DE3888715T2

DE3888715T2 - Reg-Gen und dadurch kodiertes Protein.

Info

Publication number: DE3888715T2
Application number: DE19883888715
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Okamoto
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1987-04-09
Filing date: 1988-04-08
Publication date: 1994-07-14
Anticipated expiration: 2008-04-09
Also published as: EP0286114A2; ES2052630T3; DE3888715D1; EP0286114A3; CA1339608C; EP0286114B1

Description

Die Erfindung betrifft das Reg-Gen von Säugetieren, insbesondere von Menschen und Ratten, und das dadurch codierte Protein.
Insulinerzeugende B-Zellen der Pankreasinseln besitzen eine extrem begrenzte Fähigkeit zur Regeneration, was eine Prädisposition für die Entwicklung von Diabetes schafft.
1984 induzierten Okamoto und seine Kollegen erstmalig erfolgreich die Regeneration von B-Zellen der Pankreasinseln durch tägliche Injektion von Poly(ADP-Ribose)- Synthetaseinhibitoren wie Nicotinamid in Ratten, deren Pankreas zu 90 % entfernt worden war (Yonemura, Y. et al., Diabetes 33 (1984), 401). Zusätzlich wurde jüngst berichtet, daß die Remissionsphase von menschlichem, insulinabhängigem Diabetes durch orale Verabreichung von Nicotinamid in großen Dosen verlängert werden kann (Vague, Ph. et al., Lancet Bd. I Nr. 8533 (1987), 619-620).
Das in dieser Erfindung verwendete Verfahren der Differentialhybridisierung wurde von Takasawa et al. (Diabetes 35 (1986), 1178) entwickelt. Das heißt, ein spezifisch in pankreatischen B-Zell-Tumoren exprimiertes Gen wurde erfolgreich durch differentielles Absuchen einer cDNA-Genbank eines B-Zell-Tumors der Ratte unter Verwendung von cDNA aus Poly(A)&spplus;-RNA von B-Zell-Tumoren und cDNA aus Poly(A)&spplus;-RNA aus normalen Pankreasinseln als Sonden identifiziert.
Die Verabreichung von Insulin ist die einzige, gegenwärtig anerkannte Diabetestherapie. Es wurde gefunden, daß orale Hypoglykämika, wie Sulfonylharnstoff, deren Wirksamkeit einst erwartet wurde, ungünstige Nebenwirkungen, einschließlich der Störung der Fähigkeit der pankreatischen B-Zellen, Insulin zu erzeugen, und der Induktion von Koronararteriosklerose, bei Langzeitverabreichung besitzen.
Wie vorstehend beschrieben, wurde gezeigt, daß die B-Zellen der Pankreasinseln induziert werden konnten, sich in dem verbleibenden Pankreas von Ratten, denen 90 % des Pankreas entfernt worden war, zu regenerieren, wenn den Ratten täglich Poly(ADP-Ribose)-Synthetaseinhibitoren, wie Nicotinamid, verabreicht wurden. Der molekulare Mechanismus dieses Prozesses wurde jedoch noch nicht aufgeklärt.
Um der Mechanismus der Regeneration und Proliferation der B-Zellen der Pankreasinseln zu erhellen, wurde nach einem Gen gesucht, das spezifisch in sich regenerierenden B- Zellen der Pankreasinseln der Ratte exprimiert wird. Das entdeckte Gen wurde als "Reg", d.h. Regenerationsgen bezeichnet. Ferner wurde nach einem menschlichen Reg-Gen unter Verwendung des Ratten-Reg-Gens als Sonde gesucht. Eine menschliche Reg-DNA-Sequenz wurde aus einer menschlichen pankreatischen cDNA-Genbank isoliert.
Fig. 1 zeigt die Basensequenz des Ratten-Reg-Gens und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz. Fig. 2 zeigt die vollständige Basensequenz einer Ratten-Reg-cDNA und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz. Fig. 3 zeigt die Basensequenz einer menschlichen Reg-cDNA und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz.
Man nimmt an, daß das erfindungsgemäße Reg-Gen in engem Bezug zur Regeneration der insulinerzeugenden pankreatischen B-Zellen steht. Durch Massenerzeugung der durch dieses Gen codierten Proteine und ihre Verarbeitung zu einer klinisch verwendbaren Medizin kann möglicherweise eine neue Dimension bei der Behandlung von Diabetes eröffnet werden, wodurch die herkömmliche Therapie der Insulinverabreichung übertroffen wird, nämlich durch Induktion der Regeneration von insulinerzeugenden pankreatischen B-Zellen bei Diabetespatienten.
Obwohl die Mechanismen der Regeneration und Proliferation der pankreatischen B-Zellen noch nicht vollständig verstanden werden, könnte ferner die Isolierung des Reg-Gens gut einen Hinweis zur Erhellung der Mechanismen auf zellulären und molekularen Ebenen liefern.
Wenn das erfindungsgemäße menschliche oder Ratten-Reg-Gen als Sonde verwendet wird, können ähnliche Gene und ihre Produkte in anderen Säugetierarten entdeckt werden, was den Erhalt verwandter Gene und ihrer Produkte ermöglicht. Zuerst wird den Ratten 90 % des Pankreas entfernt, um sich regenerierende pankreatische B-Zellen der Ratte zu erhalten. Dieses Verfahren wurde von V.G. Foglia (Rev. Soc. Argent. Biol. 20 (1944), 21-37) entwickelt. Die Ratten fallen innerhalb eines Monats nach der 90 %-igen Pankreatektomie in einen diabetischen Zustand, aber wenn die Ratten mit der teilweisen Pankreatektomie tägliche Nicotinamid-Injektionen (täglich etwa 0,5 g/kg Gewicht) eine Woche vor bis drei Monate nach der Operation erhalten, wird die Regeneration der Inseln in dem verbleibenden Pankreas induziert, was zur Verhinderung oder Besserung des Diabetes führt. Die sich regenerierenden Pankreasinseln der Ratte werden nach dem bekannten Collagenase-Verfahren isoliert (Okamoto, H. et al, FEBS Lett. 54 (1975), 103; Yamamoto, H., Okamoto, H., Lectures on Internal Secretion Experiment Bd. 3 (1982) 278, Kodansha Scientific, gedruckt in Japan). Die isolierten, sich regenerierenden Inseln werden homogenisiert und die Gesamt-RNA wird durch Gradientenzentrifugation nach dem Verfahren von Chirgwin et al. (Biochemistry 18 (1979), 5294-99) gewonnen. Aus der erhaltenen Gesamt-RNA wird Poly(A)&spplus;-RNA mittels Oligo(dT)-Cellulosechromatographie nach dem Verfahren von H. Aviv und P. Leder (Proc. Natl. Acad. Sci. 69 (1972), 1408-1412) isoliert.
Unter Verwendung der isolierten Poly(A)&spplus;-RNA als Matrize wird cDNA mit reverser Transkriptase synthetisiert, und das Hybrid aus cDNA und RNA wird mit RNaseH und DNA-Polymerase I behandelt, um doppelsträngige cDNA zu erhalten. Dieses Verfahren wird nach der Methode von U. Gubler et al. (Gene 25 (1983), 263-269) durchgeführt. Wenn ein im Handel erhältlicher Kit zur Herstellung von cDNA (z.B. das von Amersham hergestellte cDNA- Synthesesystem) verwendet wird, kann die cDNA leicht hergestellt werden.
Die erhaltene doppelsträngige cDNA wird in einen geeigneten Clonierungsvektor insertiert, und der erhaltene Vektor wird weiter in einen geeigneten Wirt zur Vermehrung eingebracht; danach ist er als cDNA-Genbank sich regenerierender Inseln der Ratte verwendbar. Geeignete Clonierungsvektoren sind Phagenvektoren, wie λgt10 und Plasmidvektoren, wie pNO1523, pKB111, pBR322, pUK, Okayama-Berg, Col E1 und Heidecher-Messing, und als geeignete Wirte können E. coli K-12 HB101, C600, L87 und NM514 ausgewählt werden. Solche Vektoren und Wirte sind im Handel erhältlich. Die cDNA kann ohne Schwierigkeit cloniert werden, wenn im Handel erhältliche cDNA-Clonierungssysteme (z.B. hergestellt von Amersham) verwendet werden.
Um das spezifisch in sich regenerierenden pankreatischen B-Zellen der Ratte exprimierte Gen zu finden, ist es notwendig, zuerst die Insulin-cDNA-Clone aus der cDNA-Genbank zu entfernen.
Der Grund dafür liegt darin, daß der Hauptteil der mRNA in den B-Zellen von den Insulingenen synthetisiert wird, was das Suchen nach Genen, die spezifisch in den sich regenerierenden pankreatischen B-Zellen exprimiert werden, stört. Ein Teil der cDNA-Genbank wird daher auf Nitrocellulose-Filtern fixiert und mit der Insulin-cDNA der Ratte hybridisiert (Metabolism and Disease, Bd. 17, Nr. 7, (1980), 1185), und die Nicht-Insulin-cDNA-Clone, die dabei nicht hybridisieren, werden somit für das anschließende Absuchen verfügbar.
Um die spezifisch in den sich regenerierenden Insel-B- Zellen exprimierten Gene zu suchen, wird ein bekanntes Differential-Absuchverfahren (Takasawa, S. et al., Diabetes 35 (1986), 1178) gewählt. Das heißt, die von der cDNA-Genbank entnommenen Proben werden auf zwei Sätzen von Nitrocellulosefiltern immobilisiert. Die Hybridisierung wird unter Verwendung der aus Poly(A)&spplus;-RNA aus sich regenerierenden Inseln der Ratte hergestellten cDNA, die auf einem Satz der Filter aufgebracht ist, und der aus Poly(A)&spplus;-RNA normaler Inseln hergestellten cDNA, die auf dem anderen Satz der Filter aufgebracht ist, als Sonden durchgeführt.
Der Clon, der nur mit der aus sich regenerierenden Inseln hergestellten Sonde hybridisiert, wird durch Vergleich der Autoradiogramme der beiden Sätze von Filtern ausgewählt, und ein cDNA-Clon des Gens, das spezifisch in den sich regenerierenden Insel-B-Zellen exprimiert wird, wird so erhalten.
Sollte diese Erfindung wiederholt werden müssen, kann das Absuchen leicht unter Verwendung einer unter Bezug auf die in Fig. 1 gezeigte Basensequenz hergestellten Sonde durchgeführt werden. In einer anderen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen und ihre allelischen Derivate durch in vitro DNA-Synthese nach bekannten Verfahren erhalten werden.
Bei der vorliegenden Erfindung konnte eine Art cDNA-Clon des spezifisch in sich regenerierenden Insel-B-Zellen der Ratte exprimierten Gens erhalten werden. Da man annimmt, daß das Gen in enger Beziehung zur Regeneration der Insel-B-Zellen steht, wurde es "Reg-Gen" genannt. Die Basensequenz der cDNA wurde nach dem Verfahren von Sanger et al. unter Verwendung des M13-Systems bestimmt (Methods in Enzymology 101 (1983), 20-78) (Fig. 1). Mit der Basensequenz und der davon abgeleiteten Aminosäuresequenz wurde eine Vielzahl von Untersuchungen auf Homologien durchgeführt, aber keine zeigte eine Homologie von 50 % oder mehr, was somit zeigt, daß es sich um völlig neue DNA und ein neues Protein handelt. Zusätzlich wurden normale Inseln, Leber, Nieren, Gehirn und Insulinome der Ratte auf Gehalte an Reg-mRNA untersucht; sie erwiesen sich jedoch als extrem niedrig.
Das erfindungsgemäße Ratten-Reg-Protein ist nicht auf das Protein mit der in Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenz beschränkt: Da man davon ausgeht, daß die relevante Aktivität selbst bei einigen geringfügigen Substitutionen, Eliminierung, Insertionen oder Additionen einiger Aminosäurereste, oder selbst in einem Teil des Proteins erhalten bleibt, fällt jedes Protein mit der gleichen Aktivität daher unter den Umfang der vorliegenden Erfindung. Gleichermaßen ist ein Ratten-Reg-Gen ebenfalls nicht auf eines mit der in Fig. 1 gezeigten Basensequenz beschränkt, und eine Vielzahl von Genen, die verschiedene Proteintypen codieren, sollen, wie vorstehend ausgeführt, unter den Umfang der vorliegende Erfindung fallen.
Ferner besitzt das abgeleitete Ratten-Reg-Protein eine Vielzahl hydrophober Aminosäurereste am N-Terminus, was auf eine sogenannte Signalsequenz schließen läßt. Folglich scheint das reife, von dem Ratten-Reg-Gen codierte Protein eine Sequenz, die mit Gln in Position 22 beginnt und mit Ala in Position 165 in Fig. 1 aufhört, zu besitzen. Ferner kann das Met an der ersten Position des N-Terminus von dem Protein in einer Zelle entfernt werden, und braucht nicht direkt mit der Aktivität des Reg-Proteins in Bezug zu stehen. Daher umfaßt diese Erfindung jedes Protein, das die gleiche Aktivität wie das Protein besitzt, das mit entweder Met (1.), Thr (2.) oder Gln (22.) beginnt und mit Ala (165.) aufhört, wie in Fig. 1 gezeigt ist. Gleichermaßen umfaßt das erfindungsgemäße Ratten-Reg-Gen jedes beliebige Gen, das die die vorstehenden drei Proteinarten codierende Basensequenz besitzt, d.h. die Sequenz, die entweder mit dem ersten Codon ATG, dem zweiten Codon ACT oder dem 22. Codon CAG beginnt und mit dem 165. Codon GCC oder einem Terminationscodon aufhört. Wenn das Ratten-Reg-Protein gentechnisch hergestellt wird, kann es bevorzugt sein, eine Basensequenz mit einem Initiationscodon ATG (codiert Met) am 5'-Terminus zu verwenden, und daher umfaßt die vorliegende Erfindung weiterhin Gene, in denen ATG mit einem der vorstehenden verschiedenen Gene am 5'-Terminus verknüpft ist, und umfaßt gleichermaßen Proteine, in denen Met an die vorstehenden verschiedenen Proteine am N-Terminus angeheftet ist.
Eine menschliche Reg-DNA-Sequenz kann aus einer menschlichen Pankreas-cDNA-Genbank unter Verwendung eines Teils der Basensequenz des Ratten-Reg-Gens als Sonde erhalten werden.
Eine menschliches pankreas-cDNA-Genbank wird, wie folgt, hergestellt.
Operativ erhaltenes menschliches Pankreas wird homogenisiert, und die Gesamt-RNA wird daraus durch Dichtegradientenzentrifugation nach dem Verfahren von Chirgwin et al. (Biochemistry 18 (1979), 5294-99) gewonnen. Aus der erhaltenen Gesamt-RNA wird Poly(A)&spplus;-RNA mittels Oligo(dT)-Cellulosechromatographie nach H. Aviv und P. Leder (Proc. Natl. Acad. Sci. 69 (1972), 1408-1412) isoliert.
Aus der isolierten Poly(A)&spplus;-RNA wird cDNA mit reverser Transkriptase synthetisiert, und das Hybrid aus cDNA und RNA wird mit RNaseH und DNA-Polymerase I behandelt, um doppelsträngige cDNA zu erhalten. Dieses Verfahren wirdnach der Methode von U. Gubler et al. (Gene 25 (1983), 263-269) durchgeführt. Wenn ein im Handel erhältlicher Kit zur Herstellung von cDNA (z.B. das von Amersham hergestellte cDNA-Synthesesystem) verwendet wird, kann die cDNA leicht hergestellt werden.
Die erhaltene doppelsträngige cDNA wird in einen geeigneten Clonierungsvektor insertiert, und der rekombinante Vektor wird weiter in einen geeigneten Wirt zur Vermehrung eingeschleust; danach ist er als cDNA-Genbank für menschlichen Pankreas verwendbar. Geeignete Clonierungsvektoren sind Phagenvektoren, wie λgt10, und Plasmidvektoren, wie pNO1523, pKB111, pBR322, pUC, Okayama-Berg, Col E1 und Heidecher-Messing, und als geeignete Wirte können E. coli K-12 HB101, C600, L87 und NM514 ausgewählt werden. Solche Vektoren und Wirte sind im Handel erhältlich. Die cDNA kann ohne Schwierigkeit cloniert werden, wenn im Handel erhältliche cDNA-Clonierungssysteme (z.B. hergestellt von Amersham) verwendet werden.
Menschliche Reg-DNA wird aus der erhaltenen cDNA-Genbank unter Verwendung einer aus dem vorstehend beschriebenen Ratten-Reg-Gen hergestellten Sonde herausgesucht. Die Sonde wird folgendermaßen hergestellt: Das Ratten-Reg-Gen wird mit geeigneten Restriktionsenzymen abgebaut, oder ein geeigneter Teil des Ratten-Reg-Gens wird mit einem automatischen DNA-Synthesegerät synthetisiert, wodurch ein DNA-Fragment erhalten wird, das mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I oder der T4-Polynucleotidkinase und mit geeigneten radioaktiv markierten Nucleotiden markiert wird.
Die Sonde wird mit der cDNA-Genbank hybridisiert. Der Clon mit der längsten DNA-Insertion wird aus den positiven Clonen ausgewählt, und die DNA-Insertion wird aus dem Clon isoliert und sequenziert. Als Ergebnis stellt sich heraus, daß das Gen eine Homologie von 77 % mit dem Ratten-Reg-Gen besitzt, und daher wird es als das menschliche Reg-Gen bestimmt. Die von beiden Genen abgeleiteten Aminosäuresequenzen besitzen eine Homologie von 68 %. Die Basensequenz des menschlichen Reg-Gens und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz sind in Fig. 3 gezeigt.
Die Aminosäuresequenz um den von dem menschlichen Reg-Gen abgeleiteten N-Terminus ist reich an hydrophoben Aminosäureresten und gilt dementsprechend als eine Signalsequenz.
Folglich beginnt das reife Protein, das von dem menschlichen Reg-Gen codiert wird, entweder mit Gly (21.), Gln (22.), Ala (24.), Gln (25.), Gln (30.) oder Ala (31.) unter den Aminosäureresten in Fig. 3. Die vorliegende Erfindung umfaßt auch diese reifen Proteine. Wenn diese Proteine gentechnisch hergestellt werden, kann das von einen Initiationscodon abgeleitete Met an den N-Terminus der Proteine angefügt werden. Die vorliegende Erfindung umfaßt auch solche Proteine, die Met am N-Terminus der vorstehenden Proteine tragen.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch jedes Gen, das die Aminosäuresequenz, beginnend mit Ala (1.), Gly (21.), Gln (22.), Ala (24.), Gln (25.), Gln (30.) oder Ala (31.) und aufhörend mit Asn (165.) von den in Fig. 3 gezeigten Aminosäureresten codiert, und jedes Gen, das eine Basensequenz, beginnend mit GCT (1. Codon), GGC (21. Codon), CAA (22. Codon), GCC (24. Codon), CAG (25. Codon), CAG (30. Codon) oder GCC (31. Codon) und aufhörend mit AAC (165. Codon) unter den in Fig. 3 gezeigten Nucleotidresten, besitzt. Die vorliegende Erfindung umfaßt ferner Gene, in denen das Initiationscodon (ATG) und das Terminationscodon (TAA, TAG oder TGA) mit den vorstehend beschriebenen Genen an den 5'- bzw. 3'-Termini verknüpft sind, und Proteine, in denen das Initiationscodon Met an die vorstehend beschriebenen Proteine N-terminal angefügt ist. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die allelischen Derivate der identifizierten Reg-DNA-Sequenzen. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung DNA-Sequenzen, die mit den DNA-Sequenzen von Figur 1 bis 3 unter üblichen Bedingungen hybridisieren. Schließlich fallen auch die mit Expressionsvektoren verknüpften und deren Proteinprodukte unter die Erfindung.
Das von der erfindungsgemäßen menschlichen Reg-DNA-Sequenz codierte Reg-Protein ist nicht auf das Protein mit der in Fig. 3 gezeigten Aminosäuresequenz beschränkt. Da man davon ausgeht, daß die relevante Aktivität selbst bei einigen geringfügigen Substitutionen, Eliminierungen, Insertionen oder Additionen einiger Aminosäurereste, oder selbst in einem Teil des Proteins erhalten bleibt, fällt jedes Protein mit der gleichen Aktivität daher unter den Umfang der vorliegenden Erfindung. Gleichermaßen ist die menschliche Reg-DNA-Sequenz nicht auf eine DNA mit der in Fig. 3 gezeigten Basensequenz beschränkt, und eine Vielzahl von Genen, die verschiedene Typen von den vorstehend aufgeführten Reg-Proteinen codieren, gilt als unter den Bereich der Erfindung fallend.
Die erhaltene cDNA kann nach üblichen Verfahren exprimiert werden. Beispielsweise kann die cDNA nach Insertion in einen geeigneten Expressionsvektor (pKK223-3, pBS, pDRS40, pDR720, pPL-lambda etc.) unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors (z.B. lac, tac, trp, pL) und Einschleusung in einen Wirt (E. coli K-12 AG-1, MM294, DH1, HB101, C600 etc.) exprimiert werden. Wenn das Reg-codierte Protein glycosyliert ist, werden vorzugsweise eukaryotische Zellen, wie Hefe- und Affenzellen, als Wirt verwendet. Wenn beispielsweise Hefe verwendet wird, können verschiedene bekannte Vektoren, wie pGPD-1, pMFα8, AAR6, ABade8, AH5, YEp52, pACF301 und pAM82, als Expressionsvektoren verwendet werden. Wenn die Affenzelle COS verwendet wird, können pKSV-10 und andere als Expressionsvektoren verwendet werden.
Abgesehen von den vorstehenden Wirt-Vektor-Systemen sind die meisten der bekannten Wirt-Vektor-Systeme für die Expression der Reg-Proteine geeignet. Die exprimierten Reg-Proteine können nach herkömmlichen Reinigungsmethoden durch geeignete Kombination von Zentrifugation, Chromatographie, Dialyse, Aussalzen und anderen Verfahren gereinigt werden.
Ferner ist die vorliegende Erfindung nicht auf das menschliche und das Ratten-Reg-Gen und die dadurch codierten Proteine beschränkt. Unter Berücksichtigung der Tatsache, daß die Basensequenzen des menschlichen und des Ratten-Reg-Gens und ihre abgeleiteten Aminosäuresequenzen eine hohe Homologie zeigen, muß ein Reg-artiges Gen auchin anderen Säugerarten gefunden werden. Daher umfaßt die vorliegende Erfindung Reg-Gene und ihre Expressionsprodukte aus anderen Säugerarten. Mit anderen Worten: Die vorliegendeErfindung erlaubt die Isolierung jedes beliebigen Gens, das mit einer Sonde hybridisiert, die unter Bezug auf die Basensequenz des erfindungsgemäßen menschlichen oder Ratten-Reg-Gens hergestellt wurde. Gene, die eine starke Homologie mit dem erfindungsgemäßen menschlichen oder Ratten Reg-Gen zeigen, können leicht aus cDNA- Genbanken anderer Säuger-Bauchspeicheldrüsen unter Verwendung des menschlichen oder Ratten-Reg-Gens oder Teilen davon als Sonde erhalten werden. Vorzugsweise dürfte als Sonde eine markierte DNA bestehend aus dem vollständigen erfindungsgemäßen menschlichen oder Ratten-Reg-Gen oder einem Teil davon (20-100 Basen) zu verwenden sein. Proteine, die von solchen Genen codiert werden, fallen natürlich unter den Umfang der vorliegenden Erfindung. Folglich beziehen sich die gemäß dieser Erfindung verwendeten Ausdrticke "Reg" und "Reg-Protein" nicht nur auf die entsprechenden Gene und Proteine, die in Menschen und Ratten vorkommen, sondern auch auf solche, die in anderen Säugerarten gefunden werden.

Beispiel

I. Isolierung der sich regenerierenden Pankreasinseln der Ratte

(1) 90 %-ige Pankreatektomie

Bei männlichen Wistar-Ratten mit einem Gewicht von 200 bis 300 g wurde unter Etheranästhesie eine Laparotomie, vorgenommen, und das Pankreas wurde mit Ausnahme des parabiliären Segments (entsprechend 90 % des gesamten Pankreas) herausgeschnitten, und der eingeschnittene Teil wurde geschlossen. Die 90 %-ige Pankreatektomie wurde von V.G. Foglia (Rev. Soc. Argent. Biol. 20 (1944), 21-37) eingeführt, und wird weithin zur Schaffung von Modellen für insulinabhängigen Diabetes verwendet. Die Ratten fallen innerhalb eines Monats nach der 90 %-igen Pankreatektomie in einen diabetischen Zustand.

(2) Verabreichung von Nicotinamid

50 mg/ml Nicotinamid in physiologischer Kochsalzlösung wurde intraperitoneal einmal täglich in einer Dosis von 0,5 g/kg Körpergewicht 7 Tage vor bis 3 Monate nach der 90 %-igen Pankreatektomie verabreicht. Die Verabreichung von Nicotinamid verhinderte und verbesserte den diabetischen Zustand der Ratten, denen 90 % des Pankreas entfernt worden war.

(3) Isolierung der sich regenerierenden Inseln

Durch die vorstehenden Schritte (1) und (2) wurde die Regeneration der Inseln in dem verbleibenden Pankreas induziert, und sowohl die Anzahl der Inseln pro Volumeneinheit Pankreas, als auch die Größe pro Insel nahm zu, wobei die Zunahme der Anzahl der Insel-Zellen für die ihrer Größe verantwortlich war. Die meisten der zunehmenden Zellen waren insulinerzeugende B-Zellen und die Anzahl der glucagonerzeugenden A-Zellen und der somatostatinerzeugenden D-Zellen war unverändert (Yonemura, Y. et al., Diabetes 33 (1984), 401). Drei Monate nach der Operation wurden die mit Nicotinamid behandelten Ratten, deren Pankreas zu 90 % entfernt worden war, unter Nembutal-Anästhesie einer Laparotomie unterworfen, und das restliche Pankreas wurde nach Aufquellen mit Hank-Lösung entfernt. Die Pankreata wurden in 5 ml Hank-Lösung fein vermahlen, und je zwei verwendete Pankreata wurden 150 mg Rinderserumalbumin (Sigma, Typ V) und 40 mg Collagenase (Wako Pure Chemical Industries Ltd., Typ IV) zugesetzt, und das Gemisch wurde 3 bis 5 Minuten bei 37ºC zum Abbau geschüttelt. Nach dem Abbau wurde die Lösung in 50 ml Hank-Lösung suspendiert und 5 min lang zur Präzipitierung der Inseln stehen gelassen. Dann wurde die obere Phase der Hank-Lösung entfernt, und weitere 25 ml frische Hank-Lösung wurden zugesetzt. Das Gemisch wurde wieder suspendiert. Nachdem das Stehenlassen, das Entfernen und das Resuspendieren 8-mal durchgeführt worden waren, wurden die sich regenerierenden Inseln unter einem Stereomikroskop gesammelt. Dann wurden 1355 sich regenerierende Inseln aus 32 Ratten, denen das Pankreas zu 90 % entfernt worden war, und die mit Nicotinamid behandelt worden waren, gesammelt. Das vorstehende Verfahren entspricht im Grunde dem von Yamamoto und Okamoto (Lecture of Internal Secretion Experiment Bd. 3, (1982), 278, Kodansha Scientific, gedruckt in Japan) beschriebenen Verfahren.

II. Herstellung einer cDNA-Genbank der sich regenerierenden Pankreasinseln der Ratte

(1) Isolierung von Gesamt-RNA

Die isolierten, sich regenerierenden Inseln wurden durch Beschallung bei 4ºC im 4 M Guanidiniumisothiocyanat, 10 mM Natriumcitrat (pH 7,0), 0,5 % Natriumlaurylsarcosin, 0,1 M 2-Mercaptoethanol und 1 % Antifoam A (Sigma) aufgebrochen.
Das Gemisch wurde auf Cäsiumtrifluoracetat mit einer Dichte von 1,64 (Pharmacia) geschichtet und 14 bis 16 Stunden bei 25ºC mit 180 000 x g zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde das RNA-Präzipitat gewonnen. Aus 1355 sich regenerierenden Inseln wurden 885 ug Gesamt-RNA erhalten (Chirgwin, J.M. et al, Biochemistry 18 (1979),5294-99).

(2) Isolierung von Poly(A)±-RNA

Aus der in vorstehender Stufe (1) erhaltenen Gesamt-RNA wurden 17,2 ug Poly(A)&spplus;-RNA mittels Oligo(dT)-Cellulose- Säulenchromatographie (H. Aviv und P. Leder, Proc. Natl. Acad. Sci. 69 (1972), 1408-1412) isoliert.

(3) Herstellung einer cDNA-Genbank

Zuerst wurden unter Verwendung von 2 ug Poly(A)&spplus;-RNA aus sich regenerierenden Inseln als Matrize und Oligo(dT) als Primer und durch deren einstündige Inkubation mit 40 Einheiten reverser Transkriptase bei 42ºC 182 ng cDNA (erster Strang) synthetisiert. Das erhaltene cDNA-RNA-Hybrid wurde mit 0,75 Einheiten RNaseH, 46 Einheiten DNA-Polymerase I und 4 Einheiten T4 DNA-Polymerase behandelt, wodurch 284 ng doppelsträngige cDNA erhalten wurden. Die Synthese der vorstehend angegebenen cDNA wurde im wesentlichen nach dem Verfahren von U. Gubler et al. (Gene 25 (1983), 263-269) durchgeführt.
Die doppelsträngige cDNA wurde mit 15 Einheiten EcoRI-Methylase (New England Biolabs) behandelt und an 450 ng eines EcoRI-Linkers mit 175 Einheiten T4 DNA-Ligase (Takara Shuzo) 45 Stunden bei 13ºC ligiert.
Das vorstehende Produkt wurde mit 76 Einheiten EcoRI (Takara Shuzo) zwei Stunden lang bei 37 ºC gespalten und auf Sephacryl S-1000 (Pharmacia) zur Trennung in cDNA und den abgebauten Linker aufgebracht. Durch die vorstehenden Stufen wurden 214 ng EcoRI-Methylase-behandeltes EcoRI-Fragment (doppelsträngige cDNA) erhalten.
20 ng der vorstehenden cDNA wurden mit 1,23 ug der λgt10- Arme (mittels alkalischer Phosphatase nach Abbau mit EcoRI, Stratagene, am 5'-Terminus dephosphoryliert) unter Verwendung von 116 Einheiten T4 DNA-Ligase (Takara Shuzo) 15 Stunden lang bei 13ºC ligiert. Die mit λgt10 ligierte cDNA sich regenerierender Inseln wurde unter Verwendung von Gigapack (Stratagene) verpackt und in den von E. coli K-12 abstammenden Y1089 (DNA Cloning, Bd. 1, 49-78, 1985, IRL-Press) eingeschleust. So wurden insgesamt 2,8 x 10&sup6; Transformanten erhalten.

III. Differentielles Absuchen der cDNA-Genbank sich regenerierender Inseln

Isolierung von spezifisch in sich regenerierenden Inseln exprimierten Genen

Aus jedem der willkürlich aus den in vorstehender Stufe II hergestellten cDNA-Genbanken sich regenerierender Inseln ausgewählten, 5000 unabhängigen Plaques wurden Phagen mit Zahnstochern in NZY-0,2% Maltosemedium (1% NZ-Amin, 0,5 % Bacto-Hefeextrakt, 0,5 % Natriumchlorid und 0,2 % Maltose), das Y1089 entsprechend 0,5 0D&sub6;&sub0;&sub0; in Mikrotiterplatten (96 Vertiefungen) enthielt, inokuliert und über Nacht bei 37ºC zur Proliferation inkubiert. Zwei ul jeder erhaltenen Phagenlösung wurden auf Nitrocellulosefilter (Schleicher und Schüll, BA85) aufgetropft und mit durch Nicktranslation-³²P markierter Ratteninsulin-II-cDNA hybridisiert. Als Ergebnis wurden 16 % der Clone als Insulin-cDNA-Clone identifiziert, und die verbleibenden 84 % Nicht-Insulin- cDNA-Clone standen für das anschließende Absuchen zur Verfügung.
150 ng Poly(A)&spplus;-RNA aus den sich regenerierenden Inseln der Ratte oder aus normalen Inseln unbehandelter Ratten wurden 2 Stunden bei 37ºC mit 15 Einheiten reverser Transkriptase (Seikagaku Kogyo) in Gegenwart von 41 ng Oligo(dT)&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8;, 20 mM dATP, 20 mM dTTP, 20 mM dGTP, 2 uM dCTP und 60 uCi [α -³²P)dCTP (Amersham) inkubiert. Danach wurde die RNA-Kette mit 0,3 N Natriumhydroxid (2 min bei 100ºC) abgebaut, und die erzeugte, mit ³²P markierte, einzelsträngige cDNA wurde durch Präzipitation mit Ethanol gewonnen. Nach diesem Verfahren wurden Sonden mit einer spezifischen Aktivität von 1 bis 2 x 10&sup8; cpm/ug Poly(A)&spplus;-RNA erhalten.
Auf zwei Sätze Nitrocellulosefilter wurden 2 ul-Proben jeder Phagenlösung der Nicht-Insulin-cDNA-Clone aufgetropft, bei Raumtemperatur 5 min lang mit 0,5 M Natriumhydroxid/ 1,5 M Natriumchlorid und dann weitere 5 min lang mit 0,5 M Tris-Salzsäure (pH 8,0)/1,5 M Natriumchlorid behandelt, dann in 2 x SSC (1 x SSC: 0,15 M Natriumchlorid und 0,015 M Natriumcitrat) getaucht und 2 h bei 80ºC gebacken.
Die gebackenen Nitrocellulosefilter ließ man 30 min in 3 x SSC bei 65ºC und dann 1 h in 3 x SSC und 1 x FBP (Denhardt-Lösung: 0,02 % Ficoll 400, 0,02 % Rinderserumalbumin und 0,02 % Polyvinylpyrrolidon) bei 65ºC reagieren. Sie wurden 1 h bei 65ºC in 1 M Natriumchlorid, 50 mM Tris-Salzsäure (pH 7,4), 10 mM EDTA, 0,1 % SDS, 1 x FBP, 10 ug/ml Lachshoden-DNA und 250 ug/ml Poly(U) (Pharmacia) prähybridisiert. Die Hybridisierung wurde unter Verwendung von 1,5 x 10&sup7; cpm aus Poly(A)&spplus;RNA aus sich regenerierenden Inseln von Ratten gewonnener cDNA als Sonde für einen Satz von Filtern (wie vorstehend beschrieben) und unter Verwendung von 1,5 x 10&sup7; cpm aus Poly(A)&spplus;RNA aus normalen Inseln von unbehandelten Ratten gewonnener cDNA als Sonde für den anderen Satz von Filtern in 1 M Natriumchlorid, 50 mM Tris-Salzsäure (pH 7,4), 10 mM EDTA (pH 8,0), 0,1 % SDS und 250 ug/ml Poly(U) für 16 h bei 65ºC durchgeführt.
Nach der Hybridisierung wurden die Filter zweimal 1 bis 2 min mit 2 x SSC bei Raumtemperatur und weiterhin 4 mal 40 min mit 0,1 x SSC/0,1 % SDS bei 65ºC gewaschen und bei 80ºC 1 h getrocknet. Die Autoradiographie wurde über Nacht bei -80ºC durchgeführt. Als Ergebnis konnte eine Art Clon, der durchweg spezifisch mit cDNA sich regenerierender Inseln hybridisierte, erhalten werden.

IV. Sequenzierung des spezifisch in den sich regenerierenden Insel-B-Zellen der Ratte exprimierten Gens

Die in vorstehender Stufe III erhaltene DNA des Phagen-cDNA-Clons, die das spezifisch in den sich regenerierenden Inseln exprimierte Gen enthielt, wurde präpariert (vgl. T. Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1982, 80ff) und mit EcoRI gespalten. Die cDNA-Insertion wurden von den Phagenvektorarmen mittels Gelelektrophorese auf 1 %-iger Agarose abgetrennt. Die Basensequenz der isolierten cDNA wurde nach dem Sanger-Verfahren unter Verwendung des M13-Systems (mp18 und mp19, Pharmacia) bestimmt (Methods in Enzymology 101 (1983), 20-78).
Als Ergebnis wurde gefunden, daß das spezifisch in sich regenerierenden Inseln exprimierte Transkript eine Gesamtlänge von 749 Nucleotiden ausschließlich der Poly(A)-Teile umfaßt und ein Protein aus 165 Aminosäureresten, beginnend mit Methionin und aufhörend mit Alanin, codiert. Die vollständige Basensequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz sind in Fig. 2 gezeigt.
Die Computeranalyse der Nucleinsäure- und Proteindatenbanken (Verfahren nach Wibur, W.J. & Lipman, D.J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 726-730) des Europäischen Laboratoriums für Molekularbiologie (Heidelberg), der Genbank (Cambridge, Massachusetts) und der National Biomedical Research Foundation (Washington, DC) zeigte, daß die Basensequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz der erfindungsgemäßen, neu clonierten cDNA sich von allen bekannten Genen oder Genprodukten unterschieden, und kein Gen oder Genprodukt mit 50 % oder mehr Homologie in den Datenbanken gefunden werden konnte. Folglich wird die aus der cDNA-Genbank der sich regenerierenden Inseln clonierte cDNA als einem völlig neuen, vorher nie beschriebenen Gen entsprechend angesehen, und das Gen wurde als "Reg" (Regenerationsgen) bezeichnet.

V. Untersuchung der Reg-mRNA

RNA wurde aus sich regenerierenden Inseln der Ratte und normalen Inseln nach dem in II-(1) beschriebenen Verfahren isoliert, und 4 ug RNA aus jeder Quelle wurden mit 1,1 M Formalin denaturiert, einer Gelelektrophorese auf 1,5 % Agarose, enthaltend 1,1 M Formalin, unterworfen und auf einen Nitrocellulosefilter überführt. Das Filter wurde 2 h bei 80ºC gebacken, 4 h bei 42ºC in 50 % Formamid, 5 x FBP, 5 x SSPE (1 x SSPE: 0,18 M Natriumchlorid, 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,7) und 1 mM EDTA), 250 um/ml Lachshoden-DNA und 0,1 % SDS prähybridisiert und nacheinander 20 h bei 42ºC in 50 % Formamid, 1 x FBP, 5 x SSPE, 0,1 % SDS und 100 ug/ml Lachshoden-DNA-Lösung, enthaltend 20 ng/ml mit ³²P mittels Nick-Translation markierte Reg-cDNA hybridisiert, dann zweimal bei Raumtemperatur 30 min lang in 2 x SSC/0,1 % SDS und zweimal bei 37ºC eine Stunde lang in 0,1 x SSC/0,1 % SDS gewaschen und schließlich autoradiographiert (-80ºC).Die Ergebnisse zeigten, daß die Reg-mRNA eine Kettenlänge von etwa 900 Nucleotiden besaß und reichlich in den sich regenerierenden Inseln, aber extrem selten in den normalen Inseln vorkam.
Wenn die mRNA in Rattenleber, -nieren, -gehirn und -insulinomen (Streptozotocin-induziert) auf gleiche Weise analysiert wurde, wurde gefunden, daß die Gehalte an Reg-mRNA in diesen Geweben extrem niedrig waren.

Beispiel 2

I. Isolierung von menschlichem Reg

1. Herstellung einer menschlichen Pankreas-cDNA-Genbank

a) Es ist unmöglich, menschliche, sich regenerierende Langerhansinseln zu präparieren, und daher wurde eine cDNA-Genbank aus menschlichem, durch Operation erhaltenem Pankreasgewebe hergestellt. In dem Pankreasgewebe der Ratte war der Gehalt an Reg-mRNA niedrig, aber immer noch nachweisbar, und daher wurde angenommen, daß menschliches Pankreasgewebe ähnliche Eigenschaften zeigen würde.

b) Isolierung von Gesamt-RNA

Operativ erhaltenes menschliches Pankreas wurde bei 4ºC mit Polytron in 4 M Guadiniumisothiocyanat, 10 mM Natriumcitrat (pH 7,0), 0,5 % Natriumlaurylsarcosin, 0,1 M 2-Mercaptoethanol und 1 % Antifoam A (Sigma) aufgebrochen. Das Gemisch wurde auf Cäsiumtrifluoracetat mit einer Dichte von 1,64 (Pharmacia) geschichtet und 14 bis 16 h bei 25ºC und 180 000 x g zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde das RNA-Prazipitat gewonnen. Aus 500 mg Pankreasgewebe wurden 2,526 mg RNA erhalten (Chirgwin J.M. et al. Biochemistry 18 (1979), 5294-99).

c) Isolierung von Poly(A)±-RNA

Aus der in vorstehender Stufe (b) erhaltenen Gesamt-RNA wurden 17,56 ug Poly(A)&spplus;-RNA mittels Oligo(dT)-Cellulose- Säulenchromatographie isoliert (H. Aviv & P. Leder, Proc. Natl. Acad. Sci. 69 (1972), 1408-1412)

d) Herstellung der cDNA-Genbank

Zuerst wurden unter Verwendung von 1 ug menschlicher pankreatischer Poly(A)&spplus;RNA als Matrize und Oligo(dT) als Primer und durch deren einstündige Inkubation mit 40 Einheiten reverser Transkriptase bei 42ºC etwa 100 ng cDNA (erster Strang) synthetisiert. Das erhaltene cDNA- RNA-Hybrid wurde mit 0,75 Einheiten RNaseH, 46 Einheiten DNA-Polymerase I und 4 Einheiten T4 DNA-Polymerase behandelt, wodurch etwa 150 ng doppelsträngige cDNA erhalten wurden. Die vorstehend beschriebene Synthese der cDNA wurde im wesentlichen nach der Methode von U. Gubler et al. (Gene 25 (1983), 263-269) durchgeführt.
Die cDNA (doppelsträngig) wurde mit 15 Einheiten EcoRI- Methylase (New England Biolabs) behandelt und an 450 ng eines EcoRI-Linkers mit 175 Einheiten T4 DNA-Ligase (Takara Shuzo) 45 h bei 13ºC ligiert.
Das vorstehende Produkt wurde mit 76 Einheiten EcoRI (Takara Shuzo) 2 h bei 37 ºC gespalten und auf Sephacryl S-1000 (Pharmacia) zur Auftrennung in cDNA und den abgebauten Linker aufgebracht. Durch die vorstehenden Schritte wurden 17,6 ng eines EcoRI-Methylase behandelten EcoRI-Fragments (doppelsträngige cDNA) gewonnen.
Die vorstehende cDNA wurde an 1,0 ug der λgt10-Arme (5'-terminal mittels alkalischer Phosphatase nach Spaltung mit EcoRI, Stratagene, dephosphoryliert) mit 116 Einheiten T4-DNA-Ligase (Takara Shuzo) 15 h bei 13ºC ligiert. Die an λgt10 ligierte menschliche Pankreas-cDNA wurde mit Gigapack (Stratagene) verpackt, in von E. coli K12 abstammenden Y1089 (DNA Cloning, Bd. 1, 49-78, 1985, IRL-Press) eingeschleust, und so wurden insgesamt 6 x 10&sup5; Transformanten erhalten.

2. Clonierung einer menschlichen Rea-cDNA aus einer cDNA-Genbank von menschlichem Pankreas

a) Aus jedem Plaque der hergestellten cDNA-Genbank von menschlichem Pankreas wurden Phagen in Maltosemedium (0,2 % Maltose, 1 % NZ-Amin, 0,5 % Bacto-Hefeextrakt und 0,5 % Natriumchlorid), enthaltend Y1089 entsprechend 0,5 OD&sub6;&sub0;&sub0;, inokuliert und über Nacht zur Proliferation bei 37ºC inkubiert. Als Ergebnis wurden 10&sup6; Plaques auf einem Agarmedium (Durchmesser 150 mm) gebildet und auf Nitrocellulosefilter überführt.
b) Ein 60 Basen langes Oligodesoxyribonucleotid, entsprechend der Basensequenz 76 bis 135 des Ratten-Reg (Fig. 1), wurde mit einem DNA-Synthesegerät (Applied Biosystems Model 380 B) 5ynthetisiert, und sein 5'-Terminus wurde mit ³²P unter Verwendung von [Y-³²P] ATP und T4-Polynucleotidkinase markiert.
c) Die in der vorstehenden Stufe a) erhaltenen Nitrocellulosefilter wurden bei Raumtemperatur 5 min mit 0,5 N Natriumhydroxid/1,5 M Natriumchlorid und dann weitere 5 min mit 0,5 M Tris-Salzsäure (pH 8,0)/1,5 M Natriumchlorid behandelt, und dann in 2 x SSC (1 x SSC: 0,15 M Natriumchlorid und 0,015 M Natriumcitrat) getaucht und 2 h bei 80ºC gebacken.
Die gebackenen Nitrocellulosefilter wurden bei 50ºC 4 h in 6 x SSC, 5 x FBP (1 x FBP: 0,02 % Ficoll 400, 0,02 % Rinderserumalbumin und 0,02 % Polyvinylpyrrolidon), 0,1 % SDS und 200 ug/ml E. coli tRNA prähybridisiert, mit dem ³²P-markierten Oligodesoxyribonucleotid bei 50ºC 12 - 16 h in 6 x SSC, 1 x FBP, 0,1 % SDS und 100 ug/ml E. coli tRNA, enthaltend 2 ng/ml ³²P-markiertes Oligodesoxyribonucleotid, hybridisiert und 4 mal gewaschen, jeweils 30 min bei 50ºC mit 6 x SSC und 0,1 % SDS.
d) Als Ergebnis wurden 58 Clone aus 10&sup6; cDNA-Clonen von menschlichem Pankreas mit der Ratten-Reg-Sonde aus 60 Basen hybridisiert.
e) Aus den positiven Clonen wurde der Clon mit der längsten Insertion (etwa 900 Nucleotide) ausgewählt. Die DNA- Insertion wurde aus dem Clon isoliert, mit EcoRI gespalten und dann in den pBS-Vektor (Stratagene) an der EcoRI-Spaltstelle subcloniert.

II. Sequenzierung der menschlichen Reg-cDNA

a) Die Basensequenz der in den pBS-Vektor subclonierten cDNA wurde nach dem Sanger-Verfahren bestimmt (Methods in Enzymology 101 (1983), 20-78).
b) Als Ergebnis wurde gefunden, daß die menschliche Reg-cDNA eine Gesamtlänge von 749 Nucleotiden, ausschließlich des Poly-(A)-Anteils, hat und ein Protein aus 166 Aminosäureresten, beginnend mit Methionin und aufhörend mit Asparagin, codiert.
c) Das durch das menschliche Reg codierte Protein ist um eine Aminosäure länger als das von dem Ratten-Reg codierte Protein aus 165 Aminosäureresten. Die Basensequenz der codierenden Region des menschlichen Regs und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz zeigen Homologien von 75 % bzw. 68 % mit denen des Ratten-Reg.
d) Die Sequenz um den N-Terminus des menschlichen Reg-Proteins ist reich an hydrophoben Aminosäureresten. Dies ist das Hauptcharakteristikum der Signalpeptide von sekretorischen Proteinen. Also wurde gefolgert, daß die mit Met (-1) beginnende und mit entweder Gln (20), Gly (21), Glu (23), Ala (24), Pro (29) oder Ser (30) aufhörende Sequenz im menschlichen Reg-Protein ein Signalpeptid ist.

Claims

1. Reg (Regenerations)-Gen, mit einer Sonde hybridisierend, die mindestens einem Teil der gesamten Basensequenz entspricht, die die in Fig. 1 (Ratten-Reg-Protein) oder Fig. 3 (menschliches Reg-Protein) gezeigte Aminosäuresequenz codiert.

2. Gen nach Anspruch 1, wobei die Basensequenz die in Fig. 1 (Ratten-Reg-Gen) oder Fig. 3 (menschliches Reg-Gen) gezeigte Basensequenz umfaßt.

3. Gen nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Gen in einem Säugerpankreas exprimiert wird.

4. Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Säuger entweder Mensch oder Ratte ist.

5. Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, ein Protein codierend, das die in Fig. 1 gezeigte Aminosäuresequenz enthält.

6. Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Aminosäuresequenz wie in Fig. 1 entweder mit Met (1.), Thr (2.), Gln (22.) oder Met-Gln (22.) beginnt und mit Ala (165.) aufhört.

7. Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 6, das die in Fig. 1 gezeigte Basensequenz enthält.

8. Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Basensequenz entweder mit ATG (1. Codon), ACT (2. Codon), CAG (22. Codon) oder ATG-CAG (22. Codon) beginnt und entweder mit GCC (165. Codon) oder dem in Fig. 1 gezeigten Terminationscodon aufhört.

9. Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und 8, das ein die in Fig. 3 gezeigte Aminosäuresequenz enthaltendes Protein codiert.

10. Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und 8 bis 9, wobei die Aminosäuresequenz, wie in der Aminosäuresequenz von Figur 3 gezeigt, mit Ala (1.), Gly (21.) Gln (22.), Ala (24.), Gln (25.), Gln (30.) oder Ala (31.) beginnt und mit Asn (165.) aufhört.

11. Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und 8 bis 10, wobei die Basensequenz wie in der Basensequenz von Fig. 3 gezeigt, GCT (1. Codon), GGC (21. Codon), CAA (22. Codon), GCC (24. Codon), CAG (25. Codon), CAG (30. Codon) oder GCC (31. Codon) bis AAC (165. Codon) umfaßt.

12. Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 11, das außerdem ein Initiationscodon am 5'-Ende und/oder ein Terminationscodon am 3'-Ende enthält.

13. Rekombinantes DNA-Molekül, das ein Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 12 enthält.

14. Wirtsorganismus, der mit einem rekombinanten DNA-Molekül nach Anspruch 13 transformiert ist.

15. Protein, das von dem Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 12 codiert wird.

16. Verfahren zur Herstellung eines Gens nach einem der Ansprüche 1 bis 12, das mit einer Sonde hybridisiert, die einem Teil oder der gesamten Basensequenz entspricht, die die in Fig. 1 oder Fig. 3 gezeigte Aminosäuresequenz codiert, umfassend die Herstellung einer Säugerpankreas- cDNA-Genbank und die Selektion des Gens unter Verwendung dieser Sonde.

17. Verfahren zur Herstellung eines Proteins nach Anspruch 15, umfassend das Einschleusen eines Vektors, der ein Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 12 unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors trägt, in einen geeigneten Wirt, die Züchtung des Wirts in einem Medium und die Gewinnung des Proteins aus der Kultur.