烷基酰基高丝氨酸内酯或其衍生物。通过实验发现,C8~12烷基酰基高丝氨酸内酯或其衍生物,特别是C8烷基酰基高丝氨酸内酯或其衍生物,可以显著诱导TNFR1三聚化和激活TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路。通过用于筛选用于治疗由自体诱导物(特别是C8~12烷基酰基高丝氨酸内酯或其衍生物,尤其是C8烷基酰基高丝氨酸内酯或其衍生物)引起的、与免疫系统相关的疾病的药物的方法得到的结果是更可靠的。该方法更灵敏。
化合物或药物组合物
本发明还提供了包含通过上述方法筛选的化合物的药物组合物。根据本发明的具体实施例,该药物组合物可以进一步包含药学上可接受的赋形剂、载体、佐剂、溶剂及其组合。
本发明提供了治疗、预防或改善疾病或不适的方法,包括给予安全和有效量的含有化合物和一种或多种治疗活性剂的药物的组合。其中,药物的组合包含一种或多种用于治疗由自体诱导物引起的与免疫系统相关的疾病(特别是,与铜绿假单胞菌感染相关的疾病)的附加药物。
用于治疗由自体诱导物引起的与免疫系统相关的疾病(特别是,与铜绿假单胞菌感染相关的疾病)的其他药物,包括但不限于:氨基糖苷类(庆大霉素、丁胺卡那霉素和妥布霉素)、喹诺酮类(环丙沙星和左氧氟沙星)和头孢菌素类(头孢他啶、头孢吡肟、头孢哌酮、头孢匹罗和头孢吡普)。
本文公开的药物组合物的化合物的量是指能有效地抑制TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路或TNFR1三聚化的量。本发明的组合物的活性成分的剂量可以变化,但是,活性成分的量必须是能够获得合适的剂型。活性成分可以以提供最佳药物效能的剂量被给药于需要这种治疗的患者(动物或人)。所选择的剂量取决于所期望的治疗效果、给药途径、和治疗的持续时间。剂量因患者不同而不同,取决于疾病的性质和严重程度、患者的体重、患者随后进食的特殊饮食、同时使用的药物、以及本领域的技术人员会认识到的其他因素。剂量范围通常为每名患者每天约0.5mg至1.0g,可以单次或多次给药。在一个实施方式中,剂量范围为每名患者每天约0.5mg至500mg;在另一个实施方式中,每名患者每天约0.5mg至200mg;在再一个实施方式中,每名患者每天约5mg至50mg。
还应当理解的是,本发明的某些化合物可以以游离形式存在用于治疗,或者在适当时作为其药学上可接受的衍生物或前药。药学上可接受的衍生物包括药学上可接受的盐、酯、这些酯的盐、或者任意其他加合物或衍生物,其在给药于有需要的患者时能够直接或间接地提供如本文另外描述的化合物,或其代谢物或残余物。
本发明的药物组合物可以以散装形式制备和包装,其中安全和有效量的本文公开的式(I)的化合物可以被提取,然后给予患者,例如带有粉末或糖浆的形式。通常,每天以体重的0.0001至10mg/千克的剂量水平给药于患者,以获得TNFR1受体或TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路的有效拮抗作用。本发明的药物组合物可以以单位剂量形式制备和包装,其中,每个物理上离散的单位包含安全和有效量的本文所公开的式(I)的化合物。当以单位剂量形式制备时,本发明的药物组合物通常含有约0.5mg至1g,或1mg至700mg,或5mg至100mg该化合物。
在除了本发明的化合物以外,本发明的药物组合物还含有一种或多种其它活性成分时,本发明的化合物与第二活性成分的重量比可以变化,取决于每种成分的有效剂量。通常,将使用每种成分的有效剂量。因此,例如,当本发明的化合物与另一种物质组合时,本发明的化合物与另一种物质的重量比通常为约1000:1至约1:1000,比如约200:1至1:200。本发明的化合物与其它活性成分的组合通常也在上述范围内,但在每种情况下都应当使用每种活性成分的有效剂量。
如本文所用的,“药学上可接受的赋形剂”是指参与赋予所述药物组合物形态或一致性的药学上可接受的材料、组分或载体。当混合时,每个赋形剂必须与所述药物组合物的其他成分相容,从而避免在给药于对象时显著降低本发明化合物效力的相互作用并避免会导致药学上不可接受的药物成分的相互作用。此外,当然,每个赋形剂必须具有足够高的纯度以使其在药学上可接受。
合适的药学上可接受的赋形剂将根据所选择的具体剂型不同而不同。此外,可以根据它们在组合物中所起的特定功能而选择合适的药学上可接受的赋形剂。例如,某些药学上可接受的赋形剂被选择的原因可以是它们具有有利于制备均匀剂型的能力。某些药学上可接受的赋形剂被选择的原因可以是它们具有有利于生产稳定剂型的能力。某些药学上可接受的赋形剂被选择的原因可以是它们具有有利于将一次给药于患者的本发明的化合物从一个器官或机体的一部分递送或转运到另一个器官或机体的一部分的能力。某些药学上可接受的赋形剂被选择的原因可以是它们具有增加患者依从性的能力。
合适的药学上可接受的赋形剂包括下列类型的赋形剂:稀释剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、成粒剂、包衣剂、润湿剂、溶剂、共溶剂、悬浮剂、乳化剂、增甜剂、调味剂、掩味剂、着色剂、抗结块剂、保湿剂、螯合剂、增塑剂、增粘剂、抗氧化剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂和缓冲剂。本领域技术人员会理解,某些药学上可接受的赋形剂可以提供不止一种功能,而且可以根据制剂中存在多少赋形剂以及制剂中还存在哪些其他成分而提供替代性的功能。
熟练技术人员拥有本领域的知识和技术,使得他们能够选择适当量的合适的药物上可接受的赋形剂用于本发明。此外,熟练技术人员可以利用描述药学上可接受的赋形剂并可用于选择合适的药学上可接受的赋形剂的很多资源。例子包括:《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack出版公司)、《药物添加剂手册》(TheHandbook of Pharmaceutical Additives,Gower出版有限公司)和《药用辅料手册》(Handbook of Pharmaceutical Excipients,美国药物学会和英国药学出版社)。
在《雷明顿:药学科学和实践》(Remington:The Science and Practice ofPharmacy,第21版,2005年版,D.B.Troy编辑,Lippincott Williams&Wilkins出版社,费城)和《制药技术百科全书》(Encyclopedia of Pharmaceutical Technology,J.Swarbrickand J.C.Boylan编辑,1988-1999,Marcel Dekker出版社,纽约)中公开了用于配制药学上可接受的组合物的各种载体和用于其制备的公知技术,它们的内容通过引用结合于此。任何常规载体介质的使用都应该认为在本发明的范围之内,除非它与本发明的化合物不相容,比如,因为产生任何不希望的生物效应或因为以有害的方式与药学上可接受的组合物的任何其他组分相互作用。
本发明的药物组合物使用本领域技术人员公知的技术和方法来制备。本领域常用的一些方法在《雷明顿药物科学》(Mack出版公司)中有描述。
因此,本发明的另一个方面涉及用于制备药物组合物的方法。该药物组合物包含本文公开的化合物和药学上可接受的赋形剂、载体、佐剂、媒介物或它们的组合,该方法包括将各种成分混合。含有本文公开的化合物的药物组合物可以在例如环境温度和大气压力下制备。
本发明的化合物通常配制成适于通过所需给药途径给药于对象的剂型。例如,包括适于以下给药途径的剂型:(1)口服给药,例如片剂、胶囊、囊片、药丸、锭剂、粉末、糖浆、酏剂、混悬剂、溶液剂、乳剂、小袋和扁囊剂;(2)肠胃外给药,例如无菌溶液、混悬剂和用于重新配制的粉末;(3)透皮给药,例如透皮贴片;(4)直肠给药,例如栓剂;(5)吸入,例如气雾剂,溶液剂和干粉末;和(6)局部给药,例如霜剂、膏剂、洗液、溶液剂、糊剂、喷雾剂、泡沫和凝胶。
在一个实施方式中,本文公开的化合物可以制备成口服剂型。在另一个实施方式中,本文公开的化合物可以制备成吸入剂型。在再一个实施方式中,本文公开的化合物可以制备成经鼻给药剂型。在又一个实施方式中,本文公开的化合物可以制备成透皮给药剂型。还有一些实施方式中,本文公开的化合物可以制备成局部给药剂型。
本文提供的药物组合物可以作为压制片剂、模印片剂(tablet triturates)、咀嚼锭剂、速溶片剂、复合压制片剂或者肠溶衣片剂、糖衣片剂或薄膜衣片剂提供。肠溶衣片剂是用抗胃酸作用但在肠中溶解或崩解,因而保护活性成分免收胃的酸性环境影响的物质进行包衣的压制片剂。肠溶衣包括但不限于脂肪酸、脂肪、水杨酸苯酯、蜡、虫胶、氨化虫胶和醋酸邻苯二甲酸纤维素。糖衣片剂是被糖衣包裹的压制片剂,包裹糖衣可有利于掩盖令人讨厌的味道或气味并保护片剂免于氧化。薄膜衣片剂是用水溶性材料的薄层或薄膜覆盖的压制片剂。薄膜衣包括但不限于羟乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙二醇4000和醋酸邻苯二甲酸纤维素。薄膜衣赋予与糖衣相同的一般特性。复合压制片剂是由超过一个压制循环制得的压制片剂,包括多层片剂、以及压制包衣片剂或干法包衣片剂。
片剂剂型可以由粉末状、结晶状或颗粒状的活性成分单独或者与本文所述的一种或多种载体或赋形剂(包括粘合剂、崩解剂、控释聚合物、润滑剂、稀释剂和/或着色剂)一起制得。调味剂和甜味剂在咀嚼片剂和锭剂的制备中尤其有用。
本文提供的药物组合物可以作为软胶囊剂或硬胶囊剂提供,软胶囊剂或硬胶囊剂可以由明胶、甲基纤维素、淀粉或藻酸钙制得。硬明胶胶囊,亦称干法充填的胶囊(dry-filled capsule,DFC),由两节胶囊组成,一节套在另一节上,从而把活性成分完全封闭。软弹性胶囊(soft elastic capsule,SEC)是一种软的球状壳体,例如明胶壳,它是通过加入甘油、山梨醇或类似的多元醇而塑化的。软明胶壳体可含有防止微生物生长的防腐剂。合适的防腐剂是如本文所描述的那些,包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯和山梨酸。本文提供的液体剂型、半固体剂型和固体剂型可以被包封在胶囊中。合适的液体剂型和半固体剂型包括在碳酸丙烯酯、植物油或甘油三酯中的溶液剂和混悬剂。含有这类溶液的胶囊剂可以按美国专利第4,328,245、4,409,239和4,410,545号中描述的方法制备。这些胶囊剂也可按照本领域技术人员公知的方法包衣,以改变或长时间维持活性成分的溶出。
本文提供的药物组合物可以以液体剂型和半固体剂型提供,包括乳剂、溶液剂、混悬剂、酏剂和糖浆剂。乳剂是一种两相体系,其中一种液体以小珠滴的形式分散在另一种液体中,其可以是水包油或油包水的形式。乳剂可以包括药学上可接受的非水液体或溶剂、乳化剂和防腐剂。混悬剂可以包括药学上可接受的悬浮剂和防腐剂。含水醇溶液剂可以包括药学上可接受的乙缩醛,例如低级烷基醛的二(低级烷基)乙缩醛,例如乙醛缩二乙醇;和具有一个或多个羟基的水混溶性溶剂,例如丙二醇和乙醇。酏剂是清亮的、有甜味的和含水醇的溶液。糖浆剂是糖(例如蔗糖)的浓缩水溶液剂,并且也可含有防腐剂。对于液体剂型,例如,聚乙二醇中的溶液剂可用足够数量的药学上可接受的液体载体(例如水)稀释,以方便给药。
其它有用的液体剂型和半固体剂型,包括但不限于含有本文提供的活性成分和二烷基化的单亚烷基二醇或聚亚烷基二醇(包括:1,2-二甲氧基甲烷、二甘醇二甲醚、三甘醇二甲醚、四甘醇二甲醚、聚乙二醇-350-二甲醚、聚乙二醇-550-二甲醚、聚乙二醇-750-二甲醚,其中350、550和750是指聚乙二醇大概的平均分子量)的那些剂型。这些制剂还可包含一种或多种抗氧化剂,例如丁基羟基甲苯(BHT)、丁基羟基苯甲醚(BHA)、没食子酸丙酯、维生素E、对苯二酚、羟基香豆素、乙醇胺、卵磷脂、脑磷脂、抗坏血酸、苹果酸、山梨醇、磷酸、亚硫酸氢盐、焦亚硫酸钠、硫代二丙酸及其酯、以及二硫代氨基甲酸酯。
在适当时,用于口服给药的剂量单位制剂可以微囊化。该制剂也可以,例如,通过包衣或者将颗粒材料包埋在聚合物、蜡或类似物中,延长或维持释放。
本文提供的用于口服给药的药物组合物也可以以脂质体、微胶粒(micell)、微球体或纳米体系的形式提供。微胶粒剂型可以按照美国专利第6,350,458号中描述的方法制备。
本文提供的药物组合物也可以作为非泡腾或泡腾颗粒剂和粉剂(需重新配制成液体剂型)提供。所述非泡腾颗粒剂或粉剂中使用的药学上可接受的载体和赋形剂可以包括稀释剂、甜味剂和润湿剂。所述泡腾颗粒剂或粉剂中使用的药学上可接受的载体和赋形剂可以包括有机酸和二氧化碳源。
在所有的上述剂型中都可以使用着色剂和调味剂。
本文公开的化合物还可以与可溶性聚合物结合作为靶向药物载体。此类聚合物可以包括:聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟丙基甲基丙烯酰胺基苯酚、聚羟乙基天冬酰胺基苯酚、或被棕榈酰基取代的聚环氧乙烷聚赖氨酸。所述化合物还可以与一类适合于实现药物的控释的可生物降解的聚合物结合,此类聚合物为例如,聚乳酸、聚ε-己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、以及水凝胶的交联或两亲性嵌段的共聚物。
本文提供的药物组合物可以配制为立即释放剂型或修改释放剂型,包括延迟释放剂型、持续释放剂型、脉冲释放剂型、控释剂型、靶向释放剂型、和编程释放剂型。
本文提供的药物组合物可以与不损害所希望的治疗作用的其它活性成分合并配制,或者与补充所希望的作用的物质合并配制。
本文提供的药物组合物可以通过注射、输注或植入进行胃肠外给药,用于局部或全身给药。本文所用的胃肠外给药包括静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、心室内、尿道内、胸骨内、颅内、肌内、滑膜内和皮下给药。
本文提供的药物组合物可以配制成适合于胃肠外给药的任何剂型,包括溶液剂、混悬剂、乳剂、胶束、脂质体、微球体、纳米体系和适合在注射前制成呈液体状的溶液或悬浮液的固体剂型。这样的剂型可以按照制药科学领域技术人员公知的常规方法制备(参见《雷明顿:药学科学和实践》,同上)。
用于肠胃外给药的药物组合物可以包括一种或多种药学上可接受的载体和赋形剂,包括但不限于水性载体、水混溶性载体、非水性载体、抵抗微生物生长的抗微生物剂或防腐剂、稳定剂、增溶剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮分散剂、润湿剂或乳化剂、络合剂、掩蔽剂或螯合剂、冷冻保护剂(cryoprotectant)、冻干保护剂(lyoprotectant)、增稠剂、pH调节剂、和惰性气体。
合适的水性载体包括但不限于水、盐水、生理盐水或磷酸缓冲盐溶液(PBS)、氯化钠注射液、林格氏注射液、等渗葡萄糖注射液、无菌水注射液、葡萄糖和乳酸盐林格氏注射液。非水性载体包括但不限于,植物来源的固定油、蓖麻油、玉米油、棉籽油、橄榄油、花生油、薄荷油、红花油、芝麻油、大豆油、氢化植物油、氢化大豆油、椰子油的中链甘油三酯、和棕榈籽油。合适的水混溶性载体包括但不限于,乙醇、1,3-丁二醇、液态聚乙二醇(例如,聚乙二醇300和聚乙二醇400)、丙二醇、甘油、N-甲基-2-吡咯烷酮、N,N-二甲基乙酰胺、和二甲亚砜。
合适的抗微生物剂或防腐剂包括但不限于,苯酚、甲酚、汞制剂、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵(例如苄索氯铵)、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯和山梨酸。合适的等渗剂包括但不限于氯化钠、甘油和葡萄糖。合适的缓冲剂包括但不限于磷酸盐和柠檬酸盐。合适的抗氧化剂是如本文所描述的那些,包括亚硫酸氢盐和偏亚硫酸氢钠。合适的局部麻醉剂包括但不限于盐酸普鲁卡因。合适的悬浮分散剂是如本文所描述的那些,包括羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。合适的乳化剂是如本文所描述的那些,包括聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯80和三乙醇胺油酸酯。合适的掩蔽剂或螯合剂包括但不限于EDTA。合适的pH调节剂包括但不限于氢氧化钠、盐酸、柠檬酸和乳酸。合适的络合剂包括但不限于环糊精,包括α-环糊精、β-环糊精、羟丙基-β-环糊精、磺基丁基醚-β-环糊精、和磺基丁基醚7-β-环糊精(CyDex公司,Lenexa,美国堪萨斯州)。
本文提供的药物组合物可以配制成用于单次或多次剂量给药。单剂量制剂包装在安瓿瓶、小药瓶或注射器中。多剂量胃肠外制剂必须包含抑细菌或抑真菌浓度的抗微生物剂。所有胃肠外制剂必须是无菌的,正如本领域已知的和实践的。
在一个实施方式中,所述药物组合物被提供为即用型无菌溶液剂。在另一个实施方式中,将药物组合物制成无菌干燥的可溶性产品,包括冻干粉剂和皮下注射用片剂,在使用前用载体重新配制。在又一个实施方式中,所述药物组合物被提供为即用型无菌混悬剂。在又一个实施方式中,药物组合物被提供为无菌干燥不溶性产品,在使用前用赋形剂重新配制。在再一个实施方式中,所述药物组合物被提供为即用型无菌乳剂。
药物组合物可以被配制成悬浮液、固体、半固体或触变性液体,作为植入贮库进行给药。在一个实施方式中,本文提供的药物组合物分散在固体内部基质(solid innermatrix)中,该内部基质被在体液中不溶解但允许药物组合物中的活性成分扩散开的外层聚合物膜包围。
合适的内部基质包括:聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸丁酯、增塑的或未增塑的聚氯乙烯、增塑的尼龙、增塑的聚对苯二甲酸乙二酯、天然橡胶、聚异戊二烯、聚异丁烯、聚丁二烯、聚乙烯、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、硅橡胶、聚二甲基硅氧烷、硅酮碳酸酯共聚物、亲水性聚合物,例如丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的水凝胶、胶原、交联聚乙烯醇、和交联的部分水解的聚乙酸乙烯酯。
合适的外部聚合物膜包括:聚乙烯、聚丙烯、乙烯/丙烯共聚物、乙烯/丙烯酸乙酯共聚物、乙烯/乙酸乙烯酯共聚物、硅橡胶、聚二甲基硅氧烷、氯丁二烯橡胶、氯化聚乙烯、聚氯乙烯、氯乙烯与乙酸乙烯酯共聚物、偏氯乙烯、乙烯和丙烯、离聚物聚对苯二甲酸乙二酯、丁基橡胶环氧氯丙烷橡胶类、乙烯/乙烯醇共聚物、乙烯/乙酸乙烯酯/乙烯醇三元共聚物、和乙烯/乙烯氧基乙醇共聚物。
在其它方面,本发明的药物组合物被制备成适于通过吸入给药至患者的剂型,例如作为干粉、气雾剂、混悬剂、或溶液组合物。在一个实施方式中,本发明涉及适于通过吸入给药至患者的干粉剂型。在一个实施方式中,本发明涉及适于通过吸入给药至患者的干粉剂型。用于经吸入送入肺中的干粉组合物通常包括:作为细分粉末的本文中所披露的化合物或其药学上可接受的盐、以及作为细分粉末的一种或多种药学上可接受的赋形剂。特别适合用于干粉的药学上可接受的赋形剂是本领域技术人员公知的,包括:乳糖、淀粉、甘露糖醇、以及单糖、二糖和多糖。细分粉末可以通过,例如,微粉化和研磨,制备。一般地,尺寸减小(例如,微粉化)的化合物可以通过约1微米到约10微米的D50值来定义(例如,如利用激光衍射所测定的)。
气雾剂可通过将本文公开的化合物或其药学上可接受的盐在液化抛射剂中悬浮或溶解而形成。合适的抛射剂包括卤代烃、烃类、和其它液化气体。代表性的抛射剂包括:三氯氟甲烷(抛射剂11)、二氯一氟甲烷(抛射剂12)、二氯四氟乙烷(抛射剂114)、四氟乙烷(HFA-134a)、1,1-二氟乙烷(HFA-152a的)、二氟甲烷(HFA-32)、五氟乙烷(HFA-12)、七氟丙烷(HFA-227a)、全氟丙烷、全氟丁烷、全氟戊烷、丁烷、异丁烷和戊烷。包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐的气溶胶通常通过定量喷雾吸入器(MDI)给药于患者。这样的装置为本领域技术人员所熟知。
气雾剂可以含有通常与MDI一起使用的另外的药学上可接受的赋形剂,如表面活性剂、润滑剂、助溶剂和其它赋形剂,以提高制剂的物理稳定性、提高阀性能、提高溶解度或者改善口味。
适于透皮给药的药物组合物可以呈现为分散的贴剂,用来在更长的时间内与患者的表皮保持紧密接触。例如,活性成分可以从贴片通过离子电渗疗法递送,如在Pharmaceutical Research(药学研究),3(6),318(1986)中综合描述的。
适于局部给药的药物组合物可配制成软膏剂、乳膏剂、混悬剂、洗剂、粉剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油剂。软膏剂、乳膏剂和凝胶剂可以配制成,例如,在水性或油性基质中添加有合适的增稠剂和/或胶凝剂和/或溶剂。因此这类基质可以,例如,包括水和/或油,如液体石蜡或者植物油如花生油或蓖麻油,或者溶剂,如聚乙二醇。根据基质的性质可以使用的增稠剂和胶凝剂包括:软石蜡、硬脂酸铝、鲸蜡硬脂醇、聚乙烯乙二醇、羊毛脂、蜂蜡、聚羧乙烯和纤维素衍生物、和/或单硬脂酸甘油酯、和/或非离子性乳化剂。
洗剂可用水性或油性基质配制,并且通常还含有一种或多种乳化剂、稳定剂、分散剂、悬浮剂或增稠剂。
外用粉剂可以在任何合适的粉末基质(例如,滑石、乳糖或淀粉)的辅助下形成。滴剂可以用水性或非水性基质来配制,还包含一种或多种分散剂、增溶剂、悬浮剂或防腐剂。
可以通过每日一次或多次施用将局部制剂给药于感染区域;在皮肤区域可以有利地使用封闭敷料。连续或延长的递送可以通过贴合贮药层系统(adhesive reservoirsystem)实现。
在一个实施方式中,本文公开的治疗方法包括将安全和有效量的所述化合物或含有所述化合物的药物组合物给药于有需要的患者。本文所公开的各个实施例包括上述治疗疾病的方法,该方法包括将安全和有效量的所述抑制剂的化合物或含有所述抑制剂的化合物的药物组合物给药于有需要的患者。
在一个实施方式中,本发明的化合物或其药物组合物可以通过任何合适的给药途径给药,包括全身给药和局部给药。全身给药包括口服给药、肠胃外给药、透皮给药和直肠给药。肠胃外给药是指除了肠内或透皮以外的给药途径,通常通过注射或输注。肠胃外给药包括静脉内、肌内和皮下注射或输注。局部给药包括应用于皮肤以及眼内、耳部、阴道内、吸入和鼻腔给药。在一个实施方式中,本发明的化合物或药物组合物可以口服给药。在另一个实施方式中,本发明的化合物或其药物组合物的化合物可以通过吸入给药。在又一个实施方式中,本发明的化合物或药物组合物可以鼻内给药。
在一个实施方式中,本发明的化合物或其药物组合物可以一次给药,或者根据给药方案(在给定的时间段内以不同的时间间隔给药多次)给药。例如,可以每天给药一次、两次、三次或四次。在一个实施方式中,每天给药一次。在另一个实施方式中,每天给药两次。可以一直给药,直到实现所希望的治疗效果或无限期地维持所希望的治疗效果。用于本发明的化合物或其药物组合物的合适的给药方案取决于该化合物的药物动力学性质,如吸收、分布和半衰期,可以由熟练技术人员来确定。此外,用于本发明的化合物或其药物组合物的合适的给药方案,包括以这样的方案给药的持续时间,取决于被治疗的病症、被治疗的病症的严重程度、被治疗的患者的年龄和身体状况、被治疗的患者的病史、同步进行的治疗的性质、所希望的治疗效果等等属于熟练技术人员的知识和经验范围内的因素。这些熟练技术人员还会理解,根据个体患者对给药方案的反应或随着时间的推移个体患者需要改变,合适的给药方案可能需要调整。
本发明的化合物可以同时与一种或多种其它治疗剂一起给药,或在一种或多种其它治疗剂之前或之后给药。本发明的化合物可以通过相同或不同的给药途径分开给药,或者在与其它药剂在同一药物组合物中一起给药。
对于约50-70公斤的对象,本发明的药物组合物或组合的单位剂量可以是活性成分约1-1000mg,优选为活性成分约1-500mg、或约1-250mg、或约1-150mg、或约0.5-100mg、或约1-50mg。所述药物组合物或组合的治疗有效剂量,取决于对象的物种、体重、年龄和个体状况,被治疗的病症或疾病或者其严重程度。具有普通技能的医师、临床医师或兽医可以容易地确定为了预防、治疗或抑制所述病症或疾病的进展所需的各活性成分的有效量。
以上引用的剂量性质可以优选地使用哺乳动物(例如,小鼠、大鼠、狗、猴或离体器官、组织及其制品)在体外和体内试验中证实。本发明的化合物可以在体外以溶液(例如,优选地是水性溶液)的形式施用,而且在体内(不管是肠内还是肠外,优选为静脉内)可以以混悬液或水性溶液的形式施用。
在一个实施方式中,本文公开的化合物的治疗有效剂量为每天约0.1mg到约2000mg。所述药物组合物应提供约0.1mg至约2000mg剂量的所述化合物。在一个具体实施方式中,药物单位剂型制备成,每个单位剂型提供约1mg至约2000mg、约10mg至约1000mg、约20mg至约500mg、或约25mg至约250mg的活性成分,或者必需成分的组合。在一个具体实施方式中,药物单位剂型制备成,提供约10mg、20mg、25mg、50mg、100mg、250mg、500mg、1000mg或2000mg的活性成分。
另外,本发明的化合物可以作为前药给药。如本文中所使用的,本发明的化合物的“前药”是该化合物的功能性衍生物,其在给药于患者时,最终在体内释放本发明的化合物。本发明的的化合物作为前药给药可使得熟练技术人员进行以下中的一个或多个:(a)改变所述化合物在体内起作用的开始时间;(b)改变所述化合物在体内起作用的持续时间;(c)改变所述化合物在体内的运输或分布;(d)改变所述化合物在体内的溶解度;以及(e)克服所述化合物的副作用或遇到的其它困难。用于制备前药的常用功能性衍生物包括在体内被化学剪切或酶剪切的化合物的修饰。这些修饰,包括磷酸盐、酰胺、酯、硫酯、碳酸酯和氨基甲酸酯的制备,是本领域技术人员所熟知的。
提供以下实施例,以使得本发明可以被更充分地理解。然而,应该理解的是,这些实施方式仅提供实施本发明的方法,本发明并不限于这些实施方式。
相关方法描述如下:
小鼠、细胞和试剂
C57BL/6、OT-I和OT-II小鼠从Jackson实验室获得。这些小鼠和Casp8-/-、Ripk3-/-和Tnfrsf1a-/-小鼠按照获批的方案在清华大学动物设施内饲养和安置。
N-3-氧代-十二酰基-高丝氨酸内酯(3OC12 HSL)、N-十二酰基-高丝氨酸内酯(C12HSL)、N-丁酰基-高丝氨酸内酯(C4 HSL)、N-己酰基-高丝氨酸内酯(C6 HSL)、N-辛酰基-高丝氨酸内酯(C8 HSL)、N-3-氧代-辛酰基-高丝氨酸内酯(3OC8 HSL)、N-癸酰基-高丝氨酸内酯(C10 HSL)、N-十四酰基-高丝氨酸内酯(C14 HSL)、N-十六酰基-高丝氨酸内酯(C6 HSL)来自开曼化学公司(Cayman Chemical)。蛋黄神经鞘磷脂(860061)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)(850375)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)(850355)和胆固醇来自Avanti Polar Lipids公司;Annexin(膜联蛋白)V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(no.FXP018-100)来自四正柏生物科技公司(4A Biotech Co.)。OT-I肽(aa257-264)和OT-II肽(aa323-339)由北京中科亚光生物科技公司(Beijing Scilight Biotechnology)合成。PMA和离子霉素(ionomycin)的混合物(no.CS1001)来自联科生物技术公司(MultiSciences Biotech)。重组人TNFα(no.300-01A)购自派普泰克公司(PeproTech);放线菌酮(no.C7698)来自西格玛公司(Sigma);脂质体2000(no.11668019)和DTSSP(no.21578)、量子点605链霉亲和素缀合物(no.Q10103MP)来自赛默飞世尔公司(ThermoFisher);caspase抑制剂来自恩佐生命科学公司(Enzo life sciences);蛋白A+G琼脂糖(no.P2012)和ONPG(no.ST429)来自碧云天生物技术公司(Beyotime Biothchnology);小鼠CD4+T细胞预富集试剂盒(no.19772)来自StemCell公司;针对小鼠IL-1β的酶联免疫检测试剂盒(88-7013-88)、针对小鼠TNFα的酶联免疫检测试剂盒(88-7324-88)和针对小鼠IL-2的酶联免疫检测试剂盒(no.88-7024-88)来自eBiosciences公司。
对于蛋白质印迹(Western blot)实验,Iκbα(no.9242)、caspase-3(8G10,no.9665)、caspase 8(D35G2,no.4790)、剪切的caspase 8(Asp387,no.9429),TNFR1(C25C1,no.3736)、EGFR(2232)、pEGFR(4407)来自CST公司;GAPDH(AG019)来自碧云天生物技术公司;TNFR1(50496-RP02)来自北京义翘神州科技公司(Sino Biological);Fas(A-20,sc-1023)来自圣克鲁斯公司(Santa Cruz)。对于免疫沉淀,FADD(H-181,sc-5559)和caspase 8 P18(C-20,sc-6136)来自圣克鲁斯公司。对于流式细胞术,抗小鼠CD69-FITC(no.11-0691)、抗小鼠CD4-PE(no.12-0041)、抗小鼠CD8a-PE(no.12-0081)来自eBiosciences公司。对于单粒子追踪,抗小鼠TNFR1(PA1-40282)来自赛默飞世尔公司,小鼠抗牛血清蛋白单克隆抗体(anti-BSA moue Ab)来自西格玛公司。
pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1-N-FLAG、peGFP-N1来自清华大学李钰(音译)博士惠赠;人EGFR-peGFP-N1来自中国科学院化学研究所方晓红(音译)博士惠赠;人TNFR1 cDNA克隆(HG10872-M)购自北京义翘神州科技公司;人TNFR1(1-293)突变体用特异性引物从人TNFR1扩增并克隆到peGFP-N1载体;huFADD-DN cDNA用特异性引物从白血病细胞(Jurkat)cDNA文库扩增并克隆到pcDNA3.1-N-标记;人的FcγRIIa cDNA从THP-1 cDNA文库扩增并克隆到peGFP-N1。所有的质粒通过测序进行验证。QS分子生物测定菌株农杆菌(JZA1)1和野生型菌株(PAO1)以及LasI缺失型(ΔLasI)和LasR缺失型(ΔLasR)突变体2如前所述。
HEK 293、RAW264.7、DC2.4、THP-1、EL-4、A20细胞在添加有10%FBS、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的DMEM(HyClone)中生长。Cos-1细胞来自北京协和细胞资源中心(Cell Resource Center,IBMS,CAMS/PUMC);HELA细胞来自中国科学院化学研究所方晓红博士惠赠;H9细胞获自中国典型培养物保藏中心(China Center for Type CultureCollection)。所有这些细胞在相同的培养基中加10mM HEPES和50μMβ巯基乙醇中生长。
细胞分析
用Annexin V/PI凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡。简要地说,用HSL刺激细胞或者不进行处理。6个小时后,收集细胞并用Annexin VFITC和PI室温染色15分钟,然后通过流式细胞术测量凋亡效果。用特定的肽、或者带或不带HSL的PMA和离子霉素混合物、或者TNFα加放线菌酮,冲击OT-I或OT-II脾细胞。24个小时后,分别收集细胞和上清液。对于OT-I激活,细胞用CD69和CD8染色。对于OT-II激活,细胞用CD69和CD4染色。细胞激活通过流式细胞术测量。所有上清液的IL-2分泌通过ELISA检测。
对于骨髓细胞-PA共培养测定,骨髓细胞从C57BL/6小鼠分离,并用WT的上清液接种,LasI或LasR缺失的PA培养6个小时。样品用LY6G染色,通过流式细胞仪计数嗜中性粒细胞的数量。
免疫共沉淀、交联、脂筏分离和蛋白质印迹
对于FADD免疫沉淀,将4μg抗小鼠FADD多克隆抗体(Santa Cruz公司,H-181)与100μl蛋白A/G琼脂糖在室温下温育2个小时。用HSL刺激每毫升3百万个纯化的CD4T细胞或者不进行处理。然后收集细胞,并用IP裂解缓冲液(50mM HEPES pH 7.4,150mM NaCl,1%NP-40,1mM EDTA,1mM PMSF,1mM NaF,1mM NaVO3和蛋白酶抑制剂混合物)裂解。将细胞裂解物加入到抗体微珠混合物中,4℃放置3个小时。然后通过低速离心(1000克,5分钟)收集微珠并用IP裂解缓冲液(添加了300mM NaCl)洗涤4次。最后一次洗涤后,沉淀用70ul的2X SDS上样缓冲液悬浮,并煮沸5分钟。对于caspase 8免疫沉淀,将4μg抗caspase 8多克隆抗体(SantaCruz公司,C-20)与100μl蛋白A/G琼脂糖在室温下温育1个小时。用HSL处理每毫升3百万个纯化的H9细胞或者不进行处理。像FADD IP中那样处理样品。为了进行交联测定,用HSL刺激从C57BL/6小鼠脾脏或人THP-1细胞中分离出的CD4+T细胞,然后收集细胞并用10mM DTS在室温下交联30分钟,用1mM Tris-HCl(pH7.5)淬火15分钟。然后,将细胞用来自Bytotime生物技术的RIPA缓冲液(50mM Tris(pH 7.4),150mM NaCl,1%Triton X-100,1%脱氧胆酸钠,0.1%SDS,1mM EDTA,1mM PMSF,1mM NaF,1mM NaVO3和蛋白酶抑制剂混合物)裂解,并与非还原性SDS上样缓冲液混合。如前3所述分离脂筏。简要地说,将THP-1细胞置于1ml溶于MN缓冲液(25mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸,150mM NaCl;pH 6.5)的1%Triton X-100中,冰上裂解20分钟。用松配合杜恩斯(Dounce)匀浆器将细胞裂解物均质化(10个冲程),然后在4℃、500克下旋转7分钟。去核上清液首先在4℃、7000克下离心12分钟,然后在4℃、100,000克下离心50分钟。将沉淀在200辛基吡喃葡萄糖苷缓冲液中重悬,并称之为DIG级分。在蛋白质印迹分析前,所有样品与3X SDS上样缓冲液混合,煮沸5分钟。
群体感应分子分布测定
如前面1所述,JZA1系统是从野生型转化的。对于该测定,首先对JZA1进行预诱导。简要地说,JZA1在含有1μg/ml四环素、100μg/ml的大观霉素和100μg/ml庆大霉素的LB液体培养基中在28℃下生长直到对数生长后期。将1ml培养物在28℃下加入到100ml含有抗生素的AT介质中,直到它进入对数生长中期。然后通过离心(12000克,10分钟)收集细菌,重悬于15%的无菌甘油中冷冻。为了进行细胞膜保留测定,在37℃下用HSL接种H9细胞。然后通过离心(1500转,5分钟)分别收集细胞和上清液。用缓冲液#1(20mM Tris-HCl,2mM EDTA,1mMDTT,10%甘油)在冰上处理细胞使细胞膜破碎。通过超离心(179000克,24分钟,4℃)分离胞浆和细胞膜碎片。细胞膜碎片溶解于缓冲液#2(缓冲液#1加1%Triton-X100)。用乙酸乙酯提取级分中的HSL,并在室温干空气中燥。然后将样品溶解在DMSO中,并与2μl预诱导的菌株JZA1在2ml AT介质中在28℃培养20个小时。在OD 600nm达到0.2-1时,通过将200μl的细胞培养液与200μl Z缓冲液4、10μl 0.05%SDS和15μl的氯仿混合,裂解细菌。将100μl的ONPG(4mg/ml)加入到每个样品中,并记录时间T0。通过加入600μl的1M NaCO3使反应终止,并记录时间Ts。测量了它们的OD 420nm,以确定米勒单位。
脂质结合分析
通过蒸发将1mg/ml各脂质种类的氯仿溶液涂覆在圆形载玻片上。然后将玻璃切片用在溶于PBS的DMSO中的100μM 3OC12 HSL在37℃温育。温育后,用PBS小心冲洗玻璃切片4-5次,用DMSO溶解脂质。如上所述,通过QS生物测定测量每个样品中的3OC12 HSL的量。
单分子荧光成像
光学设置:单分子荧光检测在基于蔡司倒置显微镜A1 stand的自制物镜型全内反射荧光显微镜(TIRFM)中进行。简要地说,包含4个单波长连续激光器(405nm、488nm、561nm和640nm)(相干)的激光组合器用作激发光源。激发光经由偏振保持单模光纤和反射准直器被导入激发路径。光首先通过一个声光可调谐滤波器(AOTF)选通,然后通过一对透镜消耗5次,最后聚焦在奥林巴斯TIRF物镜的后焦平面(100×,NA 1.49),该物镜带有可垂直于光轴地平移以实现可变入射角的透镜(f=150mm)。荧光信号被相同的物镜收集,然后过滤并与Optosplit II(Cairn Research公司)光谱分离,然后被投射到电子倍增电荷耦合器件(EMCCD)相机(安道尔IXON DU-897U BV)。通过驱动AOTF和EMCCD相机的Micro-Manager软件控制数据采集。
单分子光漂白步骤计数:将0.5μg TNFR1(1-293)-peGFP-N1质粒或0.5μg EGFR-peGFP-N1质粒转染到HeLa细胞中培养5-6个小时。然后用HSL、TNFα刺激细胞或者不进行处理,并用PBS洗涤两次,并在成像之前用4%多聚甲醛固定。用488nm、5mW激光功率(在激光穿过物镜后进行测量的)激发GFP。收集的荧光信号通过带通滤波器HQ 525/50(ChromaTechnology公司)选通。EMCCD相机的EM增益设置为300。对每个样品获取400帧的影像,全帧速率为10Hz。为了成像分析,首先,使用Image J软件中的滚球法从获自被固定的细胞的影像中减去背景荧光,并根据细胞的轮廓手动选择影像上的感兴趣区域。为了分析漂白步骤,首先通过Image J插件构建每个荧光点的荧光时间进程,然后手动计数漂白步骤。
基于量子点的单粒子跟踪
为了跟踪细胞膜上的TNFR1个体,首先用木瓜蛋白酶消化抗TNFR1的IgG以生成Fab片段。然后Fab通过其C末端的独特-SH与生物素缀合。为了制备抗TNFR1的Fab QD缀合物,将1ml DMEM中有0.7nM抗TNFR1-Fab-生物素的溶液,逐滴加入1ml 2nM的QD 605-链霉亲和素缀合物中。用3OC12 HSL处理之前已血清饥饿处理1个小时的细胞单层(50%汇合),或者不进行处理,并用500ml抗TNFR1-Fab-QD最终溶液在25℃下温育2分钟。然后在25℃下用PBS将细胞洗涤两次,放置在无血清培养基中,并加载以进行成像。对于单FcRγIIA跟踪,通过用木瓜蛋白酶消化抗BSA IgG(Sigma Aldrich公司)获得Fc片段。如前面所述制备Fc-QD缀合物。Cos-1细胞与FcγRIIa质粒瞬时转染,24个小时后,用3OC12 HSL刺激细胞或者不进行处理,并用500ml的最终的Fc-QD溶液在25℃下温育2分钟。被量子点标记的细胞在TIRF模式进行成像。荧光在488nm激发并通过带通滤波器(575-640,Carl Zeiss公司)选通。物镜后测量的激励功率为约2mW。对每个样品获取400帧的影像,全帧速率为17赫兹。通过用Matlab编写的Utrack构建个体轨迹。通过用Matlab编写的定制程序计算扩散系数和曲线图面积(plotarea)。对于通过MSD-t analysis 5确定运动模式:线性的简单布朗扩散模式;上开口抛物线式的定向扩散模式;下开口抛物线式的限制扩散模式;和接近零的静态模式。
PA肺部感染
在轻度麻醉下用2×106或1×107CFU的PAO1、ΔLasI和ΔLasR PA气管内(i.t.)感染6-8周龄的C57BL/6小鼠。24个小时后,将感染小鼠的肺部切除并均质化,用于计算细菌数。通过低速离心收集上清液,测定细胞因子。用流式细胞术从肺部组织悬液检测嗜中性粒细胞数。
骨髓嵌合体
将5周龄的C57BL/6小鼠用5.5Gy剂量的γ射线照射两次,3个小时后通过静脉途径(WT到WT,Casp8-/-Ripk3-/-到WT,Tnfrsf1a-/-到WT)交叉移植骨髓细胞。小鼠持续用抗生素(新霉素1mg/ml,多链丝霉素0.1mg/ml)3周。重构6周后用1×107CFU的细菌PAO1进行感染。对于CD45.1/CD45.2嵌合体移植,将5周龄的C57BL/6小鼠用5.5Gy的γ射线照射两次,3个小时后通过静脉途径对骨髓细胞(CD45.1:CD45.2=1:1)进行混合和交叉移植。4周后,如前所述,用1×107CFU P.A细菌感染小鼠。
吞噬测定
对于吞噬测定,通过商业方法将聚苯乙烯微珠涂布BSA加鼠抗BSA抗体。实验前,用Opti-MEM培养基在24孔板中在清洁的玻璃切片上培养RAW264.7细胞。细胞与包被微珠共培养,在900克、4℃离心5分钟,在37℃下培养45分钟。然后将细胞用4%多聚甲醛固定,并用488nm抗小鼠荧光抗体染色,用于免疫荧光成像。为了分析,在明场下计算对每个细胞上的微珠的总数,分别在荧光灯照明下计算未被吞噬的微珠的数量。
原子力显微镜
为了制备脂质小型单层囊泡(SUV),脂质的氯仿溶液(DOPC:DPPC=1:1,DOPC:SM:CHOL=3:6:1)在玻璃瓶里氯仿中混合,并在氮气流中干燥。将干燥的脂质膜用4mM HEPES缓冲液(含150mM NaCl)重悬,以生成SUV。将囊泡溶液(100μl)加到夹在AFM加热器头上流体单元格中的新切云母上。于55℃温育30分钟,然后室温下再放置30分钟,用HEPES缓冲液充分洗涤双层,以去除多余的囊泡。
在NanoScope V Multimode扫描探针显微镜(数字仪表,Veeco公司,美国加州圣巴巴拉)上在轻敲模式下在室温得到AFM图像,使用V形的Si3N4针尖(型号DNL-10),弹簧常数~0.35N/m,共振频率在8到10kHz之间,水溶液。所有实验均使用市售的流体单元格,用O型圈密封,在Hepes缓冲液中进行。使用了J扫描器(125μm×125μm),扫描速率为每行0.8到2Hz之间。
透射电子显微镜
对于TEM分析,将培养的细胞在原位进行固定、脱水、渗透和嵌入培养皿中的处理。在室温下将细胞在0.1M磷酸盐缓冲液,pH 7.2中用2.5%的戊二醛预固定2个小时,并用二甲胂酸盐缓冲的1%四氧化锇后固定1个小时。然后将细胞通过梯度乙醇脱水并包埋在Epon混合物中。聚合后,将含有包埋细胞的硬化的Epon层从塑料培养皿分离。在光学显微镜下选择代表区域,将其修整并粘合到树脂桩上用于切片。在ultramicrotome(EM UC6,Leica公司)上用金刚石刀切超薄切片,并收集到在带有铜支撑膜的单孔网格上。将切片用含水醋酸双氧铀和Reynolds柠檬酸铅染色,并用日立H7650 TEM在80kV下观察。图像是用安装在显微镜上的Morada G2(奥林巴斯)数码相机获得的。SEM成像用的样品用2.5%的戊二醛溶液制备并固定,然后用乙醇和HMDS梯度脱水或临界点干燥。样品溅涂有金(JEC-3000FC,日本电子株式会社)。然后,用电子显微镜(JSM-700F,日本电子株式会社)检查样品。
统计
对于所有的测定,在每种条件下使用至少5只小鼠,且所有实验重复至少三次。所有曲线图示出SEM的平均值。通过未配对T检验对各独立实验进行了统计分析。小于0.05的p值被认为是显著。*:<0.05;**:<0.01;***:<0.001;N.S.:不显著。
实施例
为了寻找哺乳动物细胞中的信号传导通路,本发明人首先证实了以前的报道,即,3OC12 HSL能够抑制通过同源MHC I类和II类限制性抗原或PMA联合离子载体诱导的原代T细胞和T细胞系激活,如通过IL-2释放量和CD69表达所测量的(图1a和b)。在从培养物中回收的活细胞中,ZAP70磷酸化影响最小,这表明在存活的细胞中TCR起源的信号未受显著影响(图1c)。然而,在10到20μM的适中浓度下,3OC12 HSL触发了明显的T细胞死亡,类似于放线菌酮加TNFα(图2a)的标准规程。因此,免疫抑制效果可以至少部分地解释为细胞损失的结果。因此,我们决定开始从它在细胞死亡诱导中的作用寻找信号传导机制。在3OC12 HSL的类似物中,那些具有10个和12个碳的酰基链的类似物诱导了细胞凋亡(图2b)。图1c表明,多数免疫细胞类型(包括胸腺瘤细胞系EL4、转化的DC系DC2.4、网状内皮细胞瘤A20、单核细胞RAW264.7和白血病细胞系THP-1)对3OC12 HSL敏感;人类淋巴母细胞H9和巯基乙酸盐诱导的巨噬细胞比较有抗性。
扩展的数据图2c表明,经3OC12 HSL处理的细胞显示出典型的凋亡细胞膜起皱和核浓缩,与经单钠尿酸盐晶体处理的细胞中的细胞质膨胀形成鲜明对比。在报道的许多细胞效应中,3OC12 HSL也触发caspase 8激活,虽然还没有人尝试建立机制。在经3OC12 HSL处理的CD4 T细胞中,caspase 8和caspase 3以随剂量和时间变化的方式被剪切(图2d为小鼠,图3的a和b为人)。与单独进行3OC12 HSL处理相比,在caspase抑制剂中,仅泛caspase抑制剂Z-VAD、caspase 3抑制剂Z-DEVD和caspase 8抑制剂Z-IETD降低了细胞毒性(图2e),这表明细胞死亡在caspase 8/3通路的下游。在免疫沉淀测定中发现,在处理后FADD(Fas相关死亡结构域蛋白)与caspase 8形成复合物,随着caspase 8被消化,关联性变得更强(图2f和图4a)。FADD的显性阴性版本也减少3OC12 HSL诱导的细胞死亡(图4b)和caspase 3剪切(图4c),这表明在3OC12 HSL存在的情况下,细胞凋亡的触发起源于质膜。
caspase 8上游,多效TNFR家族成员既介导促存活NF-κb激活,也介导细胞凋亡编程。事实上,Casp8-/-Ripk3-/-巨噬细胞对3OC12 HSL介导的细胞死亡更有抗性,并与Tnfrsf1a-/-脾细胞(图2g)共享表型,它们的差距从第2至8小时变得更加明显(图5a)。caspase 8突变体和TNFR1中的caspase 3剪切的减少证实了在这些突变体中更弱的信号传导(图5b)。本发明人发现,在3OC12 HSL处理的非凋亡Jurkat细胞中,Iκbα被降解。相比之下,在同一细胞系的Ripk1-/-版本中,Iκbα保持完整(图6a和b)。这些结果表明,3OC12 HSL激活通过FADD传导信号的表面结构;并且取决于细胞类型,对于NFκb激活,通过RIP1传送信号,或者对于凋亡,由caspase 8传送信号。这是TNFR家族成员在配体结合时的典型行为,在本发明人的条件中明显缺失。
本发明人想知道是否增加的疏水性与它们在质膜中保留的能力有关联。将3OC12HSL加入轻度凋亡抗性H9细胞培养物中(图7a),并使用差速离心提取质膜。具有6至14个碳的酰基链的类似物用作对照。基于β半乳糖苷酶报告基因的用于自体诱导物检测的精制超灵敏系统用于定量(图7a)。按从相同起始细胞数检测到的每个级分中的米勒单位百分比测量,发现在质膜级分中3OC12 HSL和C12 HSL的含量更高,而胞浆中的含量更低(图7a)。相比较而言,这种质膜富集不如C6、C8、3-氧代-C8、C10和C14类似物明显(图7b)。对于3OC12HSL,随着时间增加这种分布模式是持久不变的(图7c)。在细菌膜中,基于HSL的自体诱导物可以通过外部壳体20自由地扩散。为了鉴定保留3OC12 HSL所需的真核膜组分,将二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)和二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、胆固醇和鞘磷脂单独或组合与氯仿的混合液涂覆到玻璃盘片上,空气中干燥。然后用3OC12 HSL溶液覆盖该玻璃盘片。洗涤后,用DMSO洗脱相应玻璃盘片。图7d表明,只有含胆固醇、鞘磷脂和DOPC的脂质组分能够有效地保留3OC12 HSL。此外,在用MβCD进行处理以去除胆固醇从而破坏了有序脂质结构域的H9细胞中,保留明显减少了(图7e)。该结果表明,HSL在膜中的保留既取决于侧链长度,也既取决于脂质结构域,而且该膜截留效果反馈了凋亡诱导所需要的侧链的长度(图2b)。
在死亡诱导信号复合物(DISC)中,FADD是桥接TNFR家族成员和胞内caspase 8的胞质尾区的衔接子。在这些受体三聚化时此信号传导级联变得活跃。普遍认为,TNFR1在配体结合时移出有序脂质结构域,然后发出细胞凋亡信号,这与Fas正好相反,Fas在FasL结合后中移入脂质有序域。本发明人首先研究了是不是3OC12 HSL的存在改变了TNFR1和Fas的低聚化。在有交联剂DTSSP和非还原条件下运行时,3OC12 HSL使条带的量迅速增加,约为TNFR1单体分子量的3倍(图8a和图9a)。但是Fas并没有表现出显著的变化,即使在延长温育时间之后(图9b)。基线TNFR1三聚化与先前的报道一致,即,这种受体的一部分经过了由其胞外三聚域诱导的自发聚集。
为了排除3OC12 HSL改变了提取条件从而可能导致TNFR1的人为聚集,进行了多步荧光猝灭(MSFQ)测定,以按其在细胞膜上的天然状态分析TNFR1(图8b)。由于添加3OC12HSL导致依赖TNFR1的细胞死亡,因此将下述突变TNFR1转染到HELA细胞中,该突变TNFR1删除了DD域并在其胞质末端添加了eGFP或mCherry序列(图10a)。选择具有适度荧光信号的转染子(用于MSFQ优化,图10b)。3OC12 HSL的添加提高了三个步骤淬火模式的百分比,证实了三聚化被诱导。统计分析表明,一个步骤漂白频率从60.0+/-2.4%变为47.1%+/-1.9%(p<0.001),而三个步骤从7.1+/-1.4%增加到17.0+/-1.3%(p<0.001)(图8c)。这种三聚化同样发生在TNFα存在的情况下,但是没有因3OC8HSL(非死亡诱导类似物)而增加,证实了通过3OC12 HSL处理的配体结合等效性(图8c)。本发明人发现,在人和小鼠T细胞中,在存在3OC12 HSL的情况下,与脂筏相关联的TNFR1(用抗洗涤剂的结构域的数量表示)减少(图11)。
已经提出将TNFα的基线三聚化作为它信号传导的阈值设定器,其为与CRD1结构域有关的特征。但是,配体诱导的三聚化是由相邻CRD2介导的。要确定3OC12 HSL介导的三聚化是否需要那些结构域中的任一个,CRD1(KY48/49AA和K61A)和CRD2(E85A和N94A)中的关键残基被突变(图12a),并进行MSFQ以确定它们的关联性。有趣的是,对于与3OC12 HSL(图12b)相关联的多聚化,这四种突变体中的每一个都不是单独必需的。只有当整个CRD1被删除,3OC12 HSL处理的影响才变得微不足道(图12b)。
大脂筏可以用来自膜脂26的提取物重新构建。我们研究了这些结构域在存在3OC12 HSL时的形态。在玻璃基板上,在水相下有序脂质结构域(通过原子力显微镜的扫描模式确定为高于周围的细胞膜至少1纳米)是稳定的(图8d)。3OC12 HSL大大改变这些结构域的外观,较高的平台被清晰地溶解了(图8d)。该溶解是从结构域的中心开始的,多孔结构随着时间延长而增加(图8e)。与此相反,由DOPC和DPPG的混合物形成的与脂筏无关的更小的结构域受影响最小(图13a),这表明3OC12 HSL特异性靶向于在胆固醇和鞘脂存在时形成的结构域。
近年来,有一种新的见解提出,血脂紊乱相与皮层细胞骨架进一步交织,形成一个限制有序结构域的物理屏障。用基于STED的成像技术30实验证实了该模型。在此约束下的跨膜蛋白显示的运动轨迹表征为以下模式:简单、定向、静态和限制。为了确定在3OC12 HSL介导的结构域破解的情况下TNFR1的运动模式,由木瓜蛋白酶消化细胞外TNFR1特异性抗体,以产生Fab片段,避免受体交联。将605nm发射波长的链霉亲和素连接量子点与纯化的Fab融合。从一系列影像衍生出TNFR1运动模式。每个标记的运动轨迹被置于均方分布(MSD)分析(图13b)。得到的四种模式,正如所预期的(图8f)。在有3OC12 HSL的情况下,TNFR1更可能落入运动的简单模式中,而限制模式和静态相应减少了(图8f)。因此,扩散系数也显著增加(图8g),这意味着在“没有结构域”的质膜中TNFR1的扩散性更高。在处理过的质膜中,每个单独的TNRF1表现出较高的x-y表面积覆盖率(图8h)。本发明人尝试了用MβCD近似处理这种较高的扩散性(图8d最后一行)。正如所预期的,MβCD处理定性地恢复了3OC12 HSL的精髓,使得TNFR1具有较高扩散系数和更大的面积覆盖率(图14a和b)。
HSL被认为是通过细菌共同活动33致病的因子。本发明人的研究结果提出一种针对3OC12 HSL的确定的宿主反应,本发明人想知道是否还可以通过免疫抑制降低宿主防御来进一步解释其致病性。本发明人用野生型(PAO1)、LasI缺失型(ΔLasI)和LasR缺失型(ΔLasR)的PA培养物的上清液,从C57BL/6小鼠培养嗜中性粒细胞。如图15a中所示,两种Las回路缺失型中的任一个都导致细胞损失的显著下降。为了进一步证实该结果,本发明人用PAO1、ΔLasI和ΔLasR PA气管内接种C57BL/6小鼠。来自突变感染的小鼠的肺部提取物显示PA CFU减少(图15b)。结果表明,3OC12 HSL是通过使用宿主本身的TNFR1通路直接抑制宿主免疫反应的致病因子。为了在QS自身从其作用中分离这种可能性,我们重构了γ照射的CD45.2 C57BL/6小鼠,采用由CD45.1(野生型)和CD45.2(野生型或Casp8-/-或Tnfrsf1a-/-)构成的杂交骨髓细胞,并且用PAO1株挑战受体。图15c表明,Casp8-/-和Tnfrsf1a-/-嗜中性粒细胞对3OC12 HSL诱导的细胞凋亡的抗性比野生型嗜中性粒细胞更大。因此,如用肺部提取物中的CFU测得的(图15d),突变受体表现出更好的感染清除。图15e和f表明,在这些小鼠中3OC12 HSL介导的细胞凋亡的缺乏大大减少了嗜中性粒细胞渗透以及TNFα和IL-1β的产生,这意味着更有效的响应。LasI缺失型PA菌株的接种,在嗜中性粒细胞计数方面,在野生型和Casp8-/-或Tnfrsf1a-/-骨髓重建小鼠之间差别不大(图16a),并且与PAO1接种相比,PA CFU计数差异变得更小(图16b),增强了体内TNFR1通路通过3OC12HSL的特异性靶向。
正在进行的结果表明,在哺乳动物质膜中混合3OC12 HSL对于TNFR1信号传导具有明显的后果。一个问题出现了,3OC12 HSL是否能调节被处理的质膜中的其它表面受体的行为,特别是在TNFR1阴性细胞或那些有优先促生存信号传导的细胞中。本发明人首先分析了人类FcγRIIa,它是一种具有本征胞质ITAM结构域34的低亲和力Fcγ受体。在用FcγRIIa转染的Cos-1细胞中,进行基于量子点的单粒子跟踪。结果表明,在3OC12 HSL处理后,属于简单和定向运动模式的FcγRIIa的百分比提高,同时处于静态模式的FcγRIIa的百分比下降(图15g)。在有3OC12 HSL的情况下,该受体也表现出更高的扩散系数(0.1056+/-0.006vs0.1564+/-0.006,p<0.001),且其运动轨道覆盖的面积更大(0.6467+/-0.042vs 0.9310+/-0.045,10p<0.001)(图15h)。由于FcγR信号传导也被膜结构域缔合所调节,本发明人发现,虽然与细胞的附着是相似的,3OC12 HSL降低了抗体包被的乳胶微珠的吞噬作用(4.6+/-0.3%vs 2.6+/-0.2%,p<0.001),而微珠与那些细胞的附着并没有受到影响(图15i)。对于EGFR(一种其信号传导依赖于脂质结构域缔合35的非免疫膜受体),我们进行了MSFQ以确定3OC12 HSL是否改变其二聚化基频。图15j表明,与载体处理相比,3OC12 HSL增加了二聚化。结果,在不存在配体的情况下,EGFR磷酸化成为可检测的(图15k)。总的来说,这些数据意味着3OC12 HSL在质膜中的简单存在导致宿主细胞表面受体信号传导的普遍破坏(genericdisruption)。
为了验证在临床上TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路抑制剂可以阻断3OC12-HSL引起的免疫细胞凋亡,本发明人使用caspase抑制剂的临床版本Emricasan进行测试。通过标准Annexin V和PI染色实验,本发明人惊讶地发现caspase抑制剂的临床版本Emricasan在阻断小鼠脾细胞和人THP-1细胞系中的3OC12-HSL细胞凋亡时具有良好的效果。结果如图17a~图17f所示。其中,图17a示出了在THP-1细胞系中的凋亡染色的流式细胞术分析。具体而言,在12孔板中THP-1细胞与指定浓度的3OC和Emricasan一起培养。1小时后,收集细胞膜用于Annexin V和PI的流式细胞仪分析。图17a表明Emricasan在阻断人THP-1细胞系中的3OC12-HSL细胞凋亡时具有良好的效果。图17b示出了图17a的凋亡染色的流式细胞术分析的统计结果。在图17b中,不同处理的活细胞百分比通过流式细胞术计数。活细胞百分比的柱状图通过平均值±SEM描述。然后如图17a和图17b中那样制备样品,用于Caspase 8和Caspase 3激活(剪切)的WB分析。结果如图17c所示。在图17c中,左侧屏板的温育时间是1个小时,左侧屏板是2个小时。Casp 8表示Caspase 8,Cld Casp 8表示剪切的Caspase 8,Casp 3表示Caspase 3,Cld Casp 3表示剪切的Caspase 3。图17c表明,在人THP-1细胞系中Emricasan具有阻断由caspase介导的3OC12-HSL的凋亡的效果。此外,本发明人使用B6脾细胞(从C57BL/6脾分离)进行测试。结果如图17d~图17f所示。图17d~图17f表明Emricasan在阻断B6脾细胞中的3OC12-HSL的细胞凋亡时也具有良好的效果。
有人提出,X盒结合蛋白1、PPARβ/δ和PPARγ针对3OC12 HSL的活性。更大可能性是次级信号传导活动,并不知道那些分子可作为自诱导物的直接目标。在本报告中,本发明人表明,该细菌代谢物的感测是通过膜干扰,从而广泛地改变哺乳动物细胞表面,在某些细胞中细胞凋亡是最可观察到的结果。
原核和真核系统的划分由几个通用的特征定义。真核细胞的独特之处在于,膜结构域是由在细菌界不存在的鞘脂质和胆固醇的微型晶体般的聚合体支撑的特征。此外,动态脂质结构域形成被长链磷脂与底层皮层细胞骨架的粘附所约束的尖桩栅栏状的排列。受体与这些结构域的动态缔合是控制通过这些分子发射的信号的调节机制。这一特征使得真核细胞膜对脂质结构域破坏特别敏感,与细菌膜形成鲜明对比,细菌膜具有由两个Singer-Nicolson双层(其特征在于缺少甾醇如胆固醇)夹着的相对固定的基于肽聚糖的细胞壁。
这项工作的一个惊人发现是,PA使用3OC12 HSL通过直接触发宿主自己的TNFR1信号传导而使免疫功能失灵,从而导致早期响应的嗜中性粒细胞发生凋亡,有利于细菌存活。这一结果揭示了一种自体诱导物的免疫调节机制,其与宿主细胞防御中的信号传导直接联系。这一发现和揭示,即,细菌自体诱导物使用先前未知的跨界通信方法来调节宿主先天免疫,对于新的固有感测机制和用于临床控制假单胞菌感染的明确目标提供了一个重要的见解。
在整个本说明书中,术语“实施方式”、“一些实施方式”、“一个实施方式”、“另一个示例”、“实施例”、“具体实施例”、或“一些实施例”等意指结合该实施方式或示例描述的具体特征、结构、材料或特点包含于本发明的至少一个实施方式或示例中。因此,诸如“在一些实施方式中”、“在一个实施方式中”、“在实施方式中”、“在另一个示例中”、““在示例中”、“在具体示例中”、或“在一些示例中”之类的短语在整个本说明书的不同地方的出现,不一定指的是同一实施方式或示例。而且,具体特征、结构、材料或特性可以在一个或多个实施方式或实施例中以任何合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施方式,本领域技术人员会理解,上述实施方式不能被解释为限制本发明,在不脱离本发明的精神、原理和范围的情况下可以在实施方式中进行变化、替换和修改。
Claims (25)
1.TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路抑制剂在用于治疗由自体诱导物引起的、与免疫系统相关的疾病的药物的制备中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途,其中,所述自体诱导物来自铜绿假单胞菌。
3.根据权利要求2所述的用途,其中,所述与免疫系统相关的疾病是与铜绿假单胞菌感染相关的疾病。
4.根据权利要求1所述的用途,其中,所述TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路抑制剂是选自下组的至少一种抑制剂:TNFR1抑制剂、TNFR1三聚化抑制剂、FADD抑制剂、caspase抑制剂。
5.根据权利要求4所述的用途,其中,所述TNFR1三聚化抑制剂包括:
(a)、针对TNFR1的竞争性抑制剂肽;或者
(b)、表达(a)的核酸或构建体。
6.根据权利要求5所述的用途,其中,所述针对TNFR1的竞争性抑制剂肽是类TNFR T2。
7.根据权利要求4所述的用途,其中,所述TNFR1抑制剂包括选自下组的至少一种:TNFR1表达抑制剂、TNFR1突变诱导剂、TNFR1功能抑制剂、TNFR1功能类似物。
8.根据权利要求4所述的用途,其中,所述FADD抑制剂包括选自下组的至少一种:FADD表达抑制剂、FADD突变诱导剂、FADD功能抑制剂、FADD功能类似物。
9.根据权利要求4所述的用途,其中,所述caspase抑制剂包括选自下组的至少一种:Z-VAD、Z-DEVD、Z-IETD、Emricasan、对caspase具有特异性的shRNA、通过激活RIP1诱导从caspase通路偏离的物质。
10.根据权利要求1所述的用途,其中,所述自体诱导物是C8~12烷基酰基高丝氨酸内酯或其衍生物。
11.根据权利要求10所述的用途,其中,所述自体诱导物是C12烷基酰基高丝氨酸内酯或其衍生物。
12.一种用于筛选用于治疗由自体诱导物引起的、与免疫系统相关的疾病的药物的方法,包括:
(1)使候选化合物与免疫细胞接触;
(2)在所述接触之前和之后,确定下列中的至少一种:
(a)细胞表面TNFR1的三聚化水平;
(b)TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路的激活水平,
其中,所述细胞表面TNFR1的三聚化水平的降低或所述TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路的激活水平的降低表示所述候选化合物是用于治疗由自体诱导物引起的、与免疫系统相关的疾病的药物。
13.根据权利要求12所述的方法,其中,所述自体诱导物是C8~12烷基酰基高丝氨酸内酯或其衍生物。
14.根据权利要求13所述的方法,其中,所述自体诱导物是C12烷基酰基高丝氨酸内酯或其衍生物。
15.一种治疗由自体诱导物引起的与免疫系统相关的疾病的方法,包括:将TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路抑制剂给药于需要治疗的对象。
16.根据权利要求15所述的方法,其中,所述自体诱导物来自铜绿假单胞菌。
17.根据权利要求15所述的方法,其中,所述与免疫系统相关的疾病是与铜绿假单胞菌感染相关的疾病。
18.根据权利要求15所述的方法,其中,所述TNFR1-FADD-caspase8-caspase3通路抑制剂是选自下组的至少一种抑制剂:TNFR1抑制剂、TNFR1三聚化抑制剂、FADD抑制剂、caspase抑制剂。
19.根据权利要求18所述的方法,其中,所述TNFR1三聚化抑制剂包括:
(a)、针对TNFR1的竞争性抑制剂肽;或者
(b)、表达(a)的核酸或构建体。
20.根据权利要求19所述的方法,其中,所述针对TNFR1的竞争性抑制剂肽是类TNFRT2。
21.根据权利要求18所述的方法,其中,所述TNFR1抑制剂包括选自下组的至少一种:TNFR1表达抑制剂、TNFR1突变诱导剂、TNFR1功能抑制剂、TNFR1功能类似物。
22.根据权利要求18所述的方法,所述FADD抑制剂包括选自下组的至少一种:FADD表达抑制剂、FADD突变诱导剂、FADD功能抑制剂、FADD功能类似物。
23.根据权利要求18所述所述的方法,所述caspase抑制剂包括选自下组的至少一种:Z-VAD、Z-DEVD、Z-IETD、Emricasan、对caspase具有特异性的shRNA、通过激活RIP1诱导从caspase通路偏离的物质。
24.根据权利要求15所述的方法,其中,所述自体诱导物是C8~12烷基酰基高丝氨酸内酯或其衍生物。
25.根据权利要求24所述的方法,其中,所述自体诱导物是C12烷基酰基高丝氨酸内酯或其衍生物。
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