DK168767B1 - DNA-sekvens, der koder for et modificeret human-IL-2 protein, hvori 125-cysteinresten er udskiftet med en anden aminosyrerest, ekspressionsvektor indeholdende DNA-sekvensen, værtcelle eller -organisme transformeret med ekspressionsvektoren samt fremgangsmåde til fremstilling af det modificerede protein - Google Patents

Description

i DK 168767 B1

Opfindelsen angår en DNA-sekvens, der koder for et modificeret human-IL-2 protein, hvori 125-cysteinresten er udskiftet med en anden aminosyrerest, ekspressionsvektor indeholdende DNA-sekvensen, værtcelle eller -organisme transformeret med ekspressionsvektoren 5 samt fremgangsmåde til fremstilling af det modificerede protein.

Biologisk aktive proteiner, som produceres mikrobielt ved hjælp af rekombinant-DNA-tekno!ogi (rDNA-teknologi) kan indeholde cystein-rester, som ikke er essentielle for deres aktivitet, men som frit 10 kan danne uønskede intermolekylære eller intramolekylære bindinger.

Et sådant protein er mi krobiologi sk fremstillet human-interleukin-2 (IL-2).

Biologisk aktive proteiner, som er ændret ved mutageni serings-15 metoder, og som bibeholder stamanalogernes aktivitet, men som mangler evnen til at danne intermolekylære bindinger eller uønskede intramolekylære disulfidbindinger, kaldes "muteiner", (Glossary of Genetics and Cytogenetics, 4.udg., s.381, Springer-Verlag (1976)).

20 Styrede mutageniseringsmetoder til frembringelse af muteiner er velkendte og en oversigt er givet af Lather, R.F. og Lecoq, J.P. i Genetic Engineering. Academic Press (1983) s.31-50. Oligonukleotid-styret mutagenisering omtales specifikt af Smith, M. og Gillam, S. i Genetic Engineering: Principles and Methods. Plenum Press (1981) 25 bd.3, s.1-32.

Proteiner, som ændres ved mutation, kan identificeres ud fra den tilgængelige information med hensyn til cysteinindholdet i biologisk aktive proteiner og den rolle, som disse cysteinrester spiller med 30 hensyn til aktivitet og tertiær struktur. For proteiner, for hvilke en sådan information ikke er tilgængelig i litteraturen, kan denne information bestemmes ved systematisk at ændre hver af cystein-resterne i proteinet ved de heri beskrevne fremgangsmåder og undersøge den biologiske aktivitet af de fremkomne muteiner samt deres 35 tilbøjelighed til at danne uønskede intermolekylære eller intramolekylære disulfidbindinger.

Human-IL-2 angives at have tre cysteinrester lokaliseret ved positionerne 58, 105 og 125 i proteinet. IL-2 findes i en aggregeret DK 168767 B1 2 oligomer form, når den isoleres fra bakterielle celler og skal reduceres med reducerende midler for at opnå et godt udbytte fra bakterieekstrakter. Ydermere er det oprensede, reducerede IL-2-protein ustabilt og reoxideres let ved opbevaring til en 5 inaktiv oligomer form. Tilstedeværelsen af tre cysteiner betyder ved reoxidation, at proteinet tilfældig kan danne en af tre mulige intramolekylære di sulfidbroer, hvoraf kun en af disse bindinger udgør den korrekte bro, som findes i det native molekyle. Denne dannelse af oligomerer gør således oprensning og separation af IL-2 1° meget arbejds- og tidkrævende og nødvendiggør adskillige yderligere trin ved oprensning og isolering, såsom reduktion af proteinet under oprensningen og reoxidationen af det til frembringelse af dets oprindelige konformation, hvorved muligheden for dannelse af en ikke-korrekt disulfidbinding forøges. Mikrobielt produceret IL-2 har ydermere vist sig at udvise konstant lav specifik aktivitet, hvilket måske kan skyldes dannelsen af multimerer eller af tilfældig fordelte intramolekylære di sulfidbroer.

Det ville derfor være ønskeligt at være i stand til at ændre mikro-20 bielt fremstillet IL-2 på en sådan måde, som ikke påvirker dets aktivitet på ugunstig vis, men som nedsætter eller eliminerer dets evne til at danne intermolekylære tværbindinger eller intramolekylære bindinger, som får proteinet til at antage en uønsket tertiær struktur (såsom en konformation, der nedsætter proteinets akti-25 vitet).

Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes derfor en DNA-sekvens, som er ejendommelig ved, at den består af en nukleotid-kombination, som koder for et modificeret human-IL-2 protein, hvori 30 125-cysteinresten er udskiftet med serin, threonin, glycin, alanin, valin, leucin, isoleucin, histidin, tysorin, phenylalanin, tryptophan eller methionin.

Med opfindelsen tilvejebringes også en ekspressionsvektor, som 33 angivet i krav 2-4, en værtcelle eller -organisme som angivet i krav 5 og en fremgangsmåde til fremstilling af modificeret human-IL-2 protein som angivet i krav 6.

Eksempler på andre proteiner end IL-2, som kan udsættes for ændring DK 168767 B1 3 ved mutation på samme måde, er lymfotoxin (tumornekrosefaktor), koloni stimulerende faktor 1 og IFN-al. De anvendelige proteiner vil sædvanligvis have et ulige antal cysteinrester.

5 Ved at anvende oligonukleotidstyret mutageni sering med en syntetisk oligonukleotidprimer, som er komplementær til området på IL-2-genet ved codon for cys 125, men som indeholder et enkelt eller multipelt baseskift i denne codon, kan der fremstilles et designergen, som resulterer i, at cys 125 erstattes med en anden valgt aminosyre.

10

Di sulfidstrukturen i det native IL-2 protein har hidtil ikke været kendt, men ved at anvende den foreliggende opfindelse til frembringelse af mutationer ved codon 58, 105 og 125 i IL-2-genet har det været muligt at identificere, hvilke cysteinrester, som er nødven-15 dige for aktivitet og derfor mest sandsynlig er involveret i den native disulfidbrodannelse. På denne måde kan den cysteinrest, som ikke er nødvendig for aktivitet, modificeres til at forhindre dannelse af ukorrekte intramolekylære di sulfidbroer og formindske chancen for dannelse af intermolekylære di sulfidbroer ved 20 udskiftning af den frie cysteinrest.

Størrelsen af oligonukleotidprimeren er bestemt ud fra kravet om stabil hybridisering af primeren til et område af genet, i hvilket mutationen skal induceres, samt af begrænsninger vedrørende de for 25 tiden tilgængelige metoder til syntetisering af oligonukleotider. De faktorer, der skal tages i betragtning ved udformningen af oligonukleotider til brug i oligonukleotidstyret mutagenisering (f.eks. den samlede størrelse og størrelsen af de områder, der flankerer mutationsstedet) omtales af Smith, M. og Gillam, S., se ovenfor. Den 3° samlede længde af oligonukleotidet vil almindeligvis være en sådan, at man optimerer stabil, unik hybridisering ved mutationsstedet med 5' og 3'-forlængelser fra mutationsstedet med en tilstrækkelig størrelse for at undgå at DNA-polymerasens exonukleaseaktivitet redigerer mutationen. De oligonukleotider, der anvendes ved 35 mutagenisering ifølge den foreliggende opfindelse, indeholder sædvanligvis fra ca. 12 til ca. 24 baser, fortrinsvis fra ca. 14 til ca. 20 baser og mest fortrinsvis fra ca. 15 til ca. 18 baser. De vil sædvanligvis indeholde mindst ca. 3 baser i 3'-enden af den ændrede eller manglende codon.

DK 168767 B1 4

De betingelser, der kan anvendes under hybridisering, beskrives af Smith, M. og Gillam, S., se ovenfor. Temperaturen vil sædvanligvis ligge i området mellem ca. 0°C og 70°C, fortrinsvis mellem ca. 10 og 50°C. Efter hybridisering forlænges primeren på fag-DNA'et ved 5 reaktion med DNA-polymerase I, T^-DNA polymerase, revers-transcip-tase eller en anden hensigtsmæssig DNA-polymerase. Det fremkomne dsDNA omdannes til lukket cirkulært dsDNA ved behandling med en DNA-ligase, såsom T^-DNA ligase. DNA-molekyler indeholdende enkeltstrengede områder kan ødelægges ved behandling med Sl-endonuklease.

10 01 igonukleotidstyret mutagenisering kan på denne måde anvendes til at fremstille et IL-2 mutantgen, som koder for et mutein med IL-2 aktivitet, men hvor cys 125 er ændret til serin 125 (og de andre i krav 1 angivne aminosyrerester). Den foretrukne oligonukleotid-15 primer, som anvendes ved fremstilling af dette IL-2 mutantgen, når fagen bærer den kodende streng af genet, er GATGATGCTTCTGAGAAAAGGT-AATC. Dette oligonukleotid har et CTG baseskift i den midterste base i den triplet, som parres med codon 125 i IL-2 genet.

20 Den fremkomne heteroduplex anvendes herefter til at transformere en kompetent værtorganisme eller -celle. Værtens repli kation af heteroduplexen tilvejebringer kopier af begge strenge. Efter repli kation kan mutantgenet isoleres fra kopierne af mutantstrengen, indsættes i en hensigtsmæssig ekspressionsvektor, og vektoren kan 25 anvendes til at transformere en egnet værtsorganisme eller -celle. Foretrukne vektorer er pi asmiderne pBR322, pCRl samt varianter heraf, syntetiske vektorer og lignende. En egnet værtsorganisme er E.coli. Det vil forstås, at når den valgte vært transformeres med vektoren indføres ligeledes hensigtsmæssigt promotor-opera- 30 tor-sekvenser for at muteinet kan udtrykkes. Værterne kan være prokaryotiske eller eukaryotiske (fremgangsmåder til indføring af DNA i eukaryotiske celler omtales i beskrivelsen til PCT-ansøgnin-gerne nr. US81/00239 og nr. US81/00240 publiceret 3. sept. 1981).

E.coli er den foretrukne vært. De ved fremgangsmåden ifølge 35 opfindelsen opnåede muteiner kan være glycosylerede eller ikke-glycosylerede afhængig af den glycosylering, der forekommer i det native stamprotein, samt den værtsorganisme, der anvendes til at fremstille muteinet. Om ønsket kan det ikke-glycosylerede mutein, der opnås, når E.coli eller en Bacillus er værtorganismen, eventuelt DK 168767 B1 5 glycosyleres in vitro ved kemiske eller enzymatiske modifikationer eller andre kendte modifikationstyper.

På tegningen viser: 5 fig. 1 et diagram af plasmidet pLWl, som indeholder genet for human interleukin-2 (IL-2) under kontrol af E.coli trp-promotoren, 10 fig. 2 et restriktionskort af fagklonen M13-IL-2, fig. 3 et restriktionskort af plasmidet pLW46, og

Fig. 4a og b henholdsvis 15b nukleotidsekvensen af den kodende 15 streng for klonen pLW46 og den tilsvarende aminosyre- sekvens for IL-2-muteinet betegnet IL-2serj25> °9 fig. 5 er et diagram af ekspressionsplasmidet pTrp3.

20

De efterfølgende eksempler anføres for at give en bedre forståelse af opfindelsen og til illustration af denne.

EKSEMPEL 1 25

Nukleotidsekvensen for en cDNA-klon, som koder for human IL-2, fremgangsmåder til fremstilling af IL-2-cDNA-biblioteker samt screening for IL-2 omtales af Taniguchi, T. et al, Nature (1983) bd.24. s.305 og følgende.

30 cDNA biblioteker beriget med potentiel IL-2-cDNA-kl oner fremstilledes ud fra IL-2-berigede mRNA-fraktioner opnået fra inducerede, perifere blodlymfocyter (PBL) og Jurkat-celler ved konventionelle metoder. Berigelsen af mRNA med hensyn til IL-2-information udførtes 35 ved at fraktionere mRNA og identificere den fraktion, der havde IL-2-mRNA aktivitet ved at injicere fraktioner i Xenoous laevis oocyter og analysere oocytlysaterne for IL-2 aktivitet på HT-2-celler (J.Watson, J.Exp.Med (1979) 150: 1570-1519 og S.Gillis et al.

J.Immun (1978) 120: 2027-2032).

DK 168767 B1 6 EKSEMPEL 2

Screening oa identifikation af IL-2-cDNA-kloner 5 IL-2-cDNA-biblioteker screenedes under anvendelse af koloni-hybridiseringsmetoden. Hver mikrotiterplade repliceredes på dublet-nitrocellulosefilterpapir (S & S type BA-85), og kolonierne fik lov til at vokse ved 37°C i 14-16 timer på L-agar indeholdende 50 mikrogram pr. ml ampicillin. Kolonierne lyseredes, og DNA fixeredes 10 til filteret ved sekventiel behandling i 5 minutter med 500 mM NaOH;

1,5 M NaCl, 2 gange vask i hver 5 minutter med 5 gange standardsal i ncitrat (SSC). Filtrene lufttørredes og opvarmedes ved 80°C

1 2 timer. Dupietfiltrene præhybridi seredes ved 42°C i 6-8 timer med 10 ml pr. filter af DNA-hybridiseringspuffer (50% formamid, 5 x SSC, 15 pH 7,0, 5 x Denhardt's opløsning (polyvinylpyrrolidin, plus ficoll og bovi nserumal bumi η; 1 x = 0,2% af hver), 50 mM natri umphosphat-puffer ved pH 7,0, 0,2% SDS, 20 øg/ml Poly U og 50 ug/ml denatureret laksesperm-DNA.

20 En ‘r-mærket 20-mer oligonucleotidgensonde fremstilledes baseret på IL-2-gensekvensen rapporteret af Taniguchi, T. et al. (se ovenfor). Nukleotidsekvensen af gensonden var GTGGCCTTCTTGGGCATGTA:

Prøverne hybridi seredes ved 42°C i 24-36 timer med 5 ml/filter 25 DNA-hybridiseringspuffer indeholdende den ^P-mærkede cDNA-gensonde. Filtrene vaskedes to gange i hver 30 minutter ved 50°C med 2 x SSC, 0,1 % SDS, vaskedes derefter 2 gange med 1 x SSC og 0,1% SDS ved 50°C i 90 minutter, lufttørredes og autoradiograferedes ved -70°C i 2 til 3 dage. Positive kloner identificeredes og screenedes igen med 50 gensonden. Fuldlængdekloner identificeredes og bekræftedes med restriktionsenzymkortlægning og sammenlignedes med sekvensen for IL-2-cDNA-klonen omtalt af Taniguchi, T. et al. (se ovenfor).

EKSEMPEL 3 35

Kloning af IL-2-aen i M13-vektor IL-2-genet klonedes i M13mp9 som beskrevet i eksempel 1 under anvendelse af pi asmi det pLWl (fig. 1) indeholdende IL-2-genet under DK 168767 B1 7 kontrol af E.coli trp-promotoren. En prøve af pLWl deponeredes i henhold til Budapesttraktaten i American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA d. 4. august 1983 og fik tildelt ATCC-nummeret 39.405. Restriktionskortet af en 5 klon (betegnet M13-IL2), som indeholdt det indskudte IL-2, er vist i fig. 2. Der fremstilledes enkeltstrenget fag-DNA fra klonen M13-IL2 til anvendelse som en skabelon for oligonukleotidstyret mutagenise-ring.

10 EKSEMPEL 4 01 iaonukleotidstvret mutaaeniserina

Som tidligere anført indeholder IL-2 cysteinrester ved amino-15 syrepositionerne 58, 105 og 125. Baseret på nukleotidsekvenserne for de dele af IL-2-genet, som indeholder codon for disse tre cysteinrester, udformedes og syntetiseredes tre oligonukleotidprimere for at mutere codon for disse cysteinrester til codon for serin. Disse oligonukleotider havde følgende sekvenser.

20 CTTCTAGAGACTGCAGATGTTTC (dm27) for at ændre cys 58, CATCAGCATACTCAGACATGAATG (DM28) for at ændre cys 105 og GATGATGCTCTGAGAAAAGGTAATC (DM29) for at ændre cys 125.

25 40 Picomol af hver oligonukleotid behandledes separat med kinase i

nærvær af 0,1 mM ATP, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT og 9 enheder T^-kinase i 50 μ1 ved 37°C i 1 time. Hver af de med kinase behandlede primere (10 pmol) hybridi seredes til 2,6 /tg enkel tstrenget M13-IL2-DNA i 15 /ti af en blanding indeholdende 100 30 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,9, 20 mM MgCl2 og 20 mM

Ø-mercaptoethanol ved opvarmning ved 67°C i 5 minutter og ved 42°C i 25 minutter. Blandingerne med annealeret DNA afkøledes på is, og voluminet indstilledes til en 25 μΐ reaktionsblanding indeholdende 0,5 /tM af hver dNTP, 17 mM Tris-HCl, pH 7,9, 17 mM MgCl2, 83 mM 3^ NaCl, 17 mM /i-mercaptoethanol, 5 enheder DNA-polymerase I, Klenow-fragment, 0,5 mM ATP og 2 enheder T^-DNA-ligase, blandingen inkuberedes ved 37°C i 5 timer. Reaktionerne afsluttedes ved opvarmning til 80°C, og reaktionsblandingerne anvendtes til at transformere kompetente JM103-celler, som udpladedes på agarplader og inkuberedes DK 168767 B1 8 natten over til opnåelse af fag-plaques.

EKSEMPEL 5 5 Screening og identifikation af mutageni serede faa-plagues.

Plader indeholdende mutageni serede M13-IL2-plaques såvel som to plader indeholdende ikke-mutageniserede M13-IL2-fag-plaques afkøledes til 4°C, og fag-plaques fra hver plade overførtes på cirkulære 10 ni trocellul osefil tre ved at lægge et tørt filter på agarpladen i 5 minutter for det første filter og 15 minutter for det andet filter. Filtrene anbragtes derefter på tykt filterpapir gennemvædet i 0,2 N NaOH, 1,5 M NaCl og 0,2% Triton i 5 minutter, og filtrene neutraliseredes ved at lægge dem på filterpapir gennemvædet med 0,5 15 molær Tris-HCl, pH 7,5 og 1,5 M NaCl i endnu 5 minutter. Filtrene vaskedes på lignende måde 2 gange på filtre gennemvædet i 2 x SSC, tørredes og opvarmedes derefter i en vacuumovn ved 80°C i 2 timer. Dupi etfil trene præhybridi seredes ved 42°C i 4 timer med 10 ml DNA-hybridiseringspuffer (5 x SSC, pH 7,0, 4 x Denhardts opløsning 20 (polyvinyl pyrrol i din, ficoll og bovi nserumal bumi η, 1 x = 0,02% af hver), 0,1% SDS, 50 mM natriumphosphatpuffer, pH 7,0 og 100 mg/ml 32 denatureret laksesperm-DNA pr. filter. P-mærkede gensonder fremstilledes ved kinasebehandling af oligonukleotidprimere med 5 32 mærket ATP. Filtrene hybridi seredes til 0,1 x 10 cpm/ml P-mærket 25 primer i 5 ml DNA-hybridiseringspuffer pr. filter ved 42°C i 8 timer. Filtrene vaskedes 2 gange ved 50°C i hver 30 minutter i vaskepuffer indeholdende 0,1% SDS og 2 x SSC, og to gange ved 50°C i 30 minutter hver med 0,1% SDS og 0,2 x SSC. Filtrene lufttørredes og autoradiograferedes ved -70°C i 2-3 dage.

30

Eftersom oligonukleotidprimerne DM28 og DM29 var udformet til at frembringe et nyt Ddel-restriktionssted i de mutageni serede kloner (fig.14), fordøjedes RF-DNA fra en række kloner, som hybridiserede med hver af de kinasebehandlede primere, med restriktionsenzymet 35 Ddel. En af de mutageniserede M13-IL2-plaques, som hybridiserede med primeren DM28, og som har et nyt Ddel-restriktionssted (M13-LW44), opsamledes og inoculeredes i en kultur af JM103, ssDNA fremstilledes fra kultursupernatanten, og dsRF-DNA fremstilledes fra cellepelleten. På lignende måde opsamledes en plaque, som DK 168767 B1 9 hybridiserede med primeren DM29, (M13-LW46) og ssDNA og RF-DNA fremstilledes ud fra den. Oligonukleotidprimeren DM27 var udformet til frembringelse af et nyt PstI-restriktionssted i stedet for et Ddel-spaltningssted. De plaques, som hybridiserede til denne primer, 5 blev derfor screenet for tilstedeværelsen af et nyt Pstl-spaltningssted. Der blev identificeret en sådan fag-plaque (M13-LW42) og ssDNA og RF-DNA fremstilledes ud fra den. DNA'et fra alle tre af disse kloner sekventeredes for at bekræfte at TGT-codon for cystein var blevet omdannet til en TCT-codon for serin.

10 EKSEMPEL 6

Fornyet kloning af det mutageniserede IL-2-qen for ekspression i E.-coli 15 RF-DNA fra M13-LW42, M13-LW44 og M13-LW46 blev hver fordøjet med restriktionsenzymerne Hindlll og Banll, og de indsatte fragmenter oprensedes fra en 1% agarosegel. På lignende måde fordøjedes plasmid pTrp3 (fig. 5) med Hindi11 og Banll, det store pi asmidfragment 20 indeholdende trp-promotoren oprensedes på en agarosegel og blev derefter ligeret med hver af de indsatte fragmenter isoleret fra M13-LW42, M13-LW44 og M13-LW46. De ligerede pi asmider transformeredes ind i kompetente E.coli K12-stamme MM294. Plasmid-DNA'et fra disse transformanter analyseredes ved restriktionsenzymkortlægning 25 f0r at bekræfte tilstedeværelsen af pi asmiderne pLW42, pLW44 og pLW46. Fig. 3 er et restriktionskort af pLW46. Når hver af disse individuelle kloner blev dyrket i fravær af tryptofan til inducering af trp-promotoren, og cellefrie ekstrakter analyseredes på SDS-polyacrylamidgel er, viste det sig, at alle tre kloner, pLW42, 30 pLW44 og pLW46, syntetiserede et 14,5 kd protein i lighed med det, der blev fundet i den positive kontrol pLW21, som var blevet vist at syntetisere en 14,4 kd IL-2-protein. Når disse ekstrakter blev analyseret for IL-2-aktivitet på HT-2-museceller havde kun klonerne pLW21 (positiv kontrol) og pLW46 betragtelig mængde IL-2-aktivitet 35 (tabel II nedenfor), hvilket indicerer, at cys 58 og cys 105 er nødvendig for biologisk aktivitet, og ændring af disse cysteinrester til serin (pLW42 henholdsvis pLW44) resulterer i tab af biologisk aktivitet. På den anden side må cys 125 ikke være nødvendig for biologisk aktivitet eftersom ændring af denne til ser 125 (pLW46) DK 168767 B1 10 ikke påvirker den biologiske aktivitet.

Tabel II

5 Kloner IL-2-aktivitet (m/mll pIL2-7 (negativ kontrol) 1 pLW21 (positiv kontrol) 113,000 pLW42 660 10 PLW44 1,990 pLW46 123,000

Fig. 4a viser nukleotidsekvensen for den kodende streng af klon pLW46. Sammenlignet med den kodende streng fra nativ human 15 IL-2-genet har klonen pLW46 et enkelt baseskift GTC ved nukleotid 374. Fig. 4b viser den tilsvarende aminosyresekvens for IL-2-mu-teinet, som pLW46 koder for. Dette mutein betegnes IL-2serl25* Sammenlignet med nativ IL-2 har muteinet serin i stedet for en cystein ved position 125.

20

En prøve af E.coli K12 stamme MM294 transformeret med pLW46 deponeredes i henhold til Budapesttraktaten i American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA d.

26. september 1983 og har fået tildelt ATCC nr. 39.452.

25

Muteiner af IL-2, i hvilket cysteinet ved position 125 er blevet erstattet med en anden aminosyre, såsom muteinet IL-2serj25> bevarer IL-2-aktivitet. De kan derfor anvendes på samme måde som nativ IL-2. Følgelig er sådanne IL-2-muteiner brugbare ved diagnosticering og behandling af bakterieinfektioner, virale infektioner, parasitiske infektioner, infektioner med protozoer og svampe; til påvisning af lymfokin eller immunomangelsygdom; til rekonstituering af normal immunofunktion i gamle mennesker og dyr; ved udvikling af diagnostiske analyser, såsom de analyser, hvortil anvendes enzymamplifika-35 tion, radioaktiv mærkning, radioaktiv afbildning og andre kendte metoder til måling af IL-2-niveuaer ved sygdomstilstande; til at fremme væksten af T-celler in vitro, til terapeutisk og diagnostisk formål, til blokering af receptorer for lymfokiner og til forskellige andre terapeutiske, diagnostiske eller forskningsmæssige 11 DK 168767 B1 formål. De forskellige terapeutiske og diagnostiske anvendelser af human IL-2 er blevet undersøgt og omtalt i S.A. Rosenberg, E.A.Grimm et al., A.Mazumder et al., og E.A.Grimm og S.A.Rosenberg. IL-2-muteiner kan anvendes alene eller i kombination med andre immunolo-5 gisk relevante B- eller T-celler eller andre terapeutiske midler.

Til terapeutiske eller diagnostiske formål kan de formuleres i ikke-toxiske, ikke-allergene, fysiologisk forenelige bæremedier, såsom destilleret vand, Ringers opløsning, Hanks opløsning, fysiologisk saltvand og lignende. Indgivelse af IL-2-muteiner i mennesker 1° eller dyr kan ske oralt eller intraperitonealt eller intramuskulært eller subkutant, alt efter hvad der nu måtte skønnes hensigtsmæssigt af lægen. Eksempler på relevante celler er B- eller T-celler, naturlige dræberceller og lignende, og eksempler på terapeutiske reagenser, som kan anvendes i kombination med de ifølge opfindelsen 15 fremstillede polypeptider, er forskellige interferoner, navnlig γ-interferon, B-cellevækstfaktor, IL-1 og lignende.

20 25 30 35

Claims (6)

12 DK 168767 B1

1. DNA-sekvens, kendetegnet ved, at den består af en nukleotidkombination, som koder for et modificeret human-IL-2 5 protein, hvori 125-cysteinresten er udskiftet med serin, threonin, glycin, alanin, val in, leucin, isoleucin, histidin, tyrosin, phenyl alanin, tryptophan eller methionin.

2. Ekspressionsvektor, kendetegnet ved, at 10 DNA-sekvensen ifølge krav 1 forefindes i vektoren i en position, som tillader ekspression af genet.

3. Ekspressionsvektor ifølge krav 2, kendetegnet ved, at det er plasmid pLW 46 som indeholdt i E. coli K 12 stamme MM 294,

15 ATCC nr. 39.452.

4. Ekspressionsvektor ifølge krav 2, kendetegnet ved, at det er pLW 1, ATCC nr. 39.405. 20

5. Værtcelle, kendetegnet ved, at den er E. coli transformeret med en ekspressionsvektor ifølge et af kravene 2-4.

6. Fremgangsmåde til fremstilling af et modificeret human-IL-2 protein, hvori 125-cysteinresten er udskiftet med serin, threonin, 25 glycin, al anin, val in, leucin, isoleucin, histidin, tyrosin, phenylalanin, tryptophan eller methionin, kendetegnet ved, at en værtcelle ifølge krav 5 dyrkes, og at det syntetiserede protein af interesse indvindes fra kulturen. 30 35