KR910009900B1 - 생물학적 활성 단백질의 합성 뮤테인 및 이의 제조방법 - Google Patents

생물학적 활성 단백질의 합성 뮤테인 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

생물학적 활성 단백질의 합성 뮤테인 및 이의 제조방법
제1도는 IFN-β의 아미노산 서열의 다이아그람이다.
제2도는 올리고뉴클레오티드-지시된 돌연변이에 의한 돌연변이 IFN-β 유전자의 제조방법을 나타낸 도식이다.
제3도는 IFN-β 유전자를 함유하는 플라스미드 pβ1trp의 다이아그람이다.
제4도는 클로닝 벡터 M13 mp8 파지(cloning vector M13 mp8 phage)의 다이아그람이다.
제5도는 클론 M13-β1의 제한지도를 나타낸 것이다.
제6도는 코드화된 영역에서의 단일 염기 변화를 보여주는 돌연변이 IFN-βser 17 유전자의 서열화 겔 패턴을 나타낸 것이다.
제7도는 발현 플라스미드 pTrp 3의 다이아그람이다.
제8a도는 클론 pSY 2501의 HinfI제한 패턴을 설명하는 것이며, 제8b도는 이로부터 생성된 2개의 169bp 및 28bp 단편을 나타낸 것이다.
제9도는 클론 pSY 2501의 제한지도이다.
제10도는 상응하는 아미노산 서열을 갖는 뮤테인 IFN-β ser17에 대한 코드화 DNA 서열을 나타낸 것이다.
제11도는 클론 pSY2501 및 pβ1trp 추출물중 IFN-β ser17에 상응하는 단일의 18,000달턴(dalton) 단백질 밴드를 나타낸 것이다.
제12도는 에스케리키아 콜라이(E.coli) trp 프로모터의 조절하에 인체 인터루킨-2(interleukin-2)(IL-2) 유전자를 함유하는 플라스미드 pLW1의 다이아그람이다.
제13도는 파지 클론 M13-IL2의 제한지도이다.
제14도는 플라스미드 pLW 46의 제한지도이다.
제15a도 및 제15b도는 각각 클론 pLW46의 코드화 본쇄의 뉴클레오티드 서열 및 IL-2 ser125로 표기된 IL-2 뮤테인의 상응하는 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
본 발명은 재조합 DNA 기술의 일반적인 분야에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 한 개 이상의 시스테인 잔기의 치환/결실에 의해 모단백질과 다른 돌연변이된 생물학적 활성 단백질에 관한 것이다.
재조합 DNA(rDNA) 기술을 이용하여 미생물학적으로 생성된 생물학적 활성 단백질은 이들의 활성에는 비필수적이나 바람직하지 못한 분자간 또는 분자내 결합을 할 수 있는 시스테인 잔기를 함유할 수 있다. 이와 같은 단백질의 예로 미생물학적으로 생성된 인체의 베타 인터페론(IFN-β)을 들 수 있다. rDNA 기술에 의해 IFN-β를 제조하는 과정에서, 미생물학적으로 생성된 IFN-β의 다이머(diner)와 올리고머(oligomer)는 고농도의 IFN-β를 함유하는 이.콜라이(E.coli) 추출물에서 생성됨이 확인되었다. 이와 같은 멀티머(multimer)의 생성으로 인해 IFN-β의 정제 및 분리에 매우 많은 노력과 시간을 요하게 되었으며, 부적합한 디설파이드 결합 형성의 가능성이 증가됨으로써, 정제 및 분리공정에 있어서, 정제시키는 동안 단백질을 환원시키고, 원래의 형태로 되게 하기 위해 재산화시킴과 같은 여러단계를 추가 실시해야 할 필요가 생기게 되었다. 더욱이, 미생물학적으로 생성된 IFN-β는 추측하는 바로는 멀티머 또는 랜덤한 분자내 더설파이드 결합을 형성함으로써 특히 활성(specific activity)이 낮음이 알려졌다. 따라서, IFN-β와 같은 미생물학적으로 생성된 생물학적 활성 단백질의 활성에 유해한 영향을 주지 않으나 바람직하지 않은 3차 구조(예 : 단백질의 활성을 감소시키는 형태)로 되게 하는 분자간 가교결합 또는 분자내 결합 형성능을 감소시키거나 제거하는 방법으로 변화시키는 것이 바람직하다.
본 발명은 지시 돌연변이(directed mutagenesis)로 원래의 활성을 보유하나 분자간 결합 또는 바람직하지 않은 분자내 디설파이드 결합을 형성하지 못하도록 한 돌연변이 생물학적 활성 단백질[이와 같은 단백질을“뮤테인”이라 칭함, Glossary of Genetics and Cytogenetics, 4th Ed. p381, Springer-Verlag(1976)]을 제조하는 방법에 관한 것이다. 이와 관련하여, 쉐퍼드, 에이취.엠.등은 아미노산 서열중 141위치의 시스테인이 티로신으로 치환된 IFN-β의 뮤테인을 기술하고 있다[Shepard, H. M., et al, Nature(1981) 294: 563-565, 또한 인체 IFN-β의 17,31 및 141위치에 3개의 시스테인이 존재함이 Gene(1980)10:11-15 및 Nature(1980) 285:542-547에 기술되어 있다]. 이와 같은 뮤테인은 IFN-β 유전자의 뉴클레오티드 485에 G→A 전위(transition)를 포함하는 부분적인 IFN-β cDNA 클론으로부터 작제된 하이브리드 유전자의 세균학적 발현에 의해 생성된다. 이와 같은 뮤테인은 천연 IFN-β의 생물학적 활성이 없으므로 치환된 시스테인이 활성을 나타내는데 필수적이라는 사실을 알 수 있다.
지시 돌연변이 방법은 공지되어 있으며, 레더, 알.에프.등에 의해 연구되었다[참조:Lather, R.F.and Lecoq, J.P. in Genetic Engineering Academic Press(1983) pp31-50]. 올리고 뉴클레오티드-지시된 돌연변이는 특히 스미스, 엠 및 길 램, 에스.에 의해 연구되었다[참조: Smith, M. and Gillam, S. in Genetic Engineering : Principles and Methods, Plenum Press(1981)3:1-32].
본 발명은 디설파이드 결합을 형성할 수 있고, 생물학적 활성을 나타내는 데에는 비필수적인 한 개 이상의 시스테인 잔기를 함유하며 이들 시스테인중 적어도 하나가 결실되거나 다른 아미노산으로 치환됨을 특징으로 하는 생물학적 활성 단백질의 합성 뮤테인에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 전술된 합성 뮤테인을 코드화하기 위해 선택적으로 지정된 DNA 서열(“지정 유전자(designer genes)”)을 함유하는 합성의 구조 유전자에 관한 것이다. 상기의 관점에는, 구조 지정 유전자를 함유하는 발현 벡터, 상기의 벡터로 형질전환된 숙주 세포 또는 유기체, 및 상기의 형질전환체 또는 그의 자손을 배양시킨 다음, 이 배양물로부터 뮤테인을 회수함으로써 합성 뮤테인을 제조하는 방법이 포함된다. 치료작용을 갖는 뮤테인의 경우에 있어서, 치료적 유효량의 뮤테인을 함유하는 치료제 조성물도 본 발명에 포함된다.
본 발명의 또다른 면에는, 시스테인 잔기를 결실시키거나 다른 아미노산으로 치환시킴으로써 단백질을 돌연변이시킴을 특징으로 하여, 바람직하지 않은 디설파이드 결합을 형성할 수 있는 시스테인 잔기 한 개 이상을 함유하는 단백질의 디설파이드 결합을 방지하는 방법이 포함된다.
또한 본 발명은 (a) 결실되거나 치환될 시스테인에 대한 코돈 또는 이러한 코돈과 짝지워진 안티센스(antisense) 삼중자를 포함하는 본쇄의 영역에 상보적인 (다른 아미노산을 코드화하는 코돈 또는 삼중자의 결실을 한정하는, 코돈 또는 안티센스 삼중자와 잘못 짝지워진 것은 제외) 돌연변이 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 모 단백질을 코드화하는 구조 유전자의 본쇄를 함유하는 일본쇄 DNA를 하이브리드화하고, (b) 이 프라이머를 DNA 폴리머라아제로 연장시켜 돌연변이 헤테로 듀플렉스(heteroduplex)를 형성한 다음, (c) 돌연변이 헤테로 듀플렉스를 복제시킴을 특징으로 하는, 올리고뉴클레오티드-지시된 돌연변이에 의해 상기 기술된 합성의 구조 유전자를 제조하는 방법에 관한 것이다.
이 공정에 사용되는 돌연변이 올리고뉴클레오티드 프라이머도 본 발명에 포함된다.
본 발명은 분자간 가교결합 또는 부적합한 분자내 디설파이드 결합 가능 부위를 제거하기 위해, 생물학적 활성을 나타내는데 비필수적인 시스테인 잔기를 계획적으로 결실시키거나 다른 아미노산으로 치환시킨 생물학적 활성 단백질의 뮤테인, 이와 같은 뮤테인을 코드화하는 돌연변이 유전자, 및 이와 같은 뮤테인을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따라 돌연변이될 수 있는 단백질은 생물학적 활성 단백질의 시스테인 함량, 및 활성 및 3차 구조의 관점에 있어서 시스테인 잔기에 의한 작용의 관점에서 볼때의 유용성으로 미루어 확인할 수 있다. 이와 같은 유용성을 갖는 단백질은 문헌에 기술되어 있지 않으므로, 본 명세서에서 기술하는 방법으로 단백질의 각 시스테인 잔기를 체계적으로 변형시킨 다음, 생성된 뮤테인의 생물학적 활성 및 바람직하지 않은 분자간 또는 분자내 디설파이드 결합도를 시험함으로써 유용성을 측정할 수 있다. 따라서, 본 발명이 특히 IFN-β 및 IL-2의 뮤테인에 대개 기술하고, 후술되는 실시예에서 설명하고 있으나, 후술되는 방법은 바람직하지 않은 디설파이드 결합을 형성할 수 있는 기능적으로 비필수적인 시스테인 잔기를 함유하는 어떠한 생물학적 활성 단백질에 대해서도 적용할 수 있음을 알 수 있다. 본 발명에 따라 돌연변이시킬 수 있는 IFN-β 및 IL-2를 제외한 단백질의 예로는 림포톡신(종양 괴사 인자), 콜로니 자극 인자-1 및 IFN-α1을 들 수 있다. 이와 같은 경우에 예로 들 수 있는 단백질은 통상적으로 홀수개의 시스테인 잔기를 갖는다.
IFN-β의 경우에는 문헌에 기술되어 있으며, 글리코실화된 IFN 및 비글리코실화된 IFN 모두 정성적으로 유사한 특이활성을 가짐이 알려져 있으므로, 글리코실기는 IFN-β의 생물학적 활성을 내포하지 않으며, 생물학적 활성을 나타내는데 기여하지 않는다. 그러나, 비글리코실화된 세균학적으로 생성된 IFN-β는 글리코실화된 천연 IFN-β보다 정량적으로 특히 활성이 낮다. IFN-β는 17,31 및 141 위치에 3개의 시스테인 잔기를 함유함이 알려져 있다. 시스테인 141은 쉐퍼드 등에 의해 생물학적 활성을 나타내는데 필수적인 것으로 확인되었다[참조 : Shepard, et al, 상기 문헌]. IFN-α는 4개의 시스테인 잔기를 함유하는데, cys 29와 cys 138 간 및 cys 1와 cys 98간에 분자내 -s-s-결합을 가지므로, 2개의 분자내 -s-s-결합을 함유한다. IFN-β 및 IFN-α간의 동종성을 기준으로, IFN-β의 cys141은 cys 31과 분자내 -s-s-결합을 형성하게 되고, 남은 cys17은 분자간 가교결합을 형성할 수 있다. cys17을 결실시키거나 다른 아미노산으로 치환시킴으로써 cys 17이 생물학적 활성을 나타내는데 필수적인지 아닌지의 여부 및 -s-s-결합 형성에 대한 cys 17의 역할을 측정할 수 있다. 단백질의 생물학적 활성을 나타내는데 cys 17이 필수적인 요소로 작용하지 않는다면, 생성된 cys 17-결실되거나 cys 17-치환된 단백질은 천연 IFN-β의 특이 활성과 유사한 활성을 나타낼 것이며, 단백질의 분리 및 정제가 용이하게 될 것이다.
cys 17에 대한 코돈의 IFN-β 유전자 영역에 상보적이나, 이 코돈에 단일 또는 다수의 염기 변화를 포함하는 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머(primer)를 사용하는 올리고뉴클레오티드-지시된 돌연변이 공정을 적용함으로서, 구조 지정 유전자가 생성되어 cys 17이 선택된 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프라이머에 cys 17에 대한 코돈이 없을때에는 cys 17을 결실시킴이 바람직하다. 또한, cys 17을 글리신, 발린, 알라닌, 로이신, 이소로이신, 티로신, 페닐알라닌, 히스티딘, 트립토판, 세린, 트레오닌 및 메티오닌과 같은 중성 아미노산으로 전환시킴이 바람직하다. 이중, 세린과 트레오닌이 화학적으로 시스테인과 유사하므로 가장 바람직하다. 시스테인을 결실시킨 경우, 성숙 뮤테인은 천연 모 단백질 또는 미생물학적으로 생성된 IFN-β보다 아미노산 1개가 적다.
인체 IL-2는 58,105 및 125 위치에 3개의 시스테인 잔기가 존재하는 것으로 밝혀져 있다. IFN-β의 경우에, 세균 세포로부터 분리했을 때, IL-2는 집합된 올리고머 형태이며, 세균 추출물로부터 수율이 좋은 상태로 수득하기 위해 환원제로 환원시켜야 한다. 또한, 정제 및 환원된 IL-2 단백질은 보관하는 동안 불안정하여 용이하게 재산화되어 불활성 올리고머 형태로 된다. 인체 IL-2에 3개의 시스테인 잔기가 존재한다는 것은 재산화되는 동안, 단백질이 가능한 3개의 분자내 디설파이드 결합중 임의로 1개의 결합을 형성하는데, 이들 3개의 결합중 1개만이 천연 단백질 분자중에 존재하는 적합한 결합이다. 천연 IL-2 단백질의 디설파이드 구조는 알려져 있지 않으므로, IL-2 유전자의 58,105 및 125 코돈에서 돌연변이를 일으키고, 활성을 나타내는데 필요한 시스테인 잔기를 확인하여 원래의 디설파이드 결합 형성에 관여할 가능성이 가장 많은 시스테인 잔기를 확인하기 위해 본 발명의 방법을 사용할 수 있다. 이와 같은 방법으로, 활성을 나타내는데 필요하지 않은 시스테인 잔기를 변형시켜 부적합한 분자내 디설파이드 결합의 형성을 방지하고, 유리 시스테인 잔기를 제거 또는 치환시킴으로써 분자간 디설파이드 결합 가능성을 극소화할 수 있다.
올리고뉴클레오티드 프라이머의 크기는 돌연변이를 유도시키고자 하는 유전자 영역에 대한 프라이머의 안정한 하이브리드화의 필요, 및 최근에 이용할 수 있는 올리고뉴클레오티드 합성법의 한계에 의해 결정된다. 올리고뉴클레오티드-지시된 돌연변이에 사용하는 올리고뉴클레오티드를 선택하는 데 있어서, 고려되어야할 인자(예:전체크기, 돌연변이 부위에 플랭킹된 부위의 크기)는 스미스, 엠.(Smith M.)과 길램 에스.(Gillam S.)에 의해 기술되었다. 일반적으로 올리고뉴클레오티드의 전체 크기는 돌연변이 부위로부터 5′ 및 3′ 위치가 연장되는 안정한 독특한 하이브리드화를 최적으로 하는 그런 크기로, DNA 폴리머라아제(polymerase)의 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성에 의해 돌연변이가 변화되지 않도록 하는 충분한 크기이다. 본 발명에 따른 돌연변이에 사용될 수 있는 올리고뉴클레오티드는 통상적으로 약 12 내지 약 24개, 바람직하게는 약 14 내지 약 20개, 보다 더 바람직하게 약 15 내지 약 18개의 염기를 함유하는 것이다. 또, 이와 같은 올리고뉴클레오티드는 통상적으로 약 3개의 변이되거나 결실된 코돈의 3′ 염기를 함유한다.
변형된 IFN-β 유전자를 제조하는 방법은 광범위하게는 코돈을 제거하거나 다른 아미노산을 코드화하도록 변화시키는 합성 뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 코돈 17(TGT)의 IFN-β 유전자에 부위-특이적 돌연변이를 유도시킴이 포함되어 있다. 시스테인을 트레오닌으로 치환시킨 다음 프라이머를 IFN-β 유전자의 안티센스 본쇄에 하이브리드화할 경우, 바람직한 뉴클레오티드 프라이머는
Figure kpo00001
(밑줄친 부분은 변형된 코돈을 표시한다)이다. 시스테인을 결실시키는 것이 바람직한 경우, 바람직한 프라이머는 cys에 대한 TGT 코돈을 제거하는 AGCAATTTTCAGCAGAAGCTCCTG이다. 시스테인을 세린으로 치환시킬 경우, 세린에 대한 AGT 코돈을 함유하는 17-뉴클레오티드 프라이머인 GCAATTTTCAGAGTCAG가 선택된 프라이머이다. cys 17코돈의 제1염기의 T→A 전위로 인해 시스테인이 세린으로 변형된다. 또한 시스테인을 결실시킬 경우 목적하는 단백질의 발현을 위해 DNA 서열에 대한 적합한 파독 프레임(reading frame)을 계속 유지시켜야 함을 인식해야 한다.
IFN-β의 본쇄가 클론화되는 M13, fd, 또는 Ø×174와 같은 일본쇄 파지에 프라이머를 하이브리드화 한다. 또한 이와 같은 파지가 유전자의 센스 본쇄(sense strand) 또는 안티센스 본쇄를 함유하는 지를 인식하고 있어야 한다. 파지가 안티센스 본쇄를 함유할 경우, 다른 아미노산을 코드화하는 코돈 또는 삼중자의 결실을 한정하는 코돈과 잘못 짝지워지는 것을 제외하고는 프라이머는 돌연변이시킬 코돈을 함유하는 센스 본쇄의 영역과 동일하다. 파지가 센스 본쇄를 함유할 경우, 프라이머는 결실될 코돈과 찍지워진 삼중자에서 적절한 잘못 짝지워짐을 제외하고는 돌연변이될 코돈을 함유하는 센스 본쇄의 영역에 상보적이다. 하이브리드화에 적용하는 조건은 스미스, 엠(smith, M.)과 길램, 에스(Gillam, S.)의 상기 문헌에 기술되어 있다. 적용온도는 통상적으로는 약 0℃ 내지 70℃, 보다 통상적으로는 약 10℃ 내지 50℃이다. 하이브리드화를 수행한 다음, DNA 폴리머라아제 I, T4, DNA 폴리머라아제, 역 전사효소(reverse transcriptase) 또는 그외의 적합한 DNA폴리머라아제와 반응시킴으로써 파지 DNA에 프라이머를 연장시킨다. T4, DNA 리가아제(ligase)와 같은 DNA 리가아제로 처리함으로써 생성된 ds DNA를 폐환된 환상 ds DNA로 전환시킨다. 일본쇄 영역을 함유하는 DNA 분자를 s1 엔도뉴클레아제 처리함으로써 파괴시킬 수 있다.
올리고뉴클레오티드-지시된 돌연변이를 유사한 방법으로 적용하여 IL-2 활성을 가지나, cys 125가 세린 125로 변형된 뮤테인을 코드화하는 돌연변이 IL-2 유전자를 생성할 수 있다. 파지가 유전자의 센스 본쇄를 함유할 경우 이와 같은 돌연변이 IL-2 유전자를 제조하는데 사용되는 바람직한 올리고뉴클레오티드 프라이머는
Figure kpo00002
이다. 이 올리고뉴클레오티드는 IL-2 유전자의 코돈 125와 짝지워진 삼중자의 가운데 염기에서 C→G 변화가 포함되어 있다.
이어서, 생성된 돌연변이성 헤테로 듀플렉스를 사용하여 컴피턴트(competent) 숙주 유기체 또는 세포를 형질전환시킨다. 숙주에 의해 헤테로 듀플렉스가 복제되면 2개의 본쇄로부터 자손이 생성된다. 복제후 돌연변이 유전자를 돌연변이 본쇄의 자손으로부터 분리하고, 적합한 발현 벡터에 삽입한 다음, 이 벡터를 사용하여 적합한 숙주 유기체 또는 세포를 형질전환시킬 수 있다. 이와 같은 경우에 사용할 수 있는 바람직한 벡터는 플라스미드 pBR322, pCR1, 이들의 변이체, 합성벡터 등이다. 적합한 숙주 미생물은 이.콜라이(E.Coli), 슈도모나스(Pseudomonas), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 서린지엔시스(Bacillus thuringiensis), 다양한 효모 균주, 바실러스 씨모필러스(Bacillus thermophilus); 마우스, 래트 또는 중국산 햄스터 난소(Chinese hamster ovary, CHO) 세포와 같은 동물세포; 식물세포, 동물 및 식물 숙주 등이다. 또한 선택된 숙주를 벡터로 형질전환시키는 경우, 뮤테인의 발현을 위해 적절한 프로모터-오퍼레이터 서열을 도입할 수 있음이 인식되어져야 한다. 숙주는 원시핵 또는 친핵체일 수 있다(진핵 세포에 DNA를 삽입하는 공정은 1981년 9월 3일에 공개된 PCT 특허원 US 81/00239 및 US 81/00240호에 기술되어 있다). 이중 이.콜라이와 CHO 세포가 바람직한 숙주이다. 본 발명에 따라 수득된 뮤테인은 모 단백질에 존재하는 글리코실화 및 뮤테인을 생성하기 위해 사용되는 숙주 유기체에 따라 글리코실화되거나 비글리코실화될 수 있다. 경우에 따라 이.콜라이(E.coli) 또는 바실러스(Bacillus)를 숙주 유기체로 사용하는 경우, 수득된 비글리코실화된 뮤테인을 임의로는 공지된 화학적, 효소적 및 그의 다른 형태의 변형법으로 시험관내에서 글리코실화할 수 있다.
본 발명의 IFN-β의 바람직한 양태에 있어서, 제1도에 제시된 바와같은 IFN-β의 아미노산 서열중 17 위치의 시스테인 잔기를 성숙 IFN-β를 코드화하는 DNA 서열의 센스 본쇄의 17코돈의 첫 번째 염기에서 T→A 전위를 일으킴으로써 세린으로 변화시킨다.
코돈 17의 첫 번째 염기에 단일 염기의 잘못 짝지워짐을 제외하고는 코돈 17의 영역에 있어서 IFN-β의 센스 본쇄상의 17개의 뉴클레오티드 서열과 동일한 합성 17-뉴클레오티드 프라이머 GCAATTTTCAGAGT CAG를 사용하여, 부위-특이적 돌연변이를 유도한다.
이 경우에 미스매취(mismatch)는 프라이머의 뉴클레오티드 12에서 수행된다.
또한 유전자 코드를 변성시킨 다음 한 개 이상의 코돈에 의해 다수의 아미노산을 코드화할 수 있음을 인식해야 한다. 세린에 대한 염기 코드의 예로는 세린에 대한 모든 코드인 TCT, TCG, TCC, TCA, AGT 및 ACG 코돈과 같은 6가지의 변성체를 들 수 있다. 편의상 이중 AGT 코돈을 바람직한 것으로 선택할 수 있다. 이와 유사하게, 트레오닌은 ACT, ACA, ACC 및 ACG 코돈중 하나로 코드화된다. 특정 아미노산에 대해 하나의 코돈을 상술할 경우, 이 아미노산을 코드화하는 모든 변성된 코돈을 포함시키고자 한다. IFN-β 유전자의 안티센스 본쇄를 함유하는 일본쇄 M13 파지 DNA에 17-mer을 하이브리드화 한다. 이어서 DNA 폴리머라아제I 클레노우(klenow) 단편을 사용하여 올리고뉴클레오티드 프라이머를 DNA상에 연장시키고 T4리가아제를 사용하여 생성된 ds DNA를 폐환된 환상 DNA로 전환시킨다. 생성된 돌연변이 헤테로 듀플렉스가 복제되면 미스매취를 함유하는 DNA 본쇄로부터 클론을 수득한다. 특정한 제한부위, 항생물질에 대한 내성 또는 감수성의 유.무 또는 공지된 다른 방법으로 돌연변이된 클론을 동정 및 스크리닝할 수 있다. 시스테인을 세린으로 치환시킬 경우, 제2도에 제시된 바와같이 T→A 전위로 인해 구조 유전자에 새로운 Hin fI 제한부위가 생성된다. 돌연변이된 파지반점(plaques)의 하이브리드화 스크리닝에서 프로브로서 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 돌연변이 클론을 동정한다. 프라이머는, 모체에 하이브리드화되는 경우, 단일의 미스매취를 가지나, 제2도에 표시된 바와같이 돌연변이된 파지 DNA에 하이브리드화되는 경우, 완전한 매취를 함유한다. 또한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 바람직하게는 돌연변이된 DNA에 하이브리드화하나 모 DNA에는 하이브리드화하지 않는 하이브리드화 조건을 적용할 수 있다. 새로 생성된 Hin fL 부위도 IFN-β 유전자의 단일염기 돌연변이의 확인 수단으로 제공된다.
돌연변이된 유전자를 함유하는 M13 파지 DNA를 분리하여 플라스미드 pTrp 3와 같은 적합한 발현벡터에 삽입한 다음, 이 벡터를 사용하여 이.콜라이 균주 MM294를 형질전환시킨다. 형질전환체 및 그의 자손을 배양하기에 적합한 성장 배지는 본 분야의 숙련가에는 공지되어 있다. IFN-β의 발현된 뮤테인을 분리, 정제 및 특성화한다.
하기 실시예는, 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 단지 상세히 설명할 목적으로 제시한다. 따라서 본 발명의 영역을 여기에만 제한시키고자 하는 것은 아니다. 실시예 1 내지 9에서는 IFN-β의 뮤테인을 제조하는 방법을 기술한다. 또한 실시예 10 내지 15에서는 IL-2의 뮤테인을 제조하는 방법을 기술한다.
[실시예 1]
[M13 벡터에 IFN-β 유전자의 클론화]
일본쇄 DNA 주형의 공급원으로 M13 파지 벡터를 사용함이 지.에프.템플 등에 의해 발표되었다[참조:G.F.Temple et al., Nature(1982)296:537-540]. 이.콜라이 trp 프로모터의 조절하에 IFN-β 유전자를 함유하는 플라스미드 pβ1trp(제3도)를 제한효소 Hin d III 및 Xho II로 분해한다. M13 mp 8(참조:J.Messing,“Third Cleveland Symposium on Macromolecules” Recombinant DNA: Ed.A.Walton, Elsevier Press, 143-153(1981)) 복제형(RF) DNA(제4도)를 제한효소 Hin dIII 및 Barm HI로 분해시킨 다음 미리 Hind III 및 Xho II로 분해시킨 pβ1 trp DNA와 혼합한다. 이어서 혼합물을 T4DNA 리가아제로 연결시키고 연결된 DNA로 이.콜라이 균주 JM103 세포를 형질전환시킨 다음 Xgal 지시평판상에 도말한다(참조:J.Messing, et al, Nucleic Acids Res(1981)9:309-321). 재조합 파지를 함유하는 반점(백색 반점)을 채취하여, JM103의 신선한 배양물에 접종한 다음, 감염된 세포로부터 RF 분자의 미니프렙(miniprep)을 제조한다(참조:H.D.Birnboim and J.Doly, Nucleic Acid Res(1979)7:1513-1523). RF분자를 다양한 제한 효소로 분해시켜 IFN-β 삽입물을 함유하는 클론을 확인한다. 이와 같은 클론(M13-β1)의 제한지도가 제5도에 제시되어 있다. 일본쇄(SS)파지 DNA를 클론 M13-β1로부터 제조하여 합성 뉴클레오티드를 사용하는 부위-특이적 돌연변이를 위한 주형(template)으로 제공한다.
[실시예 2]
[부위-특이적 돌연변이]
40피코몰의 합성 올리고뉴클레오티드 GCAATTTTCAGAGTCAG(프라이머)를 0.1mM 아데노신 트리포스페이트(ATP), 50mM 하이드록시 메틸아미노메탄하이드로클로라이드(Tris-HCl)(pH 8.0), 10mM MgCl2, 5mM 디티오트레이톨(DTT) 및 9단위의 T4키나아제의 존재하에 37℃에서 1시간 동안 50㎕중, T4키나아제로 처리한다. 키나아제로 처리된 프라이머(12피코몰)를 50mM NaCl, 10mM Tris-HCl(pH8.0), 10mM MgCl2및 10mMβ-머캅토에탄올을 함유하는 50㎕의 혼합물중, 67℃에서 5분간 및 42℃에서 25분간 가열함으로써 SS M13-β1 DNA 5㎍에 하이브리드화한다. 이어서 아닐링된 혼합물을 얼음상에서 냉각시킨 다음, 각각 0.5mM의 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트(dNTP), 80mM Tris-HCl(pH 7.4), 8mM MgCl2, 100mM NaCl, 9단위의 DNA 폴리머라아제 I, 클레노우 단편, 0.5mM ATP 및 2단위의 T4DNA 리가아제를 함유하는 50㎕의 반응혼합물에 가하여 37℃에서 3시간 및 25℃에서 2시간 동안 배양시킨다. 이어서 페놀추출 및 에탄올 침전을 수행함으로써 반응을 종결시킨다. DNA를 10mM Tris-HCl(pH 8.0), 10mM 에틸렌 디아민테트라아세트산(EDTA), 50% 슈크로오즈 및 0.05% 브로모페닐블루중에 용해시킨 다음, 2㎍/ml의 에티듐 브로마이드의 존재하에, 0.8% 아가로오즈겔 상에서 전기영동시킨다. M13-β1의 RF형에 상응하는 DNA 밴드를 퍼클로레이트 법에 의해 겔슬라이스로부터 용출시킨다(참조:R.W.Davis, et al, Advanced Bacterial Genetics″, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., p178-179(1980)). 용출된 DNA를 사용하여 컴피턴트 JM 103세포를 형질전환시킨 다음, 철야 성장시키고, 배양상등액으로부터 SS DNA를 분리한다. 이 SS DNA를 프라이머 연장의 제2사이클에서 주형으로 사용하고, DNA의 겔 정제된 RF형을 사용하여 컴피턴트 JM 103 세포를 형질전환시키고, 한천 평판상에 도말한 다음, 철야 배양시켜 파지 반점을 수득한다.
[실시예 3]
[부위 특이적 돌연변이]
시스테인을 코드화하는 IFN-β 유전자의 코돈 17을 트레오닌을 코드화하는 IFN-β 유전자의 코돈 17로 바꾸기 위해 GCAATTTTCAGACTCAG를 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머로 사용하는 점을 제외하고는 실시예 2의 방법을 반복한다.
[실시예 4]
[부위 특이적 결실]
IFN-β 유전자의 코돈 17을 결실시키기 위해 AGCAATTTTCAGCAGAAGCTCCTG를 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머로 사용하는 점을 제외하고는 실시예 2의 방법을 반복한다.
[실시예 5]
[돌연변이된 반점의 스크리닝 및 확인]
돌연변이된 M13-β1반점(실시예 1)을 함유하는 평판 및 돌연변이되지 않은 M13-β1파지 반점을 함유하는 2개의 평판을 4℃로 냉각시킨 다음, 첫 번째 건조필터를 5분 동안에 걸쳐 묻고, 다시 두 번째 필터를 15분에 걸쳐 묻음으로써 2개의 니트로셀룰로오즈 필터에 각 평판으로부터 반점을 옮긴다. 다음에 필터를 5분간 0.2N NaOH, 1.5M NaCl 및 0.2% Triton X-100에 침지시킨, 두꺼운 필터 페이퍼에 방치한 다음 0.5M Tris-Hcl(pH 7.5) 및 1.5M NaCl에 침지시킨 필터페이퍼에 다시 5분간 묻음으로써 중화한다. 필터를 유사한 방법으로 2×SSC(Standard Saline Citrate)에 침지시킨 필터상에서 2회 세척하고, 건조시킨 다음 다시 80℃의 진공 오븐에서 2시간 동안 건조시킨다. 2개의 필터를 55℃에서 4시간 동안 필터 1개당 10ml의 DNA 하이브리드화 완충액(5×SSC)(pH 7.0), 4×덴하르트 용액(Denhardt′s Solution : 폴리비닐피롤리돈, 피콜(ficoll) 및 소의 혈청 알부민, 여기서 1X는 각각 0.02%임), 0.1% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 50mM 인산 나트륨 완충액(pH 7.0) 및 100㎍/ml의 변성된 연어 정액 DNA로 예비하이브리드화(prehybridize)한다. 올리고뉴클레오티드 프라이머를 32p-표지된 ATP로 키나아제 처리함으로써, 32p-표지된 프로브를 제조한다. 필터를 필터 1개당 5ml의 DNA 하이브리드화 완충액으로 55℃에서 24시간 동안 3.5×105cpm/ml의 32p-표지된 프라이머에 하이드리드화한다. 필터를 55℃에서 30분간 0.1% SDS를 함유하고 SSC의 양을 감소시킨 세척용 완충액으로 세척한다. 처음에는 필터를 2×SSC를 함유하는 완충액으로 세척하고, 가이거 계수기(Geiger counter)를 사용하여 돌연변이되지 않은 M13-β1반점을 함유하는 대조 필터에 대한 방사능의 존재를 확인한다. 방사능이 검출되지 않을때까지, 돌연변이 되지않은 M13-β1 반점을 함유하는 대조 필터를 SSC의 농도를 단계적으로 저하시키면서 세척한다. 사용하는 SSC의 최저 농도는 0.1×SSC이다. 필터를 공기 건조시키고, -70℃에서 2 내지 3일간 오토라디오그라피한다. 키나아제 처리한 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 480개의 돌연변이된 M13-β1 반점 및 100개의 돌연변이되지 않은 대조 반점을 스크리닝한다. 5개의 돌연변이된 M13-β1 반점이 프로브로 하이브리드화되는 반면에 대조용 반점은 하나도 프로브로 하이브리드화되지 않는다.
5개의 돌연변이된 M13-β1 반점중 한 개(M13-SY 2501)를 채취하여 JM 103 배양물에 접종한다.
SS DNA를 상등액으로부터 제조하고, 2본쇄(ds) DNA는 세포 펠릿으로부터 제조한다. SS DNA를 M13 유니버살 프라이머를 사용하는 클론의 디데옥시-서열화를 위한 주형으로 사용한다. 서열분석 결과는 제6도에 제시되어 있으며, 이로부터 TGT cys 코돈이 AGT ser 코돈으로 전환되었음이 확인되었다.
[실시예 6]
[이.콜라이중에서의 돌연변이된 IFN-β의 발현]
M13-SY2501로부터 생성된 RF DNA를 제한효소 Hind III 및 xho II로 분해하고, 520bp 삽입 단편을 1% 아가로오즈 겔상에서 정제한다. 이.콜라이 trp 프로모터를 함유하는 플라스미드 pTrp3(제7도 참조)을 Hind III 및 BamHI효소로 분해한 다음, 정제된 M13-SY 2501 DNA 단편과 혼합하고, T4DNA 리가아제의 존재하에 연결시킨다. 연결된 DNA를 사용하여 이.콜라이 균주 MM294를 형질전환시킨다. 암피실린내성 형질전환체를 테트라싸이클린 약제에 대한 감수성에 대해 스크리닝한다. 5개의 암피실린 내성, 테트라 싸이클린 감수성 클론으로부터의플라스미드 DNA를 Hinf I으로 분해시켜 M13-SY2501 삽입물의 존재에 대해 스크리닝한다. 제8a도에서는, 원래의 IFN-β클론, pBl trip의 Hinf I 패턴과 비교된 pSY 2501 클론의 Hinf I 제한 패턴이 제시되어 있다. 예측한 바와같이, pSY 2501에는 추가의 Hinf I 부위가 존재하여, 197bp IFN-β 내부 단편이 169bp 단편 및 28bp 단편으로 절단된다(참조 제8b도). 클론 pSY 2501의 제한 지도는 제9도에 제시되어 있다. 돌연변이 IFN-β 유전자의 완전한 DNA 서열은 예측된 아미노산 서열과 함께 제10도에 제시되어 있다.
클론 pSY 2501로 표시된 플라스미드는 하기 기관에 기탁되어 있다[참조:Agricultural Research Culture Collection(NRRL), Fermentation Laboratory, Northern Regional Research Center, Science and Education Administration, U.S.Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 60604; CMCC No.1533 및 NRRL No.B-15356].
pSY 2501 및 pβ1 trp의 배양물은 그의 자손을 포함하여, 흡광도(0D 600) 1.0까지 성장한다. 세포를 제거한 추출물을 제조하여 IFN-β 항바이러스 활성량을 GM 2767 세포에 대해 미소 역가 검정으로 분석한다. 클론 pSY 2501의 추출물은 pβ1 trp보다 3 내지 10배 활성이 높으며(표 1), 이것은 클론 pSY 2501은 IFN-β 활성을 나타내는 단백질을 합성하거나, 이 단백질이 고도의 특이활성을 나타내는 것을 의미한다.
[표 1]
Figure kpo00003
클론 pSY 2501이 수배의 활성을 갖는 단백질을 합성하는지를 시험하기 위해, 클론 pSY 2501 및 클론 pβ1trp의 추출물을 대조용 추출물과 함께 SDS 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동한 다음, 겔을 쿠마시에 블루(coomasie blue)로 염색하여 단백질을 가시화한다. 제11도에 제시된 바와같이, 클론 pSY 2501 및 클론 pβ1trp의 추출물에는 존재하나 대조용 클론 ptrp3의 추출물에는 존재하지 않는 약 18,000 달턴의 단백질에 상응하는 단백질 밴드 한 개만이 나타난다. 분자량은 약 20,000달턴이지만 18,000달턴의 겔 이동패턴을 보여주는 상기 단백질은, 이 단백질을 pβ1trp 추출물로부터 정제함에 의해 IFN-β로 확인되었다. 이 단백질이 pβ1trp 추출물중에서 보다 pSY 2501의 추출물중에 더 적게 존재하므로 클론 pSY 2501의 추출물중 단백질의 특이활성이 클론 pβ1trp의 추출물중 단백질의 특이 활성보다 높다.
[실시예 7]
[IFN-Bser17의 정제]
IFN-Bser17을 생성하기 위해 형질전환시킨 이.콜라이로부터 IFN-Bser17을 회수한다. 이.콜라이를 하기 조성을 갖는 성장 배지에서 680nm에서의 0D가 10 내지 11이 될 때까지 증식시킨다(건조중량 8.4g/ℓ).
[표 2]
Figure kpo00004
수득된 9.9ℓ(9.9kg)의 형질전환된 이.콜라이를 20℃로 냉각시킨 다음 여액의 중량이 8.8kg으로 될 때까지 평균압력 강하∼110kpa 및 정상상태(steady-state)의 여과속도 260ml/min으로 교차류 필터(cross-flow filter)를 통과시켜 농축한다. 농축물(약 1ℓ)을 흡인시켜 용기에 넣고 15℃로 냉각시킨다. 이어서, 농축물중의 세포를 5℃, ∼69,000kpa에서 맨턴-골린 균질화기(Manton-Gaulin homogenizer)를 통과시켜 파괴시킨다. 균질화기를 1ℓ의 인산염 완충식염수(pH7.4, PBS)로 세척하고, 전술된 바의 파괴된 농축물에 이 세척물을 가하여 최종 용적이 2ℓ가 되도록 한다. 이것을 유출속도 50ml/min에서 12000×g로 연속적으로 원심분리한다. 상등액으로부터 고체를 분리하여 2%(중량)의 SDS를 함유하는 4ℓ의 PBS에 재현탁 시킨다. 이 현탁액을 실온에서 15분간 교반시키면, 육안으로 보다 현탁된 물질이 없게 된다. 이어서 이 용액을 2-부탄올:용액의 용적비가 1:1이 되도록 하여 2-부탄올로 추출한다. 유출속도 200ml/min으로 하여, 액상-액상 분리기를 사용하여 추출 공정을 수행한다. 이어서 유기층을 분리하고, 증발 건조시켜 21.3g의 단백질을 수득한다. 이 단백질을 용적비 1:10으로 증류수에 재현탁시킨다.
수득한 생성물을, 바이러스 세포변성 작용(CPE)에 대한 보호를 기준으로 하는 분석을 사용하여 인체 IFN-β 활성에 대해 분석한다. 이 분석은 미소역가 평판에서 수행한다. 50㎕의 최소 필수 배지를 각각의 웰(Well)에 가하고, 25㎕의 시료를 제1웰에 가하며, 제2웰부터 용적비 1:3으로 연속하여 희석한다. 바이러스(Vesicular Stomatitus), 세포(human fibroblast line GM-2767) 및 대조용 IFN-β를 각각의 평판에 가한다. 대조용 IFN-β는 1ml당 100단위를 사용한다. 이어서 이 평판에 10분간 UV선을 조사한다. 조사를 끝낸후, 100㎕의 세포현탁액(1.2×105개/ml)을 각각의 웰에 가한 다음 18 내지 24시간 동안 트레이(tray)를 배양시킨다. 세포 1개당 1개의 반점 형성 단위로 대조용 세포를 제외한 각각의 웰에 바이러스 용액을 가한다. 다음에, 바이러스 대조용에서 100% CPE가 나타날때까지 트레이를 배양시킨다. 통상적으로는 바이러스 용액을 가하고 18 내지 24시간 후 100% CPE가 나타난다. 대조용 IFN-β의 50% CPE웰의 위치와 관련하여 분석결과를 이해한다. 결과로부터, 평판상에서 모든 시료에 대한 인터페론의 역가를 측정한다. 수득된 생성물의 특이 활성은 5×10μ/mg으로 측정된다.
[실시예 8]
[산에 의한 침전 및 크로마토그라피에 의한 정제]
추출한 다음 수층과 유기층을 분리하고 유기층을 용적비 3:1의 PBS와 혼합하며, 빙초산을 가하여 혼합물의 pH를 약 5로 저하시키는 것을 제외하고는 실시예 7의 공정을 반복한다. 10000 내지 17000×g로 15분간 원심분리함으로써 생성된 침전을 분리하여 10% W/V SDS, 10mM DTT 및 50mM 아세트산 나트륨 완충액(pH 5.5)에 재용해시킨 다음 80℃로 5분간 가열한다.
이어서 이 용액을 벡크만 구배계(Beckman gradient system)를 사용하여 브라운리(Brownlee) RP-300, 10μM“Aquapore” 칼럼에 적용시킨다. 완충액 A는 H2O중의 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)이고; 완충액 B는 아세토니트릴중의 0.1% TFA이다. 280nm에서의 자외선 흡광도로 검출한다. 3시간 후 용매계의 직선 구배는 0% 내지 100% 완충액 B이다. 최고의 인터페론 활성을 갖는 분획을 합쳐서 특이 활성을 측정하면, 원래의 IFN-β의 약 2×108μ/mg에 비해, 단백질 1mg당 9.0×107내지 3.8×108국제단위를 나타낸다.
[실시예 9]
[IFN-βser17의 생화학적 특성화]
40㎍의 IFN시료를 200㎕의 5.7N HCl, 0.1% 페놀로 108℃에서 가수분해하고 24 내지 72시간 후, 아미노산 조성을 측정한다. 퍼포름산 산화를 수행한 후, 같은 방법으로 프롤린 및 시스테인을 분석하는데, 이 경우에는 가수분해시 페놀을 사용하지 않는다. 400㎕의 시료를 5.7N HCl, 10% 머캅토아세트산(페놀부재)으로 가수분해하고 24시간 후 트립토판을 분석한다. 분석은 단일의 AA10 수지 칼럼을 사용하여 벡크만 121MB 아미노산 분석기로 수행한다.
정제된 IFN-㎕ser17을 산가수분해하고 각각 24, 48, 72시간 후에 측정한 아미노산 조성은 클론 IFN 유전자의 DNA 서열에서 제거된 N-말단 메티오닌을 제외한 것으로, 예측된 바와 일치한다.
정제된 IFN의 아미노산 말단으로부터 처음 58개의 잔기의 아미노산 서열은, 0.7mg의 시료에 대해 0.1M퀘드롤(Quadrol)완충액을 사용하여 벡크만 890C 서열 분석기로 측정한다. PTH 아미노산은, 45℃에서 알텍스 울트라스피어(Altex Ultrasphere) ODS 칼럼(4.6×250nm)상에서 역상 HPLC하고, 1.3분 후 40% 완충액 B로 용출하여, 8.4분후 40 내지 70% 완충액 B로 용출시켜 측정하는데, 이 경우에 완충액 A는 0.115M 아세트산 나트륨, 5% 테트라하이드로 푸란(THF)이고, pH5.11이며, 완충액 B는 아세토니트릴중의 10% THF이다.
측정된 IFN-βser17의 N-말단 아미노산 서열은 N-말단 메티오닌의 부재를 제외하고는 DNA 서열로부터 예측된 서열과 부합된다.
전술한 바와같이, IFN-βser17제제는 천연 IFN-β와 매우 근사하거나 천연 IFN-β 보다 우수한 특이 활성을 나타낸다. IFN-βser17에는 유리 설퍼히드릴 그룹이 없으나 31위치 및 141위치에 남아있는 시스테인간에 한 개의 -S-S-결합이 존재한다. 한편 이 단백질은 용이하게 올리고머를 형성하지 않으며, 실제적으로는 모노머 형태이다. 본 발명에 따라 수득된 IFN-βser17은 단일 생성물 또는 다양한 형태의 혼합물로서, 암치료시 또는 인터페론 치료가 지시된 상태에서 임상적 및 치료적으로 사용하거나, 또는 바이러스 감염을 치료하기 위해 불활성이며 무독성이고 비알레르기성이며 생리학적으로 적절한 담체 매질중의 약제학적으로 허용되는 제제로 제형화할 수 있다. 이와같은 담체매질에는 증류수, 생리 식염수, 링거액, 핸크액(Hank′s Solution)등이 포함되나 이것에만 제한되는 것은 아니다. 덱스트로오즈, HSA(인체의 혈청 알부민)등과 같은 그외의 무독성 안정화 및 가용화 첨가제가 적절히 포함될 수 있다. 치료제는 경구적으로, 또는 정맥, 근육, 복강내 및 피하투여와 같이 비경구적으로 투여할 수 있다. 본 발명의 변형된 IFN-β 제제는 또한 이와 같은 목적에 통상적으로 사용되는 적합한 매질중에 가한 제형으로 국소 적용할 수 있다.
전술된 IFN-β의 뮤테인의 주요한 이점은 IFN-β의 17위치에서 유리 설프히드릴 그룹을 제거한 점이며, 이로인해, 단백질에서 cys 31 및 cys 141간에 적합한 디설파이드 결합이 형성되어 완전한 생물학적 작용을 나타내기 위한 외면적으로 필요한 형태로 되게 한다. IFN-βser17의 특이 활성이 증가됨으로써 치료제로 사용할 경우 소량으로도 치료가 가능하게 된다. 17위치의 시스테인을 결실시키고, 유리-SH 그룹이 제거됨으로써 IFN-βser17단백질은 미생물학적으로 생성된 IFN-β만큼 용이하게 다이머 및 올리고머가 형성되지 않는다. 이로인해 단백질의 정제가 용이해지며, 안정성이 향상된다.
[실시예 10]
인체 IL-2를 코드화하는 cDNA 클론에 대한 뉴클레오티드 서열, IL-2 cDNA 라이브러리의 제조 방법, 및 IL-2의 스크리닝 방법은 태니구치, 티.등에 의해 기술되었다[참조:Taniguchi, T., et al, Nature(1983) Vol 24, p305 et seq].
잠재적인 IL-2 cDNA 클론중에 강화된 cDNA 라이브러리는 유도된 말초혈의 임파구(PBL) 및 저켓(Jurkat)세포로부터 수득된 IL-2 강화된 mRNA 분획으로부터 통상적인 방법으로 제조한다. IL-2 메시지에 대한 mRNA의 강화는 mRNA를 분획화하고 크세노푸스 래비스(Xenopus laevis)난모 세포중에 분획을 주사함으로써 IL-2 mRNA 활성을 갖는 분획을 확인하고, HT-2 세포의 IL-2 활성을 난모세포 용해질을 사용하여 분석함으로써 수행한다(참조:J.Watson, J Exp Med(1979) 150:1570-1519 및 S.Gillis et al, J Immun(1978) 120:2027-2032).
[실시예 11]
[IL-2 cDNA클론의 스크리닝 및 확인]
콜로니 하이브리드화 공정을 이용하여 IL-2 cDNA 라이브러리를 스크리닝한다. 각각의 미소역가 평판을 이중 니트로셀룰로오즈 필터 페이퍼(S S형 BA-85)에 복제한 다음 50㎍/ml의 암피실린을 함유하는 L한천 상에서 37℃로 14 내지 16시간 동안 콜로니를 증식시킨다. 콜로니를 용해시키고, 500mM NaOH, 1.5M NaCl의 순으로 5분간 처리함으로써 필터에 DNA를 고정시키고, 5×표준 염수 시트레이트(SSC)용액으로 각각 5분간 2회 세척한다. 필터를 공기 건조시키고, 2시간 동안 80℃로 다시 건조시킨다. 이중 필터를 42℃에서 6 내지 8시간 동안 필터 1개당 10ml의 DNA 하이브리드화 완충액(50% 포름아미드, 5×SSC, pH 7.0, 5×덴하르트 용액(폴리비닐 피롤리딘, 피콜 및 소의 혈청 알부민, 1X=각각 0.2%), 50mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0), 0.2% SDS, 20㎍/ml 폴리μ, 및 50㎍/ml의 변성 연어 정액 DNA로 예비 하이브리드화한다.
32p-표지된 20-mer 올리고뉴클레오티드 프로브는 타니구치, 티.(Taniguchi, T.)등에 의해 발표된 IL-2 유전자 서열을 기준으로 제조한다. 프로브의 뉴클레오티드 서열은 GTGGCCTTCTTGGGCATGTA이다.
시료를 42℃에서 24 내지 36시간 동안32p cDNA 프로브를 함유하는 5ml/필터의 DNA 하이브리드화 완충액으로 하이브리드화한다. 필터를 각각 50℃에서 2×SSC, 0.1% SDS로 30분간 2회 세척한 다음 50℃에서 90분간 1×SSC 및 0.1% SDS로 2회 세척하여 공기 건조시킨 다음 -70℃에서 2 내지 3일간 오토라피오그라피한다. 양성 클론을 확인하여 프로브로 재스크리닝한다. 제한 효소 지도 및 타니구치등에 의해 발표된 IL-2 cDNA 클론의 서열과 비교함으로써 전체적인 클론의 길이를 동정하여 확인한다.
[실시예 12]
[IL-2유전자의 M13 벡터로의 클론화]
이.콜라이 trp 프로머터의 조절하게 IL-2 유전자를 함유하는 플라스미드 pLW1(제12도)을 사용하여 실시예 1에 기술된 바와같이 IL-2 유전자를 M13mp9에 클론화한다. pLW1 시료는 1983년 8월 4일자로 기탁번호(ATCC) 제39,405호로 ATCC[American type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA]에 기탁되어 있다. IL-2 삽입물을 함유하는 하나의 클론(M13-IL2로 표기)의 제한지도는 제13도에 제시되어 있다. 클론 M13-IL2로부터 일본쇄 파지 DNA를 제조하여 올리고뉴클레오티드-지시된 돌연변이를 위한 주형으로 제공한다.
[실시예 13]
[올리고뉴클레오티드-지시된 돌연변이]
전술한 바와 같이, IL-2는 58, 105 및 125번의 아미노산 위치에서 시스테인 잔기를 함유한다. 3개의 시스테인 잔기에 대한 코돈을 함유하는 IL-2 유전자 부분의 뉴클레오티드 서열을 기준으로 하여, 이 3개의 시스테인 잔기에 대한 코돈을 세린에 대한 코돈으로 돌연변이시키기 위해 3개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 계획하여 합성한다.
Figure kpo00005
40 피코몰의 올리고뉴클레오티드를 각각 50㎕의 0.1mM ATP, 50mM Tris-HCl(pH 8.0), 10mM MgCl2, 5mM DTT 및 9단위의 T4키나아제의 존재하에 37℃에서 1시간 동안 키나아제 처리한다. 키나아제 처리된 각각의 프라이머(10 피코몰)를 100mM NaCl, 200mM Tris-HCl(pH 7.9), 20m MgCl2및 20mM β-머캅토에탄올을 함유하는 15㎕의 혼합물 중에서 67℃로 5분간 및 42℃로 25분간 가열함으로써 2.6㎍의 ssM 13-IL2 DNA에 하이브리드화 한다. 아닐링된 혼합물을 얼음상에서 냉각시킨 다음, 각각 0.5 mM의 dNTP, 17mM Tris-HCl(pH 7.9), 17mM MgCl2, 83mM NaCl, 17mM β-머캅토에탄올, 5단위의 DNA 폴리머러아제 I 클레노우 단편, 0.5mM ATP 및 2단위의 T4DNA 리가아제를 함유하는 최종용적 25㎕의 반응혼합물에 적용한 다음, 37℃로 5시간 동안 배양한다. 이어서, 80℃로 가열하여 반응을 종결시키고, 반응 혼합물을 사용하여 컴피턴트 JM 103 세포를 형질전환시키고, 한천 평탄상에 도말한 다음 철야 배양하여 파지 반점을 수득한다.
[실시예 14]
[돌연변이 유발된 파지 반점의 스크리닝 및 확인]
돌연변이 유발된 M13-IL2 반점을 함유하는 평탄 및 돌연변이 유발되지 않은 M13-IL2 파지반점을 함유하는 2개의 평탄올 4℃로 냉각시킨 다음 제1필터에 대해 5분간 및 제2필터에 대해 15분간 건조 필터를 한천 평판상에 묻음으로써 각 평판으로부터 수득된 파지 반점을 2개의 니트로셀룰로오즈 필터 서클에 옮긴다. 이어서 필터를 0.2N NaOH, 1.5M NaCl 및 0.2% Triton중에 5분간 침지시킨 두꺼운 필터 페이퍼에 놓았다가 0.5M Tris-HCl(pH 7.5) 및 1.5M NaCl로 5분간 침지시킨 필터페이퍼에 다시 묻음으로써 중화시킨다. 이 필터를 2×ssc중에 침지시킨 필터상에서 유사한 방법으로 2회 세척하고, 건조시킨 후 80℃의 진공오븐에서 다시 2시간 동안 건조시킨다. 이중 필터를 필터 1개당 10ml의 DNA 하이브리드화 완충액(5×ssc, pH 7.0), 4×덴하르트 용액(폴리비닐피롤리딘, 피콜 및 소외 혈청 알부민, 1×=각각 0.02%), 0.1% SDS, 50mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0) alc 100㎍/ml의 변성된 연어의 정액 DNA로 42℃에서 4시간 동안 예비 하이브리드화 한다.32P-표지된 브로브는 올리고 뉴클레오티드 프라이머를 표지된 ATP로 키나아제 처리하여 제조한다. 필터를 42℃에서 8시간 동안 필터 1개당 5ml의 DNA 하이브리드화 완충액 중에서 0.1×105cpm/ml의32P-표지된 프라이머에 하이브리드화한다. 필터를 50℃에서 30분간 0.1% SDS 및 2×SSC를 함유하는 세척용 완충액으로 2회 50℃에서 30분간 0.1% SDS 및 0.2×ssc로 2회 세척한다. 필터를 공기 건조시킨 다음 -70℃에서 2 내지 3일간 오토라디오그라피한다.
올리고뉴클레오티드 프라이머 DM 28 및 DM 29는 돌연변이 유발된 클론의 새로운 Dde I 제한부위(제14도)를 생성하도록 지정된 것이므로, 키나아제 처리된 프라이머로 하이브리드화된 다수의 클론으로부터의 RF-DNA를 제한 효소 Dde I으로 분해한다. 프라이머 DM 28로 하이브리드화 되어 새로운 Dde I 제한부위를 함유하는 돌연변이 유발된 M13-IL2 반점중 하나(M13-LW44)를 채취한 다음 JM103 의 배양물에 접종하면, ss DNA는 배양물의 상등액으로부터 제조되고, dsRF-DNA는 세포펠릿으로부터 제조된다. 이와 유사하게, 프라이머 DM29로 하이브리드화된 반점(M13-LW46)을 채취한 다음 이로부터 ssDNA 및 RF-DNA를 제조한다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 DM27은 Dde I 부위 대신 새로운 Pst I 제한부위를 생성하도록 지정되어 있다. 따라서, 이 프라이머로 하이브리드화된 반점을 새로운 Pst I 부위의 존재에 대해 스크리닝한다. 이러한 파지중 하나가 M13-LW42로 확인되었으며 이 반점으로부터 ss DNA 및 RF-DNA가 제조된다. 이 3개의 클론으로부터의 DNA를 서열화하여 시스테인에 대한 표적 TGT코돈이 세린에 대한 TCT코돈으로 전환되었음을 확인되었다.
[실시예 15]
[이.클라이에서의 발현을 위한 돌연변이 유발된 IL-2 유전자의 재클론화]
M13-LW42, M13-LW44 및 M13-LW46으로부터 수득된 RF-DNA를 각각 제한효소 HindIII 및 BanII로 분해한 다음 삽입 단편을 1% 아가로오즈 겔로부터 정제한다. 이와 유사하게, 플라스미드 pTrp3(제7도)을 HindIII 및 BanII로 분해하고, trp 프로모터를 함유하는 긴 플라스미드 단편을 아가로오즈 겔 상에서 정제한 다음 M13-Lw42, M13-LW44 및 M13-LW46으로부터 분리된 각각의 삽입 단편과 연결시킨다. 연결된 플라스미드를 사용하여 컴피턴트 이.클라이 K12 균주 MM294를 형질전환시킨다. 이와 같은 형질전환체로부터 수득된 플라스미드 DNAs를 제한효소 지도작성으로 분석하여, 플라스미드 pLW 42, pLW 44 및 pLW 46의 존재를 확인한다. 제14도는 pLW 46의 제한지도이다. 이와 같은 클론 각각을 트립토판의 부재하에 증식시켜 trp 프로모터를 유도시키고 세포를 제거한 추출물을 SDS-폴리아크릴아미드 겔상에서 분석하는 경우, 이들 3개의 클론, 즉 pLW 42, pLW 44 및 pLW 46은 14.4kd IL-2 단백질을 합성하는 것으로 알려진 양성 대조군인 pLW21에서 발견되는 것과 유사한 14.5kd 단백질을 합성함이 확인된다. 이와 동일한 추출물을 마우스 HT-2 세포에 대한 IL-2 활성에 대해 분석할 경우, pLW21(양성 대조군) 및 pLW46만이 유의적인 IL-2 활성을 나타내는데(표 2), 이것은 cys 58 및 cys 105가 생물학적 활성을 나타내는데 필요하며, 이들이 세린(각각 pLW 42 및 pLW 44)으로 변화되면, 생물학적 활성이 소실된다는 것을 의미한다. 한편, cys 125는 생물학적 활성을 나타내지 않는 ser 125(PLW 46)으로 변화되기 때문에, 생물학적 활성을 나타내는데 필수적이 아닐 수도 있다.
[표 3]
Figure kpo00006
제15a도는 클론 pLW46의 코드화 본쇄의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 인체의 IL-2 유전자의 코드화 본쇄와 비교할 때 클론 pLW 46은 뉴클레오티드 374에서 G→C로의 단일 염기 변화를 갖는다. 제15b도는 pLW46에 의해 코드화된 IL-2뮤테인의 상응하는 아미노산 서열을 나타낸다. 이 뮤테인은 IL-2 ser 125로 표기한다. 천연 IL-2에 비해 이 뮤테인은 125 위치에 시스테인 대신 세린을 함유한다.
pLW46으로 형질전환시킨 이.클라이 K12균주 MM294시료는 기탁번호(ATCC) 39,452호로 1983년 9월 26일에 ATCC[American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA]에 기탁되어 있다.
125 위치의 시스테인이 결실되거나 다른 아미노산으로 치환된, 뮤테인 IL-2 ser 125와 같은 IL-2 뮤테인은 IL-2 활성을 갖는다. 따라서 이 물질은 천연 IL-2와 같은 방법으로 제형화 및 사용될 수 있다. 그러므로, 이와 같은 IL-2 뮤테인은 세균, 바이러스, 기생충, 원생동물 및 진균 감염증의 진단 및 치료; 림포카인(lymphokine) 또는 면역결핍증의 확인; 노화된 인간 및 동물에 정상적인 면역기능의 재구성; 효소를 사용하는 증폭, 방사선 표시, 방사선 조영, 및 병적상태에서의 IL-2를 모니터링하기 위한 다른 방법과 같은 진단법의 개발; 림포카인에 대한 수용체 부위를 차단하기 위한 치료 및 진단목적으로 시험관내에서 T세포의 성장촉진; 및 그외의 치료, 진단 및 연구 목적에 유용하다. 인체의 IL-2를 치료하고 진단하는데 사용되는 여러 가지 방법은 여러 사람에 의해 연구 발표 되었다[참조 : S.A.Rosenberg, E.A.Grimm, et al, A.Mazumder, et al, and E.A.Grimm and S.A.Rosemberg]. 또한 IL-2 뮤테인은 단일로 또는 그외의 면역학적으로 적합한 B 또는 T세포 또는 그외의 치료제와 함께 사용할 수 있다. 치료 또는 진단용으로 사용하기 위해, 이들은 증류수, 링거액, 핸크액(Hank′s solution), 생리식염수 등과 같은 무독성이고 비알레르기성이며 생리학적으로 적합한 담체매질중에서 제형화할 수 있다. IL-2 뮤테인은 인체 또는 동물에 대해 의사의 지시에 따라 경구, 복강내, 근육 또는 피하로 투여할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드와 함께 사용할 수 있는 적합한 B 또는 T세포, 천연 킬러 세포(natural killer cell) 및 치료제의 예로는 다양한 인터페론, 특히 r인터페론, B세포 성장인자, IL-1 등을 들 수 있다.

Claims (34)

  1. 합성 뮤테인을 코드화하는 구조 유전자를 함유하는 발현 벡테로 형질 전환시킨 재조합 숙주 세포 또는 유기체, 또는 이와 같은 세포 또는 유기체의 자손을 배양시킨 다음 이 배양물로부터 생성된 합성 뮤테인을 수득함을 특징으로 하여 디설파이드 결합을 할 수 있고 생물학적 활성을 나타내는데에 비필수적인 시스테인 잔기 한 개 이상을 함유하며 이 시스테인 잔기중 적어도 하나는 결실되거나 다른 아미노산으로 치환된 생물학적 활성 단백질의 합성 뮤테인을 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 시스테인 잔기가 단지 한 개만 존재하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 시스테인 잔기가 세린, 트레오닌, 글리신, 알라닌, 발린, 로이신, 이소로이신, 히스티딘, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판 또는 메티오닌으로 치환된 방법.
  4. 제1항에 있어서, 시스테인 잔기가 세린 또는 트레오닌으로 치환된 방법.
  5. 제1항에 있어서, 단백질이 IFN-β, IL-2, 림포톡신, 콜로니 자극 인자-1 또는 IFN-α 1인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 단백질이 IFN-α이고, 시스테인 잔기가 IFN-α의 17 위치에 존재하며, 시스테인 잔기가 세린 잔기로 치환된 방법.
  7. 제6항에 있어서, 뮤테인이 비글리코실화된 방법.
  8. 제1항에 있어서, 단백질이 IL-2이고, 시스테인 잔기가 IL-2의 125 위치에 존재하며, 시스테인 잔기가 세린으로 치환된 방법.
  9. 제8항에 있어서, 뮤테인이 비글리코실화된 방법.
  10. 시스테인 잔기를 결실시키거나 다른 아미노산으로 치환시킴으로써 단백질을 돌연변이시킴을 특징으로 하여, 디설파이드 결합을 할 수 있는 시스테인 잔기 한 개 이상을 함유하는 단백질의 디설파이드 결합형성을 방지하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 단백질이 생물학적으로 활성이며, 시스테인이 생물학적 활성을 나타내는데 필수적이 아님을 특징으로 하는 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 시스테인 잔기를 세린 또는 트레오닌으로 치환시킴을 특징으로 하는 방법.
  13. 제10항에 있어서, 단백질이 IFN-β, IL-2, 림포톡신, 콜로니 자극 인자-1 또는 IFN-α 1임을 특징으로 하는 방법.
  14. 제10항에 있어서, 단백질이 IFN-β이고, 시스테인 잔기가 IFN-β의 17 위치에 존재하며, 시스테인 잔기를 세린 잔기로 치환시킴을 특징으로 하는 방법.
  15. 제10항에 있어서, 단백질이 IL-2이고, 시스테인 잔기가 IL-2의 125 위치에 존재하며, 시스테인 잔기를 세린 잔기로 치환시킴을 특징으로 하는 방법.
  16. (a) 디설파이드 결합을 형성할 수 있으며, 생물학적 활성을 나타내는데에 비필수적인 시스테인 잔기 한 개 이상을 함유하는 생물학적 활성 단백질을 코드화하는 구조 유전자의 본쇄를 함유하는 일본쇄 DNA를, 시스테인 잔기에 대한 코돈 또는 이 코돈과 짝지워진 안티센스(antisense) 삼중자를 포함하는 본쇄 영역에 상보적인(다른 아미노산을 코드화하는 코돈 또는 삼중자의 결실을 한정하는, 코돈 또는 안티센스 삼중자와의 미스매취는 제외됨) 돌연변이 올리고뉴클레오티드 프라이머로 하이브리드화하고, (b) 이 프라이머를 DNA 폴리머라아제로 연장시켜 돌연변이 헤테로 듀플렉스(heteroduplex)를 형성시킨 다음, (c) 돌연변이 헤테로 듀플렉스를 복제함을 특징으로 하여, 한 개 이상의 시스테인 잔기가 결실되거나 다른 아미노산으로 치환된, 언급된 생물학적으로 활성인 단백질의 합성 뮤테인을 코드화 하는 유전자를 제조하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 미스매취가 세린 또는 메티오닌을 코드화 하는 삼중자임을 특징으로 하는 방법.
  18. 제16항에 있어서, 일본쇄 DNA가 상기 언급된 본쇄를 함유하는 일본쇄 파지이며, (b) 단계의 돌연변이 헤테로 듀플렉스를 폐환된 환상 헤테로 듀플렉스로 전환시킴을 특징으로 하는 방법.
  19. 제16항에 있어서, 폐환된 환상 헤테로 듀플렉스로 컴피턴트 세균 숙주를 형질 전환시킨 다음, 생성된 형질 전환체를 배양함으로써 복제를 수행함을 특징으로 하는 방법.
  20. 제16항에 있어서, 헤테로 듀플렉스의 돌연변이 본쇄의 자손을 분리한 다음, 이 자손으로부터 DNA를 분리하고, 다시 이 DNA로부터 유전자를 분리하는 추가의 단계가 포함됨을 특징으로 하는 방법.
  21. 제16,17,18,19 또는 20항에 있어서, 단백질이 인체 IFN-β이고, 시스테인 잔기가 17 위치에 존재하며, 미스매취가 세린에 대한 코돈임을 특징으로 하는 방법.
  22. 제20항에 있어서, 본쇄가 IFN-β의 안티센스 본쇄이고, 돌연변이 올리고뉴클레오티드 프라이머가 GCAATTTTCAGAGTCAG임을 특징으로 하는 방법.
  23. 제16,17,18,19 또는 20항에 있어서, 단백질이 인체 IL-2이며, 시스테인 잔기가 125 위치에 존재하고, 미스매취가 세린에 대한 코돈임을 특징으로 하는 방법.
  24. 디설파이드 결합을 할 수 있고 생물학적 활성을 나타내는데에 비필수적인 시스테인 잔기 한 개 이상을 함유하는 생물학적으로 활성이 단백질의 합성 뮤테인에 있어서, 이 시스테인 잔기중 적어도 하나가 결실되거나 다른 아미노산으로 치환됨을 특징으로 하는 합성 뮤테인.
  25. 제24항에 있어서, 시스테인 잔기가 단지 한 개만 존재함을 특징으로 하는 합성 뮤테인.
  26. 제24항에 있어서, 시스테인 잔기가 세린, 트레오닌, 글리신, 알라닌, 발린, 로이신, 이소로이신, 히스티딘, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판 또는 메티오닌으로 치환됨을 특징으로 하는 합성 뮤테인.
  27. 제24항에 있어서, 시스테인 잔기가 세린 또는 트레오닌으로 치환됨을 특징으로 하는 합성 뮤테인.
  28. 제24항에 있어서, 뮤테인이 비글리코실화됨을 특징으로 하는 합성 뮤테인.
  29. 제24항에 있어서, 단백질 IFN-β, IL-2, 림포톡신, 콜로니 자극 인자-1, 또는 IFN-β 1임을 특징으로 하는 합성 뮤테인.
  30. 제24항에 있어서, 단백질이 IFN-β이고, 시스테인 잔기는 IFN-β의 17 위치에 존재하며, 시스테인 잔기가 세린 잔기로 치환됨을 특징으로 하는 합성 뮤테인.
  31. 제30항에 있어서, 뮤테인이 비글리코실화됨을 특징으로 하는 뮤테인.
  32. 제24항에 있어서, 단백질이 IL-2이고, 시스테인 잔기는 IL-2의 125 위치에 존재하며, 시스테인 잔기가 세린 잔기로 치환됨을 특징으로 하는 합성 뮤테인.
  33. 제32항에 있어서, 뮤테인이 비글리코실화됨을 특징으로 하는 합성 뮤테인.
  34. 제24,25,26,27,28,29,30,31,32 또는 33항의 합성 뮤테인을 코드화 하는 DNA 서열을 갖는 유전자임을 특징으로 하는 구조 유전자.
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