CN115989239A

CN115989239A - 具有双重突变的人干扰素β变体和用于改善人干扰素β变体的稳定性的方法

Info

Publication number: CN115989239A
Application number: CN202180046602.9A
Authority: CN
Inventors: 崔俊英; 金娜荣; 孙元洛; 洪性贤; 李镕辰; 李世炯
Original assignee: Abion Inc
Current assignee: Abion Inc
Priority date: 2020-04-29
Filing date: 2021-04-29
Publication date: 2023-04-18
Also published as: CA3177028A1; AU2021264372A1; EP4144748A1; KR20210133895A; JP2023524248A; US20230159605A1; WO2021221485A1; MX2022013662A; KR102593710B1; BR112022022035A2

Abstract

本发明涉及具有双重突变的人干扰素β变体和用于改善人干扰素β变体的稳定性的方法，并且更具体而言，涉及包含具有丝氨酸取代人干扰素β的第17个氨基酸半胱氨酸和苏氨酸取代人干扰素β的第27个氨基酸精氨酸的氨基酸序列的人干扰素β变体、以及用于改善人干扰素βR27T变体的稳定性的方法，该方法包括用丝氨酸取代人干扰素βR27T变体中的第17个氨基酸半胱氨酸的步骤，在所述人干扰素βR27T变体中，用苏氨酸取代人干扰素β的第27个氨基酸精氨酸。

Description

具有双重突变的人干扰素β变体和用于改善人干扰素β变体的稳定性的方法

技术领域

本申请要求于2020年4月29日提交的韩国专利申请号10-2020-0052513和10-2020-0052913的优先权，所述专利申请的全部内容是本申请的参考。

本发明涉及具有双重突变的人干扰素β变体和用于改善人干扰素β变体的稳定性的方法，并且更具体而言，涉及包括具有丝氨酸取代人干扰素β的第17个氨基酸半胱氨酸和苏氨酸取代人干扰素β的第27个氨基酸精氨酸的氨基酸序列的人干扰素β变体、以及用于改善人干扰素βR27T变体的稳定性的方法，该方法包括用丝氨酸取代人干扰素βR27T变体中的第17个氨基酸丝氨酸的步骤，在所述人干扰素βR27T变体中，用苏氨酸取代人干扰素β的第27个氨基酸精氨酸。

背景技术

干扰素(IFN)是一类细胞因子，并且具有抗病毒活性且具有抑制细胞增殖和调控天然免疫应答的功能，并且在其中，干扰素β(IFN-β)是具有五个α螺旋的球状蛋白质，其大小为22kD，并且当去除糖链后，变成18kD(Arduini等，Protein Science 8：第1867-1877页，1999)。

关于干扰素β的临床应用的研究正在积极进行中，并且特别地，干扰素β作为用于缓解、减轻或治疗多发性硬化的症状的药物备受关注。

干扰素β具有各种免疫学活性，例如抗病毒活性、细胞生长抑制或抗增殖活性、淋巴细胞细胞毒性增强活性、免疫调节活性、靶细胞的分化诱导或抑制活性、巨噬细胞的活化活性、细胞因子产生的活性增加、细胞毒性T细胞的活性效应增加，天然杀伤细胞的活性增加等，加上多发性硬化。相应地，据报道，干扰素β有效治疗癌症、自身免疫性病症、病毒感染、HIV相关疾病、丙型肝炎、类风湿性关节炎等等。

目前，存在可用于治疗的两种类型的干扰素β。首先，干扰素β-1a是一种糖基化蛋白，其由包括人干扰素β基因的中国仓鼠卵巢(CHO)产生，由166个氨基酸残基组成，并且具有22kD的大小。其次，干扰素β-1b是由大肠杆菌(E.coil)产生、由165个氨基酸残基组成的蛋白质，其中糖被缺失，作为第一个氨基酸的甲硫氨酸残基被缺失，并且用丝氨酸取代第17个半胱氨酸残基。目前已商品化的干扰素β-1a包括Rebif和Avonex，而干扰素β-1b包括Betaseron和Extavia。

另一方面，人干扰素β也是一类糖蛋白，并且由于与蛋白质相连的糖链部分在蛋白质的活性中起重要作用，因此在糖蛋白的情况下，当添加糖链时，其活性可能是增加的。即，已知蛋白质糖基化可能影响许多生物化学性质，例如稳定性、溶解度、细胞内运输活性、药代动力学和抗原性。

相应地，已报道了通过将糖链引入糖蛋白、人天然干扰素β内，来制备具有增加或改善的活性或功能的人干扰素β变体的实例(韩国专利注册号0781666)。如本文使用的，人干扰素β变体R27T是重组人干扰素β变体(下文，rhINF-β)，其通过用苏氨酸(Thr)取代在位置27处的精氨酸(Arg)用于在干扰素β1a的位置25处的另外糖基化进行设计，并且与野生型干扰素β1a(Rebif)相比，显示出稳定性增加、蛋白质聚集趋势降低和半衰期增加的效应。即，R27T是通过定点诱变的另外糖基化生成的rhINF-β的生物改良药(biobetter)。

同时，蛋白质药物的开发中的主要任务之一是提供这样的蛋白质，其提供足够的化学、物理和生物学稳定性，以在纯化过程和贮存过程中显示出改善的稳定性。然而，由于蛋白酶解途径中的各种固有敏感性、以及具有蛋白质的不同水平的大分子、二级、三级和四级结构的蛋白质结构的复杂性，仍然难以实现高稳定性。

作为第一种重组肽激素的胰岛素于1982年首次获批，并且已成功生产30余年，并且目前已相继报道了众多重组蛋白/肽药物的成功案例。然而，在生物药物的开发过程中，特别是在制剂方面，由于各种因素例如蛋白质聚集、物理化学不稳定、低半衰期、低溶解度和药代动力学性质，仍然面临着困难。

特别地，蛋白质聚集和降解是在几乎所有生物制药过程中容易出现的主要问题之一，其中治疗性蛋白质在贮存期间在溶液中是结构/热力学上不稳定的。因为治疗性蛋白质对由于在纯化、加工和贮存过程中的各种因素的结构变化很敏感，因此当蛋白质暴露于严酷条件下例如反复冷冻/融化和贮存于具有不同pH的缓冲液中时，这些问题可能加剧。另外，因为基于蛋白质的生物药物具有物理降解，例如由于解折叠、聚集和非天然折叠的不溶性颗粒形成的可能性，因此重要的是避免蛋白质聚集或物理变性并且使稳定性达到最大。

在2004年，已开发了引起干扰素的糖基化突变的干扰素β突变蛋白(韩国专利号781666)，并且已进行了将该蛋白质用作治疗剂的研究。因为干扰素β是较不稳定的，因此在纯化过程中，通常发生降解反应，例如肽键的切割、脱酰胺和甲硫氨酸氧化为硫化甲硫氨酸和二硫键交换(US2012/0177603)，但有必要考虑这些降解反应。

相应地，有必要开发一种人干扰素β变体，其显示出比天然干扰素β的药物效应更佳的功效，并且需要用于以高产率获得人干扰素β变体的方法。

具体实施方式

技术问题

本发明的另一个目的是提供编码人干扰素β变体的多核苷酸。

本发明的又一个目的是提供包含多核苷酸的在动物细胞中表达人干扰素β的表达载体。

本发明的又一个目的是提供用载体转化的动物细胞。

本发明的又一个目的是提供用于制备人干扰素β变体的方法，其包括培养动物细胞。

本发明的又一个目的是提供药物组合物，其包含作为活性成分的人干扰素β变体。

本发明的又一个目的是提供药物组合物，其由作为活性成分的人干扰素β变体组成。

本发明的又一个目的是提供药物组合物，其基本上由作为活性成分的人干扰素β变体组成。

本发明的又一个目的是提供用于改善人干扰素βR27T变体的稳定性的方法，其包括用丝氨酸取代人干扰素βR27T变体中的第17个氨基酸半胱氨酸，在所述人干扰素βR27T变体中，用苏氨酸取代人干扰素β的第27个氨基酸精氨酸。

本发明的又一个目的是提供人干扰素β变体用于制备药剂的用途，所述药剂具有天然人干扰素β对选自多发性硬化、癌症、自身免疫性病症、病毒感染、HIV相关疾病和丙型肝炎的疾病的药物效应。

本发明的又一个目的是提供用于治疗选自多发性硬化、癌症、自身免疫性病症、病毒感染、HIV相关疾病和丙型肝炎的疾病的方法，其包括将有效剂量的组合物施用于有此需要的受试者，所述组合物具有天然人干扰素β的药物效应并且包含人干扰素β变体。

技术方案

为了实现该目的，本发明提供了人干扰素β变体，其包含具有丝氨酸取代人干扰素β的第17个氨基酸半胱氨酸和苏氨酸取代第27个氨基酸精氨酸的氨基酸序列。

为了实现另一个目的，本发明提供了编码人干扰素β变体的多核苷酸。

为了实现又一个目的，本发明提供了包含多核苷酸的在动物细胞中表达人干扰素β的表达载体。

为了实现又一个目的，本发明提供了用载体转化的动物细胞。

为了实现又一个目的，本发明提供了用于制备人干扰素β变体的方法，其包括培养动物细胞。

为了实现又一个目的，本发明提供了药物组合物，其包含作为活性成分的人干扰素β变体。

进一步地，本发明提供了药物组合物，其由作为活性成分的人干扰素β变体组成。

进一步地，本发明提供了药物组合物，其基本上由作为活性成分的人干扰素β变体组成。

为了实现又一个目的，本发明提供了用于改善人干扰素βR27T变体的稳定性的方法，其包括用丝氨酸取代人干扰素βR27T变体中的第17个氨基酸半胱氨酸，在所述人干扰素βR27T变体中，用苏氨酸取代人干扰素β的第27个氨基酸精氨酸。

为了实现又一个目的，本发明提供了人干扰素β变体用于制备药剂的用途，所述药剂具有天然人干扰素β对选自多发性硬化、癌症、自身免疫性病症、病毒感染、HIV相关疾病和丙型肝炎的疾病的药物效应。

为了实现又一个目的，本发明提供了用于治疗选自多发性硬化、癌症、自身免疫性病症、病毒感染、HIV相关疾病和丙型肝炎的疾病的方法，其包括将有效剂量的组合物施用于有此需要的受试者，所述组合物具有天然人干扰素β的药物效应并且包含人干扰素β变体。

在下文中，将详细描述本发明。

在本发明中的具有双重突变的人干扰素β变体是包含具有丝氨酸取代人干扰素β的第17个氨基酸半胱氨酸和苏氨酸取代第27个氨基酸精氨酸的氨基酸序列的人干扰素β变体。

在本发明中，‘人干扰素β变体’代表这样的所有多肽，其具有衍生自人干扰素β的氨基酸序列的全部或部分，并且具有人干扰素β的活性，同时用丝氨酸取代天然人干扰素β中的第17个氨基酸半胱氨酸且用苏氨酸取代第27个氨基酸精氨酸。

本文使用的“人干扰素β的活性”定义为在人干扰素β的已知活性中，任何多肽足以被鉴定为人干扰素β的一种或多种活性。这些活性可以包括例如多发性硬化的减轻、缓解或治疗活性，抗病毒活性，细胞生长抑制活性，抗生长活性，抗增殖活性，淋巴细胞毒性增强活性，免疫调控活性，靶细胞的分化诱导或抑制活性，细胞因子生成的活性增加，细胞毒性T细胞的效应活性增加，巨噬细胞的效应活性增加，天然杀伤细胞的活性增加，癌症预防或治疗活性，自动免疫功能障碍预防或治疗活性，病毒感染预防或治疗活性，HIV相关疾病的预防或治疗活性，丙型肝炎的预防或治疗活性，类风湿性关节炎的预防或治疗活性等等。

本发明的具有双重突变的人干扰素β变体最优选为这样的多肽，其包含具有丝氨酸取代天然人干扰素β中的第17个氨基酸半胱氨酸和苏氨酸取代第27个氨基酸精氨酸的氨基酸序列，所述天然人干扰素β具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

在本发明中，具有丝氨酸取代天然人干扰素β中的第17个氨基酸半胱氨酸和苏氨酸取代第27个氨基酸精氨酸的变体可以包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，具体而言基本上由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成，更具体而言由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成，但并不限于此。

SEQ ID NO:1：

MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN

SEQ ID NO:3：

MSYNLLGFLQRSSNFQSQKLLWQLNGTLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN

另外，本发明的人干扰素β变体可以是人干扰素β变体，其具有丝氨酸取代SEQ IDNO:1的人干扰素β的第17个氨基酸半胱氨酸和苏氨酸取代第27个氨基酸精氨酸，与SEQ IDNO:1的野生型干扰素β具有至少90％的序列同源性，并且具有干扰素β的活性。

如本文使用的，术语“变体”指这样的蛋白质，其中一个或多个氨基酸在保守取代和/或修饰方面不同于所述序列，但蛋白质的功能或性质得到维持。变体通过几个氨基酸的取代、缺失或添加而不同于所鉴定的序列。此类变体一般可以通过修饰氨基酸序列或蛋白质的一个或多个氨基酸并评估修饰的蛋白质进行鉴定。即，与天然蛋白质相比，变体的能力可以是增加、不变或降低的。另外，一些变体可以包括其中一个或多个部分例如N末端前导序列或跨膜结构域已去除的变体。其它变体可以包括其中其一部分从成熟蛋白质的N和/或C末端去除的变体。术语“变体”可以与修饰、修饰的蛋白质、修饰的多肽、突变体、突变蛋白、趋异体(divergent)、变体等(以英文表达)一起使用，并且以修饰含义使用的任何术语并不限于此。为了本发明的目的，与天然野生型或未修饰的蛋白质相比，变体可以具有突变蛋白质的增加活性，但并不限于此。

本文使用的术语“保守取代”意指用具有相似结构和/或化学性质的另一种氨基酸取代一种氨基酸。变体可以具有例如一种或多种保守取代，同时仍具有一种或多种生物活性。这些氨基酸取代一般可以基于残基的极性、电荷、溶解度以及疏水性、疏水性和/或两亲性质中的相似性而发生。例如，在具有带电氨基酸侧基的氨基酸中，带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸，并且带负电的(酸性)氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸。在具有不带电氨基酸侧基的氨基酸中，非极性氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和脯氨酸，并且极性或亲水性氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。在非极性氨基酸中，芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。

另外，变体可以进一步包括对多肽的性质和二级结构具有最小作用的氨基酸的缺失或添加。例如，多肽可以缀合至在涉及共翻译或翻译后的蛋白质转移的蛋白质的N末端处的信号(或前导)序列。

在本发明的一个方面，人干扰素β变体可以包括这样的氨基酸序列，其具有对于SEQ ID NO:1的野生型人干扰素β蛋白的第27个氨基酸固定的苏氨酸以及对于第17个氨基酸固定的丝氨酸，并且具有至少80％的同源性或同一性，但并不限于此。具体而言，本发明的变体可以包括与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性或同一性的蛋白质。另外，如果变体是具有此类同源性或同一性并显示出与蛋白质对应的功效的氨基酸序列，除在SEQ ID NO:1的野生型人干扰素β蛋白的位置27和17处的氨基酸之外，显而易见的是，具有其中一些序列被缺失、修饰、取代或添加的氨基酸序列的蛋白质也包括在本公开内容的范围内。

本文使用的术语“同源性”或“同一性”意指与两个给定氨基酸序列相关的程度并且可以表示为百分比。术语‘同源性’或‘同一性’经常可以互换使用。

任何两个蛋白质序列是否具有同源性、相似性或同一性可以使用已知的计算机算法来确定，所述计算机算法例如如本领域已知的使用默认参数的“FASTA”程序。可替代地，可以使用如在EMBOSS包的Needleman程序(版本5.0.0或更高版本)中进行的Needleman-Wunsch算法，并且进行确定(包括GCG程序包)。例如，可以使用在美国国家生物技术信息中心数据库(National Center for Biotech Information Database)处的BLAST或ClustalW，来确定同源性、相似性或同一性。

另外，本发明提供了多核苷酸，其编码本发明的具有双重突变的人干扰素β变体。

如本文使用的，术语“多核苷酸”定义为包括单链或双链RNA、DNA或RNA-DNA聚合物的含义。

只要利用他或她的普通能力，基于给定的氨基酸序列，本领域技术人员可以容易地制备编码氨基酸序列的多核苷酸。

本发明还提供了动物细胞表达载体，其包含能够在动物细胞中表达本发明的人干扰素β变体的多核苷酸。

与天然人干扰素β变体相比，本发明的具有双重突变的人干扰素β变体进一步包括1或2条糖链，但考虑到这些糖链一般在动物细胞中出现，动物细胞表达载体特异性地基本包括：

(i)编码如上所述的人干扰素β变体的多核苷酸；

(ii)可操作地连接到(i)的核苷酸序列的启动子，以形成RNA分子；

(iii)编码前导序列的多核苷酸；

(iv)复制起点；和

(v)导致RNA分子的3'末端的聚腺苷酸化的3'非翻译位点。

在上文中，启动子指能够激活转录的序列，但此类序列是本领域已知的，并且类似地，作用于稳定前导序列的3'非翻译位点和用于将翻译的蛋白质转运到其中发生糖基化的内质网的mRNA也是本领域已知的。

同时，本发明的表达载体可以任选地包括报道(例如萤光素酶和β-葡糖醛酸酶)基因、抗生素(例如新霉素、羧苄青霉素、卡那霉素、大观霉素、潮霉素等)抗性基因和选择标记物基因等等，并且可以任选地包括增强子。

同时，可以用作本发明的动物细胞表达载体的实例可以包括pSV2-neo、pCAGGS、pcDL-SR296,pAc373等等，但必要时，示例性载体可以包括如上所述的启动子、前导区、3'非翻译位点、报道基因、选择标记物基因、增强子等等。

本发明提供了用表达载体转化的动物细胞和通过培养动物细胞用于产生人干扰素β变体的方法。

如本文使用的，转化指通过引入外源多核苷酸(在本发明中，意指编码具有双重突变的人干扰素β变体的多核苷酸)来修饰宿主细胞的基因型，并且意指将外源多核苷酸引入宿主细胞内，而不管用于转化的方法如何。引入宿主细胞内的外源性多核苷酸可以整合到宿主细胞的基因组内并得到维持，或者可以并不整合到宿主细胞的基因组内但得到维持，并且本发明包括这两种情况。

同时，如本文使用的，动物细胞包括可以用于生产重组蛋白质的哺乳动物细胞和昆虫细胞。可以用于本发明中的动物细胞的实例可以包括COS细胞、CHO细胞、C-127细胞、BHK细胞、大鼠Hep I细胞、大鼠Hep II细胞、TCMK细胞、人肺细胞、人肝肿瘤细胞、HepG2细胞、小鼠肝细胞、DUKX细胞、293细胞等等，并且昆虫细胞的实例可以包括蚕培养细胞。

在又一个方面，本发明涉及包含如上所述的本发明的人干扰素β变体的药物组合物。

在本发明的药物组合物中包括的人干扰素β已主要用作多发性硬化的治疗剂，但它据报道用于治疗癌症、自身免疫性病症、病毒感染、HIV相关疾病、丙型肝炎等，并且药物效应已不断得到报道。

为此，应该理解，本发明的药物组合物的药物效应不仅包括作为用于多发性硬化的治疗剂的药物效应，还包括人干扰素β的所有其它药物效应。

另外，此类药物效应应该理解为不仅包括迄今为止已知的药物效应的含义，还包括后来发现为人干扰素β的药物效应的药物效应的含义。

因为本发明的药物组合物的特征在于包括通过本发明获得的具有增加的活性或功能的人干扰素β变体，所以即使本发明的药物组合物不仅包括迄今为止已知的药物效应，还包括药物以后发现的药物效应，本发明的范围并非不合理地扩展。

尽管如此，人干扰素β变体已主要用作用于多发性硬化的治疗剂，并且已经发现了对癌症、自身免疫性病症、病毒感染、HIV相关疾病、丙型肝炎等的疗效，使得药物效应优选为这些药物效应。

同时，本发明的药物组合物可以经口或通过其它途径进行施用，所述途径包含经皮、皮下、静脉内或肌内。

可替代地，本发明的药物组合物可以以各种制剂进行制备，并且在制剂的情况下，可以使用常用的稀释剂或赋形剂如填料、增量剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂和表面活性剂进行制备。

另外，在本发明的药物组合物的日剂量中，药物组合物可以以本领域已知的量进行施用，但一般可以以0.01至5mg/kg的体重范围施用一次或分成几次。然而，因为本发明的药物组合物的实际剂量根据几种相关因素例如施用途径，患者的年龄、性别和体重以及患者的严重程度进行确定，所以不应该理解，该剂量在任何方面限制本发明的范围。

本发明还提供了用于改善人干扰素βR27T变体的稳定性的方法，其包括用丝氨酸取代人干扰素βR27T变体中的第17个氨基酸半胱氨酸，在所述人干扰素βR27T变体中，用苏氨酸取代人干扰素β的第27个氨基酸精氨酸。

在本发明的一个实施方案中，在用丝氨酸取代人干扰素βR27T变体(C17S)中的第17个氨基酸半胱氨酸且进行纯化后，通过使用RP-HPLC确认了具有和不具有C17S突变的变体的糖基化变化。结果确认了，与不具有C17S的R27T变体相比，在蛋白质纯化后，具有C17S的R27T变体的2糖基化比率得到改善。

在本发明的另一个实施方案中，在用丝氨酸取代人干扰素βR27T变体(C17S)中的第17个氨基酸半胱氨酸且进行纯化后，评估了在pH 2.0至6.0的磷酸盐缓冲液和乙酸缓冲液中的贮存稳定性。结果确认了，与不具有C17S的R27T变体相比，具有C17S的R27T变体在每种缓冲液中的蛋白质回收率得到改善。

在本发明的另一个实施方案中，在用丝氨酸取代人干扰素βR27T变体(C17S)的第17个氨基酸半胱氨酸且进行纯化后，在反复冷冻/融化的同时进行SEC-HPLC分析，以确认蛋白质单体的比率。结果确认了，在反复冷冻/融化过程后，与不具有C17S的R27T变体相比，具有C17S的R27T变体的单体比率得到改善。

在本发明中，“人干扰素βR27T变体”代表这样的所有多肽，其具有衍生自人干扰素β的氨基酸序列的全部或部分，并且具有人干扰素β的活性，同时用苏氨酸取代SEQ ID NO:1的野生型人干扰素β中的第27个氨基酸精氨酸。

在本发明中，具有苏氨酸取代人干扰素β的第27个氨基酸精氨酸的人干扰素βR27T变体可以包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，具体而言基本上由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成，更具体而言由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成，但并不限于此。

SEQ ID NO:2：

MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGTLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN

另外，人干扰素βR27T变体可以包括这样的氨基酸序列，其具有对于SEQ ID NO:1的野生型人干扰素β蛋白的第27个氨基酸固定的苏氨酸，并且具有其至少80％的同源性或同一性，但并不限于此。具体而言，本发明的变体可以包括与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性或同一性的蛋白质。另外，如果变体是具有此类同源性或同一性并显示出与蛋白质对应的功效的氨基酸序列，则除在SEQ ID NO:1的野生型人干扰素β蛋白的位置27处的氨基酸之外，显而易见的是，具有其中一些序列被缺失、修饰、取代或添加的氨基酸序列的蛋白质也包括在本公开内容的范围内。

在本发明中，用丝氨酸取代人干扰素βR27T变体的第17个氨基酸半胱氨酸的步骤可以通过本领域用于引入氨基酸的点突变的已知方法来进行，而无限制。

例如，该步骤可以通过用载体转化宿主细胞，然后在培养基中培养宿主细胞的方法来进行，所述载体包括编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有苏氨酸取代SEQ ID NO:1的野生型人干扰素β蛋白的第27个氨基酸精氨酸和丝氨酸取代第17个氨基酸半胱氨酸。

关于与其有关的详细描述，可以照原样应用用于产生包含R27T和C17S双重突变的人干扰素β变体的方法的内容。

在本发明中，编码人干扰素β变体的多核苷酸可以包括编码蛋白质的任何多核苷酸序列，所述蛋白质具有苏氨酸取代SEQ ID NO:1的野生型人干扰素β的第27个氨基酸精氨酸和丝氨酸取代第17个氨基酸半胱氨酸，而无限制。具体而言，在本发明中，由于密码子简并或考虑到生物中表达蛋白质的优选密码子，多核苷酸可以在不改变蛋白质的氨基酸序列的范围内在编码区中进行各种修饰。

由培养物产生的人干扰素β变体可以释放到培养基内，或者可以不释放到培养基内而是保留在细胞中。

在本发明的方法中，可以进一步包括从培养的细胞或培养基中回收具有丝氨酸取代第17个氨基酸半胱氨酸的人干扰素βR27T变体的步骤。

用于回收在培养步骤中产生的人干扰素β变体的方法可以是根据培养方法，使用本领域已知的合适方法从培养基中收集靶蛋白。例如，可以使用离心、过滤、阴离子交换层析、结晶、HPLC等等，并且通过使用本领域已知的适当方法，从培养基或细胞中回收所需变体是可能的。

另外，回收步骤可以包括纯化过程，并且可以使用本领域已知的合适方法，例如使用膜过滤等等来进行。

在本发明的一个方面，稳定性可以选自纯化稳定性、贮存稳定性和冷冻/融化稳定性。

纯化稳定性意指在纯化从宿主细胞或细胞培养基中回收的蛋白质的过程中可能发生的蛋白质变性速率降低，并且所述纯化可以包括但不限于本领域用于纯化蛋白质的常规方法。例如，纯化包括盐析(例如，硫酸铵沉淀和磷酸钠沉淀)、溶剂沉淀(使用丙酮、乙醇等的蛋白质级分沉淀)、透析、凝胶过滤、离子交换和柱层析例如反相柱层析，并且可以优选柱层析。

在本发明的一个方面，纯化稳定性可以意指蛋白质的糖基化水平的变化在上述蛋白质纯化过程之前和之后降低，并且具体而言，可以意指2糖基化蛋白质的纯化率在人干扰素βR27T变体中得到改善。

在本发明的另一个方面，纯化稳定性的特征可以在于蛋白质的聚集和降解在蛋白质的浓缩和缓冲液更换过程中减少。一般而言，蛋白质或多肽可能在纯化过程期间/或之后进行的浓缩和缓冲液更换过程中聚集或降解，但当用丝氨酸取代人干扰素βR27T变体的第17个氨基酸半胱氨酸时，可以减少在浓缩和缓冲液更换过程中的蛋白质变性。

蛋白质可以使用本领域已知的方法进行浓缩。可以用于蛋白质浓缩的非限制性的示例性方法包括超滤、切向流过滤、使用膜浓缩器(例如，纤维素膜浓缩器)的离心浓缩、针对吸水材料(例如，吸水聚合物)的透析、盐析(例如，使用硫酸铵)和层析(例如，尺寸排阻层析)。

用于蛋白质浓缩的超滤是使用水压使得分子和溶剂通过由孔制成的膜的分离方法，所述孔称为粒度并且也称为值的截断大小。因为具有较高分子量的分子并不通过膜，仅分子量小于膜的截断值的分子可以通过膜并形成所谓的保存液。相应地，当溶剂流过膜时，保存液中存在的分子被浓缩。超滤可以用于蛋白质浓缩或缓冲液更换，或者可以用于将靶蛋白配制到所需溶液或所需缓冲液内。

在一个具体的实施方案中，包含靶蛋白的溶液或组合物的浓缩可以通过切向流过滤(TFF)来进行。该方法可特别用于在大规模上的浓缩，即，用于浓缩以1升至数百升体积的溶液。因此，该方法可特别用于在工业规模上生产靶蛋白的浓缩溶液。

TFF技术基于特定装置的使用，所述装置允许过滤的溶液流过半透膜，仅小于膜孔的分子才能通过所述半透膜，形成滤液，并且留下待收集的较大材料(保留量)。两个不同的压力由TFF方法应用；一个压力是将溶液进料到系统内，以使溶液在系统内循环(入口压力)，并且另一个压力跨膜施加，导致小分子和溶剂穿过膜(膜压力)。入口压力通常可以在1至3巴例如1.5至2巴的范围内。膜压力通常可以大于1巴。

当TFF用于浓缩组合物时，靶蛋白的浓缩组合物可以收集到缓冲液中。可用于TFF的膜通常可以由再生纤维素或聚醚砜(PES)制成。膜的孔径通常可以具有小于10,000Mw，例如在10至10,000Mw的范围内的截留分子量。

在另一个实施方案中，包含靶多肽的组合物的浓缩可以通过使用离心装置来进行。在这种情况下，靶蛋白通过对膜施加离心力通过膜进行过滤。此类膜经常通过截留分子量(Mw)进行表征，所述截留分子量即可以通过膜的化合物的最大分子尺寸，并且具有比其更大的分子尺寸的化合物可能无法通过膜。

膜可以特别地由聚醚砜(PES)或再生纤维素制成。此类合适的商业过滤装置的实例可以是Centricon Plus-80或Centricon Plus-15，但并不限于此。

浓缩一般可以以2000至4500g，例如2500至4000g、或2750至3500g、或3000至3500g，例如3000g、或3100g、或3200g、或3300g、或3400g、或3500g进行。

包含浓缩靶蛋白的组合物的缓冲液更换可以通过以下进行：a)将浓缩的包含靶蛋白的组合物在缓冲液或制剂中稀释例如5至15倍，并且b)将稀释的组合物再次浓缩并进行该步骤，然后配置组合物中的缓冲剂或制剂的添加，使得在这些步骤之前组合物中的缓冲剂或制剂的添加量为例如5v/v％或更少、或者1v/v％或更少。

在本发明中，贮存稳定性意指在将纯化的人干扰素βR27T变体贮存于缓冲液中或改变缓冲液组成的过程中可能发生的蛋白质变性速率降低。

在本发明中，缓冲液可以具有pH 2.0至6.0，优选pH 2.0至5.0，且最优选pH 2.0至4.0，但并不限于此。

在本发明中，缓冲剂可以选自乙酸、磷酸、碳酸铵、磷酸铵、硼酸、柠檬酸、乳酸、柠檬酸钾、偏磷酸钾、磷酸二氢钾、乙酸钠、柠檬酸钠、乳酸钠溶液、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、碳酸氢盐、三(三(羟甲基)氨基甲烷)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸)(HEPES)、2-(2-氨基-2-氧乙基)氨基乙磺酸(ACES)、N-(2-乙酰氨基)2-亚氨基二乙酸(ADA)、3-(1,1-二甲基)-1,2-羟乙基氨基-2-丙磺酸(AMPSO)、N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、N,N-双(2-羟乙基甘氨酸(Bicine)、双-三(双(2-羟乙基)亚氨基-三(羟甲基)甲烷、3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)、2-(N-环己基氨基)乙磺酸(CHES)、3-N,N-双(2-羟乙基氨基-2-羟基-丙磺酸(DIPSO)、N-(2-羟乙基哌嗪)-N'-(3-丙磺酸)(HEPPS)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-羟基丙磺酸(HEPPSO)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、三乙醇胺、咪唑、甘氨酸、乙醇胺、磷酸盐、3-(N-吗啉代)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸(PIPES)、哌嗪-N,N'-双(2-羟基丙磺酸(POPSO)、N-三羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、3-N-三(羟甲基)甲基氨基-2-氢羟基丙磺酸(TAPSO)、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇和2-氨基-2-甲基-1-丙醇，但并不限于此。

在本发明中，冷冻/融化稳定性意指当使缓冲液中贮存的人干扰素βR27T变体冷冻且融化的循环重复时，蛋白质变性的可能性降低。

在本发明的一个方面，冷冻/融化稳定性可以表征为在-100℃至-10℃下冷冻后的融化稳定性，优选在-90℃至-30℃下冷冻后的融化稳定性，并且最优选在-80℃至-50℃下冷冻后的融化稳定性。

在本发明的另一个方面，冻融稳定性可以表征为在乙酸盐缓冲液中的冷冻/融化稳定性，优选在pH 3.0至5.0的乙酸盐缓冲液中的冷冻/融化稳定性。

在本发明的另一个方面，冷冻/融化稳定性可以表征为在三个或更多个冷冻/融化循环后减少的蛋白质聚集和降解，优选在四个或更多个冷冻/融化循环后减少的蛋白质聚集和降解，并且更优选在四个或更多个冷冻/融化循环后减少的蛋白质聚集和降解。

人干扰素β的生物活性可以通过与1型干扰素受体的相互作用而改变。在本发明中，为了改善人干扰素βR27T变体的稳定性，突变诱导的第17个氨基酸定位于与1型干扰素受体IFNAR2的结合表面上，并且特别地，第15至23个位点是主要的受体结合位点，使得当氨基酸序列中的任何一个或多个突变时，生物活性也可能是改变的。特别地，因为游离的半胱氨酸残基具有比二硫键合的半胱氨酸更强的疏水性，所以活性的变化可能通过取代第17个氨基酸半胱氨酸引起。如预计的，由于对人干扰素βR27T变体引入了另外的C17S突变，R27T变体的疏水性变化降低，但不存在对蛋白活性的作用，并且纯化稳定性、贮存稳定性、冷冻/融化稳定性得到改善。另外，C17S突变的引入可以通过经由丝氨酸残基在蛋白质中诱导氢键合来改善稳定性。

本发明提供了人干扰素β变体用于制备药剂的用途，所述药剂具有天然人干扰素β对选自多发性硬化、癌症、自身免疫性病症、病毒感染、HIV相关疾病和丙型肝炎的疾病的药物效应。

本发明提供了用于治疗选自多发性硬化、癌症、自身免疫性病症、病毒感染、HIV相关疾病和丙型肝炎的疾病的方法，其包括将有效剂量的组合物施用于有此需要的受试者，所述组合物具有天然人干扰素β的药物效应并且包含人干扰素β变体。

本发明的术语‘有效剂量’意指这样的量，当施用于受试者时，所述量显示出改善、治疗、预防、检测且诊断选自多发性硬化、癌症、自身免疫性病症、病毒感染、HIV相关疾病和丙型肝炎的疾病，或者抑制或缓解疾病的效应。‘受试者’可以是动物，优选哺乳动物，特别是动物包含人，并且也可以是衍生自动物的细胞、组织、器官等等。受试者可以是需要该效应的患者。

本发明的术语‘治疗’综合地指改善选自多发性硬化、癌症、自身免疫性病症、病毒感染、HIV相关疾病和丙型肝炎的疾病或疾病的症状。治疗可以包括治疗或基本上预防疾病，或改善其状况，并且包括缓解、治疗或预防衍生自癌症的症状或大部分症状，但并不限于此。

如本文使用的，术语‘包含’以与‘包括’或‘“特征在于’相同的含义使用，并不排除在根据本发明的组合物或方法中并未具体提到的另外成分或方法步骤。除非另有说明，否则术语‘由……组成’意指排除另外的元素、步骤或成分等。术语‘基本上由……组成’意欲包括在组合物或方法的范围内，除所述材料或步骤之外，基本上不影响其基本性质的材料或步骤。

有利效应

因此，由本发明提供的具有双重突变的人干扰素β变体在具有极佳的干扰素β活性的同时，极大地改善了纯化过程的效率，以便用于使用其的治疗剂生产中。

另外，根据用于改善本发明的人干扰素βR27T变体的稳定性的方法，通过改善在纯化过程、贮存过程和冷冻/融化过程中的蛋白质稳定性，同时维持具有苏氨酸取代人干扰素β的第27个氨基酸精氨酸的人干扰素βR27T变体的活性，一致地确保在制备和分配过程中的蛋白质质量是可能的。

序列表

<110> 瑷备恩有限公司

<120> 具有双重突变的人干扰素β变体和用于改善人干扰素β变体的稳定性的方法

<130> OP22-0070/PCT/CN

<150> PCT/KR2021/005487

<151> 2021-04-29

<150> KR 10-2020-0052513

<151> 2020-04-29

<150> KR 10-2020-0052913

<151> 2020-04-29

<160> 5

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 166

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人干扰素β蛋白

<400> 1

Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln

1 5 10 15

Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu

20 25 30

Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln

35 40 45

Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln

50 55 60

Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn

65 70 75 80

Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn

85 90 95

His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr

100 105 110

Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg

115 120 125

Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr

130 135 140

Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu

145 150 155 160

Thr Gly Tyr Leu Arg Asn

165

<210> 2

<211> 166

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人干扰素βR27T突变蛋白(ABN101(NT))

<400> 2

Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln

1 5 10 15

Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Thr Leu Glu Tyr Cys Leu

20 25 30

Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln

35 40 45

Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln

50 55 60

Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn

65 70 75 80

Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn

85 90 95

His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr

100 105 110

Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg

115 120 125

Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr

130 135 140

Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu

145 150 155 160

Thr Gly Tyr Leu Arg Asn

165

<210> 3

<211> 166

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人干扰素βR27T、C17S双重突变蛋白(ABN101(CS))

<400> 3

Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln

1 5 10 15

Ser Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Thr Leu Glu Tyr Cys Leu

20 25 30

Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln

35 40 45

Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln

50 55 60

Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn

65 70 75 80

Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn

85 90 95

His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr

100 105 110

Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg

115 120 125

Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr

130 135 140

Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu

145 150 155 160

Thr Gly Tyr Leu Arg Asn

165

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Xba1正向引物

<400> 4

ggtctagagc caccatgacc a 21

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Pac1反向引物

<400> 5

cacttaggga ttaattaatc agttcctcag gtag 34

附图说明

图1说明了在蛋白质表达DNA生产实验中的PCR条件。

图2说明了在蛋白质表达DNA生产实验中的限制性酶处理和克隆。

图3说明了在蛋白质表达DNA生产实验中使用T4 DNA连接酶(NEB)的克隆过程。

图4说明了在蛋白质表达DNA生产实验中的菌落PCR条件。

图5A和5B说明了在ABN 101(NT)和ABN 101(CS)(ABN 101(NT)：R27T突变体干扰素β，ABN 101(CS)：C17S、R27T双重突变干扰素β)转导后，细胞存活率的观察结果。

图6A和6B说明了ABN 101(NT)和ABN 101(CS)的50ml规模补料分批结果。

图7说明了ABN 101(NT)和ABN 101(CS)的1L规模补料分批结果。

图8说明了在干扰素β变体稳定性确认实验中的浓缩和缓冲液更换。

图9A和9B说明了干扰素变体RP-HPLC结果。

图10A至10D说明了在干扰素变体缓冲液更换期间单体含量的变化。

图11A至11F说明了在20mM Na-Pi缓冲液中的干扰素变体的F/T稳定性比较的确认。

图12A至12C说明了在20mM Na-OAc缓冲液中的干扰素变体的F/T稳定性比较的确认。

关于本发明的模式

在下文中，本发明将进行详细描述。

然而，下述实施例仅是本发明的说明，并且本发明的内容并不限于下述实施例。

进行下述实验以制备ABN 101(NT)，R27T突变人干扰素β-1a和ABN 101(CS)，R27T和C17S双重突变形式。

实验方法

1.蛋白质表达DNA的制备

为了在pD2535nt-HDP载体的人启动子之后克隆ABN 101(NT)和ABN 101(CS)，设计了添加有XbaI和PacI酶限制性位点的引物，并且序列如下。

正向：5’-ggtctagagccaccAtgacca-3’(SEQ ID NO.4)

XbaI

反向：5’-cacttagggattaattaatcagttcctcaggtag-3’(SEQ ID NO.5)

PacI

因为两个插入片段通过仅改变第119个DNA序列将半胱氨酸变为丝氨酸，所以用于克隆的引物是通用的。两个插入片段通过AccuPower PCR PreMix(Bioneer)进行扩增，并且PCR条件显示于下图1中。

通过0.8％琼脂糖凝胶确认经由PCR获得的PCR产物的大小，并且使用MEGAquick-spinTMPlus Total Fragment DNA Purification Kit(Intron)进行凝胶提取。如图2中所示，已纯化的PCR产物和pD2535nt-HDP载体用限制性酶进行处理，以进行克隆。限制性酶及其缓冲液都与ThermoFisher产品一起使用。

在限制性酶处理后，尝试通过使用MEGAquick-spinTMPlus Total Fragment DNAPurification试剂盒(Intron)仅获得纯DNA片段来增加克隆效率，并且在纯化后，如图3中所示的，使用T4 DNA连接酶(NEB)，以进行克隆。

在连接后，使用DH5a化学感受态大肠杆菌(Enzynomics)产品进行转化。首先，使DH5a细胞在冰中缓慢融化，然后将20μl的反应产物完全加入，并且在冰上放置30分钟。然后，热休克在42℃下应用30秒，然后在冰上稳定2分钟。添加400μl SOC培养基(由enzymenomics提供)，并且在37℃下振荡温育1小时。在愈合(healing)后，以3000rpm离心3分钟的细胞在含有50μg卡那霉素的LB培养基中进行涂布，然后在37℃培养箱中温育过夜。分离在平板上出现的菌落并且进行菌落PCR以确认克隆。使用10p尖端尽可能多地刮下与其它菌落不重叠的单个菌落，然后将其埋入AccuPower PCR PreMix(Bioneer)管中。PCR用通过Horizon提供的pD2535nt-HDP载体的菌落PCR引物进行，并且条件如下图4中所示。

通过0.8％琼脂糖凝胶确认PCR产物的大小，以确认克隆的完成，并且在克隆的pD2535nt-HDP::ABN 101(NT)和pD2535nt-HDP::ABN 101(CS)中，用于CHO-K1细胞转染的DNA prep通过nucleobond Xtra Maxi Plus(MACHEREY-NAGEL)来进行。

2.转导

具有表达质粒的大肠杆菌在含有100μg/mL卡那霉素的LB培养基中进行温育且收获，并且使用QIAGEN Plasmid Midi prep试剂盒分离DNA。将30μl的10x cutsmart缓冲液和2.5μl的NrU1-HF限制性酶加入50μg分离的DNA中，以制备300μl的最终体积。然后，使分离的DNA在37℃下温育2小时，以使其线性化。在2小时后，加入30μl 1/10体积的3M、pH 5.5乙酸钠溶液和750μl冰冷的乙醇，并且在-80℃下温育过夜。第二天，将乙醇沉淀的DNA离心，并且用70％乙醇洗涤，以获得高纯度DNA，并且使用Nanodrop测量浓度。在转导的第一天，使用添加有以4mM浓度的L-谷氨酰胺的CDFortiCHO培养基，将CHO-K1细胞在E125摇瓶中接种至3x10⁵/ml，然后在37℃、5％CO₂和125rpm条件下温育24小时。在第二天时，测量在第一天时接种的细胞数目，并且将细胞接种至5x10⁵/ml，并且在37℃、5％CO₂和125rpm条件下温育24小时。在第三天时，测量接种的细胞数目，以确认数目是否已达到1x10⁶/ml，并且当达到时，将细胞最后接种至1x10⁶/ml，以准备转导。将37.5μg线性化的DNA和37.5μl Freestyle MAX试剂加入600μl OptiPRO SFM培养基中，并且在室温下反应5分钟。其后，将含有DNA的混合物转移至含有Freestyle MAX试剂的混合物中并混合，然后在室温下反应25分钟。在反应后，将DNA-脂质混合物小心地加入先前接种的CHO-K1细胞中。使细胞在37℃、5％CO₂和125rpm条件下温育48小时，以进行转导。在转导48小时后，起始甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX)抗性细胞的选择。当细胞在添加有25或50μM MSX的选择性培养基中温育约25天时，将完全转染的细胞培养且每2至3天监测一次。当每2至3天监测一次时，当存活率达到70％或更多且活细胞的数目达到0.5至1.2x10⁶/ml时，这些细胞作为池进行选择，并且悬浮培养物在选择性培养基上在37℃、5％CO₂和125rpm条件下传代培养3次或更多次，以使细胞稳定。

3.补料分批

使用通过转导制备的以池状态的细胞进行补料分批。使用不含MSX的CDFortiCHO培养基，将50ml细胞在E250摇瓶中接种至3x10⁵/ml，并且在37℃、5％CO₂和125rpm条件下温育约12天。此时，使用cedex bio分析细胞培养基的葡萄糖代谢物，并且测量细胞的存活率和活细胞的数目。在第3、5和7天时，添加5％(V/V)CD Efficient Feed C+溶液，并且在第4和6天时，添加45％葡萄糖溶液。在补料分批完成后，将培养基离心，并且仅获取上清液，并且在冷藏或冷冻条件下贮存。

4.干扰素β-1a生物活性的确认(ELISA)

使用TORAY Co.，Ltd的HuIFN-βELISA试剂盒，分析用制备的表达细胞系显示出通过人干扰素β-1a表达的蛋白质有多少生物活性。通过补料分批保证的培养基最初使用试剂盒中的稀释剂稀释10,000倍，并且连续稀释2倍，以制备1,280,000倍稀释的样品。根据方案，使用稀释剂制备从200IU/ml到3.125IU/ml的标准材料，用于测量试剂盒中的生物活性。使用试剂盒中的洗涤缓冲液引发且制备ELISA板。在引发后，将100μl/孔的制备样品和标准材料加入ELISA板中，并且将50μl/孔的HRP缀合的抗体加入每个孔中。使板在27℃下温育2小时并进行反应。在反应完成后，将板洗涤，然后加入以100μl/孔的显色试剂，并且在27℃下温育30分钟，以诱导显色反应。其后，为了完成显色反应，以100μl/孔加入终止溶液，并且使用分光光度计装置，在测量450nm/参考620nm的波长下进行板检测。基于本文获得的吸光度，使用四参数法绘制标准曲线，并且换算出样品的生物活性。通过将经由标准曲线换算得到的样品的活性乘以稀释率，再次检查原始样品的生物活性。

5.干扰素β-1a表达(浓度)的确认(ELISA)

使用TORAY Co.，Ltd的HuIFN-βELISA试剂盒，分析通过由制备的表达细胞系表达的人干扰素β-1a表达多少蛋白质。以与生物活性确认方法相同的方式，通过补料分批保证的培养基最初使用试剂盒中的稀释剂稀释10,000倍，并且连续稀释2倍，以制备1,280,000倍稀释的样品。现有的参考标准材料通过两倍连续稀释以2.5ng/ml至0.039ng/ml的浓度进行制备。后续ELISA测试过程与生物活性确认ELISA测试方法相同。基于所得到的吸光度，使用四参数法绘制标准曲线，并且换算出样品的干扰素β-1a表达水平。通过将经由标准曲线换算得到的表达水平乘以稀释率，再次确认原始样品的浓度。

6.干扰素β变体的纯化

使用细胞工厂(cell factory)(Nunc Co.，Ltd.，目录号170069)温育上文实施例中制备的细胞系。每个表达细胞系以5X10⁴个细胞/ml传代培养到具有含有10％FBS的α-MEM培养基的细胞工厂内，并且在5％CO₂和37℃下温育72小时，以确认细胞生长。在用PBS洗涤3次后，尽可能地去除血清组分，并且将培养基替换为无血清培养基(Sigma C8730)。在替换为无血清培养基后，每24小时收获培养基，并且加入新的无血清培养基。培养基总共收获4次并进行纯化。在将200ml蓝色琼脂糖凝胶树脂(Amersham-Pharmacia)填充到XK50/20柱(Amersham-Pharmacia)中之后，使10C.V.(柱体积)的缓冲液A(20mM磷酸钠、1M NaCl，pH7.4)流动，以达到平衡状态。灭菌且过滤的培养液以20ml/分钟的流速流过处于平衡状态的柱，并且通过连接波长为280nm的UV检测器进行监测。使缓冲液B(20mM磷酸钠、1M NaCl、30％乙二醇，pH 7.4)流过柱，以洗涤未吸附的组分，并且用缓冲液C(20mM磷酸钠、1M NaCl、60％乙二醇，pH 7.4)洗脱附着至树脂的蛋白质。洗脱物用磷酸盐缓冲盐水(PBS)进行透析，用浓缩器(Centricon，截断10,000)进行浓缩，并且用磷酸盐缓冲盐水(PBS)进行透析。

7.干扰素βR27T变体和干扰素β双重变体(R27T和C17S)的2糖基化纯化效率比较

在使用蓝色琼脂糖树脂纯化的干扰素β变体ABN 101(NT)和干扰素β双重变体ABN101(CS)中，使用反相高效液相层析(RP-HPLC)测量2糖基化干扰素β变体的含量。

在将每种干扰素变体稀释至0.5mg/mL后，以初始流动相比率混合乙腈(ACN)，然后进行分析。RP-HPLC分析通过YMC-C4柱进行，并且其中使用的溶剂如下。在将0.1％三氟乙酸(TFA)与三重蒸馏水混合，然后在0.2μm PVDF过滤器后脱气1小时后，使用流动相A。在将0.1％TFA与ACN混合，然后在0.2μm PVDF过滤器后脱气约1小时后，使用流动相B。

分析条件在下表中进行指示。

[表1]

参数	条件
		柱	TMC Pack C4，4x250mm，5μm
柱温	25℃
		流速	1.0mL/分钟
自动进样器温度	4℃
		波长	214nm或280nm
注入体积	50μl

[表2]

时间(分钟)	洗脱剂A(％)	洗脱剂B(％)
			0.0	70.0	30.0
1.0	70.0	30.0
			18.0	45.0	55.0
18.1	0.0	100.0
			22.0	0.0	100.0
22.1	70.0	30.0
			30.3	70.0	30.0

8.根据缓冲液组成变化确认干扰素β变体稳定性

在使用蓝色琼脂糖树脂纯化的干扰素β变体ABN 101(NT)和干扰素β双重变体ABN101(CS)各自中，每种缓冲液使用centricon进行替换。为了确认由于在干扰素药物的缓冲液替换过程中发生的聚集的质量劣化程度，获得从蓝色琼脂糖树脂中洗脱的每种蛋白质，然后使用centricon中的20mM磷酸钠(pH 2.9)缓冲液，以约7倍的体积比进行浓缩和缓冲液更换。在用centricon完成缓冲液更换后，在0.2μm PES注射器式过滤器后，用UV分光光度计在280nm波长下测量蛋白质浓度，以确认回收率。

另外，为了确认关于其它制剂缓冲液的贮存稳定性，使用centricon以相同的体积比水平，分别将已用20mM磷酸盐(pH 2.9)进行缓冲液更换的蛋白质再次用20mM乙酸钠(pH3.8)进行缓冲液更换。该过程在图8中进行说明。

9.根据缓冲液组成变化确认冷冻/融化贮存稳定性

为了确认冷冻/融化稳定性，对于由每种缓冲液构成的干扰素药物，在-70℃下冷冻12小时或更久和在25℃下融化4小时的冷冻/融化循环进行3或5次，然后进行尺寸排阻高效液相层析(SEC-HPLC)分析。干扰素β变体的贮存稳定性通过确认经由高分子量(HMW)分析的聚集与经由低分子量(LMW)分析的降解的比率进行测量，以分析蛋白质的单体变化率。对于SEC-HPLC，使用Tosoh Co.，Ltd.的尺寸排阻柱(TSKG2000)，并且所使用的溶剂如下。通过混合三重蒸馏水并且在0.2μm PVDF过滤器后脱气1小时，来使用流动相A，并且通过将150mM氯化钠和100mM磷酸氢二钠二水合物与三重蒸馏水混合，然后用磷酸滴定至pH 7.0，并且在0.2μm PVDF过滤器后脱气，来使用流动相B。

分析条件在下表中进行指示。

[表3]

[表4]

时间(分钟)	洗脱剂A(％)	洗脱剂B(％)
			0.0	0.0	100.0
40.0	0.0	100.0

结果和解释

1.在ABN 101(NT)和ABN 101(CS)的基因转导后，根据MSX浓度的池开发结果

在CHO-K1细胞用克隆到pD2535nt-HDP载体内的DNA转导后，在48小时后确认细胞的数目和存活率，并且基于细胞的数目和存活率，用两种浓度的MSX的抗性细胞选择进行了25天。结果，ABN 101(NT)比ABN 101(CS)更早获得抗性细胞，并且在50uM ABN 101(CS)的情况下，显示了3x10⁵/ml的最终活细胞数目和48％的存活率，使得确认了抗性细胞最慢获得。尽管存活率很低，但根据干扰素β-1a的表达确定了生长和存活率受到影响。其结果在图5A和5B中进行说明。

2.在ABN 101(NT)和ABN 101(CS)池状态下的补料分批结果

使用以池状态的细胞进行50ml小规模补料分批的结果如下。在ABN 101(NT)池和ABN 101(CS)池中，确认了存活率在MSX浓度为50μM的池中维持得比25μM更久，并且确认了活细胞的数目在MSX浓度为50μM的池中维持得比25μM更少。然而，尽管活细胞的数目在MSX浓度为50μM的池中维持得比25μM更少，但在补料分批的最后一天时，培养基中的干扰素β-1a的生物活性更高，并且确认了ABN 101(CS)池的生物活性是ABN 101(NT)池的至少2倍。结果在图6A和6B中进行说明。

3.ABN 101(NT)和ABN 101(CS)池的1L规模补料分批结果

基于上文的小规模补料分批结果，使用MSX浓度为50μM的池进行1L规模补料分批。结果，在培养的第4天时的生物活性对于ABN 101(NT)为0.69MIU/ml，而对于ABN 101(CS)为5.99MI/ml，使得确认了ABN 101(CS)的生物活性是约8.6倍。当比较培养的第12天的生物活性时，确认了ABN 101(CS)的生物活性是约4.5倍。结果在图7中进行说明。

4.干扰素β变体的纯化结果

作为干扰素β变体的纯化结果，纯化效率高于常规人干扰素β。结果确认了，包含具有丝氨酸取代第17个氨基酸半胱氨酸和苏氨酸取代第27个氨基酸精氨酸的氨基酸序列的人干扰素β变体具有更高的纯化效率。

5.干扰素βR27T变体和干扰素β双重变体(R27T和C17S)的2糖基化纯化率结果

使用蓝色琼脂糖树脂纯化的干扰素β变体分别用2糖基化：1糖基化的含量进行分析。结果，如下表5以及图9A和9B中所示，确认了ABN 101(CS)双重变体的2糖基化含量比ABN101(NT)高约10％。当通过ELISA比较每种材料的生物活性时，不存在显著差异，但确认了当干扰素β变体在相同规模上进行表达且纯化时，2糖基化蛋白的纯化效率很高。

[表5]

6.根据缓冲液组成变化的干扰素β变体稳定性结果

为了确认干扰素β变体对于每种缓冲液组成的稳定性，通过用centricon更换每种缓冲液来进行蛋白质回收率和SEC-HPLC分析。当纯化每种蛋白质，然后将缓冲液更换为20mM磷酸钠(pH 2.9)时，确认了其回收率在ABN 101(CS)中很高，如下表6中所示。

[表6]

另外，通过使用centricon以相同方式将缓冲液替换为20mM乙酸钠(pH 3.8)，以将用相应缓冲液更换的每种蛋白质再次替换为基于不同制剂的缓冲液，确认了回收率。结果确认了，当用基于乙酸盐的缓冲液进行更换时，ABN 101(CS)的回收率也高于ABN 101(NT)，如表7中所示。这被解释为通过经由双重变体增加的稳定性，来自物理因素例如centricon的蛋白质结构稳定性。

[表7]

关于每种缓冲液组成变化的蛋白质回收率和单体分析结果显示于下表8以及图10A至10D中。

[表8]

7.根据缓冲液组成变化的冷冻/融化稳定性结果

为了通过缓冲液组成确认干扰素β变体的冷冻/融化稳定性，以取代缓冲液形式的干扰素变体分别反复冷冻-融化3次或5次，并且通过SEC-HPLC分析确认单体变化率。结果，当干扰素变体贮存于基于20mM磷酸钠(pH 2.9)的缓冲液中并且经受反复冷冻-融化时，两种干扰素β变体之间的差异并不显著(参见表9、表10以及图11A至11F)。

[表9]

ABN 101(NT)	HMW(％)	单体(％)	LMW(％)
				F/T 1cy	5	76	19
F/T 3cy	6	76	18
				F/T 5cy	5	77	18

[表10]

ABN 101(CS)	HMW(％)	单体(％)	LMW(％)
				F/T 1cy	8	89	3
F/T 3cy	11	86	3
				F/T 5cy	13	84	3

然而，作为通过将缓冲液更换为20mM乙酸钠(pH 3.8)并进行冷冻-融化测试分析的结果，ABN 101(CS)维持了单体含量，但ABN 101(NT)显示了与ABN101(CS)相比快速增加的HMW(5倍增加)(参见表11、表12和图12A至12C)。通过这些结果，可以预计由于ABN 101(CS)的双重变体的稳定性增加效应，可以补偿基于乙酸盐的干扰素变体药物的贮存不稳定性。

[表11]

[表12]

工业适用性

因此，本发明提供了人干扰素β变体，其包含具有苏氨酸取代人干扰素β的第27个氨基酸精氨酸和丝氨酸取代第17个氨基酸半胱氨酸的氨基酸序列。本发明提供了具有改善的纯化效率的人干扰素β变体，其可以有效地用于使用其的治疗剂生产，并且因此具有极佳的工业适用性。

Claims

1.一种人干扰素β变体，其包含具有丝氨酸取代人干扰素β的第17个氨基酸半胱氨酸和苏氨酸取代第27个氨基酸精氨酸的氨基酸序列。

2.一种多核苷酸，其编码权利要求1的人干扰素β变体。

3.权利要求2的多核苷酸，其中所述人干扰素β变体是包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的人干扰素β变体。

4.一种在动物细胞中表达人干扰素β的表达载体，其包含权利要求2的多核苷酸。

5.一种动物细胞，其用权利要求4的表达载体进行转化。

6.一种用于制备人干扰素β变体的方法，其包括培养权利要求5的动物细胞。

7.一种药物组合物，其包含作为活性成分的权利要求1的人干扰素β变体，其中所述药物组合物具有天然人干扰素β的药物效应。

8.权利要求7的药物组合物，其中所述药物组合物具有天然人干扰素β的药物效应，并且所述药物效应是预防或治疗选自多发性硬化、癌症、自身免疫性病症、病毒感染、HIV相关疾病和丙型肝炎的疾病的药物效应。

9.一种用于改善人干扰素βR27T变体的稳定性的方法，其包括用丝氨酸取代人干扰素βR27T变体中的第17个氨基酸半胱氨酸，在所述人干扰素βR27T变体中，苏氨酸取代人干扰素β的第27个氨基酸精氨酸。

10.权利要求9的方法，其中所述人干扰素βR27T变体由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。

11.权利要求9的方法，其中所述稳定性选自纯化稳定性、贮存稳定性和冷冻/融化稳定性。

12.权利要求11的方法，其中所述纯化稳定性改善了2种糖基化蛋白的纯化效率。

13.权利要求11的方法，其中所述纯化稳定性减少了在浓缩和缓冲液更换过程中的蛋白质聚集和降解。

14.权利要求11的方法，其中所述贮存稳定性是在pH 2.0至6.0的缓冲液中的贮存稳定性。

15.权利要求14的方法，其中所述缓冲液是选自以下的缓冲液：乙酸、磷酸、碳酸铵、磷酸铵、硼酸、柠檬酸、乳酸、柠檬酸钾、偏磷酸钾、磷酸二氢钾、乙酸钠、柠檬酸钠、乳酸钠溶液、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、碳酸氢盐、三(三(羟甲基)氨基甲烷)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸)(HEPES)、2-(2-氨基-2-氧乙基)氨基乙磺酸(ACES)、N-(2-乙酰氨基)2-亚氨基二乙酸(ADA)、3-(1,1-二甲基)-1,2-羟乙基氨基-2-丙磺酸(AMPSO)、N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、N,N-双(2-羟乙基甘氨酸(Bicine)、双-三(双(2-羟乙基)亚氨基-三(羟甲基)甲烷、3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)、2-(N-环己基氨基)乙磺酸(CHES)、3-N,N-双(2-羟乙基氨基-2-羟基-丙磺酸(DIPSO)、N-(2-羟乙基哌嗪)-N'-(3-丙磺酸)(HEPPS)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-羟基丙磺酸(HEPPSO)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、三乙醇胺、咪唑、甘氨酸、乙醇胺、磷酸盐、3-(N-吗啉代)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸(PIPES)、哌嗪-N,N'-双(2-羟基丙磺酸(POPSO)、N-三羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、3-N-三(羟甲基)甲基氨基-2-氢羟基丙磺酸(TAPSO)、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇和2-氨基-2-甲基-1-丙醇。

16.权利要求11的方法，其中所述冷冻/融化稳定性是在-100℃至-10℃下冷冻后的融化稳定性。

17.权利要求11的方法，其中所述冷冻/融化稳定性是在乙酸缓冲液中的冷冻/融化稳定性。

18.权利要求11的方法，其中所述冷冻/融化稳定性减少在3次或更多次冷冻/融化循环后的蛋白质聚集和降解。

19.权利要求1的人干扰素β变体用于制备药剂的用途，所述药剂具有天然人干扰素β对选自多发性硬化、癌症、自身免疫性病症、病毒感染、HIV相关疾病和丙型肝炎的疾病的药物效应。

20.一种用于治疗选自多发性硬化、癌症、自身免疫性病症、病毒感染、HIV相关疾病和丙型肝炎的疾病的方法，其包括将有效量的组合物施用于有此需要的受试者，所述组合物具有天然人干扰素β的药物效应并且包含权利要求1的人干扰素β变体。

21.一种人干扰素β变体，其具有丝氨酸取代SEQ ID NO:1的人干扰素β的第17个氨基酸半胱氨酸和苏氨酸取代第27个氨基酸精氨酸，与SEQ ID NO:1的野生型干扰素β具有至少90％的序列同源性，并且具有干扰素β的活性。