JP2020530300A - 切断されたモルモットｌ−アスパラギナーゼバリアントおよび使用の方法 - Google Patents

Abstract

切断され、ヒト化されているモルモットL-アスパラギナーゼのバリアントが記載され、当該Ｌ−アスパラギナーゼを含有する融合タンパク質および急性リンパ性白血病および急性骨髄性白血病などのがんの処置における当該Ｌ−アスパラギナーゼの使用が同様に記載されている。

Description

導入
本願は、２０１７年８月１１日に出願された米国仮出願第６２／５４４，３９６号、および２０１７年８月１１日に出願された第６２／５４４，４１１号の優先権の利益を主張し、その内容はその全体が参照によりここに組み込まれる。

本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＥＢ０１３６８５および退役軍人省によって授与された助成金番号ＢＸ００１９１９の下での政府の支援によってなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

背景
急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）などの一定のがんは、かかるがんにおけるアスパラギン合成酵素の欠如／低発現に最も一般的に起因する因子である、Ａｓｎの血液からのスカベンジングに依存する。結果的に、Ｌ−アスパラギナーゼは、これらのがんの処置において重要な構成要素として同定されている。全ての市販のＬ−アスパラギナーゼは、二重の活性を有する。主たる活性であるＬ−アスパラギナーゼ活性は、アミノ酸であるＬ−アスパラギン（Ａｓｎ）をＬ−アスパラギン酸（Ａｓｐ）およびアンモニアに加水分解する。第２の活性は、Ｌ−グルタミナーゼ活性であり、これはＬ−グルタミン（Ｇｌｎ）をＬ−グルタミン酸（Ｇｌｕ）およびアンモニアに加水分解する。例えば、ELSPAR（登録商標）（大腸菌（Escherichia coli）から得られる酵素）およびERWINAZE（登録商標）（エルウィニア・クリサンセミ（Erwinia chrysanthemi）から得られる酵素）などの、ＦＤＡに認可された酵素については、Ｌ−グルタミナーゼ活性は、第１のＬ−アスパラギナーゼ活性の２〜１０％の範囲に及ぶ。これらの薬物のＬ−アスパラギナーゼ活性の重要性が受け入れられる一方、白血病細胞を殺す際のＬ−グルタミナーゼ活性の重要性について相反する報告がある。その上、Ｌ−グルタミナーゼ活性は、Ｌ−アスパラギナーゼの臨床的な毒性の多くに関連している。事実、Ｌ−アスパラギナーゼ処置の有毒な副作用は、この抗がん薬の使用を厳しく限定する。

治療薬として細菌の酵素を使用することの別の不利な点は、それらの免疫原性であり、それはアナフィラキシーショックにまで至る、過敏症反応に起因して、患者への直接の脅威を引き起こし得る。その上、生成された抗体は、酵素薬物を不活化および除去し得、よってその有効性を低減するかまたは排除さえする。大腸菌酵素とポリエチレングリコールを結びつけること（ペグ化）または野生型大腸菌酵素の残基１１５、１１８、１２０、１２３、２１５、２１９、３０７および３１２の突然変異による脱免疫化などの方法は、これらの重度の副作用を低減するために開発されている（ＷＯ２０１２／０７５１７３Ａ２）。しかしながら、低減された免疫原性および低減されたＬ−グルタミナーゼ活性を有する代替Ｌ−アスパラギナーゼの調製が、必要とされる。

モルモットのＬ−アスパラギナーゼは、モルモット血清から精製され、特徴づけられた（Zhang、et al. (1995) Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol. 112(4):607-12）。Ｈ０Ｗ０Ｔ５＿ＣＡＶＰＯと注釈づけられた、モルモット酵素は、抗腫瘍活性を示し、アスパラギンに対して低いＫ_ｍ値を有し、Ｌ−グルタミナーゼ活性を欠いている（Schalk、et al. (2014) J. Biol. Chem. 289:33175-33186）。ＥＰ０７２６３１３Ｂ１およびＵＳ６，５３７，５４７もまた参照されたい。

Ｌ−アスパラギナーゼを使用してがんを処置するための他のアプローチは、Ｌ−アスパラギナーゼの、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）アゴニストまたはＴＲＡＩＬ受容体アゴニスト、例として３つの可溶性ＴＲＡＩＬドメインおよび抗体フラグメントなどの追加の機能ドメインとの、共投与を含む。ＵＳ２０１５／０３３７０２７、ＵＳ２００９／０１３１３１７およびＷＯ２０１２／１７０６４０を参照されたい。この点において、Ｌ−アスパラギナーゼは、Ｂｃｌ−２／Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤ＡＢＴ２６３によって誘導された内因性アポトーシスおよびＬ−アスパラギナーゼ単一処置に対して耐性である神経膠腫細胞におけるＴＲＡＩＬによって媒介された外因性アポトーシスの両方に対する耐性を克服することが示されている（Karpel-Massler, et al. (2016) Oncotarget 7(23):33512-28）。

本発明の概要
本発明は、配列番号１の残基１〜３５９と少なくとも８５％の配列同一性を共有している、Ｃ末端で切断されたモルモットＬ−アスパラギナーゼ（ＧｐＡ）バリアントを提供する。いくつかの態様において、Ｃ末端切断は、配列番号１の３５９と３９６との間の位置においてである。ある態様において、Ｃ末端切断は、配列番号１の３６９の位置においてである。他の態様において、切断されたＧｐＡバリアントは、配列番号１と比べて、例として、位置７、１０、２３、２５、４８、４９、５２、５３、５４、５７、５８、５９、６０、６２、９２、９８、１０１、１０２、１０６、１０８、１２１、１２２、１３４、１４７、１９３、１９８、２１７、２３３、２３６、２５０、２５７、２８１、３０１、３１１、３４０、３４４、３６０、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、または３６８、またはその組み合わせの位置において、少なくとも１つのアミノ酸置換をさらに含む。特定の態様において、配列番号１と比べての少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｈ１０Ｒ、Ｑ２３Ｒ、Ｋ２５Ｅ、Ｋ４８Ｅ、Ｑ５２Ｒ、Ｑ５４Ｒ、Ｐ５７Ｓ、Ｄ５８Ｅ、Ｈ５９Ｄ、Ａ６０Ｔ、Ａ６２Ｖ、Ｄ９１Ａ、Ｄ９２Ｅ、Ｋ９８Ｑ、Ｅ１０１Ｋ、Ｑ１０８Ｈ、Ｓ１２１Ｆ、Ｇ１２２Ａ、Ｈ１３４Ｑ、Ｒ１４７Ｈ、Ｋ１９３Ｒ、Ｃ１９８Ａ、Ｃ１９８Ｓ、Ｃ１９８Ｖ、Ｄ２１７Ｅ、Ｎ２３３Ｓ、Ｈ２３６Ｑ、Ｓ２５０Ａ、Ｑ２８８Ｅ、Ｒ３０１Ｑ、Ｅ３４４Ｄ、Ｌ３６０Ｐ、Ｔ３６２Ｓ、Ａ３６３Ｖ、Ｄ３６４Ｅ、Ｌ３６５Ｅ、Ｈ３６６Ｒ、Ｑ３６７Ｒ、またはＳ３６８Ｐ、またはその組み合わせである。さらに他の態様において、配列番号１と比べての少なくとも１つのアミノ酸置換は、以下を含む：（ａ）位置４９、５２、２２５、２５７、２８１または３４０、またはその組み合わせの位置においてシステイン残基；または（ｂ）位置７、５３、５４、５７、５８、９８、１０６、２３３、２５０、２５７、２８１、３１１または３４０、またはその組み合わせの位置においてリシン残基。理想的には、バリアントは、野生型ＧｐＡと等しいかまたはそれより大きな触媒活性を有する。任意に、切断されたＧｐＡバリアントは、ヒスチジンタグ、ＳＵＭＯタグ、アルブミン結合ドメイン、ＴＲＡＩＬの３つのタンデム可溶性ドメイン（例として、ヒトＴＲＡＩＬの残基１１５〜２８１）、またはその組み合わせをさらに含み得る。

切断されたＧｐＡバリアントまたは融合タンパク質を含有する核酸分子、発現ベクター、宿主細胞および医薬組成物もまた提供され、処置を必要とする対象に切断されたＧｐＡバリアントまたは融合タンパク質の有効量を、任意にＴＲＡＩＬの安定な形態と組み合わせて投与することによって、がんを処置する方法もまた提供される。

図面の簡単な記載
図１は、ＤＮＡシャッフリングプロセスおよびＣ末端ドメインスワッピングから得られたクローンの略図である。ｈＡＳＮａｓｅ１配列は、オープンな枠（open boxes）であり、ｇｐＡＳＮａｓｅ１は、陰影のある枠（shade boxes）である。選択から単離された（＃６３、６４、６５およびＳＡ）かまたはＣ末端スワッピングによって生成された（６３−ｈＣ、６４−ｈＣ、６５−ｈＣおよびＳＡ−ｈＣ）クローンは、ｈＡＳＮａｓｅ１（オープンな枠）とｇｐＡＳＮａｓｅ１（塗りつぶされた枠（filled boxes））との配列の間のシャッフルである。

図２Ａおよび２Ｂは、ｈＡＳＮａｓｅ１（ｈＡＳＮ）、ｇｐＡＳＮａｓｅ１（ＧｐＡ）、および選ばれたヒト化クローンのアミノ酸配列アライメントを示す。下線を引いた残基は、ＧｐＡ由来の残基である。 図２Ａおよび２Ｂは、ｈＡＳＮａｓｅ１（ｈＡＳＮ）、ｇｐＡＳＮａｓｅ１（ＧｐＡ）、および選ばれたヒト化クローンのアミノ酸配列アライメントを示す。下線を引いた残基は、ＧｐＡ由来の残基である。

本発明の詳細な記載
Ｌ−アスパラギナーゼは、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）の処置のために使用される化学療法薬である。Ｌ−アスパラギナーゼの臨床的有効性のための主な必須条件は、このアミノ酸の血中での完全な欠乏を可能にするアスパラギンに対してのマイクロモルＫｍである。現在のところ承認されているＬ−アスパラギナーゼが、細菌起源のものであるために、免疫原性が課題となり、それはヒト酵素によって和らげられるであろう。しかしながら、全てのヒトＬ−アスパラギナーゼは、アスパラギンに対してミリモルのＫ_ｍを有する。低いＫ_ｍのモルモットＬ−アスパラギナーゼ（ｇｐＡＳＮａｓｅ１）が同定され、それはヒトＬ−アスパラギナーゼ１（ｈＡＳＮａｓｅ１）と約７０％のアミノ酸同一性を共有している。ヒト酵素と同様に、ｇｐＡＳＮａｓｅ１は、以下の２つのドメインを含有する；Ｌ−アスパラギナーゼ活性が存在する約３６０残基のＮ末端ドメイン、および未知の機能の約２００残基のＣ末端ドメイン。半減期を改善するために、ＧｐＡのより短いが安定であるバージョンが探し求められた。結果的に、ＧｐＡは、活性を保持するＧｐＡの最も短いフラグメントを同定するためにＣ末端で切断された。この分析は、３５９アミノ酸残基のＮ末端触媒ドメインが、ＳＵＭＯタグと共に発現し得、野生型活性を保持していることを指し示した。しかしながら、ＳＵＭＯタグを除去すると、タンパク質は不安定となった。切断を残基３６９まで拡張することは、安定および活性の両方である酵素を提供した。

切断されたＧｐＡバリアントの免疫原性を減少させるために、以下の２つの異なるアプローチが、酵素をヒト化するために用いられた：ＤＮＡシャッフリングおよび表面残基の構造ベースの突然変異。ＧｐＡのヒト化は、ｈＡＳＮａｓｅ１とおよそ８０％の配列同一性、野生型ＧｐＡ活性、アスパラギンに対しての低いＫ_ｍ値、および検出可能なＬ−グルタミナーゼ活性なし、を共有するバリアントを生じた。システインまたはリシン残基を導入し、ＰＥＧへと結びつけると、切断されたＧｐＡバリアントは維持され、およびいくつかの例においては、それらのＬ−アスパラギナーゼ活性における増加を示した。加えて、ＮまたはＣ末端へのヒスチジンタグ、ＳＵＭＯタグ、および／またはアルブミン結合ドメインの追加などの改変は、ｉｎ ｖｉｖｏでの循環時間を増加させ得、ＴＲＡＩＬの３つのタンデム可溶性ドメインへの切断されたＧｐＡバリアントの融合は、固有のアポトーシスカスケードのための必要なシグナルを提供すること（Ｌ−アスパラギナーゼ）および外部からのアポトーシスカスケードを誘導すること（ＴＲＡＩＬ）の両方によって細胞死を促進し得る。

結果的に、本発明は、Ａｓｎの外部供給の存在に依存するリンパ腫および白血病などのがんの処置における使用のための、切断されたＧｐＡバリアントおよびその融合タンパク質を提供する。本Ｌ−アスパラギナーゼの改善された安全性は、現在の患者集団（例として、小児ＡＬＬを有する患者）および他の患者集団（例として、成人ＡＬＬ、ＡＭＬ、および他のがん）における長期にわたる使用に利益をもたらす。

当該技術分野で知られているように、Ｌ−アスパラギナーゼ（Ｌ−アスパラギンアミノヒドロラーゼ、E.C.3.5.1.1）は、Ａｓｎにおけるアミド結合をＡｓｐおよびアンモニアに加水分解するアミダーゼである（Kumar & Verma (2012) Asian J. Biochem. Pharma Res. 3:197-205）。本明細書において「ｇｐＡＳＮａｓｅ１」または「ＧｐＡ」と称されている、野生型モルモット（Cavia porcellus）Ｌ−アスパラギナーゼは、Uniprotのアクセッション番号Ｈ０Ｗ０Ｔ５＿ＣＡＶＰＯおよび配列番号１の下で入手可能な５６５アミノ酸残基のタンパク質である。ＧｐＡは、抗腫瘍活性を示し、アスパラギンに対して低いＫ_ｍ値を有し、Ｌ−グルタミナーゼ活性を欠く。しかしながら、野生型ＧｐＡは、ｈＡＳＮａｓｅ１とおよそ７０％の配列同一性のみ共有する。結果的に、本発明は、いくつかの態様においては、免疫原性を減少させるためにヒト化される切断されたＧｐＡを提供する。特に、本発明は、配列番号１の残基１〜３５９と少なくとも８５％の配列同一性を共有する切断されたＧｐＡバリアントを提供する。

「ＧｐＡバリアント」は、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を示して、Ａｓｎに対して低いＫ_ｍを有し、Ｌ−グルタミナーゼ活性を欠いている、ＧｐＡの天然に存在しない形態を指す。これと比較して、「野生型」ＧｐＡは、天然に存在する供給源から単離されたときの典型的なＬ−アスパラギナーゼの形態を指す。野生型は、天然の集団において最も頻繁に観察されるものであり、したがって、任意に正常または野生型の形態と呼ばれる。野生型ＧｐＡは、およそ３９ｓ^−１の反応速度（ｋ_ｃａｔ）およびＡｓｎに対して５８μＭのＫ_ｍを有する（Schalk、et al. (2014) J. Biol. Chem. 289:33175-33186）。本発明の切断されたＧｐＡバリアントは、典型的には野生型ＧｐＡ酵素の少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％のｋ_ｃａｔを示し、Ａｓｎに対して２５０μＭ、２００μＭ、１５０μＭ、１００μＭ、８０μＭまたは６０μＭより低いＫ_ｍを示す。

少なくとも、ＧｐＡバリアントは、切断されている。「切断されたＧｐＡ」は、およそ２０６のＣ末端アミノ酸残基の全てまたは一部が取り除かれているＧｐＡを指す。ある態様において、切断されたＧｐＡタンパク質は、Ｎ末端に３５９アミノ酸残基の触媒ドメインを保持する。理想的には、完全長ＧｐＡ（配列番号１）は、残基３５９と３９６との間の位置においてＣ末端で切断されている。特に、完全長ＧｐＡ（配列番号１）は、位置３５９、３６７、３６９、３７４、３８４、３９２または３９６の位置においてＣ末端で切断されている。ある態様において、切断されたＧｐＡバリアントは、位置３６９の位置においてＣ末端で切断される。例示の切断されたＧｐＡバリアントは、配列番号３（ＧｐＡ３５９）、配列番号４（ＧｐＡ３６７）、配列番号５（ＧｐＡ３６９）、配列番号６（ＧｐＡ３７４）、配列番号７（ＧｐＡ３８４）、配列番号８（ＧｐＡ３９２）および配列番号９（ＧｐＡ３９６）において提供される。いくつかの態様において、Ｃ末端で切断されたＧｐＡバリアントは、配列番号３を含むかまたは配列番号３からなる。ある態様において、Ｃ末端で切断されたＧｐＡバリアントは、配列番号５を含むかまたは配列番号５からなる。

本発明の他の側面に従うと、ＧｐＡバリアントは、切断され、野生型ＧｐＡ酵素と比較して、安定性を増加させる、ｈＡＳＮａｓｅ１との配列同一性を増加させる、および／またはＧｐＡのｉｎ ｖｉｖｏ循環時間を増加させる、少なくとも１つのアミノ酸置換または改変（例として、ペグ化またはタンパク質融合）を含む。本明細書において示されるように、ＧｐＡの表面に位置するアミノ酸残基は、ＧｐＡをヒト化する、および／またはペグ化のために好適な部位を提供するかのいずれかのための突然変異をされた。さらに、ＧｐＡのタンパク質タグまたはトリマーＴＲＡＩＬへの融合は、安定性および／または増強された腫瘍細胞殺傷活性を提供する。

結果的に、いくつかの側面において、ＧｐＡバリアントは、野生型ＧｐＡ（配列番号１）と比べて少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。特定の態様において、置換されているアミノ酸残基は、表面残基である。用語「表面残基」は、タンパク質の表面に位置している残基を指す。対照的に、埋まっている残基は、タンパク質の表面に位置していない残基である。表面残基は、大抵は親水性側鎖を含む。操作上、表面残基は、分子構造の表面にわたって転がる(rolled over)水和層(sphere of hydration)に接触する残基として、タンパク質の構造モデルから計算上同定され得る。表面残基はまた、重水素交換研究、または例として、親水性アルキル化剤などの、様々な標識試薬の到達性の使用を通じて実験的に同定され得る。特定の態様において、アミノ酸置換は、活性部位の残基、例として、Ｔｈｒ１９、Ｓｅｒ８５、Ｓｅｒ８６、Ｔｈｒ１１６、Ａｓｐ１１７、Ａｌａ１４２、Ｌｙｓ１８８、Ａｓｎ２７２、およびＴｙｒ３０８の１つにおいてではない。

本発明のＧｐＡバリアントを生成するために置換され得るＧｐＡの表面残基は、これらに限定されないが、配列番号１の位置７、１０、２３、２５、４０、４８、４９、５２、５３、５４、５７、５８、５９、６０、６２、９２、９８、１０１、１０６、１０８、１２１、１２２、１３１、１３２、１３４、１４７、１９３、１９８、２１７、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２３３、２３６、２５０、２５３、２５７、２６１、２８１、２８２、２８３、２８４、３０１、３１１、３４０、３４４、３４５、３４７、３５２、３５８、３５９、３６０、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、または３６８のアミノ酸残基を含む。いくつかの態様において、ＧｐＡバリアントは、少なくとも１のアミノ酸置換を含む。他の態様において、ＧｐＡバリアントは、約１〜５０、１〜４５、１〜４０、１〜３５、１〜３０、１〜２５、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜７、または１〜４のアミノ酸置換を含む。特定の態様において、ＧｐＡバリアントは、配列番号１の位置７、１０、２３、２５、４８、４９、５２、５３、５４、５７、５８、５９、６０、６２、９２、９８、１０１、１０６、１０８、１２１、１２２、１３４、１４７、１９３、１９８、２１７、２３３、２３６、２５０、２５７、２８１、３０１、３１１、３４０、３４４、３６０、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７および３６８の１以上においてアミノ酸置換を含む。

本明細書において指し示されるように、切断されたＧｐＡ３６９は、ｈＡＳＮａｓｅ１のＮ末端３７１アミノ酸残基と約７２％の配列同一性を共有する。理想的には、ＧｐＡの少なくとも１のアミノ酸置換は、野生型ＧｐＡと比較して、ｈＡＳＮａｓｅ１との増加したアミノ酸配列同一性を有するＧｐＡバリアントを生成する。結果的に、本発明の一側面は、ＧｐＡのヒト化について提供する。本発明のこの側面に従うと、切断されたＧｐＡバリアントは、好ましくは、ｈＡＳＮａｓｅ１のＮ末端３７１アミノ酸残基と少なくとも７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８２％または８４％のアミノ酸配列同一性を有する。さらに、切断されたＧｐＡバリアントは、野生型の切断されたＧｐＡと少なくとも８５％、８７％、８９％、９１％、９３％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を共有する。

好ましくは、切断されたＧｐＡのヒト化は、野生型ＧｐＡの１以上の表面残基とｈＡＳＮａｓｅ１の対応する表面残基とを取り換えることによって達成される。とりわけ、切断されたＧｐＡのヒト化は、野生型ＧｐＡ残基のＨ１０、Ｑ２３、Ｋ２５、Ｋ４８、Ｑ５２、Ｑ５４、Ｄ９１、Ｄ９２、Ｋ９８、Ｅ１０１、Ｑ１０８、Ｓ１２１、Ｇ１２２、Ｈ１３４、Ｒ１４７、Ｋ１９３、Ｄ２１７、Ｎ２３３、Ｈ２３６、Ｓ２５０、Ｑ２８８、Ｒ３０１、Ｅ３４４、Ｌ３６０、Ｔ３６２、Ａ３６３、Ｌ３６５、Ｈ３６６、Ｑ３６７、またはＳ３６８、またはそのいずれかの組み合わせと、ｈＡＳＮａｓｅ１の対応する表面残基とを取り換えることによって達成される。具体的に言うと、切断されたＧｐＡのヒト化は、以下のアミノ酸置換の１以上を行うことによって達成される：野生型ＧｐＡに対してＨ１０Ｒ、Ｑ２３Ｒ、Ｋ２５Ｅ、Ｋ４８Ｅ、Ｑ５２Ｒ、Ｑ５４Ｒ、Ｄ９１Ａ、Ｄ９２Ｅ、Ｋ９８Ｑ、Ｅ１０１Ｋ、Ｑ１０８Ｈ、Ｓ１２１Ｆ、Ｇ１２２Ａ、Ｈ１３４Ｑ、Ｒ１４７Ｈ、Ｋ１９３Ｒ、Ｄ２１７Ｅ、Ｎ２３３Ｓ、Ｈ２３６Ｑ、Ｓ２５０Ａ、Ｑ２８８Ｅ、Ｒ３０１Ｑ、Ｅ３４４Ｄ、Ｌ３６０Ｐ、Ｔ３６２Ｓ、Ａ３６３Ｖ、Ｌ３６５Ｅ、Ｈ３６６Ｒ、Ｑ３６７Ｒおよび／またはＳ３６８Ｐ。例示の切断され、ヒト化されたＧｐＡバリアントは、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６５および配列番号８６において提供される。

Ｌ−アスパラギナーゼのペグ化は、ｉｎ ｖｉｖｏ循環時間を増加させることが示されている。用語「ペグ化された」または「ペグ化」は、Ｌ−アスパラギナーゼとポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を結びつけることを指す。「ＰＥＧ」または「ポリエチレングリコール」は、いずれかの水溶性のポリ（エチレングリコール）またはポリ（エチレンオキシド）を指す。よってＰＥＧの表現は、構造（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ、式中ｎは、２から約１０００までの整数である、を含む。一般に使用されるＰＥＧは、エンドキャップＰＥＧであり、ここでＰＥＧの末端の一方の端は、アルコキシなどの比較的不活性な基でエンドキャップされており、一方で他の端は、リンカー部分によってさらに修飾されていてもよいヒドロキシル基である。一態様において、キャッピング基は、メトキシであり、対応するエンドキャップＰＥＧは、ｍＰＥＧと表示される。ゆえに、ｍＰＥＧは、ＣＨ_３Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎであり、式中ｎは、２から約１０００までの整数である。別の態様において、キャッピング基は、ヒドロキシルであり、対応するエンドキャップＰＥＧは、ヒドロキシＰＥＧである。「ＰＥＧ」とこれに続く数字（下付き文字ではない）は、該数字に１，０００を乗じたものとおおよそ等しい分子量を有するＰＥＧ部分を指し示す。ゆえに、「ＰＥＧ４０」または「ＰＥＧ４０Ｋ」は、おおよそ４０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧ部分である。ＰＥＧの分子量を決定するために使用されるであろう方法の例は、限定せずに、例えば、ＴＯＦ−ＭＳなどの質量分析を含む。ＰＥＧは、例えば、日油株式会社、東京、日本；Creative PEG-works、Winston Salem、NC；およびNanocs、Boston、MAによって提供されるだろう。

一態様において、ＰＥＧ部分は、例として、ＯＳｕ−活性化エステルを用いて、Ｎ末端アルファ−アミノ基上のまたはガンマ位置におけるリシン残基（単数または複数）上の求核置換（アシル化）によって取り付けられてもよい。別の態様において、ＰＥＧ部分は、ＰＥＧ−アルデヒド試薬およびシアノ水素化ホウ素ナトリウムなどの還元剤を使用して、ＧｐＡタンパク質中に存在するアミノ基における還元アルキル化によって取り付けられてもよい。別の態様において、ＰＥＧ部分は、例えばＰＥＧマレイミド試薬を使用する、マイケル付加反応において対を形成していないシステイン残基の側鎖へと取り付けられてもよい。他のペグ化方法は、これらに限定されないが、架橋ペグ化（bridging PEGylation）、トランスグルタミナーゼのペグ化、糖ペグ化（glycoPEGylation）、遺伝子工学を使用するペグ化、放出可能リンカー（releasable linker）のペグ化を含む。ペグ化方法のレビューについて、Pasut & Veronese (2012) J. Contr. Rel. 161:461-472；およびRoberts、et al. (2012) Adv. Drug Del. Rev. 64:116-127を参照されたい。一態様において、ＰＥＧ部分は、リシンまたはシステイン残基（単数または複数）の側鎖（単数または複数）に取り付けられる。

「リンカー」は、ＧｐＡタンパク質の−ＨＮ−基とＰＥＧ部分の−Ｏ−基とをつなぐ化学的部分を指す。好ましい態様において、リンカーは、ＧｐＡの活性にいかなる悪影響をも及ぼさない。リンカーは、典型的にはカルボン酸の誘導体であり、ここでカルボン酸の官能性は、アミド結合を介してＧｐＡタンパク質に取り付けられるために使用される。リンカーの例は、これらに限定されないが、リンキングモチーフを有する酢酸部分：ＣＨ_２ＣＯ、リンキングモチーフを有するプロピオン酸部分：ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯまたはＣＨＣＨ_３ＣＯ、リンキングモチーフを有する酪酸部分：ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯまたはＣＨ_２ＣＨＣＨ_３ＣＯ、ＣＯ基、Ｎ−（アミノカルボニル）スクシンイミド誘導体（例えば、Ｎ−（Ｎ−プロピルプロパンアミド）スクシンイミド、Ｎ−（Ｎ−プロピルヘキサンアミド）スクシンイミドおよびＮ−（Ｎ−エチルプロパンアミド）スクシンイミドなど）、ペンタン酸（（ＣＨ_２）_５ＣＯ）、α−メチルブタン酸（ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＯ）、コハク酸（ＣＯ（ＣＨ_２）_２ＣＯ）、グルタル酸（ＣＯ（ＣＨ_２）_３ＣＯ）、スクシンアミド誘導体（例えば、（ＣＨ_２）_２ＮＨＣＯ（ＣＨ_２）_２ＣＯなど）、グルタルアミド誘導体（例えば、（ＣＨ_２）_３ＮＨＣＯ（ＣＨ_２）_３ＣＯおよび（ＣＨ_２）_２ＮＨＣＯ（ＣＨ_２）_３ＣＯなど）を含む。本発明における使用の例示のＰＥＧ分子は、これらに限定されないが、メトキシＰＥＧスクシンイミジルカルボナート（ｍＰＥＧ−ＳＣ）、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルカルボキシメチルエステル（ｍＰＥＧ−ＳＣＭ）およびｍＰＥＧ−スクシンアミドスクシンイミジルエステル（ｍＰＥＧ−ＳＡＳ）を含む。

本発明のＬ−アスパラギナーゼをペグ化するために使用され得るペグ化の方法は、例えば、ＵＳ４，１７９，３３７、ＵＳ５，７６６，８９７、ＵＳ２００２／００６５３９７、およびＵＳ２００９／００５４５９０において提供される。理想的には、ペグ化されたＧｐＡバリアントは、約２０：１〜１００：１、またはより具体的には２０：１〜５０：１、または最も具体的には２０：１のＰＥＧ：ＧｐＡの比率において、ＰＥＧと切断されたＧｐＡバリアントとを反応させることにより、ＰＥＧのサイズに依存して産生される。いくつかの側面において、ＧｐＡバリアントは、少なくとも１のシステイン残基を有し、ＰＥＧは、マレイミドＰＥＧであり、反応は、グリシンまたはアスパラギン酸の不在下において実行され、および反応産物は、ベータ−メルカプトエタノールを用いて処理される。他の側面において、ＧｐＡバリアントは、少なくとも１のリシン残基を有し、ＰＥＧは、ｍＰＥＧ−ＳＣ、ｍＰＥＧ−ＳＣＭまたはｍＰＥＧ−ＳＡＳであり、および反応は、ＤＴＴおよびグリセロールの不在下において実行される。

本明細書において開示されるように、Ｌ−アスパラギナーゼは、アミノ酸置換によりＬ−アスパラギナーゼのアミノ酸配列中に導入される、１〜６システイン残基または１０〜３０リシン残基における部位特異的なペグ化によってペグ化され得る。例４および５を参照されたい。特に、切断されたＧｐＡ、またはヒト化され、切断されたＧｐＡは、以下の導入によってペグ化されていてもよい：（ａ）位置４９、５２、２２５、２５７、２８１および／または３４０におけるシステイン残基；または（ｂ）位置７、５３、５４、５７、５８、９８、１０６、２３３、２５０、２５７、２８１、３１１および／または３４０におけるリシン残基。特定の場所におけるシステイン残基またはリシン残基の導入に加えて、内在性のシステイン残基またはリシン残基は、タンパク質長にわたってペグ化部位がより均等に分布するように突然変異されていてもよい（すなわち、別の残基と置換されている）。この点において、ある態様は、残基Ｃｙｓ１９８をＡｌａ、ＶａｌまたはＳｅｒと置き換えること、および／または残基Ｌｙｓ２２３をＡｓｐと置き換えることを含む。一態様において、Ｃｙｓ１９８は、Ａｌａと置き換えられ、Ｌ−アスパラギナーゼ誘導体は、Ｃｙｓ７９においてペグ化される。他の態様において、Ｃｙｓ１９８は、Ａｌａと置き換えられ、位置４９、２２５および３４０のアミノ酸の１以上は、システインと置き換えられる。ペグ化についての好適な例示の切断されたＧｐＡバリアントは、配列番号５１（ＧｐＡ３６９−Ｃ１９８Ａ）、配列番号５２（ＧｐＡ３６９−Ｃ１９８Ｓ）、配列番号５３（ＧｐＡ３６９−Ｃ１９８Ｖ）、配列番号５４（ＧｐＡ３６９−Ｃ１９８Ａ＋Ｋ２２５Ｃ）、配列番号５５（ＧｐＡ３６９−Ｃ１９８Ａ＋Ｋ２２５Ｃ＋Ｅ３４０Ｃ）、配列番号５６（ＧｐＡ３６９−Ｃ１９８Ａ＋Ｋ２２５Ｃ＋Ｅ３４０Ｃ＋Ｅ４９Ｃ）、配列番号５７（ＧｐＡ３６９−Ｃ１９８Ａ＋Ｋ２２５Ｃ＋Ｅ３４０Ｃ＋Ｅ４９Ｃ＋Ｑ２５７Ｃ）、配列番号５８（ＧｐＡ３６９（ｈｕｍ）−Ｇｒｏｕｐ１＋２＋３−Ｃ１９８Ａ）、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５および配列番号８６において提供される。

切断されたＧｐＡのin vivo循環時間を増加させるために、本発明は、バリアント、特に、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ）、ＳＵＭＯタグ（ＳＵＭＯ）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）、またはそれらの組み合わせを有する切断されたＧｐＡバリアントも提供する。切断されたＧｐＡバリアントは、そのＣ末端、Ｎ末端および／またはＧｐＡ配列中の内部の場所にヒスチジンタグ、ＳＵＭＯタグおよび／またはアルブミン結合ドメインを含み得る。理想的には、Ｈｉｓタグ、ＳＵＭＯタグまたはＡＢＤが、ＧｐＡ配列中(すなわち、NまたはC末端にではなく)に挿入されているとき、挿入は、ＧｐＡタンパク質の１以上のフレキシブルループ中にある。実例として、切断されたＧｐＡバリアントは、ＳＵＭＯ−アスパラギナーゼ−ＡＢＤ、Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ−ＡＢＤ−アスパラギナーゼ、Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ−アスパラギナーゼ−ＡＢＤ、Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ−アスパラギナーゼ、Ｈｉｓ−ＡＢＤ−アスパラギナーゼ、ＡＢＤ−アスパラギナーゼ、ＡＢＤ−ＳＵＭＯ−アスパラギナーゼ、アスパラギナーゼ^{１−２２５}−ＡＢＤ−アスパラギナーゼ^{２２６−３６９}、アスパラギナーゼ^{１−３４０}−ＡＢＤ−アスパラギナーゼ^{３４１−３６９}などのＮからＣ末端構造を有し得る。Ｈｉｓ、ＳＵＭＯまたはＡＢＤをコードする核酸は、切断されたＧｐＡバリアントをコードする核酸の５’または３’のいずれかにインフレームで挿入され得、それにより融合タンパク質を作製することができる。

理想的には、ヒスチジンタグ、ＳＵＭＯタグ、アルブミン結合ドメイン、またはそれらの組み合わせの１以上の包含は、Ｌ−アスパラギナーゼのｉｎ ｖｉｖｏ循環時間を著しく増加させる。代替的に言えば、バリアントは、同等のタンパク質用量で投与される野生型Ｌ−アスパラギナーゼよりも長いｔ_１／２を有する。本明細書に使用されるとき、用語「ｔ_１／２」または「半減期」は、切断されたＧｐＡバリアントまたはその融合タンパク質の濃度がｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで（例えば哺乳動物における注射後に）半減するのに必要な時間を指す。Ｌ−アスパラギナーゼの有効性が薬物のｉｎ ｖｉｖｏ半減期に関連することを考えると、本発明の切断されたＧｐＡバリアントは、白血病およびリンパ腫などのがんの処置に特に有用である。

本明細書に使用されるとき、「ヒスチジンタグ」は、少なくとも１つのヒスチジン（Ｈｉｓ）残基、好ましくは６つのＨｉｓ残基から構成されるアミノ酸モチーフを指す。ヒスチジンタグは、６（ヘキサヒスチジンタグ、６×Ｈｉｓタグ、またはＨｉｓ_６タグ）、７、８、９、１０、または２０のヒスチジン残基までのポリヒスチジンを含む。

「ＳＵＭＯタグ」は、目的のタンパク質の可溶性／安定性を増強するための、ＳＵＭＯ（低分子ユビキチン様修飾因子）タンパク質の目的のタンパク質との融合を指す。ＳＵＭＯタグの包含は、CHAMPION pET SUMO expression system（Invitrogen）、EXPRESSO T7 SUMO cloning and expression system（Lucigen）、またはpET His6 SUMO TEV LIC cloning vector（Addgene）などの既知の発現系を使用して達成され得る。ＳＵＭＯタグに加えて、Ｕｂ、Ｒｕｂ１、Ｈｕｂ１、ＩＳＧ１５、Ｕｂｉ−Ｌ（ＭＮＳＦ）、ＦＡＴ１０、Ａｐｇ１２、Ａｐｇ８およびＵｒｍ１を含むが、これらに限定されない、他のＵｂｌタンパク質が使用され得ることが企図される（Larsen & Wang (2002) J. Proteome Res. 1(5):411-9）。ＵＳ７，６５５，４１３（参照によりその全体がここに組み込まれる）も参照されたい。例示のＳＵＭＯタグが、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９および配列番号７０に記載されている。

「アルブミン結合ドメイン」または「ＡＢＤ」は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでアルブミンに結合し、治療剤の血清半減期および生体内分布を増強するポリペプチドを指す。アルブミンは、任意の動物種、例えばヒト、サル、または齧歯類の動物に由来し得る。アルブミン結合ドメインは、例えば、ＵＳ６，２６７，９６４、ＷＯ１９９１／１９７４１、ＷＯ２００５／０９７２０２、ＷＯ２００１／４５７４６、ＷＯ２０１３／０４３０７１およびＵＳ２００４／０００１８２７に記載されている。さらに、ＵＳ９，１５６，８８７は、本発明で使用され得る非天然のアルブミン結合ドメインを開示している。いくつかの態様において、アルブミン結合ドメインは、配列番号７１、配列番号７２または配列番号７３に示されたアミノ酸配列を有する。

本明細書に開示の切断されたＧｐＡバリアントの増強された細胞傷害活性は、ＧｐＡをＴＲＡＩＬの３つのタンデム可溶性ドメインにコンジュゲートまたは融合させることによって、またはＧｐＡをＴＲＡＩＬの安定な形態とともに共投与することによって達成され得る。その結果得られる融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬの３つのタンデム可溶性ドメインを欠く切断されたＧｐＡバリアントと比較して、ＩＣ_５０値の少なくとも２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、または４０倍の減少を提供し得る。結果的に、ＴＲＡＩＬの３つのタンデム可溶性ドメインに融合される切断されたＧｐＡバリアントは、がん、特にＬ−アスパラギナーゼに非感受性のがんの処置に特に有用である。

「融合タンパク質」は、非天然の様式で作動可能に結合されたタンパク質またはタンパク質フラグメント（例として、ＧｐＡバリアント）を含有するキメラタンパク質を指す。本発明の融合タンパク質によれば、ＴＲＡＩＬの３つのタンデム可溶性ドメイン（ＴＲＡＩＬ_トリマー）は、切断されたＧｐＡバリアントとインフレームで融合される。理想的には、グリシンまたはセリン残基が、ＴＲＡＩＬトリマーのフォールディングを促進するために各ＴＲＡＩＬリピートの間に挿入される（例として、配列番号８７および配列番号８８を参照されたい）。任意に、ＴＲＡＩＬトリマーおよびアスパラギナーゼ構成要素は、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、または配列番号８４に記載のリンカーによって分離され得る。融合タンパク質は、ＧｐＡ構成要素が、これまでに記載されるバリアントのいずれかであり得る、ＧｐＡのＣ末端（ＧｐＡ−ＴＲＡＩＬ_トリマー；例として、配列番号８９および配列番号９０）またはＮ末端（ＴＲＡＩＬ_トリマー−ＧｐＡ；例として、配列番号９１および配列番号９２）に融合されるＴＲＡＩＬトリマーを含み得る。タグまたは改変と組み合わせてさらに使用されるとき、融合タンパク質は、ＳＵＭＯ−ＴＲＡＩＬ_トリマー−ＧｐＡ−ＡＢＤ、Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ−ＡＢＤ−ＴＲＡＩＬ_トリマー−ＧｐＡ、Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ−ＴＲＡＩＬ_トリマー−ＧｐＡ−ＡＢＤ、Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ−ＧｐＡ−ＴＲＡＩＬ_トリマー、Ｈｉｓ−ＡＢＤ−ＴＲＡＩＬ_トリマー−ＧｐＡ、ＡＢＤ−ＧｐＡ−ＴＲＡＩＬ_トリマー、ＡＢＤ−ＳＵＭＯ−ＴＲＡＩＬ_トリマー−ＧｐＡ等の構造を有し得る。ＮまたはＣ末端にて挿入されることに加えて、ＡＢＤペプチドは、ＧｐＡバリアントの１以上のフレキシブルループ（flexible loops）に付け足され得る。一例において、フレキシブルループは、残基２１５〜２２８に及ぶ。別の例において、フレキシブルループは、ＧｐＡの残基３３７〜３４２に及ぶ。例として、配列番号９４および配列番号９５を参照されたい。ＴＲＡＩＬ、特にＴＲＡＩＬ_トリマーをコードする核酸は、Ｌ−アスパラギナーゼをコードする核酸の５’または３’のいずれかにインフレームで挿入され得、それによって融合タンパク質を作製する。

好ましくは、ＴＲＡＩＬの可溶性ドメインは、哺乳動物、特に、対立遺伝子バリアントおよび／またはその誘導体を含むヒトＴＲＡＩＬに由来する。可溶性ドメインは、膜局在化ドメインなしの受容体結合ドメインを含むＴＲＡＩＬの細胞外部分を含む。ＴＮＦスーパーファミリーの他のタンパク質と同様に、ＴＲＡＩＬは、１５〜３０アミノ酸のＮ末端部分、いわゆるストーク領域を介して膜に固定される。ストーク領域は、トリマー形成に寄与し、細胞膜に対してある距離を提供する。しかしながら、ストーク領域は受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の部分ではない。結果的に、可溶性ＴＲＡＩＬドメインは、ストーク領域由来の任意のアミノ酸を欠くＴＲＡＩＬの受容体結合ドメインを含むことが好ましい（ＵＳ２０１５／０３３７０２７を参照されたい）。

可溶性ＴＲＡＩＬドメインは、ヒトＴＲＡＩＬに由来し得る。好ましくは、可溶性ＴＲＡＩＬドメインは、特にアミノ酸残基１１５〜１２２から出発するヒトＴＲＡＩＬに由来し、ヒトＴＲＡＩＬのアミノ酸残基１１５〜２８１、１２０〜２８１、１２１〜２８１または１２２〜２８１を含む。ある態様において、各々のＴＲＡＩＬの可溶性ドメイン_トリマーは、ヒトＴＲＡＩＬの残基１１５〜２８１から構成される。ヒトＴＲＡＩＬの残基１１５〜２８１は、本明細書において配列番号８０に示されている。正確なフォールディングを促進するために、グリシンまたはセリン残基が、各ＴＲＡＩＬリピートの間に挿入されてもよい。例として、配列番号８７および配列番号８８を参照されたい。

細胞死受容体結合ＴＲＡＩＬドメインの誘導体およびバリアントはすべて企図されており、それらのアミノ酸配列を置換、付加および／または欠失／切断によって変更することによって、または、機能的に同等のポリペプチドをもたらす化学的改変を導入することによって作製され得る。任意のポリペプチドの配列中のあるアミノ酸が、ポリペプチドの活性に悪影響を及ぼすことなく他のアミノ酸に置換され得ることは、当業者に理解されるであろう。

本明細書に開示のＴＲＡＩＬドメインは、開示される配列中の１以上のアミノ酸の置換を含む。当業者は、周知の技術を使用して、本明細書において示されるペプチドの好適な配列バリアントを決定し得るであろう。ある態様において、当業者は、活性にとって重要でないと考えられる領域を標的化することによって、活性を破壊することなく変化し得る分子の好適なエリアを同定し得る。他の態様において、当業者は、同様なポリペプチド間で保存されている分子の残基および部分を同定し得る。さらなる態様において、生物学的活性または構造にとって重要なアミノ酸残基さえも、その生物学的活性を破壊することなく、またはペプチド構造に悪影響を及ぼさずに、保存的アミノ酸置換を受け得る。

３つのＴＲＡＩＬの可溶性ドメインは、好ましくは、１〜８個のアミノ酸残基から構成されるペプチド結合基を介して互いに連結される。同様に、ＴＲＡＩＬ_トリマーは、１〜２０個のアミノ酸残基から構成されるペプチド結合基を介してＬ−アスパラギナーゼに結合されていることが好ましい。用語「ペプチド結合基」または「リンカー」は、２つの異なる分子を一緒に作動可能に結合する分子架橋として作用するペプチド部分を指すことを意味する。望ましくは、本発明のリンカーは、グリシンまたはセリン、またはそれらの組み合わせから構成される。特定の態様において、各々のＴＲＡＩＬの可溶性ドメイン_トリマーは、好ましくは、単一のグリシンまたは単一のセリン残基によって互いに結合される。例示のＴＲＡＩＬ_トリマーは、３つの可溶性ＴＲＡＩＬドメインの間に単一のセリン残基を含む（配列番号８８）。ＴＲＡＩＬ_トリマーとＬ−アスパラギナーゼとの間に位置するペプチド結合基に関して、このリンカーは可動性リンカーであることが望ましい。可動性リンカーは、好ましくは、１〜２０のアミノ酸残基の長さ、特に６、９、１２、１５または１８のアミノ酸残基の長さを有する。可動性リンカーは、好ましくは、グリシン／セリンリンカー、すなわち主にグリシンおよびセリンのアミノ酸から構成されるペプチドリンカーである。特定の態様において、ＴＲＡＩＬ_トリマーとＬ−アスパラギナーゼとの間のリンカーは、（ＧＧＧＳ）_ｎリンカー（配列番号８１）であり、ここで、ｎは１〜４である、または、例としてＧＧＧＳ（ＧＧＧＧＳ）_ｎ（配列番号８２）、本明細書において、ｎは１〜４である、を含むその順列である。ある態様において、ＴＲＡＩＬ_トリマーとＬ−アスパラギナーゼとの間のリンカーは、配列番号８３に示されたアミノ酸配列を有する。他の態様において、ＴＲＡＩＬ_トリマーとＬ−アスパラギナーゼとの間のリンカーは、配列番号８４に記載のアミノ酸配列を有する。ＴＲＡＩＬ_トリマー−ＧｐＡバリアント融合タンパク質の例は、３つの可溶性ＴＲＡＩＬドメインの間に単一のグリシンまたはセリン残基を、ＴＲＡＩＬ_トリマーと切断されたＧｐＡバリアントとの間にグリシン／セリンリンカーを含むＮ末端ＴＲＡＩＬ_トリマーを有する。例として、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１および配列番号９２を参照されたい。

ＴＲＡＩＬの安定な形態は、トリマー形成を促進するＴＲＡＩＬの形態を指すことが意図される。特に、ＴＲＡＩＬのトリマー形成を促進するために、小さなトリマー形成ドメインであるＦＯＬＤＯＮ配列（ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ；配列番号８５）は、ＴＲＡＩＬの安定性および生物学的活性を３７℃で少なくとも４８時間維持することが示されている（Kouno, et al. (2013) J. Invest. Dermatol. 133(9):2212-2220）。結果的に、ＦＯＬＤＯＮペプチドは、Ｈｉｓ−ＳＵＭＯタグとＴＲＡＩＬのＮ末端との間に挿入されてＨｉｓ−ＳＵＭＯ−ＦＯＬＤＯＮ−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質をもたらす。融合タンパク質は発現され、細菌培養において＞１０ｍｇ／Ｌの融合タンパク質の収量が得られた。タンパク質は極めて安定しており、ＦＯＬＤＯＮの包含が、ＴＲＡＩＬの安定な形態をもたらすことを示した。結果的に、ＧｐＡの細胞傷害活性を増強するために、ＴＲＡＩＬの安定な形態は、切断されたＧｐＡバリアントとともに共投与および／または医薬組成物中で組み合わせられ得る。

本明細書に開示の切断されたＧｐＡバリアントおよび融合タンパク質は、従来の組み換えタンパク質技術によって容易に調製され得、ここで、組み換え宿主細胞は、バリアントまたは融合タンパク質をコードする核酸分子を含む発現コンストラクトまたはベクターによって形質転換または形質導入され、組み換え宿主細胞は、好適な条件下で増殖させてバリアントまたは融合タンパク質の発現を提供し、続いてバリアントまたは融合タンパク質は単離され、任意には精製されてもよい。結果的に、本発明は、切断されたＧｐＡバリアントまたはその融合タンパク質、ならびにそれらを含有する発現カセットおよび／または発現ベクターをコードする核酸分子も提供する。理想的には、発現カセットおよび発現ベクターは、目的の宿主細胞における発現を促進するために必要な調節配列（例えば、プロモーター、ターミネーターなど）を含有する。切断されたＧｐＡバリアントまたは融合タンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞もまた、本発明の範囲内に含まれる。宿主細胞は、真核細胞（例として、哺乳動物、真菌または酵母細胞）または原核細胞（例として、大腸菌）を含み得る。

本発明の切断されたＧｐＡバリアントおよび／または融合タンパク質は、一旦生産および単離／精製されると、そのまま使用され得、または薬学的に許容し得る賦形剤を含有する医薬組成物として処方され得る。本明細書において提供される医薬組成物は、固体または液体の形態での静脈内投与用または静脈内注射用に特別に処方され得る。最適な医薬組成物は、例えば、意図される投与経路、送達形態、および所望の投与量に依存して、当業者によって決定され得る。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences（第19版、1995）を参照されたい。

切断されたＧｐＡバリアントおよび／または融合タンパク質は、注射可能な処方などの従来の全身投与形態に組み込まれ得る。投与形態は、必要な生理学的に許容し得る担体材料、賦形剤、潤滑剤、バッファー、界面活性剤、抗菌剤、（マンニトールなどの）増量剤、抗酸化剤（アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム）なども含み得る。

医薬組成物中の主な担体または賦形剤は、性質上水性または非水性のいずれかであり得る。例えば、好適な担体または賦形剤は、注射用水、生理食塩水または人工脳脊髄液であり得、場合によっては、非経口投与のための組成物に一般的な他の材料で補充され得る。中性緩衝生理食塩水または血清アルブミンと混合された生理食塩水は、さらなる例示的なビヒクルである。医薬組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓバッファー、または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸バッファーを含み得、ソルビトールまたはそのための好適な代替物をさらに含み得る。本発明の医薬組成物は、所望の純度を有する選択された組成物を、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態の任意の処方剤と混合することによって、保存用に調製され得る（Remington's Pharmaceutical Sciences, Id.）。さらに、本発明の切断されたＧｐＡバリアントまたは融合タンパク質は、スクロースまたはグリシンなどの適切な賦形剤を使用して凍結乾燥物として処方され得る。

本発明の切断されたＧｐＡバリアント、融合タンパク質、または医薬組成物の投与経路は、静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、または病巣内の経路による注射；徐放性システムまたは移植デバイスによるものを含む。組成物は、ボーラス注射によって投与され得、または、注入または移植デバイスによって連続的に投与され得る。組成物はまた、所望の分子が吸収または封入された膜、スポンジまたは別の適切な材料の移植を介して局所的に投与され得る。移植デバイスが使用される場合、デバイスは、任意の好適な組織または器官に移植され得、所望の分子の送達は、放散、徐放ボーラス、または連続投与を介するものであり得る。

本発明の組成物は、非経口的に送達され得る。非経口投与が企図されるとき、本発明における使用のための治療上の組成物は、薬学的に許容し得るビヒクル中で本発明のスクリーニング方法で同定された所望の化合物を含む発熱物質を含まない非経口的に許容し得る水溶液の形態であり得る。非経口注射のための特に好適なビヒクルは、本発明のスクリーニング方法で同定された化合物が適切に保存された滅菌等張溶液として処方される滅菌蒸留水である。調製には、注射可能なマイクロスフィア、生体分解可能な粒子、ポリマー化合物（ポリ乳酸またはポリグリコール酸など）、ビーズまたはリポソームなどの剤との、所望の分子の処方が関与し得、これは、産物の制御放出または徐放を提供し得、次いでデポー注射を介して送達され得る。ヒアルロン酸による処方は、循環における持続期間を促進する効果を有する。移植可能な薬物送達デバイスを使用して、所望の分子を導入し得る。

組成物はまた、吸入のために処方され得る。これらの態様において、切断されたＧｐＡバリアントまたは融合タンパク質は、吸入のための乾燥粉末として処方されるか、または吸入溶液はまた、噴霧などによるエアロゾル送達のための噴射剤とともに処方され得る。肺投与は、化学的に改変されたタンパク質の肺送達を記載するＷＯ１９９４／０２００６９にさらに記載されている。

本発明の組成物は、経口などの消化管を通じて送達され得る。かかる薬学的に許容し得る組成物の調製は、当業者の知識の範囲内である。この様式で投与される本発明の切断されたＧｐＡバリアントまたは融合タンパク質は、錠剤およびカプセルなどの固体剤形の配合において慣用的に使用される担体を用いて、または用いずに処方され得る。カプセルは、バイオアベイラビリティが最大化され、腸管の（pre-systemic）分解が最小化されるときに、胃腸管中の点で処方の活性部分を放出するように設計され得る。ここで開示される本発明のペプチドの吸収を促進するために、追加の剤が含まれ得る。希釈剤、香味料、低融点ワックス、植物油、滑沢剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤、および結合剤もまた用いられ得る。

これらの組成物はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントを含有し得る。微生物の作用の防止は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの様々な抗菌剤および抗真菌剤の包含によって確実にされ得る。また、糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことは望ましいものであり得る。注射可能な医薬形態の延長された吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅らせる剤の包含によってもたらされ得る。

本発明の切断されたＧｐＡバリアントおよび／または融合タンパク質は、アスパラギンの枯渇によって処置可能な疾患または状態の処置に特に有用である。結果的に、本発明はまた、処置を必要とする対象に切断されたＧｐＡバリアントまたは融合タンパク質の有効量を投与することによって、疾患、特にがんを処置するための方法を提供する。ここで使用される「有効量」は、（ａ）障害の重篤度を低減すること；（ｂ）処置される障害（単数または複数）に特徴的な症状の発症を限定または防止すること；（ｃ）処置される障害（単数または複数）に特徴的な症状の悪化を阻害すること；（ｄ）障害を以前に有していた患者における障害（単数または複数）の再発を限定または防止すること；（ｅ）以前に障害（単数または複数）の徴候があった患者の症状の再発を限定または防止すること；（ｆ）疾患または障害の発生後の死亡率の低減；（ｇ）治癒；および（ｈ）疾患の予防という意図された目的を達成するのに十分な活性成分の量を指す。各々の個々の場合における有効量は、当該技術分野において確立された方法にしたがって当業者によって経験的に決定され得る。本発明の文脈で使用される場合、「投与すること」は、個体へのｉｎ ｖｉｖｏ投与、ならびに細胞または組織へのｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ直接投与を含む。切断されたＧｐＡバリアントまたは融合タンパク質の有効量は、一般に、アポトーシスを誘導し、対象のがん細胞または腫瘍において循環するＬ−アスパラギンを低減させ得るものである。臨床医は、最適な治療上の効果を得るために投与量または投与経路を力価測定し得る。

ある態様において、切断されたＧｐＡバリアントまたは融合タンパク質は、成人および小児の両方における急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）などのがん、ならびにアスパラギン枯渇が有用な効果を有することが期待される他の状態の処置における使用のための医薬品の処置または製造において有用である。かかる状態は、血液悪性腫瘍、非ホジキンリンパ腫、ＮＫリンパ腫、膵臓がん、卵巣がん、ホジキン病、急性骨髄性白血病、急性骨髄単球性白血病、慢性リンパ性白血病、リンパ肉腫、細網肉腫、および黒色肉腫を含むが、これらに限定されない、悪性腫瘍またはがんを含むが、これらに限定されない。アスパラギン枯渇に応答する代表的な非悪性血液疾患は、免疫システムに媒介される血液疾患（例として、ＨＩＶ感染によって引き起こされるもの（すなわち、ＡＩＤＳ）などの感染疾患）を含む。アスパラギン依存症に関連する非血液疾患は、自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、ＳＬＥ、自己免疫、コラーゲン血管疾患、ＡＩＤＳなど）を含む。他の自己免疫疾患は、骨関節炎、アイザックス症候群、乾癬、インスリン依存性真性糖尿病、多発性硬化症、硬化性全脳炎、全身性エリテマトーデス、リウマチ熱、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎およびクローン病）、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、糸球体腎炎、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、およびグレーブス病を含む。特定の態様において、切断されたＧｐＡバリアントまたは融合タンパク質は、非ホジキンリンパ腫、白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、およびヘアリー細胞白血病の処置において使用される。

疾患を引き起こすことが疑われる細胞は、任意の好適なｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏアッセイ（例として、増殖培地がアスパラギンを欠いているｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ）においてアスパラギン依存性について試験され得る。よって、一側面において、本発明は、本発明の切断されたＧｐＡバリアントまたは融合タンパク質の有効量を患者に投与することを含む、患者において処置可能な疾患を処置する方法に関する。特定の態様において、疾患はＡＬＬである。特定の態様において、アスパラギン枯渇により処置可能な疾患の処置において使用される切断されたＧｐＡバリアントまたは融合タンパク質は、モルモット由来の切断されたＧｐＡバリアントを含む。

切断されたＧｐＡバリアントまたは融合タンパク質は、１週間に約３回から１ヶ月に約一度までの範囲に及ぶスケジュール、典型的には、１週間に一度または隔週に一度、単一剤（例として、単剤治療）として、または、グルココルチコイド、コルチコステロイド、抗がん化合物、または他の剤（メトトレキサート、デキサメタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、ビンクリスチン、シクロホスファミド、およびアントラサイクリンを含むが、これらに限定されない）を含むがこれらに限定されない化学治療薬の組み合わせの部分として、投与され得る。一例として、ＡＬＬを有する患者は、誘導、強化または増強、および維持を含む３つの化学治療の段階の間に、多剤化学治療の構成要素として、本発明の切断されたＧｐＡバリアントまたは融合タンパク質を投与されるであろう。特定の例において、切断されたＧｐＡバリアントまたは融合タンパク質は、アスパラギン合成酵素阻害剤と共に投与されない（例として、ＷＯ ２００７／１０３２９０を参照されたい）。別の特定の例において、切断されたＧｐＡバリアントまたは融合タンパク質は、アスパラギン合成酵素阻害剤と共に投与されないが、他の化学治療薬と共に投与される。切断されたＧｐＡバリアントまたは融合タンパク質は、多剤化学治療レジメンの部分として、他の化合物の前、後、または同時に投与され得る。

特定の態様において、方法には、約１Ｕ／ｋｇ〜約１０００Ｕ／ｋｇの量で本発明の切断されたＧｐＡバリアントまたは融合タンパク質を投与することが関与する。より特定の態様において、切断されたＧｐＡバリアントまたは融合タンパク質は、約２０、５０、６０、７０、１００、２００、３００、４００、５００および６００Ｕ／ｋｇからなる群から選択される量で投与される。別の特定の態様において、切断されたＧｐＡバリアントまたは融合タンパク質は、約１０００ＩＵ／ｍ^２〜約２００００ＩＵ／ｍ^２の範囲に及ぶ用量（例として、１０００ＩＵ／ｍ^２、２０００ＩＵ／ｍ^２、３０００ＩＵ／ｍ^２、４０００ＩＵ／ｍ^２、５０００ＩＵ／ｍ^２、６０００ＩＵ／ｍ^２、７０００ＩＵ／ｍ^２、８０００ＩＵ／ｍ^２、９０００ＩＵ／ｍ^２、１００００ＩＵ／ｍ^２、１１０００ＩＵ／ｍ^２、１２０００ＩＵ／ｍ^２、１３０００ＩＵ／ｍ^２、１４０００ＩＵ／ｍ^２、１５０００ＩＵ／ｍ^２、１６０００ＩＵ／ｍ^２、１７０００ＩＵ／ｍ^２、１８０００ＩＵ／ｍ^２、１９０００ＩＵ／ｍ^２、または２００００ＩＵ／ｍ^２）で投与される。別の特定の態様において、切断されたＧｐＡバリアントまたは融合タンパク質は、約３日〜約１０日（例えば、３、４、５、６、７、８、９、または１０日）の期間、単回用量で、検出不能なレベルまでＡｓｎを枯渇させる用量で投与される。別の態様において、方法には、野生型Ｌ−アスパラギナーゼと比較して単回用量の後により長いｉｎ ｖｉｖｏ循環半減期を有する本発明の切断されたＧｐＡバリアントまたは融合タンパク質を投与することが関与する。

以下の非限定的な例は、本発明をさらに説明するために提供される。

例１：活性である、Ｃ末端で切断されたＧｐＡの生成
ヒトＬ−アスパラギナーゼ（ｈＡＳＮａｓｅ１；UNIPROTエントリーQ86U10；配列番号２）およびモルモットＬ−アスパラギナーゼ（ｇｐＡＳＮａｓｅ１またはＧｐＡ；UNIPROTエントリーH0W0T5；配列番号１）などの哺乳動物のＬ−アスパラギナーゼは、Ｌ−アスパラギナーゼ活性が存在する約３６０残基のＮ末端ドメイン、および未知の機能の約２００残基のＣ末端ドメインの２つのドメインを含有する。比較すると、臨床的に関係のある細菌である大腸菌およびErwinia chrysanthemi由来のＬ−アスパラギナーゼは、約３５０アミノ酸残基の長さがあり、そのようなＣ末端ドメインを含有しない。

注射可能な生物製剤の治療の課題の１つは、不十分なバイオアベイラビリティをもたらす短い半減期からのものである。除去は、大部分はタンパク質分解、腎臓の濾過から、または免疫系による中和から生じる。外来配列のより大きな分子が、免疫系によって検出されるより多くの機会を有し、および系から迅速に取り除かれる。ＧｐＡのより短いが安定であるバージョンを同定することは、とくに完全長タンパク質のＣ末端ドメインが未知の機能である文脈において、よりよい治療を提供することを期待された。

ＧｐＡのＣ末端残基の機能を査定するために、Ｃ末端で切断されたＧｐＡバリアントを、構築し、安定性および全体のＬ−アスパラギナーゼ活性について分析した。ｈＡＳＮａｓｅ１、ＧｐＡ、大腸菌のＬ−アスパラギナーゼ、およびErwiniaのＬ−アスパラギナーゼ酵素の配列アラインメントおよび結晶構造解析は、残基３５９での触媒ドメイン末端を指し示した。ＧｐＡの残基１〜３５９から構成されるコンストラクト（配列番号３）を、組換えで発現したが、精製されたＣ末端の切断された酵素は、不安定であった。したがって、追加でＣ末端が切断されたＧｐＡコンストラクトを、ＳＵＭＯタグに融合して、調製した（表１）。

これらのＣ末端で切断されたＧｐＡコンストラクトの組換え過剰発現は、全てのタンパク質が十分に過剰発現し、＞９５％の純度に精製されることを指し示した（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定された）。安定性ＳＵＭＯタグを切り落とした後に、ＧｐＡ３６７がわずか数分の内に素早く沈殿した一方で、より長いバリアントは、優れた安定性および活性を示しており、それは完全長タンパク質に匹敵した。とりわけ、余分なＣｙｓ３８８を保有するより長いコンストラクトは、不特定のジスルフィド結合を形成する傾向があり、Ｌ−アスパラギナーゼ活性のために必要なテトラマー形態を変更した。少なくとも残基１〜３６９から構成されるＣ末端で切断されたＧｐＡが、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有する安定したＧｐＡ酵素をもたらす一方で、本明細書において示されているように、残基１〜３５９または１〜３６７から構成されるＣ末端で切断されたＧｐＡの安定性は、異種ペプチド／タンパク質（例として、ＳＵＭＯタグまたはアルブミン）との融合または化学修飾（例として、ペグ化）によって安定化し得る。

例２：指向性進化法によって産生されたヒト化ＧｐＡバリアント
概要。指向性進化法、または実験室内で自然の進化プロセスを模倣するプロセスは、酵素の特性を改善するための広く使用される。例として、Dalby (2011) Curr. Opin. Struct. Biol. 21:473-480；Goldsmith & Tawfik (2012) Curr. Opin. Struct. Biol. 22:406-412；Labrou (2010) Curr. Protein Pept. Sci. 11:91-100；Wang & Zhao (2012) Bioresour. Technol. 115:117-125を参照されたい。ライブラリー生成、スクリーニング技法、そして第一に自然のタンパク質の進化のメカニズムのよりよい理解における進歩を前提として、進化した触媒活性における大きな改善（開始点と比べて、および絶対ｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ値において）が得られた（Fasan、et al. (2008) J. Mol. Biol. 383:1069-80；Bar-Even, et al. (2011) Biochemistry (Mosc.) 50:4402-10）。

免疫原性を克服するために、ＩＩ型大腸菌Ｌ−アスパラギナーゼと同様の動力学的特性を有するヒト様Ｌ−アスパラギナーゼが、指向性進化法アプローチを介して生成された。ＤＮＡファミリーシャッフリングを使用して、ｈＡＳＮａｓｅ１と高い配列同一性を有するが、ｇｐＡＳＮａｓｅ１の低いＫ_ｍ特性を有する、いくつかのクローンが同定された。

株。染色体遺伝子の欠失は、λ−ｒｅｄリコンビナーゼシステムを使用して実施された（Datsenko & Wanner (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97:6640-6645）。チロシンアミノトランスフェラーゼ遺伝子ｔｙｒＢ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子ａｓｐＣおよびＬ−アスパラギナーゼ遺伝子ａｎｓＡ、ａｎｓＢ、ｉａａＡを、大腸菌ＢＷ２５１１３Ｆ⁻、ＤＥ（ａｒａＤ−ａｒａＢ）５６７、ｌａｃＺ４７８７（ｄｅｌ）：：ｒｒｎＢ−３、ＬＡＭ−、ｒｐｈ−１、ＤＥ（ｒｈａＤ−ｒｈａＢ）５６８、ｈｓｄＲ５１４の染色体から欠失させて、大腸菌ＢＷ５Δをもたらした。簡潔に言うと、プライマー対を使用して、適切なｋｅｉｏ株由来のカナマイシン耐性カセットにより交換された遺伝子を既知の方法に従って増幅した（Datsenko & Wanner (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97:6640-6645）。続いて、直線状のＰＣＲ産物を使用して、ＢＷ２５１１３の染色体上の標的遺伝子の全体のオープンリーディングフレームを交換した。正確な遺伝子欠失を含有するコロニーは、ＦＬＰリコンビナーゼプラスミドｐＣＰ２０を用いて形質転換し、カナマイシン耐性マーカーを取り除いて、およびｐＣＰ２０を次いで、その結果得られる株から取り除いた。大腸菌ＢＷ２Δ株は、同じプロセスに続いて、およびａｎｓＡおよびａｎｓＢの遺伝子の欠失の後に、得られた。

ＢＷ２ΔおよびＢＷ５Δ内のｈＡＳＮａｓｅ１およびｇｐＡＳＮａｓｅ１のクローニング。ｈＡＳＮａｓｅ１のコドン−最適化された配列をコードする遺伝子を、プライマーＮｄｅＩ−ｈＡ＿Ｆ１およびｈＡ−ＢａｍＨＩ＿Ｒ５７３を使用して増幅し、プライマーＮｄｅＩ−ｇｐＡ＿Ｆ１およびｇｐＡ−ＢａｍＨＩ＿Ｒ５６５を用いてｇｐＡＳＮａｓｅ１のコドン−最適化された配列をコードする遺伝子を増幅した（表２）。ＢａｍＨＩ／ＮｄｅＩの消化の後に、ＰＣＲ産物をｐＢＡＤベクター内に挿入した。その結果得られるベクターを続いて使用してＢＷ５Δ株およびＢＷ２Δ株を形質転換し、ＢＷ５Δ ｐＢＡＤ＿ｈＡＳＮａｓｅ１株、ＢＷ５Δ ｐＢＡＤ＿ｇｐＡＳＮａｓｅ１株、ＢＷ２Δ ｐＢＡＤ＿ｈＡＳＮａｓｅ１株およびＢＷ２Δ ｐＢＡＤ＿ｇｐＡＳＮａｓｅ１株をもたらした。ＢＷ５ΔおよびＢＷ２Δをまた、空のｐＢＡＤベクターを用いて形質転換し、対照として役立たせた。

培地および増殖実験。Ｍ９完全培地を、０．４％グリセロール、２μＭのチアミン、１ｍＭのＭｇＳＯ_４、０．１ｍＭのＣａＣｌ_２および１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを補充したＭ９最小塩（Ｓｉｇｍａ）から作製した。完全なＭ９プレートのために、１５ｇ／Ｌの寒天を添加した。ＢＷ２Δ株を用いた実験のために、Ｍ９培地を、ＮＨ_４Ｃｌを含まずに作製した。必要な場合に、Ｌ−アスパラギナーゼを種々の濃度でＭ９培地に添加した。ｐＢＡＤベクター内にクローニングされたｈＡＳＮａｓｅ１およびｇｐＡＳＮａｓｅ１の発現を誘導するために、０．０２％アラビノーズをＭ９培地に添加した。完全Ｍ９の寒天プレート上の増殖実験のために、最初に株を３７℃で一晩中ＬＢ中で増殖して、遠心沈殿し、Ｍ９培地中で洗浄した。適切な希釈のこの懸濁液を、次いで各株について同じ数のコロニーとなるように、Ｍ９プレート上に広げた。プレートを、３７℃で４８〜９６時間インキュベートした。

ＤＮＡシャッフリング。ＤＮＡシャッフリングを、記載されるもの（Meyer、et al. (2014) Curr. Protoc. Mol. Biol.、Ausubel (ed) 105:Unit-15.12）から僅かな調整を伴って実施した。簡潔に言うと、ｈＡＳＮａｓｅ１およびＧｐＡ遺伝子の等モルの混合物を、０．５ＵのＤＮａｓｅ（ＮＥＢ）で２分３０秒間消化した。１００ｂｐと２００ｂｐとの間のフラグメントを、QIAQUICK gel extract kit（Qiagen）を使用して抽出し、ＰＣＲによって再会合し、次いでＧｐＡ遺伝子に特異的なプライマーかまたはｈＡＳＮａｓｅ１遺伝子に特異的なものかのいずれかを使用して増幅した。得られるシャッフルされたフラグメントを、Ｍｅｇａｗｈｏｐ法を使用してｐＢＡＤベクター内にクローニングした（Miyazaki (2003) Methods Mol. Biol. 231:23-28）。簡潔に言うと、１００〜３００ｎｇのシャッフルされたフラグメントを、メガプライマーとして使用してｐＢＡＤ＿ｈＡＳＮａｓｅ１またはｐＢＡＤ＿ｇｐＡＳＮａｓｅ１のいずれかを鋳型として使用して全プラスミドのＰＣＲを実行した。ＤｐｎＩを用いた鋳型の消化の後に、シャッフルされた配列を含有する２０〜４０ｎｇの新たな合成プラスミドを使用して、エレクトロコンピテントＢＷ５Δ細胞を形質転換した。パルスの後に、細胞を１ｍｌのＳＯＣ培地中で再懸濁し、３７℃で１時間振盪しながらインキュベートした。細胞を、次いで４０００ｘｇで４分間遠心沈殿し、２００μＬのＭ９培地中で穏やかに再懸濁した。０．２ｍＭのＡｓｎまたは２ｍＭのＡｓｎを補充したＭ９プレート上に１００μＬプレーティングした。プレートの３７℃での４日のインキュベーション後に、２ｍＭのＡｓｎプレート由来のコロニーを単離し、２００μＬの新鮮なＭ９培地中にプールした。２つの希釈を連続して実行し、新鮮な０．２ｍＭのＡｓｎＭ９プレートにプレーティングするために使用した。３７℃での４日および室温での追加の３日のインキュベーションの後に、０．２ｍＭのＡｓｎプレート上で増殖することのできるクローンを単離し、ＬＢプレート上に画線した。

Ｃ末端ドメインスワッピング。ｈ_Ｎ−ｇ_Ｃのクローンを組み立てるために、ｈＡＳＮａｓｅ１のＮ末端ドメイン（ｈ_Ｎ、残基１〜３６１）に対応する配列を、ＮｄｅＩ−ｈＡ＿Ｆ１およびｇｐＡ３６０−３６７＿Ｒのプライマーを使用して増幅し、およびｇｐＡＳＮａｓｅ１のＣ末端ドメイン（ｇＣ、残基３６０〜５６５）に対応する配列を、ｈＡ３５４−３６１＿ＦおよびｇｐＡ−ＢａｍＨＩ＿Ｒ５６５のプライマーを使用して増幅した。ｇ_Ｎ−ｈ_Ｃのクローンを組み立てるために、ｇｐＡＳＮａｓｅ１のＮ末端ドメイン（ｇ_Ｎ、残基１〜３５９）に対応する配列を、ＮｄｅＩ−ｇｐＡ＿Ｆ１およびｈＡ３６２−３６９＿Ｒのプライマーを使用して増幅し、およびｈＡＳＮａｓｅ１のＣ末端ドメイン（ｈ_Ｃ、残基３６２〜５７３）に対応する配列を、ｇｐＡ３５２−３５９＿ＦおよびｈＡ＿ＢａｍＨＩ＿Ｒ５７３のプライマーを使用して増幅した。プライマーを、表２中に列挙する。キメラを次いで適切なプライマーを使用して、フラグメントｈ_Ｎおよびｇ_Ｃまたはｇ_Ｎおよびｈ_ＣのＰＣＲ融合によって構築して、および次いでこれに続いてｐＢＡＤおよびｐＥＴベクター内にクローニングした。

クローニングおよび選択的クローンの発現。単離されたクローンを培養した；プラスミドを抽出し、配列決定した。対応する遺伝子を、ｐＥＴベクター（ｐＢＡＤベクター内にクローニングするために使用されるものと同じプライマーを使用した、Ｈｉｓ−ＳＵＭＯタグを含む改変ｐＥＴ１４ｂ）に導入し、Ｃ４１（ＤＥ３）細胞においてＨｉｓ−タグタンパク質の発現を可能とした。培養を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを補充した１Ｌの２ＹＴ培地において実行した。発現を、０．１ｍＭのＩＰＴＧを用いて誘導し、および細胞を、１８℃で一晩中増殖させた。野生型ｇｐＡＳＮａｓｅ１についてこれまでに記載したように（Schalk、et al. (2014) J. Biol. Chem. 289:33175-86）、細胞を回収し、溶解し、および精製した。タンパク質を、ｐＨ７．５の２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２００ｍＭのＫＣｌ、５００ｍＭのイミダゾールのバッファー中に溶出し、およびイミダゾール不含であるが１ｍＭのＤＴＴを含有する同じバッファーに対して透析した。大腸菌ａｎｓＢ酵素の発現および精製を、これまでに記載した（Schalk、et al。(2014) J. Biol. Chem. 289:33175-86）。

動力学的アッセイ。クローンの触媒活性を、還元型ＮＡＤＨの１：１の酸化を通じてＬ−アスパラギン酸（Ａｓｐ）の生産を測定する、分光ＮＡＤＨ依存性酵素共役アッセイ（spectroscopic NADH-dependent enzyme-coupled assay）（Fernandez、et al. (2013) Int. J. Clin. Exp. Med. 6:478-487；Hejazi、et al. (2002) Biochem. J. 364:129-136）を使用して決定した。ＮＡＤＨのＮＡＤへの変換を、３７℃における３４０ｎｍの吸光度の減少として分光光度的に測定した。全ての測定は、ｐＨ７．５の１００ｍＭのＴｒｉｓ、０．４ｍＭのα−ケトグルタル酸および５０ｎＭの（ｈＡＳＮａｓｅ１、ｈＮ−ｇＣ）；１０ｎＭの（ｇｐＡＳＮａｓｅ１、ｇＮ−ｈＣ、６３−ｈＣ、６４−ｈＣ、６５−ｈＣ、ＳＡ−ｈＣ）または３ｎＭの（ａｎｓＢ）酵素を含む０．４ｍＭのＮＡＤＨを含有するバッファーにおいて３回行われた。グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（Sigma）およびリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Sigma）は、共役酵素反応のためのヘルパー酵素であった；５および１単位を、夫々使用した。SigmaPlot（Systat Software Inc）を使用して、データをミカエリス−メンテン式に当てはめた。ｈＡＳＮａｓｅ１の協調的な性質に起因して、この酵素は、ヒルの式を使用して分析された。

細胞の培養。ＬＯＵＣＹ（Ben-Bassat、et al。(1990) Cancer Genet. Cytogenet. 49(2):241-8）およびＳＵＰ−Ｂ１５（ATCC CRL-1929）細胞株は、当該技術分野において記載されている。全ての細胞株は、ＳＴＲ（Short Tandem Repeat）によって分析され、Global Bioresource Center ATCCからの対応するＳＴＲプロファイルデータと１００％一致することを確認した。全ての細胞株は、マイコプラズマフリーであることが確認された。ＬＯＵＣＹおよびＳＵＰ−Ｂ１５株を、１０％のＦＢＳ（Hyclone）および１ｘペニシリン−ストレプトマイシン溶液（Invitrogen）で補充したＲＰＭＩ １６４０培地を使用して、湿潤雰囲気（５％ＣＯ_２、３７℃）で培養した。Ｌ−グルタミンを細胞培養物に直接２ｍＭの最終濃度まで添加した。ＤＰＢＳ（ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、Mediatech）または種々のＬ−アスパラギナーゼのいずれかの１０μＬの存在下で、細胞懸濁液の９０μＬのアリコート（１ｍＬ当たり５×１０^５個の細胞）を、丸底９６ウェルマイクロタイタープレート中で、０．００００１〜０．１ＩＵ／ｍＬの範囲に及ぶ最終濃度まで、三重で培養した。５％のＣＯ_２を含有する加湿空気中でプレートを３７℃で４日間インキュベートした後、Alamar Blue（Invitrogen）を１０％（ｖ／ｖ）の最終濃度まで加え、プレートを追加で２時間インキュベートし、続いて、蛍光シグナルを読んだ。白血病細胞の生存率は、Ｌ−アスパラギナーゼの存在下での蛍光カウントの、ＤＰＢＳ対照における蛍光カウントに対するパーセンテージとして計算した。

選択システムの開発。Ｌ−アスパラギナーゼ活性についての選択システムを作り出すために、その増殖が、酵素反応のいずれかの産物に依存する細菌株を必要とした。Ｌ−アスパラギナーゼが、AsnのAspおよびアンモニアへの加水分解の触媒作用を及ぼすために、２つの選択システムが開発され、および試験された:一方は、単一窒素源として反応産物のアンモニアに依存する細菌株を用い、および他方は、Aspについて栄養素要求性の株を使用する。

ＢＷ２Δ株：窒素源についてＬ−アスパラギナーゼ反応への依存。全ての生物は、窒素源を必要とする。Ｍ９などの最少培地における大腸菌の増殖のために、窒素源は、大抵はＮＨ_４Ｃｌ塩の形態で得られる。しかしながら、ＮＨ_４Ｃｌの不在下において、この研究で使用される大腸菌ＢＷ株が、培地中の２ｍＭのＡｓｎを使用して増殖し得ることが実証された。このことは、大腸菌が、その内在性のＬ−アスパラギナーゼの活性を通じてＡｓｎを窒素源として使用し得ることを示している。外来性のＬ−アスパラギナーゼ活性によって産生されるＮＨ_４Ｃｌ依存のＢＷ大腸菌株を作り出すために、２つの内在性のＬ−アスパラギナーゼ遺伝子（ａｎｓＡおよびａｎｓＢ）を、大腸菌ＢＷ親株から除去し、それを次いでＢＷ２Δと称する。Ａｓｎについて極めて高いＫ_ｍ値を有するために、とりわけ、第３の内在性のＬ−アスパラギナーゼ（ｉｉｉＡ）は除去されなかった。実際に、実験条件下において、培地中に２ｍＭのＡｓｎを含んでいてさえ、ＢＷ２Δ株の増殖は、大いに減じた。

ＢＷ５Δ株：アスパラギン酸についてのＬ−アスパラギナーゼ反応への依存。大腸菌は、Ａｓｎを加水分解すること（Ｌ−アスパラギナーゼ反応）によってかまたはアミノトランスフェラーゼ反応によって、Ａｓｐを生成し得る。実際に、親ＢＷ株は、Ｍ９培地単独において十分に増殖し、Ａｓｐの補充の影響はない。Ａｓｐについて栄養素要求性の大腸菌株を作製するために、２つの関係のあるアミノトランスフェラーゼ遺伝子（ａｓｐＣおよびｔｙｒＢ）と同様に、３つ全ての内在性のＬ−アスパラギナーゼ遺伝子（ａｎｓＡ、ａｎｓＢ、およびｉｉｉＡ）を除去した。これら５つの遺伝子が除去された株を、ＢＷ５Δ株と称する。ＢＷ５Δ株が、Ａｓｐ栄養素要求性を獲得することを確かにするために、増殖についてＡｓｐの補充を行った、および行わなかったＭ９最少培地中で試験した。Ａｓｐを補充しなかった培地にて、ＢＷ５Δが増殖し得なかったことを観察した。しかしながら、Ａｓｐの補充された条件下においては、増殖を観察した。

Ｌ−アスパラギナーゼを発現するクローンの選択のための、ＢＷ２Δ株およびＢＷ５Δ株の使用。これらの細菌株が、Ｌ−アスパラギナーゼ活性のための選択システムとして使用され得るか否か、そして第一にそれらのＫ_ｍ特性に基づいてＬ−アスパラギナーゼ間の識別を可能にするであろうか否かを調査するために、低いＫ_ｍを有するＬ−アスパラギナーゼまたは高いＫ_ｍを有するＬ−アスパラギナーゼのいずれかを発現するＢＷ２Δ株およびＢＷ５Δ株の増殖について分析した。進化させるべきであるタンパク質標的である、ヒトＬ−アスパラギナーゼＩ型（ｈＡＳＮａｓｅ１）は、ミリモルの範囲においてＡｓｎについてのＫ_ｍによって特徴づけられ（Karamitros & Konrad (2014) J. Biol. Chem. 289:12962-75；Schalk、et al. (2014) J. Biol. Chem. 289:33175-86）、よって高いＫ_ｍのＬ−アスパラギナーゼとして使用された。モルモットＬ−アスパラギナーゼＩ（ｇｐＡＳＮａｓｅ１）は、マイクロモルの範囲においてＡｓｎについてのＫ_ｍを有すると特徴づけられ（Schalk、et al. (2014) J. Biol. Chem. 289:33175-86）、よって低いＫ_ｍのＬ−アスパラギナーゼとして使用された。十分に制御されたタンパク質発現を有するために、夫々のＬ−アスパラギナーゼをコードする遺伝子の両方を、ｐＢＡＤベクター中でクローニングした。

窒素の単一源を供給するＬ−アスパラギナーゼ反応に基づく、第１のスクリーニングシステムにおいて、ＢＷ２Δを、ｐＢＡＤ（対照ベクター）、ｐＢＡＤ＿ｈＡＳＮａｓｅ１（高Ｋ_ｍ酵素）またはｐＢＡＤ＿ｇｐＡＳＮａｓｅ１（低Ｋ_ｍ酵素）を用いて形質転換した。形質転換された細胞を、ＮＨ_４Ｃｌを欠くが、増加する濃度のＡｓｎが補充されたＭ９培地中で増殖させた。低いＡｓｎの濃度は、低Ｋ_Ｍ酵素をコードする、ｐＢＡＤ＿ｇｐＡＳＮａｓｅ１プラスミドを保有する細菌の増殖を優先的に促進するであろうことが予期された。結果は、ｐＢＡＤ＿ｈＡＳＮａｓｅ１およびｐＢＡＤ＿ｇｐＡＳＮａｓｅ１の両方のＢＷ２Δの増殖が、実際にはＡｓｎの濃度（すなわち、よりよい増殖をもたらす増強されたＡｓｎの濃度）に依存したことを示す。しかしながら、Ａｓｎの濃度毎に、ｐＢＡＤ＿ｈＡＳＮａｓｅ１とｐＢＡＤ＿ｇｐＡＳＮａｓｅ１のＢＷ２Δの間に有意な増殖の差はなく、例として、０．２ｍＭのＡｓｎにおいて、低いＫ_ｍのｇｐＡＳＮａｓｅ１酵素を発現するＢＷ２Δ細菌は、高いＫ_ｍのｈＡＳＮａｓｅ１酵素を発現する細菌よりも有意に多いかまたは大きなコロニーを形成しなかった。要するに、このスクリーニングシステムは、それらのＡｓｎのＫ_ｍ値において異なるＬ−アスパラギナーゼ間を区別することについては好適ではないことが見出された。

Ａｓｐの栄養素要求性に基づく、第２のスクリーニングシステムにおいて、ＢＷ５Δを同様に、ｐＢＡＤ、ｐＢＡＤ＿ｈＡＳＮａｓｅ１またはｐＢＡＤ＿ｇｐＡＳＮａｓｅ１を用いて形質転換した。形質転換された細胞を、増加する濃度のＡｓｎを補充した完全Ｍ９培地中で増殖させた。ｐＢＡＤ＿ｈＡＳＮａｓｅ１およびｐＢＡＤ＿ｇｐＡＳＮａｓｅ１のＢＷ５Δの増殖が、Ａｓｎの濃度に依存していることが見出された。興味深いことに、モルモット酵素が、基質（Ｋ_ｍ＝５０μＭ）で飽和し、およびヒト酵素が、部分的にのみ飽和する（Ｋ_ｍ＝３，５００μＭ）濃度を表す、２ｍＭのＡｓｎにおいて、ｈＡＳＮａｓｅ１およびｇｐＡＳＮａｓｅ１を形質転換されたＢＷ５Δ株は、同様の増殖を示す。言い換えれば、この相対的に高いＡｓｎ濃度において、ＢＷ５Δ株を、低いＫ_ｍのＬ−アスパラギナーゼを発現するそれらの細菌と高いＫ_ｍの酵素を発現するそれらとの間を見分けるために使用することができない。対照的に、基質Ａｓｎのより低い濃度において、ｐＢＡＤ＿ｇｐＡＳＮａｓｅ１のＢＷ５Δのみが、増殖することが可能である。実際に、ｈＡＳＮａｓｅ１のＫ_ｍよりも十分低いがｇｐＡＳＮａｓｅ１のＫ_ｍより高いＡｓｎの濃度である、０．２ｍＭのＡｓｎにおいて、ｐＢＡＤ＿ｇｐＡＳＮａｓｅ１のＢＷ５Δのコロニーが、発育した一方でｐＢＡＤ＿ｈＡＳＮａｓｅ１のＢＷ５Δは、増殖することができなかった。注目すべきことに、アラビノース（タンパク質発現のための誘導物質）が、０．０００２％〜０．２％の範囲で使用されたときに、増殖における変化が認められなかったために、この増殖の差は、酵素の発現レベルとは無関係であることが見出された。まとめると、結果は、最少培地プレート上でｈＡＳＮａｓｅ１を発現するＢＷ５ΔとｇｐＡＳＮａｓｅ１を発現するＢＷ５Δとの間で見られる増殖における差は、夫々の発現されたＬ−アスパラギナーゼのＫ_ｍを直接的に反映していることを示唆する。

実験のこの最初のセットからの結論は、窒素を供給するＬ−アスパラギナーゼ反応に基づく（ＢＷ２Δ株を使用する）スクリーニングが、高Ｋ_ｍ酵素と低Ｋ_ｍ酵素との間を十分に識別はしない一方で、アミノ酸Ａｓｐを供給するＬ−アスパラギナーゼ反応に基づく（ＢＷ５Δ株を使用する）スクリーニングは、Ａｓｎへの異なる親和性を有する酵素間を実際に区別する−低いＡｓｎの濃度において、低いＫ_ｍのＬ−アスパラギナーゼを発現する細菌のみがコロニーを形成するということである。ゆえに、低いＫ_ｍを獲得しているヒトＬ−アスパラギナーゼバリアントを発見することを目的とした全てのさらなる選択作業を、ＢＷ５Δ大腸菌株を用いて実施した。

ＤＮＡファミリーシャッフリング。ＤＮＡファミリーシャッフリングは、遺伝的多様性を生成するための代替の方法である。ｈＡＳＮａｓｅ１およびｇｐＡＳＮａｓｅ１のタンパク質配列は、夫々５７３および５６５アミノ酸を含有しており、アミノ酸レベルにおいて６９．８％同一である（１７０アミノ酸異なっている）。ｈＡＳＮａｓｅ１（配列番号３５）およびｇｐＡＳＮａｓｅ１（配列番号３６）両方の合成コドン−最適化されたバージョンを取り扱うと、ｈＡＳＮａｓｅ１およびｇｐＡＳＮａｓｅ１をコードする遺伝子は、ＤＮＡレベルにおいて７５％の同一性を示す。本明細書において言及されるように、ｈＡＳＮａｓｅ１はＡｓｎについて３．５ｍＭのＫ_ｍを有し、一方でモルモット酵素のＫ_ｍは、５０μＭであると決定された（表３）。ＤＮＡシャッフリング方法を、モルモットの低いＫ_ｍを示すが、ヒト酵素と可能な限り同等の高さのアミノ酸相同性を有するキメラを得るために、２つのＬ―アスパラギナーゼを組み替えるために使用した。シャッフルされたフラグメントを、次いでｐＢＡＤベクター内でクローニングした。その結果得られるキメラのライブラリーを、ＢＷ５Δ株を形質転換するために使用した。低いＫ_ｍを所有する突然変異体の存在を、上に記載の通りの選択プロトコルを使用して発見した。４つのクローン（＃６３、＃６４、＃６５および＃ＳＡ）を、０．２ｍＭのＡｓｎ濃度においてＭ９プレートから単離した。これらのクローンの配列分析は、主にＮ末端（すなわち、触媒）ドメインにおいて発生する組換え事象を伴うシャッフリングパターンを明らかにした；選択されたクローンのうちの１つ（＃ＳＡ）は、触媒ドメインを超える未成熟な終止コドン（ＳＴＯＰ）を導入する突然変異を保有した（図１）。

Ｃ末端ドメインのスワッピング。ＧｐＡに対する免疫原性を最小化するために、ヒトＬ−アスパラギナーゼと可能な限り同一であるが、モルモット／大腸菌ＩＩ型酵素の低いＫ_ｍ特性を有する酵素を探し求めた。シャッフリング実験は、モルモットＬ−アスパラギナーゼドメインとこれに続くヒトＣ末端ドメインを有するキメラが、ｇｐＡＳＮａｓｅ１の好ましい動力学的特性をいまだに残存しているが、増加されたヒト酵素との配列同一性を有していることを示唆した。

結果的に、２つのキメラを生成した；ｈ_Ｎ−ｇ_Ｃと称されており、モルモットＣ末端ドメインに融合したヒトＮ末端ドメインを含むものが一つ、および、ｇ_Ｎ−ｈ_Ｃと称されており、ヒトＣ末端ドメインに融合したモルモットＮ末端ドメインを含むものが第二である（図１、表３）。これらのキメラのｉｎ ｖｉｔｒｏの動力学的特徴付けは、ｈ_Ｎ−ｇ_ＣがｈＡＳＮａｓｅ１と同様の動力学的特性を示し、ｇ_Ｎ−ｈ_ＣがｇｐＡＳＮａｓｅ１と同様の動力学的特性を示すという予測を検証した（表４）。

この結果は、ＧｐＡのＣ末端ドメインが、Ｌ−アスパラギナーゼの触媒活性に影響を与えず、および最も重要なことにＫ_ｍに悪影響を及ばさないことを示す。ｇｐＡＳＮａｓｅ１の動力学的特性を有するが、ｈＡＳＮａｓｅ１と最も高い配列相同性を有するクローンを同定することが目標であるために、＃６３、＃６４、＃６５および＃ＳＡの４つのクローンを、それらのシャッフルされたＣ末端ドメインとヒトＣ末端ドメインの正確な配列を置き換えることによって遺伝子操作した（図１）。遺伝子操作されたクローン、すなわち６３_Ｎ−ｈ_Ｃ、６４_Ｎ−ｈ_Ｃ、６５_Ｎ−ｈ_ＣおよびＳＡ_Ｎ−ｈ_Ｃは、野生型ｈＡＳＮａｓｅ１配列と夫々８５．７％、９１．１％、８７．１％および９１．６％の同一性を示した（表３および図２Ａ-２Ｂ）。

バリアントの触媒特性。６３_Ｎ−ｈ_Ｃ、６４_Ｎ−ｈ_Ｃ、６５_Ｎ−ｈ_ＣおよびＳＡ_Ｎ−ｈ_Ｃの詳細な動力学的特性を決定するために、これらの酵素をコードする遺伝子を、ｐＥＴ１４ｂ発現ベクター内にサブクローニングし、およびＣ４１大腸菌細胞中で発現させた。精製されたクローンを、それらのＬ−アスパラギナーゼ活性について試験した（表４）。がん治療について承認されているＬ−アスパラギナーゼと比較するために、大腸菌Ｌ−アスパラギナーゼａｎｓＢもまた含んだ。指向性進化法によって選択されｈＡＳＮａｓｅ１のＣ末端ドメインを保有している４つのクローンが、ｈＡＳＮａｓｅ１と高い配列同一性（＞８５％）を示すが、マイクロモルの範囲のＫ_ｍを有するｇｐＡＳＮａｓｅ１と同様の動力学的特性を示すことを観察した。クローン６３_Ｎ−ｈ_Ｃ（ｈＡＳＮａｓｅ１の配列と８５．７％の同一性）は、４７μＭにおいて最も低いＫ_ｍを示した。クローンＳＡ_Ｎ−ｈ_Ｃは、ｈＡＳＮａｓｅ１と最も高い配列同一性（９１．６％の同一性）を有したが、このクローンは、１６５μＭという幾分か高いＡｓｎのＫ_ｍを有した。これが血液Ａｓｎ濃度に関係があるために、５０μＭのＡｓｎにおける酵素の観察されたＡｓｎの加水分解速度（ｋ_{ｏｂｓ＠５０μＭ}）を比較した（Ollenschlaeger (1988) Eur. J. Clin. Invest. 18:512-6）。大腸菌ａｎｓＢのｋ_{ｏｂｓ＠５０μＭ}は、４１±０．３ｓｅｃ^−１であることが見出され、および野生型ｇｐＡＳＮａｓｅ１のそれは、２０ｓｅｃ^−１であった。重要なことに、ヒト化クローンについてのｋ_{ｏｂｓ＠５０μＭ}値もまた、この範囲内であった、すなわちクローン６３_Ｎ−ｈ_Ｃ、６４_Ｎ−ｈ_Ｃ、６５_Ｎ−ｈ_ＣおよびＳＡ_Ｎ−ｈ_Ｃ、夫々について１７ｓｅｃ^−１、１０ｓｅｃ^−１、１７ｓｅｃ^−１および６ｓｅｃ^−１であった。

ヒト化Ｌ−アスパラギナーゼクローンの細胞培養の評価。ＧｐＡ酵素が、抗ＡＬＬ活性を示すか否か決定するために、ヒトのＴ−ＡＬＬ ＬＯＵＣＹおよびＢ−ＡＬＬ ＳＵＰ−Ｂ１５細胞株を、増加する濃度のｇｐＡＳＮａｓｅ１に露出させた。この分析の結果は、ｇｐＡＳＮａｓｅ１が、ＬＯＵＣＹおよびＳＵＰ−Ｂ１５細胞株、夫々について０．０００１５ＩＵ／ｍｌおよび０．０００３６ＩＵ／ｍｌのＩＣ_５０を示すことを指し示した（表５）。とりわけ、これらのＩＣ_５０値は、大腸菌ＩＩ型酵素のそれらに匹敵する。

ｈＡＳＮａｓｅ１およびｇｐＡＳＮａｓｅ１のキメラを、それらの抗ＡＬＬ効能についてもまた評価した。クローンｇ_Ｎ−ｈ_Ｃ、６３_Ｎ−ｈＣおよび６５_Ｎ−ｈＣは、これらのクローンが最も低いＡｓｎのＫ_ｍ（夫々、３５、４７および７４μＭ）を有しており、それによってｇｐＡＳＮａｓｅ１のそれとほとんど同様の活性（５０μＭ）を有すために、これらの実験のために選択された。６５_Ｎ−ｈＣの最も高いＫ_ｍ値に起因して、このクローンは、他の酵素と比較して最も高いＩＣ_５０値を有したが、それでもなおＴ−ＡＬＬおよびＢ−ＡＬＬ細胞の両方を殺傷するために極めて有効であった（ｍＩＵ／ｍＬの範囲におけるＩＣ_５０；表５）。クローンｇ_Ｎ−ｈ_Ｃおよび６３_Ｎ−ｈ_Ｃは、ｇｐＡＳＮａｓｅ１と比較して、それらの細胞殺傷力において酷似していることを証明した。クローン６３_Ｎ−ｈ_Ｃについて、このクローンが、ｈＡＳＮａｓｅ１へのパーセント同一性を６９．８％から、ｇｐＡＳＮａｓｅ１において存在するような８５．７％まで増加させたために、このことは特に注目に値する。

要約すると、この分析は、必要な低いＫ_ｍ特性を有するＧｐＡのヒト化バリアントを同定した。同定されたクローンのうちの２つである、６３Ｎ−ｈＣおよび６５Ｎ−ｈＣは、夫々ｈＡ−ＦＬと８５．７％および８７．１％のアミノ酸配列同一性を共有したが、完全長ＧｐＡと同様のＫ_ｍを有した。これらのクローンは、完全長ｈＡＳＮａｓｅ１と比べて、１００倍-１４０倍増強された触媒効率を所有している。とりわけ、これらの高度なヒト様Ｌ−アスパラギナーゼは、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡＬＬ殺傷の潜在力を維持する。

例３：構造ベースアプローチ（Structured-Based Approach）を介して産生されるヒト化ＧｐＡバリアント
ＤＮＡシャッフリングおよびドメインスワッピングの代替として、構造ベースアプローチが、ＧｐＡ酵素をヒト化し、および同じものの免疫原性を低減するためにとられた。このアプローチのために、切断されたＧｐＡ３６９バリアント（配列番号５）を改変した。ＧｐＡの結晶構造を、検査し、酵素の表面のどの残基が、ｈＡＳＮａｓｅ１における対応するアミノ酸に突然変異され得、およびその存在が、酵素の活性または安定性に有害ではないであろうかに関して予測がなされた。候補表面残基は、ＧｐＡの活性または安定性に対して影響を生じうる可能性に基づいて３群に分けられた（Ｇｒｏｕｐ１、影響なし；Ｇｒｏｕｐ２、おそらく影響なし；およびＧｒｏｕｐ３、影響のある可能性がある）（表６）。

Ｇｒｏｕｐ１の突然変異全て、Ｇｒｏｕｐ１および２の突然変異の組み合わせ、およびＧｒｏｕｐ１、２および３の突然変異の組み合わせを含有するＧｐＡバリアントを調製した（表７）。ＧｐＡバリアントは、組み換えて発現され、および野生型の活性および安定性の１００％を保持することが見出された。

Ｉｎ ｖｉｖｏの安定性データは、ＧｐＡ酵素に存在する表面に露出したループのうちの１つの潜在的な切断を示唆した。特に、データは、ｈＡＳＮａｓｅ１に存在するようなループ１（ｌｏｏｐ１^ｈｕｍ、残基５７〜６２：ＳＥＤＴＬＶ（配列番号４３））の配列を有するタンパク質と、ＧｐＡに存在するような配列（ｌｏｏｐ１^ｇｐ、残基５７〜６２：ＰＤＨＡＬＡ（配列番号４４））を有するタンパク質との間の異なる安定性を示唆した。結果的に、Ｇｒｏｕｐ１、２および３の突然変異の組み合わせを含有するＧｐＡバリアントを、さらにｌｏｏｐ１^ｈｕｍ配列を含むために突然変異させた（表７）。さらに、Ｌｏｏｐ１ＧｐＡバリアントを、組み換えて発現させ、野生型の活性および安定性を１００％保持することを見出した。

例４：ペグ化のための表面システイン残基の突然変異
ペグ化は、ｉｎ ｖｉｖｏ循環時間を増加させることが知られている。ＰＥＧ分子は、マレイミドベースのペグ化化学によって目的のタンパク質のシステイン残基に容易に結びつき得る。ＧｐＡ３６９およびヒト化ＧｐＡ３６９バリアントは、５つの固有のシステイン残基、Ｃｙｓ７９、Ｃｙｓ１７３、Ｃｙｓ１９８、Ｃｙｓ２９６およびＣｙｓ２９９を含有する。結晶構造分析に基づき、Ｃｙｓ１７３およびＣｙｓ２９６は埋まっており、よってペグ化の影響を受けないことが予測される。Ｃｙｓ２９９は、Ｃｙｓ１９８よりも近づきにくく、テトラマーの安定化に貢献していると考えられる。この部位におけるペグ化を避けるためにＣｙｓ２９９をＡｌａまたはＳｅｒのいずれかに交換する試みは、不安定なタンパク質をもたらした。反対に、位置１９８におけるシステイン残基からアラニン（ＧｐＡ３６９−Ｃ１９８Ａ、配列番号５１）、セリン（ＧｐＡ３６９−Ｃ１９８Ｓ、配列番号５２）またはバリン（ＧｐＡ３６９−Ｃ１９８Ｖ、配列番号５３）への突然変異は、参照ＧｐＡ３６９酵素と比較して同等の安定性および活性のタンパク質を生じた。その上、今や単一の反応性の表面システイン（Ｃｙｓ７９）のみを含有する、ＧｐＡ３６９−Ｃ１９８Ａ、ＧｐＡ３６９−Ｃ１９８ＳおよびＧｐＡ３６９−Ｃ１９８Ｖタンパク質のマレイミド−ペグ化は、均一な産物をもたらした。

ペグ化による生物製剤の保護の程度は、ＰＥＧ剤の構造および複雑性に依存するが、多くのケースにおいて、単一部位のペグ化は、マクロ分子全体を覆うのに十分ではない。したがって、１〜５の表面システイン残基を含有する、追加のＧｐＡバリアントを生成した。この点において、複数部位がペグ化された産物についてシステインに突然変異し得る残基の領域を同定するために、ＧｐＡの構造を分析した。有用な領域は、表面上になければならず、オリゴマー化の境界面から離れていなければならず（ＧｐＡは、テトラマーであるため、境界面に近くの残基をペグ化することは、酵素の活性に有害であり得る）、および外側を向く残基を含む。これらの基準を満たすＧｐＡの領域を、表８中に列記した。

突然変異され得る可能な残基の中で（表８）、領域１からのＥ４９、領域２からのＫ２２５、領域３からのＱ２５７および領域４からのＥ３４０を、システインへの突然変異のための良好な候補として同定した。Ｋ２２５Ｃ、Ｅ３４０Ｃ、Ｅ４９ＣおよびＱ２５７Ｃ突然変異の１以上を含む、ＧｐＡ３６９−Ｃ１９８およびＧｐＡ３６９（ｈｕｍ）−Ｇｒｏｕｐ１＋２＋３−Ｃ１９８のバリアントを生成した（表９）。

表９に列記したバリアントのそれぞれを、組み換えて発現させ、精製して、ｍＰＥＧ−１０Ｋ、ｍＰＥＧ−２０ＫおよびｍＰＥＧ−４０Ｋ（表１０）の１以上を用いてペグ化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって決定されるとき、ペグ化された酵素のサイズは、活性なシステインの数とともに増加した。例えば、マレイミド−ＰＥＧ１０Ｋを使用して、ＧｐＡ３６９（ｈｕｍ）−Ｃ１９８Ａは、ペグ化後により高い分子量で移動し（ＰＥＧによって供給された追加の１０ＫＤａに起因して）、およびＧｐＡ３６９（ｈｕｍ）−Ｃ１９８Ａ＋Ｒ５２Ｃは、このバリアントが２つのＰＥＧ分子と反応することができるために、よりいっそう高い見かけの分子量で移動する（酵素に結びついた２つの１０Ｋ分子によって供給された追加の合計２０ＫＤａのために）。注目すべきことに、ＧｐＡ３６９−Ｃ１９８Ａ−Ｋ２２５Ｃ−Ｅ３４０Ｃ−Ｅ４９Ｃ−Ｑ２５７Ｃ突然変異体を調製し、発現させ、精製し、ｍＰＥＧ−１０Ｋを用いてペグ化した。しかしながら、ｍＰＥＧ−１０Ｋを用いたこのバリアントのペグ化は、複数種類の産物をもたらす。シャペロン６０ＫＤａは、このタンパク質と１：１の比率で存在しており、ＧｐＡ３６９−Ｃ１９８Ａ−Ｋ２２５Ｃ−Ｅ３４０Ｃ−Ｅ４９Ｃ−Ｑ２５７Ｃ突然変異体が、十分にフォールディングされていなかったことを示唆する。

さらにバリアントのペグ化を査定するために、種々のＰＥＧ：タンパク質の比率を使用した。この分析のために、２ｍｇ／ｍＬのＧｐＡ３６９−Ｃ１９８Ａを、２倍、１０倍、および２０倍超過のｍ−ＰＥＧ１０Ｋリニア（linear）と一緒に使用した。さらに、ペグ化反応が完了した後に５ｍＭのベータ−メルカプトエタノールを添加すること、およびペグ化反応中に１０ｍＭまたは１００ｍＭのグリシンまたは１０ｍＭのアスパラギン酸などの添加剤を含むことの効果を決定するために分析を実施した。この分析は、ＧｐＡ３６９バリアントの完全なペグ化を確実にするために、２０：１のモル比のマレイミドＰＥＧ：タンパク質が、必要であることを指し示した。さらに、ベータ−メルカプトエタノールの添加は、均一な産物を提供することが見出された一方で、グリシンまたはアスパラギン酸は、ペグ化反応において除外されるべきであった。

直鎖状のマレイミド−ＰＥＧ１０Ｋに加えて、ペグ化され、直鎖状のマレイミド−ＰＥＧ２０Ｋ、直線状のマレイミド−ＰＥＧ４０Ｋ 二分枝のマレイミド−ＰＥＧ２０Ｋ、四腕のマレイミド−ＰＥＧ１０Ｋ、およびＹ字型のマレイミド−ＰＥＧ４０Ｋを用いてＧｐＡ３６９バリアントをペグ化した。これらの種々の型のＰＥＧのそれぞれを用いたペグ化を観察した。とりわけ、ペグ化されたバリアントは、ＧｐＡ３６９の裸のバリアントと比較して、Ｌ−アスパラギナーゼ活性において著しい増加を示した（表１０）。

例５：ペグ化のための表面リシン残基の突然変異
多くの従来の生物学的製剤は、リシン残基上でペグ化されており、そこでリシン側鎖のイプシロンアミノ基がＰＥＧ分子と反応する。リシンは、タンパク質の表面に存在する共通のアミノ酸である。したがって、この戦略を使用するペグ化は、しばしばタンパク質に結びついたＰＥＧ分子の可変数を有する、均一性の低い産物をもたらす。

均一性を増加させるために、別のリシン残基とごく接近しているＧｐＡのリシン残基（resides）を、ＰＥＧと反応しないであろう残基と置き換えた。加えて、構造的完全性に悪影響を与える可能性のある残基、よってテトラマーＬ−アスパラギナーゼの酵素活性を、酵素全体の表面を完全に、および均等に保護するために、表面リシン残基と置き換えた。

表１１に列記された、この戦略を使用する突然変異を有する切断されたＧｐＡバリアントは、本発明における使用に有用であると考えられた。

リシン残基を介した活性、安定性およびペグ化を示すために、ＧｐＡ３６９（ｈｕｍ）−Ｇｒｏｕｐ１＋２＋３−Ｃ１９８Ａ−Ｒ５４Ｋ＋Ａ９１Ｋ＋Ｋ２２３Ｄ＋Ｓ３１１Ｋバリアントを生成し、組み換えて発現させて、精製し、および種々のＰＥＧ：タンパク質比を使用してペグ化した。この分析は、ＧｐＡ３６９バリアントの完全ペグ化を確実にするために、２０：１より大きなモル比のアミンＰＥＧ対タンパク質を必要とすることを示した。ＤＴＴおよびグリセロールなどの添加材は、ペグ化反応中に除外されるべきであることもまた観察された。メトキシＰＥＧサクシニミジルカルボナート１０Ｋ（ｍＰＥＧ−ＳＣ−１０Ｋ）、ｍＰＥＧ−サクシニミジルカルボキシメチルエステル５Ｋ（ｍＰＥＧ−ＳＣＭ−５Ｋ）およびｍＰＥＧ−スクシンアミドサクシニミジルエステル５Ｋ（ｍＰＥＧ−ＳＡＳ−５Ｋ）を含む、種々のサイズおよびリンカー型を試験した。とりわけ、いずれのペグ化産物も、裸のバージョンと比較して、Ｌ−アスパラギナーゼ活性における喪失を示さなかった（表１２）。

例６：ｉｎ ｖｉｖｏ半減期を増加させるためのタグ
Ｌ−アスパラギナーゼの有効性は、薬物のｉｎ ｖｉｖｏ半減期に関連する；半減期が長ければ長いほど、酵素は血液アスパラギンを加水分解するようにより長く作用する。結果的に、本明細書に開示のＬ−アスパラギナーゼバリアントのｉｎ ｖｉｖｏ半減期を増加させるために、タグをＬ−アスパラギナーゼのＮ末端に融合させる。かかるタグは、ヒスチジンタグ、酵母ＳＵＭＯタグ；ヒトＳＵＭＯタグ；ＳＵＭＯタグが、ヒトにおいて存在する４つの相同ＳＵＭＯドメイン（ＳＵＭＯ−１、ＳＵＭＯ−２、ＳＵＭＯ−３またはＳＵＭＯ−４）の一つであり得るＨｉｓ_６−ヒトＳＵＭＯタグ；およびアルブミン結合ペプチドタグを含み得る。各タグは、Ｌ−アスパラギナーゼ酵素の循環時間を増加させ得る。加えて、タグの組み合わせが使用され得る。特に、ＳＡ２１およびＳＵＭＯタグを組み合わせて、さらに長期にわたる半減期を有するバリアントを得ることができる。

ヒスチジンタグ。一連の６〜９個のヒスチジン残基を特定するＤＮＡ配列は、組み換えタンパク質の生産のためのベクターにおいて頻繁に使用される。結果は、そのＮ末端またはＣ末端に融合された６ｘＨｉｓまたはポリ−Ｈｉｓタグを有する組み換えタンパク質の発現である。

発現されたＨｉｓタグ化タンパク質は、精製および容易に検出され得、それによってタンパク質特異的抗体またはプローブなしで組み換えタンパク質を特異的に精製または検出する手段を提供する。キットはＨｉｓタグタンパク質について市販されている。

ＳＵＭＯ改変。Ｎ末端融合パートナーとしてのＳＵＭＯは、著しく改善されたタンパク質安定性および可溶性に基づいて、原核および真核の発現系における機能的タンパク質の生産を増強することが見出されている。

融合タンパク質の発現および精製に続いて、ＳＵＭＯタグは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでエンドペプチダーゼ活性を介して特異的（ＳＵＭＯ）プロテアーゼによって切断されて、放出されたタンパク質パートナーの所望のＮ末端を生成することができる。ＳＵＭＯタグ発現系は市販されている。いくつかの態様では、ＳＵＭＯタグは、酵母ＳＵＭＯタグ（例として、Ｓｍｔ３（配列番号６６））である。他の態様では、ＳＵＭＯタグは、ヒトＳＵＭＯタグ（例として、ＳＵＭＯ−１（配列番号６７）、ＳＵＭＯ−２（配列番号６８）、ＳＵＭＯ−３（配列番号６９）またはＳＵＭＯ−４（配列番号７０））である。

Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ改変。ヒスチジン（例として、１ｘ−６ｘＨｉｓ）タグとＳＵＭＯ改変を組み合わせることにより、効率的な精製、増加した発現および可溶性、ならびにＬ−アスパラギナーゼの増加した半減期が提供される。目的のタンパク質にＨｉｓ−ＳＵＭＯ改変を提供するための発現系は市販されている。例として、CHAMPION pET SUMO protein expression system（Invitrogen）を参照されたい。

アルブミン結合ドメイン。ファージディスプレイを使用して複数の種に由来する血清アルブミンへと結合する一連のペプチドが、同定された（Dennis, at al.(2002) J.Biol.Chem.277(38):35035-35043；ＵＳ２０１６／０１８５８７４；およびＵＳ２００４／０００１８２７）。これらのペプチドの１つである、ＳＡ２１と呼ばれるものが、延長された血清の半減期を有することが見出された。例示のアルブミン結合ペプチドは、ＳＡ２０（ＱＲＬＩＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤＦ；配列番号７１）、ＳＡ２１（ＲＬＩＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤ；配列番号７２）、およびＳＡ３１（ＲＬＩＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ；配列番号７３）を含むが、これらに限定されない。かかるドメインを本明細書に開示のＬ−アスパラギナーゼ酵素へと融合することにより、アルブミンとの非共有結合性会合を介しての薬物動態の改善が期待される。Dennis, et al.(2002) J.Biol.Chem.277(38):35035-35043；ＵＳ２０１６／０１８５８７４；およびＵＳ２００４／０００１８２７を参照されたい。

例示の様々なタグを伴う切断されたＧｐＡバリアントを、表１３に提供する。

例７：ＴＲＡＩＬ−ＧｐＡ融合タンパク質
ＴＲＡＩＬ（リガンドを含むＴＮＦ関連アポトーシス）は、アポトーシスによって細胞死を誘導するタンパク質である。結果的に、ＴＲＡＩＬ−アスパラギナーゼ融合タンパク質は、これら２つのタンパク質の活性を組み合わせるように作製される。この融合タンパク質を使用して、Ｌ−アスパラギナーゼの構成要素は、細胞がアポトーシスを受けるようシグナルを送り、およびＴＲＡＩＬの構成要素は、細胞死を誘導する。実例として、３つのタンデムＴＲＡＩＬの可溶性ドメイン（ＴＲＡＩＬ_トリマー）を、切断され、ヒト化された、ＧｐＡ３６９（ｈｕｍ）−Ｇｒｏｕｐ１＋２＋３（配列番号４７）またはＧｐＡ３６９（ｈｕｍ）−Ｇｒｏｕｐ１＋２＋３−ｌｏｏｐ１^ｈｕｍ（配列番号５０）などのモルモットＬ−アスパラギナーゼとインフレームで融合させて、ＴＲＡＩＬ_トリマー−ＧｐＡまたはＧｐＡ−ＴＲＡＩＬ_トリマー融合タンパク質を生成する。

融合タンパク質の有効性は、０．０００１から２．５ＩＵ／ｍｌまでの範囲に及ぶ最終濃度の融合タンパク質の存在下でヒト急性骨髄性白血病ＭＶ４；１１細胞を培養することにより査定される。５％ＣＯ_２を含有する加湿空気中で３７℃で４日間プレートをインキュベートした後に、Alamar Blue（Invitrogen）を、１０％ｖ／ｖの最終濃度まで添加し、プレートを追加で４時間インキュベートして、これに続いて蛍光シグナルを読み取る。白血病細胞の生存率は、Ｌ−アスパラギナーゼの存在下の蛍光カウントのパーセンテージ対ＤＰＢＳ対照におけるそれとして計算される。この分析は、活性融合タンパク質が、切断され、ヒト化されたモルモットＬ−アスパラギナーゼ単独と比較して、著しく良好なＭＶ４；１１細胞株に対する殺傷活性を持つことを示すだろう。

白血病細胞を殺傷することについて融合タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの有効性は、４〜１０匹の６週齢の非肥満糖尿病／重症複合免疫不全γ（ＮＳＧ）マウス（The Jackson Laboratory）に５ｘ１０^６ルシフェラーゼ陽性ＭＶ４；１１細胞を含有するＤＰＢＳ１５０μＬを注射することによって査定される。一定の時点で、生物発光を、IVIS Lumina IIイメージングシステム（PerkinElmer）を使用して測定する。生着後（０日）に、マウスに１週間毎日１５ ＩＵ／マウスの融合タンパク質を腹腔内注射で処置する。生物発光シグナルを、０日および７日に測定する。この分析の結果は、融合タンパク質によるＭＶ４；１１細胞の著しい殺傷効果を示すだろう。

膵臓および卵巣がんなどの固形がんに対する融合タンパク質の有効性もまた決定される。Ｐａｎｃ−１およびＭｉａＰａｃａ２などの膵臓がん細胞株ならびにＯＶＣＡＲ３およびＯＶＣＡＲ４などの卵巣がん細胞株を、０．０００１から２．５ＩＵ／ｍｌまでの範囲に及ぶ最終濃度の融合タンパク質またはＧｐＡ単独で、または融合タンパク質について使用されるそれと対応する濃度のＴＲＡＩＬ_トリマーで処置する。５％ＣＯ_２を含有する加湿空気中で３７℃で４日間プレートをインキュベートした後に、Alamar Blue（Invitrogen）を、１０％ｖ／ｖの最終濃度まで添加し、プレートを追加で４時間インキュベートして、これに続いて蛍光シグナルを読み取る。がん細胞生存率は、融合タンパク質の存在下の蛍光カウントのパーセンテージ対ＤＰＢＳ対照中におけるそれとして計算される。この分析は、活性融合タンパク質が、ＴＲＡＩＬ_トリマーまたはＧｐＡ単独と比較して、著しく良好ながん細胞株に対する殺傷活性を持つことを示すだろう。

Claims (20)

1. 配列番号１の残基１〜３５９と少なくとも８５％の配列同一性を共有しているＣ末端で切断されたモルモットＬ−アスパラギナーゼ（ＧｐＡ）バリアント。
2. Ｃ末端の切断が、配列番号１の３５９と３９６との間の位置である、請求項１に記載の切断されたＧｐＡバリアント。
3. Ｃ末端の切断が、配列番号１の３６９の位置である、請求項１または２に記載の切断されたＧｐＡバリアント。
4. 配列番号１と比べて少なくとも１つのアミノ酸置換をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の切断されたＧｐＡバリアント。
5. 配列番号１と比べての少なくとも１つのアミノ酸置換が、位置７、１０、２３、２５、４８、４９、５２、５３、５４、５７、５８、５９、６０、６２、９２、９８、１０１、１０６、１０８、１２１、１２２、１３４、１４７、１９３、１９８、２１７、２３３、２３６、２３７、２５０、２５７、２８１、３０１、３１１、３４０、３４４、３６０、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、または３６８、またはその組み合わせの位置である、請求項４に記載の切断されたＧｐＡバリアント。
6. 配列番号１と比べての少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｈ１０Ｒ、Ｑ２３Ｒ、Ｋ２５Ｅ、Ｋ４８Ｅ、Ｑ５２Ｒ、Ｑ５４Ｒ、Ｐ５７Ｓ、Ｄ５８Ｅ、Ｈ５９Ｄ、Ａ６０Ｔ、Ａ６２Ｖ、Ｄ９１Ａ、Ｄ９２Ｅ、Ｋ９８Ｑ、Ｅ１０１Ｋ、Ｑ１０８Ｈ、Ｓ１２１Ｆ、Ｇ１２２Ａ、Ｈ１３４Ｑ、Ｒ１４７Ｈ、Ｋ１９３Ｒ、Ｃ１９８Ａ、Ｃ１９８Ｓ、Ｃ１９８Ｖ、Ｄ２１７Ｅ、Ｎ２３３Ｓ、Ｈ２３６Ｑ、Ｓ２５０Ａ、Ｑ２８８Ｅ、Ｒ３０１Ｑ、Ｅ３４４Ｄ、Ｌ３６０Ｐ、Ｔ３６２Ｓ、Ａ３６３Ｖ、Ｄ３６４Ｅ、Ｌ３６５Ｅ、Ｈ３６６Ｒ、Ｑ３６７Ｒ、またはＳ３６８Ｐ、またはその組み合わせである、請求項４または５に記載の切断されたＧｐＡバリアント。
7. 配列番号１と比べての少なくとも１つのアミノ酸置換が、以下：
   （ａ）位置４９、５２、２２５、２５７、２８１、または３４０、またはその組み合わせでのシステイン残基；または
   （ｂ）位置７、５３、５４、５７、５８、９８、１０６、２３３、２５０、２５７、２８１、３１１または３４０、またはその組み合わせでのリシン残基
   を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の切断されたＧｐＡバリアント。
8. バリアントが、野生型ＧｐＡと等しいかまたはそれより大きな触媒活性を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の切断されたＧｐＡバリアント。
9. ヒスチジンタグ、ＳＵＭＯタグ、アルブミン結合ドメイン、またはその組み合わせをさらに含む、請求項１に記載の切断されたＧｐＡバリアント。
10. ＴＲＡＩＬの３つのタンデム可溶性ドメインをさらに含む、請求項１に記載の切断されたＧｐＡバリアント。
11. ＴＲＡＩＬの可溶性ドメインが、ヒトＴＲＡＩＬの残基１１５〜２８１を含む、請求項１０に記載の切断されたＧｐＡバリアント。
12. 請求項１に記載の切断されたＧｐＡバリアントをコードする、核酸分子。
13. 請求項１２に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
14. 請求項１２に記載の核酸分子を含む、宿主細胞。
15. 請求項１に記載の切断されたＧｐＡバリアントおよび薬学的に許容し得る賦形剤を含む、医薬組成物。
16. ＴＲＡＩＬの安定な形態をさらに含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
17. ＴＲＡＩＬの安定な形態が、ＦＯＬＤＯＮ配列ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ（配列番号８５）を含む、請求項１６に記載の医薬組成物。
18. 処置を必要とする対象に請求項１に記載の切断されたＧｐＡバリアントの有効量を投与し、それによって対象のがんを処置することを含む、がんを処置する方法。
19. がんが、非ホジキンリンパ腫、白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、およびヘアリー細胞白血病から選択される、請求項１８に記載の方法。
20. ＴＲＡＩＬの安定な形態を投与することをさらに含む、請求項１８に記載の方法。