JPH1057080A

JPH1057080A - Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有する哺乳類由来のポリペプチド

Info

Publication number: JPH1057080A
Application number: JP9160625A
Authority: JP
Inventors: Takeshi Ario; 武司有尾; Madoka Taniai; まどか谷合; Kozo Yamamoto; 康三山本; Masashi Kurimoto; 雅司栗本
Original assignee: Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1996-06-07
Filing date: 1997-06-04
Publication date: 1998-03-03
Anticipated expiration: 2017-06-04
Also published as: JP3819540B2

Abstract

(57)【要約】【課題】Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有する哺乳類由
来のポリペプチド、当該ポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ、当該ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換え
ＤＮＡ、当該ポリペプチドをコードするＤＮＡを導入し
てなる形質転換体並びに、当該ポリペプチドの製造方法
及び、当該ポリペプチドを有効成分として含んでなる感
受性疾患剤を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドと、当該ポリペプチドをコードするＤＮＡと、当該ポ
リペプチドをコードするＤＮＡと自律複製可能なベクタ
ーを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡと、当該ポリペ
プチドをコードするＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形
質転換体並びに、当該形質転換体を培地中で培養し、産
生したポリペプチドを培養物から採取することを特徴と
する当該ポリペプチドの製造方法及び、当該ポリペプチ
ドを有効成分として含んでなる感受性疾患剤により解決
する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明はＬ−アスパラギナ
ーゼ活性を有する新規なポリペプチド、詳細には、Ｌ−
アスパラギナーゼ活性を有する哺乳類由来のポリペプチ
ドに関する。

【０００２】

【従来の技術】Ｌ−アスパラギナーゼ（ＥＣ３．５．
１．１）は、Ｌ−アスパラギンを加水分解してＬ−アス
パラギン酸とアンモニアを生ずる反応を触媒する酵素で
ある。Ｌ−アスパラギナーゼの抗腫瘍剤としての研究
は、ジェー・ジー・キッズが『ジャーナル・オブ・エキ
スペリメンタル・メディスン』、第９８巻、５６５乃至
５８２頁（１９５３年）において、モルモットの血清に
リンパ腫に対する抗腫瘍作用が認められることを報告し
たことに端を発する。その後、ジェー・ディー・ブルー
ムは『ネイチャー』、第１９１巻、１１１４乃至１１１
５頁（１９６１年）において、この抗腫瘍作用の実体が
Ｌ−アスパラギナーゼであることを明らかにした。現
在、その作用機作は次のように説明されている。即ち、
急性リンパ性白血病細胞等の腫瘍細胞は、Ｌ−アスパラ
ギンシンテターゼを欠損しているため、生体内のＬ−ア
スパラギンが必須栄養素となることから、生体内にＬ−
アスパラギンが不足するか存在しない条件下では増殖で
きないので、生き続けることができない。ところがＬ−
アスパラギンは正常細胞にとっては必須栄養素ではない
ので、悪性腫瘍患者においては、Ｌ−アスパラギナーゼ
により生体内のＬ−アスパラギンを加水分解すれば、腫
瘍細胞のみを選択的に死滅させ、悪性腫瘍を治療するこ
とができるというものである。以来、Ｌ−アスパラギナ
ーゼの抗腫瘍剤としての実用化を目指して精力的な研究
が続けられ、その結果、現在では、大腸菌由来のＬ−ア
スパラギナーゼは白血病及びリンパ腫の治療剤として用
いられるようになった。

【０００３】しかしながら、大腸菌由来のＬ−アスパラ
ギナーゼは、人体からみれば、所詮、異種蛋白質であ
り、これを配合使用する従来の治療剤は、患者に投与す
ると、アナフィラキシーショック、蕁麻疹、浮腫、喘
鳴、呼吸困難などの過敏反応を始めとする深刻な副作用
を頻発させることとなった。斯くして、従来の治療剤は
用量及び投与頻度を大幅に制限せざるを得ない状況にあ
り、そのため、斯かる副作用を軽減乃至解消するための
提案が幾つかなされてきた。

【０００４】その第一は、特開昭５４−１１９０８２号
公報に見られるように、２−Ｏ−置換ポリエチレングリ
コール−４，６−ジクロロ−Ｓ−トリアジンにより大腸
菌由来のＬ−アスパラギナーゼにおけるアミノ基の６５
％以上を封鎖し、Ｌ−アスパラギナーゼそのものを化学
的に修飾しようというものである。第二は、特開平４−
３２０６８４号公報又は特開昭５５−１９０１８号公報
に見られるように、ある種のヒト細胞株の培養物又は人
尿から、ヒトのＬ−アスパラギナーゼを採取しようとい
うものである。第一の提案には、大量に入手の容易な大
腸菌のＬ−アスパラギナーゼを利用できる利点はあるも
のの、修飾反応の制御が困難なうえに、副作用を完全に
解消するまでには到らないという問題がある。第二の提
案によるヒトのＬ−アスパラギナーゼは、大腸菌が産生
するものと違って、患者に投与しても抗体を産生し難い
利点はあるものの、特開平４−３２０６８４号公報に開
示されたヒト細胞はＬ−アスパラギナーゼ産生能が充分
高いとは言えず、Ｌ−アスパラギナーゼを量産しようと
すると、細胞を大量に培養しなければならない問題があ
り、また特開昭５５−１９０１８号公報で開示された方
法においても、工業的規模で継続して新鮮な人尿を得る
ことが困難であるという問題がある。

【０００５】ところで、昨今の組換えＤＮＡ技術の進歩
には目覚しいものがある。今日では、目的とするポリペ
プチドをコードするＤＮＡを単離することができれば、
そのＤＮＡと自律複製可能なベクターから組換えＤＮＡ
を作製し、これを微生物や動植物の細胞に導入して得ら
れる形質転換体を培養することにより、所望量のポリペ
プチドが容易に取得できるようになった。しかしながら
今日に至るまで、Ｌ−アスパラギナーゼをコードする哺
乳類由来のＤＮＡは未だ単離されておらず、当然のこと
ながら、組換えＤＮＡ技術により、哺乳類由来のＬ−ア
スパラギナーゼが製造されてもいない。

【０００６】斯かる状況に鑑み、斯界においては、一刻
も早く活性なＬ−アスパラギナーゼをコードする哺乳類
由来のＤＮＡが単離され、その単離されたＤＮＡに組換
えＤＮＡ技術を適用することにより、Ｌ−アスパラギナ
ーゼ活性を有する哺乳類由来のポリペプチドを大量生産
する技術の確立が待ち望まれている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】この発明の第一の課題
は、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有する哺乳類由来のポ
リペプチドを提供することにある。

【０００８】この発明の第二の課題は、斯かるポリペプ
チドをコードするＤＮＡを提供することにある。

【０００９】この発明の第三の課題は、斯かるポリペプ
チドをコードするＤＮＡと自律複製可能なベクターを含
んでなる組換えＤＮＡを提供することにある。

【００１０】この発明の第四の課題は、斯かる組換えＤ
ＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体を提供するこ
とにある。

【００１１】この発明の第五の課題は、斯かる形質転換
体を用いる上記ポリペプチドの製造法を提供することに
ある。

【００１２】この発明の第六の課題は、斯かるポリペプ
チドを有効成分として含んでなる感受性疾患剤を提供す
ることにある。

【００１３】

【課題を解決するための手段】この発明は、上記第一の
課題をＬ−アスパラギナーゼ活性を有する哺乳類由来の
ポリペプチドにより解決するもである。

【００１４】またこの発明は、上記第二の課題をＬ−ア
スパラギナーゼ活性を有する哺乳類由来のポリペプチド
をコードするＤＮＡにより解決するものである。

【００１５】またこの発明は、上記第三の課題をＬ−ア
スパラギナーゼ活性を有する哺乳類由来のポリペプチド
をコードするＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んで
なる組換えＤＮＡにより解決するものである。

【００１６】またこの発明は、上記第四の課題を、Ｌ−
アスパラギナーゼ活性を有する哺乳類由来のポリペプチ
ドをコードするＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転
換体により解決するものである。

【００１７】またこの発明は、上記第五の課題を、Ｌ−
アスパラギナーゼ活性を有する哺乳類由来のポリペプチ
ドをコードするＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転
換体を培養し、産生したポリペプチドを培養物から採取
してなるポリペプチドの製造方法により解決するもので
ある。

【００１８】またこの発明は、上記第六の課題を、Ｌ−
アスパラギナーゼ活性を有する哺乳類由来のポリペプチ
ドを有効成分として含んでなる感受性疾患剤により解決
するものである。

【００１９】

【作用】哺乳類由来のこの発明のポリペプチドは、Ｌ−
アスパラギンに作用し、Ｌ−アスパラギン酸とアンモニ
アを生成する。

【００２０】この発明のＤＮＡは、自律複製可能な適宜
ベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、この組換えＤＮ
Ａを、通常当該ポリペプチドを産生しないけれども、容
易に増殖させることのできる適宜宿主に導入して形質転
換体とすることにより、当該ポリペプチドの産生を発現
する。

【００２１】この発明の複製可能な組換えＤＮＡは、通
常、当該ポリペプチドを産生しないけれども、容易に増
殖させることのできる適宜宿主に導入して形質転換体と
することにより、当該ポリペプチドの産生を発現する。

【００２２】この発明の形質転換体は、培養すると、当
該ポリペプチドの産生を発現する。

【００２３】この発明の製造方法に従ってこの形質転換
体を培養すれば、所望量のポリペプチドが容易に得られ
る。

【００２４】この発明の感受性疾患剤は、ヒトに投与す
ると重篤な副作用なく、顕著な治療・予防効果を発揮す
る。

【００２５】本発明者は、Ｌ−アスパラギナーゼをコー
ドするモルモット及びヒト由来のＤＮＡを世界で初めて
単離し、その塩基配列を解明するのに成功した。すなわ
ち、モルモット由来のＤＮＡは、配列表における配列番
号１５に示す塩基配列を、また、ヒト由来のＤＮＡは、
配列表における配列番号１６に示す塩基配列を有してい
ることを明らかにした。この知見は、同じ出願人による
特願平第７−４２５６４号明細書（特開平８−２１４８
８５号公報）に開示されている。本発明はこれら知見に
基づくものであって、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有す
る哺乳類由来のポリペプチドを世界で初めて提供するも
のである。

【００２６】

【発明の実施の形態】この発明のポリペプチドは、それ
が哺乳類に由来するものであって、かつ、Ｌ−アスパラ
ギナーゼ活性を有する限りその出所・由来は問わない。
この発明のポリペプチドは哺乳類由来の遺伝子を発現さ
せることにより得ることができ、通常、配列表における
配列番号１、２及び３に示すアミノ酸配列を含んでい
る。ただし、その配列番号３に示すアミノ酸配列におい
て、符号「Ｘａａ」を付して示したアミノ酸はグルタミ
ン又はアルギニンを表すものとする。個々のポリペプチ
ドとしては、例えば、配列表における配列番号４乃至９
に示すいずれかのアミノ酸配列のポリペプチドが挙げら
れる。ただし、斯界の技術水準に鑑み、その配列番号４
乃至９に示すアミノ酸配列に対して、Ｌ−アスパラギナ
ーゼ活性を実質的に喪失させることなく、そのアミノ酸
の１個又は２個以上を他のアミノ酸で置換することは比
較的容易である。一方、同じＤＮＡに由来するポリペプ
チドであっても、それを導入する際に用いるベクターの
種類や、それを導入する宿主の種類又はそのＤＮＡを含
む形質転換体の培養に使用する培地の成分・組成や培養
温度・ｐＨなどによっては、宿主内酵素によるＤＮＡ発
現後の修飾や精製の過程で、所期の活性は保持している
ものの、Ｎ末端及び／又はＣ末端におけるアミノ酸が１
個又は２個以上欠失するか、Ｎ末端及び／又はＣ末端に
１個又は２個以上のアミノ酸が付加したり、産生したポ
リペプチドに糖鎖の付加が生じることがある。斯かる状
況に鑑み、配列表における配列番号４乃至９に示すいず
れかのアミノ酸配列をそっくりそのまま有するポリペプ
チドは言うに及ばず、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有す
る限り、それらの相同体も、当然この発明に包含され
る。なお、この発明のポリペプチドは、通常多量体の形
態、望ましくは、４量体の形態をとるときにＬ−アスパ
ラギナーゼ活性を有する。

【００２７】この発明のポリペプチドは、通常、組換え
ＤＮＡ技術により製造される。すなわち、この発明のポ
リペプチドは、通常、それをコードするＤＮＡを含む形
質転換体を培養し、産生したポリペプチドを培養物から
採取することにより製造することができる。斯かる形質
転換体は、例えば、配列表における配列番号１０乃至１
５に示すいずれかの塩基配列を含んでいる組換えＤＮＡ
を適宜宿主に宿主に導入することにより得ることができ
る。なお上記の塩基配列は、遺伝子コードの縮重を利用
して、コードするアミノ酸配列を変えることなく、塩基
の１個又は２個以上を他の塩基で置き換えても良い。ま
た、ＤＮＡの宿主中での当該ポリペプチドの産生を促す
ために、当該ポリペプチド又はその相同体をコードする
塩基配列における、塩基の１個又は２個以上を他の塩基
で適宜置換し得ることは云うまでもない。さらには、当
該ポリペプチド又はその相同体をコードする塩基配列に
おける塩基の５′末端及び／又は３′末端に１個又は２
個以上のアミノ酸をコードする配列及び／又はアミノ酸
をコードしない配列を付加し得ることも云うまでもな
い。

【００２８】この発明のポリペプチドをコードするＤＮ
Ａは、その発現産物たるポリペプチドがＬ−アスパラギ
ナーゼ活性を有している限り、それが天然から得られた
ものであっても、人為的に合成されたものであってもか
まわないし、また天然から得られたものと配列の一致す
る野生型ＤＮＡであっても、野生型ＤＮＡに対するＤＮ
Ａ相同体であっても構わない。この発明のポリペプチド
をコードするＤＮＡの天然の給源としては、例えば、モ
ルモットの肝臓が挙げられ、そこからは常法により、例
えば、配列番号１５に示す塩基配列を含んでいる野生型
ＤＮＡが得られる。すなわち、同じ出願人による特願平
７−４２５６４号明細書（特開平８−２１４８８５号公
報）に開示されているように、先ず、モルモット肝臓よ
り精製したポリ（Ａ）付加ＲＮＡを材料として、常法に
よりｃＤＮＡライブラリーを作製する。ここに、モルモ
ット血清より精製したＬ−アスパラギナーゼの部分アミ
ノ酸配列に基づき化学合成したオリゴヌクレオチドをプ
ローブとして用いて、プラークハイブリダイゼーション
法を適用し、この発明のポリペプチドをコードするＤＮ
Ａを含むファージクローンを採取する。斯くして得られ
たファージクローンを通常一般の方法により処理すれ
ば、当該ＤＮＡが得られる。また、配列表における配列
番号１５に基づいてＤＮＡを化学合成することも可能で
ある。野生型ＤＮＡに対する相同体の例としては、例え
ば、配列表における配列番号１０乃至１４に示す塩基配
列を含む個々のＤＮＡが挙げられる。配列表における配
列番号１０に示す塩基配列を含むＤＮＡは、配列表にお
ける配列番号１５に示す、上述のようにして得られる野
生型ＤＮＡに、斯界において慣用の方法、例えば、ＰＣ
Ｒ法や点突然変異導入法を、配列表における配列番号１
０の塩基配列に基づいて適用することにより得ることが
できる。配列表における配列番号１１乃至１４に示す塩
基配列を含むＤＮＡは、いずれも以下のようにして得る
ことができる。すなわち、先ず、同じ出願人による特願
平７−４２５６４号明細書（特開平８−２１４８８５号
公報）に開示されたような、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラ
リーのスクリーニング等により、配列表における配列番
号１６に示す塩基配列を含む野生型ＤＮＡを得る。そし
て次に、この野生型ＤＮＡに、斯界において慣用のＰＣ
Ｒ法や点突然変異導入法などを、配列表における配列番
号１１乃至１４の塩基配列に基づき適用すればよい。ま
た、配列表における配列番号１０乃至１４に示す塩基配
列に基づいてＤＮＡを化学合成することも可能である。

【００２９】斯かるＤＮＡは、通常、組換えＤＮＡの形
態で宿主に導入される。組換えＤＮＡは、通常ＤＮＡと
自律複製可能なベクターを含んでなり、ＤＮＡが入手で
きれば、通常一般の組換えＤＮＡ技術により比較的容易
に調製することができる。斯かるベクターの例として
は、例えば、ｐＫＫ２２３−３、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＲ
Ｌ−λ、ｐＢＴｒｐ２ＤＮＡ、ｐＵＢ１１０、ＹＥｐ
１３、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、ｐＢＩ１２
１、ｐＣＤＭ８、ｐＢＰＶ、ＢＣＭＧＳｎｅｏ等のプラ
スミドベクターが挙げられ、このうち、この発明のＤＮ
Ａを大腸菌、枯草菌等の原核細胞で発現させるにはｐＫ
Ｋ２２３−３、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＲＬ−λ、ｐＢＴｒ
ｐ２ＤＮＡおよびｐＵＢ１１０が、また酵母或いは動
植物由来の細胞すなわち、真核細胞で発現させるにはＹ
Ｅｐ１３、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、ｐＢＩ１
２１、ｐＣＤＭ８、ｐＢＰＶ及びＢＣＭＧＳｎｅｏが好
適である。

【００３０】斯かるベクターにこの発明のＤＮＡを挿入
するには、斯界において通常一般の方法が採用される。
具体的には、例えば、先ず、自律複製可能なベクターを
制限酵素により切断する。次にＰＣＲ法を応用して、こ
の発明のＤＮＡの５′末端及び３′末端に、先にベクタ
ーの切断に用いたのと同一の制限酵素切断部位を導入し
二本鎖とした後、同制限酵素で切断する。次に、該ベク
ターと該ＤＮＡ断片の混合液に、ＤＮＡリガーゼを作用
させて連結する。斯くして得られた組換えＤＮＡは、適
宜宿主に導入して形質転換体とし、これを培養すること
により無限に複製可能である。

【００３１】この発明による組換えＤＮＡは、大腸菌、
枯草菌、放線菌、酵母、植物細胞、動物細胞を始めとす
る適宜の宿主に導入することができる。宿主が大腸菌の
場合には、例えば、宿主を組換えＤＮＡとカルシウムイ
オンの存在下で培養すればよく、一方宿主が枯草菌の場
合には、例えば、コンピテントセル法やプロトプラスト
法を適用すればよい。また宿主が動物細胞の場合には、
例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン法やエレクトロポレー
ション法によればよい。形質転換体をクローニングする
には、ハイブリダイゼーション法を適用するか、培地で
培養し、Ｌ−アスパラギナーゼを産生するものを選択す
ればよい。

【００３２】斯くして得られる形質転換体は、培地で培
養すると、菌体内外又は細胞内外に当該ポリペプチドを
産生する。培地には、通常、炭素源、窒素源、ミネラル
さらには必要に応じてアミノ酸やビタミンなどの微量栄
養素を補足した通常一般の液体培地が使用され、ここの
炭素源としては、澱粉、澱粉加水分解物、グルコース、
果糖、蔗糖などの糖質が、また窒素源としては、例えば
アンモニア乃至アンモニウム塩、尿素、硝酸塩、ペプト
ン、酵母エキス、脱脂大豆、コーンスティープリカー、
肉エキスなどの含窒素無機乃至有機物が挙げられる。形
質転換体を斯かる培地に接種し、栄養培地を温度２５乃
至６５℃、ｐＨ５乃至８に保ちつつ、通気攪拌などによ
る好気的条件下で約１乃至１０日間培養すれば、当該ポ
リペプチドを含む培養物が得られる。この培養物は、感
受性疾患剤としてそのまま使用可能なこともあるが、通
常は、例えば、使用に先立ち必要に応じて、超音波や細
胞壁溶解酵素により菌体又は細胞を破砕した後、濾過、
遠心分離などにより当該ポリペプチドを菌体破砕物又は
細胞破砕物から分離し、精製する。又例えば、培養物か
ら菌体又は細胞を濾過、遠心分離などにより除去した培
養上清を回収し、精製する。精製には、菌体又は細胞破
砕物由来の不溶性成分を除去した上澄液や、培養上清
に、例えば、塩析、透析、濾過、濃縮、ゲル濾過クロマ
トグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和性
クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、等電点
電気泳動及びゲル電気泳動などの、蛋白質を精製するた
めの斯界における通常一般の方法が採用でき、必要に応
じて、これら方法を適宜組み合わせればよい。そして、
最終使用形態に応じて、精製したポリペプチドを濃縮・
凍結乾燥して液状又は固状にすればよい。

【００３３】以下、実験例に基づき説明するが、ここで
用いられる方法は斯界において慣用のものであり、例え
ば、ジェイ・サムブルックら、『モレキュラー・クロー
ニング・ア・ラボラトリー・マニュアル』（１９８９
年）、コールド・スプリング・ハーバー発行や、松村正
実、『ラボマニュアル遺伝子工学』（１９８８年）、丸
善発行などにも詳述されている。

【００３４】

【実験例１】〈モルモット及びヒト由来の野生型ＤＮＡの発現〉

【００３５】

【実験例１−１】〈モルモット由来の野生型ＤＮＡの発現〉

【００３６】

【実験例１−１（ａ）】〈モルモット由来の野生型ＤＮＡの調製〉モルモット由
来のＬ−アスパラギナーゼをコードする野生型ＤＮＡ
は、同じ出願人による特願平７−４２５６４号明細書
（特開平８−２１４８８５号公報）に開示された方法に
準じて調製した。このＤＮＡは、配列表における配列番
号１５に示す塩基配列を有していた。以後、その配列番
号１５に示す塩基配列において、ポリペプチドをコード
する領域すなわち、当該塩基配列における第２０乃至第
１７１４の塩基よりなる配列を有するＤＮＡを『ＧＰＡ
／ＷＴＤＮＡ』と呼ぶ。また、ＧＰＡ／ＷＴＤＮＡ
の発現産物たる、配列表における配列番号１５に並記し
たアミノ酸配列を有するポリペプチドを、以後『モルモ
ット野生型Ｌ−アスパラギナーゼ』と呼ぶ。なお、配列
表における配列番号１７には、ＧＰＡ／ＷＴＤＮＡの
塩基配列とともに、そのコードするアミノ酸配列が併記
されている。

【００３７】

【実験例１−１（ｂ）】〈組換えＤＮＡの調製〉０．５ｍｌ容反応管に１０×Ｐ
ＣＲ緩衝液を１０μｌ、２５ｍＭｄＮＴＰミックスを
１μｌ、鋳型として、実験例１−１（ａ）で得たモルモ
ット由来のＬ−アスパラギナーゼをコードする野生型Ｄ
ＮＡを１ｎｇとり、配列表の配列番号１５に並記したア
ミノ酸配列におけるＮ末端及びＣ末端付近の配列に基づ
き化学合成したオリゴヌクレオチドをセンスプライマー
及びアンチセンスプライマーとして適量加え、滅菌蒸留
水で９９．５μｌとした後、２．５単位／μｌアンプリ
タックＤＮＡポリメラーゼを０．５μｌ加えた。センス
プライマーは、配列が５′−ＡＡＴＣＴＣＧＡＧＣＣＡ
ＣＣＡＴＧＧＣＧＣＧＣＧＣＡＴＣＡ−３′であり、配
列表における配列番号１５に併記したアミノ酸配列のＮ
末端をコードする部分の上流に、エム・コザックが『ニ
ュークレイック・アシッド・リサーチ』、第１５巻、８
１２５乃至８１４８頁（１９８７年）に示した動物細胞
における共通配列を付加し、さらにその上流に制限酵素
ＸｈｏＩ切断部位を付加したものである。アンチセン
スプライマーは、配列が５′−ＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴ
ＴＡＴＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＧＣＧＧＣＡＣ−３′であ
り、配列表における配列番号１５に併記したアミノ酸配
列のＣ末端をコードする部分の下流に２個の終始コドン
を付加し、さらにその下流に制限酵素ＮｏｔＩ切断部
位を付加した配列に相補的な配列のものである。常法に
より、上記混合物を９４℃で１分間、５５℃で１分間、
７２℃で３分間の順序でインキュベートするサイクルを
４０回繰り返すことによりＰＣＲを行いＤＮＡを増幅さ
せ、ＧＰＡ／ＷＴＤＮＡを含むＤＮＡを得た。このＤ
ＮＡを制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで切断するこ
とにより得られる約１．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を２５ｎ
ｇとり、これに予め制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで
切断しておいたインビトロジェン社製プラスミドベクタ
ー『ｐＣＤＭ８』を１０ｎｇを加え、さらに宝酒造製ラ
イゲーション・キット・バージョン２の溶液Ｉを先のＤ
ＮＡ混合溶液と同容量加えた後、１６℃で２時間インキ
ュベートして、複製可能な組換えＤＮＡ『ｐＣＧＰＡ／
ＷＴ』を得た。

【００３８】組換えＤＮＡｐＣＧＰＡ／ＷＴをコンピ
テントセル法によりインビトロジェン社製大腸菌ＭＣ１
０６１／Ｐ３株に導入し、得られた形質転換体を２０μ
ｇ／ｍｌのアンピシリン及び１０μｇ／ｍｌのテトラサ
イクリンを含むＬブロス培地（ｐＨ７．２）に接種し、
３７℃で１８時間振とう培養した。培養物を遠心分離し
て形質転換体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法を適
用して組換えＤＮＡｐＣＧＰＡ／ＷＴを抽出した。蛍光
光度計を使用する自動シーケンサにより分析したところ
ｐＣＧＰＡ／ＷＴは、その３′末端に終止コドンが連結
されたＧＰＡ／ＷＴＤＮＡを含んでおり、またＧＰＡ
／ＷＴＤＮＡは、ＣＭＶプロモーター下流に５′末端
から３′末端方向に連結されていることが確認された。

【００３９】実験例１乃び後述する実験例２でのＤＮＡ
の発現には、いずれもサル腎臓由来の細胞株であるＣＯ
Ｓ−１細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１６５０）を宿主とし
た系を用いた。この系は一過性発現系であるため、形質
転換体内では導入されたＤＮＡが安定して、すなわち数
日を超えて保持されず、形質転換体を用いて繰り返し目
的とするペプチドを産生できないという欠点がある。し
かし、該細胞に先述のプラスミドベクター『ｐＣＤＭ
８』のようなＳＶ４０ウイルス複製起点を有するベクタ
ーを導入した場合には、その細胞あたりのコピー数が一
次的に１０⁵個程度に上昇することが知られており、こ
のために目的とするＤＮＡの発現産物の解析が極めて容
易であるという利点がある。

【００４０】

【実験例１−１（ｃ）】〈組換えＤＮＡのＣＯＳ−１細胞への導入と発現〉実施
例１−１（ｂ）で調製した組換えＤＮＡｐＣＧＰＡ／
ＷＴを、フレデリック・エム・オースベルらが『カレン
ト・プロトコール・イン・モレキュラー・バイオロジ
ー』（１９８７年）、ジョン・ワイリー・アンド・サン
ズ・インク発行、チャプター９．２．１乃至９．２．３
及び、チャプター９．２．５乃至９．２．６で紹介して
いるＤＥＡＥ−デキストラン法に準じてＣＯＳ−１細胞
に導入し、発現させた。詳細には、先ず口径３．５ｃｍ
のベクトン・ディッキンソン・ラブウェア製６穴マルチ
ウエルプレート『３０４６』の１穴に２．５ｍｌの１０
％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むＤＭＥ培地を入れ、１．
８×１０⁵ 個のＣＯＳ−１細胞を接種し、５％（ｖ／
ｖ）ＣＯ₂ インキュベーター内で３７℃で培養した。翌
日、培養上清をアスピレーターで除去し、５０ｍＭトリ
ス−塩酸（ｐＨ７．４）を含むＤＭＥ培地で細胞を洗浄
後、２．８μｇ／ｍｌのｐＣＧＰＡ／ＷＴ、５０ｍＭの
トリス−塩酸（ｐＨ７．４）、０．４ｍｇ／ｍｌのＤＥ
ＡＥ−デキストラン、０．１ｍＭのクロロキンを含むＤ
ＭＥ培地を、１穴あたり２．５ｍｌずつ加え、５％（ｖ
／ｖ）ＣＯ₂ インキュベーター内で３７℃で４時間静置
した。その後上清を除去し１０（ｖ／ｖ）％ＤＭＳＯを
含む１０ｍＭリン酸食塩緩衝液（以後ＰＢＳという）を
１穴当たり２．５ｍｌ添加して室温で２分間静置し、上
清を除去して５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．４）を含
むＤＭＥ培地で細胞を洗浄し、２．５ｍｌのコスモバイ
オ社製ＣＯＳ培地を加え、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ₂インキ
ュベーター内で３７℃で３日間培養し、目的ＤＮＡを発
現させた。なお、対照区としてプラスミドベクターｐＣ
ＤＭ８を用いてこれと同一の実験をも行った。

【００４１】３日間培養した後の、先述の培養器を−８
０℃で静置して凍結させた後、室温で融解させる操作を
３回繰り返して細胞を破砕させた。その後全培養物を遠
沈管に移し取り、遠心分離により不溶性成分を沈澱とし
て除去し、全可溶性画分を得た。そしてこれを膜濃縮
し、１穴由来の全可溶性画分を０．５ｍｌに調整して、
以降の分析に用いた。

【００４２】

【実験例１−１（ｄ）】〈Ｌ−アスパラギナーゼ活性の測定〉Ｌ−アスパラギナ
ーゼ活性は、次のようにして測定した活性値（単位）で
表示した。すなわち、１．５ｍｌ反応管に被検試料を５
０μｌずつ分注する一方、Ｌ−アスパラギンを１．４ｍ
ｇ／ｍｌになるように５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）に溶解し、溶液を１反応管あたり２００μｌずつ加
え反応混合液とした。同反応管を３７℃で０、１、２、
４、６及び１６時間静置した後、反応混合液中のＬ−ア
スパラギン酸をアミノ酸分析機により測定した。これと
並行して、１．０、０．５又は０．２５単位／ｍｌに希
釈した大腸菌由来のＬ−アスパラギナーゼ標品を用いる
系を設け、３７℃で０及び１時間静置した後、Ｌ−アス
パラギン酸測定結果から求めたＬ−アスパラギン酸の増
加量に基づき検量線を作成した。被検試料の系で測定さ
れたＬ−アスパラギン酸の増加量をこの検量線に内挿
し、被検試料の活性値を推定した。活性の低い被検試料
は反応時間を２時間以上にのばした系での測定結果から
活性値を推定した。なお、Ｌ−アスパラギナーゼ１単位
は、上記条件下で反応させたとき、１分間にＬ−アスパ
ラギンからアンモニアを１μｍｏｌ遊離する量と定義し
た。

【００４３】実験例１−１（ｃ）で得た全可溶性画分そ
れぞれにこの処理を施し、３．６×１０⁵ 個のＣＯＳ−
１細胞由来の全可溶性画分中に検出されたＬ−アスパラ
ギナーゼ活性の総量として表示した。その結果、モルモ
ット野生型Ｌ−アスパラギナーゼの活性は０．０８３単
位であった。対照区では、検出されなかった。

【００４４】

【実験例１−１（ｅ）】〈ウエスタン・ブロッティング〉先ず以下の方法によ
り、抗Ｌ−アスパラギナーゼ抗体を調製した。すなわ
ち、常法に従って化学合成した、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌ
ｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ
−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−
Ａｒｇ−Ｃｙｓにより表される配列のオリゴペプチドの
Ｃ末端にキーホール・リンペット・ヘモシアニンを結合
させ、精製した後、常法に従いウサギに免疫した。２週
間間隔で６回免疫した後、全採血し５０％（ｗ／ｖ）硫
安塩析にて精製し、抗Ｌ−アスパラギナーゼ・ウサギ抗
血清を得た。次に、ユー・ケー・レムリが『ネイチャ
ー』、第２２７巻、６８０乃至６８５頁（１９７０年）
に報告した方法に準じて、実験例１−１（ｃ）で得た、
全可溶性画分のうち０．２ｍｌを、還元剤存在下で１
２．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動（以後ＳＤＳ−ＰＡＧＥという）に供し、泳動さ
れた全ポリペプチドをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
からニトロセルロース膜に転写した後、先の抗Ｌ−アス
パラギナーゼ・ウサギ抗血清を用いて、エイチ・トービ
ンが『プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユー・エス・
エー』、第７６巻、４３５０乃至４３５４頁（１９７９
年）に報告した方法に準じてウエスタン・ブロッティン
グを行った。発色はアルカリフォスファターゼ発色系に
よった。対照と比較して、試料で特異的に染色されたバ
ンドを確認するとともに、染色されたバンドを分子量マ
ーカーと比較してＬ−アスパラギナーゼのサブユニット
あたりの分子量を求めた。用いた分子量マーカーは、ウ
シ血清アルブミン（６７ｋＤａ）、オボアルブミン（４
５ｋＤａ）、大豆トリプシンインヒビター（２０．１ｋ
Ｄａ）及びα−ラクトアルブミン（１４．４ｋＤａ）で
あり、これらはアミドブラックにて染色した。実験例１
−１（ｃ）で得た全可溶性画分は明瞭なバンドは示さな
かった。

【００４５】

【実験例１−１（ｆ）】〈ゲル濾過による分子量の測定〉次に実験例１−１
（ｃ）で得た、ＣＯＳ−１細胞由来の全可溶性画分のう
ち２ｍｌを、ＰＢＳで平衡化したファルマシア製『ハイ
ロード・スーパーデックス・２００・カラム』（内径１
６ｍｍ×６０ｃｍ）を用いてゲル濾過カラムクロマトグ
ラフィーに供し、溶出フラクションのＬ−アスパラギナ
ーゼ活性を調べることにより、モルモット野生型Ｌ−ア
スパラギナーゼのネイティブな分子量を調べた。分子量
マーカーとして、チログロブリン（６６９ｋＤａ）、フ
ェリチン（４４０ｋＤａ）、カタラーゼ（２３２ｋＤ
ａ）、アルドラーゼ（１５８ｋＤａ）、ウシ血清アルブ
ミン（６７ｋＤａ）及びオボアルブミン（４３ｋＤａ）
を用た。その結果、溶出画分のＬ−アスパラギナーゼ活
性のピークは分子量約３００ｋＤａに相当する位置に認
められた。

【００４６】ウエスタン・ブロッティングでは明瞭なバ
ンドを示さなかったため、モルモット野生型Ｌ−アスパ
ラギナーゼの解離した状態での分子量は測定できなかっ
た。そのネイティブな状態での分子量は、ゲル濾過の結
果から、約３００ｋＤａと見積もられた。これに対し
て、モルモット血清Ｌ−アスパラギナーゼを精製し、ネ
イティブな状態での分子量をゲル濾過により分子量を求
めると、約１９０ｋＤａと見積もられる。因みに、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにより解離した状態での分子量を求めると
約４３ｋＤａと見積もられる。一方、同じ出願人による
特願平７−４２５６４号明細書（特開平８−２１４８８
５号公報）に開示されたモルモット血清Ｌ−アスパラギ
ナーゼの３個の部分アミノ酸配列は、モルモット野生型
Ｌ−アスパラギナーゼのアミノ酸配列における、第１０
乃至第２３６のアミノ酸残基よりなる領域内に認められ
る。また、イー・ハームズらが『フェブス・レター』、
第２８５巻、５５乃至５８頁（１９９１年）で大腸菌由
来のＬ−アスパラギナーゼ等を用いた実験結果から提唱
した、Ｌ−アスパラギナーゼ活性に必須な２つの共通配
列すなわち、配列表における配列番号１及び２に示すア
ミノ酸配列は、モルモット野生型Ｌ−アスパラギナーゼ
のアミノ酸配列上ではそれぞれ、第１６乃至第１９のア
ミノ酸残基及び第１１４乃至第１１８のアミノ酸残基よ
りなる配列と一致する。これらのことと実験例１−１に
示した結果から本発明者は、モルモット野生型Ｌ−アス
パラギナーゼにとって、当該アミノ酸配列における第１
乃至第４００のアミノ酸残基又はその前後のアミノ酸残
基よりなる部分が、その活性発現に必須であろうと推測
した。そこで、実験例２−１ではモルモット由来のＬ−
アスパラギナーゼ相同体であるＣ末端欠失変異体の活性
を調べるべく、モルモット由来のＤＮＡ相同体の発現産
物の性質・性状について試験する。

【００４７】

【実験例１−２】〈ヒト由来の野生型ＤＮＡの発現〉ヒト由来のＬ−アス
パラギナーゼをコードする野生型ＤＮＡは、同じ出願人
による特願平７−４２５６４号明細書（特開平８−２１
４８８５号公報）に開示された方法に準じて調製した。
このＤＮＡは配列表における配列番号１６に示す塩基配
列を有していた。以後、その配列番号１６に示す塩基配
列においてポリペプチドをコードする領域すなわち、当
該塩基配列における第９３乃至第１８１１の塩基よりな
る配列を有するＤＮＡを『ＨＡ／ＷＴＤＮＡ』と呼
ぶ。また、ＨＡ／ＷＴＤＮＡの発現産物たる配列番号
１６に並記したアミノ酸配列を有するポリペプチドを、
以後『ヒト野生型Ｌ−アスパラギナーゼ』と呼ぶことも
ある。なお、配列表における配列番号１８には、ＨＡ／
ＷＴＤＮＡの塩基配列とともに、そのコードするアミ
ノ酸配列が併記されている。

【００４８】鋳型、センスプライマー及びアンチセンス
プライマー以外は実験例１−１（ｂ）と同一の条件でＰ
ＣＲを行った。鋳型は、この実験例１−２で得たヒト由
来のＬ−アスパラギナーゼをコードする野生型ＤＮＡ、
センスプライマーは配列が５′−ＡＡＴＣＴＣＧＡＧＣ
ＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＧＣＧＣＧＧＴＧ−３′である
オリゴヌクレオチド、アンチセンスプライマーは配列が
５′−ＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＣＡＧＡＣＡＣＣ
ＡＧＧＣＡＧＣＡＣ−３′であるオリゴヌクレオチドで
あった。この結果増幅されたＤＮＡを引き続き実験例１
−１（ｂ）と同じ方法で処理し、組換えＤＮＡ『ｐＣＨ
Ａ／ＷＴ』を調製した。同様に配列を確認した後、ＣＯ
Ｓ−１細胞に導入し、発現させて、実験例１−１と同様
に分析した。

【００４９】モルモット野生型Ｌ−アスパラギナーゼと
は対照的に、ヒト野生型Ｌ−アスパラギナーゼは、本実
験系においては活性が検出できなかった。この原因のひ
とつとして、例えば、ヒト野生型Ｌ−アスパラギナーゼ
はモルモット野生型Ｌ−アスパラギナーゼに比べ、比活
性が低いことが考えられた。そこで、次の実験例２−２
においては、ヒト由来のＤＮＡ相同体の発現産物の性質
・性状について試験する。

【００５０】

【実験例２】〈モルモット及びヒト由来のＤＮＡ相同体の発現〉

【００５１】

【実験例２−１】〈モルモット由来のＤＮＡ相同体の発現〉モルモット由
来の野生型ＤＮＡの、特定の位置の塩基配列が終止コド
ンに置換されたＤＮＡ相同体を次のように調製した。す
なわち、配列表の配列番号１７に示す塩基配列におけ
る、第１０９０乃至第１０９２の塩基よりなる配列を終
止コドンに置換したＤＮＡ、及び第１０１２乃至第１０
１４の塩基よりなる配列を終止コドンに置換したＤＮＡ
を、ＰＣＲ法を適用して調製した。アンチセンスプライ
マーの配列以外は、全て実験例１−１（ｂ）と同一の条
件でＰＣＲを行った。それぞれのＤＮＡ調製のために使
用したアンチセンスプライマーの配列は、５′−ＣＴＧ
ＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＣＡＴＧＣＣＧＴＧＧＧＣＡＧ
ＴＧＴ−３′及び５′−ＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴ
ＣＡＧＣＣＣＡＡＣＡＣＧＴＡＧＧＡ−３′であった。
この結果増幅されたＤＮＡを引き続き実験例１−１
（ｂ）と同様に処理し、組換えＤＮＡ『ｐＣＧＰＡ／Ｄ
３６４ｓｔｐ』及び『ｐＣＧＰＡ／Ｌ３３８ｓｔｐ』を
調製した。同様に配列を確認したところ、ｐＣＧＰＡ／
Ｄ３６４ｓｔｐ及びｐＣＧＰＡ／Ｌ３３８ｓｔｐは、そ
れぞれモルモット野生型Ｌ−アスパラギナーゼにおけ
る、第１乃至第３６３のアミノ酸残基及び第１乃至第３
３７のアミノ酸残基よりなる配列をコードするＤＮＡ
と、それぞれの３′末端側に介在配列なく存在する終止
コドンを含むものでった。以後これらのポリペプチドを
コードする部分のＤＮＡを、それぞれ『ＧＰＡ／Ｄ３６
４ｓｔｐＤＮＡ』及び『ＧＰＡ／Ｌ３３８ｓｔｐＤ
ＮＡ』と呼ぶ。ＧＰＡ／Ｄ３６４ｓｔｐＤＮＡ及びＧ
ＰＡ／Ｌ３３８ｓｔｐＤＮＡはＣＭＶプロモーター下
流に、５′末端から３′末端方向に連結されていた。以
後これらのＤＮＡの発現産物を『モルモットＬ−アスパ
ラギナーゼ相同体』と呼ぶこともある。

【００５２】これら組換えＤＮＡを、実験例１−１に従
ってＣＯＳ−１細胞に導入した後、同様に試験した。対
照区として、実験例１−１（ｂ）で調製した組換えＤＮ
ＡｐＣＧＰＡ／ＷＴ及びｐＣＤＭ８を同様に処理し試験
した。結果を表１に示す。

【００５３】

【表１】

【００５４】表１に示したように、上記のモルモットに
由来する野生型ＤＮＡ及びその相同体のうち、ＧＰＡ／
ＷＴＤＮＡ及びＧＰＡ／Ｄ３６４ｓｔｐＤＮＡの発
現産物では活性が認められたが、ＧＰＡ／Ｌ３３８ｓｔ
ｐＤＮＡ発現産物では活性は検出されなかった。この
ことは、モルモット由来のＬ−アスパラギナーゼが十分
な活性を示すためには、野生型Ｌ−アスパラギナーゼの
アミノ酸配列上、第１乃至第３６３のアミノ酸残基より
なる領域があれば十分であることを示唆している。この
第１乃至第３６３のアミノ酸残基よりなる配列は、配列
表における配列番号４に示したものである。これをコー
ドするＤＮＡの塩基配列は、配列表における配列番号１
０に示したものである。またモルモット野生型Ｌ−アス
パラギナーゼのアミノ酸配列は、配列表における配列番
号５に示されている。

【００５５】

【実験例２−２】〈ヒト由来のＤＮＡ相同体の発現〉ヒト由来の野生型Ｄ
ＮＡの特定の位置の塩基配列を終止コドン又は他のアミ
ノ酸に対するコドンに置換したＤＮＡ相同体を調製し
た。先ず、配列表の配列番号１８に示す塩基配列におけ
る第１０９６乃至第１０９８の塩基よりなる配列を終止
コドンに置換したＤＮＡ相同体を、ＰＣＲ法を適用して
調製した。すなわち、鋳型、センスプライマー及びアン
チセンスプライマー以外は、全て実験例１−１（ｂ）と
同一の条件でＰＣＲを行った。鋳型は、実験例１−２で
得たヒト由来のＬ−アスパラギナーゼをコードする野生
型ＤＮＡ、センスプライマーは配列が５′−ＡＡＴＣＴ
ＣＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＧＣＧＣＧＧＴＧ−
３′であるオリゴヌクレオチド、アンチセンスプライマ
ーは配列が、５′−ＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＡ
ＣＡＣＣＧＡＧＧＧＴＧＧＣＧＴ−３′であるオリゴヌ
クレオチドであった。この結果増幅されたＤＮＡを実験
例１−１に従って処理し、組換えＤＮＡ『ｐＣＨＡ／Ｅ
３６６ｓｔｐ』を調製し、配列を確認した。ｐＣＨＡ／
Ｅ３６６ｓｔｐは、配列表の配列番号１６に併記したア
ミノ酸配列における第１乃至第３６５のアミノ酸残基よ
りなる配列をコードするＤＮＡと、その３′末端に介在
配列なく存在する終止コドンを含むものであった。以後
このコード部分のＤＮＡを『ＨＡ／Ｅ３６６ｓｔｐＤ
ＮＡ』と呼ぶ。ＨＡ／Ｅ３６６ｓｔｐＤＮＡは、ＣＭＶ
プロモーターの下流に５′末端から３′末端方向に連結
されていた。

【００５６】ＤＮＡの特定の位置のコドンを他のアミノ
酸に対するコドンへ置換するには、ロバート・エム・ホ
ートンらが『メソッズ・イン・エンザイモロジー』、ア
カデミック・プレス発行、第２１７巻、２７０乃至２７
９頁（１９９３年）で紹介しているオーバーラップ・エ
クステンション法に従って行った。その概要を図１に示
すと共に以下に説明する。第１、変異を導入すべき位置
の塩基を、目的とする別の塩基に置換した互いに相補な
変異プライマーＡ及び変異プライマーＳを調製する。こ
こで、変異プライマーＡはアンチセンス鎖であり、変異
プライマーＳはセンス鎖である。他方、目的とするＤＮ
Ａの全域を増幅し得るプライマーのセット、すなわち、
５′末端プライマー及び３′末端プライマーを調製す
る。ここで５′末端プライマーはセンス鎖であり、３′
末端プライマーはアンチセンス鎖である。第２、基の塩
基配列のＤＮＡを鋳型として、先の５′末端プライマー
と変異プライマーＡを用いて通常のＰＣＲを行う。これ
と並行して、同じＤＮＡを鋳型として、先の３′末端プ
ライマーと変異プライマーＳを用いて通常のＰＣＲを行
う（第１段ＰＣＲ）。第３、第１段ＰＣＲにより増幅し
た２つのＤＮＡ、第１段ＰＣＲで使用した５′末端プラ
イマー及び３′末端プライマーを、同一の反応管で混合
し、ＰＣＲを行う（第２段ＰＣＲ）。第１段ＰＣＲで増
幅された２つのＤＮＡ断片は、鋳型兼プライマーとして
変異が導入されたＤＮＡの生成に用いられ、５′末端プ
ライマー及び３′末端プライマーは変異が導入されたＤ
ＮＡ増幅のためのプライマーとして用いられる。この方
法により、７とおりの塩基置換を導入したＤＮＡすなわ
ち、７種のＤＮＡ相同体を調製した。７とおりの塩基置
換の内容と、それに伴うアミノ酸配列の変化の内容を表
２にまとめて示した。この７種のＤＮＡ相同体の調製に
用いた、鋳型ＤＮＡと変異プライマーＡ及び変異プライ
マーＳの配列を表３にまとめて示した。一方、７個のＤ
ＮＡ相同体の調製に用いた、５′末端プライマー及び
３′末端プライマーはそれぞれ、この実験例２−２で先
に示したｐＣＨＡ／Ｅ３６６ｓｔｐの調製時に用いたセ
ンスプライマー及びアンチセンスプライマーと同一であ
る。

【００５７】

【表２】

【００５８】

【表３】

【００５９】ここで得たヒト由来のＤＮＡ相同体を実験
例１−１に従って処理し、組換えＤＮＡ『ｐＣＨＡ／Ｍ
ＵＴ１』、『ｐＣＨＡ／ＭＵＴ２』、『ｐＣＨＡ／ＭＵ
Ｔ３』、『ｐＣＨＡ／ＭＵＴ４』、『ｐＣＨＡ／ＭＵＴ
５』、『ｐＣＨＡ／ＭＵＴ６』及び『ｐＣＨＡ／ＭＵＴ
７』を得た。以後、この実験例２−２で得た、以上のＤ
ＮＡ相同体の発現産物を、『ヒトＬ−アスパラギナーゼ
相同体』と呼ぶこともある。同様に配列を確認した後、
ＣＯＳ−１細胞へ導入し発現させ、試験した。対照区と
して、実験例１−２で得たｐＣＨＡ／ＷＴ及びｐＣＤＭ
８を同様に処理・試験した。また、この実験例２−２で
は各発現産物の量的な比較のための参考としてウエスタ
ン・ブロッティングで検出されたバンドのシグナル強度
を、デンシトメトリーにより数値化した。以上の結果を
表４に示した。

【００６０】

【表４】

【００６１】表４の結果は、ヒト由来のＬ−アスパラギ
ナーゼは野生型でも、その相同体の一つであるＣ末端欠
失変異体（ＨＡ／Ｅ３６６ｓｔｐＤＮＡ発現産物）で
もモルモット由来のそれらに比べ、比活性が低いことを
示唆している。また、これに対し、ヒト由来の野生型Ｌ
−アスパラギナーゼ本来のアミノ酸配列の内のいくつか
を他のアミノ酸に置換した点突然変異体の中には、検出
され得る程度に比活性が上昇するものがあることをも示
している。発現産物が少なくとも検出され得る程度の活
性を示すことが確認された、ヒト由来のＤＮＡ相同体
ＨＡ／ＭＵＴ１ＤＮＡ、ＨＡ／ＭＵＴ２ＤＮＡ、ＨＡ
／ＭＵＴ３ＤＮＡ及びＨＡ／ＭＵＴ５ＤＮＡは、そ
れぞれ配列表における配列番号１１、１２、１３及び１
４に示す塩基配列を有すものであり、そのコードするポ
リペプチドは、それぞれ配列表における配列番号６、
７、８及び９に示すアミノ酸配列を有すものである。

【００６２】以上の実験結果から、哺乳類に由来するポ
リペプチドが、少なくとも実験例１及び２で用いた発現
系・活性測定系で検出され得る程度のＬ−アスパラギナ
ーゼ活性を示すためには、従来公知の、配列表における
配列番号１及び２に示すアミノ酸配列の他に、例えば、
同じく配列番号３に示すアミノ酸配列を有する必要があ
ることを見出した（ただし、符号「Ｘａａ」を付して示
したアミノ酸はグルタミン又はアルギニンを表すものと
する）。因みに、モルモット野生型Ｌ−アスパラギナー
ゼは、そのアミノ酸配列上第２９８乃至第３０２の残基
よりなる部分ににこの配列を有している。配列表におけ
る配列番号１乃至３に示すアミノ酸配列を全て有するポ
リペプチドとしては、例えば、モルモットに由来する、
配列表における配列番号４乃び５に示すアミノ酸配列を
有するポリペプチドと、ヒトに由来する配列表における
配列番号６乃至９に示すアミノ酸配列を有するポリペプ
チドが挙げられる。

【００６３】以上の知見に基づき、本発明者はＬ−アス
パラギナーゼ活性を有する哺乳類由来のポリペプチドを
発明するに至った。以下実施例に基づきこの発明を説明
するが、ここで選択した方法はいずれも斯界において慣
用のものである。当然ながら、この発明を実施するため
の方法は、これらに限定されるわけではない。

【００６４】

【実施例Ａ−１】〈Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有するモルモット由来の
野生型ポリペプチド〉

【００６５】

【実施例Ａ−１（ａ）】〈形質転換体の調製〉０．５ｍｌ容反応管に１０×ＰＣ
Ｒ緩衝液を１０μｌ、２５ｍＭｄＮＴＰミックスを１
μｌ、鋳型として、実験例１−１で得た組換えＤＮＡ
ｐＣＧＰＡ／ＷＴを１ｎｇとり、ＧＰＡ／ＷＴＤＮＡ
の５′末端及び３′末端の配列に基づき化学合成したオ
リゴヌクレオチドをセンスプライマー又はアンチセンス
プライマーとして適量加え、滅菌蒸留水で９９．５μｌ
とした後、２．５単位／μｌアンプリタックＤＮＡポリ
メラーゼを０．５μｌ加えた。センスプライマーは、配
列が５′−ＧＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＧＣＧＣＧＣＡ
ＴＣＡ−３′であり、ＧＰＡ／ＷＴＤＮＡの５′末端
の上流に制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位を付加したもの
である。アンチセンスプライマーは、配列が５′−ＧＣ
ＡＡＧＣＴＴＴＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＧＣＧＧＣＡＣ−
３′であり、ＧＰＡ／ＷＴＤＮＡの３′末端の下流に
終始コドンを付加し、さらにその下流に制限酵素Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ切断部位を付加した配列に相補的な配列のも
のである。常法により、上記混合物を９４℃で１分間、
５５℃で１分間、７２℃で３分間の順序でインキュベー
トするサイクルを４０回繰り返すことによりＰＣＲを行
い、ＤＮＡを増幅させた。このＤＮＡを制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断することにより約
１．７ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を
得た。このＤＮＡ断片を２５ｎｇとり、これに予め制限
酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断しておい
たファルマシア製プラスミドベクター『ｐＫＫ２２３−
３』を１０ｎｇを加え、さらに宝酒造製ライゲーション
キット・バージョン２の溶液Ｉを先のＤＮＡ混合溶液と
同体積加えた後、１６℃で２時間インキュベートするこ
とにより、複製可能な組換えＤＮＡ『ｐＫＧＰＡ／Ｗ
Ｔ』を得た。

【００６６】組換えＤＮＡｐＫＧＰＡ／ＷＴをコンピ
テントセル法によりファルマシア製大腸菌ＪＭ１０５株
に導入し、ここで得られる形質転換体『Ｊ−ＧＰＡ／Ｗ
Ｔ』を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬブロス培
地（ｐＨ７．２）に接種し、３７℃で１８時間振とう培
養した。培養物を遠心分離して形質転換体を採取し、通
常のアルカリ−ＳＤＳ法を適用して組換えＤＮＡｐＫ
ＧＰＡ／ＷＴを抽出した。蛍光光度計を使用する自動シ
ーケンサで分析することにより、このｐＫＧＰＡ／ＷＴ
においては、図２に示すごとく配列表における配列番号
１７に示す塩基配列のＧＰＡ／ＷＴＤＮＡがタックプ
ロモーターの下流に５′末端から３′末端方向に連結さ
れているのが確認された。また、ＧＰＡ／ＷＴＤＮＡ
の３′末端側には、介在配列なく終止コドンが存在して
いることも確認された。

【００６７】

【実施例Ａ−１（ｂ）】〈ポリペプチドの製造〉形質転換体Ｊ−ＧＰＡ／ＷＴを
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬブロス培地（ｐ
Ｈ７．２）に接種し、３７℃で１８時間振とう培養し
た。次に３０ｌ容ジャーファーメンタに新鮮なＬブロス
培地を１８ｌとり、先に培養しておいた種培養物を１％
（ｖ／ｖ）の割合で接種し、３７℃で通気攪拌培養し
た。培養物の一部を厚さ１ｃｍのキュベットにとり、波
長６５０ｎｍにおける吸光度を測定しつつ培養し、吸光
度が約１．５に達した時点でＩＰＴＧを終濃度０．１ｍ
Ｍとなるように添加し、さらに５時間培養した。その
後、遠心分離により培養物から回収される菌体を、１３
９ｍＭ塩化ナトリウム、７ｍＭリン酸水素二ナトリウム
及び３ｍＭリン酸二水素ナトリウムを含む混液（ｐＨ
７．２）に懸濁し常法により超音波処理して菌体を破砕
し、菌体破砕物を遠心分離して上清を回収した。

【００６８】この上清に氷冷下で硫酸アンモニウムを５
０％（ｗ／ｖ）まで加え、均一に溶解し、暫時静置し遠
心分離後、沈澱を採取した。この沈澱を２０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解させ、同緩衝液に透析
後、同緩衝液で平衡化したファルマシア製『キュー・セ
ファロース・エフ・エフ・カラム』に負荷し、同緩衝液
で充分に洗浄後、０から０．５Ｍの塩化ナトリウムの濃
度勾配下、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を
通液した。塩化ナトリウム濃度が０．１乃至０．３Ｍ付
近で溶出した画分を採取し、膜濃縮しながら１０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶媒交換した。
同緩衝液で平衡化したシグマ製『Ｌ−アスパラギン・ア
ガロース』に負荷し、同緩衝液で洗浄後０．５Ｍ塩化ナ
トリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．５）で溶出させた。溶出画分を膜濃縮し、１０％
（ｖ／ｖ）グリセリンを含むトリス塩酸−塩緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）で平衡化したファルマシア製『ハイロード・
スーパーデックス・２００・カラム』に負荷し、約３０
０ｋＤａ付近の溶出画分を採取したところ、純度９０％
以上の精製ポリペプチドが、培養液あたり約０．１ｍｇ
／ｍｌの収量で得られた。

【００６９】

【実施例Ａ−１（ｃ）】〈理化学的性質〉精製ポリペプチドを次のように分析
し、その理化学的性質を明らかにした。精製ポリペプチ
ドのネイティブな分子量は、実験例１−１（ｅ）に準じ
てゲル濾過により求めた。その結果、溶出画分のＬ−ア
スパラギナーゼ活性のピークは分子量約３００ｋＤａに
相当する位置に認められた。精製ポリペプチドの、解離
した状態での分子量は、実験例１−１（ｅ）中に示した
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより求めた。その結果、分子量５０
±１０ｋＤａの位置に、主たるバンドが認められた。こ
の結果は、精製ポリペプチドは、ネイティブな状態では
多量体を形成していることを示している。２種類の方法
の測定誤差及び、大腸菌を始めとする哺乳類以外の従来
公知のＬ−アスパラギナーゼのネイティブな状態での形
態が全て４量体であることを考慮に入れると、この結果
は精製ポリペプチドが４量体を形成していることを示し
ていると考えられる。またこの精製ポリペプチドを、実
験例１−１（ｄ）に示した方法に供した結果、Ｌ−アス
パラギナーゼ活性を有していることが確認された。

【００７０】

【実施例Ａ−２】〈Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有するモルモット由来の
野生型ポリペプチド〉

【００７１】

【実施例Ａ−２（ａ）】〈形質転換体の調製〉概要を図３に示す。先ず始めに、
センスプライマー及びアンチセンスプライマーの配列以
外は、全て実施例Ａ−１（ａ）と同一の条件でＰＣＲを
行った。センスプライマーの配列は、５′−ＧＴＧＡＡ
ＴＴＣＧＧＡＧＧＴＴＣＡＧＡＴＧＧＣＧＣＧＣＧＣＡ
ＴＣＡ−３′であり、アンチセンスプライマーの配列
は、５′−ＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＡＴＧＧＣＡ
ＧＧＣＧＧＣＡＣ−３′であった。ここで増幅されたＤ
ＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで切断し、
約１．７ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ断片を得
た。このＤＮＡ断片７０ｎｇと、予め制限酵素Ｘｈｏ
Ｉ及びＮｏｔＩで切断しておいたファルマシア製プラ
スミドベクター『ｐＢＰＶ』５０ｎｇ及び、リンカーと
して次の塩基配列よりなる４種のオリゴヌクレオチド
を、それぞれ２５ｎｇずつ混合した。第１のオリゴヌク
レオチドの配列は、５′−ＴＣＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧ
ＡＡＧＴＧＴＴＣＧＴＧＧＧＴＴＡＴＴ−３′、第２の
それは、５′−ＴＴＣＴＴＣＣＴＧＡＴＧＧＣＣＧＴＡ
ＧＴＧＡＣＡＧＧＡＧＴＧ−３′、第３のそれは、５′
−ＡＡＴＴＣＡＣＴＣＣＴＧＴＣＡＣＴＡＣＧＧＣＣＡ
ＴＣＡＧＧＡ−３′であり、第４のそれは、５′−ＡＧ
ＡＡＡＡＴＡＡＣＣＣＡＣＧＡＡＣＡＣＴＴＣＡＴＧＧ
ＴＧＧＣ−３′である。なおリンカーとして用いたオリ
ゴヌクレオチドは、いずれも常法に従い合成後、ファル
マシア製Ｔ４ポリヌクレオチド・キナーゼを作用させた
後、エタノール沈澱により精製したものを用いた。この
ＤＮＡ混合溶液に、等容の宝酒造製ライゲーション・キ
ット・バージョン２の溶液Ｉを加え、１６℃で２時間保
持することにより複製可能な組換えＤＮＡ『ｐＢＩｇＧ
ＰＡ／ＷＴ』を得た。

【００７２】組換えＤＮＡｐＢＩｇＧＰＡ／ＷＴをコ
ンピテントセル法により大腸菌ＨＢ１０１株に導入し、
得られる形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを
含むＬブロス培地（ｐＨ７．２）に接種し、３７℃で１
８時間振とう培養した。培養物を遠心分離して菌体を回
収し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法を適用して組換ＤＮＡ
ｐＢＩｇＧＰＡ／ＷＴを抽出した。自動シーケンサで
配列を分析すると、このｐＢＩｇＧＰＡ／ＷＴは図４に
示すような構造をしていることが確認された。すなわ
ち、モロニー・マウス肉腫ウイルスのロング・ターミナ
ル・リピート由来のエンハンサー（Ｅｍｓｖ）とマウス
・メタロチオネインＩ遺伝子由来のプロモーター（Ｐｍ
ｔｉ）からなる転写調節域の下流に、ディー・エフ・ス
ターンが『サイエンス』、第２３５巻、３２１乃至３２
４頁（１９８７年）で紹介しているイムノグロブリンの
分泌シグナル配列を含むペプチド部分をコードするＤＮ
Ａ、ＩｇｓｅｃＤＮＡが連結されており、さらに
その下流に同じ読み枠で、ＧＰＡ／ＷＴＤＮＡが５′
末端から３′末端方向に連結されていた。また、ＧＰＡ
／ＷＴＤＮＡの３′末端には介在配列なく終止コドン
が存在していることも確認した。

【００７３】この組換えＤＮＡｐＢＩｇＧＰＡ／ＷＴ
を、ライフ・テクノロジーズ製リポフェクチン試薬を用
い、添付のプロトコールに従って、マウス由来細胞株Ｃ
１２７（ＡＴＣＣＣＲＬ−１６１６）に導入した。該
組換えＤＮＡが導入された形質転換体は、第一段階とし
て、増殖の制御能力の喪失すなわちフォーカス形成能に
よって選択した。第二段階として、フォーカスを含む近
傍の細胞を滅菌濾紙にて回収し、目的とする形質転換体
を通常の限界希釈法により、Ｌ−アスパラギナーゼ活性
の産生能に基づき単細胞化した。斯くして形質転換体
『Ｃ−ＧＰＡ／ＷＴ』を得た。

【００７４】

【実施例Ａ−２（ｂ）】〈ポリペプチドの製造〉形質転換体Ｃ−ＧＰＡ／ＷＴ
を、先ず種培養として２．５ｍｌの１０％（ｖ／ｖ）ウ
シ胎児血清を含むＤＭＥ培地を添加した口径３．５ｃｍ
のベクトン・ディッキンソン・ラブウェア製６穴マルチ
ウエルプレート『３０４６』の１穴に接種し、コンフル
エントにまで培養した。ここから細胞をトリプシン処理
することにより剥離させ、その一部を種細胞として、同
培地を添加した別の新たな６穴プラスチックプレートの
６穴に接種し培養した。同様の操作を順次培養器を拡張
させながら繰り返し、細胞数を増加させて、１５０ｃｍ
² 培養フラスコ５０本を用いて、該形質転換体を通常の
連続培養に供した。最終的に培養上清１００ｌを回収
し、実施例Ａ−１（ｂ）の菌体破砕物の上清の処理方法
と同様に、硫酸アンモニウム沈澱、沈澱溶解液のキュー
・セファロース・エフエフ・カラムを用いたクロマトグ
ラフィー、その溶出画分のＬ−アスパラギン・アガロー
ス・を用いたクロマトグラフィー及びその溶出画分のハ
イロード・スーパーデックス・２００・カラムを用いた
クロマトグラフィーの順で処理した。その結果、純度９
０％以上の精製ポリペプチドが、培養液あたり約１μｇ
／ｍｌの収量で得られた。

【００７５】

【実施例Ａ−２（ｃ）】〈理化学的性質〉得られた精製ポリペプチドの理化学的
性質を、実施例Ａ−１（ｃ）と同様に調べると、実施例
Ａ−１（ｂ）で得た精製ポリペプチドと同等の性質を示
すものであることが確認された。

【００７６】

【実施例Ａ−３】〈Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有するヒト及びモルモッ
ト由来のポリペプチド相同体〉

【００７７】

【実施例Ａ−３（ａ）】〈形質転換体の調製〉鋳型、センスプライマー及びアン
チセンスプライマー以外は実施例Ａ−１（ａ）に示した
方法と同一条件でＰＣＲを行い、得られたＤＮＡを実施
例Ａ−１（ａ）と同様に処理することにより組換えＤＮ
Ａ『ｐＫＧＰＡ／Ｄ３６４ｓｔｐ』、『ｐＫＨＡ／ＭＵ
Ｔ１』、『ｐＫＨＡ／ＭＵＴ２』、『ｐＫＨＡ／ＭＵＴ
３』及び『ｐＫＨＡ／ＭＵＴ５』を得た。それぞれの組
換えＤＮＡの調製のために用いた鋳型ＤＮＡの名称、セ
ンスプライマー及びアンチセンスプライマーの塩基配列
を表５にまとめて示す。実施例Ａ−１（ａ）と同様に塩
基配列を分析し、これらの組換えＤＮＡの構造確認し
た。これらの組換えＤＮＡの構造は、図５乃至９に示し
ている。

【００７８】

【表５】

【００７９】ここで得た、組換えＤＮＡを同様に実施例
Ａ−１（ａ）に従って処理し、形質転換体『Ｊ−ＧＰＡ
／Ｄ３６４ｓｔｐ』、『Ｊ−ＨＡ／ＭＵＴ１』、『Ｊ−
ＨＡ／ＭＵＴ２』、『Ｊ−ＨＡ／ＭＵＴ３』及び『Ｊ−
ＨＡ／ＭＵＴ５』を得た。

【００８０】

【実施例Ａ−３（ｂ）】〈ポリペプチドの製造〉これら５種類の形質転換体を実
施例Ａ−１（ｂ）と同様に培養、菌体の破砕、菌体破砕
物の硫酸アンモニウム沈澱、沈澱溶解液のキュー・セフ
ァロース・エフエフ・カラムを用いたクロマトグラフィ
ー、及びその溶出画分のＬ−アスパラギン・アガロース
を用いたクロマトグラフィーの順で処理した。この結果
得られた溶出画分は実施例Ａ−１（ｂ）と同様に膜濃縮
した後、ハイロード・スーパーデックス・２００・カラ
ムを用いたクロマトグラフィーに供し、約１４０ｋＤａ
付近の溶出画分を採取したところ、いずれも純度９０％
以上の精製ポリペプチドが培養液あたり約０．１ｍｇ／
ｍｌの収量で得られた。これらの精製ポリペプチドを実
施例Ａ−１（ｃ）の方法により分析し、理化学的性質を
明らかにした。実施例Ａ−１で得た結果とあわせて表６
に示した。

【００８１】

【表６】

【００８２】表６に示す結果は、大腸菌を宿主として発
現させ精製された、それぞれの野生型ポリペプチド或い
はポリペプチド相同体は、いずれもＬ−アスパラギナー
ゼ活性を示すことが分かる。またこれらのポリペプチド
は４量体を形成していることが示されている。

【００８３】

【実施例Ａ−４】〈Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有するヒト及びモルモッ
ト由来のポリペプチド相同体〉

【００８４】

【実施例Ａ−４（ａ）】〈形質転換体の調製〉鋳型、センスプライマー又はアン
チセンスプライマー以外は実施例Ａ−１（ａ）に示した
方法と同一条件でＰＣＲを行った。得られたＤＮＡを実
施例Ａ−２（ａ）で用いたのと同一のリンカーを用い、
同一の条件で連結することにより、組換えＤＮＡ『ｐＢ
ＩｇＧＰＡ／Ｄ３６４ｓｔｐ』、『ｐＢＩｇＨＡ／ＭＵ
Ｔ１』、『ｐＢＩｇＨＡ／ＭＵＴ２』、『ｐＢＩｇＨＡ
／ＭＵＴ３』及び『ｐＢＩｇＨＡ／ＭＵＴ５』を得た。
それぞれの組換えＤＮＡの調製のためのＰＣＲに用いた
鋳型ＤＮＡの名称、センスプライマー及びアンチセンス
プライマーの塩基配列を表７にまとめて示す。実施例Ａ
−１（ａ）と同様に塩基配列を分析し、これらの組換え
ＤＮＡの構造を確認した。これらの組換えＤＮＡの構造
は、図１０乃至１４に示している。

【００８５】

【表７】

【００８６】ここで得た、組換えＤＮＡを同様に実施例
Ａ−２（ａ）と同様に処理することにより、それぞれ形
質転換体『Ｃ−ＧＰＡ／Ｄ３６４ｓｔｐ』、『Ｃ−ＨＡ
／ＭＵＴ１』、『Ｃ−ＨＡ／ＭＵＴ２』、『Ｃ−ＨＡ／
ＭＵＴ３』及び『Ｃ−ＨＡ／ＭＵＴ５』を得た。

【００８７】

【実施例Ａ−４（ｂ）】〈ポリペプチドの製造〉

【００８８】これら５種類の形質転換体を実施例Ａ−２
（ｂ）と同様に培養し、培養上清を実施例Ａ−１（ｂ）
の菌体破砕の処理方法と同様に硫酸アンモニウム沈澱、
沈澱溶解液のキュー・セファロース・エフ・エフ・カラ
ムを用いたクロマトグラフィー及びその溶出画分のＬ−
アスパラギン・アガロース・ゲルを用いたクロマトグラ
フィーの順で処理した。この結果得られた溶出画分は実
施例Ａ−１（ｂ）と同様に膜濃縮した後、ハイロード・
スーパーデックス・２００・カラムを用いたクロマトグ
ラフィーに供し、約１４０ｋＤａ付近の溶出画分を採取
したところ、純度９０％以上の精製ポリペプチドが培養
液あたり約１μｇ／ｍｌの収量で得られた。これらの精
製ポリペプチドを実施例Ａ−１（ｃ）の方法により分析
し、理化学的性質を明らかにした。実施例Ａ−３で得た
結果とあわせて表８に示した。

【００８９】

【表８】

【００９０】表８に示す結果は、動物細胞を宿主として
発現させ精製された、それぞれの野生型ポリペプチド或
いは、ポリペプチド相同体は、いずれもＬ−アスパラギ
ナーゼ活性を示すことが分かる。またこれらのポリペプ
チドは４量体を形成していることが示される。

【００９１】以上実施例Ａに示すごとく、この発明のポ
リペプチドは、いずれもＬ−アスパラギナーゼ活性を示
す。したがって、この発明の感受性疾患剤は、ヒトに投
与すると、体内のＬ−アスパラギンを加水分解し、Ｌ−
アスパラギナーゼ感受性疾患の治療・予防に効果を発揮
する。この発明でいう感受性疾患とは、Ｌ−アスパラギ
ン依存性腫瘍細胞の存在に起因する疾患全般を意味する
ものとし、具体的には、例えば、急性白血病・急性転化
した慢性白血病・Ｔ細胞白血病等の白血病、非ホジキン
病・ホジキン病等の悪性リンパ腫を挙げることができ
る。斯くしてこの発明の感受性疾患剤は、上記のごとき
感受性疾患を治療・予防するための抗腫瘍剤としての用
途を有することとなる。剤型並びに感受性疾患の種類及
び性状にもよるが、この発明の感受性疾患剤は、通常、
液状、ペースト状又は固状に調製され、当該ポリペプチ
ドを０．０００００１乃至１００％（ｗ／ｗ）、望まし
くは、０．０００１乃至１００％（ｗ／ｗ）含んでい
る。

【００９２】この発明の感受性疾患剤は当該ポリペプチ
ド単独の形態はもとより、当該ポリペプチドとそれ以外
の生理的に許容される、例えば、基剤、賦形剤、可溶
剤、緩衝剤、安定剤、さらには必要に応じて、他の生理
活性物質乃至は他の薬剤のうちから選ばれる１種又は２
種以上との組成物としての形態をも包含する。基剤、賦
形剤、可溶剤、緩衝剤及び安定剤としては具体的には、
例えば、日本医薬品添加剤協会編集、『医薬品添加物辞
典』（１９９４年）、薬事日報社発行や、日本医薬品添
加剤協会編集、『医薬品添加物辞典追補１９９５』
（１９９５年）、薬事日報社発行などに記載のものが挙
げられる。他の生理活性物質乃至他の薬剤としては具体
的には、例えば、インターフェロン−α、インターフェ
ロン−β、インターフェロン−γ、インターロイキン
１、インターロイキン２、インターロイキン３、ＴＮＦ
−α、ＴＮＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、カルボコン、シクロ
フォスファミド、アクラルビシン、チオテパ、ブスルフ
ァン、アンシタビン、シタラビン、フルオロウラシル、
テトラヒドロフリルフルオロウラシル、メトトレキサー
ト、アクチノマイシンＤ、クロモマイシンＡ３、ダウノ
ルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、メルカプ
トプリン、プレドニゾロン、マイトマイシンＣ、ビンク
リスチン、ビンブラスチン、金コロイド、クレスチン、
ピシバニール、レンチナン及び丸山ワクチンなどが挙げ
られる。

【００９３】さらに、この発明の感受性疾患剤は、投薬
単位形態の薬剤をも包含し、その投薬単位形態の薬剤と
は、当該ポリペプチドを、例えば、１回当たりの用量又
はその正数倍（４倍まで）若しくはその約数（１／４０
まで）に相当する量を含んでおり、投薬に適する物理的
に分離した一体の剤型にある薬剤を意味する。この様な
投薬形態の薬剤としては、注射剤、液剤、散剤、顆粒
剤、錠剤、カプセル剤、舌下剤、点眼剤、点鼻剤、座剤
などが挙げられる。

【００９４】この発明の感受性疾患剤は経口的に投与し
ても非経口的に投与しても、いずれの場合にも、感受性
疾患の治療・予防に効果を発揮する。感受性疾患の種類
や症状にもよるが、具体的には、患者の症状や投与後の
経過を観察しながら、成人当たり約０．１μｇ乃至５０
０ｍｇ／回、望ましくは約０．１乃至１００ｍｇ／回の
ポリペプチドを１乃至４回／日又は１乃至７回／週の用
量で１日乃至１年間にわたって経口投与するか、皮内、
皮下、筋肉内又は静脈内に非経口投与すればよい。ま
た、この発明の感受性疾患剤のその他の一形態として
は、例えば、遺伝子治療を応用した形態が挙げられる。
つまり、この発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを
適宜宿主に導入してなる形質転換体を投与し、この発明
のポリペプチドを感受性疾患患者の生体内で産生させる
ことにより、上記の投与形態と同等の効果を発揮する。
なお、遺伝子治療を実施するための一般的手順は、例え
ば、島田隆、斎藤泉、小澤敬也編集、『実験医学別冊バ
イオマニュアルＵＰシリーズ遺伝子治療の基礎技術』
（１９９６年）、羊土社発行に詳述されている。

【００９５】次に、実験例３に基づき、この発明のポリ
ペプチドの生物活性について、実験例４に基づき、この
発明のポリペプチドの安全性について説明する。

【００９６】

【実験例３】〈生物活性〉

【００９７】

【実験例３−１】〈イン・ビトロにおける抗腫瘍細胞効果〉

【００９８】ヒト組織球リンパ腫細胞株Ｕ９３７（ＡＴ
ＣＣＮｏ．ＣＲＬ−１５９３）及びヒトリンパ芽球由
来細胞株Ｍｏｌｔ４（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＲＬ−１５８
２）を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ
１６４０培地で予め経代培養しておいた。対数増殖期に
あるそれぞれの細胞培養系から、細胞を遠心分離により
回収し、同培地で２×１０⁵個／ｍｌの細胞濃度に調整
し、該細胞懸濁液をベクトン・ディッキンソン・ラブウ
ェア製２４穴マルチウエルプレート『３０４７』プレー
トに、１穴あたり１ｍｌで合計１３穴に接種した。ここ
に実施例Ａ−１乃至Ａ−４で調製した１２種類の精製ポ
リペプチドのＰＢＳによる希釈液をそれぞれ添加し、５
％（ｖ／ｖ）ＣＯ₂ インキュベーター内で、３７℃で７
２時間培養した。各精製ポリペプチドの終濃度は、Ｌ−
アスパラギナーゼ活性として１単位／ｍｌであった。対
照区として、ＰＢＳを等容添加して同じく培養する系を
設けた。培養後細胞を回収し、トリパン・ブルーにより
死細胞を染色して、精製ポリペプチド添加系の細胞生存
率を対照区と比較した。その結果、いずれの精製ポリペ
プチドを添加した系も、細胞生存率は対照区と比較して
有意に低い値を示した。このことは、実施例Ａ−１乃至
Ａ−４で得られた精製ポリペプチドは、いずれもＵ９３
７及びＭｏｌｔ４に対する細胞障害性を有することを示
している。

【００９９】

【実験例３−２】〈イン・ビボにおける抗腫瘍細胞効果〉

【０１００】東北大学加齢医学研究所医用細胞資源セン
ターに登録されているマウスリンパ腫細胞株６Ｃ３ＨＥ
Ｄを、常法により１×１０⁷ 個／匹で８日ごとにその脇
腹に皮下注射することによって経代移植されているＣ３
Ｈマウスをモデルマウスとして用いた。該細胞の移植後
４日目から７日目までの毎日、該モデルマウスに実施例
Ａ−１乃至Ａ−４で得られた精製ポリペプチドを、４０
０単位／匹で、静脈注射にて投与した。移植後４及び８
日目の腫瘍の大きさを肉眼で観察した。なお精製ポリペ
プチドは、０．１５Ｍの塩化ナトリウム溶液で希釈した
後、ミリポア製の孔径０．４５μｍのメンブランフィル
ターで濾過した後に投与した。対照区として、０．１５
Ｍ塩化ナトリウム溶液を同様に処理した系を設けた。そ
の結果、対照区では腫瘍の明らかな肥大が認められたの
に対し、精製ポリペプチドを投与した系では腫瘍の明ら
かな退縮又は消失が認められた。このことは、実施例Ａ
−１乃至Ａ−４で調製される精製ポリペプチドが、いず
れもモデルマウスの腫瘍を治癒する能力があることを示
している。

【０１０１】

【実験例４】〈急性毒性試験〉実施例Ａ−１乃至Ａ−４で調製された
精製ポリペプチドをそれぞれ別個に、常法にしたがって
８週齢のマウスに経皮、経口あるいは腹腔内に注射投与
した。その結果、これらの精製ポリペプチドのＬＤ５０
は、いずれの投与経路による場合も約１００ｍｇ／ｋｇ
以上であった。このことは、この発明のポリペプチドが
ヒトへの投与を前提とする医薬品として安全であること
を裏付けている。

【０１０２】以下、この発明の感受性疾患剤につき実施
例を挙げて説明する。

【０１０３】

【実施例Ｂ】

〈感受性疾患剤〉

【０１０４】

【実施例Ｂ−１】〈液剤〉安定剤として１％（ｗ／ｖ）のヒト血清アルブ
ミンを含む生理食塩水に実施例Ａ−１乃至Ａ−４で得た
精製ポリペプチドをそれぞれ別個に０．１ｍｇ／ｍｌと
なるように溶解させ、常法に従った精密濾過により滅菌
して液剤を得た。

【０１０５】いずれの製品も安定性に優れ、悪性腫瘍、
急性白血病、悪性リンパ腫、慢性白血病の急性転化、Ｔ
細胞白血病を含む感受性疾患を治療・予防するための注
射剤、点眼剤、及び点鼻剤として有用である。

【０１０６】

【実施例Ｂ−２】〈液剤〉安定剤として１％（ｗ／ｖ）のグリセリンを含
む生理食塩水に実施例Ａ−１乃至Ａ−４で得た精製ポリ
ペプチドをそれぞれ別個に０．１ｍｇ／ｍｌとなるよう
に溶解させ、常法に従った精密濾過により滅菌して液剤
を得た。

【０１０７】いずれの製品も安定性に優れた、悪性腫
瘍、急性白血病、悪性リンパ腫、慢性白血病の急性転
化、Ｔ細胞白血病を含む感受性疾患を治療・予防するた
めの注射剤、点眼剤、及び点鼻剤として有用である。

【０１０８】

【実施例Ｂ−３】〈乾燥注射剤〉安定剤として、１％（ｗ／ｖ）の精製ゼ
ラチンを含む生理食塩水に実施例Ａ−１乃至Ａ−４で得
た精製ポリペプチドをそれぞれ別個に５０ｍｇ／ｍｌと
なるように溶解させ、常法に従った精密濾過により滅菌
して、バイアル瓶に１ｍｌずつ分注し、凍結乾燥後密栓
した。

【０１０９】いずれの製品も安定性に優れ、悪性腫瘍、
急性白血病、悪性リンパ腫、慢性白血病の急性転化、Ｔ
細胞白血病を含む感受性疾患を治療・予防するための乾
燥注射剤として有用である。

【０１１０】

【実施例Ｂ−４】〈軟膏剤〉滅菌蒸留水に和光純薬工業製カルボキシビニ
ルポリマー『ハイビスワコー１０４』と高純度トレハロ
ースをそれぞれ濃度１．４％（ｗ／ｗ）及び２．０％
（ｗ／ｗ）になるように溶解させ、実施例Ａ−１乃至Ａ
−４で得た精製ポリペプチドをそれぞれ別個に均一に混
合後、ｐＨ７．２に調整して１ｇ当たり該ポリペプチド
を約１０ｍｇ含むペースト状物を得た。

【０１１１】いずれの製品も延展性と安定性に優れ、悪
性腫瘍、急性白血病、悪性リンパ腫、慢性白血病の急性
転化、Ｔ細胞白血病を含む感受性疾患を治療・予防する
ための軟膏として有用である。

【０１１２】

【実施例Ｂ−５】〈錠剤〉林原製無水結晶α−マルトース粉末『ファイン
トース』に実施例Ａ−１乃至Ａ−４で得た精製ポリペプ
チドと細胞賦活剤としてのルミンを均一に混合し、得ら
れる混合物を打錠機により打錠して製品１錠（約２００
ｍｇ）当たり該ポリペプチド及びルミンをそれぞれ約５
ｍｇ含む錠剤を得た。

【０１１３】いずれの製品も摂取性と安定性に優れ、さ
らに細胞賦活作用も有し、悪性腫瘍、急性白血病、悪性
リンパ腫、慢性白血病の急性転化、Ｔ細胞白血病を含む
感受性疾患を治療・予防するための錠剤として有用であ
る。

【０１１４】

【発明の効果】この発明は、Ｌ−アスパラギナーゼ活性
を有する哺乳類由来のポリペプチドの発見に基づくもの
である。この発明のポリペプチドは、いずれもアミノ酸
配列まで解明されている物質であり、安定したＬ−アス
パラギンを加水分解する活性を有する。これにより、こ
の発明のポリペプチドは、Ｌ−アスパラギン依存性腫瘍
細胞に起因する各種の疾患に対する治療剤・予防剤とし
て威力を発揮する。

【０１１５】この発明のポリペプチドは哺乳類由来であ
ることから、ヒトに対する抗原性が低く、多量投与或い
は継続投与しても重篤な副作用を惹起することがない。
したがって、この発明のポリペプチドは、使用に際して
患者の感受性に関して厳密な管理をしなくとも、所望の
効果を発揮できる利点がある。

【０１１６】かくも有用なるこの発明のポリペプチド
は、これをコードするこの発明のＤＮＡを利用すること
により、所望量を容易に製造することができる。

【０１１７】この発明は、斯くも顕著な作用効果を発揮
するものであり、斯界に貢献すること誠に多大な意義の
ある発明であるといえる。

【０１１８】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：4 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【０１１９】配列番号：2 配列の長さ：5 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【０１２０】配列番号：3 配列の長さ：5 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【０１２１】配列番号：4 配列の長さ：363 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ポリペプチド配列 Met Ala Arg Ala Ser Gly Ser Glu Arg His Leu Leu Leu Ile Tyr Thr 1 5 10 15 Gly Gly Thr Leu Gly Met Gln Ser Lys Gly Gly Val Leu Val Pro Gly 20 25 30 Pro Gly Leu Val Thr Leu Leu Arg Thr Leu Pro Met Phe His Asp Lys 35 40 45 Glu Phe Ala Gln Ala Gln Gly Leu Pro Asp His Ala Leu Ala Leu Pro 50 55 60 Pro Ala Ser His Gly Pro Arg Val Leu Tyr Thr Val Leu Glu Cys Gln 65 70 75 80 Pro Leu Leu Asp Ser Ser Asp Met Thr Ile Asp Asp Trp Ile Arg Ile 85 90 95 Ala Lys Ile Ile Glu Arg His Tyr Glu Gln Tyr Gln Gly Phe Val Val 100 105 110 Ile His Gly Thr Asp Thr Met Ala Phe Gly Ala Ser Met Leu Ser Phe 115 120 125 Met Leu Glu Asn Leu His Lys Pro Val Ile Leu Thr Gly Ala Gln Val 130 135 140 Pro Ile Arg Val Leu Trp Asn Asp Ala Arg Glu Asn Leu Leu Gly Ala 145 150 155 160 Leu Leu Val Ala Gly Gln Tyr Ile Ile Pro Glu Val Cys Leu Phe Met 165 170 175 Asn Ser Gln Leu Phe Arg Gly Asn Arg Val Thr Lys Val Asp Ser Gln 180 185 190 Lys Phe Glu Ala Phe Cys Ser Pro Asn Leu Ser Pro Leu Ala Thr Val 195 200 205 Gly Ala Asp Val Thr Ile Ala Trp Asp Leu Val Arg Lys Val Asn Trp 210 215 220 Lys Asp Pro Leu Val Val His Ser Asn Met Glu His Asp Val Ala Leu 225 230 235 240 Leu Arg Leu Tyr Pro Gly Ile Pro Ala Ser Leu Val Arg Ala Phe Leu 245 250 255 Gln Pro Pro Leu Lys Gly Val Val Leu Glu Thr Phe Gly Ser Gly Asn 260 265 270 Gly Pro Ser Lys Pro Asp Leu Leu Gln Glu Leu Arg Ala Ala Ala Gln 275 280 285 Arg Gly Leu Ile Met Val Asn Cys Ser Gln Cys Leu Arg Gly Ser Val 290 295 300 Thr Pro Gly Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Gly Ala Asn Ile Val Ser Gly 305 310 315 320 Leu Asp Met Thr Ser Glu Ala Ala Leu Ala Lys Leu Ser Tyr Val Leu 325 330 335 Gly Leu Pro Glu Leu Ser Leu Glu Arg Arg Gln Glu Leu Leu Ala Lys 340 345 350 Asp Leu Arg Gly Glu Met Thr Leu Pro Thr Ala 355 360 363

【０１２２】配列番号：5 配列の長さ：565 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ポリペプチド配列 Met Ala Arg Ala Ser Gly Ser Glu Arg His Leu Leu Leu Ile Tyr Thr 1 5 10 15 Gly Gly Thr Leu Gly Met Gln Ser Lys Gly Gly Val Leu Val Pro Gly 20 25 30 Pro Gly Leu Val Thr Leu Leu Arg Thr Leu Pro Met Phe His Asp Lys 35 40 45 Glu Phe Ala Gln Ala Gln Gly Leu Pro Asp His Ala Leu Ala Leu Pro 50 55 60 Pro Ala Ser His Gly Pro Arg Val Leu Tyr Thr Val Leu Glu Cys Gln 65 70 75 80 Pro Leu Leu Asp Ser Ser Asp Met Thr Ile Asp Asp Trp Ile Arg Ile 85 90 95 Ala Lys Ile Ile Glu Arg His Tyr Glu Gln Tyr Gln Gly Phe Val Val 100 105 110 Ile His Gly Thr Asp Thr Met Ala Phe Gly Ala Ser Met Leu Ser Phe 115 120 125 Met Leu Glu Asn Leu His Lys Pro Val Ile Leu Thr Gly Ala Gln Val 130 135 140 Pro Ile Arg Val Leu Trp Asn Asp Ala Arg Glu Asn Leu Leu Gly Ala 145 150 155 160 Leu Leu Val Ala Gly Gln Tyr Ile Ile Pro Glu Val Cys Leu Phe Met 165 170 175 Asn Ser Gln Leu Phe Arg Gly Asn Arg Val Thr Lys Val Asp Ser Gln 180 185 190 Lys Phe Glu Ala Phe Cys Ser Pro Asn Leu Ser Pro Leu Ala Thr Val 195 200 205 Gly Ala Asp Val Thr Ile Ala Trp Asp Leu Val Arg Lys Val Asn Trp 210 215 220 Lys Asp Pro Leu Val Val His Ser Asn Met Glu His Asp Val Ala Leu 225 230 235 240 Leu Arg Leu Tyr Pro Gly Ile Pro Ala Ser Leu Val Arg Ala Phe Leu 245 250 255 Gln Pro Pro Leu Lys Gly Val Val Leu Glu Thr Phe Gly Ser Gly Asn 260 265 270 Gly Pro Ser Lys Pro Asp Leu Leu Gln Glu Leu Arg Ala Ala Ala Gln 275 280 285 Arg Gly Leu Ile Met Val Asn Cys Ser Gln Cys Leu Arg Gly Ser Val 290 295 300 Thr Pro Gly Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Gly Ala Asn Ile Val Ser Gly 305 310 315 320 Leu Asp Met Thr Ser Glu Ala Ala Leu Ala Lys Leu Ser Tyr Val Leu 325 330 335 Gly Leu Pro Glu Leu Ser Leu Glu Arg Arg Gln Glu Leu Leu Ala Lys 340 345 350 Asp Leu Arg Gly Glu Met Thr Leu Pro Thr Ala Asp Leu His Gln Ser 355 360 365 Ser Pro Pro Gly Ser Thr Leu Gly Gln Gly Val Ala Arg Leu Phe Ser 370 375 380 Leu Phe Gly Cys Gln Glu Glu Asp Ser Val Gln Asp Ala Val Met Pro 385 390 395 400 Ser Leu Ala Leu Ala Leu Ala His Ala Gly Glu Leu Glu Ala Leu Gln 405 410 415 Ala Leu Met Glu Leu Gly Ser Asp Leu Arg Leu Lys Asp Ser Asn Gly 420 425 430 Gln Thr Leu Leu His Val Ala Ala Arg Asn Gly Arg Asp Gly Val Val 435 440 445 Thr Met Leu Leu His Arg Gly Met Asp Val Asn Ala Arg Asp Arg Asp 450 455 460 Gly Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ala Val Gln Gly Arg His Arg Glu Cys 465 470 475 480 Ile Arg Leu Leu Arg Lys Ala Gly Ala Cys Leu Ser Pro Gln Asp Leu 485 490 495 Lys Asp Ala Gly Thr Glu Leu Cys Arg Leu Ala Ser Arg Ala Asp Met 500 505 510 Glu Gly Leu Gln Ala Trp Gly Gln Ala Gly Ala Asp Leu Gln Gln Pro 515 520 525 Gly Tyr Asp Gly Arg Ser Ala Leu Cys Val Ala Glu Ala Ala Gly Asn 530 535 540 Gln Glu Val Leu Ala Leu Leu Arg Asn Leu Ala Leu Val Gly Pro Glu 545 550 555 560 Val Pro Pro Ala Ile 565

【０１２３】配列番号：6 配列の長さ：365 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ポリペプチド配列 Met Ala Arg Ala Val Gly Pro Glu Arg Arg Leu Leu Ala Val Tyr Thr 1 5 10 15 Gly Gly Thr Ile Gly Met Arg Ser Glu Leu Gly Val Leu Val Pro Gly 20 25 30 Thr Gly Leu Ala Ala Ile Leu Arg Thr Leu Pro Met Phe His Asp Glu 35 40 45 Glu His Ala Arg Ala Arg Gly Leu Ser Glu Asp Thr Leu Val Leu Pro 50 55 60 Pro Asp Ser Arg Asn Gln Arg Ile Leu Tyr Thr Val Leu Glu Cys Gln 65 70 75 80 Pro Leu Phe Asp Ser Ser Asp Met Thr Ile Ala Glu Trp Val Arg Val 85 90 95 Ala Gln Thr Ile Lys Arg His Tyr Glu Gln Tyr His Gly Phe Val Val 100 105 110 Ile His Gly Thr Asp Thr Met Ala Phe Ala Ala Ser Met Leu Ser Phe 115 120 125 Met Leu Glu Asn Leu Gln Lys Thr Val Ile Leu Thr Gly Ala Gln Val 130 135 140 Pro Ile His Ala Leu Trp Ser Asp Gly Arg Glu Asn Leu Leu Gly Ala 145 150 155 160 Leu Leu Met Ala Gly Gln Tyr Val Ile Pro Glu Val Cys Leu Phe Phe 165 170 175 Gln Asn Gln Leu Phe Arg Gly Asn Arg Ala Thr Lys Val Asp Ala Arg 180 185 190 Arg Phe Ala Ala Phe Cys Ser Pro Asn Leu Leu Pro Leu Ala Thr Val 195 200 205 Gly Ala Asp Ile Thr Ile Asn Arg Glu Leu Val Arg Lys Val Asp Gly 210 215 220 Lys Ala Gly Leu Val Val His Ser Ser Met Glu Gln Asp Val Gly Leu 225 230 235 240 Leu Arg Leu Tyr Pro Gly Ile Pro Ala Ala Leu Val Arg Ala Phe Leu 245 250 255 Gln Pro Pro Leu Lys Gly Val Val Met Glu Thr Phe Gly Ser Gly Asn 260 265 270 Gly Pro Thr Lys Pro Asp Leu Leu Gln Glu Leu Arg Val Ala Thr Glu 275 280 285 Arg Gly Leu Val Ile Val Asn Cys Thr Gln Cys Leu Arg Gly Ala Val 290 295 300 Thr Thr Asp Tyr Ala Ala Gly Met Ala Met Ala Gly Ala Asn Val Ile 305 310 315 320 Ser Gly Phe Asp Met Thr Ser Glu Ala Ala Leu Ala Lys Leu Ser Tyr 325 330 335 Val Leu Gly Gln Pro Gly Leu Ser Leu Asp Val Arg Lys Glu Leu Leu 340 345 350 Thr Lys Asp Leu Arg Gly Glu Met Thr Pro Pro Ser Val 355 360 365

【０１２４】配列番号：7 配列の長さ：365 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ポリペプチド配列 Met Ala Arg Ala Val Gly Pro Glu Arg Arg Leu Leu Ala Val Tyr Thr 1 5 10 15 Gly Gly Thr Ile Gly Met Arg Ser Glu Leu Gly Val Leu Val Pro Gly 20 25 30 Thr Gly Leu Ala Ala Ile Leu Arg Thr Leu Pro Met Phe His Asp Glu 35 40 45 Glu His Ala Arg Ala Arg Gly Leu Ser Glu Asp Thr Leu Val Leu Pro 50 55 60 Pro Asp Ser Arg Asn Gln Arg Ile Leu Tyr Thr Val Leu Glu Cys Gln 65 70 75 80 Pro Leu Phe Asp Ser Ser Asp Met Thr Ile Ala Glu Trp Val Arg Val 85 90 95 Ala Gln Thr Ile Lys Arg His Tyr Glu Gln Tyr His Gly Phe Val Val 100 105 110 Ile His Gly Thr Asp Thr Met Ala Phe Ala Ala Ser Met Leu Ser Phe 115 120 125 Met Leu Glu Asn Leu Gln Lys Thr Val Ile Leu Thr Gly Ala Gln Val 130 135 140 Pro Ile His Ala Leu Trp Ser Asp Gly Arg Glu Asn Leu Leu Gly Ala 145 150 155 160 Leu Leu Met Ala Gly Gln Tyr Val Ile Pro Glu Val Cys Leu Phe Phe 165 170 175 Gln Asn Gln Leu Phe Arg Gly Asn Arg Ala Thr Lys Val Asp Ala Arg 180 185 190 Arg Phe Ala Ala Phe Cys Ser Pro Asn Leu Leu Pro Leu Ala Thr Val 195 200 205 Gly Ala Asp Ile Thr Ile Asn Arg Glu Leu Val Arg Lys Val Asp Gly 210 215 220 Lys Ala Gly Leu Val Val His Ser Ser Met Glu Gln Asp Val Gly Leu 225 230 235 240 Leu Arg Leu Tyr Pro Gly Ile Pro Ala Ala Leu Val Arg Ala Phe Leu 245 250 255 Gln Pro Pro Leu Lys Gly Val Val Met Glu Thr Phe Gly Ser Gly Asn 260 265 270 Gly Pro Thr Lys Pro Asp Leu Leu Gln Glu Leu Arg Val Ala Thr Glu 275 280 285 Arg Gly Leu Val Ile Val Asn Cys Thr Gln Cys Leu Arg Gly Ala Val 290 295 300 Thr Thr Asp Tyr Ala Ala Gly Met Ala Met Ala Gly Ala Gly Val Ile 305 310 315 320 Ser Gly Phe Asp Met Thr Ser Glu Ala Ala Leu Ala Lys Leu Ser Tyr 325 330 335 Val Leu Gly Gln Pro Gly Leu Ser Leu Asp Val Arg Lys Glu Leu Leu 340 345 350 Thr Lys Asp Leu Arg Gly Glu Met Thr Pro Pro Ser Val 355 360 365

【０１２５】配列番号：8 配列の長さ：365 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ポリペプチド配列 Met Ala Arg Ala Val Gly Pro Glu Arg Arg Leu Leu Ala Val Tyr Thr 1 5 10 15 Gly Gly Thr Ile Gly Met Arg Ser Glu Leu Gly Val Leu Val Pro Gly 20 25 30 Thr Gly Leu Ala Ala Ile Leu Arg Thr Leu Pro Met Phe His Asp Glu 35 40 45 Glu His Ala Arg Ala Arg Gly Leu Ser Glu Asp Thr Leu Val Leu Pro 50 55 60 Pro Asp Ser Arg Asn Gln Arg Ile Leu Tyr Thr Val Leu Glu Cys Gln 65 70 75 80 Pro Leu Phe Asp Ser Ser Asp Met Thr Ile Ala Glu Trp Val Arg Val 85 90 95 Ala Gln Thr Ile Lys Arg His Tyr Glu Gln Tyr His Gly Phe Val Val 100 105 110 Ile His Gly Thr Asp Thr Met Ala Phe Ala Ala Ser Met Leu Ser Phe 115 120 125 Met Leu Glu Asn Leu Gln Lys Thr Val Ile Leu Thr Gly Ala Gln Val 130 135 140 Pro Ile His Ala Leu Trp Ser Asp Gly Arg Glu Asn Leu Leu Gly Ala 145 150 155 160 Leu Leu Met Ala Gly Gln Tyr Val Ile Pro Glu Val Cys Leu Phe Phe 165 170 175 Gln Asn Gln Leu Phe Arg Gly Asn Arg Ala Thr Lys Val Asp Ala Arg 180 185 190 Arg Phe Ala Ala Phe Cys Ser Pro Asn Leu Leu Pro Leu Ala Thr Val 195 200 205 Gly Ala Asp Ile Thr Ile Asn Arg Glu Leu Val Arg Lys Val Asp Gly 210 215 220 Lys Ala Gly Leu Val Val His Ser Ser Met Glu Gln Asp Val Gly Leu 225 230 235 240 Leu Arg Leu Tyr Pro Gly Ile Pro Ala Ala Leu Val Arg Ala Phe Leu 245 250 255 Gln Pro Pro Leu Lys Gly Val Val Met Glu Thr Phe Gly Ser Gly Asn 260 265 270 Gly Pro Thr Lys Pro Asp Leu Leu Gln Glu Leu Arg Val Ala Thr Glu 275 280 285 Arg Gly Leu Val Ile Val Asn Cys Thr Gln Cys Leu Gln Gly Ala Val 290 295 300 Thr Thr Asp Tyr Ala Ala Gly Met Ala Met Ala Gly Ala Asn Val Ile 305 310 315 320 Ser Gly Phe Asp Met Thr Ser Glu Ala Ala Leu Ala Lys Leu Ser Tyr 325 330 335 Val Leu Gly Gln Pro Gly Leu Ser Leu Asp Val Arg Lys Glu Leu Leu 340 345 350 Thr Lys Asp Leu Arg Gly Glu Met Thr Pro Pro Ser Val 355 360 365

【０１２６】配列番号：9 配列の長さ：365 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ポリペプチド配列 Met Ala Arg Ala Val Gly Pro Glu Arg Arg Leu Leu Ala Val Tyr Thr 1 5 10 15 Gly Gly Thr Ile Gly Met Arg Ser Glu Leu Gly Val Leu Val Pro Gly 20 25 30 Thr Gly Leu Ala Ala Ile Leu Arg Thr Leu Pro Met Phe His Asp Glu 35 40 45 Glu His Ala Arg Ala Arg Gly Leu Ser Glu Asp Thr Leu Val Leu Pro 50 55 60 Pro Asp Ser Arg Asn Gln Arg Ile Leu Tyr Thr Val Leu Glu Cys Gln 65 70 75 80 Pro Leu Phe Asp Ser Ser Asp Met Thr Ile Ala Glu Trp Val Arg Val 85 90 95 Ala Gln Thr Ile Lys Arg His Tyr Glu Gln Tyr His Gly Phe Val Val 100 105 110 Ile His Gly Thr Asp Thr Met Ala Phe Ala Ala Ser Met Leu Ser Phe 115 120 125 Met Leu Glu Asn Leu Gln Lys Thr Val Ile Leu Thr Gly Ala Gln Val 130 135 140 Pro Ile His Ala Leu Trp Ser Asp Gly Arg Glu Asn Leu Leu Gly Ala 145 150 155 160 Leu Leu Met Ala Gly Gln Tyr Val Ile Pro Glu Val Cys Leu Phe Phe 165 170 175 Gln Asn Gln Leu Phe Arg Gly Asn Arg Ala Thr Lys Val Asp Ala Arg 180 185 190 Arg Phe Ala Ala Phe Cys Ser Pro Asn Leu Leu Pro Leu Ala Thr Val 195 200 205 Gly Ala Asp Ile Thr Ile Asn Arg Glu Leu Val Arg Lys Val Asp Gly 210 215 220 Lys Ala Gly Leu Val Val His Ser Ser Met Glu Gln Asp Val Gly Leu 225 230 235 240 Leu Arg Leu Tyr Pro Gly Ile Pro Ala Ala Leu Val Arg Ala Phe Leu 245 250 255 Gln Pro Pro Leu Lys Gly Val Val Met Glu Thr Phe Gly Ser Gly Asn 260 265 270 Gly Pro Thr Lys Pro Asp Leu Leu Gln Glu Leu Arg Val Ala Thr Glu 275 280 285 Arg Gly Leu Val Ile Val Asn Cys Thr Gln Cys Leu Gln Gly Ala Val 290 295 300 Thr Thr Asp Tyr Ala Ala Gly Met Ala Met Ala Gly Ala Gly Val Ile 305 310 315 320 Ser Gly Phe Asp Met Thr Ser Glu Ala Ala Leu Ala Lys Leu Ser Tyr 325 330 335 Val Leu Gly Gln Pro Gly Leu Ser Leu Asp Val Arg Lys Glu Leu Leu 340 345 350 Thr Lys Asp Leu Arg Gly Glu Met Thr Pro Pro Ser Val 355 360 365

【０１２７】配列番号：10 配列の長さ：1089 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列 ATGGCGCGCG CATCAGGCTC CGAGAGGCAC CTGCTGCTCA TCTACACTGG CGGCACTTTG 60 GGCATGCAGA GCAAGGGCGG GGTGCTCGTC CCCGGCCCAG GCCTGGTCAC TCTGCTGCGG 120 ACCCTGCCCA TGTTCCATGA CAAGGAGTTC GCCCAGGCCC AGGGCCTCCC TGACCATGCT 180 CTGGCGCTGC CCCCTGCCAG CCACGGCCCC AGGGTCCTCT ACACGGTGCT GGAGTGCCAG 240 CCCCTCTTGG ATTCCAGCGA CATGACCATC GATGATTGGA TTCGCATAGC CAAGATCATA 300 GAGAGGCACT ATGAGCAGTA CCAAGGCTTT GTGGTTATCC ACGGCACCGA CACCATGGCC 360 TTTGGGGCCT CCATGCTGTC CTTCATGCTG GAAAACCTGC ACAAACCAGT CATCCTCACT 420 GGCGCCCAGG TGCCAATCCG TGTGCTGTGG AATGACGCCC GGGAAAACCT GCTGGGGGCG 480 TTGCTTGTGG CCGGCCAATA CATCATCCCT GAGGTCTGCC TGTTTATGAA CAGTCAGCTG 540 TTTCGGGGAA ACCGGGTAAC CAAGGTGGAC TCCCAGAAGT TTGAGGCCTT CTGCTCCCCC 600 AATCTGTCCC CACTAGCCAC TGTGGGCGCG GATGTCACAA TTGCCTGGGA CCTGGTGCGC 660 AAGGTCAACT GGAAGGACCC GCTGGTGGTG CACAGCAACA TGGAGCACGA CGTGGCACTG 720 CTGCGCCTCT ACCCTGGCAT CCCGGCCTCC CTGGTCCGGG CATTCCTGCA GCCCCCGCTC 780 AAGGGCGTGG TCCTGGAGAC CTTCGGCTCT GGCAACGGGC CGAGCAAGCC CGACCTGCTG 840 CAGGAGTTGC GGGCCGCGGC CCAGCGCGGC CTCATCATGG TCAACTGCAG CCAGTGCCTG 900 CGGGGGTCTG TGACCCCGGG CTATGCCACG AGCTTGGCGG GCGCCAACAT CGTGTCCGGC 960 TTAGACATGA CCTCAGAGGC CGCGCTGGCT AAGCTGTCCT ACGTGTTGGG CCTGCCGGAG 1020 CTGAGCCTGG AGCGCAGGCA GGAGCTGCTG GCCAAGGATC TTCGCGGGGA AATGACACTG 1080 CCCACGGCA 1089

【０１２８】配列番号：11 配列の長さ：1095 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列 ATGGCGCGCG CGGTGGGGCC CGAGCGGAGG CTGCTGGCCG TCTACACCGG CGGCACCATT 60 GGCATGCGGA GTGAGCTCGG CGTGCTTGTG CCCGGGACGG GCCTGGCTGC CATCCTGAGG 120 ACACTGCCCA TGTTCCATGA CGAGGAGCAC GCCCGAGCCC GCGGCCTCTC TGAGGACACC 180 CTGGTGCTAC CCCCGGACAG CCGCAACCAG AGGATCCTCT ACACCGTGCT GGAGTGCCAG 240 CCCCTCTTCG ACTCCAGTGA CATGACCATC GCTGAGTGGG TTCGCGTTGC CCAGACCATC 300 AAGAGGCACT ACGAGCAGTA CCACGGCTTT GTGGTCATCC ACGGCACCGA CACCATGGCC 360 TTTGCTGCCT CGATGCTGTC CTTCATGCTG GAGAACCTGC AGAAGACTGT CATCCTCACT 420 GGGGCCCAGG TGCCCATCCA TGCCCTGTGG AGCGACGGCC GTGAGAACCT GCTGGGGGCA 480 CTGCTCATGG CTGGCCAGTA TGTGATCCCA GAGGTCTGCC TTTTCTTCCA GAATCAGCTG 540 TTTCGGGGCA ACCGGGCAAC CAAGGTAGAC GCTCGGAGGT TCGCAGCTTT CTGCTCCCCG 600 AACCTGCTGC CTCTGGCCAC AGTGGGTGCT GACATCACAA TCAACAGGGA GCTGGTGCGG 660 AAGGTGGACG GGAAGGCTGG GCTGGTGGTG CACAGCAGCA TGGAGCAGGA CGTGGGCCTG 720 CTGCGCCTCT ACCCTGGGAT CCCTGCCGCC CTGGTTCGGG CCTTCTTGCA GCCTCCCCTG 780 AAGGGCGTGG TCATGGAGAC CTTCGGTTCA GGGAACGGAC CCACCAAGCC CGACCTGCTG 840 CAGGAGCTGC GGGTGGCCAC CGAGCGCGGC CTGGTCATCG TCAACTGTAC CCAGTGCCTC 900 CGGGGGGCTG TGACCACAGA CTATGCAGCT GGCATGGCCA TGGCGGGAGC CAACGTCATC 960 TCAGGCTTCG ACATGACATC GGAGGCCGCC CTGGCCAAGC TATCGTATGT GCTGGGCCAG 1020 CCAGGGCTGA GCCTGGATGT CAGGAAGGAG CTGCTGACCA AGGACCTTCG GGGGGAGATG 1080 ACGCCACCCT CGGTG 1095

【０１２９】配列番号：12 配列の長さ：1095 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列 ATGGCGCGCG CGGTGGGGCC CGAGCGGAGG CTGCTGGCCG TCTACACCGG CGGCACCATT 60 GGCATGCGGA GTGAGCTCGG CGTGCTTGTG CCCGGGACGG GCCTGGCTGC CATCCTGAGG 120 ACACTGCCCA TGTTCCATGA CGAGGAGCAC GCCCGAGCCC GCGGCCTCTC TGAGGACACC 180 CTGGTGCTAC CCCCGGACAG CCGCAACCAG AGGATCCTCT ACACCGTGCT GGAGTGCCAG 240 CCCCTCTTCG ACTCCAGTGA CATGACCATC GCTGAGTGGG TTCGCGTTGC CCAGACCATC 300 AAGAGGCACT ACGAGCAGTA CCACGGCTTT GTGGTCATCC ACGGCACCGA CACCATGGCC 360 TTTGCTGCCT CGATGCTGTC CTTCATGCTG GAGAACCTGC AGAAGACTGT CATCCTCACT 420 GGGGCCCAGG TGCCCATCCA TGCCCTGTGG AGCGACGGCC GTGAGAACCT GCTGGGGGCA 480 CTGCTCATGG CTGGCCAGTA TGTGATCCCA GAGGTCTGCC TTTTCTTCCA GAATCAGCTG 540 TTTCGGGGCA ACCGGGCAAC CAAGGTAGAC GCTCGGAGGT TCGCAGCTTT CTGCTCCCCG 600 AACCTGCTGC CTCTGGCCAC AGTGGGTGCT GACATCACAA TCAACAGGGA GCTGGTGCGG 660 AAGGTGGACG GGAAGGCTGG GCTGGTGGTG CACAGCAGCA TGGAGCAGGA CGTGGGCCTG 720 CTGCGCCTCT ACCCTGGGAT CCCTGCCGCC CTGGTTCGGG CCTTCTTGCA GCCTCCCCTG 780 AAGGGCGTGG TCATGGAGAC CTTCGGTTCA GGGAACGGAC CCACCAAGCC CGACCTGCTG 840 CAGGAGCTGC GGGTGGCCAC CGAGCGCGGC CTGGTCATCG TCAACTGTAC CCAGTGCCTC 900 CGGGGGGCTG TGACCACAGA CTATGCAGCT GGCATGGCCA TGGCGGGAGC CGGCGTCATC 960 TCAGGCTTCG ACATGACATC GGAGGCCGCC CTGGCCAAGC TATCGTATGT GCTGGGCCAG 1020 CCAGGGCTGA GCCTGGATGT CAGGAAGGAG CTGCTGACCA AGGACCTTCG GGGGGAGATG 1080 ACGCCACCCT CGGTG 1095

【０１３０】配列番号：13 配列の長さ：1095 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列 ATGGCGCGCG CGGTGGGGCC CGAGCGGAGG CTGCTGGCCG TCTACACCGG CGGCACCATT 60 GGCATGCGGA GTGAGCTCGG CGTGCTTGTG CCCGGGACGG GCCTGGCTGC CATCCTGAGG 120 ACACTGCCCA TGTTCCATGA CGAGGAGCAC GCCCGAGCCC GCGGCCTCTC TGAGGACACC 180 CTGGTGCTAC CCCCGGACAG CCGCAACCAG AGGATCCTCT ACACCGTGCT GGAGTGCCAG 240 CCCCTCTTCG ACTCCAGTGA CATGACCATC GCTGAGTGGG TTCGCGTTGC CCAGACCATC 300 AAGAGGCACT ACGAGCAGTA CCACGGCTTT GTGGTCATCC ACGGCACCGA CACCATGGCC 360 TTTGCTGCCT CGATGCTGTC CTTCATGCTG GAGAACCTGC AGAAGACTGT CATCCTCACT 420 GGGGCCCAGG TGCCCATCCA TGCCCTGTGG AGCGACGGCC GTGAGAACCT GCTGGGGGCA 480 CTGCTCATGG CTGGCCAGTA TGTGATCCCA GAGGTCTGCC TTTTCTTCCA GAATCAGCTG 540 TTTCGGGGCA ACCGGGCAAC CAAGGTAGAC GCTCGGAGGT TCGCAGCTTT CTGCTCCCCG 600 AACCTGCTGC CTCTGGCCAC AGTGGGTGCT GACATCACAA TCAACAGGGA GCTGGTGCGG 660 AAGGTGGACG GGAAGGCTGG GCTGGTGGTG CACAGCAGCA TGGAGCAGGA CGTGGGCCTG 720 CTGCGCCTCT ACCCTGGGAT CCCTGCCGCC CTGGTTCGGG CCTTCTTGCA GCCTCCCCTG 780 AAGGGCGTGG TCATGGAGAC CTTCGGTTCA GGGAACGGAC CCACCAAGCC CGACCTGCTG 840 CAGGAGCTGC GGGTGGCCAC CGAGCGCGGC CTGGTCATCG TCAACTGTAC CCAGTGCCTC 900 CAGGGGGCTG TGACCACAGA CTATGCAGCT GGCATGGCCA TGGCGGGAGC CAACGTCATC 960 TCAGGCTTCG ACATGACATC GGAGGCCGCC CTGGCCAAGC TATCGTATGT GCTGGGCCAG 1020 CCAGGGCTGA GCCTGGATGT CAGGAAGGAG CTGCTGACCA AGGACCTTCG GGGGGAGATG 1080 ACGCCACCCT CGGTG 1095

【０１３１】配列番号：14 配列の長さ：1095 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列 ATGGCGCGCG CGGTGGGGCC CGAGCGGAGG CTGCTGGCCG TCTACACCGG CGGCACCATT 60 GGCATGCGGA GTGAGCTCGG CGTGCTTGTG CCCGGGACGG GCCTGGCTGC CATCCTGAGG 120 ACACTGCCCA TGTTCCATGA CGAGGAGCAC GCCCGAGCCC GCGGCCTCTC TGAGGACACC 180 CTGGTGCTAC CCCCGGACAG CCGCAACCAG AGGATCCTCT ACACCGTGCT GGAGTGCCAG 240 CCCCTCTTCG ACTCCAGTGA CATGACCATC GCTGAGTGGG TTCGCGTTGC CCAGACCATC 300 AAGAGGCACT ACGAGCAGTA CCACGGCTTT GTGGTCATCC ACGGCACCGA CACCATGGCC 360 TTTGCTGCCT CGATGCTGTC CTTCATGCTG GAGAACCTGC AGAAGACTGT CATCCTCACT 420 GGGGCCCAGG TGCCCATCCA TGCCCTGTGG AGCGACGGCC GTGAGAACCT GCTGGGGGCA 480 CTGCTCATGG CTGGCCAGTA TGTGATCCCA GAGGTCTGCC TTTTCTTCCA GAATCAGCTG 540 TTTCGGGGCA ACCGGGCAAC CAAGGTAGAC GCTCGGAGGT TCGCAGCTTT CTGCTCCCCG 600 AACCTGCTGC CTCTGGCCAC AGTGGGTGCT GACATCACAA TCAACAGGGA GCTGGTGCGG 660 AAGGTGGACG GGAAGGCTGG GCTGGTGGTG CACAGCAGCA TGGAGCAGGA CGTGGGCCTG 720 CTGCGCCTCT ACCCTGGGAT CCCTGCCGCC CTGGTTCGGG CCTTCTTGCA GCCTCCCCTG 780 AAGGGCGTGG TCATGGAGAC CTTCGGTTCA GGGAACGGAC CCACCAAGCC CGACCTGCTG 840 CAGGAGCTGC GGGTGGCCAC CGAGCGCGGC CTGGTCATCG TCAACTGTAC CCAGTGCCTC 900 CAGGGGGCTG TGACCACAGA CTATGCAGCT GGCATGGCCA TGGCGGGAGC CGGCGTCATC 960 TCAGGCTTCG ACATGACATC GGAGGCCGCC CTGGCCAAGC TATCGTATGT GCTGGGCCAG 1020 CCAGGGCTGA GCCTGGATGT CAGGAAGGAG CTGCTGACCA AGGACCTTCG GGGGGAGATG 1080 ACGCCACCCT CGGTG 1095

【０１３２】配列番号：15 配列の長さ：1928 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA ハイポセティカル配列：No アンチセンス：No 起源生物名：モルモット組織の種類：肝臓配列の特徴特徴を表す記号：5′UTR 存在位置：1..19 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：20..1714 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：3′UTR 存在位置：1715..1928 特徴を決定した方法：S 配列 GAGTGGCTTA GCCGCAGGC ATG GCG CGC GCA TCA GGC TCC GAG AGG CAC 49 Met Ala Arg Ala Ser Gly Ser Glu Arg His 1 5 10 CTG CTG CTC ATC TAC ACT GGC GGC ACT TTG GGC ATG CAG AGC AAG GGC 97 Leu Leu Leu Ile Tyr Thr Gly Gly Thr Leu Gly Met Gln Ser Lys Gly 15 20 25 GGG GTG CTC GTC CCC GGC CCA GGC CTG GTC ACT CTG CTG CGG ACC CTG 145 Gly Val Leu Val Pro Gly Pro Gly Leu Val Thr Leu Leu Arg Thr Leu 30 35 40 CCC ATG TTC CAT GAC AAG GAG TTC GCC CAG GCC CAG GGC CTC CCT GAC 193 Pro Met Phe His Asp Lys Glu Phe Ala Gln Ala Gln Gly Leu Pro Asp 45 50 55 CAT GCT CTG GCG CTG CCC CCT GCC AGC CAC GGC CCC AGG GTC CTC TAC 241 His Ala Leu Ala Leu Pro Pro Ala Ser His Gly Pro Arg Val Leu Tyr 60 65 70 ACG GTG CTG GAG TGC CAG CCC CTC TTG GAT TCC AGC GAC ATG ACC ATC 289 Thr Val Leu Glu Cys Gln Pro Leu Leu Asp Ser Ser Asp Met Thr Ile 75 80 85 90 GAT GAT TGG ATT CGC ATA GCC AAG ATC ATA GAG AGG CAC TAT GAG CAG 337 Asp Asp Trp Ile Arg Ile Ala Lys Ile Ile Glu Arg His Tyr Glu Gln 95 100 105 TAC CAA GGC TTT GTG GTT ATC CAC GGC ACC GAC ACC ATG GCC TTT GGG 385 Tyr Gln Gly Phe Val Val Ile His Gly Thr Asp Thr Met Ala Phe Gly 110 115 120 GCC TCC ATG CTG TCC TTC ATG CTG GAA AAC CTG CAC AAA CCA GTC ATC 433 Ala Ser Met Leu Ser Phe Met Leu Glu Asn Leu His Lys Pro Val Ile 125 130 135 CTC ACT GGC GCC CAG GTG CCA ATC CGT GTG CTG TGG AAT GAC GCC CGG 481 Leu Thr Gly Ala Gln Val Pro Ile Arg Val Leu Trp Asn Asp Ala Arg 140 145 150 GAA AAC CTG CTG GGG GCG TTG CTT GTG GCC GGC CAA TAC ATC ATC CCT 529 Glu Asn Leu Leu Gly Ala Leu Leu Val Ala Gly Gln Tyr Ile Ile Pro 155 160 165 170 GAG GTC TGC CTG TTT ATG AAC AGT CAG CTG TTT CGG GGA AAC CGG GTA 577 Glu Val Cys Leu Phe Met Asn Ser Gln Leu Phe Arg Gly Asn Arg Val 175 180 185 ACC AAG GTG GAC TCC CAG AAG TTT GAG GCC TTC TGC TCC CCC AAT CTG 625 Thr Lys Val Asp Ser Gln Lys Phe Glu Ala Phe Cys Ser Pro Asn Leu 190 195 200 TCC CCA CTA GCC ACT GTG GGC GCG GAT GTC ACA ATT GCC TGG GAC CTG 673 Ser Pro Leu Ala Thr Val Gly Ala Asp Val Thr Ile Ala Trp Asp Leu 205 210 215 GTG CGC AAG GTC AAC TGG AAG GAC CCG CTG GTG GTG CAC AGC AAC ATG 721 Val Arg Lys Val Asn Trp Lys Asp Pro Leu Val Val His Ser Asn Met 220 225 230 GAG CAC GAC GTG GCA CTG CTG CGC CTC TAC CCT GGC ATC CCG GCC TCC 769 Glu His Asp Val Ala Leu Leu Arg Leu Tyr Pro Gly Ile Pro Ala Ser 235 240 245 250 CTG GTC CGG GCA TTC CTG CAG CCC CCG CTC AAG GGC GTG GTC CTG GAG 817 Leu Val Arg Ala Phe Leu Gln Pro Pro Leu Lys Gly Val Val Leu Glu 255 260 265 ACC TTC GGC TCT GGC AAC GGG CCG AGC AAG CCC GAC CTG CTG CAG GAG 865 Thr Phe Gly Ser Gly Asn Gly Pro Ser Lys Pro Asp Leu Leu Gln Glu 270 275 280 TTG CGG GCC GCG GCC CAG CGC GGC CTC ATC ATG GTC AAC TGC AGC CAG 913 Leu Arg Ala Ala Ala Gln Arg Gly Leu Ile Met Val Asn Cys Ser Gln 285 290 295 TGC CTG CGG GGG TCT GTG ACC CCG GGC TAT GCC ACG AGC TTG GCG GGC 961 Cys Leu Arg Gly Ser Val Thr Pro Gly Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Gly 300 305 310 GCC AAC ATC GTG TCC GGC TTA GAC ATG ACC TCA GAG GCC GCG CTG GCT 1009 Ala Asn Ile Val Ser Gly Leu Asp Met Thr Ser Glu Ala Ala Leu Ala 315 320 325 330 AAG CTG TCC TAC GTG TTG GGC CTG CCG GAG CTG AGC CTG GAG CGC AGG 1057 Lys Leu Ser Tyr Val Leu Gly Leu Pro Glu Leu Ser Leu Glu Arg Arg 335 340 345 CAG GAG CTG CTG GCC AAG GAT CTT CGC GGG GAA ATG ACA CTG CCC ACG 1105 Gln Glu Leu Leu Ala Lys Asp Leu Arg Gly Glu Met Thr Leu Pro Thr 350 355 360 GCA GAC CTG CAC CAG TCC TCT CCG CCG GGC AGC ACA CTG GGG CAA GGT 1153 Ala Asp Leu His Gln Ser Ser Pro Pro Gly Ser Thr Leu Gly Gln Gly 365 370 375 GTC GCC CGG CTC TTT AGT CTG TTC GGT TGC CAG GAG GAA GAT TCG GTG 1201 Val Ala Arg Leu Phe Ser Leu Phe Gly Cys Gln Glu Glu Asp Ser Val 380 385 390 CAG GAC GCC GTG ATG CCC AGC CTG GCC CTG GCC TTG GCC CAT GCT GGT 1249 Gln Asp Ala Val Met Pro Ser Leu Ala Leu Ala Leu Ala His Ala Gly 395 400 405 410 GAA CTC GAG GCT CTG CAG GCA CTT ATG GAG CTG GGC AGT GAC CTG CGC 1297 Glu Leu Glu Ala Leu Gln Ala Leu Met Glu Leu Gly Ser Asp Leu Arg 415 420 425 CTA AAG GAC TCT AAT GGC CAA ACC CTG TTG CAT GTG GCT GCT CGG AAT 1345 Leu Lys Asp Ser Asn Gly Gln Thr Leu Leu His Val Ala Ala Arg Asn 430 435 440 GGG CGT GAT GGC GTG GTC ACC ATG CTG CTG CAC AGA GGC ATG GAT GTC 1393 Gly Arg Asp Gly Val Val Thr Met Leu Leu His Arg Gly Met Asp Val 445 450 455 AAT GCC CGA GAC CGA GAC GGC CTC AGC CCA CTG CTG TTG GCT GTA CAG 1441 Asn Ala Arg Asp Arg Asp Gly Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ala Val Gln 460 465 470 GGC AGG CAT CGG GAA TGC ATC AGG CTG CTG CGG AAG GCT GGG GCC TGC 1489 Gly Arg His Arg Glu Cys Ile Arg Leu Leu Arg Lys Ala Gly Ala Cys 475 480 485 490 CTG TCC CCC CAG GAC CTG AAG GAT GCA GGG ACC GAG CTG TGC AGG CTG 1537 Leu Ser Pro Gln Asp Leu Lys Asp Ala Gly Thr Glu Leu Cys Arg Leu 495 500 505 GCA TCC AGG GCT GAC ATG GAA GGC CTG CAG GCA TGG GGG CAG GCT GGG 1585 Ala Ser Arg Ala Asp Met Glu Gly Leu Gln Ala Trp Gly Gln Ala Gly 510 515 520 GCC GAC CTG CAG CAG CCG GGC TAT GAT GGG CGC AGC GCT CTG TGT GTC 1633 Ala Asp Leu Gln Gln Pro Gly Tyr Asp Gly Arg Ser Ala Leu Cys Val 525 530 535 GCA GAA GCA GCC GGG AAC CAG GAG GTG CTG GCC CTT CTG CGG AAC CTG 1681 Ala Glu Ala Ala Gly Asn Gln Glu Val Leu Ala Leu Leu Arg Asn Leu 540 545 550 GCA CTT GTA GGC CCG GAA GTG CCG CCT GCC ATC TGATCGCCAG CAATCCCGCT 1734 Ala Leu Val Gly Pro Glu Val Pro Pro Ala Ile 555 560 565 GTGGTGTGAG CCACTCCGCC ATCTGCTGCT TTGACCCACT CGAGGGACCC TAGCACACGA 1794 CCCCCCAGCA GGATGCACCC CACTACTTAG AGTATACCCC AGGCTGGCTC AGTGACAAGC 1854 TGCAAAGGTC TTTGTTGGCA GAACAGCAAT AAAGTAACTA CAGAGTGGCC AAAAAAAAAA 1914 AAAAAAAAAA AAAA 1928

【０１３３】配列番号：16 配列の長さ：2096 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA ハイポテセィカル配列：No アンチセンス：No 起源生物名：ヒト組織の種類：肝臓配列の特徴：特徴を表す記号：5′UTR 存在位置：1..92 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：93..1811 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：3′UTR 存在位置：1812..2096 特徴を決定した方法：S 配列 CGCCCCGGGC CTCCTCCGCG CAGTCCCTGA GTCCCGCAGG CCCTGCGTCC CCGCTGCACA 60 CCCCCGTCCA CTCCCGTGGT CCCCGGTCCG GC ATG GCG CGC GCG GTG GGG CCC 113 Met Ala Arg Ala Val Gly Pro 1 5 GAG CGG AGG CTG CTG GCC GTC TAC ACC GGC GGC ACC ATT GGC ATG CGG 161 Glu Arg Arg Leu Leu Ala Val Tyr Thr Gly Gly Thr Ile Gly Met Arg 10 15 20 AGT GAG CTC GGC GTG CTT GTG CCC GGG ACG GGC CTG GCT GCC ATC CTG 209 Ser Glu Leu Gly Val Leu Val Pro Gly Thr Gly Leu Ala Ala Ile Leu 25 30 35 AGG ACA CTG CCC ATG TTC CAT GAC GAG GAG CAC GCC CGA GCC CGC GGC 257 Arg Thr Leu Pro Met Phe His Asp Glu Glu His Ala Arg Ala Arg Gly 40 45 50 55 CTC TCT GAG GAC ACC CTG GTG CTA CCC CCG GAC AGC CGC AAC CAG AGG 305 Leu Ser Glu Asp Thr Leu Val Leu Pro Pro Asp Ser Arg Asn Gln Arg 60 65 70 ATC CTC TAC ACC GTG CTG GAG TGC CAG CCC CTC TTC GAC TCC AGT GAC 353 Ile Leu Tyr Thr Val Leu Glu Cys Gln Pro Leu Phe Asp Ser Ser Asp 75 80 85 ATG ACC ATC GCT GAG TGG GTT CGC GTT GCC CAG ACC ATC AAG AGG CAC 401 Met Thr Ile Ala Glu Trp Val Arg Val Ala Gln Thr Ile Lys Arg His 90 95 100 TAC GAG CAG TAC CAC GGC TTT GTG GTC ATC CAC GGC ACC GAC ACC ATG 449 Tyr Glu Gln Tyr His Gly Phe Val Val Ile His Gly Thr Asp Thr Met 105 110 115 GCC TTT GCT GCC TCG ATG CTG TCC TTC ATG CTG GAG AAC CTG CAG AAG 497 Ala Phe Ala Ala Ser Met Leu Ser Phe Met Leu Glu Asn Leu Gln Lys 120 125 130 135 ACT GTC ATC CTC ACT GGG GCC CAG GTG CCC ATC CAT GCC CTG TGG AGC 545 Thr Val Ile Leu Thr Gly Ala Gln Val Pro Ile His Ala Leu Trp Ser 140 145 150 GAC GGC CGT GAG AAC CTG CTG GGG GCA CTG CTC ATG GCT GGC CAG TAT 593 Asp Gly Arg Glu Asn Leu Leu Gly Ala Leu Leu Met Ala Gly Gln Tyr 155 160 165 GTG ATC CCA GAG GTC TGC CTT TTC TTC CAG AAT CAG CTG TTT CGG GGC 641 Val Ile Pro Glu Val Cys Leu Phe Phe Gln Asn Gln Leu Phe Arg Gly 170 175 180 AAC CGG GCA ACC AAG GTA GAC GCT CGG AGG TTC GCA GCT TTC TGC TCC 689 Asn Arg Ala Thr Lys Val Asp Ala Arg Arg Phe Ala Ala Phe Cys Ser 185 190 195 CCG AAC CTG CTG CCT CTG GCC ACA GTG GGT GCT GAC ATC ACA ATC AAC 737 Pro Asn Leu Leu Pro Leu Ala Thr Val Gly Ala Asp Ile Thr Ile Asn 200 205 210 215 AGG GAG CTG GTG CGG AAG GTG GAC GGG AAG GCT GGG CTG GTG GTG CAC 785 Arg Glu Leu Val Arg Lys Val Asp Gly Lys Ala Gly Leu Val Val His 220 225 230 AGC AGC ATG GAG CAG GAC GTG GGC CTG CTG CGC CTC TAC CCT GGG ATC 833 Ser Ser Met Glu Gln Asp Val Gly Leu Leu Arg Leu Tyr Pro Gly Ile 235 240 245 CCT GCC GCC CTG GTT CGG GCC TTC TTG CAG CCT CCC CTG AAG GGC GTG 881 Pro Ala Ala Leu Val Arg Ala Phe Leu Gln Pro Pro Leu Lys Gly Val 250 255 260 GTC ATG GAG ACC TTC GGT TCA GGG AAC GGA CCC ACC AAG CCC GAC CTG 929 Val Met Glu Thr Phe Gly Ser Gly Asn Gly Pro Thr Lys Pro Asp Leu 265 270 275 CTG CAG GAG CTG CGG GTG GCC ACC GAG CGC GGC CTG GTC ATC GTC AAC 977 Leu Gln Glu Leu Arg Val Ala Thr Glu Arg Gly Leu Val Ile Val Asn 280 285 290 295 TGT ACC CAC TGC CTC CAG GGG GCT GTG ACC ACA GAC TAT GCA GCT GGC 1025 Cys Thr His Cys Leu Gln Gly Ala Val Thr Thr Asp Tyr Ala Ala Gly 300 305 310 ATG GCC ATG GCG GGA GCC GGC GTC ATC TCA GGC TTC GAC ATG ACA TCG 1073 Met Ala Met Ala Gly Ala Gly Val Ile Ser Gly Phe Asp Met Thr Ser 315 320 325 GAG GCC GCC CTG GCC AAG CTA TCG TAT GTG CTG GGC CAG CCA GGG CTG 1121 Glu Ala Ala Leu Ala Lys Leu Ser Tyr Val Leu Gly Gln Pro Gly Leu 330 335 340 AGC CTG GAT GTC AGG AAG GAG CTG CTG ACC AAG GAC CTT CGG GGG GAG 1169 Ser Leu Asp Val Arg Lys Glu Leu Leu Thr Lys Asp Leu Arg Gly Glu 345 350 355 ATG ACG CCA CCC TCG GTG GAA GAG CGC CGG CCC TCA CTG CAG GGC AAC 1217 Met Thr Pro Pro Ser Val Glu Glu Arg Arg Pro Ser Leu Gln Gly Asn 360 365 370 375 ACG CTG GGC GGT GGG GTC TCC TGG CTC CTC AGT CTG AGC GGC AGC CAG 1265 Thr Leu Gly Gly Gly Val Ser Trp Leu Leu Ser Leu Ser Gly Ser Gln 380 385 390 GAG GCA GAT GCC CTG CGG AAT GCC CTG GTG CCC AGC CTG GCC TGT GCT 1313 Glu Ala Asp Ala Leu Arg Asn Ala Leu Val Pro Ser Leu Ala Cys Ala 395 400 405 GCT GCC CAC GCC GGT GAC GTG GAG GCG CTG CAG GCG CTT GTG GAG CTG 1361 Ala Ala His Ala Gly Asp Val Glu Ala Leu Gln Ala Leu Val Glu Leu 410 415 420 GGC AGT GAC CTG GGC CTG GTG GAC TTT AAC GGC CAA ACC CCA CTG CAC 1409 Gly Ser Asp Leu Gly Leu Val Asp Phe Asn Gly Gln Thr Pro Leu His 425 430 435 GCG GCC GCC CGG GGA GGC CAC ACA GAG GCA GTC ACC ATG CTG CTG CAG 1457 Ala Ala Ala Arg Gly Gly His Thr Glu Ala Val Thr Met Leu Leu Gln 440 445 450 455 AGA GGT GTG GAC GTG AAC ACC CGG GAC ACG GAT GGC TTC AGC CCG CTG 1505 Arg Gly Val Asp Val Asn Thr Arg Asp Thr Asp Gly Phe Ser Pro Leu 460 465 470 CTG CTG GCC GTG CGG GGC AGG CAT CCG GGT GTC ATT GGG TTG CTG CGG 1553 Leu Leu Ala Val Arg Gly Arg His Pro Gly Val Ile Gly Leu Leu Arg 475 480 485 GAA GCC GGG GCC TCC CTG TCC ACC CAG GAG CTG GAG GAA GCA GGG ACG 1601 Glu Ala Gly Ala Ser Leu Ser Thr Gln Glu Leu Glu Glu Ala Gly Thr 490 495 500 GAG CTG TGC AGG CTG GCA TAC AGG GCC GAC CTC GAA GGC CTG CAG GTG 1649 Glu Leu Cys Arg Leu Ala Tyr Arg Ala Asp Leu Glu Gly Leu Gln Val 505 510 515 TGG TGG CAG GCA GGG GCT GAC CTG GGG CAG CCG GGC TAT GAC GGG CAC 1697 Trp Trp Gln Ala Gly Ala Asp Leu Gly Gln Pro Gly Tyr Asp Gly His 520 525 530 535 AGC GCC CTG CAC GTC GCA GAG GCA GCC GGG AAC CTG GCA GTG GTG GCC 1745 Ser Ala Leu His Val Ala Glu Ala Ala Gly Asn Leu Ala Val Val Ala 540 545 550 TTT CTA CAG AGC CTG GAG GGT GCG GTT GGT GCC CAG GCC CCA TGC CCA 1793 Phe Leu Gln Ser Leu Glu Gly Ala Val Gly Ala Gln Ala Pro Cys Pro 555 560 565 GAA GTG CTG CCT GGT GTC TAACCTGAAG GCGTCCTGCT GCAGTATAAG 1841 Glu Val Leu Pro Gly Val 570 CCATTCCTTC CTCCCATGAC CTGCTGGAGG GGTCTCAGGC ATGACCCCAC TGCTGGGGCT 1901 GCTTCCCAGC CTGCTCTCAT GTAAAGCCTG AAGGCCTTTG TTGGGCAGGA CGGCAATAAA 1961 GTCTCTGACA TCCCCTCACC AGGTCTGTAC AGCCTGGCTC TGAGAGGCTC TGTCTGGGTC 2021 CGGGACTGTG AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 2081 AAAAAAAAAA AAAAA 2096

【０１３４】配列番号：17 配列の長さ：1695 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA ハイポセティカル配列：No アンチセンス：No 起源生物名：モルモット組織の種類：肝臓配列の特徴特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：1..1695 配列 ATG GCG CGC GCA TCA GGC TCC GAG AGG CAC CTG CTG CTC ATC TAC ACT 48 Met Ala Arg Ala Ser Gly Ser Glu Arg His Leu Leu Leu Ile Tyr Thr 1 5 10 15 GGC GGC ACT TTG GGC ATG CAG AGC AAG GGC GGG GTG CTC GTC CCC GGC 96 Gly Gly Thr Leu Gly Met Gln Ser Lys Gly Gly Val Leu Val Pro Gly 20 25 30 CCA GGC CTG GTC ACT CTG CTG CGG ACC CTG CCC ATG TTC CAT GAC AAG 144 Pro Gly Leu Val Thr Leu Leu Arg Thr Leu Pro Met Phe His Asp Lys 35 40 45 GAG TTC GCC CAG GCC CAG GGC CTC CCT GAC CAT GCT CTG GCG CTG CCC 192 Glu Phe Ala Gln Ala Gln Gly Leu Pro Asp His Ala Leu Ala Leu Pro 50 55 60 CCT GCC AGC CAC GGC CCC AGG GTC CTC TAC ACG GTG CTG GAG TGC CAG 240 Pro Ala Ser His Gly Pro Arg Val Leu Tyr Thr Val Leu Glu Cys Gln 65 70 75 80 CCC CTC TTG GAT TCC AGC GAC ATG ACC ATC GAT GAT TGG ATT CGC ATA 288 Pro Leu Leu Asp Ser Ser Asp Met Thr Ile Asp Asp Trp Ile Arg Ile 85 90 95 GCC AAG ATC ATA GAG AGG CAC TAT GAG CAG TAC CAA GGC TTT GTG GTT 336 Ala Lys Ile Ile Glu Arg His Tyr Glu Gln Tyr Gln Gly Phe Val Val 100 105 110 ATC CAC GGC ACC GAC ACC ATG GCC TTT GGG GCC TCC ATG CTG TCC TTC 384 Ile His Gly Thr Asp Thr Met Ala Phe Gly Ala Ser Met Leu Ser Phe 115 120 125 ATG CTG GAA AAC CTG CAC AAA CCA GTC ATC CTC ACT GGC GCC CAG GTG 432 Met Leu Glu Asn Leu His Lys Pro Val Ile Leu Thr Gly Ala Gln Val 130 135 140 CCA ATC CGT GTG CTG TGG AAT GAC GCC CGG GAA AAC CTG CTG GGG GCG 480 Pro Ile Arg Val Leu Trp Asn Asp Ala Arg Glu Asn Leu Leu Gly Ala 145 150 155 160 TTG CTT GTG GCC GGC CAA TAC ATC ATC CCT GAG GTC TGC CTG TTT ATG 528 Leu Leu Val Ala Gly Gln Tyr Ile Ile Pro Glu Val Cys Leu Phe Met 165 170 175 AAC AGT CAG CTG TTT CGG GGA AAC CGG GTA ACC AAG GTG GAC TCC CAG 576 Asn Ser Gln Leu Phe Arg Gly Asn Arg Val Thr Lys Val Asp Ser Gln 180 185 190 AAG TTT GAG GCC TTC TGC TCC CCC AAT CTG TCC CCA CTA GCC ACT GTG 624 Lys Phe Glu Ala Phe Cys Ser Pro Asn Leu Ser Pro Leu Ala Thr Val 195 200 205 GGC GCG GAT GTC ACA ATT GCC TGG GAC CTG GTG CGC AAG GTC AAC TGG 672 Gly Ala Asp Val Thr Ile Ala Trp Asp Leu Val Arg Lys Val Asn Trp 210 215 220 AAG GAC CCG CTG GTG GTG CAC AGC AAC ATG GAG CAC GAC GTG GCA CTG 720 Lys Asp Pro Leu Val Val His Ser Asn Met Glu His Asp Val Ala Leu 225 230 235 240 CTG CGC CTC TAC CCT GGC ATC CCG GCC TCC CTG GTC CGG GCA TTC CTG 768 Leu Arg Leu Tyr Pro Gly Ile Pro Ala Ser Leu Val Arg Ala Phe Leu 245 250 255 CAG CCC CCG CTC AAG GGC GTG GTC CTG GAG ACC TTC GGC TCT GGC AAC 816 Gln Pro Pro Leu Lys Gly Val Val Leu Glu Thr Phe Gly Ser Gly Asn 260 265 270 GGG CCG AGC AAG CCC GAC CTG CTG CAG GAG TTG CGG GCC GCG GCC CAG 864 Gly Pro Ser Lys Pro Asp Leu Leu Gln Glu Leu Arg Ala Ala Ala Gln 275 280 285 CGC GGC CTC ATC ATG GTC AAC TGC AGC CAG TGC CTG CGG GGG TCT GTG 912 Arg Gly Leu Ile Met Val Asn Cys Ser Gln Cys Leu Arg Gly Ser Val 290 295 300 ACC CCG GGC TAT GCC ACG AGC TTG GCG GGC GCC AAC ATC GTG TCC GGC 960 Thr Pro Gly Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Gly Ala Asn Ile Val Ser Gly 305 310 315 320 TTA GAC ATG ACC TCA GAG GCC GCG CTG GCT AAG CTG TCC TAC GTG TTG 1008 Leu Asp Met Thr Ser Glu Ala Ala Leu Ala Lys Leu Ser Tyr Val Leu 325 330 335 GGC CTG CCG GAG CTG AGC CTG GAG CGC AGG CAG GAG CTG CTG GCC AAG 1056 Gly Leu Pro Glu Leu Ser Leu Glu Arg Arg Gln Glu Leu Leu Ala Lys 340 345 350 GAT CTT CGC GGG GAA ATG ACA CTG CCC ACG GCA GAC CTG CAC CAG TCC 1104 Asp Leu Arg Gly Glu Met Thr Leu Pro Thr Ala Asp Leu His Gln Ser 355 360 365 TCT CCG CCG GGC AGC ACA CTG GGG CAA GGT GTC GCC CGG CTC TTT AGT 1152 Ser Pro Pro Gly Ser Thr Leu Gly Gln Gly Val Ala Arg Leu Phe Ser 370 375 380 CTG TTC GGT TGC CAG GAG GAA GAT TCG GTG CAG GAC GCC GTG ATG CCC 1200 Leu Phe Gly Cys Gln Glu Glu Asp Ser Val Gln Asp Ala Val Met Pro 385 390 395 400 AGC CTG GCC CTG GCC TTG GCC CAT GCT GGT GAA CTC GAG GCT CTG CAG 1248 Ser Leu Ala Leu Ala Leu Ala His Ala Gly Glu Leu Glu Ala Leu Gln 405 410 415 GCA CTT ATG GAG CTG GGC AGT GAC CTG CGC CTA AAG GAC TCT AAT GGC 1296 Ala Leu Met Glu Leu Gly Ser Asp Leu Arg Leu Lys Asp Ser Asn Gly 420 425 430 CAA ACC CTG TTG CAT GTG GCT GCT CGG AAT GGG CGT GAT GGC GTG GTC 1344 Gln Thr Leu Leu His Val Ala Ala Arg Asn Gly Arg Asp Gly Val Val 435 440 445 ACC ATG CTG CTG CAC AGA GGC ATG GAT GTC AAT GCC CGA GAC CGA GAC 1392 Thr Met Leu Leu His Arg Gly Met Asp Val Asn Ala Arg Asp Arg Asp 450 455 460 GGC CTC AGC CCA CTG CTG TTG GCT GTA CAG GGC AGG CAT CGG GAA TGC 1440 Gly Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ala Val Gln Gly Arg His Arg Glu Cys 465 470 475 480 ATC AGG CTG CTG CGG AAG GCT GGG GCC TGC CTG TCC CCC CAG GAC CTG 1488 Ile Arg Leu Leu Arg Lys Ala Gly Ala Cys Leu Ser Pro Gln Asp Leu 485 490 495 AAG GAT GCA GGG ACC GAG CTG TGC AGG CTG GCA TCC AGG GCT GAC ATG 1536 Lys Asp Ala Gly Thr Glu Leu Cys Arg Leu Ala Ser Arg Ala Asp Met 500 505 510 GAA GGC CTG CAG GCA TGG GGG CAG GCT GGG GCC GAC CTG CAG CAG CCG 1584 Glu Gly Leu Gln Ala Trp Gly Gln Ala Gly Ala Asp Leu Gln Gln Pro 515 520 525 GGC TAT GAT GGG CGC AGC GCT CTG TGT GTC GCA GAA GCA GCC GGG AAC 1632 Gly Tyr Asp Gly Arg Ser Ala Leu Cys Val Ala Glu Ala Ala Gly Asn 530 535 540 CAG GAG GTG CTG GCC CTT CTG CGG AAC CTG GCA CTT GTA GGC CCG GAA 1680 Gln Glu Val Leu Ala Leu Leu Arg Asn Leu Ala Leu Val Gly Pro Glu 545 550 555 560 GTG CCG CCT GCC ATC 1695 Val Pro Pro Ala Ile 565

【０１３５】配列番号：18 配列の長さ：1719 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA ハイポテセィカル配列：No アンチセンス：No 起源生物名：ヒト組織の種類：肝臓配列の特徴：特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：1..1719 特徴を決定した方法：S 配列 ATG GCG CGC GCG GTG GGG CCC GAG CGG AGG CTG CTG GCC GTC TAC ACC 48 Met Ala Arg Ala Val Gly Pro Glu Arg Arg Leu Leu Ala Val Tyr Thr 1 5 10 15 GGC GGC ACC ATT GGC ATG CGG AGT GAG CTC GGC GTG CTT GTG CCC GGG 96 Gly Gly Thr Ile Gly Met Arg Ser Glu Leu Gly Val Leu Val Pro Gly 20 25 30 ACG GGC CTG GCT GCC ATC CTG AGG ACA CTG CCC ATG TTC CAT GAC GAG 144 Thr Gly Leu Ala Ala Ile Leu Arg Thr Leu Pro Met Phe His Asp Glu 35 40 45 GAG CAC GCC CGA GCC CGC GGC CTC TCT GAG GAC ACC CTG GTG CTA CCC 192 Glu His Ala Arg Ala Arg Gly Leu Ser Glu Asp Thr Leu Val Leu Pro 50 55 60 CCG GAC AGC CGC AAC CAG AGG ATC CTC TAC ACC GTG CTG GAG TGC CAG 240 Pro Asp Ser Arg Asn Gln Arg Ile Leu Tyr Thr Val Leu Glu Cys Gln 65 70 75 80 CCC CTC TTC GAC TCC AGT GAC ATG ACC ATC GCT GAG TGG GTT CGC GTT 288 Pro Leu Phe Asp Ser Ser Asp Met Thr Ile Ala Glu Trp Val Arg Val 85 90 95 GCC CAG ACC ATC AAG AGG CAC TAC GAG CAG TAC CAC GGC TTT GTG GTC 336 Ala Gln Thr Ile Lys Arg His Tyr Glu Gln Tyr His Gly Phe Val Val 100 105 110 ATC CAC GGC ACC GAC ACC ATG GCC TTT GCT GCC TCG ATG CTG TCC TTC 384 Ile His Gly Thr Asp Thr Met Ala Phe Ala Ala Ser Met Leu Ser Phe 115 120 125 ATG CTG GAG AAC CTG CAG AAG ACT GTC ATC CTC ACT GGG GCC CAG GTG 432 Met Leu Glu Asn Leu Gln Lys Thr Val Ile Leu Thr Gly Ala Gln Val 130 135 140 CCC ATC CAT GCC CTG TGG AGC GAC GGC CGT GAG AAC CTG CTG GGG GCA 480 Pro Ile His Ala Leu Trp Ser Asp Gly Arg Glu Asn Leu Leu Gly Ala 145 150 155 160 CTG CTC ATG GCT GGC CAG TAT GTG ATC CCA GAG GTC TGC CTT TTC TTC 528 Leu Leu Met Ala Gly Gln Tyr Val Ile Pro Glu Val Cys Leu Phe Phe 165 170 175 CAG AAT CAG CTG TTT CGG GGC AAC CGG GCA ACC AAG GTA GAC GCT CGG 576 Gln Asn Gln Leu Phe Arg Gly Asn Arg Ala Thr Lys Val Asp Ala Arg 180 185 190 AGG TTC GCA GCT TTC TGC TCC CCG AAC CTG CTG CCT CTG GCC ACA GTG 624 Arg Phe Ala Ala Phe Cys Ser Pro Asn Leu Leu Pro Leu Ala Thr Val 195 200 205 GGT GCT GAC ATC ACA ATC AAC AGG GAG CTG GTG CGG AAG GTG GAC GGG 672 Gly Ala Asp Ile Thr Ile Asn Arg Glu Leu Val Arg Lys Val Asp Gly 210 215 220 AAG GCT GGG CTG GTG GTG CAC AGC AGC ATG GAG CAG GAC GTG GGC CTG 720 Lys Ala Gly Leu Val Val His Ser Ser Met Glu Gln Asp Val Gly Leu 225 230 235 240 CTG CGC CTC TAC CCT GGG ATC CCT GCC GCC CTG GTT CGG GCC TTC TTG 768 Leu Arg Leu Tyr Pro Gly Ile Pro Ala Ala Leu Val Arg Ala Phe Leu 245 250 255 CAG CCT CCC CTG AAG GGC GTG GTC ATG GAG ACC TTC GGT TCA GGG AAC 816 Gln Pro Pro Leu Lys Gly Val Val Met Glu Thr Phe Gly Ser Gly Asn 260 265 270 GGA CCC ACC AAG CCC GAC CTG CTG CAG GAG CTG CGG GTG GCC ACC GAG 864 Gly Pro Thr Lys Pro Asp Leu Leu Gln Glu Leu Arg Val Ala Thr Glu 275 280 285 CGC GGC CTG GTC ATC GTC AAC TGT ACC CAC TGC CTC CAG GGG GCT GTG 912 Arg Gly Leu Val Ile Val Asn Cys Thr His Cys Leu Gln Gly Ala Val 290 295 300 ACC ACA GAC TAT GCA GCT GGC ATG GCC ATG GCG GGA GCC GGC GTC ATC 960 Thr Thr Asp Tyr Ala Ala Gly Met Ala Met Ala Gly Ala Gly Val Ile 305 310 315 320 TCA GGC TTC GAC ATG ACA TCG GAG GCC GCC CTG GCC AAG CTA TCG TAT 1008 Ser Gly Phe Asp Met Thr Ser Glu Ala Ala Leu Ala Lys Leu Ser Tyr 325 330 335 GTG CTG GGC CAG CCA GGG CTG AGC CTG GAT GTC AGG AAG GAG CTG CTG 1056 Val Leu Gly Gln Pro Gly Leu Ser Leu Asp Val Arg Lys Glu Leu Leu 340 345 350 ACC AAG GAC CTT CGG GGG GAG ATG ACG CCA CCC TCG GTG GAA GAG CGC 1104 Thr Lys Asp Leu Arg Gly Glu Met Thr Pro Pro Ser Val Glu Glu Arg 355 360 365 CGG CCC TCA CTG CAG GGC AAC ACG CTG GGC GGT GGG GTC TCC TGG CTC 1152 Arg Pro Ser Leu Gln Gly Asn Thr Leu Gly Gly Gly Val Ser Trp Leu 370 375 380 CTC AGT CTG AGC GGC AGC CAG GAG GCA GAT GCC CTG CGG AAT GCC CTG 1200 Leu Ser Leu Ser Gly Ser Gln Glu Ala Asp Ala Leu Arg Asn Ala Leu 385 390 395 400 GTG CCC AGC CTG GCC TGT GCT GCT GCC CAC GCC GGT GAC GTG GAG GCG 1248 Val Pro Ser Leu Ala Cys Ala Ala Ala His Ala Gly Asp Val Glu Ala 405 410 415 CTG CAG GCG CTT GTG GAG CTG GGC AGT GAC CTG GGC CTG GTG GAC TTT 1296 Leu Gln Ala Leu Val Glu Leu Gly Ser Asp Leu Gly Leu Val Asp Phe 420 425 430 AAC GGC CAA ACC CCA CTG CAC GCG GCC GCC CGG GGA GGC CAC ACA GAG 1344 Asn Gly Gln Thr Pro Leu His Ala Ala Ala Arg Gly Gly His Thr Glu 435 440 445 GCA GTC ACC ATG CTG CTG CAG AGA GGT GTG GAC GTG AAC ACC CGG GAC 1392 Ala Val Thr Met Leu Leu Gln Arg Gly Val Asp Val Asn Thr Arg Asp 450 455 460 ACG GAT GGC TTC AGC CCG CTG CTG CTG GCC GTG CGG GGC AGG CAT CCG 1440 Thr Asp Gly Phe Ser Pro Leu Leu Leu Ala Val Arg Gly Arg His Pro 465 470 475 480 GGT GTC ATT GGG TTG CTG CGG GAA GCC GGG GCC TCC CTG TCC ACC CAG 1488 Gly Val Ile Gly Leu Leu Arg Glu Ala Gly Ala Ser Leu Ser Thr Gln 485 490 495 GAG CTG GAG GAA GCA GGG ACG GAG CTG TGC AGG CTG GCA TAC AGG GCC 1536 Glu Leu Glu Glu Ala Gly Thr Glu Leu Cys Arg Leu Ala Tyr Arg Ala 500 505 510 GAC CTC GAA GGC CTG CAG GTG TGG TGG CAG GCA GGG GCT GAC CTG GGG 1584 Asp Leu Glu Gly Leu Gln Val Trp Trp Gln Ala Gly Ala Asp Leu Gly 515 520 525 CAG CCG GGC TAT GAC GGG CAC AGC GCC CTG CAC GTC GCA GAG GCA GCC 1632 Gln Pro Gly Tyr Asp Gly His Ser Ala Leu His Val Ala Glu Ala Ala 530 535 540 GGG AAC CTG GCA GTG GTG GCC TTT CTA CAG AGC CTG GAG GGT GCG GTT 1680 Gly Asn Leu Ala Val Val Ala Phe Leu Gln Ser Leu Glu Gly Ala Val 545 550 555 560 GGT GCC CAG GCC CCA TGC CCA GAA GTG CTG CCT GGT GTC 1716 Gly Ala Gln Ala Pro Cys Pro Glu Val Leu Pro Gly Val 565 570 573

【図面の簡単な説明】

【図１】オーバー・ラップ・エクステンション法の概要
を示す図である。

【図２】組換えＤＮＡｐＫＧＰＡ／ＷＴの制限酵素地
図を示す図である。

【図３】組換えＤＮＡｐＢＩｇＧＰＡ／ＷＴの調製法
の概要を示す図である。

【図４】組換えＤＮＡｐＢＩｇＧＰＡ／ＷＴの制限酵
素地図を示す図である。

【図５】組換えＤＮＡｐＫＧＰＡ／Ｄ３６４ｓｔｐの
制限酵素地図を示す図である。

【図６】組換えＤＮＡｐＫＨＡ／ＭＵＴ１の制限酵素
地図を示す図である。

【図７】組換えＤＮＡｐＫＨＡ／ＭＵＴ２の制限酵素
地図を示す図である。

【図８】組換えＤＮＡｐＫＨＡ／ＭＵＴ３の制限酵素
地図を示す図である。

【図９】組換えＤＮＡｐＫＨＡ／ＭＵＴ５の制限酵素
地図を示す図である。

【図１０】組換えＤＮＡｐＢＩｇＧＰＡ／Ｄ３６４ｓ
ｔｐの制限酵素地図を示す図である。

【図１１】組換えＤＮＡｐＢＩｇＨＡ／ＭＵＴ１の制
限酵素地図を示す図である。

【図１２】組換えＤＮＡｐＢＩｇＨＡ／ＭＵＴ２の制
限酵素地図を示す図である。

【図１３】組換えＤＮＡｐＢＩｇＨＡ／ＭＵＴ３の制
限酵素地図を示す図である。

【図１４】組換えＤＮＡｐＢＩｇＨＡ／ＭＵＴ５の制
限酵素地図を示す図である。

【符号の説明】

ＥｃｏＲＩＥｃｏＲＩ切断部位ＨｉｎｄＩＩＩＨｉｎｄＩＩＩ切断
部位ＮｏｔＩＮｏｔＩ切断部位ＸｈｏＩＸｈｏＩ切断部位ＧＰＡ／ＷＴモルモット野生型Ｌ−
アスパラギナーゼをコードするＤＮＡ（ＧＰＡ／ＷＴ
ＤＮＡ）Ｄ３６４ｓｔｐモルモットＬ−アスパ
ラギナーゼ相同体をコードするＤＮＡ（ＧＰＡ／Ｄ３６
４ｓｔｐＤＮＡ）ＨＡ／ＭＵＴ１ヒトＬ−アスパラギナ
ーゼ相同体をコードするＤＮＡ（ＨＡ／ＭＵＴ１ＤＮ
Ａ）ＨＡ／ＭＵＴ２ヒトＬ−アスパラギナ
ーゼ相同体をコードするＤＮＡ（ＨＡ／ＭＵＴ２ＤＮ
Ａ）ＨＡ／ＭＵＴ３ヒトＬ−アスパラギナ
ーゼ相同体をコードするＤＮＡ（ＨＡ／ＭＵＴ３ＤＮ
Ａ）ＨＡ／ＭＵＴ５ヒトＬ−アスパラギナ
ーゼ相同体をコードするＤＮＡ（ＨＡ／ＭＵＴ５ＤＮ
Ａ）ＰｔａｃｔａｃプロモーターｒｒｎＢＴ１Ｔ２リボゾームＲＮＡオペ
ロンの転写終領域５Ｓ５ＳリボゾームＲＮＡ
遺伝子ＡｍｐＲアンピシリン耐性遺伝
子ｐＢＲ３２２ｏｒｉ大腸菌における複製開
始点Ｉｇｓｅｃイムノグロブリンの分
泌シグナル配列を含むペプチド部分をコードするＤＮＡ
（ＩｇｓｅｃＤＮＡ）Ｅｍｓｖモロニー・マウス肉腫
ウイルスのロング・ターミナル・リピート由来のエンハ
ンサーＰｍｔｉマウス・メタロチオネ
インＩ遺伝子由来のプロモーターＰｏｌｙ（Ａ）ＳＶ４０由来のポリ
（Ａ）付加シグナルＢＰＶＩウシパピローマ・ウイ
ルスのゲノム

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 9/82 5/10 Ａ６１Ｋ 9/08 Ｆ 9/82 35/12 // Ａ６１Ｋ 9/08 48/00 ＡＤＹ 35/12 37/54 ＡＤＵ 48/00 ＡＤＹＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/82 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有する哺乳
類由来のポリペプチド。
【請求項２】哺乳類由来の遺伝子を発現させて得るこ
とのできる請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】配列表における配列番号１、２及び３
（ただし、符号「Ｘａａ」を付して示したアミノ酸はグ
ルタミン又はアルギニンを表すものとする。）に示すア
ミノ酸配列を含んでなる請求項１又は２に記載のポリペ
プチド。
【請求項４】配列表における配列番号４に示すアミノ
酸配列又はそのアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を
含んでなる請求項１、２又は３に記載のポリペプチド。
【請求項５】配列表における配列番号５に示すアミノ
酸配列又はそのアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を
含んでなる請求項１、２又は３に記載のポリペプチド。
【請求項６】配列表における配列番号６に示すアミノ
酸配列又はそのアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を
含んでなる請求項１、２又は３に記載のポリペプチド。
【請求項７】配列表における配列番号７に示すアミノ
酸配列又はそのアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を
含んでなる請求項１、２又は３に記載のポリペプチド。
【請求項８】配列表における配列番号８に示すアミノ
酸配列又はそのアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を
含んでなる請求項１、２又は３に記載のポリペプチド。
【請求項９】配列表における配列番号９に示すアミノ
酸配列又はそのアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を
含んでなる請求項１、２又は３に記載のポリペプチド。
【請求項１０】モルモット又はヒトに由来する請求項
１、２、３、４、５、６、７、８又は９に記載のポリペ
プチド。
【請求項１１】多量体の形態で存在する請求項１、
２、３、４、５、６、７、８、９又は１０に記載のポリ
ペプチド。
【請求項１２】請求項１乃至１０に記載のポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ。
【請求項１３】配列表における配列番号１０に示す塩
基配列又はその塩基配列に相同的若しくは相補的な塩基
配列を含んでなる請求項１２に記載のＤＮＡ。
【請求項１４】配列表における配列番号１１に示す塩
基配列又はその塩基配列に相同的若しくは相補的な塩基
配列を含んでなる請求項１２に記載のＤＮＡ。
【請求項１５】配列表における配列番号１２に示す塩
基配列又はその塩基配列に相同的若しくは相補的な塩基
配列を含んでなる請求項１２に記載のＤＮＡ。
【請求項１６】配列表における配列番号１３に示す塩
基配列又はその塩基配列に相同的若しくは相補的な塩基
配列を含んでなる請求項１２に記載のＤＮＡ。
【請求項１７】配列表における配列番号１４に示す塩
基配列又はその塩基配列に相同的若しくは相補的な塩基
配列を含んでなる請求項１２に記載のＤＮＡ。
【請求項１８】モルモット又はヒトに由来する請求項
１２、１３、１４、１５、１６又は１７に記載のＤＮ
Ａ。
【請求項１９】自律複製可能なベクターをさらに含ん
でなる請求項１２、１３、１４、１５、１６、１７又は
１８に記載のＤＮＡ。
【請求項２０】自律複製可能なベクターがプラスミド
ベクターである請求項１９に記載のＤＮＡ。
【請求項２１】自律複製可能なベクターがメタロチオ
ネインプロモーター及び／又はタックプロモーターを含
んでなる請求項１９又は２０に記載のＤＮＡ。
【請求項２２】請求項１乃至１０に記載のポリペプチ
ドをコードするＤＮＡを宿主に導入してなる形質転換
体。
【請求項２３】宿主が原核細胞又は真核細胞である請
求項２２に記載の形質転換体。
【請求項２４】宿主が大腸菌である請求項２２又は２
３に記載の形質転換体。
【請求項２５】宿主がマウス乳癌由来の細胞である請
求項２２又は２３に記載の形質転換体。
【請求項２６】請求項１乃至１０に記載のポリペプチ
ドをコードするＤＮＡを宿主に導入してなる形質転換体
を培養し、産生したポリペプチドを培養物から採取して
なるポリペプチドの製造方法。
【請求項２７】産生したポリペプチドを塩析、透析、
濾過、濃縮、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換
クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、疎水
クロマトグラフィー、等電点電気泳動及び／又はゲル電
気泳動により採取する請求項２６に記載のポリペプチド
の製造方法。
【請求項２８】請求項１乃至１０に記載のポリペプチ
ドを有効成分として含んでなる感受性疾患剤。
【請求項２９】悪性腫瘍治療剤としての請求項２８に
記載の感受性疾患剤。
【請求項３０】白血病又はリンパ腫治療剤としての請
求項２８又は２９に記載の感受性疾患剤。
【請求項３１】安定剤として血清アルブミン、グリセ
リン、ゼラチン、トレハロース及び／又はマルトースを
含んでなる請求項２８、２９又は３０に記載の感受性疾
患剤。