JPH08214885A - 哺乳類のｌ−アスパラギナーゼをコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 哺乳類のＬ−アスパラギナーゼをコードする
ＤＮＡを提供する。 【構成】 特定のアミノ配列を含んでなる哺乳類のＬ−
アスパラギナーゼをコードするＤＮＡを要旨とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明はＬ−アスパラギナーゼ
をコードする新規なＤＮＡ、詳細には、哺乳類のＬ−ア
スパラギナーゼをコードするＤＮＡに関する。

【０００２】

【従来の技術】Ｌ−アスパラギナーゼ（ＥＣ３．５．
１．１）は、Ｌ−アスパラギンに作用してＬ−アスパラ
ギン酸とアンモニアを遊離するアミドヒドロラーゼの一
種である。Ｌ−アスパラギナーゼは動植物及び微生物に
おけるＬ−アスパラギン代謝の中心的役割を担う酵素で
あるが、ジェー・ジー・キッズが『ジャーナル・オブ・
エキスペリメンタル・メディスン』、第９８巻、第５６
５乃至５８１頁（１９５３年）にリンパ腫に対する阻害
作用を報告して以来、抗腫瘍剤としての実用化に向けて
精力的な研究が続けられてきた。その結果、今では、大
腸菌のＬ−アスパラギナーゼが白血病及びリンパ腫の治
療剤として用いられるようになった

【０００３】しかし、抗腫瘍作用に優れた大腸菌のＬ−
アスパラギナーゼも、人体からみれば、所詮、異種蛋白
質であり、これを配合使用する従来の治療剤は、患者に
投与すると、アナフィラキシーショック及び蕁麻疹、浮
腫、喘鳴、呼吸困難などの過敏反応を始めとする深刻な
副作用を頻発させることとなった。斯くして、従来の治
療剤は用量及び投与頻度を大幅に制限せざるを得ない状
況にあり、そのため、斯かる副作用を軽減乃至解消する
ための提案が幾つかなされてきた。

【０００４】その第一は、特開昭５４−１１９０８２号
公報に見られるように、２−Ｏ−置換ポリエチレングリ
コール−４，６−ジクロロ−Ｓ−トリアジンにより大腸
菌由来のＬ−アスパラギナーゼにおけるアミノ基の６５
％以上を封鎖し、Ｌ−アスパラギナーゼそのものを化学
的に修飾しようというものである。第二は、特開平４−
３２０６８４号公報に見られるように、ヒトの肺、胃又
は胸部から採取した線維芽細胞を培養し、培養物からヒ
トのＬ−アスパラギナーゼを採取しようというものであ
る。第一の提案には、大量入手容易な大腸菌のＬ−アス
パラギナーゼを利用できる利点はあるものの、修飾反応
の制御が困難なうえに、副作用を解消するまでには到ら
ないという問題がある。第二の提案によるヒトのＬ−ア
スパラギナーゼは、大腸菌が産生するものと違って、患
者に投与しても抗体を産生し難い利点はあるものの、特
開平４−３２０６８４号公報に開示されたヒト細胞はＬ
−アスパラギナーゼ産生能が充分高いとは言えず、Ｌ−
アスパラギナーゼを量産しようとすると、細胞を大量に
培養しなければならない問題がある。

【０００５】一方、昨今の組換えＤＮＡ技術の進歩には
目覚しいものがある。今日では、全アミノ酸配列が解明
されていないポリペプチドであっても、これをコードす
る遺伝子を単離し、その塩基配列を解明できれば、その
ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡを
作製し、これを微生物や動植物の細胞に導入して得られ
る形質転換体を培養することにより、所望量のポリペプ
チドが容易に取得できるようになった。

【０００６】斯かる状況に鑑み、斯界においては、一刻
も早く哺乳類のＬ−アスパラギナーゼをコードする遺伝
子、望ましくは、ヒトのＬ−アスパラギナーゼをコード
する遺伝子が単離され、塩基配列の解明されるのが待ち
望まれている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】この発明の目的は、哺
乳類のＬ−アスパラギナーゼをコードするＤＮＡを提供
することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】この発明は、上記課題
を、配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配
列を含んでなる哺乳類のＬ−アスパラギナーゼをコード
するＤＮＡにより解決するものである。

【０００９】

【作用】この発明のＤＮＡは、形質転換体とすることに
より、特定のアミノ酸配列を含む哺乳類のＬ−アスパラ
ギナーゼの産生を発現する。

【００１０】以下、実施例等を参照しながらこの発明を
説明するに、この発明はモルモットのＬ−アスパラギナ
ーゼをコードする新規なＤＮＡの発見に基づくものであ
る。モルモットの血清中にＬ−アスパラギナーゼの存在
することは以前より知られていたものの、その性質・性
状はほとんど解明されていなかった。

【００１１】本発明者は、カラムクロマトグラフィーを
中心とする種々の精製方法を組合わせてモルモットの血
清からＬ−アスパラギナーゼ活性を有する物質を単離
し、その部分アミノ酸配列を決定した。そして、その部
分アミノ酸配列に基づき化学合成したプライマーを用い
て、モルモットの肝細胞から採取したｍＲＮＡを鋳型に
ＲＴ−ＰＣＲ反応させたところ、モルモットのＬ−アス
パラギナーゼを部分コードするＤＮＡ断片が得られた。
このＤＮＡ断片をプローブにして上記ｍＲＮＡから別途
作製したｃＤＮＡライブラリーを鋭意検索したところ、
１，６９５塩基対からなる、配列表における配列番号５
に示す塩基配列を含むＤＮＡ断片が得られた。この塩基
配列を解読したところ、モルモットのＬ−アスパラギナ
ーゼは５６５個のアミノ酸からなり、配列表における配
列番号３に示すアミノ酸配列を有していることが判明し
た。

【００１２】この知見に基づき、本発明者がヒトの肝細
胞から採取したｍＲＮＡを引続き検索したところ、ヒト
のＬ−アスパラギナーゼをコードする遺伝子を単離する
ことに成功した。この遺伝子は１，７１９塩基対からな
る、配列表における配列番号６に示す塩基配列を含んで
なり、解読したところ、５７３個のアミノ酸からなる、
配列表における配列番号４に示すアミノ酸配列をコード
していることが判明した。

【００１３】配列表における配列番号３乃至６に示すア
ミノ酸配列及び塩基配列を解明するに到った一連の操作
を要約すると、次のようになる。 （１） クロマトグラフィーを中心とする種々の精製方
法を組合わせてモルモットの血清からＬ−アスパラギナ
ーゼを単離し、高度に精製した。 （２） このＬ−アスパラギナーゼをトリプシン消化
し、消化物から３種類のペプチド断片を単離し、アミノ
酸配列を決定した。 （３） モルモットの肝細胞からｍＲＮＡを採取し、こ
れを鋳型に上記アミノ酸配列に基づき化学合成したプラ
イマーの存在下でＲＴ−ＰＣＲ反応させてＤＮＡ断片を
調製する一方、それらアミノ酸配列に基づき別途化学合
成したプローブを用いてそれらＤＮＡ断片を検索したと
ころ、モルモットのＬ−アスパラギナーゼ活性を部分コ
ードするＤＮＡ断片が得られた。 （４） このＤＮＡ断片を同位体標識した後、前記ｍＲ
ＮＡを鋳型に調製したｃＤＮＡライブラリーにハイブリ
ダイズさせ、顕著な会合を示した形質転換体を採取し
た。 （５） 形質転換体からｃＤＮＡを採取し、塩基配列を
決定し、解読するとともに、その解読したアミノ酸配列
と前記部分アミノ酸配列を比較したところ、モルモット
のＬ−アスパラギナーゼは配列表における配列番号３に
示すアミノ酸配列を有し、配列表における配列番号５に
示す塩基配列によりコードされていることが判明した。 （６） さらに、ヒトの肝細胞から採取したｍＲＮＡを
鋳型にｃＤＮＡライブラリーを作製する一方、配列表に
おける配列番号５に示す塩基配列のＤＮＡ断片を調製
し、同位体標識後、上記ｃＤＮＡライブラリーにハイブ
リダイズさせ、顕著な会合を示した形質転換体を採取し
た。 （７） 形質転換体からｃＤＮＡを採取し、塩基配列を
決定し、解読したところ、ヒトのＬ−アスパラギナーゼ
は配列表における配列番号４に示すアミノ酸配列を有
し、配列表における配列番号６に示す塩基配列によりコ
ードされていることが判明した。

【００１４】配列表における配列番号３及び４に示すア
ミノ酸配列を比較すると、両者は、共通して、配列表に
おける配列番号１又は２に示すアミノ酸配列を有してい
る。すなわち、配列番号１に示すアミノ酸配列は、配列
番号３及び４に示すアミノ酸配列における第１６乃至１
９番目の配列に、一方、配列番号２に示すアミノ酸配列
は、配列番号３及び４に示すアミノ酸配列における第１
１４乃至１１８番目の配列に相当する。アミノ酸配列に
おける斯かる共通性に基づき、この発明でいう哺乳類の
Ｌ−アスパラキナーゼは、配列表における配列番号１又
は２に示すアミノ酸配列を含んでなるものということに
なる。その代表例としては、例えば、配列表における配
列番号３に示すアミノ酸配列を有するモルモットのＬ−
アスパラギナーゼ、配列番号４に示すアミノ酸配列を有
するヒトのＬ−アスパラギナーゼ、さらには、それらア
ミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を有する変異体が挙
げられる。斯かる変異体は、配列表における配列番号１
又は２に示すアミノ酸配列を保持しつつ、Ｌ−アスパラ
ギナーゼ活性を実質的に失わない範囲で、配列表におけ
る配列番号３又は４に示すアミノ酸配列におけるそれ以
外のアミノ酸の１個又は２個以上を他のアミノ酸で置換
したもの、さらには、それら配列番号３及び４に示すア
ミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端にアミノ酸が１個
又は２個以上付加したもの、及びそのＮ末端及び／又は
Ｃ末端のアミノ酸が１個又は２個以上欠失したものを包
含する。

【００１５】斯くして、この発明のＤＮＡは、上記のご
ときアミノ酸配列をコードするものということになる。
個々のＤＮＡとしては、例えば、配列表における配列番
号５乃至６及び１０乃至１１に示す塩基配列及びそれら
に相同的な塩基配列並びにそれらに相補的な塩基配列の
ものを挙げることができる。斯かる塩基配列において
は、遺伝子コードの縮重を利用して、コードするアミノ
酸配列を変えることなく、それら塩基配列における塩基
の１個又は２個以上を他の塩基で置換してもよい。ま
た、この発明のＤＮＡが、実際に、宿主内で哺乳類のＬ
−アスパラギナーゼの産生を発現するために、この発明
でいうＬ−アスパラギナーゼ又はその変異体をコードす
る塩基配列における塩基の１個又は２個以上を他の塩基
で適宜置換し得ることは言うまでもない。

【００１６】この発明のＤＮＡは、それが上述のごとき
塩基配列を有するかぎり、それが天然に由来するものか
人為的に合成されたものであるかは問わない。天然の給
源としては、例えば、モルモット及びヒトの肝臓が挙げ
られ、その細胞からは、例えば、配列表における配列番
号５又は６に示す塩基配列を含むＤＮＡが得られる。一
方、この発明のＤＮＡを人為的に合成するには、例え
ば、配列表における配列番号５又は６に示す塩基配列に
基づいて化学合成するか、配列表における配列番号３又
は４に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡを自律複製
可能な適宜ベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、これ
を適宜宿主に導入して得られる形質転換体を培養し、培
養物から菌体を分離し、その菌体から当該ＤＮＡを含む
プラスミドを採取すればよい。

【００１７】斯くして得られるＤＮＡは、斯界における
慣用の方法により形質転換体とすることができる。斯か
る形質転換体は、培養すると、細胞乃至菌体内外に哺乳
類のＬ−アスパラギナーゼを産生する。哺乳類のＬ−ア
スパラギナーゼは、従来公知の大腸菌のものと違い、患
者に反復投与してもアナフィラキシーショックや過敏反
応などの副作用を惹起し難い特徴があるので、単独又は
他の薬剤と併用して、急性白血病、急性リンパ性白血病
及び悪性リンパ腫を含む哺乳類における悪性腫瘍一般の
治療に有利に用いることができる。

【００１８】以下、実施例に基づきこの発明を説明する
が、そこで用いられる手法は斯界において慣用のもので
あり、例えば、ティー・マニャティスら『モレキュラー
・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル』、１
９８９年、コールド・スプリング・ハーバー発行や、松
村正実『ラボマニュアル遺伝子工学』、１９８８年、丸
善発行などにも詳述されている。

【００１９】

【実施例１ モルモットのＬ−アスパラギナーゼの精
製】８乃至１０週齢のモルモット１００匹から採血し、
血液を常法にしたがって処理して血清３００ｍｌを得
た。血清に硫酸アンモニウムを５０％飽和になるように
加え、４℃で２時間静置し、約８，０００ｒｐｍで３０
分間遠心分離した。沈澱部を採取し、１０ｍＭ燐酸緩衝
液（ｐＨ７．０）に溶解し、新鮮な同一緩衝液に対して
４℃で１８時間透析後、予め新鮮な同一緩衝液により平
衡化しておいたファルマシア製ゲル濾過クロマトグラフ
ィー用ゲル『セファクリルＳ−３００』３００ｍｌのカ
ラムに負荷し、カラムに新鮮な同一緩衝液を通液した。

【００２０】分子量約１５０，０００ダルトンに相当す
る画分を採取し、予め２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．
０）により平衡化しておいた東ソー製高速液体クロマト
グラフィー用カラム『ＤＥＡＥ−５ＰＷ』に負荷し、カ
ラムを新鮮な同一緩衝液で洗浄した後、０Ｍから１Ｍに
上昇する塩化ナトリウムの濃度勾配下、２０ｍＭ燐酸緩
衝液（ｐＨ７．０）を１３ｍｌ／分の流速で通液した。
塩化ナトリウム濃度が０．２５Ｍ付近で溶出した画分約
１２０ｍｌを採取し、蒸留水に対して４℃で４時間透析
した後、予め５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．
４）により平衡化しておいたファルマシア製アフィニテ
ィークロマトグラフィー用ゲル『ブルーセファロースＣ
Ｌ−６Ｂ』１００ｍｌのカラムに負荷し、カラムに新鮮
な同一緩衝液を通液してモルモットのＬ−アスパラギナ
ーゼを溶出させた。

【００２１】Ｌ−アスパラギナーゼを含む画分を採取
し、濃縮後、予め１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に
より平衡化しておいたファルマシア製ゲル濾過クロマト
グラフィー用ゲル『ハイロードスーパーデックス２０
０』のカラムに負荷し、カラムに新鮮な同一緩衝液を通
液した。分子量約１５０，０００ダルトンに相当する画
分を採取し、濃縮したところ、比活性約１０単位／ｍｇ
蛋白質のモルモットのＬ−アスパラギナーゼがモルモッ
ト１匹当たり約４００μｇの収量で得られた。

【００２２】なお、この明細書を通じて、Ｌ−アスパラ
ギナーゼの活性は、次のようにして測定した活性値（単
位）で表示する。すなわち、９６ウェルマイクロプレー
トに被検試料を１６０μｌ／ウェルずつ分注する一方、
Ｌ−アスパラギンを濃度１．４ｍｇ／ｍｌになるように
５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、溶液を４
０μｌ／ウェルずつマイクロプレートに加える。この状
態でマイクロプレートを３７℃で１０乃至３０分間イン
キュベートした後、反応により遊離したＬ−アスパラギ
ン酸をアミノ酸分析機により測定する。同時に、被検試
料に代えて１．０、０．５又は０．２５単位／ｍｌに希
釈した大腸菌のＬ−アスパラギナーゼ標品を用いる系を
設け、上記と同様に処置した後、遊離したＬ−アスパラ
ギン酸を同様に測定し、その測定値に基づき検量線を作
成する。被検試料の系で測定されたＬ−アスパラギン酸
の量をこの検量線に内挿し、被検試料の活性値を推定す
る。Ｌ−アスパラギナーゼの１単位とは、上記条件下で
反応させたとき、１分間にＬ−アスパラギンからアンモ
ニアを１μｍｏｌ遊離するＬ−アスパラギナーゼ活性ポ
リペプチドの量と定義する。

【００２３】

【実施例２ モルモットのＬ−アスパラギナーゼの部分
アミノ酸配列】実施例１で調製した精製Ｌ−アスパラギ
ナーゼを含む水溶液の一部をとり、約５０μｌまで濃縮
した。濃縮物に３％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、６０％（ｗ／
ｖ）グリセロール及びジチオトレイトール６０ｍｇ／ｍ
ｌからなる混液２５μｌを加え、５０℃で３０分間イン
キュベートした後、１０％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミ
ドゲル上に移し、常法にしたがって電気泳動した。ゲル
を０．１％（ｗ／ｖ）クーマシーブリリアントブルーＲ
２５０及び１０％（ｖ／ｖ）酢酸を含む５０％（ｖ／
ｖ）水性メタノールに浸漬して発色させ、７％（ｖ／
ｖ）酢酸を含む１２％（ｖ／ｖ）水性メタノールにより
繰返し濯いで脱色し、蒸留水に１８時間浸漬して洗浄
後、ゲルより染色部分を切出し、凍結乾燥した。

【００２４】乾燥ゲルをシグマ製トリプシン剤『ＴＰＣ
Ｋトリプシン』２μｇ／ｍｌを含む１００ｍＭ炭酸水素
ナトリウム、０．５ｍＭ塩化カルシウム及び０．０２％
（ｖ／ｖ）ツイーン２０水溶液からなる混液０．６ｍｌ
に浸漬し、３７℃で１８時間インキュベートしてＬ−ア
スパラギナーゼをトリプシン消化した。消化物を遠心分
離して上清を採取する一方、沈澱部を０．００１％（ｖ
／ｖ）ツイーン２０を含む１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ
酢酸水溶液１ｍｌに浸漬し、室温下で４時間振盪した
後、遠心分離して上清を採取した。新たに生じた沈澱
を、先ず、０．００１％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含む
７０％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液で、次に、
０．００１％（ｖ／ｖ）ツイーン２０及び５０％（ｖ／
ｖ）トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル溶液で、順
次、上記と同様に処理し、得られた上清と上記で得られ
た上清をプールし、２５０μｌまで濃縮後、遠心瀘過し
た。

【００２５】斯くして得られたペプチド断片を含む水溶
液を、予め０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液
により平衡化しておいた東ソー製高速液体クロマトグラ
フィー用カラム『ＨＰＬＣ ＯＤＳ−１２０Ｔ』に負荷
し、カラムを０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶
液で洗浄後、溶出液中のポリペプチド濃度を吸光光度計
により２１４ｎｍ及び２８０ｎｍの波長下でモニタしな
がら、０％（ｖ／ｖ）から７０％（ｖ／ｖ）に上昇する
水性アセトニトリルの濃度勾配下、カラムに０．１％
（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液を０．５ｍｌ／分の
流速で通液した。そして、通液開始から約６６分後、約
６９分後及び約７２分後に溶出した画分（以下、それぞ
れ『ペプチド断片Ａ』、『ペプチド断片Ｂ』、『ペプチ
ド断片Ｃ』と言う。）を別々に採取した。このときの溶
出パターンを図１に示す。

【００２６】パーキン・エルマー製プロテイン・シーケ
ンサ『４７３Ａ型』を使用し、常法にしたがってこれら
ペプチド断片Ａ、Ｂ及びＣのアミノ酸配列を調べたとこ
ろ、それぞれ、配列表における配列番号７乃至９に示す
アミノ酸配列を有していた。

【００２７】

【実施例３ モルモットのＬ−アスパラギナーゼの全ア
ミノ酸配列とそれをコードするＤＮＡの塩基配列】

【００２８】

【実施例３−１ 全ＲＮＡの調製】常法にしたがって調
製したモルモットの肝細胞を湿重量で３ｇとり、１０ｍ
Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）及び０．５％（ｗ
／ｖ）ＳＤＳを含む６Ｍグアニジンイソチオシアネート
水溶液２０ｍｌに浮遊させ、ホモジナイザにより破砕し
た。３５ｍｌ容遠心管に５．７Ｍ塩化セシウムと０．１
Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）の混液２５ｍｌを注入し、
その上に細胞破砕物を重層し、２５，０００ｒｐｍ、２
０℃で２０時間遠心分離した。遠心管からＲＮＡを含む
画分を採取し、１５ｍｌ容遠心管に移し、等容量のクロ
ロホルム／ブタノール混液（混合比４：１）を加え、５
分間振盪した後、１０，０００ｇ、４℃で１０分間遠心
分離し、水層部を採取し、２．５倍容のエタノールを加
え、−２０℃で２時間静置して全ＲＮＡを沈澱させた。
沈澱部を７５％（ｖ／ｖ）エタノールで洗浄し、乾燥し
たところ、全ＲＮＡが約４ｍｇ得られた。

【００２９】

【実施例３−２ モルモットのＬ−アスパラギナーゼを
部分コードするＤＮＡ断片の調製】実施例３−１で調製
した全ＲＮＡ １μｇに２５ｍＭ塩化マグネシウムを４
μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液（１００ｍＭトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ８．３）、５００ｍＭ塩化カリウム）を２μ
ｌ、１ｍＭ ｄＮＴＰミックスを８μｌ、１単位／μｌ
ＲＮａｓｅ阻害剤を１μｌ、２．５単位／μｌ逆転写
酵素を１μｌ及び２．５μＭランダムヘキサマーを１μ
ｌ加え、滅菌蒸留水で２０μｌとした。常法により、混
合物を０．５ｍｌ容反応管中、２５℃で１０分間、４２
℃で３０分間、９９℃で５分間、５℃で５分間インキュ
ベートして逆転写酵素反応させ、第一ストランドｃＤＮ
Ａを含む水溶液を得た。

【００３０】第一ストランドｃＤＮＡ水溶液２０μｌと
２５ｍＭ塩化マグネシウムを４μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝
液（１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５
００ｍＭ塩化カリウム）を８μｌ、２．５単位／μｌア
ンプリタックＤＮＡポリメラーゼを０．５μｌ、さら
に、センスプライマー又はアンチセンスプライマーとし
てプライマー１及びプライマー２をそれぞれ１ｐｍｏｌ
ずつ加え、滅菌蒸留水で１００μｌとした。常法によ
り、混合物を９４℃で１分間、４２℃で２分間、７２℃
で３分間のサイクルで４０回繰返し反応させ、第一スト
ランドｃＤＮＡを鋳型にモルモットのＬ−アスパラギナ
ーゼを部分コードするＤＮＡ断片を増幅した。なお、プ
ライマー１及びプライマー２は、配列表の配列番号８又
は７におけるＧｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ
又はＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ
で表されるアミノ酸配列に基づき化学合成したオリゴヌ
クレオチドであり、それぞれ、５´−ＧＧＮＡＴＧＣＡ
ＲＷＳＮＡＡＲ−３´又は５´−ＧＣＮＧＧＤＡＴＮＣ
ＣＮＧＧＲＴＡ−３´で表される塩基配列を有してい
た。

【００３１】斯くして得られたＰＣＲ産物の一部をと
り、常法にしたがって２％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上
で電気泳動して分画後、０．４Ｎ水酸化ナトリウムによ
り加圧ブロットしてＤＮＡをナイロン膜上に転写し、固
定した。ナイロン膜を２×ＳＳＣで洗浄し、風乾後、５
×ＳＳＰＥ、５×デンハルト液、０．５％（ｗ／ｖ）Ｓ
ＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含むプ
レハイブリダイゼーション混液に浸漬し、６５℃で３時
間インキュベートした。別途、プローブ１として、配列
表の配列番号９におけるＰｈｅ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
ｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕで表されるアミノ酸配列に基づき５
´−ＴＴＹＡＴＧＹＴＮＧＡＲＡＡＹＹＴ−３´で表さ
れる塩基配のオリゴヌクレオチドを化学合成し、［γ−
³²Ｐ］ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより同
位体標識した。そして、プローブ１を１ｐｍｏｌ、５×
ＳＳＰＥ、５×デンハルト液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤ
Ｓ及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む混液
にナイロン膜を浸漬し、４２℃で２４時間インキュベー
トしてハイブリダイズさせ、室温下でナイロン膜を６×
ＳＳＣにより洗浄した後、常法にしたがってオートラジ
オグラフィーしたところ、目的とするＤＮＡ断片がＰＣ
Ｒ産物に含まれていた。

【００３２】残りのＰＣＲ産物にノバジェン製プラスミ
ドベクター『ｐＴ７ブルーＴ』５０ｎｇと適量のＴ４
ＤＮＡリガーゼを加え、さらに、１００ｍＭ ＡＴＰを
最終濃度１ｍＭまで加えた後、１６℃で１８時間インキ
ュベートしてプラスミドベクターにＤＮＡ断片を挿入し
た。得られた組換えＤＮＡをコンピテントセル法により
ノバジェン製大腸菌『ＮｏＶａ Ｂｌｕｅ』株に導入し
て形質転換体とし、これを１０ｇ／ｌバクトトリプト
ン、５ｇ／ｌバクトイーストエキストラクト、２．５ｇ
／ｌ塩化ナトリウム、１５ｇ／ｌバクトアガー、１００
ｍｇ／ｌアンピシリン、４０ｍｇ／ｌ Ｘ−Ｇａｌ及び
２３．８ｍｇ／ｌイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクト
ピラノシド（以下、「ＩＰＴＧ」と略記する。）を含む
プレート培地に接種し、３７℃で２４時間培養してコロ
ニーを形成させた。常法にしたがってプレート培地にナ
イロン膜を載置し、約３０秒間静置してコロニーを移取
った後、ナイロン膜を剥離し、０．５Ｍ水酸化ナトリウ
ム及び１．５Ｍ塩化ナトリウムを含む混液に７分間浸漬
して溶菌した。その後、ナイロン膜を１．５Ｍ塩化ナト
リウムを含む０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．
２）に３分間浸漬し、２×ＳＳＣで洗浄後、０．４Ｍ水
酸化ナトリウムに２０分間浸漬し、５×ＳＳＣ中で洗浄
し、風乾後、５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト液、０．５
％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子
ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション混液に浸漬
し、４２℃で２４時間インキュベートした。その後、常
法にしたがってナイロン膜にプローブ１をハイブリダイ
ズさせ、６×ＳＳＣで洗浄後、前記と同様にオートラジ
オグラフィーし、プローブ１と顕著な会合を示した形質
転換体をプレート培地から採取した。

【００３３】この形質転換体をアンピシリン１００μｇ
／ｍｌを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に接種し、
３７℃で１８時間培養し、培養物から菌体を採取し、通
常のアリカリ−ＳＤＳ法により組換えＤＮＡを採取し
た。ジデオキシ法により調べたところ、この組換えＤＮ
Ａは配列表の配列番号５に示す塩基配列における第６１
乃至７４６番目に相当する塩基配列のＤＮＡ断片を含ん
でいた。

【００３４】

【実施例３−３ ｍＲＮＡの調製】実施例３−１で調製
した全ＲＮＡを５００μｇ含む水溶液を０．０５ｍｌと
り、これに１ｍＭ二ナトリウム−ＥＤＴＡと０．１％
（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）を０．５ｍｌ加えて全量を１ｍｌとし
た。混合物に日本ロシュ製オリゴ（ｄＴ）₃₀ラテックス
『オリゴテックス−ｄＴ３０スーパ−』を１ｍｌ加え、
６５℃で５分間加熱して変性させた後、直ちに氷浴中で
３分間冷却した。５Ｍ塩化ナトリウムを０．２ｍｌ加
え、３７℃で１０分間インキュベートし、２５℃、１
０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を除いて
得られたペレット状の沈澱に滅菌蒸留水０．５ｍｌを加
えて懸濁させ、６５℃で５分間インキュベートしてオリ
ゴテックスからｍＲＮＡを溶出させた。回収したｍＲＮ
Ａは約５μｇであった。

【００３５】

【実施例３−４ ｃＤＮＡライブラリーの作製】アマシ
ャム製ｃＤＮＡクローニングキット『ｃＤＮＡ合成シス
テム・プラス』を使用し、実施例３−３で調製したｍＲ
ＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製した。すなわち、
１．５ｍｌ容反応管に第一ストランド合成用溶液４μ
ｌ、ピロリン酸ナトリウム溶液１μｌ、ヒト胎盤リボヌ
クレアーゼインヒビター１μｌ、デオキシヌクレオチド
三燐酸混合液２μｌ及びオリゴｄＴプライマー１μｌを
順次加え、実施例３−３で調製したｍＲＮＡを５μｇ加
えた後、滅菌蒸留水で１９μｌとした。混合物に逆転写
酵素２０単位を含む溶液１μｌを加え、４２℃で４０分
間インキュベートして第一ストランドｃＤＮＡを含む反
応物を得た。

【００３６】反応物に第二ストランドｃＤＮＡ合成用溶
液３７．５μｌ、大腸菌リボヌクレアーゼＨを０．８単
位、ＤＮＡポリメラーゼＩを２３単位この順序で加え、
滅菌蒸留水で１００μｌとした後、１２℃で６０分間、
２２℃で６０分間インキュベートし、Ｔ４ ＤＮＡポリ
メラーゼを２単位を加え、３７℃でさらに１０分間イン
キュベートして第二ストランドｃＤＮＡを含む溶液を得
た。反応物に０．２５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を４
μｌ加えて反応を停止させた後、常法によりフェノール
／クロロホルム抽出し、エタノール沈澱させてｃＤＮＡ
を採取した。

【００３７】このようにして得たｃＤＮＡにＬ／Ｋ緩衝
液を２μｌ、さらにＥｃｏ ＲＩアダプターを２５０ｐ
ｍｏｌ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを２．５単位この順序で
加え、滅菌蒸留水で２０μｌとした後、１５℃で１６時
間インキュベートしてｃＤＮＡ両端にＥｃｏ ＲＩアダ
プターを連結した。反応物に０．２５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐ
Ｈ８．０）を２μｌ加えて酵素を失活させ、常法により
分子篩クロマトグラフィーにより未反応のＥｃｏ ＲＩ
アダプターを除去し、Ｌ／Ｋ緩衝液を４０μｌとＴ４ポ
リヌクレオチドキナ−ゼを８０単位加え、滅菌蒸留水で
４００μｌとし、３７℃で３０分間インキュベートして
Ｅｃｏ ＲＩアダプターの５´末端を燐酸化した後、反
応物をフェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈
澱してＤＮＡを採取した。ＤＮＡに適量のλｇｔ１０ア
ームを含むＬ／Ｋ緩衝液を１．５μｌとＴ４ ＤＮＡリ
ガーゼを２．５単位加え、滅菌蒸留水で全量を１５μｌ
とし、１５℃で１６時間インキュベートした後、通常の
生体外パッケージングを適用して組換えλＤＮＡを含む
ファージを得た。

【００３８】

【実施例３−５ 組換えＤＮＡのクローニング】アマシ
ャム製大腸菌ＮＭ５１４株に実施例３−４で調製したフ
ァージを常法により感染させた後、１０ｇ／ｌバクトト
リプトン、５ｇ／ｌバクトイーストエキストラクト、１
０ｇ／ｌ塩化ナトリウム及び１５ｇ／ｌバクトアガーを
含む寒天倍地（ｐＨ７．０）に接種し、３７℃で１０時
間培養してプラークを形成させた。寒天培地にナイロン
膜を載置し、約３０秒間静置してプラークを移取り、剥
離した後、先ず、０．５Ｍ水酸化ナトリウムと１．５Ｍ
塩化ナトリウムを含む水溶液に７分間、次に、１．５Ｍ
塩化ナトリウムを含む０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）に３分間浸漬する操作を繰返した。ナイロン
膜を２×ＳＳＣで濯ぎ、風乾し、０．４Ｎ水酸化ナトリ
ウムに２０分間浸漬し、５×ＳＳＣでさらに濯ぎ、風乾
後、５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト液、０．５％（ｗ／
ｖ）ＳＤＳ及びサケ精子ＤＮＡを１００μｇ／ｍｌ含む
混液に浸漬し、６５℃で３時間インキュベートした。別
途、実施例３−２で調製したＤＮＡ断片をアマシャム製
ＤＮＡ標識キット『レディ・プライムＤＮＡ標識システ
ム』により³²Ｐ標識してプローブ２とし、その適量と５
×ＳＳＰＥ、５×デンハルト液、０．５％（ｗ／ｖ）Ｓ
ＤＳ及びサケ精子ＤＮＡを１００μｇ／ｍｌ含む混液
中、６５℃で２０時間インキュベートしてハイブリダイ
ズさせた。ナイロン膜を２×ＳＳＣ中、６５℃で２０分
間、０．２×ＳＳＣ中、６５℃で２０分間濯いだ後、オ
ートラジオグラフィーして、プローブ２に顕著な会合を
示したファージＤＮＡクローンを採取した。

【００３９】常法にしたがってこのクローンを大腸菌中
で増幅し、菌体から組換えＤＮＡを抽出した。組換えＤ
ＮＡを制限酵素Ｅｃｏ ＲＩで切断する一方、プラスミ
ドベクターｐＵＣ１９（ＡＴＣＣ３７２５４）を同じ制
限酵素で切断し、得られたＤＮＡ断片とプラスミド断片
を常法によりＤＮＡリガーゼで連結して組換えＤＮＡと
した。そして、この組換えＤＮＡを通常のコンピテント
セル法により大腸菌ＪＭ１０９株（ＡＴＣＣ５３３２
３）に導入し、形質転換体を得た。

【００４０】

【実施例３−６ ＤＮＡの塩基配列と蛋白質のアミノ酸
配列の決定】実施例３−５で調製した形質転換体をアン
ピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ
７．２）に接種し、３７℃で１８時間振盪培養した。培
養物から形質転換体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ
法により処理してこの発明のＤＮＡを含む組換えＤＮＡ
を得た。蛍光光度計を使用する自動シーケンサにより分
析したところ、この組換えＤＮＡは配列表における配列
番号１０に示す塩基配列を含んでなり、解読したとこ
ろ、同じく配列番号１０に示すアミノ酸配列をコードし
ていることが示唆された。このアミノ酸配列において
は、その第１０乃至２５番目又は第２４３乃至２５３番
目に配列表における配列番号８及び７に示す部分アミノ
酸配列が含まれており、このことは、配列番号３のアミ
ノ酸配列を有するモルモットのＬ−アスパラギナーゼが
配列番号５に示す塩基配列のＤＮＡによりコードされて
いることを示している。

【００４１】次の実施例４では、配列表における配列番
号５に示す塩基配列のＤＮＡ断片をプローブに使用し、
ヒトの肝臓から採取したｍＲＮＡからヒトのＬ−アスパ
ラギナーゼをコードするｃＤＮＡを採取する。そして、
そのｃＤＮＡの塩基配列を決定し、解読して、ヒトのＬ
−アスパラギナーゼの全アミノ酸配列を決定する。

【００４２】

【実施例４ ヒトのＬ−アスパラギナーゼの全アミノ酸
配列とそれをコードするＤＮＡの塩基配列】

【００４３】

【実施例４−１ ｃＤＮＡライブラリーの作製】アマシ
ャム社製ｃＤＮＡクローニングキット『ｃＤＮＡ合成シ
ステム・プラス』を使用し、クローンテック製ポリ
（Ａ）付加ヒト肝臓ＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを
作製した。すなわち、１．５ｍｌ容反応管に第一ストラ
ンド合成用溶液１０μｌ、１ｍＭピロリン酸ナトリウム
溶液２．５μｌ、１μｇ／μｌヒト胎盤リボヌクレアー
ゼインヒビター２．５μｌ、１μｇ／μｌデオキシヌク
レオチド三燐酸混合液５μｌ及び１μｇ／μｌオリゴｄ
Ｔプライマーを２．５μｌとり、ポリ（Ａ）付加ヒト肝
臓ＲＮＡを５μｇ加え、滅菌蒸留水で４５μｌとした
後、逆転写酵素１００単位を含む溶液を５μｌ加え、４
２℃で４０分間インキュベートして第一ストランドｃＤ
ＮＡを含む反応物を得た。

【００４４】反応物に第二ストランドｃＤＮＡ合成用溶
液９３．５μｌ、大腸菌リボヌクレアーゼＨを４単位、
ＤＮＡポリメラーゼＩを１１５単位加え、滅菌蒸留水で
２５０μｌとし、１２℃で６０分間、２２℃で６０分
間、７０℃で１０分間この順序でインキュベートした
後、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを１０単位加え、３７℃
でさらに１０分間インキュベートした。０．２５Ｍ Ｅ
ＤＴＡ（ｐＨ８．０）を１０μｌ加えて反応を停止させ
た後、反応物を常法にしたがってフェノール／クロロホ
ルム抽出し、抽出物をエタノール沈澱させて第二ストラ
ンドｃＤＮＡを得た。

【００４５】このようにして得た第二ストランドｃＤＮ
ＡにＬ／Ｋ緩衝液（ｐＨ８．０）を２μｌ、Ｅｃｏ Ｒ
Ｉアダプターを２５０ｐｍｏｌ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
を２．５単加え、滅菌蒸留水で２０μｌとし、１５℃で
１６時間インキュベートしてｃＤＮＡの両端にＥｃｏ
ＲＩアダプターを連結した後、０．２５Ｍ ＥＤＴＡ
（ｐＨ８．０）を２μｌを加えて反応を停止させた。分
子篩クロマトグラフィーにより反応物から未反応のＥｃ
ｏ ＲＩアダプターを除去し、Ｌ／Ｋ緩衝液 （ｐＨ
８．０）を４０μｌとＴ４ポリヌクレオチドキナ−ゼを
８０単位加え、滅菌蒸留水で４００μｌとし、３７℃で
３０分間インキュベートしてＥｃｏ ＲＩアダプターの
５´末端を燐酸化した後、フェノール／クロロホルム抽
出し、抽出物をエタノール沈澱してｃＤＮＡを採取し
た。その後、ｃＤＮＡに適量のλｇｔ１０アームを含む
Ｌ／Ｋ緩衝液（ｐＨ８．０）を１．５μｌとＴ４ ＤＮ
Ａリガーゼを２．５単位加え、滅菌蒸留水で１５μｌと
し、１５℃で１６時間インキュベートした後、通常の生
体外パッケージングを適用して組換えλＤＮＡを含むフ
ァージを得た。

【００４６】

【実施例４−２ 組換えＤＮＡのクローニング】常法に
より、大腸菌ＮＭ５１４株に実施例４−１で調製したフ
ァージを感染させた後、１０ｇ／ｌバクトトリプトン、
５ｇ／ｌバクトイーストエキストラクト、１０ｇ／ｌ塩
化ナトリウム及び１５ｇ／ｌバクトアガーを含む寒天倍
地（ｐＨ７．０）に接種し、３７℃で１０時間培養して
プラークを形成させた。寒天培地にナイロン膜を載置
し、約３０秒間静置してプラークを移取り、剥離した
後、先ず、０．５Ｍ水酸化ナトリウム及び１．５Ｍ塩化
ナトリウムを含む水溶液に７分間、次に、１．５Ｍ塩化
ナトリウムを含む０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７．０）に３分間浸漬する操作を繰返した。ナイロン膜
を２×ＳＳＣで濯ぎ、風乾し、０．４Ｎ水酸化ナトリウ
ムに２０分間浸漬し、５×ＳＳＣでさらに濯ぎ、風乾
後、５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト液、０．５％（ｗ／
ｖ）ＳＤＳ及びサケ精子ＤＮＡを１００μｇ／ｍｌ含む
混液に浸漬し、６５℃で３時間インキュベートした。

【００４７】組換えＤＮＡをクローニングすべく、別
途、アマシャム製ＤＮＡ標識キット『レディ・プライム
ＤＮＡ標識システム』を使用し、配列表における配列番
号５に示す塩基配列のＤＮＡ断片を同位体標識してプロ
ーブ３を調製した。すなわち、１．５ｍｌ容反応管に実
施例３−５の方法により得たＤＮＡ断片を２５ｎｇと
り、滅菌蒸留水で４５μｌとし、９５℃で３分間加熱し
た後、反応管にとり、［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰ溶液を５μ
ｌ加え、３７℃で３０分間インキュベートして同位体標
識した。その後、同位体標識したＤＮＡ断片を含む反応
物に通常の分子篩クロマトグラフィーを適用し、未反応
の［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰを除去してプローブ３を得た。

【００４８】次に、前記ナイロン膜をプローブ３の適量
と５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト液、０．５％（ｗ／
ｖ）ＳＤＳ及びサケ精子ＤＮＡを１００μｇ／ｍｌ含む
混液中、５０℃で２０時間インキュベートしてハイブリ
ダイズさせた後、６×ＳＳＣ中、室温下で２０分間、２
×ＳＳＣ中、室温下でさらに２０分間インキュベート
し、洗浄し、オートラジオグラフィーして、プローブ３
に顕著な会合を示したファージＤＮＡクローンを採取し
た。常法によりこのクローンを大腸菌中で増幅し、菌体
から組換えＤＮＡを抽出した。組換えＤＮＡを制限酵素
Ｅｃｏ ＲＩで切断する一方、プラスミドベクターｐＵ
Ｃ１９（ＡＴＣＣ３７２５４）を同じ制限酵素で切断
し、得られたＤＮＡ断片とプラスミド断片を常法により
ＤＮＡリガーゼで連結して組換えＤＮＡとした。そし
て、この組換えＤＮＡを通常のコンピテントセル法によ
り大腸菌ＪＭ１０９株（ＡＴＣＣ５３３２３）に導入
し、形質転換体を得た。

【００４９】

【実施例４−３ ヒトのＬ−アスパラギナーゼをコード
するＤＮＡの塩基配列と全アミノ酸配列の決定】実施例
４−２で調製した形質転換体をアンピシリン５０μｇ／
ｍｌを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に接種し、３
７℃で１８時間振盪培養した。培養物から形質転換体を
採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法により処理してこの
発明のＤＮＡを含む組換えＤＮＡを得た。蛍光光度計を
使用する自動シーケンサにより分析したところ、この組
換えＤＮＡは配列表における配列番号１１に示す塩基配
列を含んでいた。この塩基配列から推定されるアミノ酸
配列は、その配列番号１１に併記したとおりであり、こ
のことは、配列表における配列番号４のアミノ酸配列を
有するヒトのＬ−アスパラギナーゼが配列番号６に示す
塩基配列のＤＮＡによりコードされていることを示唆し
ている。また、配列表における配列番号３及び４に示す
アミノ酸配列を比較すると、約７０％の相同性のあるこ
とが判明した。

【００５０】

【発明の効果】叙上のとおり、この発明は、哺乳類のＬ
−アスパラギナーゼをコードする新規なＤＮＡの発見に
基づくものである。この発明のＤＮＡに組換えＤＮＡ技
術を適用することにより、従来、入手困難であったヒト
を含む哺乳類のＬ−アスパラギナーゼの所望量を容易に
入手できることとなる。

【００５１】斯くも顕著な作用効果を発揮するこの発明
は、斯界に貢献すること誠に多大な、意義のある発明と
言える。

【００５２】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：4 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Gly Gly Thr 1

【００５３】配列番号：2 配列の長さ：5 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 His Gly Thr Asp Thr 1 5

【００５４】配列番号：3 配列の長さ：565 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ポリペプチド 配列 Met Ala Arg Ala Ser Gly Ser Glu Arg His Leu Leu Leu Ile Tyr Thr Gly 1 5 10 15 Gly Thr Leu Gly Met Gln Ser Lys Gly Gly Val Leu Val Pro Gly Pro Gly 20 25 30 Leu Val Thr Leu Leu Arg Thr Leu Pro Met Phe His Asp Lys Glu Phe Ala 35 40 45 50 Gln Ala Gln Gly Leu Pro Asp His Ala Leu Ala Leu Pro Pro Ala Ser His 55 60 65 Gly Pro Arg Val Leu Tyr Thr Val Leu Glu Cys Gln Pro Leu Leu Asp Ser 70 75 80 85 Ser Asp Met Thr Ile Asp Asp Trp Ile Arg Ile Ala Lys Ile Ile Glu Arg 90 95 100 His Tyr Glu Gln Tyr Gln Gly Phe Val Val Ile His Gly Thr Asp Thr Met 105 110 115 Ala Phe Gly Ala Ser Met Leu Ser Phe Met Leu Glu Asn Leu His Lys Pro 120 125 130 135 Val Ile Leu Thr Gly Ala Gln Val Pro Ile Arg Val Leu Trp Asn Asp Ala 140 145 150 Arg Glu Asn Leu Leu Gly Ala Leu Leu Val Ala Gly Gln Tyr Ile Ile Pro 155 160 165 170 Glu Val Cys Leu Phe Met Asn Ser Gln Leu Phe Arg Gly Asn Arg Val Thr 175 180 185 Lys Val Asp Ser Gln Lys Phe Glu Ala Phe Cys Ser Pro Asn Leu Ser Pro 190 195 200 Leu Ala Thr Val Gly Ala Asp Val Thr Ile Ala Trp Asp Leu Val Arg Lys 205 210 215 220 Val Asn Trp Lys Asp Pro Leu Val Val His Ser Asn Met Glu His Asp Val 225 230 235 Ala Leu Leu Arg Leu Tyr Pro Gly Ile Pro Ala Ser Leu Val Arg Ala Phe 240 245 250 255 Leu Gln Pro Pro Leu Lys Gly Val Val Leu Glu Thr Phe Gly Ser Gly Asn 260 265 270 Gly Pro Ser Lys Pro Asp Leu Leu Gln Glu Leu Arg Ala Ala Ala Gln Arg 275 280 285 Gly Leu Ile Met Val Asn Cys Ser Gln Cys Leu Arg Gly Ser Val Thr Pro 290 295 300 305 Gly Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Gly Ala Asn Ile Val Ser Gly Leu Asp Met 310 315 320 Thr Ser Glu Ala Ala Leu Ala Lys Leu Ser Tyr Val Leu Gly Leu Pro Glu 325 330 335 340 Leu Ser Leu Glu Arg Arg Gln Glu Leu Leu Ala Lys Asp Leu Arg Gly Glu 345 350 355 Met Thr Leu Pro Thr Ala Asp Leu His Gln Ser Ser Pro Pro Gly Ser Thr 360 365 370 Leu Gly Gln Gly Val Ala Arg Leu Phe Ser Leu Phe Gly Cys Gln Glu Glu 375 380 385 390 Asp Ser Val Gln Asp Ala Val Met Pro Ser Leu Ala Leu Ala Leu Ala His 395 400 405 Ala Gly Glu Leu Glu Ala Leu Gln Ala Leu Met Glu Leu Gly Ser Asp Leu 410 415 420 425 Arg Leu Lys Asp Ser Asn Gly Gln Thr Leu Leu His Val Ala Ala Arg Asn 430 435 440 Gly Arg Asp Gly Val Val Thr Met Leu Leu His Arg Gly Met Asp Val Asn 445 450 455 Ala Arg Asp Arg Asp Gly Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ala Val Gln Gly Arg 460 465 470 475 His Arg Glu Cys Ile Arg Leu Leu Arg Lys Ala Gly Ala Cys Leu Ser Pro 480 485 490 Gln Asp Leu Lys Asp Ala Gly Thr Glu Leu Cys Arg Leu Ala Ser Arg Ala 495 500 505 510 Asp Met Glu Gly Leu Gln Ala Trp Gly Gln Ala Gly Ala Asp Leu Gln Gln 515 520 525 Pro Gly Tyr Asp Gly Arg Ser Ala Leu Cys Val Ala Glu Ala Ala Gly Asn 530 535 540 Gln Glu Val Leu Ala Leu Leu Arg Asn Leu Ala Leu Val Gly Pro Glu Val 545 550 555 560 Pro Pro Ala Ile 565

【００５５】配列番号：4 配列の長さ：573 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ポリペプチド 配列 Met Ala Arg Ala Val Gly Pro Glu Arg Arg Leu Leu Ala Val Tyr Thr Gly 1 5 10 15 Gly Thr Ile Gly Met Arg Ser Glu Leu Gly Val Leu Val Pro Gly Thr Gly 20 25 30 Leu Ala Ala Ile Leu Arg Thr Leu Pro Met Phe His Asp Glu Glu His Ala 35 40 45 50 Arg Ala Arg Gly Leu Ser Glu Asp Thr Leu Val Leu Pro Pro Asp Ser Arg 55 60 65 Asn Gln Arg Ile Leu Tyr Thr Val Leu Glu Cys Gln Pro Leu Phe Asp Ser 70 75 80 85 Ser Asp Met Thr Ile Ala Glu Trp Val Arg Val Ala Gln Thr Ile Lys Arg 90 95 100 His Tyr Glu Gln Tyr His Gly Phe Val Val Ile His Gly Thr Asp Thr Met 105 110 115 Ala Phe Ala Ala Ser Met Leu Ser Phe Met Leu Glu Asn Leu Gln Lys Thr 120 125 130 135 Val Ile Leu Thr Gly Ala Gln Val Pro Ile His Ala Leu Trp Ser Asp Gly 140 145 150 Arg Glu Asn Leu Leu Gly Ala Leu Leu Met Ala Gly Gln Tyr Val Ile Pro 155 160 165 170 Glu Val Cys Leu Phe Phe Gln Asn Gln Leu Phe Arg Gly Asn Arg Ala Thr 175 180 185 Lys Val Asp Ala Arg Arg Phe Ala Ala Phe Cys Ser Pro Asn Leu Leu Pro 190 195 200 Leu Ala Thr Val Gly Ala Asp Ile Thr Ile Asn Arg Glu Leu Val Arg Lys 205 210 215 220 Val Asp Gly Lys Ala Gly Leu Val Val His Ser Ser Met Glu Gln Asp Val 225 230 235 Gly Leu Leu Arg Leu Tyr Pro Gly Ile Pro Ala Ala Leu Val Arg Ala Phe 240 245 250 255 Leu Gln Pro Pro Leu Lys Gly Val Val Met Glu Thr Phe Gly Ser Gly Asn 260 265 270 Gly Pro Thr Lys Pro Asp Leu Leu Gln Glu Leu Arg Val Ala Thr Glu Arg 275 280 285 Gly Leu Val Ile Val Asn Cys Thr His Cys Leu Gln Gly Ala Val Thr Thr 290 295 300 305 Asp Tyr Ala Ala Gly Met Ala Met Ala Gly Ala Gly Val Ile Ser Gly Phe 310 315 320 Asp Met Thr Ser Glu Ala Ala Leu Ala Lys Leu Ser Tyr Val Leu Gly Gln 325 330 335 340 Pro Gly Leu Ser Leu Asp Val Arg Lys Glu Leu Leu Thr Lys Asp Leu Arg 345 350 355 Gly Glu Met Thr Pro Pro Ser Val Glu Glu Arg Arg Pro Ser Leu Gln Gly 360 365 370 Asn Thr Leu Gly Gly Gly Val Ser Trp Leu Leu Ser Leu Ser Gly Ser Gln 375 380 385 390 Glu Ala Asp Ala Leu Arg Asn Ala Leu Val Pro Ser Leu Ala Cys Ala Ala 395 400 405 Ala His Ala Gly Asp Val Glu Ala Leu Gln Ala Leu Val Glu Leu Gly Ser 410 415 420 425 Asp Leu Gly Leu Val Asp Phe Asn Gly Gln Thr Pro Leu His Ala Ala Ala 430 435 440 Arg Gly Gly His Thr Glu Ala Val Thr Met Leu Leu Gln Arg Gly Val Asp 445 450 455 Val Asn Thr Arg Asp Thr Asp Gly Phe Ser Pro Leu Leu Leu Ala Val Arg 460 465 470 475 Gly Arg His Pro Gly Val Ile Gly Leu Leu Arg Glu Ala Gly Ala Ser Leu 480 485 490 Ser Thr Gln Glu Leu Glu Glu Ala Gly Thr Glu Leu Cys Arg Leu Ala Tyr 495 500 505 510 Arg Ala Asp Leu Glu Gly Leu Gln Val Trp Trp Gln Ala Gly Ala Asp Leu 515 520 525 Gly Gln Pro Gly Tyr Asp Gly His Ser Ala Leu His Val Ala Glu Ala Ala 530 535 540 Gly Asn Leu Ala Val Val Ala Phe Leu Gln Ser Leu Glu Gly Ala Val Gly 545 550 555 560 Ala Gln Ala Pro Cys Pro Glu Val Leu Pro Gly Val 565 570

【００５６】配列番号：5 配列の長さ：1695 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列 ATGGCGCGCG CATCAGGCTC CGAGAGGCAC CTGCTGCTCA TCTACACTGG CGGCACTTTG 60 GGCATGCAGA GCAAGGGCGG GGTGCTCGTC CCCGGCCCAG GCCTGGTCAC TCTGCTGCGG 120 ACCCTGCCCA TGTTCCATGA CAAGGAGTTC GCCCAGGCCC AGGGCCTCCC TGACCATGCT 180 CTGGCGCTGC CCCCTGCCAG CCACGGCCCC AGGGTCCTCT ACACGGTGCT GGAGTGCCAG 240 CCCCTCTTGG ATTCCAGCGA CATGACCATC GATGATTGGA TTCGCATAGC CAAGATCATA 300 GAGAGGCACT ATGAGCAGTA CCAAGGCTTT GTGGTTATCC ACGGCACCGA CACCATGGCC 360 TTTGGGGGCT CCATGCTGTC CTTCATGCTG GAAAACCTGC ACAAACCAGT CATCCTCACT 420 GGCGCCCAGG TGCCAATCCG TGTGCTGTGG AATGACGCCC GGGAAAACCT GCTGGGGGCG 480 TTGCTTGTGG CCGGCCAATA CATCATCCCT GAGGTCTGCC TGTTTATGAA CAGTCAGCTG 540 TTTCGGGGAA ACCGGGTAAC CAAGGTGGAC TCCCAGAAGT TTGAGGCCTT CTGCTCCCCC 600 AATCTGTCCC CACTAGCCAC TGTGGGCGCG GATGTCACAA TTGCCTGGGA CCTGGTGCGC 660 AAGGTCAACT GGAAGGACCC GCTGGTGGTG CACAGCAACA TGGAGCACGA CGTGGCACTG 720 CTGCGCCTCT ACCCTGGCAT CCCGGCCTCC CTGGTCCGGG CATTCCTGCA GCCCCCGCTC 780 AAGGGCGTGG TCCTGGAGAC CTTCGGCTCT GGCAACGGGC CGAGCAAGCC CGACCTGCTG 840 CAGGAGTTGC GGGCCGCGGC CCAGCGCGGC CTCATCATGG TCAACTGCAG CCAGTGCCTG 900 CGGGGGTCTG TGACCCCGGG CTATGCCACG AGCTTGGCGG GCGCCAACAT CGTGTCCGGC 960 TTAGACATGA CCTCAGAGGC CGCGCTGGCT AAGCTGTCCT ACGTGTTGGG CCTGCCGGAG 1020 CTGAGCCTGG AGCGCAGGCA GGAGCTGCTG GCCAAGGATC TTCGCGGGGA AATGACACTG 1080 CCCACGGCAG ACCTGCACCA GTCCTCTCCG CCGGGCAGCA CACTGGGGCA AGGTGTCGCC 1140 CGGCTCTTTA GTCTGTTCGG TTGCCAGGAG GAAGATTCGG TGCAGGACGC CGTGATGCCC 1200 AGCCTGGCCC TGGCCTTGGC CCATGCTGGT GAACTCGAGG CTCTGCAGGC ACTTATGGAG 1260 CTGGGCAGTG ACCTGCGCCT AAAGGACTCT AATGGCCAAA CCCTGTTGCA TGTGGCTGCT 1320 CGGAATGGGC GTGATGGCGT GGTCACCATG CTGCTGCACA GAGGCATGGA TGTCAATGCC 1380 CGAGACCGAG ACGGCCTCAG CCCACTGCTG TTGGCTGTAC AGGGCAGGCA TCGGGAATGC 1440 ATCAGGCTGC TGCGGAAGGC TGGGGCCTGC CTGTCCCCCC AGGACCTGAA GGATGCAGGG 1500 ACCGAGCTGT GCAGGCTGGC ATCCAGGGCT GACATGGAAG GCCTGCAGGC ATGGGGGCAG 1560 GCTGGGGCCG ACCTGCAGCA GCCGGGCTAT GATGGGCGCA GCGCTCTGTG TGTCGCAGAA 1620 GCAGCCGGGA ACCAGGAGGT GCTGGCCCTT CTGCGGAACC TGGCACTTGT AGGCCCGGAA 1680 GTGCCGCCTG CCATC 1695

【００５７】配列番号：6 配列の長さ：1719 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列 ATGGCGCGCG CGGTGGGGCC CGAGCGGAGG CTGCTGGCCG TCTACACCGG CGGCACCATT 60 GGCATGCGGA GTGAGCTCGG CGTGCTTGTG CCCGGGACGG GCCTGGCTGC CATCCTGAGG 120 ACACTGCCCA TGTTCCATGA CGAGGAGCAC GCCCGAGCCC GCGGCCTCTC TGAGGACACC 180 CTGGTGCTAC CCCCGGACAG CCGCAACCAG AGGATCCTCT ACACCGTGCT GGAGTGCCAG 240 CCCCTCTTCG ACTCCAGTGA CATGACCATC GCTGAGTGGG TTCGCGTTGC CCAGACCATC 300 AAGAGGCACT ACGAGCAGTA CCACGGCTTT GTGGTCATCC ACGGCACCGA CACCATGGCC 360 TTTGCTGCCT CGATGCTGTC CTTCATGCTG GAGAACCTGC AGAAGACTGT CATCCTCACT 420 GGGGCCCAGG TGCCCATCCA TGCCCTGTGG AGCGACGGCC GTGAGAACCT GCTGGGGGCA 480 CTGCTCATGG CTGGCCAGTA TGTGATCCCA GAGGTCTGCC TTTTCTTCCA GAATCAGCTG 540 TTTCGGGGCA ACCGGGCAAC CAAGGTAGAC GCTCGGAGGT TCGCAGCTTT CTGCTCCCCG 600 AACCTGCTGC CTCTGGCCAC AGTGGGTGCT GACATCACAA TCAACAGGGA GCTGGTGCGG 660 AAGGTGGACG GGAAGGCTGG GCTGGTGGTG CACAGCAGCA TGGAGCAGGA CGTGGGCCTG 720 CTGCGCCTCT ACCCTGGGAT CCCTGCCGCC CTGGTTCGGG CCTTCTTGCA GCCTCCCCTG 780 AAGGGCGTGG TCATGGAGAC CTTCGGTTCA GGGAACGGAC CCACCAAGCC CGACCTGCTG 840 CAGGAGCTGC GGGTGGCCAC CGAGCGCGGC CTGGTCATCG TCAACTGTAC CCACTGCCTC 900 CAGGGGGCTG TGACCACAGA CTATGCAGCT GGCATGGCCA TGGCGGGAGC CGGCGTCATC 960 TCAGGCTTCG ACATGACATC GGAGGCCGCC CTGGCCAAGC TATCGTATGT GCTGGGCCAG 1020 CCAGGGCTGA GCCTGGATGT CAGGAAGGAG CTGCTGACCA AGGACCTTCG GGGGGAGATG 1080 ACGCCACCCT CGGTGGAAGA GCGCCGGCCC TCACTGCAGG GCAACACGCT GGGCGGTGGG 1140 GTCTCCTGGC TCCTCAGTCT GAGCGGCAGC CAGGAGGCAG ATGCCCTGCG GAATGCCCTG 1200 GTGCCCAGCC TGGCCTGTGC TGCTGCCCAC GCCGGTGACG TGGAGGCGCT GCAGGCGCTT 1260 GTGGAGCTGG GCAGTGACCT GGGCCTGGTG GACTTTAACG GCCAAACCCC ACTGCACGCG 1320 GCCGCCCGGG GAGGCCACAC AGAGGCAGTC ACCATGCTGC TGCAGAGAGG TGTGGACGTG 1380 AACACCCGGG ACACGGATGG CTTCAGCCCG CTGCTGCTGG CCGTGCGGGG CAGGCATCCG 1440 GGTGTCATTG GGTTGCTGCG GGAAGCCGGG GCCTCCCTGT CCACCCAGGA GCTGGAGGAA 1500 GCAGGGACGG AGCTGTGCAG GCTGGCATAC AGGGCCGACC TCGAAGGCCT GCAGGTGTGG 1560 TGGCAGGCAG GGGCTGACCT GGGGCAGCCG GGCTATGACG GGCACAGCGC CCTGCACGTC 1620 GCAGAGGCAG CCGGGAACCT GGCAGTGGTG GCCTTTCTAC AGAGCCTGGA GGGTGCGGTT 1680 GGTGCCCAGG CCCCATGCCC AGAAGTGCTG CCTGGTGTC 1719

【００５８】配列番号：7 配列の長さ：11 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメントの種類：中間部フラグメント 配列 Leu Tyr Pro Gly Ile Pro Ala Ser Leu Val Arg 1 5 10

【００５９】配列番号：8 配列の長さ：16 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメントの種類：中間部フラグメント 配列 His Leu Leu Leu Ile Tyr Thr Gly Gly Thr Leu Gly Met Gln Ser Lys 1 5 10 15

【００６０】配列番号：9 配列の長さ：9 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメントの種類：中間部フラグメント 配列 Ser Phe Met Leu Glu Asn Leu His Lys 1 5

【００６１】配列番号：10 配列の長さ：1928 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA ハイポセティカル配列：No アンチセンス：No 起源 生物名：モルモット 組織の種類：肝臓 配列の特徴 特徴を表す記号：5'UTR 存在位置：1..19 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：20..1714 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：3'UTR 存在位置：1715..1928 特徴を決定した方法：S 配列 GAGTGGCTTA GCCGCAGGC 19 ATG GCG CGC GCA TCA GGC TCC GAG AGG CAC CTG CTG CTC ATC TAC ACT 67 Met Ala Arg Ala Ser Gly Ser Glu Arg His Leu Leu Leu Ile Tyr Thr 1 5 10 15 GGC GGC ACT TTG GGC ATG CAG AGC AAG GGC GGG GTG CTC GTC CCC GGC 115 Gly Gly Thr Leu Gly Met Gln Ser Lys Gly Gly Val Leu Val Pro Gly 20 25 30 CCA GGC CTG GTC ACT CTG CTG CGG ACC CTG CCC ATG TTC CAT GAC AAG 163 Pro Gly Leu Val Thr Leu Leu Arg Thr Leu Pro Met Phe His Asp Lys 35 40 45 GAG TTC GCC CAG GCC CAG GGC CTC CCT GAC CAT GCT CTG GCG CTG CCC 211 Glu Phe Ala Gln Ala Gln Gly Leu Pro Asp His Ala Leu Ala Leu Pro 50 55 60 CCT GCC AGC CAC GGC CCC AGG GTC CTC TAC ACG GTG CTG GAG TGC CAG 259 Pro Ala Ser His Gly Pro Arg Val Leu Tyr Thr Val Leu Glu Cys Gln 65 70 75 80 CCC CTC TTG GAT TCC AGC GAC ATG ACC ATC GAT GAT TGG ATT CGC ATA 307 Pro Leu Leu Asp Ser Ser Asp Met Thr Ile Asp Asp Trp Ile Arg Ile 85 90 95 GCC AAG ATC ATA GAG AGG CAC TAT GAG CAG TAC CAA GGC TTT GTG GTT 355 Ala Lys Ile Ile Glu Arg His Tyr Glu Gln Tyr Gln Gly Phe Val Val 100 105 110 ATC CAC GGC ACC GAC ACC ATG GCC TTT GGG GGC TCC ATG CTG TCC TTC 403 Ile His Gly Thr Asp Thr Met Ala Phe Gly Ala Ser Met Leu Ser Phe 115 120 125 ATG CTG GAA AAC CTG CAC AAA CCA GTC ATC CTC ACT GGC GCC CAG GTG 451 Met Leu Glu Asn Leu His Lys Pro Val Ile Leu Thr Gly Ala Gln Val 130 135 140 CCA ATC CGT GTG CTG TGG AAT GAC GCC CGG GAA AAC CTG CTG GGG GCG 499 Pro Ile Arg Val Leu Trp Asn Asp Ala Arg Glu Asn Leu Leu Gly Ala 145 150 155 160 TTG CTT GTG GCC GGC CAA TAC ATC ATC CCT GAG GTC TGC CTG TTT ATG 547 Leu Leu Val Ala Gly Gln Tyr Ile Ile Pro Glu Val Cys Leu Phe Met 165 170 175 AAC AGT CAG CTG TTT CGG GGA AAC CGG GTA ACC AAG GTG GAC TCC CAG 595 Asn Ser Gln Leu Phe Arg Gly Asn Arg Val Thr Lys Val Asp Ser Gln 180 185 190 AAG TTT GAG GCC TTC TGC TCC CCC AAT CTG TCC CCA CTA GCC ACT GTG 643 Lys Phe Glu Ala Phe Cys Ser Pro Asn Leu Ser Pro Leu Ala Thr Val 195 200 205 GGC GCG GAT GTC ACA ATT GCC TGG GAC CTG GTG CGC AAG GTC AAC TGG 691 Gly Ala Asp Val Thr Ile Ala Trp Asp Leu Val Arg Lys Val Asn Trp 210 215 220 AAG GAC CCG CTG GTG GTG CAC AGC AAC ATG GAG CAC GAC GTG GCA CTG 739 Lys Asp Pro Leu Val Val His Ser Asn Met Glu His Asp Val Ala Leu 225 230 235 240 CTG CGC CTC TAC CCT GGC ATC CCG GCC TCC CTG GTC CGG GCA TTC CTG 787 Leu Arg Leu Tyr Pro Gly Ile Pro Ala Ser Leu Val Arg Ala Phe Leu 245 250 255 CAG CCC CCG CTC AAG GGC GTG GTC CTG GAG ACC TTC GGC TCT GGC AAC 835 Gln Pro Pro Leu Lys Gly Val Val Leu Glu Thr Phe Gly Ser Gly Asn 260 265 270 GGG CCG AGC AAG CCC GAC CTG CTG CAG GAG TTG CGG GCC GCG GCC CAG 883 Gly Pro Ser Lys Pro Asp Leu Leu Gln Glu Leu Arg Ala Ala Ala Gln 275 280 285 CGC GGC CTC ATC ATG GTC AAC TGC AGC CAG TGC CTG CGG GGG TCT GTG 931 Arg Gly Leu Ile Met Val Asn Cys Ser Gln Cys Leu Arg Gly Ser Val 290 295 300 ACC CCG GGC TAT GCC ACG AGC TTG GCG GGC GCC AAC ATC GTG TCC GGC 979 Thr Pro Gly Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Gly Ala Asn Ile Val Ser Gly 305 310 315 320 TTA GAC ATG ACC TCA GAG GCC GCG CTG GCT AAG CTG TCC TAC GTG TTG 1027 Leu Asp Met Thr Ser Glu Ala Ala Leu Ala Lys Leu Ser Tyr Val Leu 325 330 335 GGC CTG CCG GAG CTG AGC CTG GAG CGC AGG CAG GAG CTG CTG GCC AAG 1075 Gly Leu Pro Glu Leu Ser Leu Glu Arg Arg Gln Glu Leu Leu Ala Lys 340 345 350 GAT CTT CGC GGG GAA ATG ACA CTG CCC ACG GCA GAC CTG CAC CAG TCC 1123 Asp Leu Arg Gly Glu Met Thr Leu Pro Thr Ala Asp Leu His Gln Ser 355 360 365 TCT CCG CCG GGC AGC ACA CTG GGG CAA GGT GTC GCC CGG CTC TTT AGT 1171 Ser Pro Pro Gly Ser Thr Leu Gly Gln Gly Val Ala Arg Leu Phe Ser 370 375 380 CTG TTC GGT TGC CAG GAG GAA GAT TCG GTG CAG GAC GCC GTG ATG CCC 1219 Leu Phe Gly Cys Gln Glu Glu Asp Ser Val Gln Asp Ala Val Met Pro 385 390 395 400 AGC CTG GCC CTG GCC TTG GCC CAT GCT GGT GAA CTC GAG GCT CTG CAG 1267 Ser Leu Ala Leu Ala Leu Ala His Ala Gly Glu Leu Glu Ala Leu Gln 405 410 415 GCA CTT ATG GAG CTG GGC AGT GAC CTG CGC CTA AAG GAC TCT AAT GGC 1315 Ala Leu Met Glu Leu Gly Ser Asp Leu Arg Leu Lys Asp Ser Asn Gly 420 425 430 CAA ACC CTG TTG CAT GTG GCT GCT CGG AAT GGG CGT GAT GGC GTG GTC 1363 Gln Thr Leu Leu His Val Ala Ala Arg Asn Gly Arg Asp Gly Val Val 435 440 445 ACC ATG CTG CTG CAC AGA GGC ATG GAT GTC AAT GCC CGA GAC CGA GAC 1411 Thr Met Leu Leu His Arg Gly Met Asp Val Asn Ala Arg Asp Arg Asp 450 455 460 GGC CTC AGC CCA CTG CTG TTG GCT GTA CAG GGC AGG CAT CGG GAA TGC 1459 Gly Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ala Val Gln Gly Arg His Arg Glu Cys 465 470 475 480 ATC AGG CTG CTG CGG AAG GCT GGG GCC TGC CTG TCC CCC CAG GAC CTG 1507 Ile Arg Leu Leu Arg Lys Ala Gly Ala Cys Leu Ser Pro Gln Asp Leu 485 490 495 AAG GAT GCA GGG ACC GAG CTG TGC AGG CTG GCA TCC AGG GCT GAC ATG 1555 Lys Asp Ala Gly Thr Glu Leu Cys Arg Leu Ala Ser Arg Ala Asp Met 500 505 510 GAA GGC CTG CAG GCA TGG GGG CAG GCT GGG GCC GAC CTG CAG CAG CCG 1603 Glu Gly Leu Gln Ala Trp Gly Gln Ala Gly Ala Asp Leu Gln Gln Pro 515 520 525 GGC TAT GAT GGG CGC AGC GCT CTG TGT GTC GCA GAA GCA GCC GGG AAC 1651 Gly Tyr Asp Gly Arg Ser Ala Leu Cys Val Ala Glu Ala Ala Gly Asn 530 535 540 CAG GAG GTG CTG GCC CTT CTG CGG AAC CTG GCA CTT GTA GGC CCG GAA 1699 Gln Glu Val Leu Ala Leu Leu Arg Asn Leu Ala Leu Val Gly Pro Glu 545 550 555 560 GTG CCG CCT GCC ATC T GATCGCCAGC AATCCCGCTG TGGTGTGAGC CACTCCGCCA 1755 Val Pro Pro Ala Ile 565 TCTGCTGCTT TGACCCACTC GAGGGACCCT AGCACACGAC CCCCCAGCAG GATGCACCCC 1815 ACTACTTAGA GTATACCCCA GGCTGGCTCA GTGACAAGCT GCAAAGGTCT TTGTTGGCAG 1875 AACAGCAATA AAGTAACTAC AGAGTGGCCA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA 1928

【００６２】配列番号：11 配列の長さ：2096 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA ハイポテセィカル配列：No アンチセンス：No 起源 生物名：ヒト 組織の種類：肝臓 配列の特徴： 特徴を表す記号：5'UTR 存在位置：1..92 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：93..1811 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：3'UTR 存在位置：1812..2096 特徴を決定した方法：S 配列 CGCCCCGGGC CTCCTCCGCG CAGTCCCTGA GTCCCGCAGG CCCTGCGTCC CCGCTGCACA 60 CCCCCGTCCA CTCCCGTGGT CCCCGGTCCG GC 92 ATG GCG CGC GCG GTG GGG CCC GAG CGG AGG CTG CTG GCC GTC TAC ACC 140 Met Ala Arg Ala Val Gly Pro Glu Arg Arg Leu Leu Ala Val Tyr Thr 1 5 10 15 GGC GGC ACC ATT GGC ATG CGG AGT GAG CTC GGC GTG CTT GTG CCC GGG 188 Gly Gly Thr Ile Gly Met Arg Ser Glu Leu Gly Val Leu Val Pro Gly 20 25 30 ACG GGC CTG GCT GCC ATC CTG AGG ACA CTG CCC ATG TTC CAT GAC GAG 236 Thr Gly Leu Ala Ala Ile Leu Arg Thr Leu Pro Met Phe His Asp Glu 35 40 45 GAG CAC GCC CGA GCC CGC GGC CTC TCT GAG GAC ACC CTG GTG CTA CCC 284 Glu His Ala Arg Ala Arg Gly Leu Ser Glu Asp Thr Leu Val Leu Pro 50 55 60 CCG GAC AGC CGC AAC CAG AGG ATC CTC TAC ACC GTG CTG GAG TGC CAG 332 Pro Asp Ser Arg Asn Gln Arg Ile Leu Tyr Thr Val Leu Glu Cys Gln 65 70 75 80 CCC CTC TTC GAC TCC AGT GAC ATG ACC ATC GCT GAG TGG GTT CGC GTT 380 Pro Leu Phe Asp Ser Ser Asp Met Thr Ile Ala Glu Trp Val Arg Val 85 90 95 GCC CAG ACC ATC AAG AGG CAC TAC GAG CAG TAC CAC GGC TTT GTG GTC 428 Ala Gln Thr Ile Lys Arg His Tyr Glu Gln Tyr His Gly Phe Val Val 100 105 110 ATC CAC GGC ACC GAC ACC ATG GCC TTT GCT GCC TCG ATG CTG TCC TTC 476 Ile His Gly Thr Asp Thr Met Ala Phe Ala Ala Ser Met Leu Ser Phe 115 120 125 ATG CTG GAG AAC CTG CAG AAG ACT GTC ATC CTC ACT GGG GCC CAG GTG 524 Met Leu Glu Asn Leu Gln Lys Thr Val Ile Leu Thr Gly Ala Gln Val 130 135 140 CCC ATC CAT GCC CTG TGG AGC GAC GGC CGT GAG AAC CTG CTG GGG GCA 572 Pro Ile His Ala Leu Trp Ser Asp Gly Arg Glu Asn Leu Leu Gly Ala 145 150 155 160 CTG CTC ATG GCT GGC CAG TAT GTG ATC CCA GAG GTC TGC CTT TTC TTC 620 Leu Leu Met Ala Gly Gln Tyr Val Ile Pro Glu Val Cys Leu Phe Phe 165 170 175 CAG AAT CAG CTG TTT CGG GGC AAC CGG GCA ACC AAG GTA GAC GCT CGG 668 Gln Asn Gln Leu Phe Arg Gly Asn Arg Ala Thr Lys Val Asp Ala Arg 180 185 190 AGG TTC GCA GCT TTC TGC TCC CCG AAC CTG CTG CCT CTG GCC ACA GTG 716 Arg Phe Ala Ala Phe Cys Ser Pro Asn Leu Leu Pro Leu Ala Thr Val 195 200 205 GGT GCT GAC ATC ACA ATC AAC AGG GAG CTG GTG CGG AAG GTG GAC GGG 764 Gly Ala Asp Ile Thr Ile Asn Arg Glu Leu Val Arg Lys Val Asp Gly 210 215 220 AAG GCT GGG CTG GTG GTG CAC AGC AGC ATG GAG CAG GAC GTG GGC CTG 812 Lys Ala Gly Leu Val Val His Ser Ser Met Glu Gln Asp Val Gly Leu 225 230 235 240 CTG CGC CTC TAC CCT GGG ATC CCT GCC GCC CTG GTT CGG GCC TTC TTG 860 Leu Arg Leu Tyr Pro Gly Ile Pro Ala Ala Leu Val Arg Ala Phe Leu 245 250 255 CAG CCT CCC CTG AAG GGC GTG GTC ATG GAG ACC TTC GGT TCA GGG AAC 908 Gln Pro Pro Leu Lys Gly Val Val Met Glu Thr Phe Gly Ser Gly Asn 260 265 270 GGA CCC ACC AAG CCC GAC CTG CTG CAG GAG CTG CGG GTG GCC ACC GAG 956 Gly Pro Thr Lys Pro Asp Leu Leu Gln Glu Leu Arg Val Ala Thr Glu 275 280 285 CGC GGC CTG GTC ATC GTC AAC TGT ACC CAC TGC CTC CAG GGG GCT GTG 1004 Arg Gly Leu Val Ile Val Asn Cys Thr His Cys Leu Gln Gly Ala Val 290 295 300 ACC ACA GAC TAT GCA GCT GGC ATG GCC ATG GCG GGA GCC GGC GTC ATC 1052 Thr Thr Asp Tyr Ala Ala Gly Met Ala Met Ala Gly Ala Gly Val Ile 305 310 315 320 TCA GGC TTC GAC ATG ACA TCG GAG GCC GCC CTG GCC AAG CTA TCG TAT 1100 Ser Gly Phe Asp Met Thr Ser Glu Ala Ala Leu Ala Lys Leu Ser Tyr 325 330 335 GTG CTG GGC CAG CCA GGG CTG AGC CTG GAT GTC AGG AAG GAG CTG CTG 1148 Val Leu Gly Gln Pro Gly Leu Ser Leu Asp Val Arg Lys Glu Leu Leu 340 345 350 ACC AAG GAC CTT CGG GGG GAG ATG ACG CCA CCC TCG GTG GAA GAG CGC 1196 Thr Lys Asp Leu Arg Gly Glu Met Thr Pro Pro Ser Val Glu Glu Arg 355 360 365 CGG CCC TCA CTG CAG GGC AAC ACG CTG GGC GGT GGG GTC TCC TGG CTC 1244 Arg Pro Ser Leu Gln Gly Asn Thr Leu Gly Gly Gly Val Ser Trp Leu 370 375 380 CTC AGT CTG AGC GGC AGC CAG GAG GCA GAT GCC CTG CGG AAT GCC CTG 1292 Leu Ser Leu Ser Gly Ser Gln Glu Ala Asp Ala Leu Arg Asn Ala Leu 385 390 395 400 GTG CCC AGC CTG GCC TGT GCT GCT GCC CAC GCC GGT GAC GTG GAG GCG 1340 Val Pro Ser Leu Ala Cys Ala Ala Ala His Ala Gly Asp Val Glu Ala 405 410 415 CTG CAG GCG CTT GTG GAG CTG GGC AGT GAC CTG GGC CTG GTG GAC TTT 1388 Leu Gln Ala Leu Val Glu Leu Gly Ser Asp Leu Gly Leu Val Asp Phe 420 425 430 AAC GGC CAA ACC CCA CTG CAC GCG GCC GCC CGG GGA GGC CAC ACA GAG 1436 Asn Gly Gln Thr Pro Leu His Ala Ala Ala Arg Gly Gly His Thr Glu 435 440 445 GCA GTC ACC ATG CTG CTG CAG AGA GGT GTG GAC GTG AAC ACC CGG GAC 1484 Ala Val Thr Met Leu Leu Gln Arg Gly Val Asp Val Asn Thr Arg Asp 450 455 460 ACG GAT GGC TTC AGC CCG CTG CTG CTG GCC GTG CGG GGC AGG CAT CCG 1532 Thr Asp Gly Phe Ser Pro Leu Leu Leu Ala Val Arg Gly Arg His Pro 465 470 475 480 GGT GTC ATT GGG TTG CTG CGG GAA GCC GGG GCC TCC CTG TCC ACC CAG 1580 Gly Val Ile Gly Leu Leu Arg Glu Ala Gly Ala Ser Leu Ser Thr Gln 485 490 495 GAG CTG GAG GAA GCA GGG ACG GAG CTG TGC AGG CTG GCA TAC AGG GCC 1628 Glu Leu Glu Glu Ala Gly Thr Glu Leu Cys Arg Leu Ala Tyr Arg Ala 500 505 510 GAC CTC GAA GGC CTG CAG GTG TGG TGG CAG GCA GGG GCT GAC CTG GGG 1676 Asp Leu Glu Gly Leu Gln Val Trp Trp Gln Ala Gly Ala Asp Leu Gly 515 520 525 CAG CCG GGC TAT GAC GGG CAC AGC GCC CTG CAC GTC GCA GAG GCA GCC 1724 Gln Pro Gly Tyr Asp Gly His Ser Ala Leu His Val Ala Glu Ala Ala 530 535 540 GGG AAC CTG GCA GTG GTG GCC TTT CTA CAG AGC CTG GAG GGT GCG GTT 1772 Gly Asn Leu Ala Val Val Ala Phe Leu Gln Ser Leu Glu Gly Ala Val 545 550 555 560 GGT GCC CAG GCC CCA TGC CCA GAA GTG CTG CCT GGT GTC TA ACCTGAAGGC 1823 Gly Ala Gln Ala Pro Cys Pro Glu Val Leu Pro Gly Val 565 570 GTCCTGCTGC AGTATAAGCC ATTCCTTCCT CCCATGACCT GCTGGAGGGG TCTCAGGCAT 1883 GACCCCACTG CTGGGGCTGC TTCCCAGCCT GCTCTCATGT AAAGCCTGAA GGCCTTTGTT 1943 GGGCAGGACG GCAATAAAGT CTCTGACATC CCCTCACCAG GTCTGTACAG CCTGGCTCTG 2003 AGAGGCTCTG TCTGGGTCCG GGACTGTGAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 2063 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA 2096

【図面の簡単な説明】

【図１】モルモットのＬ−アスパラギナーゼのペプチド
マップを示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 38/46 ＡＢＹ Ａ６１Ｋ 37/54 ＡＢＹ

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表における配列番号１又は２に示す
   アミノ酸配列を含んでなる哺乳類のＬ−アスパラギナー
   ゼをコードするＤＮＡ。
2. 【請求項２】 哺乳類のＬ−アスパラギナーゼが配列表
   における配列番号３に示すアミノ酸配列又はそれに相同
   的なアミノ酸配列を有する請求項１に記載のＤＮＡ。
3. 【請求項３】 哺乳類のＬ−アスパラギナーゼが配列表
   における配列番号４に示すアミノ酸配列又はそれに相同
   的なアミノ酸配列を有する請求項１に記載のＤＮＡ。
4. 【請求項４】 配列表における配列番号５に示す塩基配
   列若しくはそれに相同的な塩基配列又はそれらに相補的
   な塩基配列を有する請求項１又は２に記載のＤＮＡ。
5. 【請求項５】 配列表における配列番号６に示す塩基配
   列若しくはそれに相同的な塩基配列又はそれらに相補的
   な塩基配列を有する請求項１又は３に記載のＤＮＡ。
6. 【請求項６】 配列表における配列番号１０に示す塩基
   配列を有する請求項１、２又は４に記載のＤＮＡ。
7. 【請求項７】 配列表における配列番号１１に示す塩基
   配列を有する請求項１、３又は５に記載のＤＮＡ。
8. 【請求項８】 遺伝子コードの縮重に基づき、配列表に
   おける配列番号３に示すアミノ酸配列を変えることな
   く、配列番号５に示す塩基配列における塩基の１個又は
   ２個以上を他の塩基で置換した請求項１、２、４又は６
   に記載のＤＮＡ。
9. 【請求項９】 遺伝子コードの縮重に基づき、配列表に
   おける配列番号４に示すアミノ酸配列を変えることな
   く、配列番号６に示す塩基配列における塩基の１個又は
   ２個以上を他の塩基で置換した請求項１、３、５又は７
   に記載のＤＮＡ。
10. 【請求項１０】 モルモット又はヒトのＬ−アスパラギ
    ナーゼをコードする請求項１、２、３、４、５、６、
    ７、８又は９に記載のＤＮＡ。