DE69033166T2

DE69033166T2 - Vom gtpase-aktivierenden protein (gap) abgeleitete peptide sowie deren diagnostische und therapeutische verwendung

Info

Publication number: DE69033166T2
Application number: DE69033166T
Authority: DE
Inventors: Francis Mccormick; Paul Polakis; Bonnie Rubinfeld; Gail Wong
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1989-08-21
Filing date: 1990-08-20
Publication date: 1999-12-23
Anticipated expiration: 2010-08-21
Also published as: WO1991002749A1; CA2065017A1; EP0491828B1; IL95441A0; ATE181332T1; AU8034694A; DE69033166D1; AU6424790A; EP0491828A1; AU652724B2; JPH05500506A

Description

Mehrere Gene sind identifiziert worden, von denen man annimmt, daß sie bei der Regulation des normalen Zellwachstums eine Rolle spielen. Eine als ras bezeichnete Untergruppe dieser Gene besteht aus mindenstens drei Vertretern, nämlich N-ras, H-ras und K-ras2. Als Oncogene bezeichnete veränderte ras- Formen sind an der Auslösung von Krebs beteiligt. Sowohl die normalen zellulären Gene als auch die Oncogene codieren chemisch verwandte Proteine, die allgemein als ras-p21-Protein bezeichnet werden.
ras-Oncogene und ihre normalen zellulären Gegenstücke verschiedener Arten sind cloniert und sequenziert worden. Ein Vergleich der Struktur dieser beiden Gene hat gezeigt, daß sie sich durch Punktmutationen unterscheiden, die die Aminosäuresequenz des ras-p21-Proteins verändern. In den ras- Oncogenen sind in den Codons 12, 13, 59 und 61 natürlich vorkommende Mutationen identifiziert worden. In vitro-Mutagenese-Arbeiten haben gezeigt, daß auch Mutationen in den Codons 63, 116, 117 und 119 zu einer Transformations-Aktivität führen. Die am häufigsten beobachtete Mutation, die ein normales zelluläres ras-Gen in sein oncogenes Gegenstück umwandelt, ist ein Austausch von Glycin an Position 12 gegen einen beliebigen anderen Aminosäurerest, mit Ausnahme von Prolin. Eine Transformations-Aktivität wird auch beobachtet, wenn Glycin deletiert wird oder wenn Aminosäuren zwischen dem Alanin-Rest an Position 11 und dem Glycin-Rest an Position 12 insertiert werden.
Bei der Erzeugung von ras-p21-Protein-Oncogenen spielen auch Mutationen an Position 61 eine wichtige Rolle. Ein Austausch von Glutamin gegen eine beliebige andere Aminosäure mit Ausnahme von Prolin oder Glutaminsäure im zellulären ras-Gen führt zu ras-Oncogenen mit Transformations-Aktivität.
Gegenüber normalen zellulären ras-Genen und ihren oncogenen Gegenstücken gibt es mindestens vier bekannte retrovirale ras-Oncogene, die Transformations-Aktivität zeigen. Im Gegensatz zu ihren nicht-retroviralen Analogen zeigen die retroviralen Gene zwei Mutationen. Die biologische Signifikanz dieser beiden Mutationen ist derzeit unklar.
Ungeachtet ihrer phylogenetischen Herkunft binden sowohl normale ras- p21-Proteine als auch oncogene ras-p21-Proteine die Guanin-Nucleotide GTP und GDP und besitzen eine immanente GTPase-Aktivität (vgl. Temeles et al., Nature, 313 (1985), 700). Die Signifikanz dieser biochemischen Eigenschaften für die biologischen Aktivitäten der ras-p21-Proteine hat sich wie folgt gezeigt. Erstens führt die Mikroinjektion von gegen ras-p21 gerichteten Antikörpern, die der Bindung von Guanin-Nucleotiden entgegenwirken, zu einer Reversion des malignen Phänotyps von durch ras-Oncogene transformierten NIH-3T3-Zellen (vgl. Clark et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 (1985), 5280, und Feramisco et al., Nature, 314 (1985), 639). Zweitens werden NIH-3T3-Zellen nicht durch oncogene ras-Proteine transformiert, die Mutationen zeigen, die dazu führen, daß p21 keine Guanin-Nucleotide binden kann (Willumsen et al., Mol. Cell. Biol., 6 (1986), 2646). Drittens erzeugen einige ras-Oncogene p21-Proteine, die im Vergleich zu ihren normalen zellulären Gegenstücken eine stark verminderte GTPase-Aktivität aufweisen.
Vor kurzem ist ein cytoplasmatischer Faktor identifiziert worden, der die GTPase-Aktivität von normalem ras-p21 stimuliert, die mit den oncogenen Mutanten assoziierte GTPase-Aktivität jedoch nicht beeinflußt (vgl. M. Trahey und F. McCormick, Science, 238 (1987), 542). Die Aktivität ist mit einem Protein in Zusammenhang gebracht worden, das als GAP bezeichnet wird, was das Akronym für GTPase-aktivierendes Protein ist. Man geht davon aus, daß GAP ein cytoplasmatisches Protein ist, das jedoch vermutlich aus dem Cytosol in die Plasma-Membran transportiert werden kann, wo es mit p21 in Wechselwirkung tritt.
M. S. Marshall et al., EMBO J., 8 (4) (1989), 1105-1110, offenbaren ein Polypeptid, das die 343 terminalen Aminosäuren von GAP umfaßt, die das ras- p21-Protein binden können.
Wie vorstehend angedeutet, sind ras-Oncogene an der Entwicklung verschiedener Tumore beteiligt, wobei sich gezeigt hat, daß sie an etwa 10%- 40% der häufigsten Formen von menschlichem Krebs beteiligt sind (vgl. H. Varmus, Annual Rev. Genetics, 18 (1984), 553, und M. Barbacid, in: Important Advances in Oncology (Herausgeber B. DeVita, S. Helman, S. Rosenberg) (1986), S. 3-22, Lippincott, Philadelphia). Beispielsweise sind ras-Oncogene durchweg in Carcinomen von Blase, Dickdarm, Niere, Leber, Lunge, Eierstock, Bauchspeicheldrüse und Magen identifiziert worden. Sie sind auch sowohl in Blutzell-Tumoren der Lymphoidzell- und Myeloidzell-Ahnenreihe als auch in Tumoren mesenchymalen Ursprungs identifiziert worden. Darüberhinaus hat sich auch gezeigt, daß Melanome, Teratocarcinome, Neuroblastome und Gliome ras-Oncogene besitzen.
In Anbetracht des möglichen Zusammenhangs zwischen ras-Oncogenen und Krebs sind umfangreiche Arbeiten durchgeführt worden, die sich auf diagnostische Tests zum Nachweis des Vorkommens des Oncogen-Produkts p21 oder der Mutanten-Oncogene konzentriert haben. Bei frühen Tests, die noch in vielen Fällen eingesetzt werden, wird das Vorkommen von ras-Oncogenen anhand von Transfektionstests bestimmt, wobei p21 aufgrund seiner Fähigkeit zur Transformation von NIH 3T3-Zellen identifiziert wird (vgl. Lane et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78 (1981), 5185, sowie B. Shilo und R. A. Weinberg, Nature, 289 (1981), 607). Dieses Verfahren ist unempfindlich und mühsam und ausgebildete technische Laborkräfte sind erforderlich, um es angemessen durchzuführen.
Ein zweites diagnostisches Verfahren konzentriert sich auf Oligonucleotid- Sonden zur Identifizierung einzelner Punktmutationen in genomischer DNA. Dieses Verfahren basiert auf der Beobachtung, daß Hybride von Oligonucleotiden, die mit genomischen Sequenzen, d. h. nicht-mutierten genomischen Sequenzen, perfekt übereinstimmen, stabiler sind als Hybride, die eine einzelne Basenfehlpaarung enthalten. Ein Beispiel für letzteres ist eine mit den ras-Oncogenen im Zusammenhang stehende Punktmutation in p21. Obwohl dieses Verfahren eindeutig empfindlicher und leichter durchzuführen ist als der Transfektionstest, ist trotzdem auch seine Durchführung beschwerlich. Das liegt daran, daß es theoretisch fast 100 Basenaustausche gibt, die zu ras-Oncogenen führen können. Um diese Austausche nachweisen zu können, müssen daher mehrere Oligonucleotid- Sonden eingesetzt werden, die jeden der drei möglichen Austausche an einem speziellen Rest enthalten (vgl. Bos et al., Nature, 315 (1985), 726, und Valenzuela et al., Nuc. Acid Res., 14 (1986), 843).
Neben den Transfektions- und Oligonucleotid-Tests sind weitere Nucleinsäure-Hybridisierungsverfahren zur Identifizierung von ras- Oncogenen entwickelt worden. Eines dieser Verfahren basiert auf der ungewöhnlichen elektrophoretischen Wanderung von Einzelbasen- Fehlpaarungen enthaltenden DNA-Heteroduplex-Molekülen in denaturierenden Gradientengelen (vgl. Myers et al., Nature, 313 (1985), 495). Mit Hilfe dieses Verfahrens werden nur etwa 25%-40% aller Basenaustausche, die möglich sind, nachgewiesen und zur Herstellung der denaturierenden Gradientengele sind ausgebildete technische Laborkräfte erforderlich. Empfindlichere Verfahren, die Verbesserungen dieses Verfahrens darstellen, sind von Winter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 (1985), 7575, und Myers et al., Science, 230 (1985), 1242, beschrieben.
Zum Nachweis des Produkts der ras-Oncogene sind immunologische Verfahrensweisen angewendet worden. Gegen intaktes oncogenes ras-p21 oder gegen chemisch synthetisierte Peptide, die ähnliche Sequenzen wie oncogenes p21 oder das nicht-transformierende Gegenstück aufweisen, sind polyclonale oder monoclonale Antikörper erzeugt worden (vgl. die Veröffentlichung des Cline et al. erteilten EP-Patents 108,564; Tamura et al., Cell, 34 (1983), 587; die PCT-Anmeldung WO/84/01389 von Weinberg et al.). Als diagnostische Mittel zur Identifizierung von oncogenem ras-p21 in menschlichen Gewebeschnitten sind Antikörper größtenteils eine Enttäuschung gewesen. Das liegt daran, daß entweder die bis heute erzeugten Antikörper sowohl das normale zelluläre ras- p21-Protein als auch das oncogene Protein erkennen, oder daß in den Fällen, wo ein monoclonaler Antikörper erzeugt worden ist, der spezifisch das oncogene Protein erkennt, immer noch eine unspezifische Anfärbung von Tumorbiopsien zu beobachten ist.
Obwohl oncogenes ras-p21 ein wirksames tumorbildendes Mittel ist, haben neuere Untersuchungen gezeigt, daß auch normales ras-p21 den malignen Phänotyp induzieren kann (vgl. Chang et al., Nature, 297 (1982), 7479, und Pulciani et al., Mol. Cell. Biol., 5 (1985), 2836). Es hat sich beispielsweise gezeigt, daß eine Transfektion normaler H-ras-DNA eine maligne Transformation induziert. Weiter ist erwähnenswert, daß bei mehreren menschlichen Tumoren eine Amplifikation des normalen ras-Gens beobachtet worden ist, wobei die Häufigkeit davon offensichtlich etwa 1% beträgt (Pulciani et al., vorstehend; Yokota et al., Science, 231 (1986), 261). Die verschiedenen zum Nachweis von ras-Oncogenen oder oncogenem p21 verwendeten diagnostischen Tests sind mit ähnlich beschränktem Erfolg auf den Nachweis von normalem ras-p21 angewendet worden.
Aus den vorangegangenen Erläuterungen sollte klar sein, daß, obwohl es eine Reihe diagnostischer Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens von ras- Oncogenen oder ihrer transformierenden Proteine gibt, noch immer ein Bedarf an schnellen und verläßlichen diagnostischen Verfahren besteht, die eine routinemäßige Identifizierung verschiedenster mit ras im Zusammenhang stehender Tumore gestatten.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Peptid, das an ein ras-p21-Protein oder einen ras-p21-GTP-Komplex bindet und die ras-p21- GTPase-Aktivität oder die GAP-stimulierte ras-p21-GTPase-Aktivität hemmt, umfassend eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus: Met-Arg-Thr-Arg-Val- Val-Ser-Gly-Phe-Val-Phe-Leu-Arg-Leu-Ile-Cys oder Thr-Met-Arg-Thr-Arg- Val-Val-Ser-Gly-Phe-Val-Phe-Leu-Arg-Leu-Ile-Cys, ein Fragment des Peptids oder ein Peptid oder Fragment mit einer ausreichenden Ähnlichkeit der Aminosäuresequenz bereit, das die vorstehend genannten Bindungs- und Hemm-Aktivitäten beibehält.
Die erfindungsgemäßen Peptide oder Fragmente eignen sich als diagnostische Mittel für Carcinome, die eine Überexpression von normalem oder oncogenem ras-p21-Protein zeigen. Die Peptide sind diagnostisch und therapeutisch nützliche Peptide, die die GTP-Hydrolyse durch ein ras-p21- Protein sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von GAP hemmen. Die Peptide vermitteln auch die Abspaltung von GDP vom ras-p21-GDP-Komplex.
Das Peptid besitzt vorzugsweise ein Molekulargewicht von weniger als 35 000 D. Das Peptid vermittelt vorzugsweise auch die Abspaltung von GDP vom ras-p21-GDP-Komplex, vermittelt jedoch nicht die Abspaltung des GTP-Analogs GTPγS vom ras-p21-GTPγS-Komplex.
Bevorzugte erfindungsgemäße Peptide bestehen aus einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe von:
(a) Met-Arg-Thr-Arg-Val-Val-Ser-Gly-Phe-Val-Phe-Leu-Arg-Leu-Ile- Cys; und
(b) Thr-Met-Arg-Thr-Arg-Val-Val-Ser-Gly-Phe-Val-Phe-Leu-Arg-Leu- Ile-Cys.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Testen auf ein ras-p21-Protein bereit, umfassend den Nachweis eines ras-p21-Proteins, das an ein vorstehend definiertes Peptid gebunden ist.
Die Erfindung stellt weiter ein Verfahren zum Testen auf ein ras-p21- Protein in einer Probe bereit, umfassend die folgenden Schritte:
(a) Inkontaktbringen der Probe mit einem vorstehend definierten Peptid, so daß das Peptid mit einem ras-p21-Protein einen Komplex bildet; und
(b) Nachweis des Komplexes, gegebenenfalls durch Markierung des ras- p21-Proteins mit radioaktivem GTP, und Nachweis von GTP.
Außerdem stellt die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens oder der Konzentration von ras-p21 in einer Probe bereit, umfassend die folgenden Schritte:
(a) Markierung eines ras-p21-GTP-Komplexes;
(b) Bildung eines Konjugats durch Inkontaktbringen des markierten ras-p21-GTP-Komplexes mit einem vorstehend definierten Peptid; und
(c) Nachweis des erhaltenen Konjugats oder seiner Konzentration.
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist ein Antikörper gegen ein vorstehend definiertes Peptid.
Die Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zum Testen auf ras-p21 in einer Probe, umfassend die folgenden Schritte:
(a) Inkontaktbringen der Probe mit einem vorstehend definierten Peptid zur Bildung eines ersten Konjugats von ras-p21 und dem Peptid;
(b) Inkontaktbringen des ersten Konjugats mit einem Antikörper gegen das Peptid zur Bildung eines zweiten Konjugats; und
(c) Nachweis des zweiten Konjugats.
Die vorstehenden Verfahren zum Testen auf das ras-p21-Protein unter Verwendung der Peptide oder Antikörper sind zur Diagnose von Krebs geeignet.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein vorstehend definiertes Peptid oder ein vorstehend definierter Antikörper zur prophylaktischen, therapeutischen oder diagnostischen Verwendung.
Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines vorstehend definierten Peptids oder Antikörpers für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Tumorbelastung oder von Krebs bereit. Vorzugsweise ist das Medikament zur parenteralen Verabreichung geeignet und/oder das Peptid ist an einen Liganden gebunden, der durch ein ras-Oncogen transformierte Zellen erkennt.
Ein fünfter Aspekt der Erfindung ist die Bereitstellung von entweder:
(a) einem Peptid, das ein Fragment eines GAP-Proteins umfaßt, das an ein ras- p21-Protein, einen ras-p21-GTP-Komplex oder einen ras-p21-GDP-Komplex binden kann, wobei das Peptid die Formel Met-Arg-Thr-Arg-Val-Val-Ser-Gly- Phe-Val-Phe-Leu-Arg-Leu-Ile-Cys oder Thr-Met-Arg-Thr-Arg-Val-Val-Ser- Gly-Phe-Val-Phe-Leu-Arg-Leu-Ile-Cys umfaßt, oder
(b) einem Peptid, das mit GAP oder einem GAP-Proteinfragment um die Bindung an ein ras-p21-Protein, einen ras-p21-GTP-Komplex oder einen ras- p21-GDP-Komplex konkurrieren kann, wobei das Peptid die Formel Met-Arg- Thr-Arg-Val-Val-Ser-Gly-Phe-Val-Phe-Leu-Arg-Leu-Ile-Cys oder Thr-Met- Arg-Thr-Arg-Val-Val-Ser-Gly-Phe-Val-Phe-Leu-Arg-Leu-Ile-Cys umfaßt, zur Herstellung eines Medikamentes gegen eine Tumorbelastung oder Krebs, wobei das Medikament gegebenenfalls parenteral verabreicht wird.
Vorzugsweise ist das Peptid an einen Liganden gebunden, der durch ein ras-Oncogen transformierte Zellen erkennt.
Fig. 1 zeigt das Elutionsprofil von einer TSK-Phenyl-Säule und die Silberfärbung von SDS-PAGE-Fraktionen davon.
Fig. 2 zeigt das SDS-Gel-Profil von GAP, das mittels eines drei Schritte umfassenden Chromatographie-Verfahrens aufgereinigt wurde, das aus einer Kationen- und Anionenaustausch-Chromatographie und anschließend einem zweiten Kationenaustausch-Chromatographie-Schritt bestand.
Fig. 3 zeigt die GAP-Aminosäuresequenz, die zur Erzeugung von DNA- Sonden verwendet wurde, die zur Identifizierung des Lambda-gt11-Clons GAP 6 verwendet wurden. Auch die entsprechende codierende DNA-Sequenz mit der möglichen Codon-Redundanz ist gezeigt.
Fig. 4 zeigt die zur Identifizierung von GAP 6 verwendeten DNA-Sonden.
Fig. 5 stellt die DNA-Sequenz und Aminosäuresequenz eines Lambda-Clons, des Clons 101, dar.
Fig. 6 stellt die DNA-Sequenz der Lambda-Clone 16 und 101 dar.
Fig. 7 zeigt das Ergebnis von GAP-Tests, die in Gegenwart von Lysaten durchgeführt wurden, die aus Lambda-Lysogenen des Clons 7 (Abbildung A oben, oberer Teil) und des Clons 101 (Abbildung A oben, unterer Teil) und aus mit pAcC12 GAP 5 transfizierten Sf9-Zellysaten (Abbildung B unten) hergestellt worden waren.
Fig. 8 zeigt die Konstruktion von pAcC12.
Fig. 9 stellt die DNA-Sequenz und die Aminosäuresequenz des Lambda- Clons 101 dar, wobei die DNA- und Aminosäureabschnitte gekennzeichnet sind, die den Sequenzen der folgenden Peptide G65, G73, cGAP 13 und Peptid 891 entsprechen.
In Fig. 10 sind die Positionen der Peptide G65, G73, cGAP 13 und 891 gekennzeichnet, wobei das gleiche Aminosäure-Numerierungssystem wie in den Fig. 5 und 9 verwendet wird.
Fig. 11 zeigt das Elutionsprofil von cGAP 13 von einer Vydac-C4-PrepPAK- Säule.
Fig. 12 zeigt die Aminosäureanalyse von cGAP 13.
Fig. 13 stellt eine Massenspektrometer-Analyse von cGAP 13 dar.
Fig. 14 zeigt graphische Darstellungen, die das Vorliegen eines radioaktiven p21-GTP-Komplexes zeigen und welche Wirkung die Peptide G65, G73 und das Peptid 891 daher auf die p21-Hydrolyse von GTP in Gegenwart und Abwesenheit von GAP ausüben.
Fig. 15 stellt Stabdiagramme dar, die das Verhältnis der Anzahl radioaktiver GDP-Impulse zu der von GTP bei Experimenten zeigen, die G65, cGAP 13 und Peptid 891 in Gegenwart und Abwesenheit von GAP umfassen.
Fig. 16 stellt das Ergebnis von Experimenten dar, die zeigen, daß Peptid 891 die Abspaltung von GDP vom ras-p21-GDP-Komplex bewirkt.
Fig. 17 stellt das Ergebnis von Experimenten dar, die zeigen, daß Peptid 891 keine Abspaltung von GTPγS vom ras-p21-GTPγS-Komplex bewirkt.
Die vorliegende Erfindung beschreibt Peptide, die an ein ras-p21-Protein, einen ras-p21-GDP-Komplex oder einen ras-p21-GTP-Komplex binden. Die Erfindung beschreibt ferner die Antikörper gegen diese Peptide. Die Peptide und ihre Antikörper und davon stammende Fragmente sind zur Diagnose von Krebs geeignet, wobei sie besonders zur Diagnose von Carcinomen geeignet sind, die eine Überexpression von normalem oder oncogenem ras-p21-Protein zeigen. Weiter lassen sich die Peptide und ihre Fragmente allein oder in Liganden-konjugierter Form zur Krebstherapie einsetzen. Die Verfügbarkeit von GAP-Sequenzen erleichtert die Identifizierung und Isolierung der erfindungsgemäßen Peptide. Da die Erzeugung solcher Peptidsequenzen auf der Kenntnis der Aminosäuresequenz von menschlichem GAP oder GAP- artigen Proteinen basierte, ist die Reihenfolge der Diskussion der Erfindung wie folgt: Aufreinigung von GAP, Verfahren zum Testen von GAP, die partielle Aminosäuresequenz von GAP, Clonierung von GAP unter Verwendung von GAP-Sonden auf der Basis der Aminosäuresequenz und Identifizierung von GAP-DNA-Sequenzen in einer cDNA-Genbank in Verbindung mit der Subclonierung der Sequenzen, Synthese von GAP-Peptidfragmenten, Identifizierung der GAP-Peptidfragmente, die die GTP-Hydrolyse durch ras-p21 oder ras-p21-Guaninnucleotid-Komplexe hemmen, Testen solcher Peptide auf ihre Fähigkeit zur Vermittlung der Abspaltung von GDP von einem ras-p21- GTP-Komplex und einem ras-p21-GTPγS-Komplex, Verwendung solcher Peptide zum Testen eines ras-p21-Proteins, Synthese von Antikörpern gegen die Peptide, Verwendung solcher Antikörper zum Testen eines p21-Proteins und Verwendung der Peptide oder Peptidfragmente, entweder allein oder an Liganden gebunden, zur Krebstherapie.
Durch die kurze Beschreibung einiger der in der Erfindung verwendeten Materialien und Verfahren wird ein besseres Verständnis der in dem vorliegenden Text beschriebenen Erfindung erreicht.
Das normale zelluläre ras-Gen und seine oncogenen Gegenstücke sind so definiert, wie von N. Barbacid, Ann. Rev. Biochem., 56 (1987), 779, beschrieben. Ebenso sind auch die von diesen Genen codierten Proteine so definiert, wie von Barbacid beschrieben. Die Definition eines ras-p21-Proteins soll außerdem Fragmente von normalem zellulärem p21 umfassen, die GTP binden und eine GAP-stimulierte GTPase-Aktivität zeigen.
GAP ist das Akronym für Guanintriphosphatase-aktivierendes Protein, wobei es sich um ein Protein handelt, das das im vorliegenden Text beschriebene Molekulargewicht und die im vorliegenden Text beschriebene Aminosäuresequenz aufweist und weiterhin die Eigenschaften besitzt, die GTPase-Aktivität von normalem zellulärem ras-p21-Protein zu stimulieren, während es in Kombination mit oncogenen ras-p21-Proteinen und GTP eine geringe oder keine stimulierende Aktivität aufweist. Der Fachmann weiß natürlich, daß unter bestimmten Bedingungen GAP auch in Form von Aggregaten oder Multimeren vorkommen kann, wobei diese Formen zum Definitionsbereich gehören sollen. Außerdem soll die Definition ferner Fragmente von GAP erfassen, die eine Aktivität zeigen. Ein Beispiel für ein solches Fragment ist ein Molekül, das ein verringertes Untereinheiten- Molekulargewicht von etwa 35 000 aufweist, wie in der vorliegenden Beschreibung gezeigt.
Die im vorliegenden Text beschriebene Erfindung umfaßt synthetisch oder mittels Rekombinationstechniken hergestellte Peptide, die an ein ras-p21- Protein, einen ras-p21-GDP-Komplex oder einen ras-p21-GTP-Komplex binden können. Diese Peptide nehmen die folgenden Formen an. Die erste Form ist strukturell einem GAP-Fragment ähnlich. Die zweite Form konkurriert mit der vorstehenden Form um die Bindung an ein ras-p21-Protein, einen ras-p21- GDP-Komplex oder einen ras-p21-GTP-Komplex. Eine dritte Form bindet an die gleiche Stelle wie die erste. Die vorliegende Erfindung umfaßt ferner sowohl polyclonale als auch monoclonale Antikörper, die für die vorstehenden Peptide spezifisch sind, ebenso wie Verfahren zum Testen eines ras-p21-Proteins unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Peptide oder Antikörper.
Im Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen Peptiden kann die genaue chemische Struktur des GAP-Moleküls und der synthetischen Peptide bekanntlich von einer Reihe von Faktoren abhängen. Da Peptide ionisierbare Amino- und Carboxyl-Gruppen enthalten, ist natürlich klar, daß die Peptide in Form von Säure- oder Basensalzen oder in neutraler Form erhalten werden können. Weiter ist klar, daß die Aminosäure-Primärsequenz durch eine Derivatbildung unter Verwendung von Zucker-Molekülen (Glycosylierung) oder durch andere chemische Derivatbildungs-Typen vergrößert werden kann, die eine kovalente oder ionische Verknüpfung der Peptide beispielsweise mit Lipiden, Phosphat-Gruppen, Acetyl-Gruppen und dergleichen umfassen, wobei dies häufig durch eine Verbindung mit Sacchariden erfolgt. Diese Modifikationen können in vitro oder in vivo erfolgen, wobei letzteres durch eine Wirtszelle durch post-translationale Prozessierungssysteme erfolgt. Selbstverständlich soll die Definition der Peptide solche Modifikationen umfassen, gleichgültig, wie sie erfolgen, sofern die in der vorliegenden Beschreibung definierten Peptid-Aktivitäten nicht signifikant verändert werden.
Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Begriff "ras-p21-GTP- Komplex" ist als der an GTP gebundene Zustand eines ras-p21-Proteins definiert.
Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Begriff "ras-p21-GDP- Komplex" ist als der an GDP gebundene Zustand eines ras-p21-Proteins definiert.
Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Begriff "ras-p21- Guaninnucleotid-Komplex" ist als der an ein Guaninnucleotid gebundene Zustand eines ras-p21-Proteins definiert.
Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Begriff "Chromatographie" ist so definiert, daß dieser das Auftragen einer ein Gemisch von Verbindungen enthaltenden Lösung auf ein Adsorptionsmittel oder ein anderes Trägermaterial umfaßt, das meistens mit einem Gradienten oder einer anderen Reihe von Elutionsmitteln eluiert wird. Von der Trägermatrix eluiertes Material wird als Eluat bezeichnet. Die schrittweise Elution wird routinemäßig so durchgeführt, daß man die Trägermatrix in eine Säule einbringt und entweder schrittweise oder vorzugsweise mittels eines Gradienten (eine) Lösung(en) über die Matrix laufen läßt, wodurch die Affinität zur Trägermatrix verändert wird. Bekanntlich umfaßt die Definition von "Chromatographie" das Einfüllen der Trägermatrix in einen Filter und die schrittweise oder chargenweise Passage eines Elutionsmittels durch das Filter.
Der Ausdruck "Matrix für hydrophobe Wechselwirkungen" ist so definiert, daß damit ein Adsorptionsmittel gemeint ist, das ein hydrophober Feststoff wie Polystyrolharzperlen, Gummi; ein Siliciumdioxid-beschichtetes Kieselgel oder vernetzte Agarose ist, die ausreichend mit hydrophoben funktionellen Gruppen substituiert ist, die die Hydrophobizität des Materials bewirken. Typische hydrophobe Materialien sind mit Alkyl-Resten substituierte Agarose und mit Aryl-Resten substituierte Agarose, wie beispielsweise Phenyl- oder Octyl-Agarose. Materialgemische, die auf einer Chromatographie-Matrix für hydrophobe Wechselwirkungen chromatographisch getrennt werden, werden im allgemeinen zuerst in einer Lösung hohen Salzgehalts an der Matrix adsorbiert und anschließend mittels einer Elution in einer Lösung niedrigen Salzgehalts oder in einem hydrophoben Lösungsmittel, wie Polyol, von der Matrix desorbiert.
"Anionenaustauscher-Matrix" ist so definiert, daß damit eine feste oder Gel- Trägermatrix gemeint ist, die in wäßrigen Lösungen eine Ladung aufweist. Die Trägermatrix kann Agarose sein, die ausreichend mit funktionellen Amin- Gruppen substituiert ist, so daß sie in wäßrigen Lösungen eine Netto-Ladung aufweist. Das zu adsorbierende Material wird im allgemeinen in einer Lösung niedrigen Salzgehalts an eine Anionenaustauscher-Matrix gebunden und wird im allgemeinen von der Anionenaustauscher-Matrix in einem Elutionsmittel hohen Salzgehalts eluiert, das Anionen wie das Chlorid-Ion enthält, die an die Anionenaustauscher-Matrix binden und das adsorbierte Material verdrängen.
Mit dem Ausdruck "Bedingungen hoher Salzkonzentration" ist eine wäßrige Lösung gemeint, in der eine ionische Substanz vorhanden ist und Bedingungen hoher Ionenstärke erzeugt. Ionenstärke ist so definiert, wie allgemein auf dem Fachgebiet anerkannt, und kann anhand der angenommenen Konzentrationen der verschiedenen in die Lösung gegebenen Ionen, modifiziert durch deren Aktivitäts-Koeffizienten, berechnet werden. Typische Beispiele für routinemäßig eingesetzte hohe Salzkonzentrationen sind hohe Ammoniumsulfat-Konzentrationen enthaltende Lösungen. Jedoch können auch andere Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Natriumsulfat, Natriumnitrat oder Natriumphosphat, eingesetzt werden.
Die Definition von "Affinitäts-Chromatographie" ist selbstverständlich der von Wilchek et al., Methods in Enzymology, 104 (1984), 3, ähnlich. In der weitesten Auslegung ihrer Definition soll "Affinitäts-Chromatographie" ein "auf biologischem Erkennen basierendes Aufreinigungsverfahren" bedeuten. Kurz gesagt, umfaßt das Verfahren das Koppeln eines Liganden an einen festen Träger und das Inkontaktbringen des Liganden mit einer Lösung, die ein den Liganden erkennendes Molekül enthält, das an den Liganden bindet. Anschließend wird das den Liganden erkennende Molekül vom Liganden freigesetzt und in reiner Form isoliert. Selbstverständlich können bei einer Affinitäts-Chromatographie verschiedene Liganden eingesetzt werden, wie von Wilchek et al. diskutiert, und Beispiele davon umfassen Lectine, Antikörper, rezeptorbindende Proteine und Aminosäuren.
Die verwendeten Begriffe "Zellen" und "rekombinanter Wirt" oder "Wirtszellen" lassen sich oft untereinander austauschen, wie aus dem Kontext deutlich wird. Diese Begriffe umfassen die direkt bei einem Versuch eingesetzte Zelle und natürlich die Nachkommenschaft davon. Aufgrund von zufälligen Mutationen oder Unterschieden in der Umwelt ist natürlich nicht die gesamte Nachkommenschaft genau identisch mit der Elternzelle. Bei Verwendung der vorstehenden Begriffe wird jedoch eine solche veränderte Nachkommenschaft einbezogen.
Die folgenden Erläuterungen betreffen die erfindungsgemäßen Antikörper.
Das in der vorliegenden Beschreibung verwendete Wort "Antikörper" bedeutet sowohl polyclonale als auch monoclonale Antikörper. Außerdem umfaßt der Begriff sowohl ein ganzes Immunglobulin als auch Antigenbindende Fragmente davon. Die polyclonalen Antikörper können erzeugt werden, indem das Peptid oder ein Peptidfragment einem Wirtstier, wie Kaninchen, Ratte, Ziege, Maus, usw., injiziert wird. Aus dem Wirtstier werden die Seren extrahiert und zum Erhalt von polyclonalen Antikörpern durchmustert, die für das Peptid-Immunogen spezifisch sind. Die monoclonalen Antikörper können beispielsweise durch Immunisierung von Mäusen mit dem vorstehend erwähnten Peptid erzeugt werden. Die Mäuse werden mit einer immunogenen Menge des Peptids intraperitoneal geimpft und erhalten dann Auffrischungsdosen mit ähnlichen Mengen des immunogenen Peptids. Wenige Tage nach der letzten Auffrischungsdosis wird aus den immunisierten Mäusen die Milz gewonnen und daraus wird eine Zellsuspension zur Verwendung bei der Fusion hergestellt.
Unter Verwendung des allgemeinen Verfahrens zur Hybridisierung somatischer Zellen von Köhler, B. und Milstein, C., Nature, 256 (1975), 495-497, können aus den Splenocyten und Maus-Tumorzellen Hybridome hergestellt werden. Bei der Hybridisierung können verfügbare Maus-Myelom-Linien, wie die vom Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, Kalifornien, USA, verwendet werden. Im wesentlichen umfaßt das Verfahren die Fusion der Tumorzellen und Splenocyten unter Verwendung eines die Fusion bewirkenden Mittels, wie Polyethylenglykol. Nach der Fusion werden die Zellen vom Fusionsmedium getrennt und zum Ausschluß nicht-hybridisierter Elternzellen in einem selektiven Zuchtmedium, wie HAT-Medium, gezüchtet. Die Hybridome können auf Wunsch vermehrt werden und Überstände können mittels herkömmlicher Immuntest-Verfahren (z. B. Radioimmuntest, Enzymimmuntest oder Fluoreszenz-Immuntest) unter Verwendung des Immunisierungsmittels als Antigen getestet werden. Positive Clone können weiter charakterisiert werden, um zu bestimmen, ob sie die Kriterien der erfindungsgemäßen Antikörper erfüllen.
Hybridome, die solche Antikörper produzieren, können, unter Verwendung bekannter Verfahren in vitro oder in vivo gezüchtet werden. Auf Wunsch können die monoclonalen Antikörper, je nachdem aus Zuchtmedien oder Körperflüssigkeiten, mit Hilfe herkömmlicher Immunglobulin- Aufreinigungsverfahren, wie Ammoniumsulfat-Präzipitation, Gelelektrophorese, Dialyse, Chromatographie und Ultrafiltration, isoliert werden.
Bei Verwendung einer ausreichend hohen Konzentration affinitätsgereinigter Antikörper kann die Bindung der Antikörper an das Protein erhöht werden. Die Affinitätsreinigung ist ein auf dem Fachgebiet wohlbekanntes Verfahren, wobei das Antigen-Peptid an einen Träger gebunden wird, der sich von dem zur Immunisierung verwendeten unterscheidet, und wobei man die Antikörper über den Träger laufen läßt, so daß sie aufgereinigt werden.

GAP-Aufreinigung

Guanosintriphosphatase-aktivierendes Protein oder GAP wird allgemein in höheren Eukaryonten exprimiert. GAP ist in Zellextrakten normaler Gewebe von Mensch und Maus einschließlich Gehirn, Leber, Placenta, B-Zellen und Blutplättchen, nachgewiesen worden. Außerdem ist es sowohl in nichttransformierten Zellkulturen einschließlich NIH 3T3 als auch in transformierten Zell-Linien einschließlich menschlicher Brustdrüsenkrebs- Zellen (MCF-7), Retinoblastomzellen (Y79) und Wilms-Tumor-Zellen (G401) gefunden worden. GAP ist auch in Insektenzellen, wie beispielsweise von Spodoptera frugiperda, vorhanden. GAP kann aus vielen dieser Zellen oder Geweben isoliert werden, wenn auch mit kleinen Veränderungen in der Aufreinigungs-Vorgehensweise und dergleichen.
Das allgemeine Verfahren zur Isolierung und Aufreinigung von GAP besteht aus der Freisetzung des Moleküls aus dem Cytoplasma geeigneter Zellen, Gewebe oder Organe, einer anschließenden Entfernung von unlöslichem Material und der Durchführung einer Kationenaustausch-Chromatographie mit der löslichen GAP-Fraktion, der sich ein zweiter Chromatographie-Schritt anschließt, wobei man das Elutionsmittel vom Kationenaustauscher über einen Anionenaustauscher laufen läßt. GAP wird vom Anionenaustauscher eluiert und weiter aufgereinigt, indem es einem dritten Chromatographie-Schritt unterworfen wird, entweder einer auf hydrophoben Wechselwirkungen basierenden Chromatographie oder einem zweiten Kationenaustausch-Schritt.
Insbesondere wird GAP durch Freisetzung des Moleküls aus dem Cytosol unter Verwendung einer Reihe von Verfahren einschließlich Auftauen, Ultraschallbehandlung, Extraktion mit einem schonenden Detergens, usw., präpariert. Dieses Verfahren wird vorzugsweise in einer physiologisch gepufferten Lösung durchgeführt, die einen oder mehrere Protease- Inhibitor(en) enthält. Zur weiteren Hemmung der Aktivität von Proteasen, insbesondere solcher Proteasen, deren Aktivität auf Metall-Ionen basiert, kann die Extraktionslösung außerdem Mittel enthalten, die mit Metall-Ionen Chelate bilden. Die bevorzugte Extraktionslösung ist eine physiologisch ausgewogene Salzlösung, die die Chelatbildner Ethylenglykoltetraessigsäure (EGTA) oder Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) sowie den Protease-Inhibitor Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) enthält. Sowohl das/die mit Metall-Ionen Chelate bildende (n) Mittel als auch der/die Protease-Inhibitor(en) liegen in Konzentrationen vor, die eine Proteolyse effektiv hemmen, vorzugsweise bei etwa 5 mM bzw. bei 100 uM. Wie der Fachmann jedoch natürlich weiß, schwanken die Konzentrationen, in denen die Protease-Inhibitoren oder Chelatbildner verwendet werden, wenn sie tatsächlich überhaupt verwendet werden, da sich die Typen und Mengen der Proteasen je nach dem zur GAP- Extraktion verwendeten Ausgangsmaterial unterscheiden.
Zur Entfernung von unlöslichem Material aus der wäßrigen Cytosol- Fraktion wird das GAP enthaltende Gemisch mittels Zentrifugation oder auf andere Weise geklärt. Wenn die Cytosol-Fraktion geringe Mengen von GAP enthält, kann es mit Hilfe eines von mehreren dem Fachmann wohlbekannten Verfahren einschließlich einer Präzipitation mit hohen Salzkonzentrationen, wie beispielsweise mit Ammoniumsulfat, oder Ultrafiltration konzentriert werden. Wenn GAP mittels Präzipitation konzentriert wird, wird es vorzugsweise anschließend in einer geeigneten physiologisch ausgewogenen Salzlösung resuspendiert, die (einen) Protease-Inhibitor(en) und vorzugsweise etwa 0,1% eines nicht-ionischen Detergens, wie NP40 enthält. Diese Lösung wird danach für eine Ionenaustausch-Chromatographie zubereitet, indem sie gegen eine in geeigneter Weise gepufferte Chromatographie-Lösung dialysiert wird, die vorzugsweise millimolare Mengen von Phosphat, ein mit Metall- Ionen Chelate bildendes Mittel, ein Reduktionsmittel und einen Protease- Inhibitor enthält. Da die GAP-Aktivität durch die Gegenwart bivalenter Kationen, wie Magnesiumchlorid, stimuliert wird, kann diese auch in der Lösung vorhanden sein. Der pH-Wert der Lösung liegt vorzugsweise bei etwa 6,0.
Das GAP-Dialysat wird dann einer chromatographischen Aufreinigung unterworfen, die vorzugsweise aus drei Schritten besteht. Der erste umfaßt eine Aufreinigung unter Verwendung einer Ionenaustausch- Chromatographie, die für den GAP-Extraktionspuffer geeignet ist. Da der bevorzugte Extraktionspuffer Phosphat enthält, ist der erste Schritt eine GAP- Aufreinigung mittels einer Kationenaustausch-Chromatographie. Der zweite Schritt besteht in einer Ionenaustausch-Chromatographie, wobei die Ionenaustauscher-Matrix eine Ionenbindungs-Kapazität aufweist, die der des zuerst eingesetzten Ionenaustauschers entgegengesetzt ist.
Das bevorzugte Aufreinigungsverfahren besteht daher im Auftragen der GAP enthaltenden Phosphat-Lösung auf einen Kationenaustauscher und der Elution von GAP davon, vorzugsweise unter Verwendung von Lösungen, die den pH-Wert oder die Leitfähigkeit der Lösung verändern. Bevorzugter wird GAP durch Anwendung entweder einer Gradienten- oder einer Nicht- Gradienten-Salzlösung eluiert und am bevorzugtesten unter Verwendung eines linearen Gradienten von Natriumchlorid im Bereich von etwa 0 M-0,6 M.
Der bevorzugte Kationenaustauscher ist ein SP-Cellulose-Kationenaustauscher. Diese sind im Handel von AMF Molecular Separations Division, Meridian, CT, unter dem Markennamen ZetaPrep-SP-Patronen erhältlich. Der SP-Cellulose-Kationenaustauscher ist ein elastisches dreidimensionales Netzwerk, das aus einem Cellulose-Grundgerüst besteht, das mit einem angelagerte funktionelle Sulfopropyl-Gruppen enthaltenden Vinyl-Polymer vernetzt ist. Die Matrix ist vorzugsweise zum radialen Durchfluß der GAP- Lösung angepaßt. Die Durchflußrate der Lösung durch die Matrix hängt von der Größe und Geometrie der verwendeten Matrix ab. Dem Fachmann ist klar, daß man vorsichtig sein muß, um ein Überschreiten der Kapazität der Matrixeinheit durch GAP zu vermeiden. Bei Überschreitung der Kapazität wird nicht das gesamte GAP zurückgehalten und im Ausfluß liegt ein Überschuß an nicht zurückgehaltenem GAP vor. Die Matrix-Kapazität zum Zurückhalten von GAP kann kontrolliert werden, indem der Ausfluß unter Verwendung eines der nachstehend beschriebenen Tests auf GAP getestet wird.
GAP enthaltende Fraktionen werden für den zweiten Chromatographie- Schritt, d. h. eine Anionenaustausch-Chromatographie, aufbereitet. Dieser besteht aus einer Vereinigung der Fraktionen und Einstellung der Lösung, auf einen pH-Wert und eine Ionenstärke, die für die Anionenaustausch- Chromatographie geeignet sind. Verschiedene Anionenaustauscher sind verfügbar und die Konzentrationen dieser Reagenzien richten sich nach dem eingesetzten Typ. DEAE-Sepharose oder TSK-DEAE-5-PW können eingesetzt werden. Der Fachmann kennt die allgemeinen Verfahren zur Herstellung und Verwendung dieser Matrizes. Der bevorzugte Anionenaustauscher ist eine TSK- DEAE-5-PW-Matrix. Sie wird hergestellt, indem sie mit einer Chlorid-Ionen enthaltenden Lösung bei einem pH-Wert von 8,5 äquilibriert wird. Bevorzugter besteht die Lösung aus Tris-hydrochlorid, pH-Wert 8,5, sowie einem Reduktionsmittel, einem Metallchelatbildner, Magnesiumchlorid und einem Protease-Inhibitor. Die Konzentrationen des Metallchelatbildners und des Protease-Inhibitors schwanken und hängen davon ab, wie umfangreich GAP proteolytisch gespalten wird und ob die verantwortlichen Proteasen durch Metall-Ionen aktiviert werden. Die Konzentration einwertiger Kationen, wie Magnesiumchlorid, und des Reduktionsmittels kann durch Kontrolle der GAP- Aktivität empirisch bestimmt werden. Diejenigen Konzentrationen werden verwendet, die die höchste Aktivität aufrechterhalten. Vorzugsweise liegen Magnesiumchlorid und das Reduktionsmittel im allgemeinen im Bereich von etwa 0,5 mM-1 mM bzw. 0,1 mM-1 mM vor.
Danach läßt man die Lösung über die Anionenaustauscher-Matrix laufen, wobei GAP an die Matrix bindet. Anschließend wird GAP unter Verwendung von Lösungen, die den pH-Wert oder die Leitfähigkeit ändern, von der Matrix eluiert. Das bevorzugte Elutionsverfahren besteht aus der Elution von GAP unter Verwendung eines linearen Salz-Gradienten von Natriumchlorid im Bereich von 0 M-0,6 M. Die Reinheit und Aktivität von so erhaltenem GAP kann mittels des nachstehend beschriebenen GTPase-Tests und einer unter reduzierenden Bedingungen durchgeführten Natriumdodecylsulfat- Polyacrylamid-Gelelektrophorese kontrolliert werden. Unter Verwendung dieser Verfahren wurde bestimmt, daß GAP ein Molekulargewicht von etwa 115 000-120 000 Dalton besitzt.
Der dritte Chromatographie-Schritt besteht darin, daß nach der Anionenaustausch-Chromatographie entweder ein zweiter Kationenaustausch- Chromatographie-Schritt oder eine auf hydrophoben Wechselwirkungen basierende Chromatographie angewendet wird. Bei dem bevorzugtesten Aufreinigungsverfahren wird ein zweiter Kationenaustausch- Chromatographie-Schritt genutzt. Durch Anwendung eines dieser beiden Verfahren erhöht sich im allgemeinen die Reinheit von GAP auf etwa 95%. Wenn eine Kationenaustauscher-Säule gewählt wird; sind hier die vorstehend beschriebenen Materialien und Verfahren genauso anwendbar. Im allgemeinen besteht dies aus einer Verringerung der in den Anionensaustauschersäulen-Eluaten vorhandenen Salzkonzentration und einer Einstellung des pH-Wertes auf etwa 6,0. Wie im ersten Kationenaustausch-Chromatographie-Schritt können hier mehrere unterschiedliche Typen von Kationenaustausch-Matrizes eingesetzt werden. Die bevorzugte Matrix ist jedoch eine SP-TSK-Säule, die unter hohem Druck eingesetzt wird. Wenn eine auf hydrophoben Wechselwirkungen basierende Chromatographie gewählt wird, sollte die Ionenstärke des Anionenaustauscher-Eluats erhöht werden, so daß sie für eine auf hydrophoben Wechselwirkungen basierende Chromatographie geeignet ist.
Danach kann man die Lösung über eine Matrix für eine auf hydrophoben Wechselwirkungen basierende Chromatographie laufen lassen und eine Elution unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren einschließlich einer Verringerung der Salz-Konzentration oder eine Elution mit einem chaotropen Mittel durchführen. Die beiden letzteren Lösungen können allein oder in Kombination verwendet werden.
Für eine auf hydrophoben Wechselwirkungen basierende Chromatographie können verschiedene Matrizes genutzt werden. Die Materialien und Verfahren zur Verwendung bei einer auf hydrophoben Wechselwirkungen basierenden Chromatographie sind von S. Shaltie, Methods in Enzymology, 104 (1984), 69, in allgemeiner Form beschrieben. Obwohl klar ist, daß es viele Materialien und Verfahren zur hydrophoben Chromatographie gibt, die sich zur Aufreinigung von GAP einsetzen lassen, ist Phenyl-Sepharose bevorzugt und ferner ist der Einsatz der Chromatographie unter hohem Druck bevorzugt. Die allgemeinen Verfahren zur Durchführung einer Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie, die eine mit einer Phenyl-Gruppe derivatisierte Matrix umfaßt, sind von F. Regmaer, Methods in Enzymology, 91 (1983), 137, beschrieben. Die bevorzugte Matrix, die mit einer Phenyl-Gruppe derivatisiert ist, ist im Handel von Bio-Rad Corporation erhältlich und wird unter dem Handelsnamen Biogel-TSK-Phenyl- 5-PW verkauft.
Dem Fachmann ist außerdem bekannt, daß ein alternatives Aufreinigungsverfahren aus einem Kationenaustausch- und Anionenaustausch-Chromatographie-Schritt bestehen kann, dem sich ein Affinitätschromatographie-Schritt anschließt. Das kann durch Bindung von GAP an ein oder mehrere pflanzliche Lectine erfolgen, die eine bekannte Kohlenhydrat-Spezifität aufweisen, die für die an GAP möglicherweise vorhandenen Kohlenhydraten geeignet ist, oder durch Bindung von GAP an gegen GAP gerichtete Antikörper. In jedem Fall kann GAP danach von der Affinitätsmatrix freigesetzt werden, unter Verwendung eines geeigneten Zuckers, wenn die Matrix aus einem Lectin besteht, oder mit Hilfe des pH- Wertes oder chaotroper Mittel, wenn die Matrix aus einem Antikörper besteht.
Da GAP ein Protease-empfindliches Molekül ist, das zu GAP-Aktivität aufweisenden Peptiden geringeren Molekulargewichts gespalten wird, erfolgt in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung eine schnelle Durchführung des gesamten Aufreinigungsverfahren in der Kälte zur Verringerung der Protease-Aktivität. Im allgemeinen liegt diese Temperatur in einem Bereich unter 10ºC, wobei der bevorzugte Temperaturbereich bei etwa 2ºC bis SOG liegt. Am bevorzugtesten ist eine Temperatur von etwa 4ºC.
Schließlich sollte erwähnt werden, daß die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Ionenaustauscher-Materialien, obwohl ihre Anwendung vorzugsweise in einer Säulen-Versuchsanordnung erfolgt, bekanntlich ebenso auch in einer Batch-Versuchsanordnung verwendet werden können.
Eine bevorzugte Ausführungsform des Aufreinigungsverfahrens besteht aus der im folgenden beschriebenen Isolierung von GAP aus menschlichen Plazenten.
GAP wurde aus 300 g menschlicher Plazenta mittels des folgenden, aus drei Schritten bestehenden Chromatographie-Verfahrens isoliert. Die Plazenten wurden kurz nach der Entbindung erhalten und bis zu ihrer Verarbeitung auf Eis gehalten. Nachdem mittels Standardtests bestimmt worden war, daß sie frei von HIV-Antikörpern waren, wurden sie wie folgt verarbeitet. Der erste Schritt umfaßte eine mechanische Entfernung von Bindegewebe und eine Säuberung der Plazenten von überschüssigem Blut durch mehrmaliges Tränken in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Dann wurden die Plazenten fragmentiert, indem das Gewebe bei -70ºC eingefroren wurde, anschließend in eine 5 mM EGTA und 100 uM PMSF enthaltende PBS-Lösung gegeben und in einem Mixer solange aufgeschlossen wurde, bis eine einheitliche fein-verteilte Suspension zu sehen war. Zur Entfernung unlöslicher Zelltrümmer wurde die Suspension bei 100 000 · g zentrifugiert, der Überstand wurde entfernt und das darin befindliche proteinhaltige Material wurde mit 40% Ammoniumsulfat präzipitiert. Ammoniumsulfat wurde entfernt und die präzipitierten Proteine wurden in 0,1% NP40 und 100 uM PMSF enthaltender PBS resuspendiert. Diese Lösung wurde umgehend 6 Stunden gegen 20 mM Kaliumphosphat, 1 mM MgCl&sub2;, 5 mM EGTA, 0,1 mM DTT, 100 uM PMSF, pH-Wert 6,1, dialysiert. Danach wurde diese Lösung auf der Kationenaustausch-Matrix S-Sepharose (schneller Durchfluß, erhältlich von Pharmacia Corporation), die vorher mit 20 mM Kaliumphosphat, 1 mM MgCl&sub2;, 5 mM EGTA, 0,1 mM DTT, 100 uM PMSF, pH-Wert 6,1, äquilibriert worden war, sofort einer Chromatographie unterworfen.
An den Kationenaustauscher absorbierte Proteine wurden mit einem 0 M- 0,6 M Natriumchlorid enthaltenden linearen Salzgradienten eluiert. Unter Verwendung des nachstehend beschriebenen GAP-Tests zeigte sich, daß der größte Teil der GAP-Aktivität in zwei Peaks vorhanden war, einem großen Peak, der bei einer Natriumchlorid-Konzentration von 100 mM-150 mM eluierte, und einem kleinen Peak, der bei einer Natriumchlorid-Konzentration von 220 mM-300 mM eluierte. Der große Peak wurde gegen 30 mM Tris-HCl, 1 mM Magnesiumchlorid, 1 mM EGTA, 0,1 mM DTT, 100 uM PMSF, pH-Wert 8,5, dialysiert. Das Dialysat wurde auf eine Anionenaustauscher-Säule, TSK-DEAE-5- PW (150 mm · 21,5 mm) aufgetragen. Zur Elution der anhaftenden Proteine wurde die Anionenaustauscher-Matrix mit einem linearen Natriumchlorid- Salzgradienten im Bereich von 0 M-0,6 M behandelt. Der größte Teil der GAP- Aktivität eluierte bei einer Natriumchlorid-Konzentration von etwa 130 mM NaCl. Die GAP-Aktivität enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, auf 0,5 M Ammoniumsulfat gebracht und über eine hydrophobe Phenyl-TSK-HPLC-Säule laufen gelassen. Die Proteine wurden aus der hydrophoben Säule unter Verwendung gegenläufiger Gradienten eluiert, die aus steigenden Ethylenglykol-Konzentrationen von 0%-30% und abnehmenden Ammoniumsulfat-Konzentrationen von 0,5 M-0 M bestanden. Der überwiegende Teil der GAP-Aktivität eluierte bei einer Ethylenglykol- Konzentration von 24% und einer Ammoniumsulfat-Konzentration von 0,1 M. Bei Tests, die wie nachstehend beschrieben durchgeführt wurden, zeigte sich eine Korrelation zwischen der GAP-Aktivität und einer Protein-Bande von etwa 120 000 Dalton, wie mittels einer unter reduzierenden Bedingungen durchgeführten Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf 6%-igen Gelen gezeigt (Fig. 1).
Zur Aufreinigung von GAP wurde eine zweite Ausführungsform des Aufreinigungsverfahrens eingesetzt. Menschliche Plazenten wurden erneut kurz nach der Entbindung erhalten, in eiskalter PBS getränkt und homogenisiert und geklärt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Zur Präzipitation von proteinhaltigem Material wurde dem geklärten Homogenat erneut Ammoniumsulfat bis zu einer Endkonzentration von 40% zugegeben. Man ließ die Ammoniumsulfat-Lösung eine Stunde bei 4% stehen, bevor das präzipitierte proteinhaltige Material mittels 15-minütiger Zentrifugation bei 10 000 · g gewonnen wurde. Das Pellet wurde in 0,1% NP40 und 100 uM PMSF enthaltender PBS resuspendiert. Diese Lösung; wurde sechs Stunden bei 4ºC gegen 20 mM Kaliumphosphat, pH-Wert 6,1, dialysiert, das 1 mM MgCl&sub2;, 5 mM EGTA, 0,1 mM DTT und 100 uM PMSF enthielt. Da GAP für Proteolyse anfällig ist, waren längere Dialyse-Zeiten nicht wünschenswert.
Zur Verringerung der Leitfähigkeit der Lösung auf 1 Millisiemens wurde das GAP-Dialysat mit einer 0,02 M MgCl&sub2;, 1 mM EGTA, 0,1 mM DTT und 100 uM PMSF enthaltenden 4 mM Kaliumphosphat-Lösung, pH-Wert 6,1, dreifach verdünnt. Diese Leitfähigkeit ist geeignet, um das Dialysat auf eine S- Sepharose-Kationenaustauscher-Säule aufzutragen. Das Dialysat wurde mittels 10-minütiger Zentrifugation bei 10 000 · g geklärt, der sich ein weiterer, aus einer Filtration durch ein 0,45 um-Filter bestehender Aufreinigungsschritt anschloß, bevor das Dialysat auf die S-Sepharose-Säule (schneller Durchfluß, Pharmacia) gegeben wurde. Der größte Teil der Protein-Verunreinigungen lief durch die S-Sepharose-Säule und die absorbierten Proteine wurden mit einem aus 0 M-0,6 M NaCl bestehenden 1,5 l-Salzgradienten eluiert. Die GAP- Aktivität enthaltenden Fraktionen wurden unter Verwendung des nachstehend beschriebenen GAP-Tests identifiziert.
Wie im ersten Beispiel festgestellt, eluierte GAP überwiegend in zwei Haupt- Peaks aus der Kationenaustauscher-Säule. Der erste Peak, der bei einer Natriumchlorid-Konzentration im Bereich von 100 mM-150 mM eluierte, wurde vereinigt und gegen einen 1 mM EGTA, 1 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM DTT und 100 uM PMSF enthaltenden 30 mM Tris-HCl-Puffer, pH-Wert 8,5, dialysiert. Die Lösung wurde bei 4ºC dialysiert und mittels Filtration durch ein 0,45 um-Filter geklärt. Das Filtrat wurde in gleiche Hälften geteilt und jede Hälfte wurde unter Verwendung von zwei aufeinanderfolgenden Anionenaustauscher-Säulen aufgereinigt.
Die beiden Filtrate wurden separat auf eine TSK-DEAE-5-PW-Säule gegeben, die Abmessungen von 150 mm · 21,5 mm aufwies. Die Säule war vorher mit dem vorstehend beschriebenen Tris-hydrochlorid-Dialysepuffer, pH-Wert 8,5, äquilibriert worden. GAP wurde 60 min mittels eines NaCl-Gradienten von 0 M- 0,6 M mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 3 ml/min eluiert. Der überwiegende Teil der GAP-Aktivität beider Filtrate eluierte als einzelner Peak bei einer Natriumchlorid-Konzentration von etwa 130 mM. Eine Analyse der DEAE-Fraktionen mittels einer Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid- Gelelektrophorese zeigte, daß GAP das Hauptprotein in den Aktivität enthaltenden Peak-Fraktionen darstellte. GAP enthaltende Fraktionen beider Aufreinigungen wurden vereinigt und in einer 0,1 mM EGTA, 10 uM DTT und 10 uM PMSF enthaltenden 2 mM Kaliumphosphat-Lösung, pH-Wert 6,1, zur Verringerung der Salzkonzentration fünffach verdünnt, damit die Lösung für einen zweiten Kationenaustauschchromatographie-Schritt, d. h. eine SP-TSK- Säulen-Chromatographie geeignet war. Der pH-Wert der Lösung wurde überprüft und gegebenenfalls mit Natriumacetat (3 M, pH 4,8) auf 6,1 eingestellt. Beide von den DEAE-Säulen isolierten GAP-Fraktionen wurden getrennt über eine TSK-SP-S-PW-Kationenaustauschersäule mit Abmessungen von 75 mm · 7,5 mm weiter aufgereinigt. Man ließ eine 1 mM EGTA, 0,1 DTT und 0,1 mM PMSF enthaltende 20 mM Kaliumphosphat-Lösung, pH-Wert 6,1, über die Säule laufen und anschließend wurde GAP 45 min mittels eines NaCl- Gradienten von 0 M-0,6 M bei einer Geschwindigkeit von 1 ml pro min eluiert. Die GAP enthaltenden Fraktionen wurden unter Verwendung des nachstehend beschriebenen Tests und einer Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid- Gelelektrophorese identifiziert. Die GAP-Aktivität entsprach einem Protein, das ein Molekulargewicht von etwa 116 000 Dalton aufwies. Zur Bestimmung der Protein-Konzentration wurde eine Aminosäureanalyse an aufgereinigtem GAP durchgeführt. Beginnend mit etwa 300 g menschlicher Plazenta wurden etwa 430 ug aufgereinigtes GAP erhalten. Fig. 2 zeigt die SDS-PAGE-Analyse von GAP in den verschiedenen, vorstehend beschriebenen Phasen der Aufreinigung.

GAP-Test

Vor kurzem sind mehrere Tests zur Bestimmung der GAP-Aktivität beschrieben worden (M. Trahey und F. McCormick, Science, 238 (1987), 542; Adari et al., Science, 240 (1988), 518).
GAP kann in vitro getestet werden, wobei verschiedene Typen von in vitro- Tests durchgeführt werden können. Der bevorzugte Test umfaßt die Bestimmung des Vorkommens von aus der Hydrolyse von GTP resultierendem GDP. Dieser Test umfaßt die Vereinigung empirisch bestimmter optimaler Mengen von normalem zellulärem p21 und α-³²P-GTP sowie GAP in einer geeigneten physiologisch gepufferten wäßrigen Lösung. Die Lösung kann auch Protease-Inhibitoren und ein Reduktionsmittel enthalten. Da Kationen die GAP-Aktivität stark stimulieren, sollten diese auch in einer wirksamen Menge vorhanden sein. Das bevorzugte Kation ist Magnesiumchlorid.
Die Umsetzungslösung wird über verschiedene Zeitspannen inkubiert, wobei die Inkubation bei Temperaturen durchgeführt werden kann, die typischerweise zur Durchführung von Enzymtests eingesetzt werden, vorzugsweise bei 10ºC-40ºC und bevorzugter bei 37ºC. Zu geeigneten Zeitpunkten werden Aliquots entnommen und auf α-³²P-GDP getestet. Das wird leicht erreicht, indem zuerst gebundenes α-³²P-GDP enthaltendes p21 von den anderen Reaktanten, insbesondere freiem α-³²P-GTP, in der Lösung getrennt wird. Das läßt sich mittels Immunpräzipitation von p21 mit dagegen gerichteten Antikörpern erreichen. Immunpräzipitations-Verfahren und gegen p21 gerichtete Antikörper sind bekannt und werden vom Fachmann routinemäßig eingesetzt. α-³²P-GDP wird aus dem Immunpräzipitat freigesetzt, indem die Probe vorzugsweise in einem Denaturierungsmittel bei einer erhöhten Temperatur, bevorzugter 5 min bei 65ºC in 1% Natriumdodecylsulfat, gelöst wird und das Gemisch auf einer geeigneten Dünnschicht- Chromatographieplatte einer Chromatographie unterworfen wird. Die Chromatographie wird vorzugsweise auf einer PEI-Cellulose-Platte in 1 M LiCl durchgeführt. Unter Verwendung geeigneter radioaktiver Nachweisverfahren, vorzugsweise Autoradiographie, wird α-³²P-GDP anhand seiner Wanderungsgeschwindigkeit im Vergleich zu der eines bekannten Standards identifiziert.
Ein alternativer GAP-Aktivitäts-Test besteht darin, im vorstehend beschriebenen Testsystem α-³²P-GTP gegen gamma-markiertes ³²P-GTP auszutauschen und unter Verwendung von Aktivkohle auf freies ³²P- markiertes Phosphat zu testen. Dieser Test kann so durchgeführt werden, wie von Tjian et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 44 (1980), 103, beschrieben.
Ein weiterer Test umfaßt keine Immunpräzipitation. Stattdessen kann ein Aliquot von einem vorstehend beschriebenen GAP-Test-Umsetzungsgemisch direkt einer PEI-Cellulose-Chromatographie in 1 M LiCl unterworfen werden. Zum Testen von Lösungen mit im wesentlichen aufgereinigtem GAP ist dieser Test jedoch der geeignetste.
Ein typischer GAP-Test läßt sich wie folgt durchführen. Etwa 0,8 ug H-ras- Protein, das wie von Trahey et al., vorstehend, beschrieben erhalten worden war, wurde an α-³²P-GTP gebunden und anschließend wurde der Komplex mit 13 ug des gegen ras gerichteten Antikörpers 157-181 präzipitiert, der das Carboxyl-terminale Ende des Moleküls erkennt. 157-181 erkennt spezifisch die Carboxyl-terminalen Reste an den Positionen 157-181 (Adari et al., Science, 240 (1988), 518). Danach wurden 10 ug eines gegen Maus-Antikörper gerichteten Schafs-IgG und 10 ul Protein A-Sepharose-Perlen zugegeben. Als Kontrolle wurden die gleichen Reaktanten kombiniert, wobei allerdings 157- 181 durch Ratten-IgG ersetzt wurde und das gegen Maus-Antikörper gerichtete Schafs-IgG durch einen gegen Ratten-Antikörper gerichteten Ziegen-IgG. Die Pellets wurden mit 20 mM Natriumchlorid, 1 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltendem 20 mM Tris-hydrochlorid, pH-Wert 7,4, gewaschen und in der gleichen Lösung resuspendiert. Dann wurden 4 ul-Aliquots des Immunkomplexes mit 10 ul GAP oder zur Kontrolle mit einem Puffer ohne GAP gemischt. Nach 60-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Sepharose-Perlen wieder gewaschen und die gebundenen Nucleotide wurden mittels Dünnschicht-Chromatographie mit 1 M LiCl als Lösungsmittel analysiert. Die Dünnschicht-Platte wurde einer ein- bis zweistündigen Autoradiographie unterworfen und danach entwickelt. Das Autoradiogramm zeigte, daß die Zugabe einer ausreichenden GAP-Menge eine nahezu vollständige Hydrolyse von GTP zu GDP bewirkte, während bei der Kontrolle ohne GAP nur eine geringe GTP-Hydrolyse erfolgte. Mit dem Test läßt sich GAP in halb-quantitativer, Dosis-abhängiger Weise nachweisen. Die quantitative Bestimmung läßt sich durch Abkratzen der relevanten Plattenbereiche und Bestimmung der CpM in GDP unter Verwendung eines gamma-Zählers verbessern. Die Immunpräzipitations-Kontrollen, bei denen die Maus- Antikörper gegen Ratten-IgG ausgetauscht worden waren, zeigten weder GTP noch GDP.
GAP kann nicht nur mittels des vorstehend beschriebenen Verfahrens, sondern vorzugsweise auch wie folgt getestet werden. 4 uM normales zelluläres p21 wurden in einem Puffer gelöst, der 80 mM β-Glycerophosphat, 5 mM MgCl&sub2;, 1 mM DTT, pH-Wert 7,5, sowie 255 uM [α-³²P]-GTP (16 Ci/mmol), 4 mM ATP und Rinderserumalbumin (2,5 mg/ml) enthielt. Das Gemisch wurde 30 min bei 37ºC vorinkubiert und anschließend wurde entweder eine Probe zugegeben, von der man annahm, daß sie GAP enthielt, oder ein gleiches Volumen von Puffer. Nach 1 h bei Raumtemperatur wurde der monoclonale Antikörper Y13-259 in Gegenwart von 0,5% NP40 in einer Menge zugegeben, die zur Bindung des gesamten in der Lösung vorhandenen p21 ausreichte. Danach wurde ein aus gegen Ratten-Antikörper gerichtetem Ziegen-IgG und Protein A-Sepharose bestehender Komplex zugegeben, um das an Y13-259 gebundene p21 zu sammeln, und der Immunkomplex wurde isoliert und 10mal in 20 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl&sub2; und 0,5% NP40 gewaschen. Zur Bestimmung des Ausmaßes der Bindung und Hydrolyse von GTP während dieser Schritte wurde eine Kontrolle durchgeführt, die die Zugabe von 5 ug p21 unmittelbar vor Zugabe von Y13-259 umfaßte.
Nucleotide wurden von p21 mit 1% SDS, 20 mM EDTA 5 min bei 65ºC eluiert und einer Chromatographie auf PEI-Cellulose in 1 M LiCl unterworfen. GTP und GDP wurden unter Verwendung von Standard-Autoradiographieverfahren sichtbar gemacht. Die Ergebnisse zeigten, daß normales zelluläres p21 im Vergleich zu den genauso getesteten oncogenen ras-Protein-Mutanten Asp 12 und Val 12 eine nahezu vollständige Umwandlung von GTP zu GDP bewirkt.
Außerdem wurde in der Kontrollprobe wenig oder kein GTP oder GDP nachgewiesen.
Die vorstehend beschriebenen Tests werden von Trahey und McCormick in Science, 238 (1987), 542, und von Adari et al. in Science, 240 (1988), 518, genauer erläutert.

GAP-Aminosäuresequenz

Das GAP-Protein oder davon stammende Fragmente können unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Standardverfahren sequenziert werden. Falls GAP mit einem blockierten Amino-terminalen Ende isoliert wird, kann eine Sequenzierung des Innenbereiches erfolgen, indem das Molekül fragmentiert wird, wie z. B. mit Lysylendopeptidase, und ein oder mehrere der erhaltenen Fragmente sequenziert werden. Obwohl das für GAP, das aus anderen Quellen als Plazenta isoliert wird, nicht notwendigerweise der Fall sein muß, wurde in der vorliegenden Erfindung festgestellt, daß GAP ein blockiertes Amino-terminales Ende zeigte.
Das Protein, das ein Molekulargewicht von etwa 120 000 aufwies und mittels des vorstehend beschriebenen Aufreinigungsverfahrens erhalten worden war, wurde aus einem 6% Natriumdodecylsulfat enthaltenden Polyacrylamid- Gel in 0,1% Natriumdodecylsulfat enthaltendes 0,05 M Ammoniumhydrogencarbonat elektroeluiert. Das angewendete Verfahren ist von Hunkapillar et al., Methods in Enzymology, 91. (1983), 227, beschrieben. Zur Sequenzierung des Innenbereiches wurde das elektroeluierte Protein unter Verwendung von Lysylendopeptidase (5% (Gew./Gew.) 18 h bei 40ºC, WAKO) fragmentiert. Die Peptide wurden mittels Umkehrphasen-Hochleistungs- Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer Brownlee-Aquapore- RP-300-Patrone (100 mm · 2,1 mm, Applied Biosystems) fraktioniert. Die Peptide wurden mit einem Acetonitril-Gradienten von 0%-70% 120 min eluiert (Puffer A: 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) in H&sub2;O; Puffer B: 0,085% TFA in 85% Acetonitril). Auf der 470A-Gasphasen-Sequenziervorrichtung von Applied Biosystems wurde eine automatische Sequenzanalyse der Peptide durchgeführt, wie berichtet. Ein für GAP charakteristisches Peptid besitzt die folgende Aminosäuresequenz:
IMPEEEYSEFK.

Clonierung von GAP

Eine GAP codierende cDNA-Sequenz voller Länge wurde wie folgt erhalten: unter Verwendung von DNA-Sequenzen, die anhand der partiellen Aminosäurezusammensetzung von GAP abgeleitet worden waren, als Oligonucleotid-Sonden wurden zuerst in einer cDNA-Genbank partielle cDNA- Sequenzen identifiziert. Eine solche, als GAP 6 bezeichnete partielle cDNA- Sequenz wurde subcloniert und sequenziert. Die Kenntnis ihrer DNA-Sequenz führte andererseits zu weiteren Sonden, die zum Absuchen von eDNA- Genbanken nach längeren cDNA-Insertionen verwendet wurden, was schließlich zu einem Clon voller Länge, dem Clon 101, führte. Jedes der verschiedenen Verfahren wird nachstehend diskutiert.

1. Allgemeine Clonierungsverfahren

Bei der Konstruktion geeigneter Vektoren, die die gewünschte GAP codierende Sequenz enthalten, werden auf dem Fachgebiet wohlbekannte Standardverfahren zur Ligierung und Restriktion eingesetzt. Isolierte Vektoren, DNA-Sequenzen oder synthetisierte Oligonucleotide werden gespalten, zugeschnitten und erneut in der gewünschten Form ligiert.
Eine ortsspezifische DNA-Spaltung wird durch Behandlung mit (einem) geeigneten Restriktionsenzym(en) unter Bedingungen durchgeführt, die allgemein auf dem Fachgebiet bekannt sind, wobei die Einzelheiten davon von den Herstellern dieser im Handel erhältlichen Restriktionsenzyme angegeben sind (vgl. z. B. den Produktkatalog von New England Biolabs). Im allgemeinen wird etwa 1 ug Plasmid- oder DNA-Sequenz mit einer 1 Einheit eines Enzyms in etwa 20 ul Pufferlösung gespalten. In den in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Beispielen wird typischerweise ein Überschuß an Restriktionsenzymen verwendet, um eine vollständige Spaltung des DNA- Substrates sicherzustellen. Bei etwa 37ºC kann die Inkubationszeit etwa ein bis zwei Stunden betragen, obwohl Abweichungen hingenommen werden können. Nach jeder Inkubation wird das Protein mittels einer Phenol/Chloroform- Extraktion entfernt, der sich eine Ether-Extraktion anschließen kann, und die Nucleinsäure wird aus den wäßrigen Fraktionen mittels Ethanol-Präzipitation und anschließender Chromatographie unter Verwendung einer Sephadex-G- 50-Säule zum Zentrifugieren gewonnen. Auf Wunsch kann mittels Polyacrylamid- oder Agarose-Gelelektrophorese unter Verwendung von Standard-Verfahren eine Trennung der gespaltenen Fragmente entsprechend der Größe erfolgen. Eine allgemeine Beschreibung von Trennverfahren entsprechend der Größe findet sich in Methods in Enzymology, 65 (1980), 499- 560.
Durch Behandlung mit dem großen Fragment der E. coli-DNA-Polymerase I, d. h. dem Klenow-Fragment, in Gegenwart der vier Desoxyribonucleotidtriphosphate (dNTPs) unter Verwendung von Inkubationszeiten von etwa 15 min bis 25 min bei 20ºC bis 25ºC in 50 mM Tris, pH-Wert 7,6, 50 mM NaCl, 6 mM M g Cl&sub2;, 6 mM DTT und 10 mM dNTPs können gespaltene Restriktionsfragmente mit glatten Enden versehen werden. Nach Behandlung mit dem Klenow-Fragment wird das Gemisch mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Eine Behandlung mit S1-Nuclease unter geeigneten Bedingungen führt zur Hydrolyse einzelsträngiger Teile.
Ligierungen werden in Volumina von 15 ul-30 ul unter folgenden Standard-Bedingungen und bei folgenden Temperaturen durchgeführt: 20 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 33 ug/ml BSA, 10 mM-50 mM NaCl, wobei für Ligierungen "klebriger Enden" 1 mM ATP und 0,3-0,6 (Weiss-) Einheiten T4-DNA-Ligase bei 14ºC verwendet wurden und für Ligierungen "glatter Enden" 1 mM ATP und 0,3-0,6 (Weiss-) Einheiten T4-Ligase. Intermolekulare Ligierungen "klebriger Enden" werden üblicherweise bei einer DNA-Gesamtkonzentration von 33 ug/ml-100 ug/ml durchgeführt. Bei Ligierungen "glatter Enden" beträgt die DNA-Gesamtkonzentration der Enden etwa 1 uM.
Bei einer Vektor-Konstruktion unter Verwendung von "Vektorfragmenten" wird das Vektorfragment üblicherweise mit bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP) behandelt, um die 5'-Phosphat-Einheit zu entfernen und eine erneute Ligierung des Vektors zu verhindern. BAP-Spaltungen werden bei einem pH-Wert von 8 in etwa 150 mM Tris in Gegenwart von Na&spplus;- und Mg²&spplus; unter Verwendung von etwa 1 BAP-Einheit pro ug Vektor etwa 1 Stunde bei 60ºC durchgeführt, Nucleinsäure-Fragmente werden mittels Phenol/Choroform-Extraktion des Präparates und anschließender Ethanol- Präzipitation gewonnen. In einer anderen Ausführungsform läßt sich bei Vektoren, die mittels einer weiteren Restriktionsenzym-Spaltung der unerwünschten Fragmente doppelt gespalten worden sind, eine erneute Ligierung verhindern.
Bei den nachstehend dargelegten Konstruktionen werden richtige Ligierungen bestätigt, indem zuerst ein geeigneter E. coli-Stamm mit dem Ligierungsgemisch transformiert wird. Erfolgreiche Transformanten werden aufgrund ihrer Resistenz gegen Ampicillin, Tetracyclin oder andere Antibiotika oder unter Verwendung anderer Marker je nach der Art der Plasmid-Konstruktion selektiert, wie auf dem Fachgebiet bekannt. Aus den Transformanten lassen sich unter Verwendung des Verfahrens von D. Ish- Howowicz et al. (Nucleic Acids Res., 9 (1981), 2989) DNA-Minipräparationen herstellen und mit Hilfe von Restriktionsspaltungen analysieren und/oder mit Hilfe des Didesoxy-Verfahrens von F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 74 (1977), 5463, das von Messing et al., Nucleic Acids Res., 9 (1981), 309, näher beschrieben worden ist, oder mit Hilfe des Verfahrens von Maxam et al., Methods in Enzymology, 65 (1980), 499, sequenzieren.
Zur Clonierung in M13 werden Wirtsstämme eingesetzt, die für eine Phageninfektion anfällige E. coli-Stämme umfassen, wie den E. coli-K12-Stamm DG98. Der Stamm DG98 ist am 13. Juli 1984 bei ATCC hinterlegt worden und besitzt die Hinterlegungsnummer 1965.
Je nach der verwendeten Wirtszelle wird eine Transformation unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt, die für solche Zellen geeignet sind. Für Prokaryonten wurde die von S. N. Cohen, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 69 (1972), 2110, beschriebene Calciumchlorid-Behandlung oder das in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982), S. 254, Cold Spring Harbor Press, beschriebene RbCl&sub2;-Verfahren verwendet. Di e Transfektion von Sf9-Zellen wurde unter Verwendung einer Modifikation des Calciumphosphat-Präzipitationsverfahrens (Graham, F. L. et al., Virology, 52 (1973), 456) erreicht, das für Insektenzellen angepaßt worden ist (J. P. Burand et al., Virology, 101 (1980); E. B. Casstens et al., Virology, 101 (1. 980), 311). Weitere Einzelheiten bezüglich der Transfektion von Sf9-Zellen sind von Summers und Smith in "A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures" (1986), Texas A & M Press, beschrieben. Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Baculovirus-Transvervektoren stammen von Transfervektoren, die von G. E. Smith et al. (1983), vorstehend, beschrieben worden sind. Diese Vektoren wurden ursprünglich konstruiert, indem das das Polyhedron-Gen enthaltende AcNPV-EcoRI-1-Fragment in die EcoRI-Stelle des von Vieira et al., Gene, 19 (1982), 259-268, beschriebenen E. coli-Plasmids pUC8 cloniert wurde. Eine Familie von Plasmiden, die einzelne BamHI-Clonierungsstellen an verschiedenen Positionen im Polyhedron-Gen aufweisen, wurde erzeugt, wie von Smith et al. (1983), vorstehend, beschrieben. Das davon am häufigsten verwendete Plasmid pAc373 besitzt eine nur einmal vorhandene BamHI-Stelle 50 Basenpaare stromabwärts von der Polyhedron-"Cap"-Stelle, d. h. 8 Basenpaare vor dem Polyhedron- Translationsinitiationscodon ATG (Luckow und Summers, Biotechnology, Bd. 6 (1988), S. 47).

2. Oligonucleotid-Sonden

Synthetische Oligonucleotide wurden mittels des Triester-Verfahrens von Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc., 103 (1981), 3185, oder unter Verwendung von im Handel erhältlichen automatischen Oligonucleotid-Synthesevorrichtungen hergestellt. Vor Anlagerung oder zur Markierung erfolgte eine Kinase- Behandlung von Einzelsträngen unter Verwendung eines Überschusses an Polynucleotidkinase, d. h. etwa 10 Einheiten pro 0,1 mMol Substrat, in Gegenwart von 50 mM Tris, pH-Wert 7,6, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM Dithiothreit, 1 mM -2 mM ATP, 1,7 pMol gamma-³²P-ATP (2,9 mCi/mmol), 0,1 mM Spermidin und 0,1 mM EDTA.
Unter Verwendung der vorstehend beschriebenen partiellen GAP- Aminosäuresequenz und der bekannten Codon-Redundanz davon wurden mehrere DNA-Oligonucleotidsonden synthetisiert, die in den Fig. 3 und 4 gezeigt sind.

3. Identifizierung und Isolierung von GAP-Sequenzen

Zur Identifizierung von GAP-DNA-Sequenzen sind mehrere Verfahren verfügbar. Das bevorzugte Verfahren ist die Verwendung der vorstehend beschriebenen Oligonucleotid-Sonden zum Absuchen von cDNA-Genbanken cDNA-Genbanken können unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren konstruiert oder können im Handel erworben werden.
Ein Verfahren zur Herstellung einer GAP-Sequenzen enthaltenden cDNA- Genbank kann beispielsweise in der Isolierung von cytoplasmatischer Gesamt- RNA aus einem geeigneten Ausgangsmaterial und einer weiteren Isolierung von Boten-RNA daraus bestehen. Letztere kann weiter in Poly(A+)-Boten-RNA fraktioniert werden, die ihrerseits noch weiter in GAP-Boten-RNA enthaltende Poly(A+)-Boten-RNA-Fraktionen fraktioniert wird. Die entsprechende GAP- Boten-RNA kann dann einer Umkehrtranskription unterworfen und in einen geeigneten Vektor zur Bildung der cDNA-Genbank cloniert werden.
Insbesondere wird das Ausgangsmaterial (d. h. Gewebe, Zellen) mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und ein nicht-ionisches Detergens, wie Ethylenoxid vom Polymer-Typ (NP-40), wird in einer Menge zugegeben, die die zellulären Membranen, nicht jedoch die Kernmembranen lysiert, wobei die Konzentration davon im allgemeinen etwa 0,3% beträgt. Dann können die Kerne mittels einer 10-minütigen Zentrifugation bei 1000 · g entfernt werden. Der post-nucleare Überstand wird einem gleichen Volumen von TE (10 mM Tris, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), pH 7,5) zugegeben, der mit 0,5% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 10 mM EDTA enthaltendem Phenol/Chloroform (1 : 1) gesättigt worden ist. Der Überstand wird erneut 4mal extrahiert und einer Phasentrennung mittels einer 120- minütigen Zentrifugation bei 2000 · g unterworfen. Die RNA wird durch Einstellen der Proben auf 0,25 M NaCl, Zugabe von 2 Volumina 100%-igem Ethanol und Aufbewahrung bei -20ºC präzipitiert. Danach wird die RNA 30 min bei 5000 · g pelletiert, mit 70%-igem und 100%-igem Ethanol gewaschen und getrocknet. Das erhaltene Material stellt cytoplasmatische Gesamt-RNA dar. Mittels Chromatographie auf Oligo(dT)-Cellulose kann aus der cytoplasmatischen Gesamt-RNA polyadenylierte (Poly A+) Boten-mRNA (mRNA) erhalten werden (J. Aviv et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 69 (1972), 1408- 1412). Die RNA wird in ETS (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,5% SDS, pH 7,5) in einer Konzentration von 2 mg/ml gelöst. Diese Lösung wird S min auf 65ºC erhitzt und danach schnell auf 4ºC gekühlt. Nachdem die RNA auf Raumtemperatur gebracht worden ist, stellt man sie auf 0,4 M NaCl ein und läßt sie langsam über eine Oligo(dT)-Cellulose-Säule laufen, die vorher mit Bindungspuffer (500 mM NaCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5) äquilibriert worden ist. Man läßt den Durchfluß erneut zweimal über die Säule laufen und wäscht die Säule mit 10 Volumina Bindungspuffer. Poly(A+)-mRNA wird mit ETS-Aliquots eluiert, einmal mit TE-gesättigtem Phenol/Chloroform extrahiert und durch Zugabe von NaCl bis zu einer Konzentration von 0,2 hM und 2 Volumina 100%-igem Ethanol präzipitiert. Die RNA wird erneut zweimal präzipitiert, einmal in 70%- igem Ethanol und danach in 100%-igem Ethanol gewaschen, bevor sie getrocknet wird. Die Poly(A+)-mRNA kann danach zur Konstruktion einer cDNA-Genbank verwendet werden.
Aus der angereicherten mRNA-Fraktion kann unter Verwendung von Oligo(dT) als Primer für die Poly A-Schwänze und AMV-Umkehrtranskriptase cDNA hergestellt werden, wobei das Verfahren von H. Okayama et al., Mol. Cell. Biol., 3 (1983), 280, eingesetzt wird, das durch Bezugnahme in den vorliegenden Text aufgenommen wird.
Natürlich sind auf dem Fachgebiet andere Verfahren zur Herstellung von cDNA-Genbanken wohlbekannt. Bei einem mittlerweile klassischen Verfahren unter Verwendung von einem Oligo(dT)-Primer und Umkehrtranskriptase wird die doppelsträngige cDNA mit Poly(dG)-Schwänzen versehen und an einen geeigneten Vektor, wie pBR322 oder einen Abkömmling davon, angelagert, der an der gewünschten Restriktionsstelle gespalten und mit einem Poly(dC)-Schwanz versehen worden ist. Eine genaue Beschreibung dieses alternativen Verfahrens findet sich beispielsweise in dem am 21. Mai 1985 erteilten US-Patent Nr. 4 518 584 des gleichen Anmelders, das durch Bezugnahme in den vorliegenden Text aufgenommen wird.
Wie vorstehend erwähnt, sind cDNA-Genbanken im Handel erhältlich. Eine besonders geeignete Genbank wird von Clontech (Katalog-Nr. #L H1008) vertrieben. Es handelt sich um eine menschliche Plazenta-cDNA umfassende Lambda gt11-Genbank, die aus Poly(A+)-Gesamtboten-RNA hergestellt worden ist.

4. Identifizierung von GAP-DNA-Sequenzen

Zum Absuchen der im Handel erhältlichen Clontech-Genbank wurden die vorstehend beschriebenen Oligonucleotid-Sonden GW13, GW15, GW17 und GW19 verwendet. Unter Verwendung von 17 Platten wurde die Genbank in einer Dichte von 50 000 Plaques pro Platte ausplattiert. Unter Verwendung des Plaque-Hybridisierungsverfahrens wurden daher etwa 850 000 Plaques abgesucht. Obwohl verschiedene solcher Verfahren bekannt sind, ist im folgenden das bevorzugte Verfahren beschrieben. Jede 150 mm-Platte wurde auf zwei Nitrocellulose-Filterpapiere (S & S, Typ BA-85) überstempelt. Die Fixierung der DNA am Filter erfolgte mittels einer schrittweisen, jeweils 5- minütigen Behandlung mit 0,5 N NaOH und 1,0 M NaCl, 1,5 M NaCl und 0,5 M Tris-HCl, pH-Wert 8, sowie 20 mM Tris und 2 mM EDTA, pH-Wert 8. Die Filter wurden luftgetrocknet und 2 Stunden bei 80ºC hitzebehandelt.
Die Duplikat-Filter wurden 2 h bei 55% mit 10 ml DNA- Hybridisierungspuffer, d. h. 5 · SSC, pH 7,0, 5 · Denhardt-Lösung (jeweils 1 · 0,02% Polyvinylpyrrolidon, Ficoll und Rinderserumalbumin), 50 m M Natriumphosphat-Puffer, pH 7,0, 5 mM EDTA, 0,1% SDS und 100 ug/ml Hefe-RNA, vorhybridisiert. Der Vorhybridisierungs-Puffer wurde entfernt und die Proben wurden mit einem Gemisch von Kinase-behandelten Sunden unter Bedingungen hybridisiert, die von der gewünschten Stringenz abhingen. Insgesamt wurde eine Radioaktivität von etwa 2 · 10&sup6; CpM/ml verwendet. Typische Bedingungen geringer Stringenz umfaßten eine 24- bis 36-stündige Hybridisierung in 50% Formamid bei einer Temperatur von 42ºC, wobei ein eine Sonde enthaltender DNA-Hybridisierungspuffer in einer Menge von 1- 5 ml/Filter verwendet wurde. Für eine höhere Stringenz wurden höhere Temperaturen und kürzere Zeiten verwendet. Bevorzugte Hybridisierungsbedingungen umfaßten die Hybridisierung der Sonden mit den Filtern in 5 · SSC (Citrat enthaltende Standard-Kochsalzlösung), Denhardt- Lösung, 50 mM NaPO&sub4;, pH-Wert 7,0, 5 mM EDTA, 0,1% SDS und 100 mg/ml Hefe- RNA, die Nacht über bei 55ºC. Danach wurden die Filter zweimal mit 2 · SSC, 0,1% SDS und 50 mM Natriumphosphat-Puffer, pH-Wert 7, jeweils 30 min bei Raumtemperatur gewaschen, danach wurden sie einmal mit 2 · SSC und 0,1% SDS bei 50ºC gewaschen und luftgetrocknet. Schließlich wurden die Filter einer 36-stündigen Autoradiographie bei -70ºC unterworfen.
Die bei der Autoradiographie erhaltenen Ergebnisse zeigten einen einzigen positiven Plaque. Unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Wasch- und Hybridisierungsbedingungen wurden mehrere plaquegereinigte Lambda gt11-Isolate identifiziert und abgenommen. Aus einem davon, der als GAP 6 bezeichnet wurde, wurde virale DNA wie folgt erhalten. GAP 6 wurde in hoher Dichte auf einem Rasen des E.coli-Stamms Y 1090 (r&supmin;) ausplattiert. Nach Lyse von E. coli wurden Phagenpartikel in SM-Puffer (0,1 M NaCl, 8,1 mM MgSO&sub4;, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,01% Gelatine) eluiert, indem E. coli mit Puffer bedeckt wurde und die Platte mehrere Stunden in der Kälte inkubiert wurde. Zur Entfernung von Zelltrümmern wurde das Phagenpartikel enthaltende Lysat 20 min bei 11 500 · g zentrifugiert und der erhaltene Überstand wurde unter Verwendung von Standardverfahren ausgetitert. Es wurde ein Titer von 2 · 10¹&sup0; plaquebildenden Einheiten (PFU)/ml bestimmt. Schließlich wurde mittels des Verfahrens von Maniatis et al., vorstehend, Phagen-DNA isoliert.

5. Charakterisierung von GAP 6

GAP 6 wurde in einem geeigneten Vektor subcloniert, um die DNA sowohl im Hinblick auf EcoRI-Restriktionsstellen als auch auf die partielle DNA-Sequenz zu charakterisieren. Obwohl die GAP 6-DNA in verschiedenen Vektoren cloniert werden kann, wurde sie in der vorliegenden Erfindung in M13 cloniert. Insbesondere wurde die GAP-DNA in einen M13-Vektor wie folgt cloniert. GAP-6-DNA wurde mit dem Enzym EcoRI behandelt; wobei zwei Fragmente von etwa 2,0 kb und 0,24 kb erzeugt wurden. Diese Fragmente wurden unter Verwendung von Agarose-Gel-Standardverfahren isoliert und in M13mp18 ligiert. Der M13-Vektor wurde so entworfen, daß Vektoren ohne DNA- Insertionen unter geeigneten Kulturbedingungen blau erscheinen, während Vektoren mit einer DNA-Insertion farblos sind.
Die ligierten M13mp18-Phagen wurden in den gefrorenen kompetenten E. coli-K12-Stamm DG98 transduziert und durch Ausplattieren auf Medien gezüchtet, die von Sigma Chem. (St. Louis, MO) erhaltenes Isopropylthiogalactosid (IPTG) in einer Konzentration von 5 · 10&supmin;&sup4; M und 40 ug/ml X-gal enthielten. Nicht-alpha-komplementierende weiße Plaques wurden auf frische Medien übertragen. Minikulturen wurden nach rekombinanter einzelsträngiger Phagen-DNA abgesucht, die Insertionen enthielt.
Die weißen M13-Plaques wurden mittels direkter Gelelektrophorese nach Insertionen abgesucht. Das letztere Verfahren wurde im wesentlichen so, wie von J. Messing, Methods of Enzymology, 101 (1983), 20, beschrieben, durchgeführt. Mit Hilfe dieses Verfahrens wurden vier M13mp18-Subclone identifiziert. Die beiden Subclone GAP 2 und GAP 8 enthielten das 2 kb- Fragment in beiden Orientierungen. Die restlichen beiden Subclone GAP 12 und GAP 18 enthielten das 0,24 kb-Fragment in beiden Orientierungen.
Die partielle DNA-Sequenz von GAP 2 und GAP 8 wurde mit Hilfe des vorstehend beschriebenen Verfahrens von F. Sanger, S. Nicklen und H. R. Coulson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977), 5463-5467, bestimmt:

6. Identifizierung von GAP-DNA-Sequenzen, die länger als GAP 6 sind

Allgemeines Verfahren: Zur Identifizierung von Plaques, die cDNA- Insertionen enthalten, die größer sind als die in GAP 6 vorhandenen, wurde ein neuartiges Verfahren verwendet, das die Aufklärung von Insertionen umfaßte, die entweder in der vorstehend beschriebenen Lambda-gt11-Genbank oder in der nachstehend beschriebenen Lambda-gt10-Genbank vorhanden waren. Das Verfahren umfaßte die Synthese von cDNA-Insertionen unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion oder PCR, wobei DNA- Oligonucleotide, die zum 5'-Bereich von GAP 6 komplementäre Sequenzen aufwiesen, und Oligonucleotid-Primer verwendet wurden, die die EcoRI- Insertionsstellen von Lambda gt11 oder Lambda gt10 flankierten. Die neu identifizierten PCR-Produkte wurden sequenziert und dementsprechend wurden DNA-Sonden synthetisiert, die Sequenzen des 5'-Bereiches von GAP 6 aufwiesen. Diese Sonden wurden ihrerseits zur Identifizierung von Plaques verwendet, die größere GAP-cDNA-Sequenzen enthielten. Das Verfahren wurde mehrmals wiederholt, wobei DNA-Sequenzen als Sonden verwendet wurden, die in 5'-Richtung zu GAP-6 zunehmend weiter entfernte Bereiche umfaßten und in jedem neuen Synthese-Zyklus von cDNA-Insertionen identifiziert wurden.
Eine PCR ist in den US-Patenten 4,683,202 und 4,683,195 beschrieben.
Im allgemeinen umfaßt die Synthese/Amplifikation von DNA-Sequenzen mittels PCR eine enzymatische Kettenreaktion, die eine spezifische DNA- Sequenz in exponentiell wachsenden Mengen erzeugt, vorausgesetzt, daß die Enden der Sequenz ausreichend genau bekannt sind, so daß damit hybridisierende Oligonucleotid-Primer synthetisiert werden können, und daß ein Teil der Sequenz zur Initiierung der Kettenreaktion verfügbar ist. Ein Primer ist zum Negativ-Strang komplementär und der andere zum Positiv- Strang. Bei Anwendung auf die vorliegende Erfindung sind die eingesetzten Primer zum 5'-Ende von GAP 6 komplementär bzw. zu den EcoRI-Stellen von Lambda gt11 oder Lambda gt10 und flankieren diese. Da in beiden Vektoren die Orientierung einer einzelnen cDNA-Insertion nicht bekannt ist, war es erforderlich, getrennte Reaktionen mit Oligonucleotiden durchzuführen, die beide Seiten der EcoRI-Stelle flankieren. Beispiele für Primer, die sich bei Lambda gt11 verwenden lassen, sind die von New England Biolabs hergestellten 24 Basen umfassenden Sequenzierungsprimer 1218 und 1222. Ebenso sind von New England Biolabs auch für Lambda gt10 geeignete Primer erhältlich, nämlich 1231 und 1232. Daher wurden getrennte Reaktionen mit entweder 1218 und 1219 oder 1231 und 1232 sowie dem entsprechenden GAP-6-Primer durchgeführt.
Die Primer wurden an denaturierte DNA angelagert und anschließend erfolgte eine Verlängerung mit einem geeigneten DNA-Polymerase-Enzym, wie dem großen Fragment von DNA-Polymerase I (Klenow) oder vorzugsweise einer DNA-Polymerase, die in Gegenwart von Detergentien und Nucleotiden stabil ist, was zu die Zielsequenz enthaltenden, neu synthetisierten Plus- und Minus-Strängen führte. In einer anderen Ausführungsform kann ein in thermostabilen Bakterien vorkommendes thermostabiles Enzym verwendet werden. Das Enzym kann unter Verwendung von DNA- Rekombinationstechniken hergestellt werden, wie in der am 2. März 1988 veröffentlichten Europäischen Patent-Veröffentlichung Nr. 258017 beschrieben. Da die neu synthetisierten Sequenzen auch Matrizen für die Primer darstellen, führen wiederholte Denaturierungs-, Primeranlagerungs- und Verlängerungszyklen zu einer exponentiellen Anreicherung des durch die Primer definierten Bereiches. Mittels einer PCR werden daher gesonderte Nucleinsäure-Duplexmoleküle von cDNA-Insertionen erzeugt, die Termini aufweisen, die den Enden der eingesetzten spezifischen Primer entsprechen.
Obwohl eine PCR unter Verwendung verschiedener Reaktionsbedingungen durchgeführt werden kann, wie in den vorstehend angegebenen Literaturstellen beschrieben, sind die bevorzugten Reaktionsbedingungen wie folgt. Mit einer speziellen Sonde hybridisierende Plaques werden entweder in 0,5 ml Wasser oder 0,5 ml SM-Puffer eluiert und 50 ul des Eluats werden mit 10 ul 10 · PCR-Puffer, 1,5 ul 10 mM dNTPs, 1 ul eines ersten Primers und 1 ul eines zweiten Primers mit jeweils einer Menge von etwa 20 pMol und 0,2 ul Taq- Polymerase, dem Äquivalent einer Aktivitäts-Einheit, kombiniert. Das Endvolumen beträgt 100 ul. 10 · PCR-Puffer besteht aus 500 mM KCl, 200 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,4, 25 mM MgCl&sub2; und 1 mg/ml.
GAP-codierende Sequenzen: GAP-6-DNA wurde sequenziert und eine auf dieser Sequenz basierende Oligonucleotid-Sonde, GW50, wurde synthetisiert, radioaktiv markiert und zum erneuten Absuchen der Clontech-Lambda-gt11- Genbank und zum Absuchen einer zweiten, aus K562-Zellen hergestellten cDNA-Genbank verwendet. K562-cDNA wurde in Lambda gt10 cloniert, wobei diese Genbank von Mes-Masson et al. in den Proceedings of the National Academy of Sciences, 83 (1986), 9768, beschrieben ist.
Das Oligonucleotid GW50 besitzt die folgende Sequenz:
Die Hybridisierung von GW50 mit beiden Genbanken wurde wie vorstehend beschrieben, durchgeführt, wobei allerdings die Wasch-Schritte nach der Hybridisierung unter stringenteren Bedingungen durchgeführt wurden. Insbesondere wurden die Plaques enthaltenden Filter zweimal mit 0,1% SDS enthaltendem 2 · SSC jeweils 15 min bei Raumtemperatur gewaschen und dann folgten zwei weitere, jeweils 15-minütige Wasch-Schritte mit 0,1% Natriumdodecylsulfat enthaltendem 0,2 · SSC bei 55ºC. Eine Autoradiographie der von der Clontech-Genbank angefertigten Filter zeigte 160 positive Plaques, während in der K562-Genbank nur ein Plaque nachgewiesen wurde.
Unter Verwendung der GAP-6-Sequenz wurden die DNA-Primer LC121 und LC122 mit zum 5'-Bereich von GAP 6 komplementären Sequenzen synthetisiert.
LC121 entspricht dem 5'-Ende von GAP 6 in Antisense-Richtung.
Die 163 positiven Plaques aus der Clontech-Genbank und der eine positive Plaque aus der K562-Genbank wurden unter Verwendung einer Pasteur-Pipette von den Agarose-Platten entfernt und 30 min in 0,5 ml SM-Puffer eluiert. Unter Verwendung von LC121 in Kombination mit den entsprechenden Lambda-Primern wurde dann jedes Isolat mittels PCR bearbeitet, wie vorstehend beschrieben. Typischerweise wurde ein Denaturierungschritt 2 min bei 94ºC durchgeführt, dem sich ein 30-sekündiger Anlagerungsschritt bei 55ºC und ein 5-minütiger Verlängerungsschritt bei 72ºC anschlossen. Meistens wurden 30 Zyklen der Umsetzung durchgeführt. Die erhaltenen amplifizierten eDNA-Insertionen wurden sequenziert.
Die Sequenzierung kann unter Verwendung der vorstehend erwähnten Verfahren oder mit Hilfe einer direkten Sequenzierung der mittels PCR erzeugten einzelsträngigen DNA durchgeführt werden.
Typischerweise wurden etwa 50 ul des PCR-Umsetzungsgemisches auf einem TAE enthaltenden 1%-igen Agarose-Gel getrennt, der die amplifizierten Produkte enthaltende Gelbereich wurde ausgeschnitten und die PCR-Produkte wurden aus der Agarose extrahiert und in etwa 10 ul-20 ul TE-Puffer suspendiert. Im allgemeinen wurde etwa ein Zehntel dieses Volumens einer asymmentrischen PCR-Amplifikation unterworfen. Die verwendeten Reaktionsbedingungen sind in der vorstehend zitierten Patentanmeldung beschrieben. Die Primer wurden typischerweise in einem Verhältnis von etwa 100 : 1 oder etwa 50 pMol : 0,5 pMol verwendet.
Unter Verwendung von LC121 stellte sich heraus, daß 14 der 163 Lambda- gt11-Plaques in 5'-Richtung zu GAP 6 zusätzlich 320 oder noch mehr Basenpaare aufwiesen, während der einzige aus der K562-Lambda gt10- Genbank isolierte, als K16 bezeichnete Plaque eine cDNA-Insertion aufwies, die zusätzlich 700 Basenpaaren in 5'-Richtung dazu umfaßte. Auf der Basis der letzteren Sequenz wurden mehrere zusätzliche Oligonucleotide, LC136, LC138 und LC140, synthetisiert und zusammen mit LC121 zum erneuten Absuchen der 163 Plaques aus der Clontech-Genbank verwendet. Die Primer besaßen die folgenden Sequenzen:
Das erneute Absuchen der 163 Plaques mit LC136 zeigte, daß 82 Plaques positiv waren, während das erneute Absuchen mit LC138 und LC140 zeigte, daß 63 der Plaques positiv waren. 38 der 63 positiven Plaques wurden einer PCR unter Verwendung der Primer 1218 und LC138 sowie 1222 und LC138 unterworfen. Es stellte sich heraus, daß sechs davon lange Bereiche der in 5'- Richtung zu GAP 6 gelegenen DNA aufwiesen. Eine Sequenzierung in M13mp18 zeigte, daß sie Fragmente unterschiedlicher Länge des gleichen Transkript- Typs darstellten. Zwei der Clone, der Clon 7 und der Clon 101, wurden genauer untersucht. Die in Clon 101 enthaltene DNA reicht aus, ein Protein von 1047 Aminosäuren zu codieren, das ein Molekulargewicht von 116 000 Dalton aufweisen würde. Dies entspricht etwa dem Molekulargewicht des GAP- Proteins, das wie vorstehend beschrieben, aus menschlicher Plazenta aufgereinigt worden war. Clon 101 enthielt daher eine GAP-eDNA voller Länge. Clon 101 wurde sequenziert und die Sequenz ist in Fig. 5 gezeigt. Clon 7 wurde auch sequenziert, wobei sich zeigte, daß er eine mit Clon 101 identische Sequenz aufwies, ihm jedoch 33 Basenpaare vom 5'-Ende fehlten.
Bei den 163 Plaques wurden außer den vorstehenden Clonen zwei Plaques identifiziert, bei denen anfangs bestimmt worden war, daß sie mit GW50 positive Ergebnisse zeigten, und die weitere, aus 65 Basenpaaren bestehende cDNA-Insertionen enthielten, die zwischen den Nucleotiden 537 und 538 des Clons 101 insertiert waren. In einem dieser beiden Clone, dem Clon 16, fehlten die ersten 180 Aminosäuren von Clon 101, während in dem andren Clon, dem Clon "Sleepy", mindestens die ersten 180 Aminosäuren fehlten, wobei dieser außerdem etwa an der Base 2448 von Clon 101 ein verkürztes 3'-Ende besaß. Die DNA-Sequenz der 65 Basenpaar-Insertion im Clon 16 ist in Fig. 6 gezeigt.

7. Expression von GAP

Lambda-Lysogene: In Lysaten von Lambda-Lysogenen der Clone 7, 16 und 101 wurde GAP-Aktivität nachgewiesen. Die Lysogene wurden in dem E. coli- Stamm Y1089 erzeugt. Die Verfahren zur Züchtung, Induktion, Ernte und Lyse der Zellen sind von T. Huynh et al. in "DNA Cloning Techniques: A Practical Approach" (Herausgeber D. Glover) (1985), S. 49-78, IRL Press, Oxford, beschrieben.
Kurz zusammengefaßt, wurden von Lysaten erhaltene Überstände gegen GAP-Testpuffer dialysiert, der aus 20 mM Tris-HCl, ph-Wert 7,0, 1 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM DTT, 0,1% NP40 und 100 uM PMSF bestand, und die GAP-Aktivität wurde unter Verwendung des vorstehend beschriebenen, auf einer Dünnschichtchromatographie (TLC) basierenden GTPase-Tests bestimmt. Entweder normales N-ras-p21-Protein, das an Position 12 einen Glycin-Rest besaß, oder p21-Mutantenproteine, bei denn der Glycin-Rest gegen einen Asparaginsäure- oder Valin-Rest ausgetauscht worden war, wurden in einer Konzentration von 2,2 uM mit 0,25 uM [α-³²P]-GTP (800 Cl/mmol) 15 min bei 37ºC in Gegenwart oder Abwesenheit von Lambda-Lysat inkubiert. Wie vorstehend diskutiert, besitzen die p21-Mutantenproteine Transformationsaktivität und zeigen keine signifikante GAP-stimulierbare GTPase-Aktivität. Etwa 10 ul Lysat oder GAP-Testpuffer wurden zugegeben und nach 1 Stunde bei Raumtemperatur wurde p21 immunpräzipitiert und die assoziierten Nucleotide wurden mittels Chromatographie auf PEI-Cellulose in 1 M LiCl analysiert. Eine zusätzliche Kontrolle der GAP-Aktivität wurde durchgeführt, die das Testen eines irrelevanten Lysogen-Lysats, speziell von Lambda gt11 ohne eine cDNA-Insertion, umfaßte. Die Ergebnisse für die Clone 7 und 101 sind in Fig. 7 gezeigt. Der obere Teil von Abbildung A zeigt die Ergebnisse für Clon 7, während der untere Bereich der Abbildung die Ergebnisse für Clon 101 zeigt. Es ist offensichtlich, daß Lysate beider Clone die Hydrolyse von GTP zu GDP in Gegenwart von normalem p21 stimulieren, nicht jedoch in Gegenwart von p21-Mutantenproteinen. Außerdem gab es keine Wirkung auf die GTP-Hydrolyse, wenn normales p21 oder die Mutanten gegen GAP-Puffer ausgetauscht wurden. Auch das nicht-relevante Lysogen-Lysat unterstützte die GTP-Hydrolyse nicht.
Transfektion von Spodoptera frugiperda: Die cDNA-Insertion voller Länge in Clon 101 wurde in Spodoptera frugiperda-Insektenzellen exprimiert. Die Insektenzellinie Sf9 wurde mit dem Baculovirus-Expressionsvektor pAcC12 transfiziert, der das GAP codierende Eco RI-Fragment von Clon 101 enthielt, und in Zellextrakten wurde die GAP-Aktivität bestimmt.
Der Baculovirus-Vektor pAcC12 wurde aus vorher vorhandenen Vektoren, insbesondere pAc311 und pAc373, konstruiert, die von Luckow und Summers in Biotechnology, Bd. 6 (1988), S. 47, im US-Patent Nr. 4,74,051 sowie in EPA 127,839 beschrieben sind. Weitere Einzelheiten sind von Summers und Smith in "A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures" (Mai 1987), Texas Agricultural Experimental Station Bulletin Nr. 1555, beschrieben.
pAcC12 wurde so konstruiert, wie nachstehend beschrieben und in Fig. 8 gezeigt. Der Transfervektor pAc311 wurde unter Verwendung von M13- Mutageneseverfahren einer ortsgerichteten Mutagenese unterworfen, um das ATG-Initiationscodon des Polyhedron-Gens in ATT umzuwandeln. Der erhaltene Vektor wurde als pVL941 bezeichnet und ist von Luckow und Summers in der Veröffentlichung mit dem Titel "High Level of Expression of Non-Fused Foreign Genes with Autographa Californica Nuclear Polyhedrosis Virus Expression Vectors" in Virology, 170 (I) (1989), 31, genau beschrieben. Ein Polylinker wurde in pVL941 an einer nur einmal vorkommenden BamHI-Stelle 30 Basenpaare stromabwärts von der ATT-Sequenz insertiert. pVL941 wurde mit BamHI gespalten und der Polylinker, der aus den beiden komplementären, selbst-hybridisierenden Oligomeren EK 129 und EK130 mit den nachstehend gezeigten Sequenzen bestand, wurde damit ligiert, wobei die Vektoren pAcC8 und pAcC9 erzeugt wurden, die den Polylinker in unterschiedlichen Orientierungen tragen. Der Polylinker besitzt eine Restriktionsstelle sowohl für Eco RI als auch für andere Restriktionsenzyme.
Da pAcC8 und pAcC9 zwei EcoRI-Restriktionsstellen besitzen, eine im Polylinker und die andere in der Plasmid-DNA, wie in Fig. 8 gezeigt, war es wünschenswert, die EcoRI-Stelle des Plasmids zu entfernen, so daß das GAP codierende EcoRI-Fragment von Clon 101 in die Polylinker-Stelle cloniert werden konnte. Das wurde unter Verwendung des Transfervektors pAc373 erreicht. pAc373 ist pAc311 ähnlich, wobei sich allerdings die das Polyhedron- Startcodon umfassenden Nucleotidsequenzen unterscheiden. Die EcoRI-Stelle wurde daher aus pAc373 entfernt, indem der Vektor vollständig mit EcoRI gespalten wurde und die Enden unter Verwendung des Klenow-Fragments unter geeigneten Reaktionsbedingungen geglättet wurden. Nach Ligierung und Transformation in E. coli DH5 wurden mittels einer Restriktionsanalyse von DNA aus Minipräparationen Kolonien identifiziert, denen die EcoRI-Stelle fehlte.
pAc373, dem die EcoRI-Stelle fehlte, wurde durch Einbau des aus den vorstehend gezeigten Oligomeren EK 129 und EK 130 bestehenden Polylinkers weiter modifiziert, indem der Vektor mit BamHI gespalten wurde und anschließend die Oligomeren damit ligiert wurden. Die erhaltenen Vektoren pAcC6 und pAcC7 enthalten den Polylinker in unterschiedlichen Orientierungen.
Das Endkonstrukt pAcC12 wurde aus pAcC7 und pAcC9 erzeugt, wie in Fig. 8 gezeigt. Diese Vektoren enthalten den Polylinker in der gleichen Orientierung. Beide Vektoren wurden mit Bst EII und EcoRI gespalten und die erhaltenen Fragmente wurden elektrophoretisch aufgereinigt. Das Bst EII/EcoRI- Fragment, das die pUC8-Sequenzen und partielle Polylinker-Sequenzen enthielt, wurde an das große Bst EII/EcoRI-Fragment von pAcC9 ligiert. Das letztere Fragment enthält die ATT-Sequenz und die restlichen Polylinker- Sequenzen.
Das EcoRI-GAP-Fragment von Clon 101 war im Transfervektor pAcC12 in beiden Orientierungen insertiert. Der Vektor mit der richtigen Orientierung wurde als pAcC12 GAP 5 bezeichnet, während der Vektor mit der falschen Orientierung als pAcC12GAP 101-7 bezeichnet wurde. 2 · 10&sup5; Sf9-Zellen wurden mit jedem Plasmid in einer Menge von etwa 2 ug transfiziert, die Zellen wurden 4 Tage gezüchtet und mittels Zentrifugation isoliert und Zellextrakte wurden mittels Solubilisierung des Zellpellets hergestellt. Die bevorzugte Solubilisierungslösung bestand aus 0,5% NP40, 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, und 150 mM NaCl. Der Extrakt wurde 15 min bei 15 000 · g zentrifugiert und Aliquots davon wurden in GAP-Testpuffer verdünnt und auf GAP-Aktivität getestet, wie vorstehend beschrieben. Verfahren zur Züchtung von Sf9-Zellen sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt, wobei die genauen Verfahren für ihre Kultivierung in M. Summers und G. Smith, "A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures" (Mai 1987), Texas Agricultural Experiment Station, Bulletin-Nr. 1555, oder in der G. E. Smith und M. D. Summers erteilten EPO 127,839 zu finden sind. Bevorzugte Medien und Kulturbedingungen lassen sich in der am 9. Februar 1989 veröffentlichten internationalen Veröffentlichung Nr. WO89/01029 mit dem Titel "Airlift Insect Cell Culture" und in der am 8. Februar 1989 veröffentlichten Internationalen Veröffentlichung Nr. WO89/01027 mit dem Titel "Lipid Microemulsions for Culture Media" finden, die beide gleichfalls anhängig sind und von denselben Anmeldern stammen.
Fig. 7, Abbildung B, zeigt die Ergebnisse. Die Wirkung von pAcGAP 5 und pAcGAP 101-7 ist in den Laufspuren 1 bzw. 2 gezeigt, wobei Laufspur 3 eine Pufferkontrolle zeigt. Man beachte, daß pAcGAP 5 die GTPase-Aktivität von normalem ras-p21 stimuliert, während es auf die p21-Mutanten keine Wirkung ausübt. Im Gegensatz dazu stimuliert pAcGAP 101-7 weder die GTPase-Aktivität von normalem ras-p21-Protein noch die von Mutanten.
Es ist wichtig zu erwähnen, daß das Baculovirus unter Verwendung der von Summers und Smith, vorstehend, beschriebenen Verfahren aus Sf9-Zellen gewonnen werden kann, die mit den vorstehend beschriebenen Transfervektoren transfiziert worden sind. Ein solches Virus kann zur direkten Transformation von Zellen mit dem entsprechenden GAP-Clon verwendet werden.

Synthese von Peptidsequenzen

Zur Bestimmung der aktiven Stelle von GAP für die Bindung an das ras-p21- Protein, den ras-p21-GDP-Komplex oder den ras-p21-GTP-Komplex wurden mehrere Fragmente von Clon 101 synthetisiert und getestet. Peptide können mit Hilfe von auf dem Fachgebiet wohlbekannten Verfahren synthetisiert werden. Das bevorzugte Peptidsynthese-Verfahren ist das von Merrifield, R. B., Sci., 232 (1985), 341-347, genauer beschriebene Festphasen-Verfahren auf einer automatischen Biosearch 9500-Peptidsynthese-Vorrichtung, wobei mit Fluorwasserstoff gespalten wird und eine Aufreinigung mittels einer präparativen HPLC unter Verwendung einer Waters-Delta-Prep-3000- Vorrichtung auf einer 15 um-20 um-Vydac-C4-PrepPAK-Säule erfolgt. Ein alternatives Verfahren erfolgt mittels einer automatischen ABI- Synthesevorrichtung.
Auf diese Weise wurden Peptide synthetisiert, die den Positionen 876-890 (als Peptid G65 bezeichnet), 975-990 (als Peptid G73 bezeichnet), 891-906 (als Peptid 891 bezeichnet) und 890-906 (als Peptid cGAP 13 bezeichnet) von GAP voller Länge entsprachen (Fig. 9 zeigt die Positionen der Peptidsequenzen; Fig. 10 stellt die entsprechenden Positionen tabellarisch dar). Diese Peptide wurden auf ihre Fähigkeit getestet, die GTP-Hydrolyse durch das ras-p21- Protein in Gegenwart oder Abwesenheit von GAP zu beeinflussen. Es stellte sich heraus, daß die Peptide 891 und cGAP 13 sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von GAP die Stimulation der GTP-Hydrolyse durch p21 hemmten, während die anderen Peptide keine Wirkung auf die Umsetzung ausübten. Peptid 891 besitzt die folgende Aminosäuresequenz: MRTRVVSGFVFLRLIC. Abgesehen von dem zusätzlichen Threonin-Rest am Peptid-Anfang besitzt cGAP 13 die gleiche Sequenz wie Peptid 891. Wie in Fig. 11 gezeigt, wurde cGAP 13 aus den vereinigten, von der Vydac-C4-PrepPAK-Säule gesammelten Fraktionen 43 bis 46 gewonnen. Die Aminosäureanalyse von cGAP 13 ist in Fig. 12 gezeigt. Eine Massenspektrometer-Analyse von cGAP 13 ist in Fig. 13 gezeigt. Es ist erwähnenswert, daß eine signifikante Menge von Methoxybenzyl-Gruppen vorliegt.

Bestimmung von Peptidsequenzen, die die GTP-Hydrolyse durch ras-p21 sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von GAP hemmen können

Die vorstehenden vier Peptide wurden in den folgenden zwei Experimenten auf ihre Fähigkeit zur Hemmung der GTP-Hydrolyse durch das ras-p21-Protein in Gegenwart und Abwesenheit von GAP getestet. Das erste Experiment umfaßte die Peptide G65, G73 und 891. Es wurde wie folgt durchgeführt: aufgereinigtes ras-p21-Wildtyp-Protein wurde mit 0,25 uM gamma-³²P-GTP in 100 mM NaPO&sub4;, pH-Wert 6,8, 0,5 mM DTT, 0,5 mM EDTA, 0,005% Na-cholat und 0,5 mg/ml BSA 15 min bei 30ºC inkubiert. Danach wurde das Gemisch mit TNM-Puffer (umfassend 20 mM Tris-HCl, pH 7,0, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl&sub2;) zehnfach verdünnt. 20 u.l (0,05 ug p21) des Gemisches wurden dann mit 2 ul Peptid in 25 mM NaOAc, pH- Wert 5,5, kombiniert und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Der GAP-Test wurde durch Zugabe von 12 ng GAP in 5 ul TNM-Puffer, der 1 mg/ml BSA enthielt, oder in 5 ul TNM-BSA-Puffer für GAP-unabhängige Umsetzungen eingeleitet und das erhaltene Gemisch wurde 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proben wurden dann durch Nitrocellulose-Membranen filtriert und dreimal mit kaltem TNM gewaschen. Die Filter wurden getrocknet und die Anzahl ihrer radioaktiven Impulse wurde bestimmt. Auf den Daten basierende Graphiken sind in Fig. 14 gezeigt. Die y-Achse in den Diagrammen zeigt die Anzahl radioaktiver Impulse pro Minute für den radioaktiven ras-p21-GTP- Komplex. Die x-Achse zeigt die in nMol angegebene Menge der zugegebenen Peptide. Das erste Diagramm dient als Kontrolle. In Gegenwart von GAP wird der radioaktive ras-p21-GTP-Komplex zu GDP und dem ras-p21-Protein hydrolysiert, wodurch sich die resultierende Menge von an das Filter gebundenem radioaktivem p21-GTP verringert und folglich die radioaktiven Impulse nachgewiesen werden. In Abwesenheit von GAP bleibt die Anzahl radioaktiver Impulse aufgrund der fehlenden GAP-stimulierten Hydrolyse relativ hoch. Es ist wichtig zu erwähnen, daß selbst in Abwesenheit von GAP das Peptid allein die GTP-Hydrolyse durch das ras-p21-Protein signifikant hemmt, wie in Fig. 14 gezeigt. Die Diagramme zeigen, daß die Peptide G65 und G75 die GTP-Hydrolyse nicht beeinflussen. Peptid 891 übt jedoch eine negative Wirkung auf die GTP-Hydrolyse aus.
Um die Wirksamkeit von cGAP 13 und Peptid 891 bei der Verhinderung der GTP-Hydrolyse zu vergleichen, wurde ein anderes Experiment wie folgt durchgeführt. Bei dem Test wurde das Verhältnis des gebildeten, aus der GTP- Hydrolyse resultierenden GDP zu dem GTP-Rest in der Testlösung bestimmt. Die Peptide 891, cGAP 13 und G65 wurden separat in Gegenwart und Abwesenheit von GAP getestet. Dabei wurden Peptid G65, das als Kontrolle diente, und α-32P- GTP verwendet.
Der Test wurde wie folgt durchgeführt. p21-GTP wurde in einem Verhältnis von 1 : 10 in einem Testpuffer verdünnt, der aus TNM, pH-Wert 7,0, 1 mM DTT und 100 uM GTP bestand. Ein Gemisch wurde hergestellt, das aus 20 λ p21 in einer Konzentration von 0,25 uM und 2 λ Peptid (in TNM, 1 mM DTT und 100 uM GTP) bestand. Dem Gemisch wurden 5 λ, d. h. 12 ng von in TNM und lmg/ml BSA verdünntem GAP, zugegeben. Bei Experimenten ohne GAP wurden stattdessen 5 λ TNM/BSA zugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Umsetzung wurde gestoppt und die Nucleotide wurden vom ras-p21-Protein mit 2% SDS, 40 mM EDTA 5 min bei 65ºC eluiert. Die Nucleotide wurden einer Chromatographie auf PEI-Cellulose in 1 M LiCl unterworfen. GTP- und GDP-Flecken wurden mittels Autoradiographie sichtbar gemacht und mittels Standard-Lösungen identifiziert. Die einzelnen Flecken wurden von den PEI-Cellulose-Platten abgekratzt und die Radioaktivität wurde bestimmt.
Das Verhältnis radioaktiver Impulse von GDP zu denen von GTP wurde in Stabdiagrammen aufgetragen (Fig. 15), wobei sich zeigt, daß sowohl das Peptid 891 als auch cGAP 13 in Konzentrationen von 50 uM bis 100 uM die Hydrolyse von p21-GTP und daher die GDP-Produktion deutlich hemmen. Bei Peptid-Konzentrationen von 10 uM wurde eine geringfügige Hemmung beobachtet. Die vorstehenden Hemmwirkungen wurden in Gegenwart von GAP beobachtet. Bei Abwesenheit von GAP gibt es eine kleine, jedoch signifikante Veränderung in der im Bereich der verwendeten Peptidkonzentrationen gebildeten GDP-Menge. Die Kontrolle G65 zeigte in Gegenwart von GAP keine Hemmwirkung auf die p21-GTP-Hydrolyse.

Peptid-vermittelte Abspaltung von GDP vom ras-p21-GDP-Komplex

Die Peptide 891 und cGAP 13 vermitteln die Abspaltung von GDP vom ras- p21-GDP-Komplex, nicht jedoch die Abspaltung des nicht-hydrolysierbaren GTP-Analogs GTPγS von einem ras-p21-GTPγS-Komplex. Die folgenden Experimente bestätigten die vorstehende Aussage. Als Kontrolle wurde Mastoporan (MP) verwendet. MP besitzt die folgende Sequenz INLKALAALAKKIL-NH&sub2;. Aus zwei Gründen wurde MP als Kontrolle gewählt. Erstens war MP wie Peptid 891 ein Peptid mit vier positiven Ladungen. Zweitens hatte sich gezeigt, daß MP eine Wirkung auf eine andere Klasse Guaninnucleotid-bindender Proteine, d. h. die GTP-Bindungs- Regulationsproteine (G-Proteine), ausübte. MP vermittelt die Abspaltung von GDP von den G-Proteinen (Higashijma, T., et al., J. of Biol. Chem., 263 (1988), 6491-6494, mit dem Titel "Mastoparan, A Peptide Toxin from Wasp Venom, Mimics Receptors by Activating GTP-binding Regulatory Proteins (G Proteins)").
Das Experiment wurde wie folgt durchgeführt: N-ras, ein Vertreter der ras- p21-Familie, wurde in 20 mM Tris, pH 7,5, 0,5 mM DTT, 0,1% NP40 und 1 mM EDTA mit 500 nM unmarkiertem GDP und 10 nM [α-³²P]-GDP 30 min bei 30ºC inkubiert. Dann wurde die MgCl&sub2;-Konzentration auf 5 mM eingestellt. Unmarkiertes GDP (100 uM) wurde zugegeben und die Inkubation wurde in 20 mM Tris, pH 7,5, 0,5 mM DTT, 0,1% NP40 und 5 mM MgCl&sub2; jeweils mit den folgenden Peptiden fortgeführt: 10 uM und 50 uM Peptid 891, 10 uM und 50 uM MP. Dem Kontrollmedium wurden keine Peptide zugegeben. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden 10 ul-Aliquots (0,5 pMole) mittels Filtration durch Nitrocellulose-Filter unter Verwendung eines 20 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl und 5 mM MgCl&sub2; enthaltenden Waschpuffers auf gebundenes [α-³²P]-GDP getestet. Die Ergebnisse sind in Fig. 16 gezeigt.
Wie in Fig. 16 gezeigt, stellen die Quadrate das Kontrollmedium ohne ein zugegebenes Peptid dar. Nach den ersten 5 min blieb in den Kontrollmedien die Anzahl radioaktiver Impulse von gebundenem [α-³²P]-GDP fast konstant. Die radioaktiven Impulse des Mediums, das MP in den beiden getesteten Konzentrationen enthielt, lagen dicht bei denen der Kontrollmedien. Im Vergleich dazu zeigte MP daher keine Wirkung auf die Abspaltung von gebundenem [α-³²P]-GDP. Im Gegensatz dazu nahm in Gegenwart von Peptid 891 die Menge von gebundenem [α-³²P]-GDP im Lauf der Zeit ab. Eine Erhöhung der Konzentration von Peptid 891 von 10 uM auf 50 uM bewirkte eine Zunahme der Rate und Menge von abgespaltenem GDP.
Das vorstehende Experiment wurde unter Verwendung von cGAP 13 durchgeführt, wobei ähnliche Ergebnisse erhalten wurden. Außerdem führte auch das gleiche Experiment unter Verwendung von H-ras, einem anderen Vertreter der ras-p21-Familie, zu ähnlichen Ergebnisse für die beiden Peptide 891 und cGAP 13.
Darüberhinaus wurde das vorstehende Experiment unter Verwendung von Peptid 891 und ras-p21-GTPγS wiederholt. Das Ergebnis ist in Fig. 17 gezeigt. Die Quadrate stellen das Kontrollmedium ohne zugegebenes Peptid dar. Die radioaktiven Impulse des Kontrollmediums lagen dicht bei denen von Peptid 891. Das Ergebnis zeigt daher, daß Peptid 891 keine Abspaltung von GTPγS von ras-p21-GTPγS bewirkt.

Diagnostische Verwendung von Pentidsequenzen

Die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Peptide können zum Testen auf das Vorkommen eines ras-p21-Proteins eingesetzt werden, insbesondere bei Tumoren mit einer Überexpression von normalem oder oncogenem ras-p21-Protein. Die Verfügbarkeit großer Mengen dieser Peptide stellt daher eine wertvolle Ergänzung der derzeitigen Krebs- Diagnoseverfahren dar. Dem Fachmann ist klar, daß sich beliebige Fragmente von Peptid 891 oder cGAP 13, die die Fähigkeit zur Bindung an das ras-p21- Protein oder einen ras-p21-GTP-Komplex beibehalten, und ein beliebiges Peptid, das mit Peptid 891 oder cGAP 13 um die Bindung an das ras-p21-Protein oder einen ras-p21-GTP-Komplex konkurriert, in dem im folgenden beschriebenen Test einsetzen lassen.
Beispielweise wurde das ras-p21-Protein mit Hilfe der Peptide 891 und cGAP 13 in folgender Weise getestet. Zuerst wurde ein markiertes ras-p21-GTP- Protein durch Inkubation einer 10 uM Lösung eines ras-p21-Proteins in 1 uM GTPγ³&sup5;S (1350 Cl/mmol) enthaltendem 20 mM Tris, pH-Wert 7,5, 1 mM Dithiothreit, 0,1 M NaCl, 0,1% NP40, 1 mM EDTA 30 min bei 30ºC hergestellt.
Das synthetische Peptid wurde auf Nitrocellulose-Filtern immobilisiert, indem 10 ul einer 1 mM Lösung (25 mM Na-acetat, pH 5,5) des Peptids unter Verwendung von Vakuumfiltration auf das Filter pipettiert wurden. Die Filter wurden in Blockierungspuffer, der 20 mM Tris, pH-Wert 7,5, 0,1% Rinderserumalbumin, 0,1% Ovalbumin und 0,05% Tween 20 enthielt, 30 min bei Raumtemperatur vorinkubiert. Die Filter wurden dann in 100 ul 20 mM Tris, pH-Wert 7,5, 0,1% NP40, 5 mM MgCl&sub2; überführt. Den Filtern wurden das freie Peptid in verschiedenen Konzentrationen von 1 uM bis 100 uM und 1 ul des ras- p21-GTPγ³&sup5;S-Präparates zugegeben. Nach einer 30-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurde der Puffer entfernt und die Filter wurden dreimal mit jeweils 1 ml eiskaltem 20 mM Tris, pH-Wert 7,5, das 5 mM MgCl&sub2; enthielt, gewaschen. Die Filter wurden getrocknet und die Anzahl radioaktiver Impulse pro Minute (CpM) wurde mittels eines Szintillationszählers bestimmt. Dem Fachmann ist bekannt, daß andere Testverfahren verwendet werden können. Beispielsweise kann das ras-p21-Protein mit einem Enzym oder einer fluorogenen Substanz markiert und mit Hilfe enzymatischer oder fluorometrischer Mittel untersucht werden.

Antikörper gegen die Peptide

Unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Standardverfahren wurden Antikörper gegen die Peptide cGAP 13 und 891 erzeugt. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung nehmen hiermit durch Bezugnahme das am 9. August 1988 McCormick et al. erteilte US-Patent Nr. 4,762,706 in den vorliegenden Text auf. Beispielsweise werden Antikörper erzeugt, indem einem Wirtstier, wie Kaninchen, Ratte, Ziege, Maus, usw., ein Peptid oder Peptidfragment injiziert wird. Vor Injektion werden die Peptide zuerst mit Keyhole-Limpet-Hämocyanin (Hämocyanin der Schlüsselloch-Napfschnecke) (KLH) oder Rinderserumalbumin (BSA) konjugiert. Die Konjugation wird über die Sulfhydryl- Gruppe im Cystein-Rest erreicht. Mittels des folgenden Verfahrens wurde ein heterobifunktionelles Vernetzungsreagens, N-Maleimido-6-aminocaproylester des Natriumsalzes von 1-Hydroxy-2-nitro-benzol-4-sulfonsäure, hergestellt. Ein Moläquivalent (2,24 g) des Natriumsalzes von 4-Hydroxy-3-nitrobenzolsulfonsäure (HNSA) wurde zusammen mit einem Moläquivalent (2,06 g) von Dicyclohexylcarbodiimid und einem Moläquivalent (2,10 g) von N- Maleimido-6-aminocapronsäure in 25 ml Dimethylformamid (DMF) die Nacht über bei Raumtemperatur gemischt. Es bildete sich ein weißes Dicyclohexylharnstoff-Präzipitat. Das Präzipitat wurde filtriert und der Mutterlauge wurden 300 ml Diethylether zugegeben. Nach etwa 10 min bis 4 Stunden präzipitierte ein gummiartiger Feststoff aus der Mutterlauge. Es stellte sich heraus, daß dieser Feststoff 58% aktiven HNSA-Ester und 42% freies HNSA enthielt.
Die Analyse umfaßte das Auflösen einer kleinen Menge des Präzipitats in Phosphatpuffer, pH-Wert 7,0, und die Bestimmung der Extinktion bei 406 nm; durch diesen Ablesewert wurde die Menge von nicht-umgesetztem freiem HNSA erhalten, das in dem HNSA-Ester-Präparat verunreinigendes Material darstellte. Durch die Zugabe sehr kleiner Mengen einer konzentrierten starken Base (wie 5 N NaOH) wurde der gebildete Ester sofort hydrolysiert und eine zweite Ablesung wurde vorgenommen. Durch Subtraktion des ersten Ablesewertes vom zweiten wurde die Ester-Menge im ursprünglichen Material bestimmt. Danach wurde der Feststoff in DMF gelöst und auf eine LH&sub2;O- Sephadex-Säule gegeben und mit DMF eluiert, so daß der Ester von verunreinigendem freiem HNSA getrennt wurde. Die fortschreitende Aufreinigung wurde mittels Dünnschicht-Chromatographie unter Verwendung von Chloroform, Aceton und Essigsäure (6 : 3 : 1 (Vol./Vol.)) als Elutionslösungsmittel kontrolliert. Aufgrund seiner Reaktivität mit einem Amin wurde das Produkt als mal-sac-HNSA-Ester identifiziert. Die Ausbeute an reinem Ester wurde auf etwa 30% der theoretisch erwarteten geschätzt. Das aufgereinigte Material bestand zu 99% aus dem Ester.
Es stellte sich heraus, daß der so erhaltene Ester sich in Wasser vollständig löste und in Wasser mehrere Stunden stabil blieb, vorausgesetzt, es wurden keine Nucleophilen zugegeben. Wenn der Ester in 1 N Ammoniak gegeben wurde, erzeugte er das entsprechende Amid, wobei ein Teil zur freien Säure hydrolysierte. Es stellte sich heraus, daß der aufgereinigte Ester bei trockener Aufbewahrung über längere Zeiträume stabil war.
Etwa 0,5 mg des aufgereinigten mal-sac-HNSA-Esters würden in 1 ml destilliertem Wasser gelöst. Ein 10 ul-Aliquot dieser Lösung wurde in 1 ml 10 mM Phosphatpuffer, pH-Wert 7,0, verdünnt. Die Extinktion bei 406 nm wurde, wie vorstehend beschrieben, zur Berechnung der Konzentration von freiem HNSA verwendet. Wenn 50 ul einer 4,8 N Natriumhydroxid-Lösung dem verdünnten Ester-Aliquot zugegeben und damit gemischt wurden, erhöhte sich die Extinktion der Lösung bei 406 nm signifikant, was darauf hindeutete, daß das nucleophile Hydroxid den Ester schnell zu seinem Säurebestandteil und dem freien HNSA-Anion hydrolysierte.
Der Unterschied zwischen der HNSA-Konzentration nach Basenzugabe und der Anfangskonzentration von freiem HNSA stellt die Ester-Konzentration dar. Aus der tatsächlichen Konzentration der Ester- und Protein-Aminogruppen kann die Menge des Esters berechnet werden, die der Protein-Lösung zugegeben werden muß, um den gewünschten Substitutionsgrad zu erreichen.
Der aufgereinigte HNSA-Ester wurde dann wie folgt mit BSA umgesetzt (die Umsetzung mit KLH war diesem Verfahren ähnlich):
Insgesamt 22 mg (20 uMol) BSA (mit einem Molekulargewicht von 66 296) wurden in 2,0 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH-Wert 7,5, gelöst, wobei eine Amin- Gesamtkonzentration von 1,0 · 10&supmin;² mol pro Liter erhalten wurde (wobei 59 Lysin-Reste/BSA-Molekül angenommen wurden). Eine berechnete Menge (11 mg, 2,35 · 10&supmin;&sup5; mol) des vorstehend hergestellten mal-sac-HNSA-Esters (mit einer Reinheit von 97,79%) in Pulverform wurde in 2,0 ml BSA-Lösung gelöst. Die Umsetzung wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. In bestimmten Zeitabständen wurden 10 ul-Aliquots aus der Lösung entfernt und jeweils in 1,0 ml 0,01 M Phosphatpuffer, pH-Wert 7,0, verdünnt. Das Spektrum jedes verdünnten Aliquots wurde unter Verwendung eines Hewlett-Packard- Spektrophotometers aufgezeichnet und die Extinktion bei 406 nm wurde gemessen. Jedem Aliquot wurden dann insgesamt 50 ul 4,8 N NaOH zugegeben, jedes Aliquot wurde gemischt und sein Spektrum wurde erneut aufgezeichnet und die Extinktion bei 406 nm wurde gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. TABELLE 1
Aus der Extinktion bei 406 nm vor und nach Zugabe einer Base wurden für die Umsetzungsgemische die Konzentration des verbliebenen Esters und der Prozentsatz des umgesetzten Esters bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, daß die Umsetzungsrate über einen Zeitraum von 15 min im wesentlichen linear ist.
Nach einer 15-minütigen Umsetzungszeit wurde die Umsetzung durch Auftragen des Umsetzungsgemisches auf eine PD10-Sephadex-G-25-Säule zum Entsalzen (Pharmacia, Inc.) abgebrochen, die mit 0,1 M Phosphatpuffer, pH- Wert 6,0, äquilibriert worden war. Es stellte sich heraus, daß 2,6 · 10&supmin;³ mol/l des Esters umgesetzt worden waren und daher 25,9% der 59 Epsilon-Aminogruppen von BSA vermutlich substituiert worden waren. Das Produkt enthielt daher 16 mal-sac-Gruppen pro Molekül.
Das Produkt der ersten Umsetzung, mal-sac-BSA (oder mal-sac-KLH) wurde durch Auftragen des Umsetzungsgemisches auf eine PD10-Sephadex-G-25-Säule zum Entsalzen, die mit 0,1 M Phosphatpuffer, pH-Wert 6,0, äquilibriert worden war, isoliert. Die Säule wurde mit 0,1 M Phosphatpuffer in 1,0 ml-Fraktionen eluiert. Der Säulenelution folgte eine Kontrolle des Extinktionsspektrums und mal-sac-BSA enthaltende Peak-Fraktionen wurden vereinigt. cGAP 13 oder Peptid 891, die wie vorstehend beschrieben synthetisiert worden waren, wurden zugegeben und das vereinigte Gemisch wurde die Nacht über bei Raumtemperatur gerührt. Die Konjugate wurden einer ausgiebigen Dialyse gegen destilliertes Wasser unterworfen und lyophilisiert und in einigen Fällen auf Veränderungen in der Aminosäure-Zusammensetzung analysiert.
Weiße Neuseeland-Kaninchen wurden mit den KLH-Derivaten der Peptide immunisiert, die ihnen in komplettem Freund-Adjuvans in periphere Lymphknoten injiziert und einige Wochen später in inkomplettem Freund- Adjuvans subkutan (sub. q.) injiziert wurden. In Abständen von mehreren Wochen wurden drei weitere sub. q.-Injektionen verabreicht. Einen oder mehrere Monate später wurden intravenöse Auffrischungsinjektionen im Abstand von wenigen Tagen verabreicht und einige Tage später wurden Blutproben entnommen.
Dem Fachmann ist bekannt, daß monoclonale Antikörper gegen die vorstehend beschriebenen Peptide mit Hilfe des Hybridom-Verfahrens hergestellt werden, wie in der vorliegenden "Genauen Beschreibung der Erfindung" beschrieben.

Diagnostische Verwendung von Antikörpern

Die vorstehend beschriebenen Antikörper können zum Testen auf das Vorkommen eines ras-p21-Proteins, insbesondere bei Tumoren mit einer Überexpression eines ras-p21-Proteins, eingesetzt werden. Die Verfügbarkeit großer Mengen dieser Antikörper stellt daher eine wertvolle Ergänzung der derzeitigen Verfahren zur Krebsdiagnose dar. Es werden Antikörper gegen cGAP 13 und Peptid 891 verwendet. Dem Fachmann ist jedoch bekannt, daß sich in dem Test beliebige Antikörper gegen die folgenden Materialien verwenden lassen: Fragmente von Peptid 891 oder cGAP13, die die Fähigkeit zur Bindung an das ras-p21-Protein, einen ras-p21-GDP-Komplex oder einen ras-p21-GTP- Komplex beibehalten, und ein beliebiges Peptid, das mit Peptid 891 oder cGAP 13 um Bindung an ein ras-p21-Protein, einen ras-p21-GDP-Komplex oder einen ras-p21-GTP-Komplex konkurriert.
Das Testverfahren erfolgt beispielsweise mit Peptid 891, einem markierten p21-Protein und einem Antikörper gegen Peptid 891. Die Antikörper gegen Peptid 891 werden an einen festen Träger gebunden. Sie können an einem der üblicherweise bei immunometrischen Tests verwendeten Träger immobilisiert werden. Dazu gehören Filterpapier, Plastikperlen oder aus Polyethylen, Polystyrol, Polypropylen oder anderen geeigneten Materialien hergestellte Teströhrchen. Auch aus einzelnen Teilchen bestehende Materialien, wie Agarose, vernetztes Dextran und andere Polysaccharide, lassen sich einsetzen. Die Verfahren für eine solche Bindung sind dem Fachmann wohlbekannt. Beispielsweise können Antikörper unter Verwendung des im US-Patent Nr. 3,645,852 beschriebenen Verfahrens an Polysaccharid-Polymere gebunden werden.
Das Verfahren zur p21-Markierung ist dasselbe wie das vorstehend für diagnostische Anwendungen der Peptidsequenzen beschriebene. Proben von markiertem p21-Protein und Peptid 891 werden inkubiert, wobei sich ein Konjugat von Peptid 891 und p21 bildet. Dann wird eine Suspension eines an Agarose-Partikeln immobilisierten Antikörpers zugegeben und das Gemisch wird inkubiert, wobei sich ein Antikörper-Peptid 891-p21-Komplex bildet. Nach dem Inkubationszeitraum werden die Agarose-Partikel durch Zugabe von Puffer gewaschen und zentrifugiert. Nach Entfernung der Waschflüssigkeit durch Absaugen wird dann im Agarosepartikel-Pellet die Anzahl radioaktiver Impulse von gebundenem radioaktivem p21 bestimmt. Bei der Kontrolle für dieses Experiment wird nach dem gleichen Verfahren gearbeitet, wobei jedoch eine bekannte Menge von markiertem p21 verwendet wird. Die Bestimmung der p21-Menge in der Probe erfolgt durch einen Vergleich zwischen den erhaltenen radioaktiven Impulsen der Kontrolle und denen der Probe.
Wie der Fachmann weiß, lassen sich auch andere Testverfahren verwenden. Beispielsweise wird das ras-p21-Protein mit einem Enzym oder einem fluorogenen Material markiert und mittels enzymatischer oder fluorometrischer Mittel untersucht.

Verfahren zur Verwendung der Peptide bei der Behandlung von menschlichem Krebs

Die Behandlung von mit dem ras-Oncogen transformierten Zellen mit
Peptiden kann zu einer Reversion von deren oncogenen Eigenschaften führen. Durch eine optimale Dosierung, die jedoch nur eine minimale oder keine nachteilige Wirkung auf normale Zellen ausübt, kehrt die Tumorzelle in ihren Normalzustand zurück. Ein anderes Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht daher in der Offenbarung von Verfahren, mit denen Peptide oder an einen Liganden konjugierte Peptide (nachstehend als Peptid- Ligand bezeichnet) einem Menschen zur Behandlung von Tumoren verabreicht werden können, die durch ras-Oncogene verursacht worden sind. Beispiele für den Liganden sind Antikörper oder Peptide, die die durch ras- Oncogene transformierten Zellen erkennen. Die Konjugation wird nach den auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren durchgeführt. Ein Beispiel für das Verfahren ist im US-Patent Nr. 4,340,535 genau beschrieben.
Die zur Behandlung des jeweiligen Patienten angewandte Strategie hängt von seinem Zustand und dem Ziel der Behandlung ab. Die Dosierung richtet sich nach solchen Faktoren, wie der Größe und dem Alter des Patienten, dem Stadium der Krankheit, den gleichzeitig verabreichten Behandlungen, z. B. Strahlentherapie, und dem Typ des verwendeten Peptids oder Peptid-Liganden. Bei jeder Behandlung muß das Peptid oder der Peptid-Ligand Patienten so verabreicht werden, daß eine wirksame Dosis in den Blutstrom und anschließend zu den Tumorzellen gelangt, um diese in den Normalzustand zurückzuführen.
Das Peptid oder der Peptid-Ligand wird über einen beliebigen Verabreichungsweg verabreicht, wozu die orale, rektale, nasale, topische (einschließlich bukkaler und sublingualer Verabreichung), vaginale und parenterale Verabreichung (einschließlich subkutaner, intramuskulärer, intravenöser, intra-arterieller und intradermaler Verabreichung) gehört. Beispiele sind eine intravenöse Injektion sowie eine kontiniuierliche Infusion oder intermittierende Infusionen zur Aufrechterhaltung gewünschter Blutspiegel. Bekanntlich kann der bevorzugte Verabreichungsweg auf der Basis der im vorstehenden Absatz diskutierten Faktoren geändert werden.
Das Peptid oder der Peptid-Ligand kann bei einer Therapie zusammen mit anderen Medikamenten oder einer Strahlentherapie verwendet werden. Das Peptid oder der Peptid-Ligand kann als Teil eines pharmazeutischen Präparats dargeboten werden. Die erfindungsgemäßen Präparate umfassen mindestens einen Verabreichungs-Bestandteil, d. h. ein Peptid oder einen Peptid-Liganden, zusammen mit einem oder mehreren verträglichen Trägern davon und gegebenenfalls anderen therapeutischen Bestandteilen. Der/die Träger müssen insofern "verträglich" sein, als sie mit den anderen Bestandteilen des Präparats kompatibel sein müssen und für den Rezipienten nicht schädlich sein dürfen. Zur parenteralen Verabreichung geeignete Präparate umfassen wäßrige und nicht-wäßrige sterile Injektionslösungen, die Antioxidantien, Puffer, Bakteriostatika und gelöste Stoffe enthalten können, die bewirken, daß das Präparat gegenüber dem Blut des zukünftigen Rezipienten isotonisch ist, sowie wäßrige und nicht-wäßrige sterile Suspensionen, die Suspensionsmittel und Verdickungsmittel umfassen können. Die Präparate können in Einheitsdosis- oder Mehrfachdosis-Behältern vorliegen, beispielsweise in abgedichteten Ampullen und Arzneiflaschen, und können im gefriergetrockneten (lyophilisierten) Zustand aufbewahrt werden, wobei es nur erforderlich ist, unmittelbar vor Verwendung den sterilen flüssigen Träger zuzugeben, beispielsweise Wasser zu Injektionszwecken. Aus sterilen Pulvern, Granulaten und Tabletten können extremporane Injektionslösungen und Suspensionen hergestellt werden.
Im folgenden ist ein Beispiel für das Verfahren beschrieben: dem Patienten wird fünf Tage täglich eine intravenöse Infusion des Peptids oder Peptid- Liganden in einem physiologisch verträglichen Träger in einer Anfangsdosis von 2,0 mg/m²-20 mg/m² verabreicht. Indem die oncogenen Zellen zum Normalzustand zurückkehren, verhindert das Peptid oder der Peptid-Ligand eine übermäßige Zellvermehrung. Das Tumorwachstum wird daher gestoppt. Weiter werden Zellen, die zum Normalzustand zurückgekehrt sind, jedoch noch die ras-Oncogene enthalten, mittels einer Chemotherapie und/oder Strahlentherapie abgetötet, die zusammen mit der Peptid- oder Peptid- Liganden-Behandlung verabreicht wird. Am Ende des fünftägigen Zeitraums wird der Patient beurteilt. Die Beurteilung umfaßt eine Untersuchung des Körpers und umfangreiche Labortests. Die Tests umfassen eine Toxizitätsauswertung und spezifische Tests, die auf den speziellen Tumor ausgerichtet sind. Im Fall von Leukämie umfassen die Tests beispielsweise die Bestimmung der Anzahl weißer Blutkörperchen. Wenn der Zustand des Patienten stabil ist, wird er erneut mit der gleichen Dosis zweimal pro Woche behandelt und wöchentlich untersucht. Vorausgesetzt, daß der Zustand des Patienten stabil ist, wird die Behandlung fünf Monate lang fortgesetzt. Am Ende des fünfmonatigen Zeitraums wird der Patient wieder beurteilt und einer Röntgenbestrahlung unterzogen. Ein Vergleich der Röntgen-Aufnahmen vor und nach der Behandlung zeigt die Wirksamkeit der Kombinationsbehandlungen, wobei sich zeigt, ob der Tumor weiter gewachsen ist oder sich seine Größe verringert hat. Entsprechend der Wirksamkeit der Kombinationsbehandlungen und dem Zustand des Patienten können die Peptid- oder Peptid-Liganden-Dosierung, die Chemotherapie und/oder Strahlenbehandlung erhöht oder während der Behandlungsdauer konstant gehalten werden. Der Zustand des Patienten und der Status des Tumors werden mittels Körperuntersuchung, Labortests und Röntgenbestrahlung regelmäßig kontrolliert. Bei einem Patienten, der eine negative Reaktion zeigt, werden die Anfangsdosis des Peptids oder Peptid-Liganden, die Chemotherapie und/oder Strahlenbehandlung verringert.
Die erfindungsgemäßen Präparate können andere auf dem Fachgebiet übliche Mittel umfassen, die für den Typ des fraglichen Präparats geeignet sind. Ferner dienen die vorstehend beschriebenen Behandlungsverfahren nur als Beispiel und schließen nicht die dem Fachmann bekannten Verfahren aus.
Hinterlegung biologischer Materialien: Die folgenden Plasmide sind am 11. Oktober 1988 bei American Type Culture Collection hinterlegt worden.

Claims

1. Peptid, das an das ras-p21-Protein oder den ras-p21-GTP-Komplex bindet und das ras-p21-GTPase Aktivität oder GAP-stimulierte ras-p21-GTPase Aktivität inhibiert, umfassend eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus: Met- Arg-Thr-Arg-Val-Val-Ser-Gly-Phe-Val-Phe-Leu-Arg-Leu-Ile-Cys oder Thr-Met- Arg-Thr-Arg-Val-Val-Ser-Gly-Phe-Val-Phe-Leu-Arg-Leu-Ile-Cys, ein Fragment des Peptids oder ein Peptid oder Fragment mit ausreichender Ähnlichkeit der Aminosäuresequenz zur ausgewählten Aminosäuresequenz, um die Bindungs- und inhibitorischen Aktivitäten zu erhalten.

2. Peptid nach Anspruch 1, mit einem Molekulargewicht von weniger als 35,000 D.

3. Peptid nach Anspruch 1 oder 2, das die Dissoziation von GDP vom ras-p21- GDP-Komplex vermittelt, aber nicht die Dissoziation des GTP-Analogs GTPγS vom rap-p21-GTPγS-Komplex.

4. Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bestehend aus einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe von:

(a) Met-Arg-Thr-Arg-Val-Val-Ser-Gly-Phe-Val-Phe-Leu-Arg-Leu-Ile-Cys; und

(b) Thr-Met-Arg-Thr-Arg-Val-Val-Ser-Gly-Phe-Val-Phe-Leu-Arg-Leu-Ile- Cys.

5. Verfahren zum Testen auf das ras-p21-Protein, umfassend den Nachweis des an ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 gebundenen ras-p21- Proteins.

6. Verfahren zum Testen auf das ras-p21-Protein in einer Probe, umfassend die Schritte: (a) Inkontaktbringen der Probe mit einem Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, so daß das Peptid einen Komplex mit ras-p21- Protein bildet, und

(b) Nachweisen des Komplexes, gegebenenfalls durch Markierung des ras- p21-Proteins mit radioaktivem GTP, und Nachweis des GTP.

7. Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart oder Konzentration von ras-p21 in einer Probe, umfassend die Schritte:

(a) Markierung des ras-p21-GTP-Komplexes;

(b) Bildung eines Konjugats durch Inkontaktbringen des markierten ras- p21-GTP-Komplexes mit einem Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4; und

(c) Nachweis des entstehenden Konjugats oder seiner Konzentration.

8. Antikörper gegen ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4.

9. Verfahren zum Testen auf ras-p21 in einer Probe, umfassend die Schritte:

(a) Inkontaktbringen der Probe mit einem Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Bildung eines ersten Konjugats von ras-p21 und dem Peptid;

(b) Inkontaktbringen des ersten Konjugats mit einem Antikörper gegen das Peptid, um ein zweites Konjugat zu bilden; und

(c) Nachweisen des zweiten Konjugats.

10. Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder Antikörper nach Anspruch 8 zur prophylaktischen, therapeutischen oder diagnostischen Verwendung.

11. Verwendung des Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder eines Antikörpers nach Anspruch 8 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Tumorbelastung oder Krebs.

12. Verwendung nach Anspruch 11, wobei das Medikament zur parenteralen Verabreichung verwendet wird.

13. Verwendung nach Anspruch 11 oder 12, wobei das Peptid an einen Liganden gebunden ist, der ras-onkogenisch transformierte Zellen erkennt.