DE69131044T2

DE69131044T2 - Interleukin-i antagonist und seine verwendung

Info

Publication number: DE69131044T2
Application number: DE69131044T
Authority: DE
Inventors: John Haskill; George Martin; Peter Ralph
Original assignee: University of North Carolina at Chapel Hill; Chiron Corp; University of North Carolina System
Current assignee: University of North Carolina at Chapel Hill; Novartis Vaccines and Diagnostics Inc; University of North Carolina System
Priority date: 1990-05-01
Filing date: 1991-04-10
Publication date: 1999-11-18
Anticipated expiration: 2011-04-11
Also published as: ATE178094T1; CA2081774A1; EP0534978A1; US5455330A; AU655766B2; JPH05506986A; DE69131044D1; AU7692791A; EP0534978B1; WO1991017249A1; US5874561A

Description

Diese Erfindung betrifft das Gebiet der Molekularbiologie/Biochemie. Beschrieben werden hier Zusammensetzungen, die prophylaktische oder therapeutische Anwendung bei der Behandlung von Krankheiten, die durch die Produktion von Cytokinen verursacht werden, finden. Insbesondere wird ein Inhibitormaterial vorgestellt, das die biologische Aktivität des Cytokins Interleukin-1 (IL-I) beeinflußt.
Cytokine sind Proteine mit niederem Molekulargewicht, die unzählige biologische Funktionen haben. Zum Beispiel ist von Cytokinen bekannt, daß sie fähig sind, ihre eigene Synthese sowie die Herstellung anderer Cytokine von einer Vielzahl von Zelltypen zu stimulieren. Sie sind auch mit einer Krankheit assoziiert. Ein gutes Beispiel ist die Anwesenheit der Cytokine Interleukin-1 (IL-I) und Tumornekrosefaktor (TNF). Für IL-1 wurde gezeigt, das es mehrere biologische Aktivitäten aufweist, wobei die zwei auffallendsten die Fiebererzeugung und die Lymphocytenaktivierung sind. Außerdem rufen beide Cytokine allein oder in Verbindung miteinander einen Schockzustand bei Tieren hervor, der hämodynamisch und hämatologisch für einen septischer Schock beim Menschen, der durch eine bakterielle Infektion hervorgerufen wurde, charakteristisch ist. Außerdem wurde für TNF vor kurzem gezeigt, daß er bei der Initiation der Expression des menschlichen Immunschwächevirus in menschlichen Zellen, die das latente Virus tragen, beteiligt ist. Folks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86 (1989), 2365. TNF und IL-1 spielen auch eine Rolle bei verschiedenen Autoimmunkrankheiten, insbesondere bei Arthritis. Duff et al., International Conference on Tumor Necrosis Factor and Related Cytotoxins 175 (1987), 10.
Ergänzend zu 11-1 und TNF wurde für ein anderes Cytokin, IL-6, vor kurzem gezeigt, daß es bei einer Infektion, insbesondere Sepsis, sowie bei der Beeinflussung des Wachstums von Tumorzellen beteiligt ist. Hack et al., Blood 74 (1989), 1704, und Miki et al., FEB 250 (1989), 607. IL-6 wird auch als Hybridom-Wachstumsfaktor, Interferon-beta-2, B-Zellen-stimulierender Faktor, 26-Kilodalton-Protein und Hepatocyten-stimulierender Faktor bezeichnet.
Wie vorstehend angedeutet, ist IL-1 eines von mehreren Cytokinen, die von Makrophagen nach Stimulation durch bakterielle Endotoxine, insbesondere LPS, produziert und sezerniert werden, und es steht somit im Verdacht, eine Rolle bei der Auslösung der Kaskade von Krankheitssymptomen nach dem Aussetzen eines Organismus gegen ein Endotoxin zu spielen. Zum Beispiel ist eines der klinischen Symptome von Sepsis die intravaskuläre Koagulation, die sich in verminderten Plasmakonzentrationen verschiedener Koagulationsfaktoren, wie Faktor XII, zeigt. Dieser Aspekt des klinischen Verlaufs der Krankheit steht im Einklang mit in vitro-Studien, die gezeigt haben, daß LPS sowohl das Kontaktsystem der spezifischen Koagulation als auch das Komplementsystem aktivieren kann. Morris E. C. et al., J. of Experimental Med. 140 (1974), 797, und Morrison D. C. et al., American Journal of Pathology 93 (1978), 527. Es wurde gezeigt, daß die IL-1-Wechselwirkung mit Endothelzellen die Prokoagulationsaktivität und das Anhaften von Endothelzellen bei Leukocyten verstärkt. Es wird angenommen, daß IL-1 als Folge einer Endotoxin-Exposition einen Inhibitor des Gewebeplasminogenaktivators induziert, der die während einer akuten entzündlichen Reaktion ablaufenden Koagulationsereignisse verstärkt. Schließlich wird angenommen, daß IL-1 die Produktion des Thrombocyten-aktivierenden Faktors und von Arachidonsäuremetaboliten verursacht, von denen beide bei der Antwort eines Organismus auf ein Endotoxin beteiligt sind. Es ist bemerkenswert, daß der Thrombocyten-aktivierende Faktor und die Arachidonsäuremetabolite als Antwort auf ein Endotoxin auch direkt produziert werden.
Es gibt zwei Formen von 11-1 : IL-1-α und IL-1-β. Obwohl diese Moleküle eine begrenzte Sequenzhomologie gemeinsam haben, weisen sie eine ähnliche biologische Aktivität auf. Dinarello C. A. et al., Journal Clinical Invest. 77 (1986), 1734. Beide Moleküle haben Molekulargewichte von etwa 17,5 kD und werden aus einem Vorläufermolekül mit einem Molekulargewicht von etwa 31 kD hergestellt.
Da IL-1 polyphäne biologische Aktivitäten aufweist, von denen viele den Organismus ungünstig beeinflussen, wird erwartet, daß das Molekül rigide reguliert werden muß, damit es nicht schädlich ist. Tatsächlich gibt es mehrere Berichte über IL-1-Inhibitoren, die die Wirkung von IL-1 regulieren. Über die IL-1-Inhibitoraktivität in Monocyten-konditioniertem Medium wurde berichtet, wobei die Monocyten auf anhaftenden Immunkomplexen gezüchtet werden. Arena W. P. et al., Journal of Immun. 134 (1985), 3868. Außerdem wurde über einen in Urin vorkommenden IL-1-Inhibitor berichtet. Seckinger P. et al., Journal of Immun. 139 (1987), 1546. Schließlich wurde über einen gereinigten und clonierten Proteininhibitor berichtet, der eine Interleukin-1-Rezeptor-Antagonist-Aktivität aufweist. Hannum et al., Nature 343 (1990), 336, und Eisenberg S. et al., Nature 343 (1990), 341.
Eisenberg et al. berichten über die Clonierung der DNA für den Inhibitor von Hannum et al. und stellen eine cDNA-Sequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz für den Inhibitor vor. Das Polypeptidtranslationsprodukt der cDNA umfaßt 177 Aminosäurereste, und 25 dieser Reste werden abgespalten, um das reife Inhibitorprotein herzustellen. Die N-terminale Aminosäuresequenz für dieses reife Inhibitorprotein aus 152 Aminosäuren ist RPSGRKS.
Es wird angenommen, daß der in Urin vorkommende und von Seckinger P. et al., a.a.O., und Seckinger P. et al., Journal of Immun. 139 (1987), 1541, teilweise gereinigte und charakterisierte IL-1-Inhibitor mit dem clonierten IL-1-Rezeptor-Antagonist, über den Eisenberg S. et al., a.a.O.; und Carter D. et al., Nature 344 (1990), 633, berichteten, vergleichbar, falls nicht identisch ist.
Es ist folglich offensichtlich, daß Cytokine neben ihren normalen biologischen Funktionen, die nicht vollständig aufgeklärt wurden, mit systemischen Veränderungen, die die Folge einer Infektion oder einer Gewebeverletzung sind, pathologisch assoziiert sind. Es besteht kein Zweifel, daß festgestellt wird, daß Cytokine bei Krankheiten, die von den vorstehend erwähnten verschieden sind, eine Rolle spielen. Nichtsdestoweniger wird die Wichtigkeit von Cytokinen bei einer Krankheit, insbesondere Sepsis, ohne weiteres deutlich, wenn man das Ausmaß der Krankheit in Betracht zieht. In den Vereinigen Staaten allein entwickeln etwa 194 000 Patienten eine nosokomiale Bakteriämie und von diesen sterben etwa 75 000. Maki D. G. (1981), Nosocomial Infect. (Dikson R. E., Hrsg.), 183, Yrke Medical Books, USA. Die meisten dieser Todesfälle sind auf sechs wichtige Gram-negative Bacillen zurückzuführen und diese sind Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Proteus, Klebstella, Enterobacter und Serratia. Die gegenwärtige Behandlung für die Bakteriämie ist die Verabreichung von Antibiotika, die unglücklicherweise eine begrenzte Wirksamkeit haben. Folglich ist erkennbar, daß ein anhaltender klinischer Bedarf für Medikamente besteht, die vom Arzt verwendet werden können, um die Wirkungen der Cytokinproduktion zu regulieren.
Gemäß einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine isolierte DNA mit einer Nucleotidsequenz bereit, die ein Protein mit Cytokin-Inhibitoraktivität codiert, wobei das Protein die N-terminale Aminosäuresequenz MALETIC hat. Die DNA dieses erfindungsgemäßen Aspekts codiert ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweisen kann, wie sie in Fig. 2 gezeigt ist. Die Cytokin-Inhibitoraktivität ist vorzugsweise eine IL-1- Inhibitoraktivität. Die vorliegende Erfindung umfaßt eine cDNA-Sequenz, die einen Proteininhibitor der Cytokinaktivität codiert, der einen 5'-codierenden Bereich aufweist, der von einem IL-I-Rezeptor-Antagonist gemäß dem Stand der Technik unterschieden werden kann. Gemäß einem zweiten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Vektor bereit, der eine DNA umfaßt, wie sie vorstehend beschrieben ist.
Gemäß einem dritten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Zelle bereit, die mit einer DNA transformiert ist, wie sie vorstehend beschrieben ist.
Gemäß einem vierten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein von der erfindungsgemäßen DNA codiertes Protein mit Cytokin-Inhibitoraktivität bereit. Gemäß diesem Aspekt ist die Cytokin-Inhibitoraktivität vorzugsweise gegen IL-1 gerichtet. Das Protein kann die aminoterminale Sequenz Met-Ala-Leu-Glu-Thr-Ile-Cys umfassen und/oder eine Aminosäuresequenz aufweisen, wie sie in Fig. 2 gezeigt ist.
Hier wird eine Klasse von Proteininhibitoren der Cytokinaktivität beschrieben, die Anwendung bei der therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung einer Krankheit, vorzugsweise Krankheiten unter Beteiligung von IL-I, findet. Der Proteininhibitor der Cytokinaktivität kann eine veränderte Form eines IL-1-Rezeptor-Antagonisten sein. Nachstehend kann der Inhibitor in einer anderen Ausführungsform als Inhibitor der Cytokinaktivität, Cytokininhibitor oder IL-1-Cytokininhibitor bezeichnet werden. Zum Beispiel wird die Aktivität des Inhibitors gegen die IL-1-Aktivität gezeigt, ohne daß beabsichtigt ist, nahezulegen, daß das Spektrum der Aktivität des Inhibitors derart begrenzt ist. Es muß angenommen werden, daß der Inhibitor durch Inhibierung der IL-I-Aktivität außerdem die Aktivität anderer Cytokine beeinträchtigt. Folglich ist der hier beschriebene Cytokininhibitor in diesem Sinn im allgemeinen ein Inhibitor der Cytokinaktivität, und dies ist der Grund, warum er alternativ als IL-1-Cytokininhibitor bezeichnet wird.
Gemäß einem fünften Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Protein, wie es vorstehend beschrieben ist, zur Verwendung bei der Behandlung oder Diagnose einer Krankheit bereit.
Gemäß einem sechsten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Proteins, wie es vorstehend beschrieben ist, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Diagnose einer Krankheit bereit, die durch Cytokinexpression verursacht wird.
Gemäß einem siebten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Diagnose einer Krankheit durch Messen der Gegenwart einer ersten Nucleotidsequenz, die ein Protein mit Cytokin-Inhibitoraktivität und einer Aminosäuresequenz, wie sie in Fig. 2 gezeigt ist, codiert, in einem biologischen Material bereit, umfassend die Schritte:
(a) Erzeugung eines Komplexes durch Inkontaktbringen des biologischen Materials mit einer zweiten Nucleotidsequenz, die zu mindestens einem Teil der ersten Nucleotidsequenz homolog ist; und
(b) Nachweis des Komplexes.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieses erfindungsgemäßen Aspekts erfolgt der Nachweis in Schritt (b) durch Polymerasekettenreaktion. Die Krankheit kann ein endometrialer oder Ovartumor sein.
Die Erfindung läßt Verfahren, wobei ein Inhibitor der Cytokinaktivität verwendet wird, um vorteilhafterweise Patienten entweder prophylaktisch oder therapeutisch zu behandeln, die an einer Vielzahl von immunologisch ansprechenden Krankheiten einschließlich Sepsis leiden, und diagnostische Verfahren zum Nachweis einer Krankheit als Funktion der Cytokin-Inhibitoraktivität zu.
Gemäß einem achten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Antikörper mit einer Spezifität für ein Epitop auf einem Cytokininhibitor bereit, wobei das Epitop die ersten sieben Aminosäuren am aminoterminalen Ende einer Aminosäuresequenz umfaßt, wie sie in Fig. 2 gezeigt ist.
Fig. 1 zeigt die Teilsequenz von MAD 15.
Fig. 2 zeigt die cDNA-Sequenz einer Variante des IL-1-Cytokininhibitors und die vorhergesagte Proteinsequenz.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Isolierung und Identifizierung eines bestimmten Faktors, nachstehend bezeichnet als Cytokininhibitor-Faktor oder einfach Inhibitor, der die Aktivität von IL-1 inhibiert. Dieser Inhibitor ist für mehrere Zelltypen einschließlich Monocyten, Fibroblasten und verschiedene Tumorzelllinien charakteristisch, aber er kommt praktisch in allen Zelltypen vor, die einen IL-1-Inhibitor benötigen, um die Aktivität von IL-1 zu kompensieren. Der Cytokininhibitor wurde im Hinblick auf bestimmte seiner molekularen und chemischen Eigenschaften charakterisiert. Jede dieser Eigenschaften wird nachstehend einzeln diskutiert.
Vor der Besprechung des erfindungsgemäßen Cytokininhibitors ist es wichtig, sich bewußt zu machen, daß der hier beschriebene Inhibitor aus einem proteinähnlichen Material mit einer definierten chemischen Struktur besteht. Jedoch hängt die genaue Struktur des Inhibitors von eine Reihe von Faktoren ab, insbesondere von chemischen Modifikationen, von denen bekannt ist, daß sie in Proteinen vorkommen. Zum Beispiel, da alle Proteine ionisierbare Amino- und Carboxylgruppen enthalten, ist es natürlich offensichtlich, daß der Inhibitor in einer sauren oder basischen Salzform oder in neutraler Form erhalten werden kann. Es ist ferner offensichtlich, daß die primäre Aminosäuresequenz durch Derivatisierung unter Verwendung von Zuckermolekülen (Glycosylierung) oder durch andere chemische Derivatisierungen, einschließlich der kovalenten oder ionischen Bindung von zum Beispiel Lipiden, Phosphatgruppen, Acetylgruppen und dergleichen an den Inhibitor, die oft durch den Zusammenschluß mit Sacchariden erfolgen, verlängert werden kann. Diese Modifikationen können in vitro oder in vivo erfolgen, wobei die letzteren durch eine Wirtszelle durch posttranslationale Prozessierungssysteme durchgeführt werden. Es ist selbstverständlich, daß solche Modifikationen, unabhängig davon, wie sie erfolgen, in der Definition des Cytokininhibitors eingeschlossen sind, solange die Aktivität des Proteins, wie sie nachstehend definiert ist, nicht zerstört wird. Es ist natürlich zu erwarten, daß solche Modifikationen die biologische Aktivität des Moleküls quantitativ oder qualitativ erhöhen oder verringern können, und solche chemisch modifizierten Moleküle sind im Schutzumfang der Erfindung ebenfalls eingeschlossen.
Der hier verwendete Begriff "Chromatographie" ist so definiert, daß er die Verwendung einer Lösung einschließt, die ein Gemisch von Verbindungen für ein Adsorptionsmittel oder ein anderes Trägermaterial enthält, das üblicherweise mit einem Gradienten oder einem anderen aufeinanderfolgenden Eluant eluiert wird. Das von der Trägermatrix eluierte Material wird als Eluat bezeichnet. Die aufeinanderfolgende Elution wird am häufigsten durchgeführt, indem die Trägermatrix in einer Säule isoliert und die Elutionslösung bzw. -lösungen, die die Affinität für die Trägermatrix verändern, entweder schrittweise oder vorzugsweise durch einen Gradienten durch die Matrix hindurch geleitet werden. Es ist erkennbar, daß in der Definition "Chromatographie" die Positionierung der Trägermatrix auf einem Filter und die aufeinanderfolgende oder chargenweise Anwendung eines Eluants über den Filter eingeschlossen ist.
Der Ausdruck "hydrophobe Wechelwirkungsmatrix" ist so definiert, daß er ein Adsorptionsmittel bezeichnet, das ein hydrophober Feststoff ist, wie Polystyrolharzkügelchen, Gummi, Siliciumdioxid-beschichtetes Silicagel oder vernetzte Agarose, der ausreichend mit hydrophoben funktionellen Gruppen substituiert ist, um das Material hydrophob zu machen. Alkyl-substituierte Agarose und Aryl-substituierte Agarose, wie zum Beispiel Phenyl- oder Octylagarose, sind repräsentative hydrophobe Materialien. Gemische von Materialien, die an einer hydrophoben Chromatographiematrix chromatographisch getrennt werden, werden im allgemeinen zuerst an die Matrix in einer Lösung mit hoher Salzkonzentration adsorbiert und anschließend von der Matrix durch Elution in einer Lösung mit geringer Salzkonzentration oder einem hydrophoben Lösungsmittel, wie Polyol, desorbiert.
Der Begriff "Anionenaustauschermatrix" ist so definiert, daß er eine feste oder gelförmige Trägermatrix bezeichnet, die in wäßrigen Lösungen geladen ist. Die Trägermatrix kann Agarose sein, die mit amin-funktionellen Gruppen ausreichend substituiert ist, so daß sie in wäßrigen Lösungen eine Nettoladung aufweist. Das zu adsorbierende Material wird im allgemeinen an die Anionenaustauschermatrix in einer Lösung mit geringer Salzkonzentration gebunden und im allgemeinen von der Anionenaustauschermatrix in einem Eluant mit hoher Salzkonzentration eluiert, der Anionen enthält, wie ein Chloridion, die an die Anionenaustauschermatrix binden und das adsorbierte Material verdrängen.
Der Begriff "Bedingungen mit hoher Salzkonzentration" bezieht sich auf eine wäßrige Lösung, in der ein ionischer Stoff vorliegt, um Bedingungen einer hohen Ionenstärke zu erzeugen. Die Ionenstärke ist definiert, wie allgemein auf dem Fachgebiet vereinbart ist, und kann aus den mutmaßlichen Konzentrationen der verschiedenen in die Lösung eingebrachten Ionen, die durch ihre Aktivitätskoeffizienten annähernd bestimmt wurden, berechnet werden. Hohe Salzkonzentrationen, die üblicherweise verwendet werden, sind durch Lösungen gekennzeichnet, die hohe Konzentrationen von Ammoniumsulfat enthalten; jedoch können andere Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Natriumsulfat, Natriumnitrat oder Natriumphosphat, ebenfalls verwendet werden.
Es ist selbstverständlich, daß die Definition von "Affinitätschromatographie" der von Wilchek et al., Methods in Enzymology 104 (1984), 3, entspricht. Im weitesten Sinn soll sich die Definition "Affmitätschromatographie" auf ein "auf biologischer Erkennung basierendes Reinigungsverfahren" beziehen. Kurz zusammengefaßt, schließt das Verfahren die Kupplung eines Liganden an einen festen Träger und das Inkontaktbringen des Liganden mit einer Lösung, die ein Ligand-Erkennungsmolekül darin enthält, das an den Liganden bindet, ein. Anschließend wird das Ligand-Erkennungsmolekül von dem Liganden freigesetzt und in reiner Form isoliert. Es ist selbstverständlich, daß eine Vielzahl von Liganden bei der Affmitätschromatographie, wie sie bei Wilchek et al. besprochen wird, verwendet werden kann, und Beispiele dieser Liganden schließen Lectine, Antikörper, Rezeptor-Bindungsproteine und Aminosäuren ein.
Die Begriffe "Zellen" oder "rekombinanter Wirt" oder "Wirtszellen" werden oft gleichbedeutend verwendet, wie aus dem Zusammenhang deutlich wird. Diese Begriffe schließen die unmittelbare Zielzelle und natürlich die Nachkommen davon ein. Es ist selbstverständlich, daß nicht alle Nachkommen mit der Ausgangszelle infolge von zufälligen Mutationen oder Unterschieden in der Umgebung genau identisch sind.
Der hier bei der Beschreibung von Wirtszellkulturen verwendete Begriff "transformiert" bezieht sich auf eine Zelle, die genetisch verändert wurde, so daß sie ein heterologes Protein produziert, das die Aktivität des nativen Proteins besitzt. Beispiele von transformierten Zellen werden in den Beispielen dieser Anmeldung beschrieben. Bakterien sind bevorzugte Mikroorganismen zur Herstellung des Proteins. Ein synthetisches Protein kann ebenfalls durch geeignet transformierte Hefe- und Säugerwirtszellen hergestellt werden.
"Funktionell verbunden" bezieht sich auf eine Anordnung, so daß die normale Funktion der Komponenten wirksam sein kann. Folglich bezieht sich eine mit Kontrollsequenzen "funktionell verbundene" codierende Sequenz auf eine Anordnung, bei der die codierende Sequenz unter der Kontrolle dieser Sequenzen exprimiert werden kann.
Der Begriff "Kontrollsequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die für die Expression einer funktionell verbundenen codierenden Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus notwendig sind. Die Kontrollsequenzen, die für Prokaryonten geeignet sind, schließen zum Beispiel einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz, eine Ribosomenbindungsstelle und mögliche andere, noch kaum verstandene Sequenzen ein. Von eukaryontischen Zellen ist bekannt, daß sie Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer verwenden.
Der Begriff "Expressionssystem" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die eine gewünschte codierende Sequenz und Kontrollsequenzen in funktioneller Verknüpfung miteinander enthalten, so daß die mit diesen Sequenzen transformierten Wirte in der Lage sind, die codierten Proteine zu produzieren. Zur Herbeiführung der Transformation kann das Expres sionssystem einen Vektor einschließen, jedoch kann die gewünschte DNA dann auch in das Wirtschromosom integriert werden.
Der hier verwendete Begriff "pharmazeutisch verträglich" bezieht sich auf ein Trägermedium, das die Wirksamkeit der biologischen Aktivität der aktiven Bestandteile nicht beeinträchtigt, und das für die Wirte, an die es verabreicht wird, nicht toxisch ist. Die Verabreichung kann durch ein geeignetes Verfahren, einschließlich der subkutanen und parenteralen Verabreichung, vorzugsweise parenteral, erfolgen. Beispiele der parenteralen Verabreichung schließen intravenös, intraarteriell, intramuskulär und intraperitoneal ein, wobei intravenös bevorzugt wird.
Der hier verwendete Begriff "prophylaktische oder therapeutische" Behandlung bezieht sich auf die Verabreichung des Cytokininhibitors an den Wirt entweder vor oder nach einer Infektion oder einem Krebsnachweis. Wenn der Cytokininhibitor vor einer Exposition mit dem infektiösen Agens verabreicht wird, ist die Behandlung prophylaktisch (d. h. sie schützt den Wirt vor einer Infektion), während, falls er nach einer Infektion oder nach Krebsbeginn verabreicht wird, die Verabreichung therapeutisch ist (d. h. sie bekämpft die bestehende Infektion oder den bestehenden Krebs).
Die Etablierung einer cDNA-Bank, enthaltend die cDNA-Sequenz, die einen verkürzten Cytokininhlbitor codiert, die Identifizierung der cDNA-Sequenz und die Subclonierung und Expression der Sequenz macht Gebrauch von zahlreichen Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind. Eine allgemeine Beschreibung der ange- bzw. verwendeten Verfahren und Materialien wird hier für den Leser der Einfachheit halber angegeben. Insbesondere werden bei der Konstruktion geeigneter Vektoren, die die gewünschte Cytokin codierende Sequenz enthalten, übliche Ligierungs- und Restriktionsverfahren angewendet, wobei isolierte Vektoren, DNA-Sequenzen oder synthetisierte Oligonucleotide gespalten, zurechtgeschnitten und in der gewünschten Form religiert werden.
Die ortsspezifische DNA-Spaltung wird durch Behandlung mit einem oder mehreren geeigneten Restriktionsenzymen unter Bedingungen, die auf dem Fachgebiet allgemein bekannt sind, durchgeführt, und die Einzelheiten davon werden vom Hersteller dieser im Handel erhältlichen Restriktionsenzyme angegeben. Vgl. z. B. New England Biolabs, Produktkatalog. Im allgemeinen wird etwa 1 ug des Plasmids oder der DNA-Sequenz durch eine Einheit Enzym in etwa 20 ul Pufferlösung umgesetzt. In den hier angeführten Beispielen wird üblicherweise ein Überschuß an Restriktionsenzym verwendet, um die vollständige Umsetzung des DNA-Substrats sicherzustellen. Inkubationszeiten von etwa einer Stunde bis zwei Stunden bei etwa 37ºC sind möglich, obwohl Veränderungen toleriert werden können. Nach jeder Inkubation wird das Protein durch Extraktion mit Phenol/Chloroform entfernt, daran kann sich eine Etherextraktion anschließen, und die Nucleinsäure wird aus wäßrigen Fraktionen durch Fällung mit Ethanol, gefolgt von einer Chromatographie unter Verwendung einer Sephadex G-50-"Spin"-Säule gewonnen. Gegebenenfalls kann eine Größenauftrennung der gespaltenen Fragmente durch Polyacrylamidgel- oder Agarosegelelektrophorese unter Anwendung von Standardverfahren durchgeführt werden. Eine allgemeine Beschreibung von Größenauftrennungsverfahren findet man in Methods in Enzymology 65 (1980), 499-560.
Die restriktionsgespaltenen Fragmente können durch Behandlung mit dem großen Fragment der E. coli-DNA-Polymerase I, d. h. dem Klenow-Fragment, in Gegenwart der vier Desoxynucleotidtriphosphate (dNTPs) unter Verwendung von Inkubationszeiten von etwa 1 S bis 25 Minuten bei 20 bis 25ºC in 50 mM Tris, pH 7,6, 50 mM NaCl, 6 mM MgCl&sub2;, 6 mM DTT und 10 mM dNTPs mit glatten Enden versehen werden. Nach der Behandlung mit dem Klenow-Fragment wird das Gemisch mit Phenol/Chloroform extrahiert und ethanolgefällt. Die Behandlung mit S1-Nuclease unter geeigneten Bedingungen führt zur Hydrolyse einzelsträngiger Teile.
Ligierungen werden in 15-30 ul-Volumina unter den folgenden üblichen Bedingungen und Temperaturen durchgeführt: 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 33 ug/ml BSA, 10 mM-50 mM NaCl und 1 mM ATP, 0,3-0,6 (Weiss-) Einheiten T4-DNA- Ligase bei 14ºC zur Ligierung überhängender Enden; bzw. wurden für Ligierungen "glatter Enden" 1 mM ATP und 0,3-0,6 (Weiss)-Einheiten T4-Ligase verwendet. Intermolekulare Ligierungen "überhängender Enden" werden üblicherweise mit DNA-Gesamtkonzentrationen von 33-100 ug/ml durchgeführt. Bei Ligierungen glatter Enden beträgt die DNA-Gesamtkonzentration der Enden etwa 1 uM
Bei der Vektorkonstruktion unter Verwendung von "Vektorfragmenten" wird das Vektorfragment üblicherweise mit alkalischer Phosphatase aus Bakterien (BAP) behandelt, um die 5'-Phosphatgruppe zu entfernen und die Religierung des Vektors zu verhindern. BAP- Umsetzungen werden bei pH 8 in etwa 150 mM Tris in Gegenwart von Na&spplus; und Mg²&spplus; unter Verwendung von etwa 1 Einheit BAP pro ug Vektor bei 60ºC für etwa 1 Stunde durchgeführt. Die Nucleinsäurefragmente werden durch Extraktion der Präparation mit Phenol/- Chloroform, gefolgt von einer Ethanolfällung gewonnen. In einer anderen Ausführungsform kann einer Religierung in Vektoren vorgebeugt werden, die durch einen zusätzlichen Restriktionsenzymverdau der unerwünschten Fragmente zweimal gespalten wurden.
Bei den nachstehend angegebenen Konstruktionen werden die korrekten Ligierungen bestätigt, indem zuerst der geeignete E. coli-Stamm mit dem Ligierungsgemisch transformiert wird. Erfolgreiche Transformanten werden durch eine Resistenz gegen Ampicillin, Tetracyclin oder andere Antibiotika oder unter Verwendung anderer Marker, abhängig von der Art der Plasmidkonstruktion, selektiert, wie auf dem Fachgebiet bekannt ist. Mini-Präp- DNA kann aus den Transformanten durch das Verfahren von Ish-Howowicz D. et al. (Nucleic Acids Res. 9 (1981), 2989) präpariert und durch Restriktion analysiert und/oder durch das Didesoxyverfahren von Sanger F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463, wie weiter von Messing et al., Nuc. Acids Res. 9 (1981), 309, beschrieben wird, oder durch das Verfahren von Maxam et al., Methods in Enzymology 65 (1980), 499, sequenziert werden.
Bei der Clonierung von M13 verwendete Wirtsstämme bestehen aus E. coli-Stämmen, die für eine Phageninfektion zugänglich sind, wie der E. coli K12 Stamm DG98. Der DG98-Stamm wurde am 13. Juli 1984 bei der ATCC hinterlegt und hat die Hinterlegungsnummer 1965.
In Abhängigkeit von der verwendeten Wirtszelle wird die Transformation unter Anwendung von für solche Zellen geeigneten Standardverfahren durchgeführt. Die Calciumbehandlung unter Verwendung von Calciumchlorid, wie von Cohen S. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69 (1972), 2110, beschrieben, und Modifikationen, wie von Hanahan D., J. Mol. Biol. 166 (1983), 557-580, beschrieben, werden für Prokaryonten oder andere Zellen verwendet, die feste Zellwandbarrieren enthalten. Die Infektion mit Agrobacterium tumefaciens (Shaw et al., Gene 23 (1983), 315) wird für bestimmte Pflanzenzellen verwendet. Transformationen in Hefe werden gemäß dem Verfahren von Van Solingen et al., J. Bacteriol. 130 (1977), 946, und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979), 3829, durchgeführt.
Mehrere Transfektionsverfahren stehen für Säugerzellen ohne solche Zellwände zur Verfügung. Das Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren von Graham und von der EB, Virology 52 (1978), 546, ist ein Verfahren. Die Transfektion kann unter Verwendung einer Modifikation (Wang et al., Science 228 (1985), 149) des Calciumphosphat-Copräzipitationsverfahrens durchgeführt werden. Ein anderes Transfektionsverfahren schließt die Verwendung von DEAE-Dextran (Sompayrac L. M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 7575- 7578) ein. Alternativ bezeichnet Lipofektion ein Transfektionsverfahren, das eine Lipidmatrix verwendet, um Plasmid-DNA in die Wirtszelle zu transportieren. Die als Lipofectin-Reagens bezeichnete Lipidmatrix ist von BRL erhältlich. Das Lipofectin-Reagens umfaßt eine wäßrige Lösung (deionisiertes und sterilgefiltertes Wasser), die 1 mg/ml Lipid (DOTMA:DOPE, 50 : 50) enthält. Diese Liposomen-vermittelte Transfektion wird im wesentlichen durchgeführt, wie von Felgner P. L. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7413) beschrieben ist. Das Lipofectin-Reagens und die DNA werden in serumfreiem Medium getrennt verdünnt, um eine makroskopische Aggregation zu verhindern, die erfolgt, wenn eines der Materialien zu konzentriert ist. Zum Beispiel werden 0,5 · 106 Zellen auf eine 60 mm-Gewebekulturschale überimpif, und 1,5 ml serumfreies Medium, enthaltend 1 bis 2 ug DNA, und eine zweite Lösung von 1,5 ml serumfreien Medium, enthaltend etwa 30 ug Lipofectin, werden hergestellt. Die verdünnten DNA- und Lipofectin-Lösungen werden gemischt und auf die Zellen aufgetragen. Die Transfektion wird durch Serum inhibiert, so werden die Zellen vor Zugabe des Lipofectin/DNA-Gemisches mit serumfreien Medium gründlich gewaschen.
Synthetische Oligonucleotide werden durch das Triesterverfahren von Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc. 103 (1981), 3185, oder unter Verwendung von im Handel erhältlichen automatischen Oligonucleotid-Synthetisiergeräten hergestellt. Die Phosphorylierung von Einzelsträngen vor der Anlagerung oder zur Markierung wird unter Verwendung eines Überschusses, z. B. etwa 10 Einheiten Polynucleotidkinase für 0,1 mmol Substrat, in Gegenwart von 50 mM Tris, pH 7,6, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM Dithiothreit, 1-2 mM ATP, 1,7 umol 32P-ATP (2,9 mCi/mmol), 0,1 mM Spermidin und 0,1 mM EDTA durchgeführt.
Eine spezifische Nucleinsäuresequenz kann unter Verwendung von Primern in einen Vektor cloniert werden, um die Sequenz, die an ihren nicht-komplementären Enden Restriktionsstellen enthält, gemäß den allgemeinen Verfahren, wie sie in den US-Patenten Nrn. 4,683,195, erteilt am 28. Juli 1987, 4,683,202, erteilt am 28. Juli 1987, und 4,800,159, erteilt am 24. Januar 1989, offenbart werden, zu amplifizieren. Eine Modifikation dieses Verfahrens, das die Verwendung der thermostabilen Thermus aquaticus (Taq) DNA-Polymerase einschließt, wurde in der Europäischen Patentveröffentlichung Nr. 258017, veröffentlicht am 2. März 1988, beschrieben und charakterisiert.
Ebenfalls nützlich ist das Thermal Cycler-Gerät (Perkin-Elmer-Cetus), das in der am 9. September 1987 veröffentlichten Europäischen Patentanmeldung Nr. 236,069 beschrieben wurde.
Im allgemeinen wird die zu clonierende Nucleinsäuresequenz mit einem Oligonucleotidstrang für jeden Strang behandelt, und ein Verlängerungsprodukt eines jeden Primers wird synthetisiert, das zu jedem Nucleinsäurestrang komplementär ist. Eine Alternative zur Verwendung von Plasmid-DNAs, die die Lymphokine von Interesse codieren, als Matrize zur PCR ist die Verwendung von RNA aus einer beliebigen Zelle, die diese Lymphokine produziert, als Matrize zur PCR, wie im US-Patent Nr. 4,800,159 beschrieben ist. Falls RNA das verfügbare Ausgangsmaterial ist, kann das von einem Primer synthetisierte Verlängerungsprodukt nach der Trennung von seinem Komplementärstrang als Matrize zur Synthese des Verlängerungsprodukts des anderen Primers dienen. Wie schon erwähnt, enthält jeder Primer an seinem 5'-Ende eine Restriktionsstelle, die die gleiche Restriktionsstelle wie auf dem anderen Primer oder von dieser verschieden ist. Nachdem eine hinreichende Amplifikation stattgefunden hat, werden die Amplifikationsprodukte mit dem oder den geeigneten Restriktionsenzym(en) behandelt, um gespaltene Produkte in einem Spaltprodukt zu erhalten. Das gewünschte Fragment, das cloniert werden soll, wird dann isoliert und in den geeigneten Clonierungsvektor ligiert.
Für Teile von Vektoren, die von cDNA oder genomischer DNA abgeleitet sind, für die Sequenzmodifikationen erforderlich sind, wird eine ortsspezifische, Primer-gerichtete Mutagenese angewendet. Dieses Verfahren ist nun auf dem Fachgebiet Standard und wird unter Verwendung eines synthetischen Oligonucleotidprimers, der zu einer einzelsträngigen Phagen-DNA, die durch Mutagenese verändert werden soll, bis auf eine begrenzte Anzahl von Falschpaarungen, welche die gewünschte Mutation darstellen, komplementär ist, durchgeführt. Kurz zusammengefaßt, wird das synthetische Oligonucleotid als Primer verwendet, um die Synthese eines Strangs, der zu dem Phagen komplementär ist, zu steuern, und die so erhaltene doppelsträngige DNA wird in ein einen Phagen tragendes Wirtsbakterium transformiert. Kulturen der transformierten Bakterien werden in Topagar plattiert, der die Plaquebildung einzelner Zellen erlaubt, die den Phagen aufgenommen haben.
Theoretisch enthalten 50% der neuen Plaques den Phagen, der die mutierte Form als Einzelstang aufweist; 50% weisen die ursprüngliche Sequenz auf. Die Plaques werden auf Nitrocellulosefilter übertragen und die "Abdrücke" werden mit dem phosphorylierten synthetischen Primer bei einer Temperatur hybridisiert, die die Hybridisierung einer genauen Paarung zuläßt, aber bei der die Falschpaarungen mit dem ursprünglichen Strang ausreichend sind, um die Hybridisierung zu verhindern. Plaques, die mit der Sonde hybridisieren, werden dann aus gewählt und gezüchtet, und die DNA wird gewonnen. Einzelheiten der ortsspezifischen Mutationsverfahren werden nachstehend in spezifischen Beispielen beschrieben.
Bei den nachstehend angegebenen Konstruktionen werden die korrekten Ligierungen zur Plasmidkonstruktion bestätigt, indem zuerst der E. coli-Stamm MM294 oder ein anderer geeigneter Wirt mit dem Ligierungsgemisch transformiert wird. Erfolgreiche Transformanten werden durch Ampicillin-, Tetracyclin- oder eine andere Antibiotikaresistenz oder unter Verwendung anderer Marker, abhängig von der Art der Plasmidkonstruktion, selektiert, wie auf dem Fachgebiet bekannt ist. Eine weitere Durchmusterung der Transformanten ist unter Anwendung des Verfahrens der Koloniehybridisierung, wie es im wesentlichen bei Maniatis T. et al. (a.a.O., 312-328) beschrieben ist, möglich. Kurz zusammengefaßt, werden Kolonien auf Nitrocellulosefilter abgedrückt und aufeinanderfolgend auf jeden von vier Whatman-Filter, die jeweils mit einer der folgenden Lösungen gesättigt sind: (1) in 10% SDS; (2) 0,5 M NaOH/1 M NaCl; (3) 1,5 M NaCl, 1,5 M Tris, pH 8,0; (4) 2x SSC; für jeweils etwa 5 Minuten gelegt. Nach Zelllyse und Bindung der DNA wurden die Filter 0,5-1 Stunde bei 42ºC in Hybridisierungspuffer, enthaltend 30% Formamid, gefolgt von einer 1-2-stündigen Hybridisierung bei 42ºC vorhybridisiert. Die Filter wurden dreimal in 2x SSC und 0,1% SDS gewaschen, bis der Hintergrund vermindert war.
Die Plasmide aus den Transformanten werden dann gemäß dem Verfahren von Clewell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62 (1969), 1159, gegebenenfalls gefolgt von einer Chloramphenicol-Ampliflkation (Clewell, J. Bacteriol. 110 (1972), 667) präpariert. Die isolierte DNA wird durch Restriktion analysiert und/oder durch das Didesoxyverfahren von Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463, wie weiter von Messing et al., Nucleic Acids Res. 9 (1981), 309, beschrieben wird, oder durch das Verfahren von Maxam et al., Methods in Enzymology %5 (1980), 499, sequenziert.
Die Expression von DNA, die einen Cytokininhibitor codiert, kann in einer Vielzahl von Zelltypen durchgeführt werden. Prokaryonten werden am häufigsten durch verschiedene Stämme von E. coli repräsentiert. Jedoch können andere mikrobielle Stämme wie Bacillen, zum Beispiel Bacillus subtilis, verschiedene Arten von Pseudomonas oder andere Bakterienstämme ebenfalls verwendet werden. In solchen prokaryontischen Systemen werden Plasmidvektoren, die Replikationsstellen und Kontrollsequenzen enthalten, die von einer Art stammen, die mit dem Wirt verträglich ist, verwendet. Zum Beispiel wird E. coli üblicherweise unter Verwendung von Derivaten von pBR322, einem Plasmid, das von einer E. coli-Art stammt, wie von Bolivar et al., Gene 2 (1977), 95, beschrieben, transformiert. pBR322 enthält Gene für eine Ampicillin- und Tetracyclinresistenz, und stellt somit zusätzliche Marker bereit, die bei der Konstruktion des gewünschten Vektors entweder beibehalten oder zerstört werden können. Häufig verwendete prokaryontische Kontrollsequenzen, die hier so definiert sind, daß sie einen Promotor zur Transkriptionsinitiation, gegebenenfalls mit einem Operator, zusammen mit einer Ribosomenbindungsstellensequenz einschließen, beinhalten solche häufig verwendeten Promotoren, wie die beta-Lactamase (Penicillinase)- und Lactose (lac)-Promotorsysteme (Chang et al., Nature 198 (1977), 1056), das Tryptophan (trp)-Promotorsystem (Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8 (1980), 4057) und den Lambda-abgeleiteten PL- Promotor (SMmatake et al., Nature 292 (1981), 128) und die N-Gen-Ribosomenbindungsstelle (NRSS), von der als eine bewegliche Kontrollkassette Gebrauch gemacht wurde, US- Patent Nr. 4,711,845, erteilt am 8. Dezember 1987, die eine erste DNA-Sequenz umfaßt, die der PL-Promotor ist, der mit einer zweiten DNA-Sequenz, die der Npns-Sequenz entspricht, stromaufwärts einer dritten DNA-Sequenz mit mindestens einer Restriktionsstelle, die die Spaltung innerhalb von 6 bp 3' von der Npss-Sequenz erlaubt, funktionell verbunden ist. Das US-Patent Nr. 4,666,848, erteilt am 19. Mai 1987, offenbart weitere Vektoren mit verbesserten Expressionsfähigkeiten. Ebenfalls nützlich ist das von Chang et al. in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 196,864, veröffentlicht am 8. Oktober 1986, beschriebene Phosphatase A (phoA)-System. Jedoch kann jedes verfügbare Promotorsystem, das mit Prokaryonten vereinbar ist, verwendet werden.
Zusätzlich zu Bakterien können auch eukaryontische Mikroorganismen, wie Hefe, als Wirte verwendet werden. Laborstämme von Saccharomyces cerevisiae, Bäckerhefe, werden am häufigsten verwendet, obwohl eine Reihe von anderen Stämmen im allgemeinen zur Verfügung steht. Obwohl Vektoren unter Verwendung des 2 Mikron-Replikationsursprungs veranschaulicht werden (Broach, Meth. Enz. 101 (1983), 307; US-Patent Nr. 4,803,164), sind andere zur Expression in Hefe geeignete Plasmidvektoren bekannt (vgl. zum Beispiel Stinchcomb et al., Nature 282 (1979), 39; Tschempe et al., Gene 10 (1980), 157, und Clarke et al., Meth. Enz. 101 (1983), 300). Kontrollsequenzen für Hefevektoren schließen Promotoren für die Synthese glycolytischer Enzyme ein (Hess et a., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149; Holland et al., Biochemistry 17 (1978), 4900).).
Weitere Promotoren, die in Hefewirtsmikroorganismen nützlich und auf dem Fachgebiet bekannt sind, schließen den Promotor für 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255 (1980), 2073) und solche für andere glycolytische Enzyme, wie Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase ein. Andere Promotoren, die den weiteren Vorteil aufweisen, daß die Transkription durch Wachstumsbedingungen reguliert wird, sind die Promotorbereiche für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, mit dem Stickstoffstoffwechsel assoziierte, abbauende Enzyme und für die Maltose- und Galactoseverwertung verantwortliche Enzyme (Holland, a.a.O.).
Man nimmt auch an, daß Terminatorsequenzen am 3'-Ende der codierenden Sequenzen wünschenswert sind. Solche Terminatoren findet man im 3'-nicht-translatierten Bereich, der den codierenden Sequenzen in von Hefe stammenden Genen folgt. Viele der veranschaulichten Vektoren enthalten Kontrollsequenzen, die von dem in Plasmid peno46 (Holland et al., J. Biol. Chem. 256 (1981), 1385) enthaltenen Enolase-Gen oder dem von YEpl3 (Broach et al., Gene 8 (1978), 121) erhaltenen LEU2-Gen stammen; jedoch ist jeder Vektor geeignet, der einen Hefe-kompatiblen Promotor, einen Replikationsursprung und andere Kontrollsequenzen enthält.
Es ist natürlich auch möglich, Proteine codierende Gene in eukaryontischen Wirtszellkulturen, die von mehrzelligen Organismen abgeleitet sind, zu exprimieren. Vgl. zum Beispiel Tissue Culture, Academic Press, Cruz und Patterson, Herausgeber (1973). Nützliche Wirtszelllinien schließen die murinen Myelome N51 und VERO sowie HeLa-Zellen und Ovarzellen des Chinesischen Hamsters (CHO) ein. Expressionsvektoren für solche Zellen schließen üblicherweise Promotoren und Kontrollsequenzen ein, die mit Säugerzellen kompatibel sind, wie zum Beispiel die üblicherweise verwendeten frühen und späten Promotoren aus dem Simianvirus 40 (SV40) (Fiers et al., Nature 273 (1978), 113), virale Promotoren, wie solche, die von Polyoma, Adenovirus 2, Rinderpapillomavirus oder Vogel-Sarkomviren stammen, oder Immunglobulin-Promotoren und Hitzeschock-Promotoren. Ein System zur Expression von DNA in Säugersystemen unter Verwendung des BPV als Vektor wird im US- Patent Nr. 4,419,446 offenbart. Eine Modifikation dieses Systems wird im US-Patent Nr. 4,601,978 beschrieben.
Allgemeine Aspekte von Säugerzellwirtssystem-Transformationen wurden von Axel im US-Patent Nr. 4,399,216, erteilt am 16. August 1983, beschrieben. Ebenfalls nützlich ist die Genamplifikation in eukaryontischen Zellen, wie sie von Ringold im US-Patent Nr. 4,656,134, erteilt am 7. April 1987, beschrieben ist. Es zeigte sich nun auch, daß "Enhancer"- Bereiche bei der Optimierung der Expression wichtig sind; diese sind im allgemeinen Sequenzen, die stromaufwärts des Promotorbereichs vorkommen. Replikationsursprünge können gegebenenfalls aus viralen Quellen erhalten werden. Jedoch ist die Integration in das Chromosom ein üblicher Mechanismus zur DNA-Replikation in Eukaryonten.
Pflanzenzellen stehen nun auch als Wirte zur Verfügung, und Kontrollsequenzen, die mit Pflanzenzellen kompatibel sind, wie der Nopalinsynthase-Promotor und Polyadenylierungssignalsequenzen (Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 561) sind zugänglich. Weiterhin wurden Verfahren und Vektoren zur Transformation von Pflanzenzellen in der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 85/04899, veröffentlicht am 7. November 1985, offenbart.
Die hier bei der Clonierung und Expression verwendeten Wirtsstämme umfassen die folgenden:
Zur Clonierung und Sequenzierung und zur Expression von Konstruktionen unter Kontrolle der meisten bakteriellen Promotoren wurde der E. coli K12-Stamm MM294, der vom E. coli Genetic Stock Center unter GCSC #6135 erhalten wurde, als Wirt verwendet. Zur Expression unter Kontrolle des PLNRES-Promotors kann der E. coli K12-Stamm MC1000 lambda lysogen, N7N53cIg57 SusPgo, ATCC-39531, ein bei der American Type Culture Collection (ATCC 39531) hinterlegter Stamm, verwendet werden. E. coli DG116, der bei der ATCC (ATCC 53606) am 7. April 1987 hinterlegt wurde, kann ebenfalls verwendet werden.
Für M13-Phagen-Rekombinanten werden E. coli-Stämme verwendet, die für eine Phageninfektion empfänglich sind, wie der E. coli K12-Stamm DG98. Der DG98-Stamm wurde bei der ATCC (ATCC 39768) am 13. Juli 1984 hinterlegt.
Die Expression in Säugerzellen wurde in COS-A2-Zellen durchgeführt und kann auch in COS-7- und CV-1- sowie Hamster- und Mauszellen durchgeführt werden. Die Expression auf Basis von Insektenzellen kann in Spodoptera frugiperda durchgeführt werden.
Eine vollständige cDNA-Sequenz, die den Cytokininhibitor codiert, kann unter Anwendung molekularbiologischer Verfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, mit den nachstehend ausführlich dargelegten Ausnahmen erhalten werden.
Mehrere Verfahren stehen zur Identifizierung der Cytokin-cDNA-Sequenzen zur Verfügung. Das bevorzugte Verfahren ist die Erzeugung einer Bank unter Verwendung von RNA, die aus anhaftenden Monocyten isoliert wurde, aber eine Bank kann praktisch aus jeder Quelle biologischen Materials, die den Cytokininhibitor exprimiert, erzeugt werden; tatsächlich können cDNA-Banken auch über den Handel bezogen werden. Monocyten sind das bevorzugte Ausgangsmaterial, da ihr Anhaften an eine geeignete Oberfläche die Expression des Cytokininhibitors induziert.
Ein veranschaulichendes Verfahren zur Herstellung einer die IL-1-Cytokininhibitor- Sequenzen enthaltenden cDNA-Bank besteht aus der Isolierung der gesamten cytoplasmatischen RNA aus einem geeigneten Ausgangsmaterial und ferner der Isolierung von Boten-RNA daraus. Die letztere kann weiter in Poly(A+)-Boten-RNA fraktioniert werden, die wiederum noch weiter in Poly(A+)-Boten-RNA-Fraktionen fraktioniert werden kann, die Cytokininhibitor-Boten-RNA enthalten. Die Boten-RNA kann dann umgekehrt transkribiert und in einen geeigneten Vektor cloniert werden, um die cDNA-Bank herzustellen.
Genauer wird das Ausgangsmaterial (d. h. Gewebe, Zellen) mit phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen und ein nichtionisches Detergens, wie Ethylenoxid vom Polymertyp (NP-40), wird in einer Menge, im allgemeinen etwa 0,3%, zugegeben, um die zellulären, aber nicht die nucleären Membranen zu lysieren. Die Kerne können dann durch eine 10-minütige Zentrifugation bei 1000 · g entfernt werden. Der post-nucleäre Überstand wird zu einem gleichen Volumen von TE (10 mM Tris, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA); pH 7,5)-gesättigtem Phenol/Chloroform (1 : 1), enthaltend 0,5% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 10 mM EDTA, zugegeben. Der Überstand wird noch viermal extrahiert und die Phase durch eine 120-minütige Zentrifugation bei 2000 · g abgetrennt. Die RNA wird durch Einstellen der Proben auf 0,25 M NaCl, Zugabe von 2 Volumina 100%iges Ethanol und Lagern bei -20ºC ausgefällt. Die RNA wird dann bei 5000 · g 30 Minuten pelletiert, mit 70%- und 100%igem Ethanol gewaschen und getrocknet. Dies stellt die gesamte cytoplasmatische RNA dar.
In einer anderen Ausführungsform kann die gesamte cytoplasmatische RNA unter Anwendung des Guanidinisocyanat-Cäsiumchlorid-Verfahrens, wie von Chirgwin et al., Biochemistry 18 (1979), 5294, beschrieben, isoliert werden.
Polyadenylierte (Poly A+) Boten-RNA (mRNA) kann aus der gesamten cytoplasmatischen RNA durch Chromatographie an Oligo(dT)-Cellulose (Aviv J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 69 (1972), 1408-1412) erhalten werden. Die RNA wird in ETS (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,5% SDS, pH 7,5) in einer Konzentration von 2 mg/ml gelöst. Diese Lösung wird 5 Minuten auf 65ºC erhitzt und dann schnell auf 4ºC abgekühlt. Nachdem die RNA- Lösung auf Raumtemperatur gebracht wurde, wird sie auf 0,4 M NaCl eingestellt und langsam über eine Oligo(dT)-Cellulose-Säule geleitet, die vorher mit Bindungspuffer (500 mM NaCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5) äquilibriert worden war. Der Durchfluß wird dann noch zweimal über die Säule geleitet, und die Säule wird mit 10 Volumina Bindungspuffer gewaschen. Poly(A+)-mRNA wird mit Aliquots von ETS eluiert, einmal mit TE-gesättigtem Phenol/Chloroform extrahiert und durch Zugabe von NaCl auf 0,2 M und 2 Volumina 100%- igem Ethanol ausgefällt. Die RNA wird noch zweimal gefällt und vor dem Trocknen einmal in 70%igem und dann 100%igem Ethanol gewaschen. Die Poly(A+)-mRNA kann dann zur Konstruktion einer cDNA-Bank verwendet werden.
Aus der angereicherten mRNA-Fraktion kann unter Verwendung von Oligo(dT)- Primern für die Poly(A)-Schwänze und AMV-reverse Transkriptase unter Anwendung des Verfahrens von Okayama et al., Mol. Cell Biol. 3 (1983), 280, cDNA hergestellt werden.
Andere Verfahren zur Herstellung von cDNA-Banken sind natürlich auf dem Fachgebiet gut bekannt. Ein nun klassisches Verfahren verwendet einen Oligo(dT)-Primer, reverse Transkriptase, das "Tailing" der doppelsträngigen cDNA mit Poly(dG) und das Anlagern an einen geeigneten Vektor, wie pBR322 oder ein Derivat davon, der an der gewünschten Restriktionsstelle gespalten und mit einem Poly(dC)-Schwanz versehen wurde. Eine ausführliche Beschreibung dieses alternativen Verfahrens findet man zum Beispiel in der EP 109,748, die am 13. April 1988 veröffentlicht wurde.
Unter Verwendung der Aminosäureteilsequenz eines bekannten IL-1-Rezeptor- Antagonist-Inhibitors, der von Hannum et al., Nature 343 (1990), 336, und Eisenberg S. et al., Nature 343 (1990), 341, beschrieben wurde, und bekannten Codon-Redundanzen dafür können mehrere DNA-Oligonucleotidsonden synthetisiert und zum Absuchen der cDNA-Bank verwendet werden.
Ein bevorzugtes Verfahren, durch das ein cDNA-Clon, der den IL-1-Cytokininhibitor codiert, identifiziert werden kann, ist die Verwendung einer cDNA-Bank, die unter Verwendung von RNA hergestellt wurde, die aus induzierten Monocyten erhalten wurde, und der Nachweis einzelner Clone, die unterschiedlich mit cDNA-Sonden hybridisieren, die unter Verwendung von RNA aus induzierten und nicht induzierten Monocyten hergestellt wurde. Clone, die vorzugsweise mit cDNA-Sonden hybridisieren, die aus induzierter, aber nicht aus nicht induzierter Monocyten-RNA hergestellt wurden, enthalten cDNA, die den erfindungsgemäßen Cytokininhibitor codiert.
Die cDNA-Insertionen können unter Anwendung bekannter Verfahren sequenziert werden. Das bevorzugte Verfahren ist die Subclonierung der Insertionen in einen geeigneten Vektor, wobei ein exemplarischer Vektor pGEM blue (Promega Biotec. Madison, Wisconsin, USA) ist, und die Sequenzierung der doppelsträngigen DNA unter Anwendung des von Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463, beschriebenen Didesoxy-Kettenterminationsverfahrens. Die Sequenzierung wird üblicherweise unter Verwendung von im Handel erhältlichen Kits, vorzugsweise dem von United States Biochemical Co., Cleveland, Ohio, USA, hergestellten Sequenase-Sequenzierungskits, und unter Verwendung von geeigneten Primern, wie T7 und SP6, erhältlich von Promega Biotec. Madison, Wisconsin, USA, und sequenzspezifischen Primern durchgeführt.
Das bevorzugte Verfahren zur Konstruktion einer cDNA-Bank, die eine cDNA- Sequenz enthält, die den L-1-Cytokininhibitor codiert, ist die Erzeugung der Bank aus RNA, die aus anhaftenden Monocyten isoliert wurde. Kurz zusammengefaßt, besteht das Ausgangsmaterial aus anhaftenden Monocyten. Monocyten können frisch von menschlichen Freiwilligen oder von der American Red Cross erhalten werden. In beiden Fällen werden die Monocyten aus Vollblut isoliert, zuerst in Form einer mononucleären Zelifraktion, die durch auf dem Fachgebiet bekannte Ficoll-Hypaque-Sedimentationsverfahren hergestellt wird. Boyun A., Scandinavian J. of Clinical Lab. Invest. 21 (1968), 77. Die Monocyten werden dann aus der mononucleären Fraktion durch Dichtefraktionierung unter Verwendung von Percoll isoliert. Ulmer A. J. und Flad D. H., J. of Immunological Methods 30 (1979), 1. In einer anderen Ausführungsform können Monocyten isoliert werden, indem sie auf Kunststoff-Gewebekulturschalen plattiert werden, wie von Eierman D. F. et al., J. of Immunology 142 (1989), beschrieben ist.
Die Monocyten werden zur Expression des IL-1-Cytokininhibitors durch Überimpfen der Monocyten auf Gewebekulturplatten oder Fibronectin-beschichtete Gewebekulturplatten induziert, wie allgemein von Eierman D. F. et al., J. of Immunol. 142 (1989), beschrieben ist. Zusätzlich zu Fibronectin kann eine Vielzahl anderer Materialien zum Beschichten der Gewebekulturplatten verwendet werden, um das Anhaften der Monocyten zu bewirken, einschließlich Kollagen. Kurz zusammengefaßt, werden 100 mm-Gewebekulturplatten mit 100 ug/ml menschlichem Fibronectin in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) 45 Minuten bei 37ºC beschichtet. Überschüssiges Fibronectin wird durch Waschen der Platten mit PBS entfernt und die Platten werden vor Gebrauch getrocknet. Die Monocyten werden auf die Platten überimpft und man läßt sie sich dann mindestens 30 Minuten an die Gewebekulturplatten anhaften, bevor daraus die gesamte RNA extrahiert wird. Die Monocyten werden in RPMI 1640-Medium, enthaltend 20 ug/ml Gentamicinsulfat, bei 37ºC in einer Atmosphäre von 95% Luft/5% CO&sub2; gezüchtet. Im allgemeinen werden etwa 1-2 · 10&sup7; Zellen pro 100 mm-Schale überimpif.
Anschließend werden anhaftende Monocyten nach Entfernung des Kulturmediums durch Zugabe von 3,5 ml einer Lösung, enthaltend 4 M Guanidiniumthiocyanatlösung, die vorher durch Mischen von 50 g Fluka-Material reine Qualität mit 0,5 g Natrium-N-lauroylsarcosin (Endkonzentration 0,5%), 2,5 ml 1 M Natriumcitrat, pH 7,0 (25 mM) und 0,7 ml 2-Mercaptoethanol (0,1 M) hergestellt wurde, lysiert. Die Lösung wird mit deionisiertem Wasser auf 100 ml aufgefüllt und gefiltert, um jegliches unlösliche Material zu entfernen. Der pH-Wert wurde mit 1M NaOH auf 7 eingestellt.
Anschließend wird die Monocyten-RNA von dem Guanidiniumthiocyanat-Homogenat durch Ultrazentrifugation über ein Cäsiumchlorid-Dichtekissen getrennt. Cäsiumchlorid technischer Qualität wird auf 5,7 M eingestellt und mit 0,1 M EDTA, pH 7, oder 25 mM Natriumacetat oder -citrat, pH 5, gepuffert. Die Lösung wird mit 0,2% Diethylpyrocarbonat sterilisiert und durch einen 0,45 um-Millipore-Filter gefiltert. Die Monocyten-RNA in dem Guanidiniumthiocyanat wird dann von dem Guanidiniumthiocyanat durch Ultrazentrifugation über das Cäsiumchlorid-Kissen getrennt. Die RNA-Pellets, die sich nach der Ultrazentrifugation gebildet haben, werden gegebenenfalls durch kurzes Erwärmen auf 68ºC in einem Wasserbad oder durch zuerst Extrahieren des Überschusses an Cäsiumchlorid aus den RNA-Pellets mit Ethanol und dann Trocknen mit Stickstoff wieder gelöst. Die auf diese Weise isolierte RNA kann verwendet werden, um eine geeignete cDNA-Bank herzustellen.
Die gesamte RNA, die isoliert wurde, wie vorstehend beschrieben, kann zur Konstruktion einer cDNA-Bank unter Anwendung der von Watson und Jackson, DNA-Cloning 1 (1985), 79, "A Practical Approach" (Glover D. M., Hrsg.), IRL Press, Oxford; und Huynh et al., "Constructing and Screening Libraries in Lambda GT 10 and Lambda GT 11 ", DNA Cloning 1 (1985), 49, "A Practical Approach" (Glover D. M., Hrsg.), IRL Press, Oxford, beschriebenen Verfahren verwendet werden. Dieses Verfahren setzt die Umwandlung der RNA in doppelsträngige cDNA unter Verwendung der AMB-reversen Transkriptase und der Klenow-Fragment-DNA-Polymerase I voraus, wie auf dem Fachgebiet bekannt ist. EcoRI- Linker wurden mit den doppelsträngigen cDNA-Fragmenten ligiert, nach Größe ausgewählt und unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Verpackungsextraktes, Gigapack (Stratagene, San Diego, CA), in den Lambda gT10-Vektor verpackt. Diese Bank enthielt etwa 5,3 · 10&sup6; Rekombinanten in einer Häufigkeit von etwa 7 · 10&sup7; pro ug DNA.
Aus der vorstehend beschriebenen Bank wurde durch Selektion von 4000 Clonen, die nicht mit einer ³²P-markierten Primärstrang-cDNA-Sonde hybridisieren, die unter Verwendung von RNA hergestellt wurde, die aus nicht induzierten Monocyten erhalten wurde, eine Unterbank abgeleitet.
Die vorstehend beschriebene Unterbank wurde durch differentielle Hybridisierung mit ³²P-markierten Primärstrang-cDNA-Sonden, die durch reverse Transkription von RNA hergestellt wurden, die aus Monocyten, die entweder 30 Minuten oder 4 Stunden anhafteten, oder aus kontrollierten, nicht anhaftenden Monocyten isoliert wurde, abgesucht. Diejenigen Plaques, die eine Hybridisierung mit der cDNA-Sonde, die aus anhaftenden Monocyten hergestellt wurde, verglichen mit nicht anhaftenden Monocyten zeigten, wurden ausgewählt und noch einmal mit der Sonde abgesucht. Dies führte zur Isolierung einer 1107-BasenpaarcDNA-Teilsequenz, die eine 1,6 kb-mRNA codiert. Der Clon wurde als MAD 15 bezeichnet und teilweise sequenziert (Fig. 1).
Zur Isolierung einer vollständigen DNA-Sequenz, die den IL-1-Cytokininhibitor codiert, wurde eine zweite cDNA-Bank konstruiert und die Sequenz daraus unter Verwendung von MAD 15 als Sonde isoliert. cDNA wurde aus RNA erzeugt, die aus induzierten peripheren Blutlymphocyten erhalten wurde. Solche Verfahren sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Das bevorzugte Verfahren besteht aus einer dreitägigen Induktion peripherer Blutzellen mit einem Calcium-Ionophor und Mezerein. Das bevorzugte Ionophor ist A-23187. Das Induktionsverfahren wird durchgeführt, wie es allgemein im US-Patent Nr. 4,376,821 beschrieben ist.
Leukocyten wurden mit 100 ng/ml Mezerein und 0,25 ug/ml A-23187 induziert. Der Induktionszeitraum betrug etwa 3 Tage, danach wurde die gesamte RNA aus induzierten peripheren Blutlymphocyten hauptsächlich unter Anwendung des vorstehend beschriebenen Guanidiiumthiocyanat-Cäsiumchlorid-Verfahrens isoliert, und aus der RNA-Gesamtfraktion kann Poly(A+)-Boten-RNA durch Chromatographie an Oligo(dT)-Cellulose, wie vorstehend beschrieben, isoliert werden.
Anschließend wird der Primärstrang der cDNA durch reverse Transkription der mRNA wie folgt erhalten. 33 ug der Poly(A+)-RNA wurden in einem Mikrozentrifugenröhrchen dispensiert und 5 Minuten bei 65ºC inkubiert und dann 5 Minuten auf Eis gekühlt.
Anschließend wurden zu der RNA aufeinanderfolgend die folgenden Komponenten zugegeben: 66 ul 250 mM Tris-HCl, pH 8,3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl&sub2;, 10,0 mM DTT; 9,0 ul RNA's in [40 E/ul]; 16,5 ul 10 mM dNTPs; 35 ul p(dT)1215 (100 pmol/ul); und 16,5 ul MLVreverse Transkriptase (200 E/ul) und Wasser bis zum Erhalt eines Gesamtvolumens von 330 ul.
Um die Wirksamkeit der Primärstrangsynthese durch alkalische Agarosegelelektrophorese zu überwachen, wird ein zweites Röhrchen hergestellt, das 2 ul [α³²P]-dCTP (10 uCl/ul) und 20 ul des Primärstrangreaktionsgemisches, das hergestellt wurde, wie vorstehend beschrieben, enthält.
Beide Röhrchen werden 60 Minuten bei 37ºC inkubiert, gefolgt vom Stoppen der Umsetzungen durch Stellen der Röhrchen in Eis. 5 ul 0,5 M EDTA und 23 ul Wasser werden zu dem [α³²P]-dCTP enthaltenden Röhrchen zugegeben. Beide Röhrchen werden bei -20ºC gelagert.
Der Sekundärstrang des cDNA-Doppelstrangs wird wie folgt hergestellt: 37,5 ul des Primärstranggemisches, das synthetisiert wurde, wie vorstehend beschrieben, wird in 8 verschiedene Röhrchen auf Eis aliquotiert. 6,25 ul des Gemisches werden auch in ein 9. Röhrchen auf Eis pipettiert. Anschließend werden zu jedem der 8 Röhrchen 262,5 ul eines Sekundärstrang-Cocktails zugegeben und zu dem übrigen Röhrchen bzw. dem Kontrollröhrchen werden 43,75 ul zugegeben. Der Sekundärstrang-Cocktail setzt sich aus den folgenden Bestandteilen zusammen: 600,0 ul 5x SSB (5x SSB besteht aus 94 mM Tris-HCl, pH 8,3, 453 mM KCl, 23,3 mM MgCl&sub2;, 18,7 mM DTT), 1802,9 ul Wasser, 56,3 ul 10 mM dNTPs, 12,5 ul [α³²P]-dCTP, 75,0 ul 6 mM β-NAD, 75,0 ul DNA-Polymerase I (10 E/ul) und 3,4 ul E. coli-Ligase (9 E/ul). Das Gesamtvolumen der Reagenzien in dem Sekundärstrang-Cocktail beträgt 2625,0 ul. Alle 9 Röhrchen werden 2 Stunden bei 16ºC inkubiert, danach werden zu dem 9. Röhrchen 5 ul 0,5 M EDTA und 65 ul Wasser zugegeben. Der Inhalt dieses Röhrchen wird für eine anschließende alkalische Agarosegelanalyse bei -20ºC gelagert.
Anschließend werden die Inhalte der 8 Röhrchen phenolextrahiert und zweimal ethanolgefällt, und die Pellets werden in 128 ul TE vereinigt.
Die vorstehend hergestellt cDNA wird wie folgt mit RNase H behandelt. Zu 128 ul cDNA wird der folgende Puffer zugegeben: 128 ul 5x RNase H-Puffer, der aus 100 mM Tris- HCl, pH 7,5, 100 mM KCl, 50 mM MgCl&sub2;, 0,7 mM DTT und 0,5 mM EDTA besteht. Die Röhrchen enthalten außerdem 377,3 ul Wasser und 6,7 ul RNase H (1,9 E/ul). Das Gesamt volumen des RNase H-Reaktionsspaltproduktes beträgt 640 ul. Das Gemisch wird bei 37º 20 Minuten inkubiert, danach werden 5 ul 0,5 M EDTA zugegeben, um die Reaktion zu beenden. Schließlich wird das Reaktionsgemisch phenolextrahiert und zweimal ethanolgefällt, und das Pellet wird in 12 ul TE resuspendiert.
Die cDNA wird durch neutrale Agarosegelelektrophorese fraktioniert und gereinigt, cDNAs mit einer Länge von etwa 0,25-7,0 Kilobasen wurden aus dem Gel entfernt, mit Glaskügelchen gereinigt und in 107,5 ul in Glaswaren destilliertem Wasser resuspendiert.
Anschließend wird die cDNA mit einem C-Schwanz versehen und wie folgt in den Vektor pCDLSRα-296 (erhalten von der DNAX Corporation und beschrieben von Takebe et al., Molecular and Cellular Biology, Bd. 8 (1988), Nr. 1, 466; und im US-Patent Nr. 4,695,542) cloniert. Ein 10x terminale Transferase-Puffer wird wie folgt hergestellt: 13,8 g Cacodylsäure werden zu 3,0 g Tris-Base in 60 ml Wasser zugegeben. Die Lösung wird durch langsame Zugabe von festem KOH auf pH 7,6 eingestellt, danach wird das Volumen mit Wasser auf 88 ml erhöht. Anschließend wird die Lösung auf 0ºC abgekühlt, dann werden 2 ml 0,1 M DTT zugegeben, gefolgt von der tropfenweisen Zugabe von 10 ml 0,1 M MnCl&sub2;, während die Lösung fortwährend gerührt wird. Zu den 38,3 ul des 10x TDT-Puffers werden 5,7 ul 1 mM dCTP und 0,6 ug doppelsträngige cDNA zugegeben. Eine bestimmte Menge an Wasser wird zugegeben, um die Lösung auf ein Gesamtvolumen von 380,5 ul zu bringen. Die Lösung wird 15 Minuten auf 37ºC erwärmt und 360 Einheiten TdT in etwa 3 ul werden zugegeben. 60 ul- Aliquots werden zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen und mit 468 ul 1 mM EDTA vereinigt. Jedes Aliquot wird dann mit dem vorher mit einem G-Schwanz versehenen Vektor in einer geeigneten Menge von Anlagerungspuffer vereinigt und in einen geeigneten Wirt transformiert. Der mit einem C-Schwanz versehene Stamm, der die größte Zahl von Transformanten produziert, wird für die Transformation im großen Maßstab verwendet.
Die cDNAs werden in den Plasmidvektor pCDL-SRα296 cloniert. Der Vektor wird wie folgt hergestellt. 200 ug des Plasmids werden mit 700 Einheiten PstI in einem Gesamtvolumen von 500 ul 60 Minuten bei 37ºC umgesetzt. Das Plasmid wird dann phenolextrahiert und zweimal ethanolgefällt und in 200 ul destilliertem Wasser resuspendiert. Die DNA- Konzentration wird durch Spektrophotometrie bestimmt. Anschließend werden etwa 136 ug pCDL-SRα296, 112,6 umol 3'-Enden, durch Vereinigen mit einer Lösung, bestehend aus 30 ul 10x TdT-Puffer, 30 ul [³H]-dGTP (etwa 70 pmol/ul), 5,5 ul 1 mM dGTP und Wasser, zum Erhalt eines Gesamtvolumens von 297 ul, mit einem G-Schwanz versehen. Die "Tailing"- Reaktion wird für verschiedene Zeiträume durchgeführt, und das Verfahren umfaßt die Entfernung von 30 ul aus dem Reaktionsröhrchen und das Vereinigen derselben mit 359 ul 17 mM EDTA, das ist der Zeitpunkt 0. Anschließend werden 360 Einheiten terminale Transferase in 3 ul zu dem vorgewärmten Reaktionsspaltproduktgemisch 15 Minuten bei 37ºC zugegeben und 30 ul des Gemisches in verschiedenen Zeitintervallen entnommen, und die Reaktionen werden durch Pipettieren des Gemisches in 359 ul 17 mM EDTA gestoppt. Das Ausmaß des "G-Tailing" wird durch Bestimmung des Einbaus von [³H]-dGTP überwacht, wie auf dem Fachgebiet bekannt ist. Um sicherzustellen, daß der pCDL-5Rα296-Vektor richtig mit einem G-Schwanz versehen ist und daß er nicht mit Vektoren ohne Schwanz verunreinigt ist, wird eine Probeanlagerung und -transformation von DHSct durchgeführt, wie auf dem Fachgebiet bekannt ist. Der Vektor wird bei -20ºC gelagert und zur Clonierung der vorstehend beschriebenen, mit einem C-Schwanz versehenen cDNA verwendet.
Kurz zusammengefaßt, bestand die Clonierung in pCDL-SRα296 aus der Vereinigung von 88 ul der mit einem C-Schwanz versehenen cDNA, entsprechend einem jeden Zeitpunkt, 2 ul des mit einem G-Schwanz versehenen Vektors und 10 ul 10x Anlagerungspuffer. Das Gesamtvolumen betrug 100 ul. Der 10x Anlagerungspuffer bestand aus: 0,1 M Tris-HCl, pH 7,6, 1,0 M NaCl und 10 mM EDTA. Die Anlagerungsreaktion wurde unter Standardbedingungen durchgeführt und das Gemisch wurde in DH5-Bakterien transformiert.
Die vorstehend erhaltene cDNA-Bank kann unter Anwendung von entweder Verfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, oder einem neuen Festkörper-Amplifikationsverfahren, das nachstehend beschrieben wird, durchgeführt werden. Das Verfahren umfaßt das Suspendieren von bakteriellen Transformanten in niedrigschmelzender Agarose. Dies steht im Gegensatz zu Verfahren gemäß dem Stand der Technik, bei denen die bakteriellen Transformanten auf geeigneten Kulturschalen ausplattiert werden. Die folgenden Materialien und Verfahren werden ver- bzw. angewendet. 0,3% Seapräp-Agarose in LB-Medium, die in einem Wasserbad bei 37ºC gehalten wurde. Eine geeignete Menge von cDNA, angelagert an pCDL- 5Rα296 und transformiert in DHSa, um bis zu etwa 2,5 · 10&sup6; cfu/ml zu erzeugen. Zu der geeigneten Menge an Agarose wird Ampicillin bis zum Erhalt von 50 ul> /ml und etwa 1,25 · 10&sup6; cfu bakterielle Transformanten zugegeben. 25 ml dieser Lösung werden in konische 50-ml Röhrchen (Falcon Corp. Nr. 2098) gegossen. Die Röhrchen werden 20-60 Minuten in ein Eiswasserbad gestellt und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Zur Abschätzung des Titers des Transformantengemisches werden 100 ul auf LB-amp&sup5;&sup0;-Platten ausplattiert.
Die Bank kann durch 20-minütiges Pelletieren der Zellen in 500 ml-Zentrifugenfläschchen bei 8 K bei Raumtemperatur gelagert werden. Die Zellpellets werden in einem Gesamtvolumen von 100 ml 12,5% Glycerin in LB-Medium resuspendiert. Aliquots der Suspension werden bei -70ºC gelagert.
Die Bank wurde unter Verwendung der cDNA-Teilsequenz MAD 1 S als Sonde auf cDNAs abgesucht, die den IL-1-Inhibitor codieren. MAD 15 wurde teilweise sequenziert, und die Sequenz ist in Fig. 1 gezeigt.
10&sup5; Kolonien der SRIct-cDNA-Bank wurden abgesucht und eine einzige vollständige cDNA-Sequenz wurde erhalten. Sie ist in Fig. 2 zusammen mit der mutmaßlichen Proteinsequenz gezeigt.
Es ist bemerkenswert, daß die cDNA-Sequenz beim Vergleich mit einem Inhibitor gemäß dem Stand der Technik, der in der WO89/11540 gezeigt ist, darauf hinweist, daß der Inhibitor kein Leader-Peptid aufweist. Folglich liegt der erfindungsgemäße Inhibitor überwiegend intrazellulär vor.
Der IL-1-Inhibitor kann in einer Vielzahl von Systemen exprimiert werden, wie vorstehend beschrieben ist. Die Expression in Säugerzellen kann in COS-A2-Zellen oder in COS-7- und CV-1- sowie Hamster- und Mauszellen durchgeführt werden. Die Expression auf Basis von Insektenzellen kann in Spodoptera frugiperda durchgeführt werden.
Das allgemeine Schema zur Isolierung des Cytokininhibitors und zu seiner Reinigung besteht aus der Freisetzung des Moleküls aus dem Cytoplasma geeigneter Zellen, Gewebe oder Organe, gefolgt von der Entfernung von unlöslichem Material und Aussetzen der löslichen Fraktion einer oder mehrerer Chromatographieschritte, einschließlich einer Anionen- und Kätionenaustauscherchromatographie. Das bevorzugte Verfahren ist, die lösliche Fraktion zuerst einer Anionenaustauscherchromatographie zu unterziehen, gefolgt von einem zweiten Chromatographieschritt, wobei der Eluant aus dem Anionenaustauscher über einen Kationenaustauscher geleitet wird. Der IL-1-Cytokininhibitor wird von dem Kationenaustauscher eluiert und kann weiter gereinigt werden, indem er einem dritten Chromatographieschritt, wie einer Hydrophobohromatographie oder einer nach Größe auftrennenden Chromatographie, oder einem zweiten Anionenaustauscherschritt unterworfen wird. Es ist wichtig anzumerken, daß die Reihenfolge der verschiedenen Chromatographieverfahren variiert werden kann, um die optimale Reinigung des Inhibitors zu bewirken.
Genauer wird der Cytokininhibitor hergestellt, indem das Molekül aus dem Cytosol unter Anwendung einer Reihe von Verfahren, einschließlich Einfrieren/Auftauen, Beschallen, milde Detergensextraktion, etc., freigesetzt wird. Dieses Verfahren wird vorzugsweise in einer physiologisch gepufferten Lösung, enthaltend einen oder mehrere Proteaseinhibitoren, durchgeführt. Außerdem kann die Extraktionslösung Metallionenchelatoren enthalten, um die Proteaseaktivität weiter zu inhibieren, insbesondere jener Proteasen, die hinsichtlich ihrer Aktivität auf Metallionen angewiesen sind. Die bevorzugte Extraktionslösung ist eine physiologisch ausbalancierte Salzlösung, die die Chelatoren Ethylenglykoltrichloressigsäure (EGTA) oder Ethylendiamintrichloressigsäure (EDTA) plus den Proteaseinhibitor Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) enthält. Der (die) Metallionenchelator(en) sowie der (die) Proteaseinhibitor(en) sind in Konzentrationen vorhanden, die die Proteolyse wirksam inhibieren, vorzugsweise etwa 5 mM bzw. 100 uM. Der Fachmann ist sich natürlich jedoch bewußt, daß, da die Arten und Mengen der Proteasen in Abhängigkeit von dem zur Extraktion des Cytokininhibitors verwendeten Ausgangsmaterial variieren, die Konzentrationen, in denen die Proteaseinhibitoren oder Chelatoren verwendet werden, falls tatsächlich überhaupt verwendet, ebenfalls variieren.
Das den Cytokininhibitor enthaltende Gemisch wird durch Zentrifugation oder auf andere Weise geklärt, um unlösliches Material aus der wäßrigen Cytosolfraktion zu entfernen. Falls die Cytosolfraktion geringe Mengen des Cytokininhibitors enthält, kann der Inhibitor durch ein beliebiges mehrerer Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, einschließlich der Fällung bei hohen Salzkonzentrationen, wie zum Beispiel mit Ammoniumsulfat, oder durch Ultrazentrifugation konzentriert werden. Falls der Cytokininhibitor durch Fällung konzentriert wird; wird er vorzugsweise anschließend in einer geeigneten physiologisch ausbalancierten Salzlösung, enthaltend einen oder mehrere Proteaseinhibitoren und vorzugsweise etwa 0,1% eines nichtionischen Detergens, wie NP40 resuspendiert. Diese Lösung wird dann zur Ionenaustauscherchromatographie durch Dialyse der Lösung gegen eine verträglich gepufferte, chromatographische Lösung, die vorzugsweise Phosphat im millimolaren Bereich, einen Metallionenchelator, ein Reduktionsmittel und einen Proteaseinhibitor enthält, aufbereitet.
Das Inhibitordialysat wird dann einer chromatographischen Reinigung unterzogen, die aus drei Schritten besteht. Der erste schließt die Reinigung unter Verwendung eines Ionenaustauscherchromatographieschrittes ein, der mit dem Cytokininhibitor-Extraktions puffer verträglich ist. Da der bevorzugte Extraktionspuffer Phosphat enthält, umfaßt der erste Schritt die Reinigung des Cytokininhibitors durch Kationenaustauscherchromatographie. Der zweite besteht aus einer Ionenaustauscherchromatographie, bei der die Ionenaustauschermatrix die entgegengesetzte Ionenbindungskapazität des verwendeten ersten Ionenaustauschers aufweist.
So besteht das bevorzugte Reinigungsschema aus dem Auftragen der den Cytokininhibitor enthaltenden Phosphatlösung auf einen Kationenaustauscher und dem Eluieren desselben daraus, vorzugsweise unter Verwendung von Lösungen, die den pH-Wert oder die spezifische Leitfähigkeit der Lösung verändern. Stärker bevorzugt wird der Cytokininhibitor durch das Auftragen von entweder einer Gradienten- oder Nicht-Gradientensalzlösung und besonders bevorzugt unter Verwendung eines linearen Gradienten von Natriumchlorid über den Bereich von etwa 0-0,6 Mol eluiert.
Der bevorzugte Kationenaustauscher ist ein SP-Cellulose-Kationenaustauscher. Solche sind im Handel von AMF Molecular Separations Division, Meridian, CT, unter der Markenbezeichnung ZetaPrep SP-Patronen erhältlich. Der SP-Cellulose-Kationenaustauscher ist ein elastisches, dreidimensionales Netzwerk, das sich aus Cellulosegerüsten zusammensetzt, die mit einem Vinylpolymeren vernetzt sind, das Sulfopropyl-funktionelle Seitengruppen enthält. Die Matrix ist vorzugsweise für den Radialstromdurchgang der Cytokininhibitor- Lösung angepaßt. Die Durchflußrate der Lösung durch die Matrix hängt von der Größe und der Geometrie der verwendeten Matrix ab. Der Fachmann ist sich jedoch bewußt, daß Sorgfalt geboten ist, um zu vermeiden, daß die Kapazitätseinheit der Matrix mit dem Cytokininhibitor überschritten wird. Falls die Kapazität überschritten wird, wird der Cytokininhibitor nicht vollständig zurückgehalten, so daß in der ausströmenden Flüssigkeit überschüssiger, nicht zurückgehaltener Inhibitor vorhanden ist. Die Kapazität der Matrix, um den Inhibitor zurückzuhalten, kann durch Nachweis einer Inhibitoraktivität in der ausströmenden Flüssigkeit unter Verwendung eines der nachstehend beschriebenen Tests überwacht werden.
Die den Cytokininhibitor enthaltende Fraktionen werden für den zweiten Chromatographieschritt, d. h. die Anionenaustauscherchromatographie, behandelt. Dieser besteht aus der Vereinigung der Fraktionen und der Einstellung der Lösung auf einen pH-Wert und eine Ionenstärke, die mit der Anionenaustauscherchromatographie kompatibel sind. Eine Vielzahl von Anionenaustauschern ist verfügbar und die Konzentrationen dieser Reagenzien variieren in Abhängigkeit von dem verwendeten Typ. DEAE-Sepharose oder TSK-DEAE-5-PW können verwendet werden. Die allgemeinen Verfahren zur Herstellung und Verwendung dieser Matrizen sind dem Fachmann bekannt. Der bevorzugte Anionenaustauscher ist die TSK-DEAE-5-PW-Matrix. Sie wird durch Äquilibrieren derselben mit einer Chloridionen enthaltenden Lösung bei einem pH-Wert von 8,5 hergestellt. Stärker bevorzugt setzt sich die Lösung aus Tris-Hydrochlorid, pH 8,5, plus einem Reduktionsmittel, einem Metallchelator, Magnesiumchlorid und einem Proteaseinhibitor zusammen. Die Konzentrationen des Metallchelators und des Proteaseinhibitors variieren und hängen davon ab, wie gründlich der Cytokininhibitor proteolysiert wird und ob die verantwortlichen Proteasen durch Metallionen aktiviert werden. Die Konzentration einwertiger Kationen, wie Magnesiumchlorid, und des Reduktionsmittels können durch Überwachung der Inhibitoraktivität empirisch bestimmt werden. Diejenigen Konzentrationen, die die höchste Aktivität aufrechterhalten, werden verwendet. Im allgemeinen wird bevorzugt, daß Magnesiumchlorid und das Reduktionsmittel im Bereich von etwa 0,5-1 mM bzw. 0,1-1 mM vorliegen.
Die Lösung wird dann über die Anionenaustauschermatrix geleitet, woraufhin der Cytokininhibitor an die Matrix bindet. Das bevorzugte Elutionsverfahren besteht aus der Elution des Inhibitors unter Verwendung eines linearen Salzgradienten im Bereich von 0-0,6 M NaCl. Die Reinheit und Aktivität des so erhaltenen Inhibitors kann wie nachstehend beschrieben und durch einen Natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektrophoreselauf unter reduzierenden Bedingungen überwacht werden. Unter Anwendung dieser Verfahren kann bestimmt werden, daß der Cytokininhibitor ein Molekulargewicht von etwa 15-20 kD aufweist.
Der dritte Chromatographieschritt besteht aus der Anwendung von entweder einem zweiten Kationenaustauscherschritt oder einem hydrophoben Wechselwirkungschromatographieschritt nach der Anionenaustauscherchromatographie. Das am meisten bevorzugte Reinigungsschema verwendet einen zweiten Kationenaustauscherschritt. Die Anwendung eines dieser Verfahren erhöht die Reinheit des Inhibitors im allgemeinen auf etwa 95%. Falls eine Kationenaustauschersäule gewählt wird, sind die vorstehend beschriebenen Materialien und Verfahren hier in einer entsprechenden Weise ver- bzw. anwendbar. Im allgemeinen bestehen diese aus der Erniedrigung der in den Anionensäuleneluaten vorliegenden Salzkonzentration und der Einstellung des pH-Werts auf etwa 6,0. Wie im ersten Kationenchromatographieschritt werden hier mehrere verschiedene Arten von Kationenaustauschermatrizen verwendet; jedoch ist die bevorzugte Matrix eine SP-TSK-Säule, die unter hohem Druck betrieben wird. Falls die Hydrophobohromatographie gewählt wird, sollte die Ionen stärke des Eluats aus dem Anionenaustauscher erhöht werden, so daß sie mit der hydrophoben Wechselwirkungschromatographie kompatibel ist. Die Lösung kann dann über eine hydrophobe Wechselwirkungschromatographiematrix geleitet und unter Anwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren, einschließlich der Verringerung der Salzkonzentration oder der Elution mit einem chaotropen Mittel, eluiert werden. Beide der letzteren Lösungen können allein oder in Verbindung miteinander verwendet werden.
Eine Vielzahl von hydrophoben Wechselwirkungschromatographiematrizen kann verwendet werden. Die Materialien und Verfahren zur Anwendung der Hydrophobohromatographie werden von Shaltie S., Methods in Enzymology 104 (1984), 69, allgemein beschrieben. Obwohl es offensichtlich ist, daß es viele hydrophobe Chromatographiematerialien und Verfahren gibt, die ver- bzw. angewendet werden können, um den Cytokininhibitor zu reinigen, wird Phenyl-Sepharose bevorzugt, und es wird ferner bevorzugt, daß die Chromatographie unter hohem Druck durchgeführt wird. Die allgemeinen Verfahren zur Durchführung einer Hochdruckflüssigkeitschromatographie, die eine Phenyl-derivatisierte Matrix einschließen, werden von Regmaer F., Methods in Enzymology 91 (1983), 137, beschrieben. Die bevorzugte Phenyl-derivatisierte Matrix ist im Handel von der Bio-Rad Corporation erhältlich und wird unter dem Warenzeichen Biogel TSK-Phenyl-5-PW verkauft.
Der Fachmann ist sich außerdem bewußt, daß ein alternatives Reinigungsschema aus einem Affinitätschromatographieschritt bestehen kann. Dieser kann durch Bindung des Inhibitors an eine geeignete Bindungseinheit, wie anti-Inhibitor-Antikörper, ausgeführt werden. Der Inhibitor kann dann von der Aflinitätsmatrix unter Anwendung eines geeigneten Verfahrens oder, falls sich die Matrix aus einem Antikörper zusammensetzt, durch pH- oder chaotrope Mittel freigesetzt werden.
Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Chromatographieverfahren kann ein weiteres Verfahren, die chromatographische Fokussierung, angewendet werden. Dieses Verfahren wird in Pharmacia's "FPLC Ion Exchange and Chromatofocusing - Principles and Methods" (1985) beschrieben und schließt die Elution von Proteinen von einem geeigneten chromatographischen Substrat als Funktion des pH-Werts ein.
Schließlich sollte angemerkt werden, daß, während die bevorzugten Anwendungen der hier beschriebenen Ionenaustauschermaterialien in Form eines Säulenformats sind, ist erkennbar, daß sie auch in einem Batchformat verwendet werden können.
Infolge des einzigartigen 5'-Endes des IL-1-Inhibitors, verglichen mit Inhibitoren gemäß des Stands der Technik, erleichtert ein Antikörper, der an das 5-Ende bindet, die Reinigung des erfindungsgemäßen Inhibitors aus einem Gemisch von Proteinen, das andere IL-1-Inhibitoren enthält. Der bevorzugte Antikörper ist monoclonal, aber es ist beabsichtigt, daß ein polyclonaler Antikörper und Antikörperfragmente des monoclonalen und polyclonalen Antikörpers, die eine Bindungsaktivität aufweisen, im Schutzumfang der Erfindung eingeschlossen sind. Der monoclonale Antikörper kann von einer beliebigen geeigneten Art stammen und kann Maus, Ratte und Mensch einschließen. Der Antikörper kann ein chimäres Konstrukt sein, das unter An- bzw. Verwendung von Rekombinationstechniken, homologer Rekombination oder eines einkettigen Antikörpers hergestellt wurde, wie auf dem Fachgebiet bekannt ist. Allgemein ist beabsichtigt, daß jedes Antikörperkonstrukt, das die Bindung eines Antikörpers kreuzblockiert, der an den IL-1-Inhibitor bindet, im Schutzumfang der Erfindung eingeschlossen ist.
Der Begriff "rekombinanter Antikörper" bezieht sich auf einen Antikörper, worin ein Teil einer jeden der Aminosäuresequenzen der schweren und leichten Kette zu entsprechenden Sequenzen in einem Antikörper homolog ist, der von einer bestimmten Art stammt oder zu einer bestimmten Klasse gehört, während das restliche Segment der Ketten zu entsprechenden Sequenzen in einem anderen homolog ist. Am häufigsten spiegelt in einem rekombinanten Antikörper der variable Bereich von sowohl der leichten als auch der schweren Kette die variablen Bereiche eines Antikörpers wieder, der von einer Säugerart stammt, während die konstanten Bereiche zu den Sequenzen in einem Antikörper, der von einer anderen Art stammt, homolog sind. Jedoch ist dies nicht notwendigerweise immer der Fall; zum Beispiel haben Ward et al.; Nature 341 (1989), 544, gezeigt, daß die variable Kette allein mit einer signifikanten Antigenbindungsaktivität in Bakterien exprimiert werden kann. Es ist auch beabsichtigt, daß im Schutzumfang des Begriffs "rekombinanter Antikörper" ein monoclonaler Fab-Antikörper eingeschlossen ist, der unter Anwendung der von Huse W. D. et al., Science 246 (1989), 1275, beschriebenen Verfahren hergestellt wurde.
Zwei Antikörper sind "kreuzblockierend" oder haben "ein gemeinsames Epitop", wenn jeder Antikörper wirksam die Bindung des anderen Antikörpers in einem Bindungsinhibierungstest blockiert. Folglich, falls die Antikörper A und B kreuzblockierend sind, bindet Antikörper A nicht an sein Antigen, wenn das Antigen vorher mit Antikörper B inkubiert worden war, und Antikörper B bindet nicht an sein Antigen, wenn das Antigen vorher mit Antikörper A inkubiert worden war.
Das Verfahren zur Erzeugung eines monoclonalen Antikörpers gegen den IL-1- Inhibitor wird nachstehend beschrieben. Das bevorzugte Fusionsverfahren dafür, das befolgt wird, wird von Köhler & Milstein, Nature 256 (1975), 495, beschrieben, so wie es von Fendly et al., in Hybridoma 6 (1987), 359, modifiziert wurde.
Balb/c-Mäuse werden mittels einer intraperitonealen Erstimmunisierung, bestehend aus 40 ug des Inhibitors in komplettem Freundschen Adjuvans (CFA), gefolgt von zwei anschließenden intraperitonealen Injektionen ohne komplettem Freundschen Adjuvans, bestehend aus jeweils 20 ug Inhibitor, immunisiert. Die erste aus 20 ug bestehende Immunisierung wird etwa drei Wochen nach der Erstimmunisierung verabreicht, und die zweite 20 ug-Nachimpfung wird etwa eine Woche später verabreicht. Etwa fünfeinhalb Wochen nach der zweiten 20 ug-Nachimpfung wird eine letzte Immunisierung durchgeführt, die aus der Verabreichung von 10 ug intravenös besteht. Drei Tage später werden die Milzen aus immunisierten Mäusen entnommen und die Splenocyten mit einer murinen Myelomzelllinie fusioniert.
Anschließend werden die Mäuse getötet und die Splenocyten aus den immunisierten Milzen durch Herauszupfen freigesetzt und in serumfreien Dulbecco's modifizierten Eagle- Medium gewaschen. In ähnlicher Weise werden SP²/OAg14-Myelomzellen gewaschen und mit den Splenocyten in einem 5 : 1-Verhältnis von Milzzellen zu Myelomzellen vereinigt. Das Zellgemisch wird pelletiert, das Medium entfernt und die Fusion durch Zugabe von 1,0 ml einer 40%igen (Vol./Vol.) Lösung von Polyethylenglykol 1500 durch tropfenweise Zugabe über einen Zeitraum von 60 Sekunden bei Raumtemperatur, gefolgt von einer 60-sekündigen Inkubation bei 37ºC bewirkt. Zu der Zellsuspension werden unter vorsichtigem Schütteln 9 ml Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium über einen Zeitraum von 5 Minuten zugegeben. Zellklumpen in dem Gemisch werden vorsichtig resuspendiert, die Zellen werden gewaschen, um jegliches zurückgebliebene PEG zu entfernen, und bei etwa 2 · 10&sup5; Zellen/Vertiefung in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium, supplementiert mit 20% fetalem Kälberserum, ausplattiert. Nach 24 Stunden werden die Zellen mit einer 2x Lösung von Hypoxanthin und Azaserin-Selektionsmedium versorgt. Die Zellen werden in insgesamt 15,5 Mikrotiterplatten ausplattiert, was 1488 Vertiefungen entspricht. Anschließend, etwa 2,4 Wochen später, zeigen 684 Vertiefungen ein gutes Zellwachstum und werden unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Tests und vorzugsweise einem ELISA-Test auf einen Antikörper gegen den Inhibitor abgesucht.
Hydridome, die einen neutralisierenden Antikörper sezernieren, der an den IL- 1- Inhibitor bindet, können durch Durchführung des nachstehend beschriebenen IL-1-Inhibitortests und Einschließen des zu testenden Antikörpers in das Reaktionsgemisch identifiziert werden. Der neutralisierende Antikörper hebt die Inhibitoraktivität des IL-1-Inhibitors auf.
Zwei Test können verwendet werden, um die biologische Aktivität des IL-1-Inhibitors zu zeigen, ein Thymocyten-Proliferationsinhibierungstest und ein PGE2-Sekretionsinhibierungstest unter Verwendung dermaler Fibroblasten.
Thymocyten sprechen auf IL-1 an, wenn sie mit Phytohämagglutinin vereinigt werden, indem sie eine Proliferationsantwort durchmachen. Die letztere kann durch einen 3H- Thymidin-Einbau oder andere auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren gemessen werden. Mosmann T., J. Immunol. Method 65 (1983), 55. Die IL-1-Inhibitoraktivität kann auf diese Weise durch Messung der Inhibierung der durch IL-1 plus Phytohämagglutinin hervorgerufenen Proliferationsantwort bestimmt werden.
Der zweite Test besteht aus der Messung der durch IL-1 verursachten Inhibierung der Sekretion von PEG2 durch menschliche dermale Fibroblasten. Es ist bekannt, daß menschliche dermale Fibroblasten nach einer 6-stündigen Stimulation mit IL-1 PEG2 produzieren, das leicht durch einen ELISA-Test gemessen werden kann.
Unter Verwendung eines der beiden vorstehend beschriebenen Tests kann der erfindungsgemäße IL-1-Inhibitor identifiziert und charakterisiert werden.
Üblicherweise wird der Thymocyten-Test unter Verwendung von etwa 1 · 10&sup6; Thymocyten durchgeführt, die in einem geeigneten Kulturmedium, enthaltend etwa 1 Einheit/ml IL-1 und variierende Mengen des Materials, das auf eine IL-1-Inhibitoraktivität getestet werden soll, gezüchtet werden. Die Inhibierung der Proliferation kann, wie auf dem Fachgebiet bekannt ist, unter Verwendung von ³H-Thymidin oder der Aufnahme des Tetrazoliumsalzes MTT gemessen werden. Mosmann, vorstehend. Geeignete Kontrollen werden durchgeführt, einschließlich der Züchtung von Thymocyten in Gegenwart des zu testenden Materials.
In ähnlicher Weise kann die Inhibierung der Sekretion von PGE&sub2; durch Plattieren von etwa 1 · 10&sup5; Zellen in einem geeigneten Kulturmedium auf eine Platte mit 96 Vertiefungen zusammen mit 0,5 Einheiten/ml IL-1 und variierenden Mengen des auf eine IL-1- Inhibitoraktivität zu testenden Materials gemessen werden. Die Anwesenheit des Inhibitors kann durch den Vergleich mit Kontrollzellen, die ohne das Inhibitormaterial inkubiert wurden, die üblicherweise etwa 50 000 pg/ml PGE&sub2; nach einer etwa 6-stündigen Exposition gegen IL-1 sezernieren, nachgewiesen werden. PGE&sub2; kann unter Verwendung eines ELISA oder eines anderen auf dem Fachgebiet bekannten Tests nachgewiesen werden. Eisenberg, Nature 343 (1990), 341.
Die Anwesenheit des erfindungsgemäßen IL-1-Inhibitors in verschiedenen Geweben/Zellen wurde bestimmt und mit dem in der WO 89/11540 beschriebenen IL-1-Inhibitor gemäß dem Stand der Technik verglichen. Das Verfahren bestand aus der Durchführung der Polymerasekettenreaktion mit Gewebe-RNA. Dieses Verfahren ist auf dem Fachgebiet gut bekannt und wird in den US-Patenten Nrn. 4,683,202 und 4,683,195 beschrieben.
Im allgemeinen schließt die Synthese/Amplifikation von DNA-Sequenzen durch PCR eine enzymatische Kettenreaktion ein, die in exponentiellen Mengen eine spezifische DNA-Sequenz erzeugt, mit der Maßgabe, daß die Enden der Sequenz im einzelnen hinreichend bekannt sind, so daß Oligonucleotidprirner synthetisiert werden können, die mit ihnen hybridisieren, und daß ein Teil der Sequenz zugänglich ist, um die Kettenreaktion zu starten. Ein Primer ist zum Minusstrang komplementär und der andere ist zum Plusstrang komplementär. Auf die vorliegende Erfindung angewendet, waren die Primer spezifische 5'-Primer, die in Verbindung mit einem üblichen 3'-Primer verwendet wurden, um einzigartige Produkte zu identifizieren, oder ein 5'-Primer in Verbindung mit dem gleichen 3'-Primer, um eine übliche in dem offenen Leserahmen vorhandene Sequenz nachzuweisen.
Die verwendeten Primer sind nachstehend in Tabelle 1 gezeigt. Die Sense- und Antisense-Primer GM397 bzw. GM368 wurden verwendet, um die erfindungsgemäße IL-1- Inhibitor-mRNA nachzuweisen. Die Anwesenheit des Inhibitors wurde mit einem IL-1-Inhibitor gemäß dem Stand der Technik, der in der WO 89/11540 beschrieben ist, unter Verwendung der Sense- und Antisense-Primer GM398 bzw. GM368 verglichen. Von den Primern ist GM397 für den erfindungsgemäßen IL-1-Inhibitor spezifisch, während GM398 und GM368 zu Sequenzen homolog sind, die in dem Inhibitor gemäß dem Stand der Technik vorkommen. Unter Anwendung dieses Verfahrens wurden die folgenden Ergebnisse erhalten.

Tabelle 1

GM368 CAGGCCTCTAGAGTACrACTCGTCCTCCTGG
GM397 CAGAAGACCTCCTGTCCTATGAGG
GM398 GAATGGAAATCTGCAGAGGCCTCCGC
Die Ergebnisse sind nachstehend in qualitativer Weise als "+" und "-" angegeben. Dieses Bewertungssystem soll nicht die Absolutmengen der IL-1-Inhibitor-mRNA angeben; vielmehr weisen "+" und "-" unter Berücksichtigung der Grenzen des angewendeten PCR- Verfahrens im wesentlichen auf mehr oder weniger mRNA in den verschiedenen getesteten Materialien hin.
Unter Anwendung des vorstehend beschriebenen PCR-Verfahrens wurde außerdem festgestellt, daß mRNA, die den erfindungsgemäßen IL-1-Inhibitor codiert, in 8 von 13 endometrialen und Ovartumorarten vorhanden ist. Da die mRNA im normalen Ovar oder Endometrium in unwesentlichen Mengen vorkommt, aber in Tumorzellen ähnlichen Ursprungs vorhanden ist, können die IL-1-Inhibitor-Nucleotidsequenzen zur Diagnose von endometrialen und Ovartumoren verwendet werden.
Ferner weist nur eine von 18 normalen Stromazelllinien unter Anwendung der PCR nachweisbare Mengen der IL-1-Inhibitor-mRNA auf
Unter Verwendung der hier beschriebenen Materialien, d. h. des Antikörpers gegen den IL-1-Inhibitor und von Nucleotidsequenzen, die ihn codieren, können diagnostische Verfahren angewendet werden, um die Anwesenheit des Inhibitors als Indikator einer Krankheit nachzuweisen.
Zum Beispiel kann die Anwesenheit des Inhibitors unter Anwendung von Antikörper-Verfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, nachgewiesen und gemessen werden. Ein Verfahren würde einen zweiseitigen immunometrischen Test einschließen, wie er im US-Patent Nr. 4,376,110 beschrieben ist.
Alternativ, da die hier offenbarten IL-1-Inhibitor-Sequenzen in verschiedenen Tumoren und im wesentlichen in sehr geringen Mengen, falls überhaupt, in normalen Zellen transkribiert werden, sind Inhibitor-Nucleotidsequenzen, entweder DNA oder RNA, bei diagnostische Anwendungen nützlich, die den Nachweis von Tumoren erleichtern oder genauere Informationen im Hinblick auf den tumorerzeugenden Zustand einer bestimmten Zelle liefern. Eine spezielle Anwendung wäre die Bestimmung der Kopienzahl des Inhibitorgens, die pro Zelle in verschiedenen Krebsarten vorhanden ist, d. h., ob das Gen amplifiziert ist. Folglich können die hier offenbarten Inhibitor-Nucleotidsequenzen verwendet werden, um den Grad einer Überamplifikation und etablierte diagnostische und prognostische Korrelationen zu messen.
Der Amplifikationsgrad kann gemäß Verfahren bestimmt werden, die auf dem Fachgebiet allgemein bekannt sind. Slamon D. et al., Science 235 (1987), 177; US-Patent Nr. 4,542,092 und US-Patent Nr. 4,699,877; Schimke R., Gene Amplification (1982), Cold Spring Harbor Laboratory. Außerdem können Polymerasekettenreaktionsverfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind und sich auf die vorstehenden beziehen, ebenfalls angewendet werden.
Eine Ausführungsform der Erfindung ist die Verabreichung einer wirksamen Menge des erfindungsgemäßen Cytokininhibitors an Individuen, bei denen ein Risiko für eine Sepsis besteht oder die eine Sepsis entwickelt haben. Ein Beispiel der ersteren Kategorie sind Patienten, die sich einem chirurgischen Eingriff unterziehen. Obwohl die Verabreichungsweise nicht besonders wichtig ist, wird die parenterale Verabreichung infolge des schnellen Fortschreitens einer Sepsis und somit der Notwendigkeit, daß sich der Inhibitor schnell über den Körper verteilen muß, bevorzugt. Folglich ist die bevorzugte Verabreichungsweise die Verabreichung eines i.v.-Bolus, kurz vor, während oder nach dem chirurgischen Eingriff. Die Dosierung des Inhibitors wird normalerweise durch den verordneten Arzt bestimmt. Es ist zu erwarten, daß die Dosierung gemäß dem Alter, Gewicht und der Antwort des einzelnen Patienten variiert. Üblicherweise liegt die Menge des verabreichten Inhibitors pro Dosis im Bereich von etwa 0,1 bis 25 mg/kg Körpergewicht, wobei die bevorzugte Dosis etwa 0,1 bis 10 mg/kg Körpergewicht des Patienten beträgt. Zur parenteralen Verabreichung wird der Inhibitor in einer injizierbaren Form, kombiniert mit einem pharmazeutisch verträglichen, parenteralen Träger formuliert. Solche Träger sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und Beispiele schließen Wasser, Salzlösung, Ringer-Lösung, Dextroselösung und Lösungen, umfassend geringe Mengen des menschlichen Serumalbumins, ein. Der Träger kann geringfügige Mengen von Zusätzen enthalten, die die Isotonie und Stabilität des Inhibitors aufrechterhalten. Die Herstellung solcher Lösungen ist dem Fachmann bekannt. Üblicherweise wird der Cytokininhibitor in solchen Trägern in einer Konzentration von etwa 1-8 mg/ml bis etwa 10 mg/ml formuliert.
Die immunsuppressiven Wirkungen des IL-1-Inhibitors gegen rheumatoide Arthritis kann in einem experimentellen Tiermodellsystem bestimmt werden. Das experimentelle Modellsystem ist eine Adjuvans-induzierte Arthritis bei Ratten, und das Protokoll wird von Holoshitz J. et al., Science 219 (1983), 56, oder von Waksman B. und Wennersten C., Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 23 (1963), 129, beschrieben. Die Herbeiführung der Krankheit kann durch eine einzige Injektion, im allgemeinen intradermal, einer Suspension abgetöteter Zellen von Mycobacterium tuberculosis in CFA verursacht werden. Der Injektionsweg kann variieren, aber Ratten können an der Basis des Schwanzes mit einem Adjuvansgemisch injiziert werden. Der Inhibitor wird in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) in einer Dosis von etwa 1-5 mg/kg verabreicht. Die Kontrolle besteht in der Verabreichung von PBS allein.
Das Verfahren zum Testen der Wirkungen des IL-1-Inhibitors besteht aus der intradermalen Injektion abgetöteter Zellen von M. tuberculosis in CFA, gefolgt von der unmittelbaren Verabreichung des Inhibitors und der anschließenden Behandlung jeden zweiten Tag bis Tag 24. 14, 16, 18, 20, 22 und 24 Tage nach der Injektion von Mycobaterium-CFA kann eine Arthritis-Gesamtbewertung erhalten werden, wie sie von Holoskitz J., vorstehend, beschrieben ist. Eine Analyse der Daten zeigt, daß der Inhibitor eine drastische Wirkung auf die Schwellung der Gelenke hat, wie durch eine Verringerung des Arthritis-Bewertung gemessen wurde.
Obwohl beliebige ähnliche oder äquivalente Verfahren und Materialien bei der Ausführung oder Prüfung der vorliegenden Erfindung an- bzw. verwendet können, werden die bevorzugten Verfahren und Materialien nunmehr beschrieben. Die vorhergehenden Beispiele sind für diese Erfindung illustrativ. Sie sollen den Schutzumfang davon nicht begrenzen.
Die vorliegende Erfindung wurde unter Bezugnahme auf spezifische Ausführungsformen beschrieben. Jedoch ist beabsichtigt, daß diese Anmeldung solche Veränderungen und Substitutionen einschließt, die durch den Fachmann durchgeführt werden können, ohne vom Geist und vom Schutzumfang der beigefügten Patentansprüche abzuweichen.

Claims

1. Isolierte DNA mit einer Nucleotidsequenz, die ein Protein mit Cytokin- Inhibitoraktivität codiert, wobei das Protein die N-terminale Aminosäuresequenz MALETIC hat.

2. DNA nach Anspruch 1 mit einer Aminosäuresequenz, wie sie in Fig. 2 gezeigt ist.

3. DNA nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Cytokin-Inhibitoraktivität IL-1- Inhibitoraktivität ist.

4. Vektor, umfassend eine DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 3.

5. Zelle, die mit einer DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 3 transformiert ist.

6. Protein, das von einer DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 3 codiert wird und Cytokin-Inhibitoraktivität aufweist.

7. Protein nach Anspruch 6, wobei die Cytokin-Inhibitoraktivität gegen IL-1 gerichtet ist.

8. Protein nach Anspruch 6, wobei das Protein die aminoterminale Sequenz mit Met-Ala- Leu-Glu-Thr-Ile-Cys umfaßt.

9. Protein nach einem der Ansprüche 6 bis 8 mit einer Aminosäuresequenz, wie sie in Fig. 2 gezeigt ist.

10. Protein nach einem der Ansprüche 6 bis 9 zur Verwendung in der Behandlung oder Diagnose einer Krankheit.

11. Verwendung eines Proteins nach einem der Ansprüche 6 bis 9 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Diagnose einer Krankheit, die durch Cytokinexpression verursacht wird.

12. Verfahren zur Diagnose einer Krankheit durch Messen der Gegenwart einer ersten Nucleotidsequenz, die ein Protein mit Cytokin-Inhibitoraktivität und einer Aminosäuresequenz, wie sie in Fig. 2 gezeigt ist, codiert, in einem biologischen Material, umfassend die Schritte:

(a) Erzeugung eines Komplexes durch Inkontaktbringen des biologischen Materials mit einer zweiten Nucleotidsequenz, die homolog zu mindestens einem Teil der ersten Nucleotidsequenz ist; und

(b) Nachweis des Komplexes.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei in Schritt (b) der Nachweis durch Polymerasekettenreaktion erfolgt.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei die Krankheit ein endometrialer oder Ovartumor ist.

15. Antikörper mit einer Spezifität für ein Epitop auf einem Cytokininhibitor, wobei das Epitop die ersten sieben Aminosäuren am aminoterminalen Ende einer Aminosäuresequenz umfaßt, wie sie in Fig. 2 gezeigt ist.