DE69631302T2

DE69631302T2 - DNS, die für L-Asparaginase von Säugetieren kodiert

Info

Publication number: DE69631302T2
Application number: DE69631302T
Authority: DE
Inventors: Takeshi Okayama-shi Ario; Madoka Okayama-shi Taniai; Kakuji Kurashiki-shi Torigoe; Masashi Okayama-shi Kurimoto
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK; Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1995-02-08
Filing date: 1996-02-07
Publication date: 2005-03-10
Anticipated expiration: 2016-02-08
Also published as: EP0726313A2; DE69631302D1; EP0726313B1; JP3721210B2; EP0726313A3; JPH08214885A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue, für L-Asparaginase codierende DNA, insbesondere eine für eine L-Asparaginase aus Säugern codierende DNA.
Bei der L-Asparaginase (EC 3.5.1.1), einer Amidohydrolase, die auf L-Asparagin unter Freisetzung von L-Asparaginsäure und Ammoniak wirkt, handelt es sich um ein Enzym, das eine Hauptrolle im L-Asparagin-Stoffwechsel in Pflanzen, Tieren und Mikroorganismen spielt und, nachdem John G. Kidd in „The Journal of Experimental Medicine", Bd. 98, S. 565–583 (1953) über die Hemmaktivität der L-Asparaginase auf Lymphome berichtet hatte, seither verstärkt auf seine gegenwärtige Verwendung als Antitumormittel hin untersucht worden ist. Als Ergebnis wird eine L-Asparaginase aus Escherichia coli nun als Therapeutikum gegen Leukämie und Lymphom eingesetzt.
Die obengenannte L-Asparaginase mit zufriedenstellender Antitumoraktivität ist jedoch beim Menschen nur ein externes Protein, wobei die Verabreichung herkömmlicher Zusammensetzungen mit der L-Asparaginase an Patienten häufig zu schweren Nebenwirkungen, wie z.B. Hyperergie, einschließlich anaphylaktischem Schock, Urticaria, Ödem, Keuchen und Dyspnoe, führt. Daher sind diese Zusammensetzungen unweigerlich in ihren Verabreichungsdosen und -häufigkeiten stark eingeschränkt, wobei einige Vorschläge zur Reduzierung oder gar Verringerung solcher Nebenwirkungen gemacht wurden.
Dabei ist als ein erster Vorschlag aus der japanischen Offenlegungsschrift Nr. 119,082/79 eine L-Asparaginase aus Escherichia coli bekannt, die durch Blockierung von mindestens 65% der Aminosäuren der L-Asparaginase mit mit 2-O- substituiertem Polyethylenglykol-4,6-dichlor-S-triazin chemisch modifiziert ist. Als ein zweiter Vorschlag ist aus der japanischen Offenlegungsschrift Nr. 320,684/92 eine menschliche L-Asparaginase bekannt, die aus einer Fibroblastenkultur von menschlicher Lunge, Magen oder Brust gewonnen wird. Ein Vorteil des ersten Vorschlags besteht darin, daß dabei eine L-Asparaginase aus Escherichia coli eingesetzt werden kann, die leicht im großtechnischen Maßstab herstellbar ist, wobei dieser erste Vorschlag einen Nachteil dahingehend aufweist, daß die Kontrolle der Modifikationsreaktion schwierig ist und die Nebenwirkungen nicht beseitigt werden konnten. Ein Vorteil des zweiten Vorschlags besteht darin, daß im Gegensatz zur L-Asparaginase aus Escherichia coli menschliche L-Asparaginase im wesentlichen keine Antikörper induziert, selbst wenn sie an Patienten verabreicht wird, wobei dieser zweite Vorschlag einen Nachteil dahingehend aufweist, daß die Produktivität menschlicher Fibroblasten nicht ausreicht, wie in der japanischen Offenlegungsschrift Nr. 320,684/92 offenbart, so daß eine Kultivierung im größeren Maßstab unvermeidlich ist, um eine ausreichende Menge an L-Asparaginase zu erhalten.
In jüngerer Zeit hat die rekombinante DNA-Technologie bemerkenswerte Fortschritte gemacht. Heutzutage läßt sich selbst ein Polypeptid ohne vollständige Aufklärung seiner Aminosäuresequenz leicht in einer gewünschten Menge herstellen, indem, sobald nur ein für das Polypeptid codierendes Gen isoliert und hinsichtlich der Basensequenz decodiert worden ist, eine rekombinante DNA mit einer für das Polypeptid codierenden DNA hergestellt, die DNA in Mikroorganismen oder in Zellen von Tieren oder Pflanzen zur Gewinnung von Transformanten eingeführt wird und die Transformanten kultiviert werden.
Im Hinblick auf die obigen Ausführungen bestand auf diesem Gebiet ein großer Bedarf nach einem für eine L-Asparaginase aus Säugern codierenden Gen, vorzugsweise der Isolierung eines für menschliche L-Asparaginase codierenden Gens sowie der unverzüglichen Aufklärung seiner Basensequenz.
Durch die vorliegende Erfindung wird eine für L-Asparaginase aus Säugern codierende DNA bereitgestellt, die dadurch gekennzeichnet ist, daß die DNA eine Basensequenz umfaßt, die die beiden in SEQ ID NO:1 und SEQ ID NO:2 gezeigten Aminosäuresequenzen codiert, und daß die DNA mit der DNA, die eine wie in SEQ ID NO:5 gezeigte Basensequenz umfaßt, oder/und der DNA, die eine wie in SEQ ID NO:6 gezeigte Basensequenz umfaßt, in einer Lösung aus 5 × SSPE, 5 × Denhardts-Lösung, 0,5% (w/v) SDS und 100 μg/ml einer denaturierten Lachssperma-DNA bei 50°C hybridisierbar ist.
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden ausführlicher, jedoch nur beispielhaft unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen beschrieben, wobei:
1 eine Peptidkarte einer L-Asparaginase aus Meerschweinchen darstellt.
Die erfindungsgemäße DNA exprimiert die Produktion einer L-Asparaginase aus Säugern mit einer spezifischen Aminosäuresequenz, indem sie sie in Zellen oder Mikroorganismen zur Bildung von Transformanten einführt.
Die vorliegende Erfindung beruhte auf der Entdeckung einer neuen DNA, die für eine L-Asparaginase aus Meerschweinchen codiert. Obwohl die Existenz von L-Asparaginase in den Seren von Meerschweinchen bekannt ist, ist sie hinsichtlich Eigenschaft und Charakteristik weitgehend unbekannt.
In der vorliegenden Erfindung wurde eine Substanz mit einer L-Asparaginase-Aktivität aus Meerschweinchenserum unter Verwendung von Reinigungsverfahren mit der Säulenchromatographie als Haupttechnik isoliert und deren Aminosäuresequenz teilweise bestimmt. Auf Grundlage dieser Sequenz wurde ein Primer chemisch synthetisiert und der RT-PCR-Reaktion mit einer aus Leberzellen des Meerschweinchens gewonnenen mRNA als Matrize unterzogen, so daß ein DNA-Fragment erhalten wurde, das teilweise für die L-Asparaginase codiert. In der vorliegenden Erfindung wurde das Fragment als Sonde für ein intensives Screening von aus der mRNA hergestellten cDNA-Bibliotheken verwendet, so daß ein aus 1695 Basenpaaren bestehendes DNA-Fragment mit der Basensequenz der SEQ ID NO:5 erhalten wurde. Die Entschlüsselung der Basensequenz zeigte, daß die L-Asparaginase aus Meerschweinchen aus 565 Aminosäuren besteht und die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:3 aufweist.
Mit den gefundenen Ergebnissen wurde in der vorliegenden Erfindung die Untersuchung von aus menschlichen Leberzellen gewonnen mRNAs fortgesetzt, wobei ein für menschliche L-Asparaginase codierendes Gen erfolgreich isoliert wurde. Das Gen weist die aus 1719 Basenpaaren bestehende Basensequenz der SEQ ID NO:6 auf, und die Entschlüsselung zeigte, daß das Gen die aus 573 Aminosäuren bestehende Aminosäuresequenz in SEQ ID NO:4 codiert.
Die zur Aufdeckung dieser Aminosäuresequenzen und Basensequenzen der SEQ ID Nos:3–6 verwendeten Techniken sind im folgenden zusammengefaßt:

(1) eine L-Asparaginase wurde aus einem Meerschweinchenserum isoliert und durch Reinigungsverfahren mit der Chromatographie als Haupttechnik hoch gereinigt;
(2) die L-Asparaginase wurde trypsinisiert, und aus dem erhaltenen Gemisch wurden drei Peptidfragmente isoliert, deren Aminosäuresequenzen danach bestimmt wurden;
(3) aus den Leberzellen des Meerschweinchens wurde eine mRNA gewonnen. Unter Verwendung der mRNA als Matrize wurde diese der RT-PCR-Reaktion in Gegenwart eines Primers, der auf Grundlage der obigen Aminosäuresequenzen chemisch synthetisiert worden war, unterworfen, so daß DNA-Fragmente erhalten wurden, die danach einem Screening mit einer Sonde, die auf Grundlage jener Aminosäuresequenzen chemisch synthetisiert worden war, unterzogen wurden. Somit wurde ein DNA-Fragment, das das aktive Zentrum der L-Asparaginase aus Meerschweinchen teilweise codiert, erhalten;
(4) nach Markierung des DNA-Fragments wurde dieses mit einer cDNA-Bibliothek, die unter Verwendung der mRNA als Matrize hergestellt worden war, hybridisiert, und anschließend wurde auf Transformanten, die eine starke Hybridisierung zeigten, selektioniert;
(5) aus den Transformanten wurde eine cDNA gewonnen, deren Basensequenz bestimmt und Aminosäuresequenz entschlüsselt. Ein Vergleich der entschlüsselten Aminosäuresequenz mit den obigen Aminosäureteilsequenzen zeigte, daß die L-Asparaginase aus Meerschweinchen die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:3 aufweist und von der Basensequenz der SEQ ID NO:5 codiert wird;
(6) eine cDNA-Bibliothek wurde unter Verwendung einer aus menschlichen Leberzellen gewonnenen mRNA und ein DNA-Fragment mit der Basensequenz der SEQ ID NO:5 hergestellt, danach markiert und mit der cDNA-Bibliothek hybridisiert, woraufhin auf Transformanten, die eine starke Hybridisierung zeigten, selektioniert wurde; und
(7) aus den Transformanten wurde eine cDNA gewonnen, ihre Basensequenz bestimmt und ihre Aminosäuresequenz entschlüsselt, wobei sich zeigte, daß menschliche L-Asparaginase die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:4 aufweist und von der Basensequenz der SEQ ID NO:6 codiert wird.

Vergleicht man die Aminosäuresequenzen der SEQ ID NO:3 und 4, so weisen diese eine gemeinsame Aminosäuresequenz mit SEQ ID NO:1 oder 2 auf. Die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:1 entspricht einer Aminosäureteilsequenz bestehend aus Aminosäuren 16–19 in SEQ ID NO:3 oder 4, während die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:2 einer Aminosäureteilsequenz bestehend aus Aminosäuren 114–118 in SEQ ID NO:3 oder 4 entspricht. Aufgrund dieser Gemeinsamkeit gehören zu den in der vorliegenden Erfindung bezeichneten L-Asparaginasen aus Säugern solche mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:1 oder 2. Als repräsentative Beispiele lassen sich hier eine L-Asparaginase aus Meerschweinchen mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:3, eine menschliche L-Asparaginase mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:4 sowie ihre zu diesen Aminosäuresequenzen komplementären Varianten anführen. Zu diesen Varianten gehören solche, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren in der SEQ ID NO:3 oder 4 durch andere Aminosäuren ersetzt sind, solche, bei denen eine oder mehrere weitere Aminosäuren an den N- und/oder C-Enden der Aminosäuresequenzen in SEQ ID NO:3 oder 4 angefügt sind, sowie solche, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren an den N- und/oder C-Enden der Aminosäuresequenz in SEQ ID NO:3 oder 4 deletiert sind, wobei die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:1 oder 2 erhalten bleibt und im wesentlichen keine L-Asparaginase-Aktivität verlorengeht.
Unter den DNAs im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man solche, die die obengenannten Aminosäuresequenzen codieren. Zu diesen DNAs gehören beispielsweise diejenigen mit den Basensequenzen der SEQ ID NOs:6, 10 und 11 sowie diejenigen mit homologen und komplementären Basensequenzen zu diesen Basensequenzen der SEQ ID NOs:6, 10 und 11. Bei diesen Basensequenzen können eine oder mehrere Basen gegen andere Basen mittels der Degeneriertheit des genetischen Codes gewechselt werden, ohne daß dabei durch sie codierte Aminosäuresequenzen verändert werden.
Um die vorliegenden DNAs die Produktion von L-Asparaginasen aus Säugern in Wirten tatsächlich exprimieren zu lassen, kann man eine oder mehrere Basen der Basensequenzen in den DNAs, die für die vorliegenden L-Asparaginasen und ihre Varianten codieren, gegen andere Basen austauschen.
Als vorliegende DNAs können alle natürlichen und künstlichen DNAs verwendet werden, solange sie eine jener Basensequenzen aufweisen. Die natürlichen Quellen für die vorliegenden DNAs sind beispielsweise die Lebern von Meerschweinchen und Mensch. Aus diesen Leberzellen lassen sich DNAs mit den Basensequenzen der SEQ ID NO:5 und 6 erhalten. Zur künstlichen Synthese der vorliegenden DNAs können diese auf Grundlage der Basensequenz der SEQ ID NO:5 oder 6 chemisch synthetisiert oder dadurch hergestellt werden, daß man DNAs, die für die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:3 oder 4 codieren, in selbstreplizierende [?] Vektoren unter Erhalt, rekombinanter DNAs inseriert, die rekombinanten DNAs in entsprechende Wirte unter Erhalt von Transformanten einführt, die Transformanten kultiviert, die proliferierten Zellen aus den Kulturen abtrennt und aus den Zellen die die vorliegenden DNAs enthaltenden Zielplasmide gewinnt.
Diese so erhaltenen DNAs können mittels herkömmlicher Verfahren in Transformanten eingeführt werden. Die so erhaltenen Transformanten produzieren bei Kultivierung intra- oder extrazellulär L-Asparaginasen aus Säugern. Im Gegensatz zu herkömmlichen, von Escherichia coli produzierten L-Asparaginasen weisen L-Asparaginasen aus Säugern dahingehend einen Vorteil auf, daß sie keine wesentlichen Nebenwirkungen, wie z.B. einen anaphylaktischen Schock und Hyperergie, verursachen, selbst wenn sie an Patienten wiederholt verabreicht werden. Diese L-Asparaginasen aus Säugern können daher selektiv allein oder in Verbindung mit anderen Arzneistoffen zur Behandlung von akuter Leukämie, akuter Lymphozytenleukämie und malignen Säugertumoren im allgemeinen, einschließlich malignen Tumoren, verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung wird mit Bezug auf die folgenden Beispiele erläutert, wobei die darin verwendeten Techniken im Fachgebiet allgemein bekannt sind: Beispiele dafür sind beschrieben in „Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2. Auflage" von T. Maniatis et al., veröffentlicht von Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA (1989), und in „Laboratory Manual for Genetic Engineering" von Masami MURAMATSU, veröffentlicht von Maruzen Co., Ltd., Tokio, Japan (1988).
Beispiel 1
Reinigung von L-Asparaginase aus Meerschweinchen
Das Blut von einhundert 8–10 Wochen alten Meerschweinchen wurde gesammelt, vereinigt und in herkömmlicher Weise behandelt, so daß 300 ml Serum erhalten wurden. In dieses wurde Ammoniumsulfat bis zu einem Sättigungsgrad von 50% (w/v) gegeben, 2 Stunden bei 4°C stehengelassen und 30 min bei etwa 8000 UpM zentrifugiert. Der Niederschlag wurde gesammelt, in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gelöst und gegen eine frische Präparation des gleichen Puffers 18 Stunden bei 4°C dialysiert. Die innen vorhandene dialysierte Lösung wurde einer mit 300 ml „SEPHACRYL S-300", einem von Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden, vertriebenen Gel zur Gelfiltrationssäulenchromatographie, gepackten Säule zugeführt, die mit einer frischen Präparation des gleichen Puffers äquilibriert worden war, woraufhin der Säule eine frische Präparation des gleichen Puffers zugeführt wurde.
Einem Molekulargewicht von etwa 150 000 Dalton entsprechende Fraktionen wurden gesammelt, vereinigt, einer mit „DEAE-5PW", einem von Tosoh Corporation, Tokio, Japan, vertriebenen Gel für die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, das mit 20 mM Phosphatpuffer äquilibriert worden war (pH 7,0), gepackten Säule zugeführt, die daraufhin mit einer frischen Präparation des gleichen Puffers gewaschen wurde und der dann ein linearer Gradientenpuffer aus Natriumchlorid mit einer von 0 M bis 1 M steigenden Konzentration in 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) bei einer Fließgeschwindigkeit von 13 ml/min zugeführt wurde. Fraktionen von ungefähr 120 ml, die bei einer Konzentration von etwa 0,25 M Natriumchlorid eluiert wurden, wurden gesammelt, vereinigt und gegen destilliertes Wasser 4 Stunden bei 4°C dialysiert. Die innen vorhandene dialysierte Lösung wurde einer mit 100 ml „BLUE SEPHAROSE CL-6B", einem von Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden, vertriebenen Gel für die Affinitätschromatographie, gepackten Säule zugeführt, woraufhin der Säule zur Elution einer L-Asparaginase aus Meerschweinchen eine frische Präparation des gleichen Puffers zugeführt wurde.
Die L-Asparaginase enthaltende Fraktionen wurden gesammelt, vereinigt und konzentriert, und das Konzentrat wurde dann einer mit „HILOARD SUPERDEX 200", einem von Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden, vertriebenen Gel für die Gelfiltrationschromatographie, gepackten Säule zugeführt, woraufhin der Säule eine frische Präparation des gleichen Puffers zugeführt wurde. Einem Molekulargewicht von etwa 150 000 Dalton entsprechende Fraktionen wurden gesammelt, vereinigt und unter Erhalt von etwa 400 μg der L-Asparaginase aus Meerschweinchen mit einer spezifischen Aktivität von etwa 10 Einheiten/mg Protein pro Meerschweinchen konzentriert.
In der gesamten vorliegenden Beschreibung wird die Aktivität der L-Asparaginase wie folgt getestet und in Einheiten ausgedrückt: Eine Probe auf eine 96-Well-Mikroplatte in einem Volumen von 160 μl/Well verteilen und in jedes Well 40 μl einer Lösung mit 1,4 mg/ml L-Asparagin, gelöst in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0), geben. Die Mikroplatte bei 37°C 10–30 min inkubieren und die freigesetzte L-Asparaginsäure in einem Aminosäureanalysegerät quantifizieren. Ein System mit einer L-Asparaginase aus Escherichia coli, die unter Erhalt einer Konzentration von 1,0, 0,5 bzw. 0,25 Einheiten/ml verdünnt worden war, bereitstellen und in ähnlicher Weise wie oben behandeln und die freigesetzte L-Asparaginsäure quantifizieren. Die Meßdaten zur graphischen Darstellung einer Arbeitskennlinie auftragen. Zur Abschätzung der Aktivität der Probe den L-Asparaginsäuregehalt im Probensystem auftragen. Eine Einheit L-Asparaginase-Aktivität ist definiert als die Menge eines Polypeptids mit einer L-Asparaginase-Aktivität, die ein μmol Ammoniak aus L-Asparagin pro min freisetzt, wenn man die Reaktion unter den obigen Bedingungen ablaufen läßt.
Beispiel 2
Aminosäureteilsequenz der L-Asparaginase aus Meerschweinchen
Ein Teil der wäßrigen Lösung mit der gereinigten L-Asparaginase aus Beispiel 1 wurde in einen Behälter gegeben und auf etwa 50 μl eingeengt. Zu dem Konzentrat wurden 25 μl eines Lösungsgemischs aus 3% (w/v) Natriumdodecylsulfat (SDS), 60% (w/v) Glycerin und 60 mg/ml Dithiothreitol gegeben, woraufhin die erhaltene Lösung 30 min bei 50°C inkubiert, auf 10% (w/v) Polyacrylamidgele übertragen und in herkömmlicher Weise einer Elektrophorese unterzogen wurde. Die erhaltenen Gele wurde nacheinander zur Anfärbung in 50% (v/v) wäßrigem Methanol mit 0,1% (w/v) Coomassie Brilliant Blue R250 und 10% (v/v) Essigsäure getränkt, durch wiederholtes Waschen mit 12% (v/v) wäßrigem Methanol mit 7% (v/v) Essigsäure entfärbt und 18 Stunden in destilliertem Wasser getränkt, woraufhin die gefärbten Gelbanden ausgeschnitten und lyophilisiert wurden.
Die getrockneten Gelbanden wurden in einem 0,6-ml-Lösungsgemisch aus 2 μg/ml „TPCK TRYPSIN", einer von Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, USA, vertriebenen Trypsinpräparation, 0,5 mM Calciumchlorid und 0,02 (v/v) wäßriger Tween 20-Lösung getränkt und zur Trypsinisierung der L-Asparaginase 18 Stunden bei 37°C inkubiert. Das trypsinisierte Produkt wurde zentrifugiert und unter Erhalt eines Überstands und eines Niederschlags getrennt, wovon der letztere dann in einem ml einer ein % (v/v) wäßrigen Trifluoressigsäurelösung mit 0,001 (v/v) Tween 20 getränkt, 4 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt und unter Erhalt eines Überstands zentrifugiert wurde. Der erhaltene Niederschlag wurde nacheinander in ähnlicher Weise wie oben mit einer 70% (v/v) wäßrigen Trifluoressigsäurelösung mit 0,001% (v/v) Tween 20 sowie einer Acetonitrillösung mit 0,001 (v/v) Tween 20 sowie 50 (v/v) Trifluoressigsäure unter Erhalt eines Überstands behandelt, der dann mit dem obigen Überstand vermischt wurde. Das Lösungsgemisch wurde unter Erhalt von 250 μl auf konzentriert und danach über Zentrifugation filtriert.
Die die so erhaltenen Peptidfragmente enthaltende wäßrige Lösung wurde einer Säule aus „HPLC ODS-120T", einem von Tosoh Corporation, Tokio, Japan, vertriebenen Gel für Hochleistungsflüssigkeitssäulenchromatographie, zugeführt. Die Säule wurde mit 0,1% (v/v) wäßriger Trifluoressigsäurelösung gewaschen, woraufhin ein linearer Gradientenpuffer aus wäßrigem Acetonitril mit von 0% (v/v) bis 70% (v/v) ansteigenden Konzentrationen in 0,1% (v/v) wäßriger Trifluoressigsäurelösung mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/min zugeführt wurde. Etwa 66 min, etwa 69 min und etwa 72 min nach Beginn der Zuführung eluierte Fraktionen (im folgenden mit „Peptidfragment A", „Peptidfragment B" bzw. „Peptidfragment C" bezeichnet) wurden gesammelt. Das Elutionsmuster, d.h. eine Peptidkarte der L-Asparaginase aus Meerschweinchen, war in 1.
Unter Verwendung eines von Perkin-Elmer Corp., Norwalk, USA, vertriebenen Proteinsequenziergeräts „MODELL 473A" wurden diese Peptidfragmente A, B und C in herkömmlicher Weise untersucht, wobei sich zeigte, daß sie die Aminosäuresequenzen der SEQ ID NO:7–9 aufweisen.
Beispiel 3
Aminosäure-Gesamtsequenz der L-Asparaginase aus Meerschweinchen und für diese codierende Basensequenz
Beispiel 3–1
Herstellung von Gesamt-RNAs
In herkömmlicher Weise aus einer Meerschweinchenleber präparierte Zellen mit einem Naßgewicht von 3 g wurden gewogen, in 20 ml wäßriger 6 M Guanidinisothiocyanatlösung mit 10 mM Natriumcitrat (pH 7,0) und 0,5% (w/v) SDS suspendiert und mit einem Homogenisator aufgeschlossen. In ein 35-ml-Zentrifugenröhrchen wurden 25 ml eines Lösungsgemischs aus 5,7 M Cäsiumchlorid und 0,1 M EDTA (pH 7,5) injiziert und die aufgeschlossenen Zellen auf diese Lösung geschichtet, woraufhin das Röhrchen bei 25 000 UpM und 20°C 20 Stunden zentrifugiert wurde. Eine RNAs enthaltende Fraktion wurde aus dem Röhrchen gesammelt, in ein anderes 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt, mit einer gleichen Menge an Chloroform/Butanol (=4:1 v/v) gemischt, 5 min gerührt und bei 10 000 g × 10 min und 4°C zentrifugiert. Die erhaltene wäßrige Schicht wurde gesammelt, mit dem 2,5fachen Volumen an Ethanol gemischt und 2 Stunden bei –20°C zum Ausfällen der Gesamt-RNAs stehengelassen. Die ausgefallenen RNAs wurden mit 75% (v/v) Ethanol gewaschen und unter Erhalt der Gesamt-RNAs in einer Ausbeute von etwa 4 mg getrocknet.
Beispiel 3–2
Herstellung eines teilweise für L-Asparaginase aus Meerschweinchen codierenden DNA-Fragments
Zu einem μg der in Beispiel 3–1 hergestellten Gesamt-RNAs wurden 4 μl 15 mM Magnesiumchlorid, 2 μl 10×PCR-Puffer, bestehend aus 100 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,3) und 500 mM Kaliumchlorid, 8 μl eines 1 mM dNTP-Mix, 1 μl eines RNase-Inhibitors (1 Einheit/μl), 1 μl einer reversen Transkriptase (2,5 Einheiten/μl), 1 μl eines beliebigen Hexamers (2,5 μM) sowie ein ausreichendes Volumen an sterilem destilliertem Wasser, um das Gesamtvolumen auf 20 μl zu bringen, gegeben. Das Lösungsgemisch wurde in ein 0,5-ml-Teströhrchen gegeben und in herkömmlicher Weise nacheinander 10 min bei 25°C, 30 min bei 42°C, 5 min bei 99°C und 5 min bei 5°C inkubiert, so daß eine enzymatische Reverse-Transkriptase-Reaktion durchgeführt wurde. Somit wurde eine wäßrige Lösung mit einer Erststrang-cDNA erhalten.
20 μl der wäßrigen Lösung wurden mit 4 μl 25 mM Magnesiumchlorid, 8 μl 10×PCR-Puffer, bestehend aus 100 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,3) und 500 mM Kaliumchlorid, 0,5 μl einer amplitaque-DNA-Polymerase (2,5 Einheiten/ml) 1 pmol Primer 1 als Sense-Primer, 1 pmol eines Primers 2 als Antisense-Primer sowie einem ausreichenden Volumen an sterilem destilliertem Wasser, um das Gesamtvolumen auf 100 μl zu bringen, gemischt. Man ließ das Lösungsgemisch in herkömmlicher Weise nacheinander 1 min bei 94°C, 2 min bei 42°C und 3 min bei 72°C reagieren, wobei diese aufeinanderfolgenden Reaktionsschritte 40mal wiederholt wurden, um ein DNA-Fragment zu amplifizieren, das die L-Asparaginase aus Meerschweinchen teilweise codiert, wobei die Erststrang-cDNA als Matrize diente. Bei den Primern 1 und 2 handelte es sich um Oligonukleotide, die auf Grundlage der Aminosäuresequenzen Gly-Met-Gln-Ser-Lys und Tyr-Pro-Gly-Ile-Pro-Ala in SEQ ID NO:8 bzw. 7 chemisch synthetisiert wurden und durch 5'-GGNATGCARWSNAAR-3' bzw. 5'-GCNGGDATNCCNGGRTA-3' dargestellte Basensequenzen aufweisen.
Dem so erhaltenen PCR-Reaktionsprodukt wurde eine Probe entnommen, die einer Elektrophorese in einem 2% (w/v) Agarosegel zwecks Auftrennung unterzogen wurde, woraufhin das Gel mit 0,4 N Natriumhydroxid unter Druck geblottet wurde, um DNAs auf einen Nylonfilm zu übertragen und darauf zu fixieren. Der Film wurde nacheinander mit 2 × SSC gewaschen, an der Luft getrocknet, in einem Lösungsgemisch für die Prähybridisierung mit 5 × SSPE, 5 × Denhardts-Lösung, 0,5% (w/v) SDS und 100 μg/ml einer denaturierten Lachssperma-DNA getränkt und in der Lösung 3 Stunden bei 65°C inkubiert. Als Sonde 1 wurde ein Oligonukleotid mit einer durch 5'-TTYATGYTNGARAAYYT-3' dargestellten Basensequenz auf Grundlage der Aminosäuresequenz Phe-Met-Leu-Glu-Asn-Leu in SEQ ID NO:9 chemisch synthetisiert und mit [γ-³²P]ATP und T4-Polynukleotidkinase markiert. Der obige Nylonfilm wurde nacheinander in einem Lösungsgemisch mit 1 pmol der Sonde 1, 5 × SSPE, 5 × Denhardts-Lösung, 0,5 (w/v) SDS und 100 μg/ml einer denaturierten Lachssperma-DNA getränkt, zur Hybridisierung bei 42°C 24 Stunden inkubiert, mit 6 × SSC bei Umgebungstemperatur gewaschen und in herkömmlicher Weise autoradiographiert, wobei sich zeigte, daß das gebildete PCR-Produkt das Ziel-DNA-Fragment enthielt.
Das verbliebene PCR-Produkt wurde mit 50 ng „pT7 BLUE T", einen von Novachem Ltd., Tel Aviv, Israel, vertriebenen Plasmidvektor, sowie einer angemessenen Menge an T4-DNA-Ligase versetzt, danach mit 100 mM ATP unter Erhalt einer Endkonzentration von 1 mM versetzt und 18 Stunden bei 16°C inkubiert, um das obige DNA-Fragment in den Plasmidvektor zu inserieren.
Die so erhaltene rekombinante DNA wurde in den „Nova Blue strain", einen von Novachem Ltd., Tel Aviv, Israel, vertriebenen Mikroorganismus der Spezies Escherichia coli, eingeführt, so daß ein Transformant erhalten wurde, der dann zur Animpfung eines Plattenmediums mit 10 g/l Bacto-trypton, 5 g/l Bacto-Hefeextrakt, 2,5 g/l Natriumchlorid, 15 g/l Bacto-Agar, 100 mg/l Ampicillin, 40 mg/l X-Gal und 23,8 mg/l Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (im folgenden mit „IPTG" abgekürzt) verwendet und zur Bildung von Kolonien 24 Stunden bei 37°C inkubiert wurde. Ein Nylonfilm wurde in herkömmlicher Weise auf der Oberfläche des Plattenmediums plaziert, zur Übertragung der Kolonien auf den Film etwa 30 s stehengelassen, woraufhin der Film von dem Plattenmedium abgezogen und in einem Lösungsgemisch mit 0,5 M Natriumhydroxid und 1,5 M Natriumchlorid zur Zellyse 7 min getränkt wurde. Danach wurde der Nylonfilm nacheinander in 0,5 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,2) mit 1,5 M Natriumchlorid für 3 min getränkt, mit 2 × SSC gewaschen, 20 min in 0,4 M Natriumhydroxid getränkt, mit 5 × SSC gewaschen, an der Luft getrocknet, in einem Lösungsgemisch zur Prähybridisierung mit 5 × SSPE, 5 × Denhardts-Lösung, 0,5 (w/v) SDS und 100 μg/l einer denaturierten Lachssperma-DNA getränkt und 24 Stunden bei 42°C inkubiert. Die Sonde 1 wurde mit dem Nylonfilm in herkömmlicher Weise hybridisiert und das erhaltene Produkt mit 6 × SSC gewaschen und in ähnlicher Weise wie oben autoradiographiert, woraufhin ein Transformant von dem Plattenmedium gesammelt wurde, der stark mit der Sonde 1 hybridisiert.
L-Broth-Medium (pH 7,2) mit 100 μg/ml Ampicillin wurde mit dem Transformanten angeimpft und 18 Stunden bei 37°C kultiviert, woraufhin die Zellen aus der Kultur geerntet und eine rekombinante DNA mittels herkömmlichem Alkali-SDS-Verfahren gewonnen wurde. Das Didesoxyverfahren zeigte, daß die rekombinante DNA ein DNA-Fragment mit einer den Basen 61–746 in SEQ ID NO:5 entsprechenden Basensequenz enthielt.
Beispiel 3–3
Herstellung von mRNA
0,05 ml einer wäßrigen Lösung mit 500 μg der Gesamt-RNAs in Beispiel 3–1 wurden in einen Behälter gegeben, in den 0,5 ml 10 mM Tri-HCl-Puffer (pH 7,5) mit 1 mM EDTA und 0,1% (w/v) SDS unter Erhalt eines Gesamtvolumens von 1 ml gegossen wurde. Das Lösungsgemisch wurde mit 1 ml „OLIGOTEX-dT300 SUPER", einem von Nippon Roche K.K., Tokio, Japan, vertriebenen oligo(dT)₃₀-Latex, versetzt und das erhaltene Gemisch 5 min zur Denaturierung des Inhalts bei 65°C inkubiert und sofort danach 3 min in einem eisgekühlten Bad abgekühlt. Zu der abgekühlten Lösung wurden 0,2 ml 5 M Natriumchlorid gegeben und die erhaltene Lösung 10 min bei 37°C inkubiert und danach bei 10 000 UpM und 25°C 10 min zentrifugiert, woraufhin ein Überstand unter Erhalt eines pelletähnlichen Niederschlags entfernt wurde, der Niederschlag wurde in 0,5 ml sterilem destilliertem Wasser suspendiert und die Suspension 5 min bei 65°C zur Extraktion der Ziel-mRNA aus dem „OLIGOTEX-dT300 SUPER" inkubiert. Die Ausbeute der mRNA betrug etwa 5 μg.
Beispiel 3–4
Herstellung einer cDNA-Bibliothek
Aus der mRNA in Beispiel 3–3 wurde eine cDNA-Bibliothek unter Verwendung des „cDNA SYNTHESIZING SYSTEM PLUS", einem von Amersham Corp., Div., Amersham International, Arlington Heights, USA, vertriebenen cDNA-Klonierungskits, hergestellt. In ein 1,5-ml-Reaktionsröhrchen wurden nacheinander 4 μl einer Lösung zur Synthese eines Erststrangs, 1 μl Natriumpyrophosphat, 1 μl Ribonukleaseinhibitor aus menschlicher Plazenta, 2 μl Didesoxynukleotid-Triphosphat-Gemisch sowie 1 μl Oligo-dT-Primer gegeben, danach mit 5 μl der in Beispiel 3–3 hergestellten mRNA sowie einem ausreichenden Volumen an sterilem destilliertem Wasser, um das Gesamtvolumen auf 19 μl zu bringen, gemischt. Zu der erhaltenen Lösung wurde 1 μl einer Lösung mit 20 Einheiten einer reversen Transkriptase gegeben, woraufhin 40 min bei 42°C unter Erhalt eines eine Erstrang-cDNA enthaltenden Reaktionsgemischs inkubiert wurde.
Das Reaktionsgemisch wurde nacheinander mit 37,5 μl einer Lösung zur Synthese einer Zweitstrang-cDNA, 0,8 Einheiten Ribonuklease H aus Escherichia coli sowie 23 Einheiten DNA-Polymerase I versetzt, sein Volumen durch Zugabe von sterilem destilliertem Wasser auf 100 μl erhöht, 60 min bei 12°C sowie 60 min bei 22°C inkubiert, mit 2 Einheiten T4-DNA-Polymerase versetzt und nochmals 10 min bei 37°C unter Erhalt einer Lösung, die die Zweitstrang-Ziel-cDNA enthält, inkubiert. Zu der so erhaltenen Lösung wurden 4 μl 0,25 M EDTA (pH 8,0) zum Abstoppen der Reaktion gegeben, woraufhin mit Phenol/Chloroform extrahiert, die Ziel-cDNA mit Ethanol ausgefällt und die cDNA gesammelt wurde.
2 μl L/K-Puffer, 250 pmol EcoRI-Adaptor und 2,5 Einheiten T4-DNR-Ligase wurden in dieser Reihenfolge zu der obigen cDNA gegeben und das Volumen des Lösungsgemischs mit sterilem destilliertem Wasser auf 20 μl erhöht, woraufhin zur Ligation des EcoRI-Adaptors an beide Enden der cDNA 16 Stunden bei 15°C inkubiert wurde. Die Reaktionsmischung wurde mit 2 μl 0,25 M EDTA (pH 8,0) zur Inaktivierung der verbliebenen Enzyme gemischt und der intakte EcoRI-Adaptor in herkömmlicher Weise mittels Molekularsiebchromatographie abgetrennt. Zu dem erhaltenen Produkt wurden 40 μl L/K-Puffer sowie 80 Einheiten T4-Polynukleotidkinase gegeben, und das Volumen dieses Gemischs wurde auf 400 μl mit sterilem destilliertem Wasser vergrößert, woraufhin das Lösungsgemisch 30 min bei 37°C zur Phosphorylierung des 5'-Terminus des EcoRI-Adaptors inkubiert und danach mit Phenol/Chloroform sowie Ethanol unter Erhalt einer DNA ausgefällt wurde. Die DNA wurde mit 1,5 μl L/K-Puffer mit einer hinreichenden Menge an λgt10-arm sowie mit 2,5 Einheiten T4-DNA-Ligase gemischt, das Reaktionsvolumen mit sterilem destilliertem Wasser auf 15 μl vergrößert, das Gemisch 16 Stunden bei 15°C inkubiert und danach einem herkömmlichen In-vitro-Verpackungsverfahren unterzogen, so daß ein Phage mit einer rekombinanten λDNA erhalten wurde.
Beispiel 3–5
Klonierung rekombinanter DNA
Der Stamm Escherichia coli NM514, vertrieben von Amersham Corp., Div., Amersham International, Arlington Heights, USA, wurde in herkömmlicher Weise mit dem Phagen in Beispiel 3–4 infiziert, zur Animpfung einer Agarplatte (pH 7,0) mit 10 g/l Bacto-Trypton, 5 g/l Bacto-Hefeextrakt, 10 g/l Natriumchlorid und 15 g/l Bacto-Agar verwendet und zur Bildung von Plaques 10 Stunden bei 37°C inkubiert. Danach wurde ein Nylonfilm auf der Oberfläche der Agarplatte plaziert und zur Übertragung der Plaques auf den Film 30 s stehengelassen, woraufhin der Film von der Platte abgezogen und nacheinander und wiederholt in einer wäßrigen Lösung mit 0,5 M Natriumhydroxid und 1,5 M Natriumchlorid für 7 min und in 0,5 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) mit 1,5 M Natriumchlorid für 3 min getränkt wurde. Der Nylonfilm wurde nacheinander mit 5 × SSC gespült, an der Luft getrocknet, in 0,4 N Natriumhydroxid 20 min getränkt, mit 2 × SSC gespült, an der Luft getrocknet, in einem Lösungsgemisch mit 5 × SSPE, 5 × Denhardts-Lösung, 0,5% (w/v) SDS und 100 μg/ml einer denaturierten Lachssperma-DNA getränkt und 3 Stunden bei 65°C inkubiert. Das DNA-Fragment in Beispiel 3–2 wurde mit ³²P unter Verwendung des „REDIPRIME DNA LABELLING SYSTEM" von Amersham Corp., Div., Amersham International, Arlington Heights, USA, unter Erhalt einer Sonde 2 markiert, von der eine angemessene Menge 20 Stunden bei 65°C hybridisiert wurde, indem sie in einer in einem Lösungsgemisch mit 5 × SSPE, 5 × Denhardts-Lösung, 0,5% (w/v) SDS und 100 μg/ml einer denaturierten Lachssperma-DNA inkubiert wurde. Der Nylonfilm wurde nacheinander in 2 × SSC 20 min bei 65°C und 0,2 × SSC 20 min bei 65°C getränkt bzw. damit gespült und einer Autoradiographie unterzogen, wonach ein Phagen-DNA-Klon selektiert wurde, der stark mit der Sonde 2 hybridisierte.
Der Klon wurde in Escherichia coli amplifiziert, und es wurde eine rekombinante DNA aus dem Mikroorganismus extrahiert. Die rekombinante DNA wurde mit Eco RI, einem Restriktionsenzym, gespalten, wobei der Plasmidvektor pUC19 (ATCC 37254) mit demselben Restriktionsenzym gespalten wurde. Die dabei gebildeten DNA- bzw. Plasmidfragmente wurden in herkömmlicher Weise mit einer DNA-Ligase ligiert, so daß eine rekombinante DNA erhalten wurde, die dann in den Escherichia-coli-Stamm JM109 (ATCC 53323) mit einem herkömmlichen Verfahren für kompetente Zellen unter Erhalt eines Transformanten eingeführt wurde.
Beispiel 3–6
Bestimmung der Basensequenz der DNA und der Aminosäuresequenz des Proteins
L-Broth-Medium (pH 7,2) mit 50 μg/ml Ampicillin wurde mit dem Transformanten in Beispiel 3–5 angeimpft und die Kultur unter Schütteln 18 Stunden bei 37°C kultiviert. Die proliferierten Transformanten wurden aus der Kultur gesammelt und mit dem herkömmlichen Alkali-SDS-Verfahren behandelt, so daß eine die erfindungsgemäße DNA enthaltende rekombinante DNA erhalten wurde. Die Analyse der rekombinanten DNA in einem automatischen Sequenziergerät unter Verwendung eines Fluoreszenzphotometers zeigte, daß sie die Basensequenz der SEQ ID NO:10 enthielt, wobei die Entschlüsselung andeutete, daß sie die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:10 codiert. Die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:10 weist eine Aminosäureteilsequenz in Positionen 10–25 und Positionen 243–253 auf, die der in SEQ ID NO:8 bzw. SEQ ID NO:7 gezeigten Sequenz entspricht. Diese Tatsache deutet darauf hin, daß die DNA der SEQ ID NO:5 für eine L-Asparaginase aus Meerschweinchen mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:3 codiert.
In Beispiel 4 wird eine für menschliche L-Asparaginase codierende cDNA von einer mRNA aus menschlicher Leber unter Verwendung der DNA der SEQ ID NO:5 als Sonde gewonnen. Die Aminosäuregesamtsequenz der menschlichen L-Asparaginase wurde durch Analysieren und Entschlüsseln der Basensequenz der cDNA bestimmt.
Beispiel 4
Aminosäuregesamtsequenz der menschlichen L-Asparaginase und Basensequenz der für menschliche L-Asparaginase codierenden DNA
Beispiel 4–1
Herstellung der cDNA-Bibliothek
Unter Verwendung des „cDNA SYNTHESIZING SYSTEM PLUS", einem von Amersham Corp., Div., Amersham International, Arlington Heights, USA, vertriebenen cDNA-Klonierungskits wurde eine cDNA-Bibliothek von einer von Clontech Laboratories, Inc., Kalifornien, USA, vertriebenen poly(A)-modifizierten RNA aus menschlicher Leber hergestellt. Dabei wurden 10 μl einer Erststrangsyntheselösung, 2,5 μl 1 mM Natriumpyrophosphat, 2,5 μl eines Ribonukleaseinhibitors aus menschlicher Plazenta (1 μg/ μl), 5 μl eines Desoxynukleotidtriphosphatgemischs (1 μg/μl) sowie 2,5 μl oligo-dT-Primer (1 μg/μl) in ein 1,5-ml-Reaktionsröhrchen gegeben und danach mit 5 μg einer poly(A)-modifizierten RNA aus menschlicher Leber gemischt. Der Ansatz wurde mit sterilem destilliertem Wasser auf ein Volumen von 45 μl aufgefüllt, danach mit 5 μl einer Lösung mit 100 Einheiten einer reversen Transkriptase gemischt und bei 42°C 40 min inkubiert, so daß ein eine Erststrang-cDNA enthaltendes Reaktionsprodukt erhalten wurde.
Das Reaktionsprodukt wurde mit 93,5 μl einer cDNA-Syntheselösung, 4 Einheiten Ribonuklease H aus Escherichia coli sowie 115 Einheiten DNA-Polymerase I versetzt und das Gemisch mit sterilem destilliertem Wasser auf ein Volumen von 250 μl aufgefüllt, danach nacheinander 60 min bei 12°C, 60 min bei 22°C und 10 min bei 70°C inkubiert, mit 10 Einheiten T4-DNA Polymerase gemischt und nochmals 10 min bei 37°C inkubiert, woraufhin die Reaktion durch Zugabe von 100 μl 0,25 M EDTA (pH 8,0) abgestoppt wurde. Das Reaktionsprodukt wurde in herkömmlicher Weise mit Phenol/Chloroform extrahiert und der Extrakt mit Ethanol unter Erhalt einer Zweitstrang-cDNA gefällt.
Die so erhaltene Zweitstrang-cDNA wurde mit 2 μl L/K-Puffer (ph 8,0), 250 pmol EcoRI-Adaptor sowie 2,5 Einheiten T4-DNA-Ligase gemischt und das Gemisch mit sterilem destilliertem Wasser auf ein Volumen von 20 μl aufgefüllt und bei 15°C 16 Stunden inkubiert, um den EcoRI-Adaptors an beide Enden der cDNA zu ligieren. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 2 μl 0,25 M EDTA (pH 8,0) abgestoppt. Intakter EcoRI-Adaptor wurde aus dem Reaktionsgemisch mittels Molekularsiebchromatographie abgetrennt und das verbliebene Reaktionsgemisch mit 40 μl L/K-Puffer (pH 8,0) sowie 80 Einheiten T4-Polynukleotidkinase gemischt, mit sterilem destillierem Wasser auf ein Volumen von 400 μl aufgefüllt, zur Phosphorylierung des 5'-Terminus des EcoRI-Adaptors 30 min bei 37°C inkubiert und mit Phenol/Chloroform extrahiert. Der Extrakt wurde zum Sammeln der cDNA mit Ethanol gefällt und die cDNA danach mit 1,5 μl L/K-Puffer (pH 8,0), der eine ausreichende Menge an λgt10-arm sowie 2,5 Einheiten T4-DNA-Ligase enthielt, gemischt und der Ansatz dann mit sterilem destilliertem Wasser auf ein Volumen von 15 μl aufgefüllt, 16 Stunden bei 15°C inkubiert und der In-vitro-Verpackung unterzogen, so daß ein Phage mit einer rekombinanten λDNA erhalten wurde.
Beispiel 4–2
Klonierung der rekombinanten DNA
Der Escherichia coli-Stamm NM514 wurde mit dem Phagen in Beispiel 4–1 infiziert, zur Animpfung einer Agarplatte (pH 7,0) mit 10 g/l Bacto-Trypton, 5 g/l Bacto-Hefeextrakt, 10 g/l Natriumchlorid und 15 g/l Bacto-Agar verwendet und 10 Stunden bei 37°C zur Ausbildung von Plaques inkubiert. Ein Nylonfilm wurde auf der Oberfläche der Agarplatte plaziert, der Ansatz dann zur Übertragung der Plaques auf den Film etwa 30 s stehengelassen, woraufhin der Film von der Platte abgezogen und nacheinander und wiederholt in einer wäßrigen Lösung mit 0,5 M Natriumhydroxid und 1,5 M Natriumchlorid 7 min und in 0,5 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) mit 1,5 M Natriumchlorid 3 min getränkt wurde. Der Film wurde mit 2 × SSC gespült, an der Luft getrocknet, in einem Lösungsgemisch mit 5 × SSPE, 5 × Denhardts-Lösung, 0,5% (w/v) SDS sowie 100 μg/ml einer denaturierten Lachssperma-DNA getränkt und 3 Stunden bei 65°C inkubiert.
Zur Klonierung einer rekombinanten DNA wurde eine Sonde 3 hergestellt, indem das DNA-Fragment des SEQ ID NO:5 mit dem „REDIPRIME DNA LABELLING SYSTEM" markiert wurde: 25 ng eines mit dem Verfahren in Beispiel 3–5 erhaltenen DNA-Fragments wurden in ein 1,5-ml-Reaktionsröhrchen gegeben, mit sterilem destilliertem Wasser unter Erhalt einer Lösung von 45 μl gemischt, die danach 3 min auf 95°C erwärmt und anschließend in ein anderes Reaktionsröhrchen überführt wurde. In das Röhrchen wurden 5 μl einer [α-³²P]dCTP-Lösung gegeben, und das DNA-Fragment wurde durch 30minütige Inkubation bei 37°C markiert. Der Reaktionsansatz mit dem markierten DNA-Fragment wurde zur Entfernung von intaktem [α-³²P]dCTP einer herkömmlichen Molekularsiebchromatographie unterzogen, womit die Sonde 3 erhalten wurde.
Der Nylonfilm wurde 20 Stunden bei 50°C in einem Lösungsgemisch mit einer ausreichenden Menge der Sonde 3, 5 × SSPE, 5 × Denhardts-Lösung, 0,5% (w/v) SDS und 100 μg/l einer denaturierten Lachssperma-DNA zur Hybridisierung der Sonde inkubiert, anschließend nacheinander 20 min in 6 × SSC bei Umgebungstemperatur und 20 min in 2 × SSC bei Umgebungstemperatur inkubiert, gewaschen und autoradiographiert, woraufhin ein Phagen-DNA-Klon selektiert wurde, der mit der Sonde 3 stark hybridisierte. Der Klon wurde in herkömmlicher Weise in Escherichia coli amplifiziert und danach eine rekombinante DNA aus dem Mikroorganismus extrahiert. Die rekombinante DNA wurde mit Eco RI, einem Restriktionsenzym, gespalten und in herkömmlicher Weise mittels einer DNA-Ligase mit dem DNA-Fragment sowie einem durch Spaltung des Plasmidvektors pUC19 (ATCC 37254) mit dem Restriktionsenzym erhaltenen Plasmidfragment ligiert. Die rekombinante DNA wurde mittels eines herkömmlichen Verfahrens mit kompetenten Zellen in den Escherichia coli-Stamm JM109 (ATCC 53323) unter Erhalt eines Transformanten eingeführt. Die oben aufgeführten Hybridisierungsbedingungen können als stringente Bedingungen beschrieben werden, insbesondere im Sinne der vorliegenden Erfindung.
Beispiel 4–3
Bestimmung der Basensequenz der für menschliche L-Asparaginase codierenden DNA sowie der Aminosäuregesamtsequenz davon
L-Broth-Medium (pH 7,2) mit 50 μg/ml Ampicillin wurde mit dem Transformanten in Beispiel 4–2 angeimpft und die Kultur unter Schütteln 18 Stunden bei 37°C kultiviert. Die proliferierten Transformanten wurden aus der Kultur gesammelt und einem herkömmlichem Alkali-SDS-Verfahren unterzogen, so daß die vorliegende erfindungsgemäße rekombinante DNA erhalten wurde. Die Analyse der rekombinanten DNA in einem automatischen Sequenziergerät unter Verwendung eines Fluoreszenzphotometers zeigte, daß sie die Basensequenz der SEQ ID NO:11 aufweist. SEQ ID NO:11 enthält ebenfalls eine aus der Basensequenz abgeleitete Aminosäuresequenz, wodurch angedeutet wird, daß die DNA der SEQ ID NO:6 für menschliche L-Asparaginase mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:4 codiert. Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NO:3 und 4 zeigte, daß sie eine Homologie von etwa 70% aufweisen.
Die vorliegende Erfindung beruht, wie oben beschrieben, auf der Entdeckung einer neuen, für eine L-Asparaginase aus Säugern codierenden DNA. Die Anwendung herkömmlicher DNA-Technologie auf die vorliegende DNA ermöglicht die Produktion einer gewünschten Menge an L-Asparaginasen aus Säugern, einschließlich des Menschen, die nicht leicht gewonnen werden konnten.
Die vorliegende Erfindung mit diesen herausragenden Wirkungen dürfte einen großen Beitrag auf diesem Gebiet leisten.
Obwohl das, was zur Zeit als bevorzugte Ausführungsform der Erfindung gilt, beschrieben wurde, versteht es sich, daß sich daran verschiedene Modifikationen durchführen lassen, und daher sollen mit den beigefügten Ansprüchen alle solchen Modifikationen, wie sie im Geist und Schutzumfang der vorliegenden Erfindung enthalten sind, abgedeckt werden.

Claims

DNA, codierend für L-Asparaginase aus Säugern, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA eine Basensequenz umfaßt, die die beiden in SEQ ID NO:1 und SEQ ID NO:2 gezeigten Aminosäuresequenzen codiert, wobei die DNA mit der DNA, die eine wie in SEQ ID NO:5 gezeigte Basensequenz umfaßt, oder/und der DNA, die eine wie in SEQ ID NO:6 gezeigte Basensequenz umfaßt, in einer Lösung aus 5 × SSPE, 5 × Denhardts-Lösung, 0,5% (w/v) SDS und 100 μg/ml einer denaturierten Lachssperma-DNA bei 50°C hybridisierbar ist.
DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA eine Basensequenz umfaßt, die entweder eine wie in SEQ ID NO:3 gezeigte Aminosäuresequenz oder eine zur in SEQ ID NO:3 gezeigten Aminosäuresequenz homologe Aminosäuresequenz codiert.
DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA eine Basensequenz umfaßt, die entweder eine wie in SEQ ID NO:4 gezeigte Aminosäuresequenz oder eine zur in SEQ ID NO:4 gezeigten Aminosäuresequenz homologe Aminosäuresequenz codiert.
DNA nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA eine Basensequenz umfaßt, bei der es sich entweder um die wie in SEQ ID NO:5 gezeigte Basensequenz oder um eine zur in SEQ ID NO:5 gezeigten Basensequenz homologe Basensequenz oder um eine zur in SEQ ID NO:5 gezeigten Basensequenz komplementäre Basensequenz handelt.
DNA nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA eine Basensequenz umfaßt, bei der es sich entweder um die wie in SEQ ID NO:6 gezeigte Basensequenz oder um eine zur in SEQ ID NO:6 gezeigten Basensequenz homologe Sequenz oder um eine zur in SEQ ID NO:6 gezeigten Basensequenz komplementäre Basensequenz handelt.
DNA nach Anspruch 2, die die Basensequenz der SEQ ID NO:10 aufweist:
DNA nach Anspruch 3, die die Basensequenz der SEQ ID NO:11 aufweist:
DNA nach Anspruch 4, wobei eine oder mehrere Basen in SEQ ID NO:5 gegen andere Basen mittels des degenerierten genetischen Codes ausgetauscht werden, ohne daß dabei die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:3 verändert wird.
DNA nach Anspruch 5, wobei eine oder mehrere Basen in SEQ ID NO:6 gegen andere Basen mittels des degenerierten genetischen Codes ausgetauscht werden, ohne daß dabei die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:4 verändert wird.
DNA nach Anspruch 1, die für eine L-Asparaginase aus Meerschweinchen oder Mensch codiert.