JPS6128392A - 変形されたインターフェロン―β及びその製造方法 - Google Patents
変形されたインターフェロン―β及びその製造方法Info
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- JPS6128392A JPS6128392A JP18730184A JP18730184A JPS6128392A JP S6128392 A JPS6128392 A JP S6128392A JP 18730184 A JP18730184 A JP 18730184A JP 18730184 A JP18730184 A JP 18730184A JP S6128392 A JPS6128392 A JP S6128392A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は組換えＤＮＡ技術の一般的分野に関する。
更に詳しくは、本発明はシスティン残基の一つないしそ
れ以上の置換／欠損によって親頻似体（ｐａｒｅｎｔ
ａｎａｌｏｇｓ）とは異なった突然変異的に改変された
生物学的に活性のある蛋白質に関する。
れ以上の置換／欠損によって親頻似体（ｐａｒｅｎｔ
ａｎａｌｏｇｓ）とは異なった突然変異的に改変された
生物学的に活性のある蛋白質に関する。
（従来の技術及び発明が解決しようとする問題点）組換
えＤＮＡ （ｒｔｌＮＡ）技術よって微生物学的につく
られる生物学的に活性な蛋白質は、システィン残基を含
有しており、それらは活性に本質的なものではないが、
分子間または分子内の望ましくない結合を自由に形成す
る。このような一つの蛋白質は、微生物学的につくられ
るヒトのベータインターフェロン（ＩＦＮ−β）である
。ｒＤＮＡ技術によってＩＦＮ−βをつくる過程で、高
濃度のＩＦＮ−βを含有する大腸菌（Ｅ、 Ｃｏ１１）
抽出物中に、微生物学的につくられるＩＦＮ−βのダイ
マーとオリゴマーが形成されることが見い出された。こ
のマルチマー形成のため、ＩＦＮ−βの精製と分離が非
常な手間と時間のかかるものとなり、精製中に蛋白質を
還元し、次いで元のコンフォメーションに戻すためにこ
れを再酸化するというように、精製単離手順に追加の段
階が幾つか必要になり、それによって不正確なジスルフ
ィド結合形成の可能性が高まる。更に、おそらくはマル
チマー形成又はランダムな分子内ジスルフィド架橋形成
□のため、微生物学的につくられるＩＦＮ−βは一貫し
て低い比活性を示すこともわかった。従って、ＩＦＮ−
βのように微生物学的につくられ生物活性のある蛋白質
を、その活性に悪影響を及ぼさず、しかも蛋白質が望ま
しくない三次構造（例えば蛋白質の活性を低下させるよ
うなコンフォメーション）を有する結果になるような分
子間架橋や分子内結合の形成能力を減少し、又は排除す
る形で改変するのが望ましいであろう。
えＤＮＡ （ｒｔｌＮＡ）技術よって微生物学的につく
られる生物学的に活性な蛋白質は、システィン残基を含
有しており、それらは活性に本質的なものではないが、
分子間または分子内の望ましくない結合を自由に形成す
る。このような一つの蛋白質は、微生物学的につくられ
るヒトのベータインターフェロン（ＩＦＮ−β）である
。ｒＤＮＡ技術によってＩＦＮ−βをつくる過程で、高
濃度のＩＦＮ−βを含有する大腸菌（Ｅ、 Ｃｏ１１）
抽出物中に、微生物学的につくられるＩＦＮ−βのダイ
マーとオリゴマーが形成されることが見い出された。こ
のマルチマー形成のため、ＩＦＮ−βの精製と分離が非
常な手間と時間のかかるものとなり、精製中に蛋白質を
還元し、次いで元のコンフォメーションに戻すためにこ
れを再酸化するというように、精製単離手順に追加の段
階が幾つか必要になり、それによって不正確なジスルフ
ィド結合形成の可能性が高まる。更に、おそらくはマル
チマー形成又はランダムな分子内ジスルフィド架橋形成
□のため、微生物学的につくられるＩＦＮ−βは一貫し
て低い比活性を示すこともわかった。従って、ＩＦＮ−
βのように微生物学的につくられ生物活性のある蛋白質
を、その活性に悪影響を及ぼさず、しかも蛋白質が望ま
しくない三次構造（例えば蛋白質の活性を低下させるよ
うなコンフォメーション）を有する結果になるような分
子間架橋や分子内結合の形成能力を減少し、又は排除す
る形で改変するのが望ましいであろう。
（問題点を解決するための手段）
本発明は定方向突然変異（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａ
ｇｅｎｅｓｉｓ）により、親構造類似体（ｐａｒｅｎｔ
ａｎａｌｏｇｓ）の活性を保持するが、分子間ジスル
フィド結合や望ましくない分子内ジスルフィド結合の形
成能力を欠いている突然変異的に改変された生物学的活
性蛋白質の製造に関するにのような蛋白質を「ムティン
」（ｍｕｔｅｉｎ）という。「遺伝学・細胞遺伝学用語
辞典」（Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃｓ
ａｎｄ Ｃｙｔｏｇｅｒ＋ｅｔｉｃｓ）第４版、３８１
頁、スブリンジャー・バーラグ（１９７６年）〕。
ｇｅｎｅｓｉｓ）により、親構造類似体（ｐａｒｅｎｔ
ａｎａｌｏｇｓ）の活性を保持するが、分子間ジスル
フィド結合や望ましくない分子内ジスルフィド結合の形
成能力を欠いている突然変異的に改変された生物学的活
性蛋白質の製造に関するにのような蛋白質を「ムティン
」（ｍｕｔｅｉｎ）という。「遺伝学・細胞遺伝学用語
辞典」（Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃｓ
ａｎｄ Ｃｙｔｏｇｅｒ＋ｅｔｉｃｓ）第４版、３８１
頁、スブリンジャー・バーラグ（１９７６年）〕。
これに関し、エッチ・エム・シェパード（Ｓｈｅｐａｒ
ｄ。
ｄ。
Ｉｌ、 Ｌ）等（Ｎａｔｕｒｅ （１９８１年）２９４
巻５６３〜５６５頁〕ばＩＦＮ−βについて、そのアミ
ノ酸配列の１４１位置のシスティンがチロシンでおき代
えられたムティンを記述している〔ヒトＩＦＮ−βには
１７ 、３１及び１４１位置にシスティンがある。Ｇｅ
ｎｅ （１９８０年）１０巻１１−１５頁及びＮａｔｕ
ｒｅ（１９８０年）２８５巻５４２−５４７頁〕。この
ムティンは、ＩＦＮ−β遺伝子のヌクレオチド４８５に
Ｇ−４へ転位をもつ部分的ＩＦＮ−βｃＤＮＡクローン
から構築された雑種遺伝子の細菌にょる発現によってつ
くられた。このムティンは本来のＩＦＮ−βの生物学的
活性を失っており、著者らは置き換えられたシスティン
が活性に本質的であったと結論するに至った。
巻５６３〜５６５頁〕ばＩＦＮ−βについて、そのアミ
ノ酸配列の１４１位置のシスティンがチロシンでおき代
えられたムティンを記述している〔ヒトＩＦＮ−βには
１７ 、３１及び１４１位置にシスティンがある。Ｇｅ
ｎｅ （１９８０年）１０巻１１−１５頁及びＮａｔｕ
ｒｅ（１９８０年）２８５巻５４２−５４７頁〕。この
ムティンは、ＩＦＮ−β遺伝子のヌクレオチド４８５に
Ｇ−４へ転位をもつ部分的ＩＦＮ−βｃＤＮＡクローン
から構築された雑種遺伝子の細菌にょる発現によってつ
くられた。このムティンは本来のＩＦＮ−βの生物学的
活性を失っており、著者らは置き換えられたシスティン
が活性に本質的であったと結論するに至った。
定方向突然変異（ｄｉｒｅｃｔａｃｌ ｍｕｔａｇｅｎ
ｅｓｉｓ）技法は周知であり、アール・エフ・レイザー
（Ｌａｔｈｅｒ、 Ｒ。
ｅｓｉｓ）技法は周知であり、アール・エフ・レイザー
（Ｌａｔｈｅｒ、 Ｒ。
Ｆ、ン及びジェイ・ピー・レコソク（Ｌｅｃｏｑ、 Ｊ
、 Ｐ、）ジェネテインク・エンジニアリング（Ｇｅｎ
ｅｔｉｃ Ｅｎ−ｇｆｎｅｅｒｉｎｇ）、アカデミ°ツ
クプレス社（１９８３年）３１−５０頁、に検討されて
いる。オリゴヌクレオチドに指示された突然変異はエム
・スミス（Ｓｍｉｔｈ、 Ｍ、）及びニス・ギラム（Ｇ
ｉｌｌａｍ、 Ｓ、）、ジェネテインク・エンジニアリ
ング：原理と方法、プレナムプレス社（１９８１年）３
巻１−３２頁に具体的に検討されている。
、 Ｐ、）ジェネテインク・エンジニアリング（Ｇｅｎ
ｅｔｉｃ Ｅｎ−ｇｆｎｅｅｒｉｎｇ）、アカデミ°ツ
クプレス社（１９８３年）３１−５０頁、に検討されて
いる。オリゴヌクレオチドに指示された突然変異はエム
・スミス（Ｓｍｉｔｈ、 Ｍ、）及びニス・ギラム（Ｇ
ｉｌｌａｍ、 Ｓ、）、ジェネテインク・エンジニアリ
ング：原理と方法、プレナムプレス社（１９８１年）３
巻１−３２頁に具体的に検討されている。
本発明の一つの面は、ジスルフィド結合を自由に形成し
、生物学的活性に非本質的であるようにな少なくとも１
個のシスティン残基をもった生物学的に活性な蛋白質の
合成ムティンであって、このムティンがシスティン残基
の少なくとも１個を欠損しているか、或いは別のアミノ
酸でおき代えられていることを特徴とするものに関する
。
、生物学的活性に非本質的であるようにな少なくとも１
個のシスティン残基をもった生物学的に活性な蛋白質の
合成ムティンであって、このムティンがシスティン残基
の少なくとも１個を欠損しているか、或いは別のアミノ
酸でおき代えられていることを特徴とするものに関する
。
本発明のもう一つの面は、上記合成ムティン類をコード
するように特に設計されたＤＮＡ配列をもつ合成構造遺
伝子（「デザイナ−遺伝子」）に関する。この面の下位
局面は、このような構造デザイナ−遺伝子を包含する発
現ベクター類、このようなベクター類で形質転換される
宿主細胞又は生物、及びこのような形質転換生物又はそ
の子孫を培養し、培養基からムティン類を回収すること
によって合成ムティンをつ（る方法である。治療上有用
性をもつムティン類の場合、ムティン類の治療有効量を
含有する治療用組成物は、本発明のもう一つの面である
。
するように特に設計されたＤＮＡ配列をもつ合成構造遺
伝子（「デザイナ−遺伝子」）に関する。この面の下位
局面は、このような構造デザイナ−遺伝子を包含する発
現ベクター類、このようなベクター類で形質転換される
宿主細胞又は生物、及びこのような形質転換生物又はそ
の子孫を培養し、培養基からムティン類を回収すること
によって合成ムティンをつ（る方法である。治療上有用
性をもつムティン類の場合、ムティン類の治療有効量を
含有する治療用組成物は、本発明のもう一つの面である
。
本発明のさらにもう一つの面は、望ましくないジスルフ
ィド結合を自由に形成するような１個ないしそれ以上の
システィン残基を有する蛋白質を、このような望ましく
ないジスルフィド結合を形成することから防ぐ方法であ
って、システィン残基を欠損させるか、これらを他のア
ミノ酸でおき代えることによって蛋白質が突然変異的に
改変されることを特徴とした方法である。
ィド結合を自由に形成するような１個ないしそれ以上の
システィン残基を有する蛋白質を、このような望ましく
ないジスルフィド結合を形成することから防ぐ方法であ
って、システィン残基を欠損させるか、これらを他のア
ミノ酸でおき代えることによって蛋白質が突然変異的に
改変されることを特徴とした方法である。
本発明の更に一つの面は、以下の工程を特徴とするオリ
ゴヌクレオチドに指示された突然変異誘発によって上記
の合成構造遺伝子をつくる方法である。
ゴヌクレオチドに指示された突然変異誘発によって上記
の合成構造遺伝子をつくる方法である。
（ａｌ 親蛋白質をコードした構造遺伝子の１本鎖か
らなる単鎖ＤＮＡを突然変異オリゴヌクレオチドプライ
マーとハイブリダイズさせ（このプライマーは、欠損又
は代替えすべきシスティン用コドン、又は場合によりこ
のコドンと対合をつくるアンチセンス・トリプレットを
包含する領域に対して相補的なものであるが、当該コド
ンの欠損又は他のアミノ酸をコードするトリプレットを
規定するコドン又はアンチセンス・トリプレットとは不
一致（ＩＩｌｉ ｓｎ＋ａ ｔｃｈ）である。）、（ｂ
） ＤＮＡポリメラーゼによりプライマーを伸長させ
、突然変異性ヘテロデュプレックス（ｈｅｔｅｒｏ−ｄ
ｕｐｌｅｘ）を形成させ、そして、 （ｃ１この突然変異性ヘテロデュプレックスを複製する
。
らなる単鎖ＤＮＡを突然変異オリゴヌクレオチドプライ
マーとハイブリダイズさせ（このプライマーは、欠損又
は代替えすべきシスティン用コドン、又は場合によりこ
のコドンと対合をつくるアンチセンス・トリプレットを
包含する領域に対して相補的なものであるが、当該コド
ンの欠損又は他のアミノ酸をコードするトリプレットを
規定するコドン又はアンチセンス・トリプレットとは不
一致（ＩＩｌｉ ｓｎ＋ａ ｔｃｈ）である。）、（ｂ
） ＤＮＡポリメラーゼによりプライマーを伸長させ
、突然変異性ヘテロデュプレックス（ｈｅｔｅｒｏ−ｄ
ｕｐｌｅｘ）を形成させ、そして、 （ｃ１この突然変異性ヘテロデュプレックスを複製する
。
本方法で用いられる突然変異株オリゴヌクレオチドプラ
イマーは本発明のもう一つの面である。
イマーは本発明のもう一つの面である。
本発明は、生物学的に活性な蛋白質の生物学的活性に本
質的ではないシスティン残基が、分子間架橋又はまちが
った分子内ジスルフィド結合の形成サイトを排除するた
めに、計画的に欠損又は他のアミノ酸でおき代えられて
いるムティン類、このようなムティン類をコードする突
然変異遺伝子、及びこのようなムティン類をつくる手段
を提供する。
質的ではないシスティン残基が、分子間架橋又はまちが
った分子内ジスルフィド結合の形成サイトを排除するた
めに、計画的に欠損又は他のアミノ酸でおき代えられて
いるムティン類、このようなムティン類をコードする突
然変異遺伝子、及びこのようなムティン類をつくる手段
を提供する。
本発明によって突然変異的に改変できる蛋白質は、生物
学的に活性な蛋白質のシスティン含量、及びシスティン
残基が活性と三次構造に関して果たす役割について人手
可能な情報から確認できる。
学的に活性な蛋白質のシスティン含量、及びシスティン
残基が活性と三次構造に関して果たす役割について人手
可能な情報から確認できる。
文献ではこのような情報が入手できない蛋白質について
は、本明細書に記載の手順によりて蛋白質のシスティン
残基の各々を系統的に変更し、生ずるムティン類の生物
学的活性及びそれらが望ましくない分子間又は分子内ジ
スルフィド結合を形成する傾向について試験を行なうこ
とによって、この情報は決定できる。従って、本発明は
ＩＦＮ−β及びＩＬ−２のムティン類に関して下に特に
説明、例示されているが、望ましくないジスルフィド結
合の形成に対して蛋白質を感受性にするような、機能的
に本質的ではないシスティン残基を含有する生物学的に
活性な任意のその他の蛋白質に以下の教示が当てはまる
ことが認められよう。ＩＦＮ−βとＩＬ−２以外に本発
明による突然変異性改変の候補となる蛋白質の例は、リ
ンフォトキシン（腫瘍壊死因子）とコロニー刺激因子−
１、それにＩＦＮ−α１である。候補蛋白質は、ふつう
には奇数のシスティン残基をもっている。
は、本明細書に記載の手順によりて蛋白質のシスティン
残基の各々を系統的に変更し、生ずるムティン類の生物
学的活性及びそれらが望ましくない分子間又は分子内ジ
スルフィド結合を形成する傾向について試験を行なうこ
とによって、この情報は決定できる。従って、本発明は
ＩＦＮ−β及びＩＬ−２のムティン類に関して下に特に
説明、例示されているが、望ましくないジスルフィド結
合の形成に対して蛋白質を感受性にするような、機能的
に本質的ではないシスティン残基を含有する生物学的に
活性な任意のその他の蛋白質に以下の教示が当てはまる
ことが認められよう。ＩＦＮ−βとＩＬ−２以外に本発
明による突然変異性改変の候補となる蛋白質の例は、リ
ンフォトキシン（腫瘍壊死因子）とコロニー刺激因子−
１、それにＩＦＮ−α１である。候補蛋白質は、ふつう
には奇数のシスティン残基をもっている。
ｒＦＮ−βの場合、グリコシル化ＩＦＮと未グリコシル
化ＩＦＮがいずれも定量的に同様な特異的活性を示すこ
と、従って、グリコシル部分はＩＦＮ−βの生物学的活
性に関与も貢献もしていないことが報告された。しかし
、細菌でつくられるグリコシル化されていないＩＦＮ−
βは、グリコシル化された天然ＩＦＮ−βより量的に低
い比活性を一貫して示す。
化ＩＦＮがいずれも定量的に同様な特異的活性を示すこ
と、従って、グリコシル部分はＩＦＮ−βの生物学的活
性に関与も貢献もしていないことが報告された。しかし
、細菌でつくられるグリコシル化されていないＩＦＮ−
βは、グリコシル化された天然ＩＦＮ−βより量的に低
い比活性を一貫して示す。
ＩＦＮ−βは、１７ 、３１及び１４１の位置にシステ
ィン残基をもつことが知られている。システィン１４１
は、シェパードら（前掲）により、生物学的活性に本質
的であることが立証された。４個のシスティン残基を含
有するＩＦＮ−αでは、二つの分子間−５−３−結合が
あり一一つはｃｙｓ２９とｃｙｓ１３８の間、他はｃｙ
ｓ ｌとｃｙｓ９８の間である。ＩＦＮ−βとＩＦＮ−
αとの相同性に基づいて、ＩＦＮ−βのｃｙｓ１４１は
ｃｙｓ３１ と分子内−５−Ｓ−結合にしており、ｃｙ
ｓ１７は自由。
ィン残基をもつことが知られている。システィン１４１
は、シェパードら（前掲）により、生物学的活性に本質
的であることが立証された。４個のシスティン残基を含
有するＩＦＮ−αでは、二つの分子間−５−３−結合が
あり一一つはｃｙｓ２９とｃｙｓ１３８の間、他はｃｙ
ｓ ｌとｃｙｓ９８の間である。ＩＦＮ−βとＩＦＮ−
αとの相同性に基づいて、ＩＦＮ−βのｃｙｓ１４１は
ｃｙｓ３１ と分子内−５−Ｓ−結合にしており、ｃｙ
ｓ１７は自由。
に分子間架橋を形成できるであろう。ｃｙｓ１７を欠失
させるか、これを別のアミノ酸と置換することによって
、ｃｙｓ１７が生物学的活性に本質的であるかどうか、
またー５−３−結合形成におけるその役割を決定できる
。ｃｙｓ１７が蛋白質の生物学的活性に本質的でないな
らば、生ずるｃｙｓ１７を欠損し又はｃｙｓ１７が置換
された蛋白質は、自然のＩＦＮ−βのそれに近い比活性
を示し、またおそらく蛋白質の単離精製を容易にもする
であろう。
させるか、これを別のアミノ酸と置換することによって
、ｃｙｓ１７が生物学的活性に本質的であるかどうか、
またー５−３−結合形成におけるその役割を決定できる
。ｃｙｓ１７が蛋白質の生物学的活性に本質的でないな
らば、生ずるｃｙｓ１７を欠損し又はｃｙｓ１７が置換
された蛋白質は、自然のＩＦＮ−βのそれに近い比活性
を示し、またおそらく蛋白質の単離精製を容易にもする
であろう。
ＩＦＮ−β遺伝子のｃｙｓ１７用コドン（ｃｏｄｏｎ）
の領域に対して相補的であるがこのコドン中に１１又は
複数の塩基変化を含有する合成オリゴヌクレオチドプラ
イマ一番用いるオリゴヌクレオチドで指示される突然変
異誘発手順を使用してデザイナ−遺伝子がつくられ、こ
うしてｃｙｓ１７がその他任意の選択されたアミノ酸で
お−き代えられる。欠損を望む場合には、ｃｙｓ１７用
コドン全コドンオリゴヌクレオチドプライマーを用いる
。ｃｙｓ１７をグリシン、バリン、アラニン、ロイシン
、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチ
ジン、トリプトファン、セリン、スレオニン及びメチオ
ニンのような中性アミノ酸へ変換するのが好ましい方法
である。セリン及びスレオニンは、システィンと化学的
類似性を有するため最も好ましい代替え物である。シス
ティンを欠失させる時は、成熟ムティンは自然の粗蛋白
質又は微生物でつくられるＩＦＮ−βよりアミノ酸１個
だけ短い。
の領域に対して相補的であるがこのコドン中に１１又は
複数の塩基変化を含有する合成オリゴヌクレオチドプラ
イマ一番用いるオリゴヌクレオチドで指示される突然変
異誘発手順を使用してデザイナ−遺伝子がつくられ、こ
うしてｃｙｓ１７がその他任意の選択されたアミノ酸で
お−き代えられる。欠損を望む場合には、ｃｙｓ１７用
コドン全コドンオリゴヌクレオチドプライマーを用いる
。ｃｙｓ１７をグリシン、バリン、アラニン、ロイシン
、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチ
ジン、トリプトファン、セリン、スレオニン及びメチオ
ニンのような中性アミノ酸へ変換するのが好ましい方法
である。セリン及びスレオニンは、システィンと化学的
類似性を有するため最も好ましい代替え物である。シス
ティンを欠失させる時は、成熟ムティンは自然の粗蛋白
質又は微生物でつくられるＩＦＮ−βよりアミノ酸１個
だけ短い。
ヒ目Ｌ−２は、蛋白質の５８ 、１０５及び１２５位に
システィン残基をもつと報告されている。ＩＦＮ−βの
場合のように、ＩＬ−２は細菌の菌体から単離される時
は集合したオリゴマー型になっていて、細菌抽出物から
良好な収量を得るためには、還元剤で還元しなければな
らない。そのうえ、精製され還元されたＩＬ−２は不安
定であり、貯蔵時にオリゴマー不活性型へ容易に再酸化
される。３個のシスティンが存在することは、天然分子
に見られるように正しい架橋は１個だけなのに、再酸化
時に蛋白質が３個の可能な分子内ジスルフィド架橋の１
個を無作為に形成しうろことを意味している。天然ＩＬ
−２蛋白質のジスルフィド構造がいかなるものか知られ
ていないから、ＩＬ−２遺伝子のコドン５８ 、１０５
及び１２５に突然変異をつくり、どのシスティン残基が
活性にとって必要であるか、従ってまた自然のジスルフ
ィド架橋形成に関与している可能性が最も大きいかを確
認するために本発明を使用できる。同様に、活性にとっ
て必要でないシスティン残基を修飾することによってま
ちがった分子内ジスルフィド架橋の形成を防ぎ、そして
遊離システィン残基の除去又は置き換えによって分子内
間ジスルフィド架橋の機会を最小限に抑えることができ
る。
システィン残基をもつと報告されている。ＩＦＮ−βの
場合のように、ＩＬ−２は細菌の菌体から単離される時
は集合したオリゴマー型になっていて、細菌抽出物から
良好な収量を得るためには、還元剤で還元しなければな
らない。そのうえ、精製され還元されたＩＬ−２は不安
定であり、貯蔵時にオリゴマー不活性型へ容易に再酸化
される。３個のシスティンが存在することは、天然分子
に見られるように正しい架橋は１個だけなのに、再酸化
時に蛋白質が３個の可能な分子内ジスルフィド架橋の１
個を無作為に形成しうろことを意味している。天然ＩＬ
−２蛋白質のジスルフィド構造がいかなるものか知られ
ていないから、ＩＬ−２遺伝子のコドン５８ 、１０５
及び１２５に突然変異をつくり、どのシスティン残基が
活性にとって必要であるか、従ってまた自然のジスルフ
ィド架橋形成に関与している可能性が最も大きいかを確
認するために本発明を使用できる。同様に、活性にとっ
て必要でないシスティン残基を修飾することによってま
ちがった分子内ジスルフィド架橋の形成を防ぎ、そして
遊離システィン残基の除去又は置き換えによって分子内
間ジスルフィド架橋の機会を最小限に抑えることができ
る。
オリゴヌクレオチドプライマーの大きさは、突然変異を
導入すべき遺伝子領域へのプライマーの安定なハイブリ
ッド形成に必要な条件により、また現在利用可能なオリ
ゴヌクレオチド合成法の限界によって決まる。オリゴヌ
クレオチドで指示される突然変異誘発に使用するオリゴ
ヌクレオチドを設計するに当たって、考慮すべき因子（
例えば全体の大きさ、突然変異サイトを迂回する部分の
大きさ）は、エム・スミス及びニス・ギラム（前掲）に
よって記述されている。概して、オリゴヌクレオチドの
全長は、突然変異サイトでの安定でユニークな雑種形成
を最適化するような長さであり、突然変異サイトから５
′及び３′末端までの伸長部分（ｃｘｔｅｎｓｉｏｎｓ
）は、ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性に
よる突然変異の作用をさけるのに十分な大きさとする。
導入すべき遺伝子領域へのプライマーの安定なハイブリ
ッド形成に必要な条件により、また現在利用可能なオリ
ゴヌクレオチド合成法の限界によって決まる。オリゴヌ
クレオチドで指示される突然変異誘発に使用するオリゴ
ヌクレオチドを設計するに当たって、考慮すべき因子（
例えば全体の大きさ、突然変異サイトを迂回する部分の
大きさ）は、エム・スミス及びニス・ギラム（前掲）に
よって記述されている。概して、オリゴヌクレオチドの
全長は、突然変異サイトでの安定でユニークな雑種形成
を最適化するような長さであり、突然変異サイトから５
′及び３′末端までの伸長部分（ｃｘｔｅｎｓｉｏｎｓ
）は、ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性に
よる突然変異の作用をさけるのに十分な大きさとする。
本発明に従って突然変異誘発に使用されるオリゴヌクレ
オチドは、通常、約１２個ないし約２４個の塩基、好ま
しくは約１４個ないし約２０個の塩基、更に好ましくは
約１４個ないし１８個の塩基を含有する。これらは通常
、変更又は欠失されるコドンの少なくとも約３個の塩基
３′を含有する。
オチドは、通常、約１２個ないし約２４個の塩基、好ま
しくは約１４個ないし約２０個の塩基、更に好ましくは
約１４個ないし１８個の塩基を含有する。これらは通常
、変更又は欠失されるコドンの少なくとも約３個の塩基
３′を含有する。
変更されたＩＦＮ−β遺伝子をつくる方法は、大体にお
いて、コドン１７を消失させるか、又はそれが別のアミ
ノ酸をコードするように変更する合成ヌクレオチドプラ
イマーを使用して、ＩＦＮ−β遺伝子のコドン１７ （
ＴＧＴ）に部位特異的突然変異を誘発せしめるものであ
る。システィンをスレオニンに変え、プライマーをＩＦ
Ｎ−β遺伝子のアンチセンス鎖にハイブリッド形成させ
る場合、好ましいヌクレオチＦ７”ライマーはＧＣＡＡ
ＴＴＴＴＣＡＣＴＣＡＧ テある（下線は変更されたコ
ドンを示す）。システィンを欠失させるのが望ましい時
は、好ましいプライマーはＡＧＣＡＡＴＴＴＴＣＡＧＣ
ＡＧＡＡＧＣＴＣＣＴＧであり、これはｃｙｓに対する
ＴＧＴコドンを喪失している。システィンをセリンに代
える時は、セリン用のへＧＴコドンを含んだ１７−ヌク
レオチドプライマーＧＣＡＡＴＴＴＴＣＡＧＡＧＴＣＡ
Ｇが選択される。ｃｙｓ１７で第一塩基Ｔ→Ａの転位に
より、システィンからセリンへの変化が起る。欠失を導
入する時には、所望の蛋白質の発現のためにＤＮＡ配列
の適正なリーディングフレームを保持しなければならな
い点を認識しなければならない。
いて、コドン１７を消失させるか、又はそれが別のアミ
ノ酸をコードするように変更する合成ヌクレオチドプラ
イマーを使用して、ＩＦＮ−β遺伝子のコドン１７ （
ＴＧＴ）に部位特異的突然変異を誘発せしめるものであ
る。システィンをスレオニンに変え、プライマーをＩＦ
Ｎ−β遺伝子のアンチセンス鎖にハイブリッド形成させ
る場合、好ましいヌクレオチＦ７”ライマーはＧＣＡＡ
ＴＴＴＴＣＡＣＴＣＡＧ テある（下線は変更されたコ
ドンを示す）。システィンを欠失させるのが望ましい時
は、好ましいプライマーはＡＧＣＡＡＴＴＴＴＣＡＧＣ
ＡＧＡＡＧＣＴＣＣＴＧであり、これはｃｙｓに対する
ＴＧＴコドンを喪失している。システィンをセリンに代
える時は、セリン用のへＧＴコドンを含んだ１７−ヌク
レオチドプライマーＧＣＡＡＴＴＴＴＣＡＧＡＧＴＣＡ
Ｇが選択される。ｃｙｓ１７で第一塩基Ｔ→Ａの転位に
より、システィンからセリンへの変化が起る。欠失を導
入する時には、所望の蛋白質の発現のためにＤＮＡ配列
の適正なリーディングフレームを保持しなければならな
い点を認識しなければならない。
プライマーはＩＦＮ−β遺伝子の１本鎖がクローニング
されたＭ１３ 、 ｆｄ 、又はφ×１７４のような１
本・鎖ファージヘハイブリソド形成される。ファージが
遺伝子のセンス鎖、アンチセンス鎖のいずれでも担持で
きることは認められよう。ファージがアンチセンス鎖を
担持する場合には、プライマーは、コドンの欠損、又は
別のアミノ酸をコードするトリプレットを規定するこの
コドンとは一致しないが、突然変異させるコドンを含有
するセンス鎖の領域と同一である。ファージがセンス鎖
を担持す・る場合は、欠失させるコドンと対合するトリ
プレット中では適当に不一致であるが、突然変異させる
コドンを含有するセンス鎖の領域に対して相補的である
。ハイブリッド形成に使用される条件はエム・スミス及
びニス・ギラム（前掲）によって記述されている。温度
は通常、約０℃ないし７０℃、もっと一般的には約１０
℃ないし５０℃の範囲にある。ハイブリッド形成後、プ
ライマーはＤＮＡポリメラーゼＩ、 Ｔ４ＤＮＡポリ
メラーゼ、逆転写酵素又は他の適当なりＮＡポリメラー
ゼとの反応によってファージＤＮＡ上で伸長される。生
ずるｄｓＤＮＡは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼのようなりＡＮ
リガーゼでの処理によって閉環状ｄｓＤＮＡへ変換され
る。１本鎖領域を含有するＤＮＡ分子はＳｌエンドヌク
レアーゼ処理によって破壊できる。
されたＭ１３ 、 ｆｄ 、又はφ×１７４のような１
本・鎖ファージヘハイブリソド形成される。ファージが
遺伝子のセンス鎖、アンチセンス鎖のいずれでも担持で
きることは認められよう。ファージがアンチセンス鎖を
担持する場合には、プライマーは、コドンの欠損、又は
別のアミノ酸をコードするトリプレットを規定するこの
コドンとは一致しないが、突然変異させるコドンを含有
するセンス鎖の領域と同一である。ファージがセンス鎖
を担持す・る場合は、欠失させるコドンと対合するトリ
プレット中では適当に不一致であるが、突然変異させる
コドンを含有するセンス鎖の領域に対して相補的である
。ハイブリッド形成に使用される条件はエム・スミス及
びニス・ギラム（前掲）によって記述されている。温度
は通常、約０℃ないし７０℃、もっと一般的には約１０
℃ないし５０℃の範囲にある。ハイブリッド形成後、プ
ライマーはＤＮＡポリメラーゼＩ、 Ｔ４ＤＮＡポリ
メラーゼ、逆転写酵素又は他の適当なりＮＡポリメラー
ゼとの反応によってファージＤＮＡ上で伸長される。生
ずるｄｓＤＮＡは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼのようなりＡＮ
リガーゼでの処理によって閉環状ｄｓＤＮＡへ変換され
る。１本鎖領域を含有するＤＮＡ分子はＳｌエンドヌク
レアーゼ処理によって破壊できる。
オリゴヌクレアーゼで指示される突然変異誘発は、ＩＬ
−２活性をもつがｃｙｓ１２５からセリン１２５へ変更
されたムティンをコードする突然変異ＩＬ−２遺伝子を
つくるにも同様に使用できる。ファージが遺伝子のセン
ス鎖を担持する場合に、この突然変異ＩＬ−２遺伝子を
つくるのに使われる好ましいオリゴヌクレオチドブライ
マーはＧＡＴＧＡＴＧＣＴＴＣＴＧ酊追ＡＡＡＧＧＴＡ
ＡＴＣである。このオリゴヌクレオチドは、ＩＬ−２遺
伝子のコドン１２５と対合するトリプレットのまん中の
塩基にＣ−Ｇの変化を有する。
−２活性をもつがｃｙｓ１２５からセリン１２５へ変更
されたムティンをコードする突然変異ＩＬ−２遺伝子を
つくるにも同様に使用できる。ファージが遺伝子のセン
ス鎖を担持する場合に、この突然変異ＩＬ−２遺伝子を
つくるのに使われる好ましいオリゴヌクレオチドブライ
マーはＧＡＴＧＡＴＧＣＴＴＣＴＧ酊追ＡＡＡＧＧＴＡ
ＡＴＣである。このオリゴヌクレオチドは、ＩＬ−２遺
伝子のコドン１２５と対合するトリプレットのまん中の
塩基にＣ−Ｇの変化を有する。
得られた突然変異性へテロディプレックスは、コンビテ
ント宿主生物又は細胞を形質転換するのに使用される。
ント宿主生物又は細胞を形質転換するのに使用される。
宿主によるヘテロデュプレックスの複製により、双方の
鎖から子孫鎖ができる。複製に続いて、突然変異鎖の子
孫から突然変異遺伝子を゛単離し、適当なベクターへ挿
入し、このベクターを適当な宿主生物又は細胞の形質転
換に使用する。好ましいベクター類はプラスミドｐＢＲ
３２２。
鎖から子孫鎖ができる。複製に続いて、突然変異鎖の子
孫から突然変異遺伝子を゛単離し、適当なベクターへ挿
入し、このベクターを適当な宿主生物又は細胞の形質転
換に使用する。好ましいベクター類はプラスミドｐＢＲ
３２２。
ｐｃＲｌ及びそれらの変異体、合成ベクター等である。
適当な宿主生物はＥ、コリ（Ｅ、Ｃｏ１１）、シュード
モーナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ） 、バシルス・ズ
ブチリス（Ｂａ−ｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ）、
バシルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈ
ｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、種々の酵母菌株、バシルス
・サーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ）、ハツカネズミやラット、チャイニーズハ
ムスターの卵巣（ｃＨＯ）細胞のような動物細胞、植物
細胞、動植物宿主等である。選んだ宿主をベクターで形
質転換する場合に、ムティンが発現されるために適当な
プロモータ・オペレーター配列も導入されることは認識
されなければならない。宿主は原核生物でも真核生物で
も良い。（真核細胞へＤＮＡを挿入する方法は１９８１
年９月３日公表されたＰＣＴ出願番号ＵＳ８１１００２
３９及びＵＳ８１１００２４０に記述されている）。Ｅ
、コリとＣＩ（Ｏ細胞が好ましい宿主である。
モーナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ） 、バシルス・ズ
ブチリス（Ｂａ−ｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ）、
バシルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈ
ｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、種々の酵母菌株、バシルス
・サーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ）、ハツカネズミやラット、チャイニーズハ
ムスターの卵巣（ｃＨＯ）細胞のような動物細胞、植物
細胞、動植物宿主等である。選んだ宿主をベクターで形
質転換する場合に、ムティンが発現されるために適当な
プロモータ・オペレーター配列も導入されることは認識
されなければならない。宿主は原核生物でも真核生物で
も良い。（真核細胞へＤＮＡを挿入する方法は１９８１
年９月３日公表されたＰＣＴ出願番号ＵＳ８１１００２
３９及びＵＳ８１１００２４０に記述されている）。Ｅ
、コリとＣＩ（Ｏ細胞が好ましい宿主である。
本発明に従って得られるムティン類は、天然の親蛋白質
に生ずるグリコシル化およびムティン調製に使われる宿
主生物に依存してグリコシル化される場合もされない場
合もある。所望により、宿主としてＥ、コリ（Ｅ、Ｃｏ
１１）及びバシルス（Ｂａｃｉｌ Ｉｕｓ）を使用する
場合に得られる未グリコシル化ムティンを、この技術分
野で知られている科学的、酵素的及びその他の変法によ
って生体外で任意にグリコシル化してよい。
に生ずるグリコシル化およびムティン調製に使われる宿
主生物に依存してグリコシル化される場合もされない場
合もある。所望により、宿主としてＥ、コリ（Ｅ、Ｃｏ
１１）及びバシルス（Ｂａｃｉｌ Ｉｕｓ）を使用する
場合に得られる未グリコシル化ムティンを、この技術分
野で知られている科学的、酵素的及びその他の変法によ
って生体外で任意にグリコシル化してよい。
ＩＦＮ−βに関する本発明の好ましい態様においては、
第１図に示すように、ＩＦＮ−βのアミノ酸配列におい
て１７位のシスティン残基は、成ＰＩＦＮ−βをコード
するＤＮＡ配列のセンス鎖のコドン１７の第一塩基のＴ
−Ａ転位によって、セリンへ変えられる。この部位特異
的な突然変異誘発は、合成１７−ヌクレオチドプライマ
ーＧＣＡＡＴＴＴＴＣＡＧ狐ＣＡＧを使用して誘発され
、このプライマーはコドン１７の第一塩基に一個の塩基
の不一致がある以外は、コドン１７の領域におけるＩＦ
Ｎ−βのセンス核上の１７の個ヌクレオチド配列と同一
である。この不一致はプライマーのヌクレオチド１２に
ある。遺伝暗号（コドン）は縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔ
ｅ） シており、アミノ酸の多くは一つ以上のコドンに
よって暗号づけられることが認識されなければならない
。例えばセリンの塩基暗号は、ＴＣＴ、 ＴＣＧ、 Ｔ
ＣＣ，ＴＣＡ、 ＡＧＴ。
第１図に示すように、ＩＦＮ−βのアミノ酸配列におい
て１７位のシスティン残基は、成ＰＩＦＮ−βをコード
するＤＮＡ配列のセンス鎖のコドン１７の第一塩基のＴ
−Ａ転位によって、セリンへ変えられる。この部位特異
的な突然変異誘発は、合成１７−ヌクレオチドプライマ
ーＧＣＡＡＴＴＴＴＣＡＧ狐ＣＡＧを使用して誘発され
、このプライマーはコドン１７の第一塩基に一個の塩基
の不一致がある以外は、コドン１７の領域におけるＩＦ
Ｎ−βのセンス核上の１７の個ヌクレオチド配列と同一
である。この不一致はプライマーのヌクレオチド１２に
ある。遺伝暗号（コドン）は縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔ
ｅ） シており、アミノ酸の多くは一つ以上のコドンに
よって暗号づけられることが認識されなければならない
。例えばセリンの塩基暗号は、ＴＣＴ、 ＴＣＧ、 Ｔ
ＣＣ，ＴＣＡ、 ＡＧＴ。
及びＡＣＧというコドンがいずれもセリンをコードする
ように、６通りの縮重である。便宜上、好ましい態様と
してＡＧＴコドンが選ばれた。同様に、スレオニンはＡ
ＣＴ、 ＡＣＡ、ＡＣＣ及びＡＣＧのコドンのどの−・
つによってもコードされる。特定アミノ酸に対して１コ
ドンを特定する時は、これがそのアミノ酸をコードする
すべての縮重コドンを包含することが意図されているｏ
１７−ｍａｒは、ＩＦＮ−β遺伝子のアンチセンス鎖を
担持する１本鎖Ｍ１３ファージＤＮＡにハイブリッド形
成される。次に、ＤＮＡポリメラーゼＩ Ｋｌｅｎｏｗ
断片を使用して、オリゴヌ然変異性ヘテロデュプレック
スの複製によって、不一致を含有するＤＮＡ鎖からクロ
ーンが得られる。
ように、６通りの縮重である。便宜上、好ましい態様と
してＡＧＴコドンが選ばれた。同様に、スレオニンはＡ
ＣＴ、 ＡＣＡ、ＡＣＣ及びＡＣＧのコドンのどの−・
つによってもコードされる。特定アミノ酸に対して１コ
ドンを特定する時は、これがそのアミノ酸をコードする
すべての縮重コドンを包含することが意図されているｏ
１７−ｍａｒは、ＩＦＮ−β遺伝子のアンチセンス鎖を
担持する１本鎖Ｍ１３ファージＤＮＡにハイブリッド形
成される。次に、ＤＮＡポリメラーゼＩ Ｋｌｅｎｏｗ
断片を使用して、オリゴヌ然変異性ヘテロデュプレック
スの複製によって、不一致を含有するＤＮＡ鎖からクロ
ーンが得られる。
突然変異クローンは、゛特定の制限位置の存在又は不存
在、抗生物質耐性もしくは感受性、又はこの技術分野に
おいて知られたその他の方法によって確認され、スクリ
ーニングされる。システィンをセリンによりおき代える
場合は、第２図に示されるＴ−Ａ転位によって、構造遺
伝子の中に新しい旧ｎｆｌ制限部位がつくられる。突然
変異クローンは、突然変異したファージプラークのハイ
ブリッド形成スクリーニングにおけるプローブとしてオ
リゴヌクレオチドプライマーを使用して同定される。第
２図に示されるように、プライマーは親とハイブリッド
形成される時は唯一の不一致を有するが、突然変異した
ファージＤＮＡにハイブリッド形成される時は完全な一
致を有するであろう。オリゴヌクレオチドプライマーを
親ＤＮＡよりも突然変異ＤＮＡへ優先的にハイブリッド
形成させるようなハイプリント形成の条件を工夫できる
。新しく発生したＨ５ｎｆ Ｉ部位も、ＩＦＮ−β遺伝
子の単一塩基の突然変異を確認する手段として役立つ。
在、抗生物質耐性もしくは感受性、又はこの技術分野に
おいて知られたその他の方法によって確認され、スクリ
ーニングされる。システィンをセリンによりおき代える
場合は、第２図に示されるＴ−Ａ転位によって、構造遺
伝子の中に新しい旧ｎｆｌ制限部位がつくられる。突然
変異クローンは、突然変異したファージプラークのハイ
ブリッド形成スクリーニングにおけるプローブとしてオ
リゴヌクレオチドプライマーを使用して同定される。第
２図に示されるように、プライマーは親とハイブリッド
形成される時は唯一の不一致を有するが、突然変異した
ファージＤＮＡにハイブリッド形成される時は完全な一
致を有するであろう。オリゴヌクレオチドプライマーを
親ＤＮＡよりも突然変異ＤＮＡへ優先的にハイブリッド
形成させるようなハイプリント形成の条件を工夫できる
。新しく発生したＨ５ｎｆ Ｉ部位も、ＩＦＮ−β遺伝
子の単一塩基の突然変異を確認する手段として役立つ。
突然変異した遺伝子を担持するＭ１３フプージＤＮＡを
単離し、プラスミドｐＴｒｐ ３のような適当な発現ベ
クター中へ組み入れ、このベク多−で大腸菌ＭＭ２９４
株を形質転換させる。形質転換体とその子孫を培養する
のに適した生育培地が当業者に知られている。ＩＰＮ−
βの発現されたムティンを単離精製し、特徴づける。
単離し、プラスミドｐＴｒｐ ３のような適当な発現ベ
クター中へ組み入れ、このベク多−で大腸菌ＭＭ２９４
株を形質転換させる。形質転換体とその子孫を培養する
のに適した生育培地が当業者に知られている。ＩＰＮ−
βの発現されたムティンを単離精製し、特徴づける。
以下の実施例は本発明の一層の理解を助けるため、また
例示だけの目的で提示されている。これらはいかなる形
においても本発明の範囲を限定するものと考えられては
ならない。実施例１〜９はＩＦＮ−βのムティンの調製
を記述している。実施例１０〜１５はＩＬ−２のムティ
ンの調製を記述している。
例示だけの目的で提示されている。これらはいかなる形
においても本発明の範囲を限定するものと考えられては
ならない。実施例１〜９はＩＦＮ−βのムティンの調製
を記述している。実施例１０〜１５はＩＬ−２のムティ
ンの調製を記述している。
ＩＪｆｉｊユ ＩＦＮ−β゛ 立子のＭ１３ベクターへ
のクローニング １本鎖ＤＮＡ鋳型の給源としてＭ１３ファージベクター
を使用することは、ジー・エフ・テンプル（Ｇ、 Ｆ、
Ｔｅｍｐｌｅ）ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８２年）２９
６巻５３７−５４０頁で実証された。大腸菌ｔｒｐプロ
モーターの制御下にＩＦＮ−β遺伝子を含有するプラス
ミドｐβ１ｔｒｐ Ｃ第３図）を制限酵素旧ｎｄｎ［及
びＸｈｏ ＩＩで消化した。Ｍ１３ｍｐ８ （ジェイ・
メッシング（Ｊ。
のクローニング １本鎖ＤＮＡ鋳型の給源としてＭ１３ファージベクター
を使用することは、ジー・エフ・テンプル（Ｇ、 Ｆ、
Ｔｅｍｐｌｅ）ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８２年）２９
６巻５３７−５４０頁で実証された。大腸菌ｔｒｐプロ
モーターの制御下にＩＦＮ−β遺伝子を含有するプラス
ミドｐβ１ｔｒｐ Ｃ第３図）を制限酵素旧ｎｄｎ［及
びＸｈｏ ＩＩで消化した。Ｍ１３ｍｐ８ （ジェイ・
メッシング（Ｊ。
Ｍｅｓｓｉｎｇ） 、 ｒ巨大分子に関する第３回クリ
ーブランド・シンポジウム：組換えＤＮＡ Ｊエイ・ウ
オールトン編、エルザビアプレス社、１４３−１５３
頁（１９８１年）〕複製型（ＲＦ） ＤＮＡ （第４図
）を制限酵素１目ｎｄｌ［［及びＢａｍＨＩで消化し、
予め旧ｎｄＩ［ｌ及びＸｈｏ ＩＩで消化しておいたｐ
β１ ｔｒｐＤＮＡと混合した。
ーブランド・シンポジウム：組換えＤＮＡ Ｊエイ・ウ
オールトン編、エルザビアプレス社、１４３−１５３
頁（１９８１年）〕複製型（ＲＦ） ＤＮＡ （第４図
）を制限酵素１目ｎｄｌ［［及びＢａｍＨＩで消化し、
予め旧ｎｄＩ［ｌ及びＸｈｏ ＩＩで消化しておいたｐ
β１ ｔｒｐＤＮＡと混合した。
次に混合物を７４ＤＮＡリガーゼで連結し、連結ＤＮＡ
を大腸菌−ＪＭ１０３株のコンビテント細胞中へ形質転
換させ、Ｘｇａｌインディケータ−プレート上に播いた
〔ジェイ・メソシング等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅ５（１９８１年）９巻３０９−３２１頁〕。組換
えファージを含有するプラーク（白いプラーク）を取り
上げ、新鮮なＪＭ１０３の培養物に接種し、そして感染
細胞からＲＦ分子のミニブレツブを調整した（エッチ・
ディー・バーンボイム（Ｈ，Ｄ、 Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）
及びジェイ・ドリイ（Ｊ、 Ｉｔａｌｙン、Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃ１ｄ Ｒｅ５（１９７９年）７巻１５１３−
１！５２３頁）。ＩＦＮ−β挿入部を含有するクローン
を同定するために、ＲＦ分子を種々の制限酵素で消化し
た。このような１クローン（Ｍ２Ｓ−β１）の制限地図
を第５図に示す。Ｍ２Ｓ−β１クローンから１本鎖（ｓ
ｓ）ファージＤＮＡをつくり、合成オリゴヌクレオチド
を使用する部位特異的突然変異誘発の鋳型として用いた
。
を大腸菌−ＪＭ１０３株のコンビテント細胞中へ形質転
換させ、Ｘｇａｌインディケータ−プレート上に播いた
〔ジェイ・メソシング等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅ５（１９８１年）９巻３０９−３２１頁〕。組換
えファージを含有するプラーク（白いプラーク）を取り
上げ、新鮮なＪＭ１０３の培養物に接種し、そして感染
細胞からＲＦ分子のミニブレツブを調整した（エッチ・
ディー・バーンボイム（Ｈ，Ｄ、 Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）
及びジェイ・ドリイ（Ｊ、 Ｉｔａｌｙン、Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃ１ｄ Ｒｅ５（１９７９年）７巻１５１３−
１！５２３頁）。ＩＦＮ−β挿入部を含有するクローン
を同定するために、ＲＦ分子を種々の制限酵素で消化し
た。このような１クローン（Ｍ２Ｓ−β１）の制限地図
を第５図に示す。Ｍ２Ｓ−β１クローンから１本鎖（ｓ
ｓ）ファージＤＮＡをつくり、合成オリゴヌクレオチド
を使用する部位特異的突然変異誘発の鋳型として用いた
。
ＵＬ例」ユ 部位時 約突然・ ｆ
ｏ、１ｍＭアデノシン三燐酸（ＡＴＰ） 、５０ ｍＭ
ヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩（トリス−塩酸）
ｐＨ８，０，１０ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭジチオ
スレイトール（ＤＤＴ）及びＴ４キナーゼ９単位の存在
下に、５０μβ中で合成オリゴヌクレオチドＧＣＡＡＴ
ＴＴＴＣＡＧＡＧＴＣＡＧ （プライマーー）４０ピコ
モルをＴ４キナーゼにより３７°Ｃで１時間処理した。
ヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩（トリス−塩酸）
ｐＨ８，０，１０ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭジチオ
スレイトール（ＤＤＴ）及びＴ４キナーゼ９単位の存在
下に、５０μβ中で合成オリゴヌクレオチドＧＣＡＡＴ
ＴＴＴＣＡＧＡＧＴＣＡＧ （プライマーー）４０ピコ
モルをＴ４キナーゼにより３７°Ｃで１時間処理した。
５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ１−リス−塩酸、ｐ
Ｈ８，０，１０ｍＭ塩化マグネシウム及び１０ｍＭβ−
メルカプトエタノールを含有する混合物５０μβ中で、
このキナーゼ処理されたプライマー（１２ピコモル）を
６７℃で５分、及ヒ４２℃で２５分加熱することによっ
て１本鎖（ｓｓ） Ｍ２Ｓ−βＩ ＤＮＡ５μｇにハイ
ブリット形成させた。アニーリングした混合物を次に氷
上で冷却し、０．５ｍＭ各デオキシヌクレオチド三燐酸
（ｄＮＴＰ）、８０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７，４，８
ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩ Ｋｌｅｎｏｅｖ断片９単位、０．
５ ｍＭＡＴＰ及びＴ４１１ＮＡリガーゼ２単位を含有
する反応混合物５０μβに添加し、３７℃で３時間及び
２５°ｄで２時間インキュベートした。次にフェノール
抽出とエタノール沈澱によって反応を停止させた。ＤＮ
Ａを１０ｍＭトリス−塩酸、ｐ Ｈ８，０，１０ｍＭエ
チレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、５０％蔗糖及び０
．０５％ブロモフェニルブルー中に溶解し、臭化エチジ
ウム２μｇ／ｍβの存在下、０．８％アガロースゲル上
の電気泳動にかけた。Ｍ２Ｓ−β１のＲＦ型に対応する
ＤＮＡバンドをパーコレート法〔アール・ダブリュー・
デービス（Ｒ，’Ａ、 Ｄａｖｉｓ） ３、「高等細
菌遺伝学ｊ （Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ） 、’：ｌ−ルド・スプリング・
ハーバ−研究所、Ｎ、 Ｙ、 １７８〜１７９頁（１９
８０年）〕によってゲルスライスから溶離した。溶離さ
れたＤＮＡをコンビテントＪＭ１０３細胞の形質転換に
使用し、菌を一夜生育させ、培養基上澄液から５ｓＤＮ
Ａを単離した。このｓｓＤ’Ｎ、Ａをプライマー伸張の
第二サイクルに鋳型として使用し、ゲル精製されたＲＦ
型ＤＮＡをコンビテントＪＭ１０３細胞中へ形質転換さ
せ、寒天プレート上に播き、−夜培養するとファージプ
ラークが得られる。
Ｈ８，０，１０ｍＭ塩化マグネシウム及び１０ｍＭβ−
メルカプトエタノールを含有する混合物５０μβ中で、
このキナーゼ処理されたプライマー（１２ピコモル）を
６７℃で５分、及ヒ４２℃で２５分加熱することによっ
て１本鎖（ｓｓ） Ｍ２Ｓ−βＩ ＤＮＡ５μｇにハイ
ブリット形成させた。アニーリングした混合物を次に氷
上で冷却し、０．５ｍＭ各デオキシヌクレオチド三燐酸
（ｄＮＴＰ）、８０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７，４，８
ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩ Ｋｌｅｎｏｅｖ断片９単位、０．
５ ｍＭＡＴＰ及びＴ４１１ＮＡリガーゼ２単位を含有
する反応混合物５０μβに添加し、３７℃で３時間及び
２５°ｄで２時間インキュベートした。次にフェノール
抽出とエタノール沈澱によって反応を停止させた。ＤＮ
Ａを１０ｍＭトリス−塩酸、ｐ Ｈ８，０，１０ｍＭエ
チレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、５０％蔗糖及び０
．０５％ブロモフェニルブルー中に溶解し、臭化エチジ
ウム２μｇ／ｍβの存在下、０．８％アガロースゲル上
の電気泳動にかけた。Ｍ２Ｓ−β１のＲＦ型に対応する
ＤＮＡバンドをパーコレート法〔アール・ダブリュー・
デービス（Ｒ，’Ａ、 Ｄａｖｉｓ） ３、「高等細
菌遺伝学ｊ （Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ） 、’：ｌ−ルド・スプリング・
ハーバ−研究所、Ｎ、 Ｙ、 １７８〜１７９頁（１９
８０年）〕によってゲルスライスから溶離した。溶離さ
れたＤＮＡをコンビテントＪＭ１０３細胞の形質転換に
使用し、菌を一夜生育させ、培養基上澄液から５ｓＤＮ
Ａを単離した。このｓｓＤ’Ｎ、Ａをプライマー伸張の
第二サイクルに鋳型として使用し、ゲル精製されたＲＦ
型ＤＮＡをコンビテントＪＭ１０３細胞中へ形質転換さ
せ、寒天プレート上に播き、−夜培養するとファージプ
ラークが得られる。
大旌侃１ 部位ン 的７然・異を
上の実施例２の実験をくり返す。但し、合成オリゴヌク
レオチドプライマーとして、システィンをコードするも
のからスレオニンをコードするものへＩＦＮ−β遺伝子
のコドン１７を変えるのにＧＣＡＡＴＴＴＴＣＡＧＡＣ
ＴＣＡＧをイ吏用する。
レオチドプライマーとして、システィンをコードするも
のからスレオニンをコードするものへＩＦＮ−β遺伝子
のコドン１７を変えるのにＧＣＡＡＴＴＴＴＣＡＧＡＣ
ＴＣＡＧをイ吏用する。
遺」１肛 那進」υυを及道
上の実施例２の実験をくり返す。但し合成オリ５ゴヌク
レオチドプライマーとしてはＩＦＮ−β遺伝子のコドン
１７を欠損させるのに八ＧＣＡＡＴＴＴＴＣＡＧ、ＣＡ
ＧＡＡＧＣＴＣＣＴＧを使用する。
レオチドプライマーとしてはＩＦＮ−β遺伝子のコドン
１７を欠損させるのに八ＧＣＡＡＴＴＴＴＣＡＧ、ＣＡ
ＧＡＡＧＣＴＣＣＴＧを使用する。
突然変異させたＭ２Ｓ−β１プラークの入ったプレート
（実施例１）並びに突然変異しないＭ２Ｓ−β１ファー
ジプラークの入った２枚のプレートを４℃に冷却し、各
プレートからのプラークを２枚のニトロセルロース円形
フィルター上へ、第一フィルターの場合には乾燥フィル
ターを寒天プレート上へ５分間重ね、第二フィルターの
場合は１５分間重ねて移した。次に０．２ ＮＮａＯＨ
，１，５Ｍ塩化ナトリウム及び０．２％トリトンｘ−ｉ
ｏｏに浸した厚手の濾紙上へフィルター類を５分間置き
、次に０、５ Ｍ ｌ−リス−塩酸、ｐ Ｈ７，５、及
び１．５Ｍ塩化ナトリウムに浸した濾紙上へ更に５分間
重ねて中和した。フィルターを同様なやり方で、２ＸＳ
ＳＣ（標準くえん酸塩）に浸したフィルター上で２回洗
い、乾燥し、真空乾燥炉内で８０℃で２時間乾燥させた
。重複フィルターをフィルター当たり１０ｍβのＤＮＡ
ハイブリッド形成緩衝液（５ｘＳＳＣ）、 ｐＨ７，０
，４Ｘデンハード液（ポリビニルピロリドン。
（実施例１）並びに突然変異しないＭ２Ｓ−β１ファー
ジプラークの入った２枚のプレートを４℃に冷却し、各
プレートからのプラークを２枚のニトロセルロース円形
フィルター上へ、第一フィルターの場合には乾燥フィル
ターを寒天プレート上へ５分間重ね、第二フィルターの
場合は１５分間重ねて移した。次に０．２ ＮＮａＯＨ
，１，５Ｍ塩化ナトリウム及び０．２％トリトンｘ−ｉ
ｏｏに浸した厚手の濾紙上へフィルター類を５分間置き
、次に０、５ Ｍ ｌ−リス−塩酸、ｐ Ｈ７，５、及
び１．５Ｍ塩化ナトリウムに浸した濾紙上へ更に５分間
重ねて中和した。フィルターを同様なやり方で、２ＸＳ
ＳＣ（標準くえん酸塩）に浸したフィルター上で２回洗
い、乾燥し、真空乾燥炉内で８０℃で２時間乾燥させた
。重複フィルターをフィルター当たり１０ｍβのＤＮＡ
ハイブリッド形成緩衝液（５ｘＳＳＣ）、 ｐＨ７，０
，４Ｘデンハード液（ポリビニルピロリドン。
フィコール及び牛血清アルブミン、■×−各０．０２％
）、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、 ５
０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液、ｐ Ｈ７，０及び１００
μｇ ／ ｍ ｊ＋の変性サケ精子ＤＮＡにより、５５
℃で４時間、事前ハイブリッド形成させた。オリゴヌク
レオチドブライマーを３２ｐで標識したＡＴＰでキナー
ゼ下に処理することによって３２Ｐで標識したプローブ
゛をつくった。フィルター当たり５ ｍ ＩｔのＤＮΔ
バイブリド形成緩衝液中でフィルターを３２ｐで標識し
たプライマー３．５ Ｘ １０ ’ｃｐｍ／ｍ ｊ２に
５５℃で２４時間ハイブリッド形成させた。０．１％Ｓ
ＤＳと減少する量のＳＳＣを含有する洗浄用緩衝液中で
それぞれ３０分、５５℃でフィルター類を洗った。フィ
ルター類を、初めに２ＸＳＳＣを含んだ緩衝液で洗い、
そして突然変異していないＭ２Ｓ−β１プラークを含有
する対照フィルターはガイガー計数管を用いて放射能の
存在について検査した。
）、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、 ５
０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液、ｐ Ｈ７，０及び１００
μｇ ／ ｍ ｊ＋の変性サケ精子ＤＮＡにより、５５
℃で４時間、事前ハイブリッド形成させた。オリゴヌク
レオチドブライマーを３２ｐで標識したＡＴＰでキナー
ゼ下に処理することによって３２Ｐで標識したプローブ
゛をつくった。フィルター当たり５ ｍ ＩｔのＤＮΔ
バイブリド形成緩衝液中でフィルターを３２ｐで標識し
たプライマー３．５ Ｘ １０ ’ｃｐｍ／ｍ ｊ２に
５５℃で２４時間ハイブリッド形成させた。０．１％Ｓ
ＤＳと減少する量のＳＳＣを含有する洗浄用緩衝液中で
それぞれ３０分、５５℃でフィルター類を洗った。フィ
ルター類を、初めに２ＸＳＳＣを含んだ緩衝液で洗い、
そして突然変異していないＭ２Ｓ−β１プラークを含有
する対照フィルターはガイガー計数管を用いて放射能の
存在について検査した。
５ｓｃ１度を段階的に低下させ、未突然変異Ｍ１３−β
１プラークをもつ対照フィルター上に検出可能な放射能
が残らなくなるまでフィルターを洗った。
１プラークをもつ対照フィルター上に検出可能な放射能
が残らなくなるまでフィルターを洗った。
ＳＳＣの使用最低濃度は０．１ ｘｓｓｃであった。フ
ィルターを空気乾燥し、−７０℃で２〜３日オートラジ
オグラフ処理した。突然変異したＭ２Ｓ−β１のプラー
ク４８０個と突然変異していない対照プラーク１００個
をキナーゼ処理したオリゴヌクレオチドプローブによっ
てスクリーニングした。対照プラークではプローブとハ
イブリッド形成したものが全く存在せず、一方突然変異
したＭ２Ｓ−β１プラーク５個がプローブとハイブリッ
ドを形成した。
ィルターを空気乾燥し、−７０℃で２〜３日オートラジ
オグラフ処理した。突然変異したＭ２Ｓ−β１のプラー
ク４８０個と突然変異していない対照プラーク１００個
をキナーゼ処理したオリゴヌクレオチドプローブによっ
てスクリーニングした。対照プラークではプローブとハ
イブリッド形成したものが全く存在せず、一方突然変異
したＭ２Ｓ−β１プラーク５個がプローブとハイブリッ
ドを形成した。
５個の突然変異Ｍ１３−β１プラークの１個（Ｈ１３−
５Ｙ２５０１）を取り上げ、ＪＭ１０３培養基へ接種し
た。
５Ｙ２５０１）を取り上げ、ＪＭ１０３培養基へ接種し
た。
上澄液から５ｓＤＮＡを調製し、そして細胞ペレ・シト
から２本鎖（ｄｓ） ＤＮＡを調製した。Ｍ１３ユニバ
ーサルプライマーを使用して、クローンのジデオキシ配
列決定用の鋳型として５ｓＤＮＡを使用した。配列決定
分析の結果を第６図に示す。この結果は、ＴＧＴｃｙｓ
コドンがＡＧＴｓｅｒコドンへ変換されたことを確証し
ている。。
から２本鎖（ｄｓ） ＤＮＡを調製した。Ｍ１３ユニバ
ーサルプライマーを使用して、クローンのジデオキシ配
列決定用の鋳型として５ｓＤＮＡを使用した。配列決定
分析の結果を第６図に示す。この結果は、ＴＧＴｃｙｓ
コドンがＡＧＴｓｅｒコドンへ変換されたことを確証し
ている。。
実施例６．大腸菌における突然変異ＩＦＮ−βの発現Ｍ
１３−５Ｙ２５０１からのＲＦ ＤＮＡを制限酵素旧
ｎｄｎＩ及びＸｈｏ ＩＩで消化し、５２０ｔ＋ｐの挿
入断片を１％アガロースゲル上で精製した。大腸菌ｔｒ
ｐプロモーターを含有するプラスミドｐＴｒｐ３ （
第７図）を酵素Ｈ４ｎｄｌＩＩ及びＢａｍＨＩで消化し
、精製したＭ２Ｓ−３Ｙ２５０１断片と混合し、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼの存在下に連結した。連結ＤＮＡをＥ、コ
リＭＭ２９４株へ形質転換した。
１３−５Ｙ２５０１からのＲＦ ＤＮＡを制限酵素旧
ｎｄｎＩ及びＸｈｏ ＩＩで消化し、５２０ｔ＋ｐの挿
入断片を１％アガロースゲル上で精製した。大腸菌ｔｒ
ｐプロモーターを含有するプラスミドｐＴｒｐ３ （
第７図）を酵素Ｈ４ｎｄｌＩＩ及びＢａｍＨＩで消化し
、精製したＭ２Ｓ−３Ｙ２５０１断片と混合し、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼの存在下に連結した。連結ＤＮＡをＥ、コ
リＭＭ２９４株へ形質転換した。
アンピシリン耐性形質転換体を薬剤テトラサイクリンに
対する感受性の点からスクリーニングした。
対する感受性の点からスクリーニングした。
アンピシリン耐性でテトラサイクリン感受性の５クロー
ンからのプラスミドＤＮＡを、Ｍ ｔａ −５Ｙ２５０
１挿入部の存在についてスクリーニングするためＨｉｎ
ｆ Ｉで消化した。第８ａ図は、クローンの一つ（ｐｓ
Ｙ２５０１）の旧ｎｆＩ制限パターンを示すが、図では
これを元のＩＦＮ−βクローンすなわちｐβｌ ｔｒｐ
のＨｉｎｆ Ｉパターンを比較している。予想のように
、ｐｓＹ２５０１に追加の旧ｎｆｌサイトがあり、１９
７ｂｐのＩＦＮ−β内部断片が１６９ｂｐの断片と２８
ｂｐ゛の断片に切れている（第８ｂ図）。クローンｐｓ
Ｙ２５０１の制限地図を第９図に示す。突然変異１’Ｆ
Ｎ−β遺伝子の完全なりＮＡ配列を、予測されたアミノ
酸配列と一緒に第１０図に示す。クローンｐｓＹ２５０
１ と称するプラスミドは６０６０４イリノイ州ペオリ
ア、ノース・ユニバーシティ・ストリート１８１５番地
、米国農務省、科学教育局北部研究センター、発酵研究
所のアグリカルチュラル・リサーチ・カルチャーコレク
ション（ＮＲＲＬ）に寄託されている。指定された寄託
番号はＣＭＣＧ１５３３号及びＮＲＲＬＢ−１５３５６
号である。
ンからのプラスミドＤＮＡを、Ｍ ｔａ −５Ｙ２５０
１挿入部の存在についてスクリーニングするためＨｉｎ
ｆ Ｉで消化した。第８ａ図は、クローンの一つ（ｐｓ
Ｙ２５０１）の旧ｎｆＩ制限パターンを示すが、図では
これを元のＩＦＮ−βクローンすなわちｐβｌ ｔｒｐ
のＨｉｎｆ Ｉパターンを比較している。予想のように
、ｐｓＹ２５０１に追加の旧ｎｆｌサイトがあり、１９
７ｂｐのＩＦＮ−β内部断片が１６９ｂｐの断片と２８
ｂｐ゛の断片に切れている（第８ｂ図）。クローンｐｓ
Ｙ２５０１の制限地図を第９図に示す。突然変異１’Ｆ
Ｎ−β遺伝子の完全なりＮＡ配列を、予測されたアミノ
酸配列と一緒に第１０図に示す。クローンｐｓＹ２５０
１ と称するプラスミドは６０６０４イリノイ州ペオリ
ア、ノース・ユニバーシティ・ストリート１８１５番地
、米国農務省、科学教育局北部研究センター、発酵研究
所のアグリカルチュラル・リサーチ・カルチャーコレク
ション（ＮＲＲＬ）に寄託されている。指定された寄託
番号はＣＭＣＧ１５３３号及びＮＲＲＬＢ−１５３５６
号である。
ｐｓＹ２５０１及びｐβ１ｔｒｐ （子孫を含む）の培
養物を１．０の光学密度（ＯＤ６゜。）まで生育させた
。無細胞抽出物をつくり、ＩＦＮ−βの抗ウイルス活性
量を微量力価検定法でＧＭ２７６７細胞によって検定し
た。
養物を１．０の光学密度（ＯＤ６゜。）まで生育させた
。無細胞抽出物をつくり、ＩＦＮ−βの抗ウイルス活性
量を微量力価検定法でＧＭ２７６７細胞によって検定し
た。
クローンｐｓＹ２５０１の抽出物はｐβ１ｔｒｐより３
〜１０倍高い活性を示しく第１表）、クローンｐｓＹ２
５０１がＩＦＮ−β活性を示す蛋白質をより多量に合成
しているか、又はつ（られた蛋白質がより高い比活性を
もっているかのいずれかであることが示される。
〜１０倍高い活性を示しく第１表）、クローンｐｓＹ２
５０１がＩＦＮ−β活性を示す蛋白質をより多量に合成
しているか、又はつ（られた蛋白質がより高い比活性を
もっているかのいずれかであることが示される。
第１表
抽出物 訪ごし４四り艷配牲−Ｑ創位〃すＱ−ｐｓＹ２
５０１ ’ ６Ｘ１０’ｐβ１ ｔ ｒ ｐ
Ｉ Ｘ １０”ｐｔｒｐ３ （対照）３０ クローンｐｓＹ２５０１が数倍多い活性蛋白を合成して
いたかどうか決定するため、両クローンの抽出物を対照
抽出物と共にＳＯＳポリアクリルアミドゲル上の電気泳
動にかけ、ゲルをクーマーシーブルーで染色して蛋白質
を発色させた。第１１図に示すように、クローンｐｓＹ
２５０１とｐβｌ ｔｒｐの抽出物中に存在するが対照
のｐｔｒｐ３抽出物中にはない約１８．０００ダルトン
の蛋白質に対応する蛋白質バンドが一つだけあった。こ
の蛋白質は約２０ 、０００ダルトンの分子量をもつが
、１８，０００ダルトンの蛋白質のゲル移動パターンを
示しており、ｐβ１ ｔｒｐの抽出物からこの蛋白質を
精製することによってＩＦＮ−βであることが予めわか
っていた。ｐｓＹ２５０１抽出物中にはｐβ１ ｔｒｐ
の抽出物中よりこの蛋白質の量が少ないから、クローン
ｐｓＹ２５０１抽出物中の蛋白質の比活性はクローンｐ
βｌ ｔｒｐのそれより高い。
５０１ ’ ６Ｘ１０’ｐβ１ ｔ ｒ ｐ
Ｉ Ｘ １０”ｐｔｒｐ３ （対照）３０ クローンｐｓＹ２５０１が数倍多い活性蛋白を合成して
いたかどうか決定するため、両クローンの抽出物を対照
抽出物と共にＳＯＳポリアクリルアミドゲル上の電気泳
動にかけ、ゲルをクーマーシーブルーで染色して蛋白質
を発色させた。第１１図に示すように、クローンｐｓＹ
２５０１とｐβｌ ｔｒｐの抽出物中に存在するが対照
のｐｔｒｐ３抽出物中にはない約１８．０００ダルトン
の蛋白質に対応する蛋白質バンドが一つだけあった。こ
の蛋白質は約２０ 、０００ダルトンの分子量をもつが
、１８，０００ダルトンの蛋白質のゲル移動パターンを
示しており、ｐβ１ ｔｒｐの抽出物からこの蛋白質を
精製することによってＩＦＮ−βであることが予めわか
っていた。ｐｓＹ２５０１抽出物中にはｐβ１ ｔｒｐ
の抽出物中よりこの蛋白質の量が少ないから、クローン
ｐｓＹ２５０１抽出物中の蛋白質の比活性はクローンｐ
βｌ ｔｒｐのそれより高い。
ス」虻例７． ＩＦＭ−β５ｊｒ１７の精製ＩＦＮ−
β５ｅｒ１７をつくるように形質転換されたＥ。
β５ｅｒ１７をつくるように形質転換されたＥ。
コリからＩＦＮ−β５ｅｒ１７を回収した。Ｅ、コリを
次の生育培地中で、６８０ｎｍで１０〜１１の光学密度
（乾燥重量８．４ｇ／β）まで生育させた。
次の生育培地中で、６８０ｎｍで１０〜１１の光学密度
（乾燥重量８．４ｇ／β）まで生育させた。
以下余白
−１し一コ（−
塩化アンモニウム ２０ｒｎＭｉ
酸カリウム １６．１ｍＭ燐酸−
カリウム ７．８ｍＭ燐酸二ナト
リウム １２．２ｍＭ硫酸マグネシウ
ム・七水和物 ３ｍＭクエン酸三ナトリウム
・三水和物 １．５ｍＭ硫酸マンガン・四水和物
３０μＭ硫酸亜鉛・七水和物
３０μＭ硫酸銅・五水和物
３！ＭＬ−）リプトファン ７０■／
β硫酸第−鉄・七水和物 ７２μＭチア
ミン塩酸塩 ２０■／βグルコース
４０ｇ／Ａアンモニアでｐ
Ｈ調整 形質転換ずみＥ、コリの収穫物９．１！（９，９ｋｇ）
を２０℃に冷却し、濾液重量が８．８ ｋｇになるまで
、収穫物を一１１０ｋｐａの平均圧力損失と毎分２６０
ｍ１の定常濾液流量でクロスフローフィルターに通すこ
とにより濃縮した。濃縮液（約１”ｊりを容器に流し込
み、１５℃に冷却した。濃縮液を５℃、約６９、０ＯＯ
ｋｐａでマントン−ゴーリンホモジナイザーに通すこと
によって濃縮液中の菌体を破砕した。
酸カリウム １６．１ｍＭ燐酸−
カリウム ７．８ｍＭ燐酸二ナト
リウム １２．２ｍＭ硫酸マグネシウ
ム・七水和物 ３ｍＭクエン酸三ナトリウム
・三水和物 １．５ｍＭ硫酸マンガン・四水和物
３０μＭ硫酸亜鉛・七水和物
３０μＭ硫酸銅・五水和物
３！ＭＬ−）リプトファン ７０■／
β硫酸第−鉄・七水和物 ７２μＭチア
ミン塩酸塩 ２０■／βグルコース
４０ｇ／Ａアンモニアでｐ
Ｈ調整 形質転換ずみＥ、コリの収穫物９．１！（９，９ｋｇ）
を２０℃に冷却し、濾液重量が８．８ ｋｇになるまで
、収穫物を一１１０ｋｐａの平均圧力損失と毎分２６０
ｍ１の定常濾液流量でクロスフローフィルターに通すこ
とにより濃縮した。濃縮液（約１”ｊりを容器に流し込
み、１５℃に冷却した。濃縮液を５℃、約６９、０ＯＯ
ｋｐａでマントン−ゴーリンホモジナイザーに通すこと
によって濃縮液中の菌体を破砕した。
燐酸塩で緩衝化された食塩水、ｐ Ｈ７，４（ＰＢＳ）
１にでホモジナイザーを洗い、洗浄液を破砕物に加え
ると、２１の最終容量が得られた。この容量を毎分５０
ｍ ｊ２の流量で１２０００ｘｇの連続遠心分離にか
けた。固体を上澄液から分離し、２重量％ＳＤＳを含有
するＰＢＳ ４βに再懸濁させた。この懸濁液を室温で
１５分かきまぜたあと、目に見える懸濁物はなかった。
１にでホモジナイザーを洗い、洗浄液を破砕物に加え
ると、２１の最終容量が得られた。この容量を毎分５０
ｍ ｊ２の流量で１２０００ｘｇの連続遠心分離にか
けた。固体を上澄液から分離し、２重量％ＳＤＳを含有
するＰＢＳ ４βに再懸濁させた。この懸濁液を室温で
１５分かきまぜたあと、目に見える懸濁物はなかった。
次に溶液を２−ブタノールで、２−ブタノール：溶液の
１：１容量比で抽出した。
１：１容量比で抽出した。
液−液相分離装置中で毎分２００ｍ ｊ！の流量を用い
て抽出を行なった。次に有機相を分離し、そして蒸発乾
固させることにより蛋白質２１．３ｇを得た。これを蒸
留水に１：１０の容量比で再懸濁した。
て抽出を行なった。次に有機相を分離し、そして蒸発乾
固させることにより蛋白質２１．３ｇを得た。これを蒸
留水に１：１０の容量比で再懸濁した。
回収された生成物は、ウィルスの細胞病理作用（ｃＰＥ
）に対する防護に基づく検定を用いて、ヒトＩＦＮ−β
活性について検定された。ミクロタイタープレート内で
この検定を行なった。最少基本借地５０μｌを各容器に
仕込み、第一容器には資料２５μｌを入れ、つぎ容器以
降には１：３の容量の希釈を連続的に行なった。ウィル
ス（水泡性口内炎）。
）に対する防護に基づく検定を用いて、ヒトＩＦＮ−β
活性について検定された。ミクロタイタープレート内で
この検定を行なった。最少基本借地５０μｌを各容器に
仕込み、第一容器には資料２５μｌを入れ、つぎ容器以
降には１：３の容量の希釈を連続的に行なった。ウィル
ス（水泡性口内炎）。
細胞（ヒト線維芽細胞Ｇ）Ｉ −２７６７系統）及び標
準ＩＦＮ−β対照群を各プレートに収容せしめた。ｍ１
当たり１００単位の標準ＩＦＮ−βを使用した。次にプ
レートに紫外線を１０分間照射した。照射後、細胞懸濁
液（ｍβ当たり細胞１．２．ｘ １０５）１００μｌを
各容器に加え、トレーを１８〜２４時間インキュベート
した。細胞当たり１プラ一ク形成単位でウィルス液を細
胞対照プレートを除く各容器に加えた。
準ＩＦＮ−β対照群を各プレートに収容せしめた。ｍ１
当たり１００単位の標準ＩＦＮ−βを使用した。次にプ
レートに紫外線を１０分間照射した。照射後、細胞懸濁
液（ｍβ当たり細胞１．２．ｘ １０５）１００μｌを
各容器に加え、トレーを１８〜２４時間インキュベート
した。細胞当たり１プラ一ク形成単位でウィルス液を細
胞対照プレートを除く各容器に加えた。
ウィルス対照が１００％のＣＰＥを示すまでトレーをイ
ンキュベートした。これは、ウィルス液を加えてから通
常１８〜２４時間で生じた。標準ＩＦＮ−β対照の５０
％ＣＰＥ容器の位置の点から検定結果を解釈した。この
点からプレート上の全試料についてのインターフェロン
の力価を測定した。回収された生成物の比活性は５ Ｘ
ＩＯ” Ｕ／ｍ１２と決定された。
ンキュベートした。これは、ウィルス液を加えてから通
常１８〜２４時間で生じた。標準ＩＦＮ−β対照の５０
％ＣＰＥ容器の位置の点から検定結果を解釈した。この
点からプレート上の全試料についてのインターフェロン
の力価を測定した。回収された生成物の比活性は５ Ｘ
ＩＯ” Ｕ／ｍ１２と決定された。
実施斑ｌ 酸゛びクロマトグラフィによる実施例７の方
法をくり返したが、但し、抽出。
法をくり返したが、但し、抽出。
水相と有機相の分離、及び有機相とＰＢＳとの容量比３
；１での混合の後、氷酢酸の添加によって混合物のｐＨ
を約５に下げた。生じた沈澱物を１００００〜１７００
０ｘｇ、 １５分間の遠心分離によって分離し、ペレッ
トを１０％Ｗ／Ｖ ＳＤＳ、 １０ｍＭ ＤＴＴ、
５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５，５に再溶解し
、８０℃に５分間加熱した。
；１での混合の後、氷酢酸の添加によって混合物のｐＨ
を約５に下げた。生じた沈澱物を１００００〜１７００
０ｘｇ、 １５分間の遠心分離によって分離し、ペレッ
トを１０％Ｗ／Ｖ ＳＤＳ、 １０ｍＭ ＤＴＴ、
５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５，５に再溶解し
、８０℃に５分間加熱した。
次に、溶液を、ベンクマン勾配系を使用して、ブラウン
リーＲＰ−３００，１０μＭ、「アクアボア」カラムに
かけた。緩衝液Ａは水中０．１％トリフルオロ酢酸（Ｔ
ＦＡ）であり、緩衝液Ｂはアセトニトリル中０．１％Ｔ
ＦＡとした。検出は２８０ｒ＋ｎ＋での紫外線吸光度に
よった。溶媒プログラムは３時間で０％緩衝液Ｂから１
００％緩衝液Ｂへの線形勾配とした。
リーＲＰ−３００，１０μＭ、「アクアボア」カラムに
かけた。緩衝液Ａは水中０．１％トリフルオロ酢酸（Ｔ
ＦＡ）であり、緩衝液Ｂはアセトニトリル中０．１％Ｔ
ＦＡとした。検出は２８０ｒ＋ｎ＋での紫外線吸光度に
よった。溶媒プログラムは３時間で０％緩衝液Ｂから１
００％緩衝液Ｂへの線形勾配とした。
最高のインターフェロン活性を含有するフラクションを
プールし、このプールされたインターフェロン調製物の
比活性は、天然のＩＦＮ−βにおける蛋白質ｍｇ当たり
約２Ｘ１０”国際草位に比べ、９．０×１０７ないし３
．８ Ｘ １０” Ｕ／ｍＪと決定された。
プールし、このプールされたインターフェロン調製物の
比活性は、天然のＩＦＮ−βにおける蛋白質ｍｇ当たり
約２Ｘ１０”国際草位に比べ、９．０×１０７ないし３
．８ Ｘ １０” Ｕ／ｍＪと決定された。
去施炎主 ｌＮＮ−β５ｅｒ１７の生化学的特徴付け５
゜７ＮＨＣＩｌ、０．１％フェノールの２００μ！中に
おいて試料４０μｇを１０８℃で２４〜７２時間の加水
分解にかけた後、アミノ酸組成を決定した。プロリンと
システィンは、過蟻酸酸化後、同じやり方で決定された
。この場合、フェノールを加水分解から省略した。トリ
プトファンは、５．７Ｎ塩＃１２１０％メルカプト酢酸
（フェノールなし）中で試料４００μｌを２４時間加水
分解した後に分析した。
゜７ＮＨＣＩｌ、０．１％フェノールの２００μ！中に
おいて試料４０μｇを１０８℃で２４〜７２時間の加水
分解にかけた後、アミノ酸組成を決定した。プロリンと
システィンは、過蟻酸酸化後、同じやり方で決定された
。この場合、フェノールを加水分解から省略した。トリ
プトファンは、５．７Ｎ塩＃１２１０％メルカプト酢酸
（フェノールなし）中で試料４００μｌを２４時間加水
分解した後に分析した。
分析は、ＡＡＩＯ樹脂の単一カラムを使用するベラ２フ
２１２１ ＪＰＮ−β５ｅｒ１７の代表的な２４−、 ４Ｂ−、
７２一時間の酸加水分解から計算されるアミノ酸組成は
、Ｎ−末端メチオニンが欠けているほかは、クローンＩ
ＦＮ遺伝子のＤＮＡ配列によって予測されるものとよく
一致している。精製ＩＦＮのアミノ酸末端（ｔｅｒｍｉ
ｎｕｓ）からの最初の５８残基のアミノ酸配列は、試料
０．７ｍｇから、ベンクマン８９０ Ｃ配列測定装置で
０． １Ｍクアドロール緩衝液を使って決定された。Ｐ
ＴＨアミノ酸は、アルテックスウルトラスフェア−０Ｄ
Ｓカラム（４． ６ Ｘ ２５０ｍｍ）による逆相高圧
液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）に４５℃でかけ、４
０％緩衝液Ｂで１．３分、４０〜７０％緩衝液Ｂで８，
４分溶出することにより決定された。ここで緩衝液Ａは
０．０１１５Ｍ酢酸ナトリウム、５％テトラヒドロフラ
ン（ＴＨＦ） 。
２１２１ ＪＰＮ−β５ｅｒ１７の代表的な２４−、 ４Ｂ−、
７２一時間の酸加水分解から計算されるアミノ酸組成は
、Ｎ−末端メチオニンが欠けているほかは、クローンＩ
ＦＮ遺伝子のＤＮＡ配列によって予測されるものとよく
一致している。精製ＩＦＮのアミノ酸末端（ｔｅｒｍｉ
ｎｕｓ）からの最初の５８残基のアミノ酸配列は、試料
０．７ｍｇから、ベンクマン８９０ Ｃ配列測定装置で
０． １Ｍクアドロール緩衝液を使って決定された。Ｐ
ＴＨアミノ酸は、アルテックスウルトラスフェア−０Ｄ
Ｓカラム（４． ６ Ｘ ２５０ｍｍ）による逆相高圧
液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）に４５℃でかけ、４
０％緩衝液Ｂで１．３分、４０〜７０％緩衝液Ｂで８，
４分溶出することにより決定された。ここで緩衝液Ａは
０．０１１５Ｍ酢酸ナトリウム、５％テトラヒドロフラ
ン（ＴＨＦ） 。
ｐＨ５．０であり、緩衝液Ｂはアセトニトリル中１０％
ＴＨＦであった。
ＴＨＦであった。
決定されたＩＦＮ−β５ｅｒ１７のＮ末端アミノ酸配列
は、Ｎ−末端メチオニンの不在を除き、ＤＮＡ配列から
予測される予測配列に一致している。
は、Ｎ−末端メチオニンの不在を除き、ＤＮＡ配列から
予測される予測配列に一致している。
上に示したように、ＩＦＮ−β５ｅｒ１７調製物は天然
のＩＰＮ−βの比活性レベルに非常に近いか、それより
すぐれた活性を示す。ＴＦＮ−β５ｅｒ１７は遊離スル
フヒドリル基をもたないが、３１及び１４１位にだけ残
っているシスティン間に１個の〜５ー８ー結合を示す。
のＩＰＮ−βの比活性レベルに非常に近いか、それより
すぐれた活性を示す。ＴＦＮ−β５ｅｒ１７は遊離スル
フヒドリル基をもたないが、３１及び１４１位にだけ残
っているシスティン間に１個の〜５ー８ー結合を示す。
蛋白質は容易にオリゴマーをつくらず、実質的にモノマ
ー型にあると考えられる。本発明に従って得られるＩＦ
Ｎ−β５ｅｒ１７は単一生成物として又は種々の型の混
合物として不活性．無毒性。
ー型にあると考えられる。本発明に従って得られるＩＦ
Ｎ−β５ｅｒ１７は単一生成物として又は種々の型の混
合物として不活性．無毒性。
非アレルギー性で、生理的に許容される担体媒体中にお
ける医薬として受は入れられる製剤へ処方でき、がん療
法で、又はインターフェロン療法が指示される症状にお
ける臨床用，治療用に、またウィルス感染用に使用でき
る。このような媒体は蒸留水，生理食塩水，リンゲル液
，バンク液等をを包含するが、これらに限定はされない
。デキストロース、 ＩＳＡ （ヒト血清アルブミン
）等のような他の無毒性の安定化・可溶化用の添加物も
最適に包含してよい。治療処方剤は、経口で、又は静脈
内，筋肉内，［腔内及び皮下投与のような非経口で投与
できる。本発明の変形ＩＦＮ−β製剤は、局所用に通常
利用される適当な媒体中で局所適用のためにも使用でき
る。
ける医薬として受は入れられる製剤へ処方でき、がん療
法で、又はインターフェロン療法が指示される症状にお
ける臨床用，治療用に、またウィルス感染用に使用でき
る。このような媒体は蒸留水，生理食塩水，リンゲル液
，バンク液等をを包含するが、これらに限定はされない
。デキストロース、 ＩＳＡ （ヒト血清アルブミン
）等のような他の無毒性の安定化・可溶化用の添加物も
最適に包含してよい。治療処方剤は、経口で、又は静脈
内，筋肉内，［腔内及び皮下投与のような非経口で投与
できる。本発明の変形ＩＦＮ−β製剤は、局所用に通常
利用される適当な媒体中で局所適用のためにも使用でき
る。
上記のＩＦＮ−βムティンの主な利点は、ＩＦＮ−βの
１７位の遊離スルフヒドリル基（−３ＦＩ基）を排除さ
れているところにあり、これによってムティンにｃｙｓ
３１とｃｙｓ１４１の間に正しいジスルフィド結合を形
成させ、十分な生物学的活性に明白に必要なコンフォメ
ーションを取らせている。ＩＦＮ−β５ｅｒ１７の増大
した比活性のため、治療用により少ない投４量が使える
。１７位置のシスティンを欠失させ、遊離−３，Ｈ基を
排除すること゛によって、ＩＦＮ−β５ｅｒ１７蛋白質
は微生物でつくられるＩＦＮ−βはどたやすくダイマー
やオリゴマーを形成しない。これが蛋白質の精製を容易
にし、その安定性を強める。
１７位の遊離スルフヒドリル基（−３ＦＩ基）を排除さ
れているところにあり、これによってムティンにｃｙｓ
３１とｃｙｓ１４１の間に正しいジスルフィド結合を形
成させ、十分な生物学的活性に明白に必要なコンフォメ
ーションを取らせている。ＩＦＮ−β５ｅｒ１７の増大
した比活性のため、治療用により少ない投４量が使える
。１７位置のシスティンを欠失させ、遊離−３，Ｈ基を
排除すること゛によって、ＩＦＮ−β５ｅｒ１７蛋白質
は微生物でつくられるＩＦＮ−βはどたやすくダイマー
やオリゴマーを形成しない。これが蛋白質の精製を容易
にし、その安定性を強める。
災隻艶↓■
ヒトＩＬ−２をコードするｃＤＮＡクローンのヌクレオ
チド配列、ＩＬ−２ｃＤＮＡライブラリーをつくる手順
、これをＩＬ−２についてスクリーニングする手順はテ
ィー・タニグチ（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ、Ｔ、）、 Ｎａ
ｔｕｒｅ （１９８３年）２４巻３０５頁以隆に記述さ
れている。
チド配列、ＩＬ−２ｃＤＮＡライブラリーをつくる手順
、これをＩＬ−２についてスクリーニングする手順はテ
ィー・タニグチ（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ、Ｔ、）、 Ｎａ
ｔｕｒｅ （１９８３年）２４巻３０５頁以隆に記述さ
れている。
有力なＩＬ−２ｃＤＮＡクローンに関して濃縮されたｃ
ＤＮＡライブラリーは、慣用手順により、誘導された末
梢血液リンパ球（ＰＢＬ）とジャーカット細胞から得ら
れる濃縮されたＩＬ−２ｍＲＮＡフラクションからつく
られた。ＩＬ−２用ｍＲＮＡの濃縮は、ｍＲＮＡを分画
し、フラクションをキセノプス、ラエビス （Ｘｅｎｏ
ｐｕｓｌａｅｖｉｓ）の未成熟卵母細胞に注入し、卵母
細胞の溶解物のＩＬ−２活性をＨＴ−２細胞で検定し、
ＩＬ−２ｍＲＮＡ活性をもつフラクションを確認するこ
とによって行った〔ジ゛エイ・ワトソンＣＪＡ４ａ’ｔ
ｓｏｎ＞、 Ｊ、 Ｅｘｐ。
ＤＮＡライブラリーは、慣用手順により、誘導された末
梢血液リンパ球（ＰＢＬ）とジャーカット細胞から得ら
れる濃縮されたＩＬ−２ｍＲＮＡフラクションからつく
られた。ＩＬ−２用ｍＲＮＡの濃縮は、ｍＲＮＡを分画
し、フラクションをキセノプス、ラエビス （Ｘｅｎｏ
ｐｕｓｌａｅｖｉｓ）の未成熟卵母細胞に注入し、卵母
細胞の溶解物のＩＬ−２活性をＨＴ−２細胞で検定し、
ＩＬ−２ｍＲＮＡ活性をもつフラクションを確認するこ
とによって行った〔ジ゛エイ・ワトソンＣＪＡ４ａ’ｔ
ｓｏｎ＞、 Ｊ、 Ｅｘｐ。
Ｍｅｄ、 （１９７９年）１５０巻１５７０−１５１９
頁及びニス・ギリス（Ｓ、 Ｇ１１ｌｉｓ）等、Ｊ、
Ｉｍｍｕｎ、（１９７８年）１２０巻２０２７〜２０３
２頁〕。
頁及びニス・ギリス（Ｓ、 Ｇ１１ｌｉｓ）等、Ｊ、
Ｉｍｍｕｎ、（１９７８年）１２０巻２０２７〜２０３
２頁〕。
実施史上上 ＩＬ−２ｃＤＮＡクローンのスクリーニン
グと同定 コロニーハイブリッド形成法を用いて、ＩＬ−２ｃＤＮ
＾ライブラリーをスクリーニングした。各ミクロタイタ
ープレートを重層したニトロセルロース濾紙（Ｓ＆Ｓタ
イプＢＡ −８５）上にレプリカ法で写取り、アンピシ
リン５０μｇ７ｍｌを含有するし寒天上で３７℃、１４
〜１６時間生育させた。コロニーを溶解し、５００ｍＭ
水酸化ナトリウム、１．５Ｍ塩化ナトリウムで５分の連
続処理することによってＤＮＡをフィルターに固定し、
５×標準クエン酸塩溶液（ＳＳＣ）で５分ずつ２回洗っ
た。フィルターを空気乾燥し、８０℃で２時間炉乾燥し
た。重層フィルターをフィルター当たりＩＱｍ４のＤＮ
Ａハイブリッド形成緩衝液（５０％ホルムアミド、５×
ＳＳＣ、ｐＨ７，０、５Ｘデンハード液（ポリビニルピ
ロリジン、フィコール及び牛血清アルブミン；１×−各
０．２％）、ｐＨ７，０の５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝
液、０．２％ＳＯ３，２０１１ｇ７ｍｌｌポリＵ及び５
０ｐｇ／ｍｌ！の変形サケ精子１１ＮＡにより、４２℃
で６〜８時間事前ハイブリッド形成させた。
グと同定 コロニーハイブリッド形成法を用いて、ＩＬ−２ｃＤＮ
＾ライブラリーをスクリーニングした。各ミクロタイタ
ープレートを重層したニトロセルロース濾紙（Ｓ＆Ｓタ
イプＢＡ −８５）上にレプリカ法で写取り、アンピシ
リン５０μｇ７ｍｌを含有するし寒天上で３７℃、１４
〜１６時間生育させた。コロニーを溶解し、５００ｍＭ
水酸化ナトリウム、１．５Ｍ塩化ナトリウムで５分の連
続処理することによってＤＮＡをフィルターに固定し、
５×標準クエン酸塩溶液（ＳＳＣ）で５分ずつ２回洗っ
た。フィルターを空気乾燥し、８０℃で２時間炉乾燥し
た。重層フィルターをフィルター当たりＩＱｍ４のＤＮ
Ａハイブリッド形成緩衝液（５０％ホルムアミド、５×
ＳＳＣ、ｐＨ７，０、５Ｘデンハード液（ポリビニルピ
ロリジン、フィコール及び牛血清アルブミン；１×−各
０．２％）、ｐＨ７，０の５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝
液、０．２％ＳＯ３，２０１１ｇ７ｍｌｌポリＵ及び５
０ｐｇ／ｍｌ！の変形サケ精子１１ＮＡにより、４２℃
で６〜８時間事前ハイブリッド形成させた。
クニグチ（前掲）に報告されたＩＬ−２遺伝子配列に基
づいて３２ｐで標識された２０−ｍａｒオリゴヌクレオ
チドプローブをつくった。プローブのヌクレオチド配列
はＧＴＧＧＣＣＴＴＣＴＴＧＧＧＣＡＴＧＴＡであった
。
づいて３２ｐで標識された２０−ｍａｒオリゴヌクレオ
チドプローブをつくった。プローブのヌクレオチド配列
はＧＴＧＧＣＣＴＴＣＴＴＧＧＧＣＡＴＧＴＡであった
。
” Ｐ ｃＤＮＡプローブを含有するフィルター当たり
５ｍβのＤＮＡハイブリッド形成緩衝液で、試料を４２
°Ｃで２４〜３６時間ハイブリッド形成させた。フィル
ターを２ Ｘ５ＳＣ、０，１％ＳＤＳ、で３０分間ずつ
２回５０゛Ｃで洗い、次に１ｘｓｓｃと０．１％ＳＤＳ
で９０分ずつ２回５０℃で洗い、空気乾燥し、−７０℃
で２〜３日間オートラジオグラフにかけた。陽性のクロ
ーンを同定し、プローブで再度スクリーニングした。十
分な長さのクローンが、制限酵素地図作成、及びタニグ
チら（前掲）が報告したＩＬ−２ｃＤＮ＾クローンの配
列との比較から確認された。
５ｍβのＤＮＡハイブリッド形成緩衝液で、試料を４２
°Ｃで２４〜３６時間ハイブリッド形成させた。フィル
ターを２ Ｘ５ＳＣ、０，１％ＳＤＳ、で３０分間ずつ
２回５０゛Ｃで洗い、次に１ｘｓｓｃと０．１％ＳＤＳ
で９０分ずつ２回５０℃で洗い、空気乾燥し、−７０℃
で２〜３日間オートラジオグラフにかけた。陽性のクロ
ーンを同定し、プローブで再度スクリーニングした。十
分な長さのクローンが、制限酵素地図作成、及びタニグ
チら（前掲）が報告したＩＬ−２ｃＤＮ＾クローンの配
列との比較から確認された。
Ｊ（膚り夛１」−λユ Ｍ１３ベクターへのＩＬ−２ｉ
公子のクローニング 大腸菌ｔｒｐプロモーターの制御下にＩＬ−２遺伝子蕃
含有するプラスミドｐｌＪ１ （第１２図）を使用して
、実施例１に記載のと同様にルー２遺伝子をＭ１３ｍｐ
９ヘクロー亘ングした。ｐｌＪ １の試料は１９８３年
８月４日、２０８５２合衆国メジーランド州ロックビル
。
公子のクローニング 大腸菌ｔｒｐプロモーターの制御下にＩＬ−２遺伝子蕃
含有するプラスミドｐｌＪ１ （第１２図）を使用して
、実施例１に記載のと同様にルー２遺伝子をＭ１３ｍｐ
９ヘクロー亘ングした。ｐｌＪ １の試料は１９８３年
８月４日、２０８５２合衆国メジーランド州ロックビル
。
パークローン・ドライブ１２３０１番地、アメリカタイ
プ・カルチャー・コレクションに預託され、ＡＴＣＣ３
９，４０５号と指定を受けた。ＩＬ−２挿入部を含有す
る１クローン（Ｍ１３− ｒＬ−２と称する）の制限地
図を第１３図に示す。１本鎖ファージＤＮＡをクローン
Ｍ １−３− ＩＬ−，２からつくり、オリゴヌクオチ
ドで指示される突然変異誘発用の鋳型として使用した。
プ・カルチャー・コレクションに預託され、ＡＴＣＣ３
９，４０５号と指定を受けた。ＩＬ−２挿入部を含有す
る１クローン（Ｍ１３− ｒＬ−２と称する）の制限地
図を第１３図に示す。１本鎖ファージＤＮＡをクローン
Ｍ １−３− ＩＬ−，２からつくり、オリゴヌクオチ
ドで指示される突然変異誘発用の鋳型として使用した。
前記のとおり、ＩＬ−２はアミノ酸位置５８，１０５及
び１２５にシスティン残基を含んでいる。ＩＬ−２遺伝
子中でこれらの３個のシスティン残基用コドンを含有す
る部分のヌクレオチド配列に基づいて、三つのオリゴヌ
クレオチドプライマーを設計し、これらの残基用コドン
をセリン用コドンへ突然変異せしめるために合成した。
び１２５にシスティン残基を含んでいる。ＩＬ−２遺伝
子中でこれらの３個のシスティン残基用コドンを含有す
る部分のヌクレオチド配列に基づいて、三つのオリゴヌ
クレオチドプライマーを設計し、これらの残基用コドン
をセリン用コドンへ突然変異せしめるために合成した。
これらのオリゴヌクレオチドは次の配列をもっている。
ｃｙｓ ５８を変える ＣＴＴＣＴＡにＡＧＡＣＴにＣ
ＡＧＡＴにＴＴＴＣ（Ｄ？１２７） ｃｙｓ１０５を変える ＣＡＴＣＡＧＣＡＴＡＣＴＣＡ
ＧＡＣＡＴＧＡＡＴＧ（ＤＭ２８） ｃｙｓ１２５を変える ＧＡＴＧＡＴＧＣ’ｒＣＴＧＡ
ＧＡＡＡＩｌｐＧＴＡＡＴＣ（０Ｍ２９） ０．１ｍＭ ＡＴＩ）、５０ｍＭ トリス−塩酸、ｐＨ
８，０゜１０ｍ Ｍ塩化マグネシウム、 ５ｍＭ Ｄ
ＴＴ及びＴ４キナーゼ９羊位の存在下に、５０μβ中で
各オリゴヌクレオチド４０ピコモルを別々に３７℃で１
時間キナーゼ処理した。キナーゼ処理されたプライマー
（１０ピコモル）の各々を、１００ｍＭ塩化ナトリウ
ム、２０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７，９，２０ｍＭ塩化
マグネシウム及び２０ｍＭβ−メルカプトエタノールを
含有する混合物１５μβ中で、６７・°Ｃで５分及び４
２℃で２５分加熱することによって５５Ｍ１３−ＩＬ−
２ＤＮＡ ２．６μｇへハイブリッド形成した。
ＡＧＡＴにＴＴＴＣ（Ｄ？１２７） ｃｙｓ１０５を変える ＣＡＴＣＡＧＣＡＴＡＣＴＣＡ
ＧＡＣＡＴＧＡＡＴＧ（ＤＭ２８） ｃｙｓ１２５を変える ＧＡＴＧＡＴＧＣ’ｒＣＴＧＡ
ＧＡＡＡＩｌｐＧＴＡＡＴＣ（０Ｍ２９） ０．１ｍＭ ＡＴＩ）、５０ｍＭ トリス−塩酸、ｐＨ
８，０゜１０ｍ Ｍ塩化マグネシウム、 ５ｍＭ Ｄ
ＴＴ及びＴ４キナーゼ９羊位の存在下に、５０μβ中で
各オリゴヌクレオチド４０ピコモルを別々に３７℃で１
時間キナーゼ処理した。キナーゼ処理されたプライマー
（１０ピコモル）の各々を、１００ｍＭ塩化ナトリウ
ム、２０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７，９，２０ｍＭ塩化
マグネシウム及び２０ｍＭβ−メルカプトエタノールを
含有する混合物１５μβ中で、６７・°Ｃで５分及び４
２℃で２５分加熱することによって５５Ｍ１３−ＩＬ−
２ＤＮＡ ２．６μｇへハイブリッド形成した。
アニーリングされた混合物を氷上で冷却し、次に０．５
ｍＭ各ｄＮＴＰ 、 １７ｍＭ ）リス−塩ｅ１１．
（ｐＨ７，９）。
ｍＭ各ｄＮＴＰ 、 １７ｍＭ ）リス−塩ｅ１１．
（ｐＨ７，９）。
１７ｍ Ｍ塩化マグネシウム、８３ｍＭ塩化ナトリウム
。
。
１７ｍＭβ−メルカプトエタノール
ーゼＩ Ｋｌｅｎｏｗ断片５単位， ０． ５ ｍＭＡ
ＴＰ 、及びＴ４ＤＮＡＩＪガーゼ２単位を含有する反
応混合物２５μβの最終容量まで調製し、３７℃で５時
間インキユヘートした。８０°Ｃに加熱して反応を停止
させ、反応混合物をコンビテン） ＪＭ１０３細胞の形
質転換に使用し、寒天プレート上に播いて一夜培養する
と、ファージプラークが得られた。
ＴＰ 、及びＴ４ＤＮＡＩＪガーゼ２単位を含有する反
応混合物２５μβの最終容量まで調製し、３７℃で５時
間インキユヘートした。８０°Ｃに加熱して反応を停止
させ、反応混合物をコンビテン） ＪＭ１０３細胞の形
質転換に使用し、寒天プレート上に播いて一夜培養する
と、ファージプラークが得られた。
突然変異誘発されたＭ １３ − ＩＬ−２プラークを
含んだプレートと、突然変異誘発されないＭ １３ −
ＩＬ−２フアージプラークを含んだプレート２枚とを
４℃に冷却し、各プレートからのファージプラークを２
枚のニトロセルロース円形フィルター上へ、第一フィル
ターの場合には乾燥フィルターを寒天プレート上へ５分
間重ね、第二フィルターの場合には１５分間重ねて移し
た。次に０．２Ｎ水酸化ナトリウム、Ｉ５Ｍ塩化ナトリ
ウム及び０．２％トリトンに浸した厚手の濾紙上にフィ
ルターを５分間置き、次に０． ５ Ｍ ）リス−ＭＣ
Ｉｔ （ｐＨ７．５） と１． ５ ＭＮａＣ １に
浸した濾紙上へさらに５分間重ねて中和した。
含んだプレートと、突然変異誘発されないＭ １３ −
ＩＬ−２フアージプラークを含んだプレート２枚とを
４℃に冷却し、各プレートからのファージプラークを２
枚のニトロセルロース円形フィルター上へ、第一フィル
ターの場合には乾燥フィルターを寒天プレート上へ５分
間重ね、第二フィルターの場合には１５分間重ねて移し
た。次に０．２Ｎ水酸化ナトリウム、Ｉ５Ｍ塩化ナトリ
ウム及び０．２％トリトンに浸した厚手の濾紙上にフィ
ルターを５分間置き、次に０． ５ Ｍ ）リス−ＭＣ
Ｉｔ （ｐＨ７．５） と１． ５ ＭＮａＣ １に
浸した濾紙上へさらに５分間重ねて中和した。
フィルターを同様なやり方で、２ＸＳＳＣに浸したフィ
ルター上で２回洗い、乾燥してから真空乾燥炉内で８０
℃で２時間乾燥した。重層フィルターをフィルター当た
り１０ｍｊ２のＤＮ八へイブリッド形成緩衝液（５ｘＳ
ＳＣ）、ｐＨ７．０ 、４Ｘデンハード液（ポリビニル
ピロリジン、フィコール及び牛血清アルブミン５１×＝
各０．０２％）、０．１％ＳＤＳ 。
ルター上で２回洗い、乾燥してから真空乾燥炉内で８０
℃で２時間乾燥した。重層フィルターをフィルター当た
り１０ｍｊ２のＤＮ八へイブリッド形成緩衝液（５ｘＳ
ＳＣ）、ｐＨ７．０ 、４Ｘデンハード液（ポリビニル
ピロリジン、フィコール及び牛血清アルブミン５１×＝
各０．０２％）、０．１％ＳＤＳ 。
５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７． ０ ）及
び１００μｇ／ｍｊ！変性サケ精子ＤＮＡにより、４２
℃で４時間事前ハイブリッド形成させた。標識をつけた
ＡＴＰでオリゴヌクレオチドプライマーをキナーゼ処理
することによって、３２ｐで標識をつけたプローブをつ
くった。フィルター当たり５ ｍ ｆｔのＤＮＡハイブ
リッド形成緩衝液中で４２℃で８時間、３２ｐで標識し
たプライマー０． Ｉ Ｘ １ ０ ５ｃｐｍ／ ｍβ
にフィルターをハイブリッド形成させた。０．１％ＳＤ
Ｓ及び２ＸＳＳＣを含有する洗浄緩衝液中で５０℃でそ
れぞれ３０分ずつ２回、次に０，１％ＳＤＳ及び０．２
ｘ ｓｓｃで５０°Ｃでそれぞれ３０分ずつ２回フィル
ターを洗った。フィルターを空気乾燥し、−７０°Ｃで
２〜３日オートラジオグラフィにかけた。
び１００μｇ／ｍｊ！変性サケ精子ＤＮＡにより、４２
℃で４時間事前ハイブリッド形成させた。標識をつけた
ＡＴＰでオリゴヌクレオチドプライマーをキナーゼ処理
することによって、３２ｐで標識をつけたプローブをつ
くった。フィルター当たり５ ｍ ｆｔのＤＮＡハイブ
リッド形成緩衝液中で４２℃で８時間、３２ｐで標識し
たプライマー０． Ｉ Ｘ １ ０ ５ｃｐｍ／ ｍβ
にフィルターをハイブリッド形成させた。０．１％ＳＤ
Ｓ及び２ＸＳＳＣを含有する洗浄緩衝液中で５０℃でそ
れぞれ３０分ずつ２回、次に０，１％ＳＤＳ及び０．２
ｘ ｓｓｃで５０°Ｃでそれぞれ３０分ずつ２回フィル
ターを洗った。フィルターを空気乾燥し、−７０°Ｃで
２〜３日オートラジオグラフィにかけた。
オリゴヌクレオチドプライマー〇Ｍ２８及び０Ｍ２９は
、突然変異誘発されたクローンに新しいＤｄｅ Ｉ制限
部位を創出するように設計されているから（第１４表）
、これらのキナーゼ処理されたプライマーとハイプリン
ト形成された幾つかのクローンからの１？Ｆ − ＤＮ
Ａを制限酵素Ｄｄｅ Ｉで消化した。プライマー ０Ｍ
２Ｂとハイブリッド形成し、新しいＤｄｅ Ｉ制限部位
をもつ突然変異誘発されたＭｘ３−ｎ，−２プラークの
一つ（Ｍ１３−ＩＪ４４）を取り上げ、Ｊ．Ｍ１０３培
養物へ接種し、培養上澄液からｓｓＤＮＡを調製し、細
胞ペレットからｄｓＲＦ − ＤＮＡを調製した。同じ
く、プライマーＤＭ２９とハイブリッド形成させたプラ
ーク（Ｍ１３−ＩＪＪ６）を取り上げ、これからｓｓＤ
ＮＡとＲＦ−ＤＮＡを調製した。オリゴヌクレオチドプ
ライマー叶２７はＤｄｅ Ｉ位置の代わりに新しいＰｓ
ｔＩ制限部位を創出するように設計されている。従って
、このブライマーにハイブリッド形成されたプラークを
新しいＰｓｔ１部位の存在の点からスクリーニングした
。このような一つのファージプラークを同定しくＭ２Ｓ
−ＬＷ４２） 、 ５ｓＤＮＡ及びＲＦ −ＤＮＡを
これから調製した。目標のシスティン用ＴＧＴコドンが
セリン用ＴＧＴコドンへ転化されたことを確認するため
、これらの３クロ一ン全部から得たＤＮＡの配列を決定
した。
、突然変異誘発されたクローンに新しいＤｄｅ Ｉ制限
部位を創出するように設計されているから（第１４表）
、これらのキナーゼ処理されたプライマーとハイプリン
ト形成された幾つかのクローンからの１？Ｆ − ＤＮ
Ａを制限酵素Ｄｄｅ Ｉで消化した。プライマー ０Ｍ
２Ｂとハイブリッド形成し、新しいＤｄｅ Ｉ制限部位
をもつ突然変異誘発されたＭｘ３−ｎ，−２プラークの
一つ（Ｍ１３−ＩＪ４４）を取り上げ、Ｊ．Ｍ１０３培
養物へ接種し、培養上澄液からｓｓＤＮＡを調製し、細
胞ペレットからｄｓＲＦ − ＤＮＡを調製した。同じ
く、プライマーＤＭ２９とハイブリッド形成させたプラ
ーク（Ｍ１３−ＩＪＪ６）を取り上げ、これからｓｓＤ
ＮＡとＲＦ−ＤＮＡを調製した。オリゴヌクレオチドプ
ライマー叶２７はＤｄｅ Ｉ位置の代わりに新しいＰｓ
ｔＩ制限部位を創出するように設計されている。従って
、このブライマーにハイブリッド形成されたプラークを
新しいＰｓｔ１部位の存在の点からスクリーニングした
。このような一つのファージプラークを同定しくＭ２Ｓ
−ＬＷ４２） 、 ５ｓＤＮＡ及びＲＦ −ＤＮＡを
これから調製した。目標のシスティン用ＴＧＴコドンが
セリン用ＴＧＴコドンへ転化されたことを確認するため
、これらの３クロ一ン全部から得たＤＮＡの配列を決定
した。
Ｍ２Ｓ−ＩＪ４２ 、 Ｍ２Ｓ−ＬＷ４４ 、及びＭ２
Ｓ−ＩＪ４６からのＲＦ−ＤＮＡをそれぞれ制限酵素旧
ｎｄＩ［［及びＢａｎ ＩＩで消化し、挿入断片を１％
アガロースゲルから精製した。
Ｓ−ＩＪ４６からのＲＦ−ＤＮＡをそれぞれ制限酵素旧
ｎｄＩ［［及びＢａｎ ＩＩで消化し、挿入断片を１％
アガロースゲルから精製した。
同様に、プラスミドｐＴｒｐ３ （第７図）を旧ｎｄＩ
［［及びＢａｎ Ｔｌで消化し、ｔｒｐプロモータを含
有する大きなプラスミド断片をアガロースゲル上で精製
し、Ｍ２Ｓ−ＬＷ４２ 、 Ｍ２Ｓ−ＩＪ４４及びＭ２
Ｓ−ＩＪ４６から単離された挿入断片の各々と連結した
。連結した′プラスミドをコンビテント大腸菌に一１２
ＭＭ２９４株へ形質転換した。これらの形質転換体から
のプラスミドＤＮＡを制限酵素地図作成によって分析し
、プラスミドｐＬＷ４２ 、ｐＬＷ４４ 、及びｐｔ
、騨４６の存在を確かめた。
［［及びＢａｎ Ｔｌで消化し、ｔｒｐプロモータを含
有する大きなプラスミド断片をアガロースゲル上で精製
し、Ｍ２Ｓ−ＬＷ４２ 、 Ｍ２Ｓ−ＩＪ４４及びＭ２
Ｓ−ＩＪ４６から単離された挿入断片の各々と連結した
。連結した′プラスミドをコンビテント大腸菌に一１２
ＭＭ２９４株へ形質転換した。これらの形質転換体から
のプラスミドＤＮＡを制限酵素地図作成によって分析し
、プラスミドｐＬＷ４２ 、ｐＬＷ４４ 、及びｐｔ
、騨４６の存在を確かめた。
第１４図はｐＬＷ４６の制限地図である。ｔｒｐプロモ
ーターを誘導するために、トリプトファンの不在下にこ
れらの個々のクローンの各々を生育させ、無細胞抽出液
をＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル上で分析し、３クロ
ーンｐｌＪ４２ 、ｐＬＷ４４及びｐｌＪ４６の全部
が、１４．４Ｋｄ ＩＬ−２蛋白質を合成することが立
証された陽性対照のｐｌＪ２１に見られるものと同様な
１４．５Ｋｄ蛋白を合成することが示された。これらの
同じ抽出液をマウスＨＴ−２細胞でｒＬ−２活性につい
て検定すると、クローンｐＬＷ２１ （陽性対照）とｐ
ｌＪ４６のみが有意義量のＩＬ−２活性を示しく下の第
２表）、ｃｙｓ５１３とｃｙｓ１０５は生物学的活性に
必要なものであり、これをセリンに変えること（それぞ
れｐＬＷ４２とｐｌＪ４４）によって生物学的活性が失
われることを意味している。一方ｃｙｓ１２５は、これ
を５ｅｒ１２５（ｐｌＪ４６）へ変えても生物学的活性
に影響しないから、活性にとって不要であるに違いない
。
ーターを誘導するために、トリプトファンの不在下にこ
れらの個々のクローンの各々を生育させ、無細胞抽出液
をＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル上で分析し、３クロ
ーンｐｌＪ４２ 、ｐＬＷ４４及びｐｌＪ４６の全部
が、１４．４Ｋｄ ＩＬ−２蛋白質を合成することが立
証された陽性対照のｐｌＪ２１に見られるものと同様な
１４．５Ｋｄ蛋白を合成することが示された。これらの
同じ抽出液をマウスＨＴ−２細胞でｒＬ−２活性につい
て検定すると、クローンｐＬＷ２１ （陽性対照）とｐ
ｌＪ４６のみが有意義量のＩＬ−２活性を示しく下の第
２表）、ｃｙｓ５１３とｃｙｓ１０５は生物学的活性に
必要なものであり、これをセリンに変えること（それぞ
れｐＬＷ４２とｐｌＪ４４）によって生物学的活性が失
われることを意味している。一方ｃｙｓ１２５は、これ
を５ｅｒ１２５（ｐｌＪ４６）へ変えても生物学的活性
に影響しないから、活性にとって不要であるに違いない
。
ＰＩＬ２−７ （陰性対照） ＩＰＬＷ２
１ （陽性対照）１１３，０００ＰＬＷ４２
６６０ＰＬＷ４４
Ｌ９９０Ｐ Ｌ Ｗ ４６
１２３，０００第１５ａ図は、クローンｐｌＪ
４６のコード鎖のヌクレオチド配１列を示す。天然のヒ
ｌ−ＩＬ−２遺伝子のコード鎖に比べ、クローンｐｌＪ
４６はヌクレトチド３７４にＧ→Ｃの一つの塩基の変化
をもつ。第１．５ ｂ図は、ｐＬＷ４６でコードされた
Ｉ Ｌ 、、 ２ムテインの対応するアミノ酸配列を示
す。このムティンをＩＬ−２ｓｅｒ１２５と称スる。天
然のＩＬ−２に比べ、ムティンは１２５位にシスティン
の代わりにセリンをもっている。
１ （陽性対照）１１３，０００ＰＬＷ４２
６６０ＰＬＷ４４
Ｌ９９０Ｐ Ｌ Ｗ ４６
１２３，０００第１５ａ図は、クローンｐｌＪ
４６のコード鎖のヌクレオチド配１列を示す。天然のヒ
ｌ−ＩＬ−２遺伝子のコード鎖に比べ、クローンｐｌＪ
４６はヌクレトチド３７４にＧ→Ｃの一つの塩基の変化
をもつ。第１．５ ｂ図は、ｐＬＷ４６でコードされた
Ｉ Ｌ 、、 ２ムテインの対応するアミノ酸配列を示
す。このムティンをＩＬ−２ｓｅｒ１２５と称スる。天
然のＩＬ−２に比べ、ムティンは１２５位にシスティン
の代わりにセリンをもっている。
ｐＬＷｄ６で形質転換されたＥ、コリに一１２ＭＭ２９
４株の試料は、１９８３年９月２６日１合衆国ソー、
２０８５２メリーランド州ロツクビル、バークローン・
ドライブ１２３０１番地、アメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｍ Ｔｙｐｅ Ｃ
ｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に寄託され、Ａ
ＴＣＣ３９、４５２号に指定された。
４株の試料は、１９８３年９月２６日１合衆国ソー、
２０８５２メリーランド州ロツクビル、バークローン・
ドライブ１２３０１番地、アメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｍ Ｔｙｐｅ Ｃ
ｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に寄託され、Ａ
ＴＣＣ３９、４５２号に指定された。
ムティンＩＬ−２ｓｅｒ１２５のように１２５位のシス
ティンが欠損した又は別のアミノ酸でおき代えられたＩ
Ｌ−２ムテイン類は、ＩＬ−２活性を保持している。従
って、これらを天然のＩＬ−２と同じように処方、使用
できる。従って、このようなムティン類は細菌。
ティンが欠損した又は別のアミノ酸でおき代えられたＩ
Ｌ−２ムテイン類は、ＩＬ−２活性を保持している。従
って、これらを天然のＩＬ−２と同じように処方、使用
できる。従って、このようなムティン類は細菌。
ウィルス、寄生虫、原生動物、及びカビの感染の診断と
処置、リンフ才力イン又は免疫不全の発現に、老令のヒ
ト及び動物における通常の免疫機能の再構成に、酵素増
幅、放射能標識、放射能映像化、及び病的状態のＩＬ−
２水準をモニターするこの技術で知られたその他の方法
など、診断検定法の開発に、リンフ才力イン類の受容体
部位を遮断する治療及び診断用に生体外でのＴ細胞生育
の促進のため、またその他種々の治療２診断、研究への
応用に有用である。ヒトＩＬ−２の種々の治療・診断へ
の応用については、ニス・エイ・ローゼンバーグ（Ｓ、
Ａ、 Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）＋イー・エイ・グリム（
Ｅ、 ’Ａ。
処置、リンフ才力イン又は免疫不全の発現に、老令のヒ
ト及び動物における通常の免疫機能の再構成に、酵素増
幅、放射能標識、放射能映像化、及び病的状態のＩＬ−
２水準をモニターするこの技術で知られたその他の方法
など、診断検定法の開発に、リンフ才力イン類の受容体
部位を遮断する治療及び診断用に生体外でのＴ細胞生育
の促進のため、またその他種々の治療２診断、研究への
応用に有用である。ヒトＩＬ−２の種々の治療・診断へ
の応用については、ニス・エイ・ローゼンバーグ（Ｓ、
Ａ、 Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）＋イー・エイ・グリム（
Ｅ、 ’Ａ。
Ｇｒｉｍ） ら、エイ・マザムダ−（Ａ、 Ｍａｚｕｍ
ｄｅｒ） ら、及びイー・エイ・グリムとニス・エイ
・ローゼンバーグが研究報告している。ＩＬ−２はそれ
自体、又は他の免疫学的に関連のあるＢ又はＴ細胞又は
その他の治療剤と組み合わせて使用できる。治療又は診
断用には、蒸留水、リンゲル液、バンク液。
ｄｅｒ） ら、及びイー・エイ・グリムとニス・エイ
・ローゼンバーグが研究報告している。ＩＬ−２はそれ
自体、又は他の免疫学的に関連のあるＢ又はＴ細胞又は
その他の治療剤と組み合わせて使用できる。治療又は診
断用には、蒸留水、リンゲル液、バンク液。
生理的食塩水などの無毒性、非アレルギー性の生理学的
に許容される担体媒体中にこれらを処方できる。ヒト又
は動物へのＩＬ−２ムテイン頻の投与は、医師が適当と
考えるところにより、経口、又は腹腔内又は筋肉内又は
皮下でありうる。関連細胞の例はＢ又はＴ細胞、天然の
キラー細胞等であり、本発明のポリペプチド類と組み合
わせて使用できる治療用試薬の例は、種々のインターフ
ェロン類、特にガンマインターフェロン、Ｂ細胞生長因
子。
に許容される担体媒体中にこれらを処方できる。ヒト又
は動物へのＩＬ−２ムテイン頻の投与は、医師が適当と
考えるところにより、経口、又は腹腔内又は筋肉内又は
皮下でありうる。関連細胞の例はＢ又はＴ細胞、天然の
キラー細胞等であり、本発明のポリペプチド類と組み合
わせて使用できる治療用試薬の例は、種々のインターフ
ェロン類、特にガンマインターフェロン、Ｂ細胞生長因
子。
ＩＬ−１等である。
第１図は、ＩＦＮ−βのアミノ酸配列図である。
第２図は、オリゴヌクレアーゼ指示された突然変異誘発
による突然変異株ＩＦＮ−β遺伝子の調製を示す略図で
ある。 第３図は、ＩＦＮ−β遺伝子を含むプラスミドｐβ１
ｔｒｐの図である。 第４図は、クローニングベクターＭ１３ｍｐ８ファージ
の図である。 第５図は、クローンＭ１３−β１の制限地図を示す。 第６図は、コード領域で一つの塩基の変化を示す突然変
異ＩＦＮ−β５ｅｒ１７遺伝子の配列順序決定ゲルパタ
ーンを示す。 第７図は、発現プラスミドｐＴｒｐ ３の図である。 第８ａ図は、クローンｐｓＹ２５０１の旧ｎｆｌ制限パ
ターンを示し、第８ｂ図は生ずるその二つの１６９ｂｐ
及び２８ｂｐ断片を示す。 第９図は、クローンｐｓＹ２５０１の制限地図である２
第１０図は、ムティンＩＦＮ−β５ｅｒ１７を暗号づけ
るＤＮＡ配列と、これに対応するアミノ酸配列を示す。 第１１図は、クローンｐｓＹ２５０１及びｐβｌ ｔｒ
ｐの抽出液におけるＩＦＮ−β５ｅｒ１７に対応する単
一の１８．０００ダルトンの蛋白質バンドを示す。 第１２図は、Ｅ、コリｔｒｐプロモーターの制御下にヒ
トインターロイキン−２（ＩＬ−２）遺伝子を含有する
プラスミドｐｌＪ１の図である。 第１３図は、ファージクローンＭ１３−ＩＬ２の制限地
図である。 第１４図は、プラスミドｐＬＷ４６の制限地図である。 第１５ａ及び１５ｂ図は、クローンｐＬＷ４６のコード
鎖のヌクレオチド配列、及びＩＬ−２ｓｅｒ１２５と称
するＩＬ−２ムテイの対応するアミノ酸配列をそれぞれ
示す。 以下余白 図面の浄書（内容に変更なし） ＴｈｒＧｌｙＴｙｒＬｅｕＡｒｇ Ａｓｎ−−−ＦＩＧ
、 １ ↓人Ａ＠菌の形■ムｊ灸 ＦＩＧ、 ２ ＦＩＧ、 ４ ＦＩＧ、 ７ ＡＴＣ ＦＩＧ、８ａ ＦＩＧ、８ｂ ＦＩＧ、９ ′／ ■ＦＮ−βの１７（ｍ置 アミノ西斐のシスケインのｔ
リンへの変］夾ＦＩＧ、１０ ＦＩＧ、 １４ ＦＩＧ、 １５ａ ＦＩＧ、 １５ｂ
による突然変異株ＩＦＮ−β遺伝子の調製を示す略図で
ある。 第３図は、ＩＦＮ−β遺伝子を含むプラスミドｐβ１
ｔｒｐの図である。 第４図は、クローニングベクターＭ１３ｍｐ８ファージ
の図である。 第５図は、クローンＭ１３−β１の制限地図を示す。 第６図は、コード領域で一つの塩基の変化を示す突然変
異ＩＦＮ−β５ｅｒ１７遺伝子の配列順序決定ゲルパタ
ーンを示す。 第７図は、発現プラスミドｐＴｒｐ ３の図である。 第８ａ図は、クローンｐｓＹ２５０１の旧ｎｆｌ制限パ
ターンを示し、第８ｂ図は生ずるその二つの１６９ｂｐ
及び２８ｂｐ断片を示す。 第９図は、クローンｐｓＹ２５０１の制限地図である２
第１０図は、ムティンＩＦＮ−β５ｅｒ１７を暗号づけ
るＤＮＡ配列と、これに対応するアミノ酸配列を示す。 第１１図は、クローンｐｓＹ２５０１及びｐβｌ ｔｒ
ｐの抽出液におけるＩＦＮ−β５ｅｒ１７に対応する単
一の１８．０００ダルトンの蛋白質バンドを示す。 第１２図は、Ｅ、コリｔｒｐプロモーターの制御下にヒ
トインターロイキン−２（ＩＬ−２）遺伝子を含有する
プラスミドｐｌＪ１の図である。 第１３図は、ファージクローンＭ１３−ＩＬ２の制限地
図である。 第１４図は、プラスミドｐＬＷ４６の制限地図である。 第１５ａ及び１５ｂ図は、クローンｐＬＷ４６のコード
鎖のヌクレオチド配列、及びＩＬ−２ｓｅｒ１２５と称
するＩＬ−２ムテイの対応するアミノ酸配列をそれぞれ
示す。 以下余白 図面の浄書（内容に変更なし） ＴｈｒＧｌｙＴｙｒＬｅｕＡｒｇ Ａｓｎ−−−ＦＩＧ
、 １ ↓人Ａ＠菌の形■ムｊ灸 ＦＩＧ、 ２ ＦＩＧ、 ４ ＦＩＧ、 ７ ＡＴＣ ＦＩＧ、８ａ ＦＩＧ、８ｂ ＦＩＧ、９ ′／ ■ＦＮ−βの１７（ｍ置 アミノ西斐のシスケインのｔ
リンへの変］夾ＦＩＧ、１０ ＦＩＧ、 １４ ＦＩＧ、 １５ａ ＦＩＧ、 １５ｂ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ジスルフィド結合を自由に形成し、生物学的活性に
とって本質的でない少なくとも１個のシステイン残基を
もった、生物学的に活性な蛋白質の合成ムテインであっ
て、そのムテインがシステイン残基の少なくとも１個を
欠失しているか、又は別のアミノ酸でおき代えられてい
るものをコードするＤＮＡ配列を遺伝子中に有すること
を特徴とする構造遺伝子。 ２、前記合成ムテインが前記システイン残基を１個もつ
ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の構造遺伝
子。 ３、前記ムテインの前記システイン残基がセリン、スレ
オニン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソ
ロイシン、ヒスチジン、チロシン、フェニルアラニン、
トリプトファン、又はメチオニンでおき代えられている
ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の構成遺伝
子。 ４、前記ムテインの前記システイン残基がセリン、又は
スレオニンでおき代えられることを特徴とする特許請求
の範囲第１項記載の構造遺伝子。 ５、前記ムテインがグリコシル化されていないことを特
徴とする特許請求の範囲第１項記載の構造遺伝子。 ６、前記蛋白質がＩＦＮ−β、ＩＬ−２、リンフォトキ
シン、コロニー刺激因子−１、又はＩＦＮ−α１である
ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の構造遺伝
子。 ７、前記蛋白質がＩＦＮ−βであり、前記システイン残
基がＩＦＮ−βの１７位にあり、そして該システイン残
基がセリン残基でおき代えられていることを特徴とする
特許請求の範囲第１項記載の構造遺伝子。 ８、前記蛋白質がＩＦＮ−βであり、前記システイン残
基がＩＦＮ−βの１７位にあり、該システイン残基がセ
リン残基でおき代えられており、そして前記ムテインが
グリコシル化されていないことを特徴とする特許請求の
範囲第７項記載の構造遺伝子。 ９、前記蛋白質がＩＬ−２であり、前記システイン残基
がＩＬ−２の１２５位にあり、そして該システイン残基
がセリンでおき代えられていることを特徴とする特許請
求の範囲第１項記載の構造遺伝子。 １０、前記蛋白質がＩＬ−２であり、前記システイン残
基がＩＬ−２の１２５位にあり、該システイン残基がセ
リンでおき代えられており、そしてムテインがグリコシ
ル化されていないことを特徴とする特許請求の範囲第９
項記載の構造遺伝子。 １１、ジスルフィド結合を自由に形成し、生物学的活性
にとって本質的でない少なくとも１個のシステイン残基
をもった、生物学的に活性な蛋白質の合成ムテインであ
って、そのムテインがシステイン残基の少なくとも１個
を欠失しているか、又は別のアミノ酸でおき代えられて
いるものをコードするＤＮＡ配列を遺伝子中に含む構造
遺伝子を製造する方法であって、以下の３工程を含むこ
とを特徴とする方法： （ａ）蛋白質をコードする構造遺伝子の１本鎖からなる
単鎖ＤＮＡを突然変異オリゴヌクレオチドプライマーと
ハイブリッド形成させ（このプライマーは、システイン
残基用コドン又はこのコドンと対合するアンチセンス・
トリプレットを包含する領域に対してこのプライマーは
相補的なものであるが、該コドンの欠失又は前記の他の
アミノ酸をコードするトリプレットを規定するコドン又
はアンチセンス・トリプレットとは不一致である。）（
ｂ）ＤＮＡポリメラーゼによってプライマーを伸長させ
、突然変異性ヘテロデュプレックスを形成させ、そして （ｃ）この突然変異性ヘテロデュプレットを複製する。 １２、不一致を規定する前記トリプレットがセリン又は
スレオニンをコードするものであることを特徴とする特
許請求の範囲第１１項記載の方法。 １３、前記単鎖ＤＮＡが該鎖を包含する１本鎖ファージ
であり、前記工程（ｂ）の突然変異性ヘテロデュプレッ
クスが閉環状ヘテロデュプレックスに変換されることを
特徴とする特許請求の範囲第１１項記載の方法。 １４、前記突然変異性ヘテロデュプレックスが閉環状ヘ
テロデュプレックスであり、前記工程（ｃ）の複製が形
質転換させたコンビテント細菌宿主の培養によることを
特徴とする特許請求の範囲第１１項記載の方法。 １５、前記工程（ｃ）の複製の後、さらに該突然変異体
の子孫を単離し、該子孫からＤＮＡを単離し、該ＤＮＡ
から遺伝子を単離することを特徴とする特許請求の範囲
第１１項記載の方法。 １６、前記蛋白質がヒトＩＦＮ−βであり、前記システ
イン残基が１７位にあり、前記不一致を規定する前記コ
ドンがセリンをコードすることを特徴とする特許請求の
範囲第１１〜１５項のいずれか１項に記載の方法。 １７、前記鎖がＩＦＮ−βのアンチセンス鎖であり、前
記突然変異オリゴヌクレオチドプライマーがＧＣＡＡＴ
ＴＴＴＣＡＧＡＧＴＣＡＧであることを特徴とする特許
請求の範囲第１６項記載の方法。 １８、前記蛋白質がヒトＩＬ−２であり、前記システイ
ン残基が１２５位にあり、不一致がセリンをコードする
コドンによることを特徴とする特許請求の範囲第１１〜
１５項のいずれか１項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US43515482A | 1982-10-19 | 1982-10-19 | |
| US435154 | 1982-10-19 | ||
| US48616283A | 1983-04-15 | 1983-04-15 | |
| US486162 | 1983-04-15 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6128392A true JPS6128392A (ja) | 1986-02-08 |
| JPH0568480B2 JPH0568480B2 (ja) | 1993-09-29 |
Family
ID=27030446
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18730184A Granted JPS6128392A (ja) | 1982-10-19 | 1984-09-08 | 変形されたインターフェロン―β及びその製造方法 |
| JP63058544A Pending JPS6420096A (en) | 1982-10-19 | 1988-03-14 | Mutein and its production |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63058544A Pending JPS6420096A (en) | 1982-10-19 | 1988-03-14 | Mutein and its production |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (4) | EP0192811B1 (ja) |
| JP (2) | JPS6128392A (ja) |
| KR (1) | KR910009900B1 (ja) |
| AT (4) | ATE33503T1 (ja) |
| AU (1) | AU563962B2 (ja) |
| BE (1) | BE898016A (ja) |
| CA (1) | CA1340861C (ja) |
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