WO2021221485A1 - 이중 돌연변이를 가지는 인간 인터페론-베타 변이체 및 인간 인터페론-베타 변이체의 안정성을 향상시키는 방법 - Google Patents

이중 돌연변이를 가지는 인간 인터페론-베타 변이체 및 인간 인터페론-베타 변이체의 안정성을 향상시키는 방법 Download PDF

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Definitions

  • interferon-beta has antiviral activity, cell growth inhibition or anti-growth activity, lymphocyte cytotoxicity enhancing activity, immunomodulatory activity, target cell differentiation induction or inhibitory activity, macrophage activation activity, cytokine production increasing activity , cancer, autoimmune disorders and viral infections, HIV-related diseases, hepatitis C, rheumatoid arthritis, etc. It has been reported to have therapeutic effects.
  • the present inventors repeated intensive research to develop a method for improving the stability of the human interferon-beta variant R27T variant, more specifically tablet stability, storage stability, and freeze/thaw stability.
  • the R27T variant By substituting serine for cysteine at the 17th amino acid (C17S), it was discovered that this object could be achieved and the present invention was completed.
  • an object of the present invention is to have the pharmacological effect of natural human interferon-beta, and to administer an effective amount of a composition comprising the human interferon-beta mutant to an individual in need thereof. It provides a method of treating a disease selected from the group consisting of multiple sclerosis, cancer, autoimmune disorders, viral infections, HIV-related diseases, and hepatitis C, including those.
  • the present invention provides an animal cell transformed with the expression vector and a method for producing a human interferon-beta mutant by culturing the animal cell.
  • Human interferon-beta contained in the pharmaceutical composition of the present invention has been mainly used as a treatment for multiple sclerosis, but there are reports that it can be used for the treatment of cancer, autoimmune disorders, viral infections, HIV-related diseases, hepatitis C, etc. and its pharmacological effect has been continuously reported.
  • composition of the present invention may be administered orally or through other routes including transdermal, subcutaneous, intravenous or intramuscular.
  • cysteine which is the 17th amino acid of the human interferon-beta R27T mutant
  • C17S serine
  • arginine which is the 27th amino acid
  • cysteine which is the 17th amino acid
  • a host cell is transformed with a vector containing a polynucleotide encoding a protein. After conversion, it can be carried out by a method of culturing it in a medium.
  • the polynucleotide encoding the human interferon-beta variant encodes a protein in which arginine, which is the 27th amino acid of wild-type human interferon-beta of SEQ ID NO: 1, is substituted with threonine, and cysteine, which is the 17th amino acid, is substituted with serine.
  • Any polynucleotide sequence may be included without limitation.
  • the polynucleotide is in the coding region within a range that does not change the amino acid sequence of the protein due to the degeneracy of the codon or in consideration of the codon preferred in the organism in which the protein is to be expressed. Various modifications may be made.
  • the purification stability may be characterized as a reduction in protein aggregation and degradation during protein concentration and buffer exchange.
  • a protein or polypeptide may undergo aggregation or degradation in the concentration and buffer exchange steps performed during/or after the purification process. Protein denaturation during buffer exchange may be reduced.
  • Ultrafiltration for protein concentration is a separation method in which water pressure is used to force molecules and solvents across a membrane made of pores known as the particle size and also the cut-off size. Since molecules with a higher molecular weight do not pass through the membrane, only molecules with a molecular weight less than the barrier value of the membrane can pass through the membrane and form a so-called preservative. Thereby, the molecules present in the holding solution are concentrated as the solvent flows across the membrane. Ultrafiltration may be used for protein concentration or buffer exchange, or may be used to formulate a protein of interest into a desired solution or a desired buffer.
  • concentration of a solution or composition comprising a protein of interest may be performed by tangential flow filtration (TFF).
  • TFF tangential flow filtration
  • concentration of the composition comprising the polypeptide of interest may be performed by use of a centrifugation device.
  • the protein of interest is filtered by the membrane by application of centrifugal force to the membrane.
  • Such membranes are often characterized by molecular weight (Mw) blocking, i.e., the maximum molecular size of a compound that can cross the membrane, beyond which compounds with a larger molecular size cannot cross the membrane.
  • the storage stability means that the protein denaturation rate that may occur in the process of storing the purified human interferon-beta R27T mutant in a buffer or changing the composition of the buffer is lowered.
  • the present invention relates to multiple sclerosis, cancer, autoimmune disorders, viral infections, HIV-related diseases, and hepatitis C for producing a formulation having a pharmacological effect of natural human interferon-beta.
  • a human interferon-beta variant is provided.
  • the 'effective amount' of the present invention means improvement, treatment, prevention, detection, and improvement of a disease selected from the group consisting of multiple sclerosis, cancer, autoimmune disorder, viral infection, HIV-related disease, hepatitis C when administered to an individual, refers to an amount exhibiting the effect of diagnosis or suppression or reduction of the disease, and the 'subject' may be an animal, preferably a mammal, particularly an animal including a human, and may be an animal-derived cell, tissue, organ, etc. . The subject may be a patient in need of the effect.
  • 6a and 6b relate to ABN 101 (NT) and ABN 101 (CS) 50ml scale Fed-batch results.
  • TORAY's HuIFN- ⁇ ELISA KIT is used to analyze it.
  • the culture medium secured by Fed-batch is initially diluted 10,000-fold using diluent in the KIT, and serially dilution is performed two-fold to prepare up to 1,280,000-fold diluted samples.
  • the ELISA plate is prepared by priming using the wash buffer in the KIT.
  • Interferon-beta mutant (ABN 101(NT)) and interferon-beta double mutant (ABN 101(CS)) purified using Blue Sepharose resin were each purified using Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography (RP-HPLC) 2 The content of the glycosylated form of interferon-beta mutant was measured.
  • the recovery rate was confirmed by substituting the buffer with 20 mM sodium acetate (pH3.8) using a centricon in the same way to replace each protein exchanged with the corresponding buffer with a buffer based on a different formulation.
  • the recovery rate of ABN 101 (CS) was also higher than that of ABN 101 (NT) when exchanged with an acetate-based buffer as shown in Table 7. This is interpreted as protein structural stability from physical factors such as centricon by increased stability by the double variant.
  • the present invention provides a human interferon-beta mutant comprising an amino acid sequence in which the 27th amino acid, arginine, is substituted with threonine, and the 17th amino acid, cysteine, is substituted with serine.
  • the present invention provides a human interferon-beta mutant with improved purification efficiency, which can be usefully used in the production of a therapeutic agent using the same, and thus has excellent industrial applicability.

Abstract

본 발명은 이중 돌연변이를 가지는 인간 인터페론-베타 변이체 및 인간 인터페론-베타 변이체의 안정성을 향상시키는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인간 인터페론-베타의 17번째 아미노산인 시스테인이 세린으로 치환되고, 27번째 아미노산인 아르기닌이 트레오닌으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 인간 인터페론-베타 변이체 및 인간 인터페론-베타의 27번째 아미노산인 아르기닌이 트레오닌으로 치환된 인간 인터페론-베타 R27T 변이체의 17번째 아미노산인 시스테인을 세린으로 치환하는 단계를 포함하는, 인간 인터페론-베타 R27T 변이체의 안정성을 향상시키는 방법에 관한 것이다.

Description

이중 돌연변이를 가지는 인간 인터페론-베타 변이체 및 인간 인터페론-베타 변이체의 안정성을 향상시키는 방법
본 출원은 2020년 4월 29일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2020-0052513호 및 2020년 4월 29일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2020-0052913호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
본 발명은 이중 돌연변이를 가지는 인간 인터페론-베타 변이체 및 인간 인터페론-베타 변이체의 안정성을 향상시키는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인간 인터페론-베타의 17번째 아미노산인 시스테인이 세린으로 치환되고, 27번째 아미노산인 아르기닌이 트레오닌으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 인간 인터페론-베타 변이체 및 인간 인터페론-베타의 27번째 아미노산인 아르기닌이 트레오닌으로 치환된 인간 인터페론-베타 R27T 변이체의 17번째 아미노산인 시스테인을 세린으로 치환하는 단계를 포함하는, 인간 인터페론-베타 R27T 변이체의 안정성을 향상시키는 방법에 관한 것이다.
인터페론(IFNs)은 사이토카인의 일종으로서 항 바이러스 활성을 나타내고, 세포 증식을 억제하며, 자연 면역 반응을 조절하는 기능을 갖는데, 이 중 인터페론-베타(interferon-beta; IFN-β)는 5개의 알파 헬릭스를 가지고 있는 구형 단백질로서, 크기는 22 kD이며 당쇄를 제거하면 18 kD이 된다(Arduini 등 Protein Science 8: pp1867-1877, 1999).
인터페론-베타의 임상 적용에 관한 연구는 활발하게 진행 중에 있고, 특히 다발성 경화증(Multiple Sclerosis)에 대한 증상의 완화, 경감 또는 치료제로 각광을 받고 있다.
다발성 경화증 이외에도 인터페론-베타는 항바이러스 활성, 세포 성장 억제 또는 항 성장 활성, 림프구 세포 독성 증대 활성, 면역 조절 활성, 표적 세포의 분화 유도 또는 억제 활성, 대식세포의 활성화 활성, 사이토카인 생성의 증가 활성, 세포독성 T세포의 효과 증가 활성, 자연 살해 세포(natural killing cell)의 증가 활성 등의 다양한 면역학적 활성으로 암, 자가 면역 장애 및 바이러스 감염, HIV와 관련된 질병, C형 간염, 류마티스성 관절염 등에 치료 등의 효과가 있다고 보고되어 있다.
현재, 치료용으로 사용되는 인터페론 베타는 2 종류가 존재하는데, 첫째로 인터페론 베타 1a는 인간 인터페론 베타 유전자를 포함하는 중국 햄스터 난소(chinese hamster ovary, CHO)로부터 생산되고, 166개 아미노산 잔기로 구성되어 있으며, 크기가 22 kD인 당화된(glycosylated) 단백질이다. 둘째로 인터페론 베타 1b는 대장균으로부터 생산되는 165개 아미노산 잔기로 구성된 단백질인데, 당이 결여되어 있고, 아미노산 1번 메티오닌(methionine) 잔기가 결여되어 있으며, 17번 시스테인(cysteine) 잔기가 세린(serine)으로 치환되어 있다. 현재 시판되고 있는 인터페론 베타 1a는 레비프(Rebif)와 아보넥스(Avonex)가 있으며, 인터페론 베타 1b는 베타세론(Betaseron), 엑타비아 (Extavia)이 있다.
한편, 인간 인터페론-베타 역시 당단백질의 일종으로, 단백질에 연결된 당쇄 부분이 단백질의 활성에 중요한 역할을 하기 때문에 당단백질의 경우 당쇄를 부가시키게 되면 그 활성이 증가하는 경우가 있다. 즉, 단백질 당화는 안정성, 용해도, 세포내 수송 활성(intracellular trafficking activity), 약물 동태 및 항원성과 같은 많은 생화학적 특성에 영향을 미칠 수 있는 것으로 알려져 있다.
이에, 당단백질인 인간 천연형 인터페론-베타에 당쇄를 도입시켜 그 활성이나 기능이 증가 또는 향상된 인간 인터페론-베타 변이체를 제조한 예가 보고된 바 있다(한국특허등록 10-0781666). 본원발명에서 이용한 인간 인터페론-베타 변이체인 R27T는 인터페론-베타 1a의 25번째 위치에 추가적인 당화를 위하여 27번째 위치의 아르기닌(Arg)을 트레오닌(Thr)으로 대체하여 설계된 재조합 인간 인터페론-베타 변이체(이하, rhINF-β)로서, 야생형의 인터페론-베타 1a(Rebif)와 비교하였을 때 안정성 증가, 단백질 응집 경향 감소, 및 반감기 증가의 효과를 나타낸다. 즉, R27T는 위치-지정 변이를 통해 추가적인 당화로 생성된 rhINF-β의 바이오베터(biobetter)이다.
한편, 단백질 의약품 개발에 있어서 주요 과제 중 하나는 충분한 화학적, 물리적, 생물학적 안정성을 부여하여 정제과정 및 보관 과정에서 향상된 안정성을 나타내는 단백질을 제공하는 것이다. 그러나 단백질 분해 경로에서 다양한 고유의 민감성(intrinsic susceptibility), 단백질의 거대분자, 2차, 3차, 4차 구조와 같은 다양한 level을 가진 단백질 구조의 복잡성 때문에 높은 안정성을 달성하는 것은 여전히 어려운 문제이다.
최초의 재조합 펩타이드 호르몬으로서 인슐린이 1982년에 처음으로 승인되어 성공적으로 생산된 지 30년 이상 된 현재, 이를 이어서 수많은 재조합 단백질/펩타이드 의약품의 성공 사례들이 보고되고 있다. 그러나 바이오 의약품의 개발 과정, 특히 제제화에 있어서, 단백질 응집, 물리화학적 불안정성, 낮은 반감기, 저용해성, 약물 동태학적 특성(pharmacokinetic properties) 등 여러 가지 요인 때문에 여전히 난관에 직면하고 있다.
특히, 단백질 응집과 분해는 거의 모든 바이오의약품 공정에서 쉽게 발생하는 주요 문제들 중 하나인데, 보관하는 동안 치료용 단백질이 용액에서 구조적/열역학적으로 불안정하기 때문이다. 치료용 단백질은 정제, 가공, 보관 시 다양한 요인으로 인한 구조적 변화에 민감하기 때문에 단백질들이 냉동/해동 반복, pH가 상이한 버퍼에의 보관 등 가혹 조건에 노출되면 상기와 같은 문제들이 악화될 수 있다. 또한, 단백질 기반 바이오 의약품들은 풀림(unfolding), 응집, 비정상적인(non-native) 폴딩으로 인한 불용성 입자화와 같은 물리적 변성(degradation)의 가능성이 있기 때문에 단백질 응집이나 물리적 변성을 피하고 안정성을 최대화시키는 것이 중요하다.
2004년 인터페론의 당화에 변이를 초래하는 인터페론-베타 돌연변이 단백질을 개발되어(대한민국 특허 제781666호) 이를 치료제로 활용하고자 하는 연구가 진행중에 있다. 인터페론 베타는 안정성이 떨어지기 때문에, 정제과정에서 펩타이드 결합의 절단, 탈 아미드화, 메티오닌의 메티오닌 설파이드로의 산화, 디설파이드 교환과 같은 분해 반응이 흔히 일어나는데 (US2012/0177603), 이들에 대한 고려가 반드시 필요하다.
이에, 천연형 인터페론-베타의 약리효과보다 우수한 효능을 나타내는 인간 인터페론-베타 변이체의 개발이 필요하며 이를 높은 수율로 얻을 수 있는 방법이 요구된다.
이에 본 발명자들은 천연형 인터페론-베타보다 약리효과가 우수하고 정제 효율이 개선된 인터페론-베타 변이체를 개발하기 위하여 노력하였다. 그 결과, 인간 인터페론-베타의 17번째 아미노산인 시스테인이 세린으로 치환되고 27번째 아미노산인 아르기닌이 트레오닌으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 인간 인터페론-베타 변이체가 우수한 인터페론 베타의 활성을 가지면서 정제과정 상의 효율도 우수하여 새로운 인터페론 베타용 제조로 활용할 수 있다는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명자는 인간 인터페론-베타 변이체인 R27T 변이체의 안정성, 보다 구체적으로는 정제 안정성, 보관 안정성 및 냉동/해동 안정성을 향상시킬 수 있는 방법을 개발하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, R27T 변이체의 17번째 아미노산인 시스테인을 세린으로 치환하면(C17S) 이와 같은 목적 달성이 가능하다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 인간 인터페론-베타의 17번째 아미노산인 시스테인이 세린으로 치환되고 27번째 아미노산인 아르기닌이 트레오닌으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 인간 인터페론-베타 변이체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인간 인터페론-베타 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함함으로써 동물 세포에서 인간 인터페론-베타를 발현시키는 발현 벡터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터로 형질 전환된 동물 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 동물 세포를 배양하는 단계를 포함하는 인간 인터페론-베타 변이체의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 인간 인터페론-베타 변이체를 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 또 다른 목적은 상기 인간 인터페론-베타 변이체로 이루어지는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 또 다른 목적은 상기 인간 인터페론-베타 변이체로 필수적으로 이루어지는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 목적은 인간 인터페론-베타의 27번째 아미노산인 아르기닌이 트레오닌으로 치환된 인간 인터페론-베타 R27T 변이체의 17번째 아미노산인 시스테인을 세린으로 치환하는 단계를 포함하는, 인간 인터페론-베타 R27T 변이체의 안정성을 향상시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 다발성 경화증, 암, 자가 면역 장애, 바이러스 감염, HIV와 관련된 질병, C형 간염으로 구성된 군에서 선택되는 질병에 대한 천연형 인간 인터페론-베타가 가지는 약리 효과를 갖는 제제를 제조하기 위한 상기 인간 인터페론-베타 변이체의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 천연형 인간 인터페론-베타가 가지는 약리 효과를 가지며, 상기 인간 인터페론-베타 변이체를 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 다발성 경화증, 암, 자가 면역 장애, 바이러스 감염, HIV와 관련된 질병, C형 간염으로 구성된 군에서 선택되는 질병 치료 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인간 인터페론-베타의 17번째 아미노산인 시스테인이 세린으로 치환되고 27번째 아미노산인 아르기닌이 트레오닌으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 인간 인터페론-베타 변이체를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 인간 인터페론-베타 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함함으로써 동물 세포에서 인간 인터페론-베타를 발현시키는 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 벡터로 형질 전환된 동물 세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 동물 세포를 배양하는 단계를 포함하는 인간 인터페론-베타 변이체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 인간 인터페론-베타 변이체를 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 인간 인터페론-베타 변이체로 이루어지는 약제학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 인간 인터페론-베타 변이체로 필수적으로 이루어지는 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 목적은 인간 인터페론-베타의 27번째 아미노산인 아르기닌이 트레오닌으로 치환된 인간 인터페론-베타 R27T 변이체의 17번째 아미노산인 시스테인을 세린으로 치환하는 단계를 포함하는, 인간 인터페론-베타 R27T 변이체의 안정성을 향상시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 목적은 다발성 경화증, 암, 자가 면역 장애, 바이러스 감염, HIV와 관련된 질병, C형 간염으로 구성된 군에서 선택되는 질병에 대한 천연형 인간 인터페론-베타가 가지는 약리 효과를 갖는 제제를 제조하기 위한 상기 인간 인터페론-베타 변이체의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 목적은 천연형 인간 인터페론-베타가 가지는 약리 효과를 가지며, 상기 인간 인터페론-베타 변이체를 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 다발성 경화증, 암, 자가 면역 장애, 바이러스 감염, HIV와 관련된 질병, C형 간염으로 구성된 군에서 선택되는 질병 치료 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서의 이중 돌연변이를 가지는 인간 인터페론-베타 변이체는 인간 인터페론-베타의 17번째 아미노산인 시스테인이 세린으로 치환되고 27번째 아미노산인 아르기닌이 트레오닌으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 인간 인터페론-베타 변이체이다.
본 발명에서 인간 인터페론-베타 변이체는 인간 인터페론-베타에서 유래된 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 지니고, 천연형 인간 인터페론-베타에서 17번째 아미노산인 시스테인이 세린으로 치환되고 27번째 아미노산인 아르기닌이 트레오닌으로 치환되었으면서 인간 인터페론-베타의 활성을 지니는 모든 폴리펩티드를 나타낸다.
본 발명에서 "인간 인터페론-베타의 활성"이란 인간 인터페론-베타가 지닌다고 알려진 활성 중에서 어떠한 폴리펩티드가 인간 인터페론-베타로 동정되기에 충분한 하나 이상의 활성으로 정의된다. 그러한 활성으로서는 이미 전술한 바의 다발성경화증에 대한 경감, 완화 또는 치료 활성, 항바이러스 활성, 세포 성장 억제 활성, 항 성장활성, 항 증식 활성, 림프구세포독성 증대 활성, 면역 조절 활성, 표적 세포의 분화 유도 또는 억제 활성, 사이토카인 생성의 증가 활성, 세포독성 T세포의 효과 증가 활성, 대식세포의 효과 증가 활성, 자연 살해 세포(natural killing cell)의 증가 활성, 암 예방 또는 치료 활성, 자가 면역 장애 예방 또는 치료 활성, 바이러스 감염 예방 또는 치료 활성, HIV와 관련된 질병의 예방 또는 치료 활성, C형 간염 예방 또는 치료 활성, 류마티스성 관절염 예방 또는 치료 활성 등을 예시할 수 있다.
본 발명의 이중 돌연변이를 가지는 인간 인터페론-베타 변이체에서 가장 바람직한 형태는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 천연형 인간 인터페론-베타에서 17번째 아미노산인 시스테인이 세린으로 치환되고 27번째 아미노산인 아르기닌이 트레오닌으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다.
본 발명에서 상기 천연형 인간 인터페론-베타에서 17번째 아미노산인 시스테인이 세린으로 치환되고 27번째 아미노산인 아르기닌이 트레오닌으로 치환된 변이체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고, 구체적으로는 서열번호 3의 아미노산 서열로 필수적으로 구성되는(consisting essentially of) 것일 수 있으며, 보다 구체적으로는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
서열번호 1
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서열번호 3
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또한, 본 발명의 인간 인터페론-베타 변이체는 서열번호 1의 인간 인터페론-베타의 17번째 아미노산인 시스테인이 세린으로 치환되고 27번째 아미노산인 아르기닌이 트레오닌으로 치환되고, 서열번호 1의 야생형 인터페론 베타와 90%이상의 서열 상동성을 가지며, 인터페론 베타의 활성을 가지는 인간 인터페론-베타 변이체일 수 있다.
본 발명에서 용어, "변이체(variant)"는 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환(conservative substitution) 및/또는 변형(modification)에 있어서 상기 열거된 서열(the recited sequence)과 상이하나, 상기 단백질의 기능(functions) 또는 특성(properties)이 유지되는 단백질을 지칭한다. 변이체는 수 개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가에 의해 식별되는 서열(identified sequence)과 상이하다. 이러한 변이체는 일반적으로 상기 단백질의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산을 변형하고, 상기 변형된 단백질의 특성을 평가하여 식별될 수 있다. 즉, 변이체의 능력은 본래 단백질(native protein)에 비하여 증가되거나, 변하지 않거나, 또는 감소될 수 있다. 또한, 일부 변이체는 N-말단 리더 서열 또는 막전이 도메인(transmembrane domain)과 같은 하나 이상의 부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 다른 변이체는 성숙 단백질 (mature protein)의 N- 및/또는 C-말단으로부터 일부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 상기 용어 "변이체"는 변이형, 변형, 변이된 단백질, 변이형 폴리펩티드, 변이 등의 용어(영문 표현으로는 modification, modified protein, modified polypeptide, mutant, mutein, divergent, variant 등)가 사용될 수 있으며, 변이된 의미로 사용되는 용어라면 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 목적상, 상기 변이체는 천연의 야생형 또는 비변형 단백질 대비 변이된 단백질의 활성이 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 상기 변이체는 하나 이상의 생물학적 활성을 여전히 보유하면서, 예를 들어 하나 이상의 보존적 치환을 가질 수 있다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 예를 들면, 전하를 띠는 곁사슬(electrically charged amino acid)을 갖는 아미노산 중 양으로 하전된(염기성) 아미노산은 알지닌, 리신, 및 히스티딘을, 음으로 하전된(산성) 아미노산은 글루탐산 및 아르파르트산을 포함하고; 전하를 띠지 않는 곁사슬(uncharged amino acid)을 갖는 아미노산 중 비극성 아미노산(nonpolar amino acid)은 글리신, 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 프롤린을 포함하고, 극성(polar) 또는 친수성(hydrophilic) 아미노산은 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함하고, 상기 비극성 아미노산 중 방향족 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신을 포함한다.
또한, 변이체는 폴리펩티드의 특성과 2차 구조에 최소한의 영향을 갖는 아미노산들의 결실 또는 부가를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드는 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질의 이전(transfer)에 관여하는 단백질 N-말단의 시그널(또는 리더) 서열과 컨쥬게이트 할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 인간 인터페론-베타 변이체는 서열번호 1의 야생형 인간 인터페론-베타 단백질의 27번째 아미노산이 트레오닌으로, 17번쨰 아미노산이 세린으로 고정되고, 이와 80% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 본 발명의 변이체는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성 또는 동일성을 가지는 단백질을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면 서열번호 1의 야생형 인간 인터페론-베타 단백질의 27번째 및 17번째 아미노산 위치 이외에, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 발명에서 용어 "상동성(homology)" 또는 "동일성(identity)"은 두 개의 주어진 아미노산 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
임의의 두 단백질 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, 당업계에 공지된 바와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램 (버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지를 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 이중 돌연변이를 가지는 인간 인터페론-베타 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 명세서에서 상기 "폴리뉴클레오티드"는 단일 가닥 또는 이중 가닥의 RNA, DNA 또는 RNA-DNA의 중합체를 모두 포함하는 의미로서 정의된다.
당업자라면 그의 통상의 능력을 활용하는 한 어떠한 아미노산 서열이 주여졌을 때 그 아미노산 서열에 기초하여 그러한 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 용이하게 제조할 수 있다.
본 발명은, 또한 동물세포에서 본 발명의 인간 인터페론-베타 변이체를 발현시킬 수 있는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 동물 세포 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 이중 돌연변이를 가지는 인간 인터페론-베타 변이체는 천연형 인간 인터페론-베타 변이체에 비하여 1 또는 2개의 당쇄를 추가로 포함하는데, 이러한 당쇄가 일반적으로 동물세포에서 일어나는 현상임을 고려할 때, 상기 동물 세포 발현 벡터는 구체적으로
(i) 전술한 바의 인간 인터페론-베타 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
(ii) 상기 (i)의 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결되어(operably linked) RNA 분자를 형성시키는 프로모터;
(iii) 리더서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
(iv) 복제 기점; 및
(v) 상기 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위를 기본적으로 포함한다.
상기에서 프로모터로는 전사를 활성화시킬 수 있는 서열을 말하는데, 그러한 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 마찬가지로 번역된 단백질을 당화가 일어나는 소포체로 이동시키기는 상기 리더 서열과 mRNA를 안정화시키는 역할을 하는 상기의 3'-비-해독화 부위도 당업계에 공지되어 있다.
한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택적으로 리포터(예: 루시퍼라아제 및 β-글루쿠로니다아제) 유전자나 선택 표지 유전자로서 항생제(예: 네오마이신, 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신 등) 내성 유전자 등을 포함할 수 있으며, 또한 선택적으로 인핸서를 포함할 수 있다.
한편, 본 발명의 동물 세포 발현 벡터로서 사용될 수 있는 것으로는 pSV2-neo, pCAGGS, pcDL-SRα296, pAc373 등을 예시할 수 있는데, 위 예시된 벡터들은 필요에 따라 전술한 바의 프로모터, 리더, 복제기점, 3'-비-해독화 부위, 리포터 유전자, 선택 표지 유전자, 인핸서 등을 포함할 수 있다.
본 발명은 상기 발현 벡터로 형질전환된 동물세포 및 이러한 동물 세포를 배양하여 인간 인터페론-베타 변이체를 생산하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 형질전환이란 외래성 폴리뉴클레오티드(본 발명에서는 이중 돌연변이를 가지는 인간 인터페론-베타 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 의미함)가 도입됨에 의한 숙주 세포의 유전자형의 변형을 의미하며, 그 형질전환에 사용된 방법과 상관없이 외래성 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포 내로 도입된 것을 의미한다. 숙주 세포내로 도입된 외래성 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포의 게놈내로 통합되어 유지되거나 통합되지 않고 유지될 수 있는데, 본 발명은 양자 모두 포함한다.
한편, 상기에서 동물 세포란 재조합 단백질의 생산에 사용될 수 있는 포유 동물 세포와 곤충세포를 포함하는 의미인데, 본 발명에 사용될 수 있는 동물세포로서는 COS 세포, CHO 세포, C-127 세포, BHK 세포, 래트 Hep I 세포, 래트 Hep II 세포, TCMK 세포, 사람의 폐 세포, 사람의 간종양 세포, HepG2 세포, 마우스의 간세포, DUKX 세포, 293 세포 등을 들 수 있고, 곤충세포로서는 누에 배양 세포 등을 들 수 있다.
본 발명은 또 다른 측면에 있어서, 전술한 바의 본 발명의 인간 인터페론-베타 변이체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 인간 인터페론-베타는 다발성 경화증 치료제로서 주로 사용되어 왔지만, 암, 자가 면역 장애, 바이러스 감염, HIV와 관련된 질병, C형 간염 등의 치료에도 이용될 수 있다는 보고가 있으며, 그 약리 효과는 계속하여 보고되고 있다.
이러한 이유에서, 본 발명의 약제학적 조성물에 있어서의 약리 효과는 다발성 경화증 치료제로서의 약리 효과뿐만 아니라, 기타의 인간 인터페론-베타가 가지는 모든 약리 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
또 그러한 약리 효과는 베타 인간 인터페론의 약리 효과로서 현재까지 알려진 약리 효과뿐만 아니라, 추후에 밝혀지게 될 약리 효과도 포함하는 의미로서 이해되어야 할 것이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명에 의하여 얻어지는 활성 또는 기능이 증가된 인간 인터페론-베타 변이체를 포함함에 특징이 있는 것이기 때문에, 본 발명의 약제학적 조성물이 위 약물의 현재까지 알려진 약리 효과뿐만 아니라 추후에 밝혀지게 될 약리 효과를 포함하더라도, 본 발명의 범위가 부당하게 확대되는 것은 아니다.
그럼에도 인간 인터페론-베타변이체가 여전히 다발성 경화증 치료제로서 주로 사용되어 온 점, 그리고 이미 암, 자가 면역 장애, 바이러스 감염, HIV와 관련된 질병, C형 간염 등의 치료 효과는 이미 밝혀졌다는 점에서 상기 약리 효과는 이러한 약리 효과인 것이 바람직하다.
한편, 본 발명의 약제학적 조성물은 경구투여되거나 기타 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다.
또 상기 본 발명의 약제학적 조성물들은 여러 가지 제형으로 제제화할 수 있는데, 제제화할 경우에는 통상적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제제화할 수 있다.
또한 본 발명의 약제학적 조성물들의 1일 투여량에 있어서 이미 당업계에 공지된 투여량으로 투여하면 되는데, 일반적으로 0.01 ~ 5 mg/kg 체중 범위에서, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 약제학적 조성물의 실제 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니된다.
본 발명은 또한 인간 인터페론-베타의 27번째 아미노산인 아르기닌이 트레오닌으로 치환된 인간 인터페론-베타 R27T 변이체의 17번째 아미노산인 시스테인을 세린으로 치환하는 단계를 포함하는, 인간 인터페론-베타 R27T 변이체의 안정성을 향상시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에서는 인간 인터페론-베타 R27T 변이체의 17번째 아미노산인 시스테인을 세린으로 치환(C17S)하고 정제한 후, RP-HPLC를 이용하여 C17S 변이를 포함하는 변이체와 포함하지 않는 변이체의 당화(glycosylation) 변화를 확인해 보았다. 그 결과, C17S를 포함하고 있는 R27T 변이체의 단백질 정제 후 2당화 비율이 C17S를 포함하고 있지 않은 R27T 변이체와 비교해 향상된 것으로 확인되었다.
본 발명의 다른 실시예에서는 인간 인터페론-베타 R27T 변이체의 17번째 아미노산인 시스테인을 세린으로 치환(C17S)하고 정제한 후, pH 2.0 내지 6.0의 인산 완충액 및 아세트산 완충액에서의 보관 안정성을 평가해 보았다. 그 결과, C17S를 포함하고 있는 R27T 변이체의 각 완충액에서의 단백질 회수율이 C17S를 포함하고 있지 않은 R27T 변이체와 비교해 향상된 것으로 확인되었다.
본 발명의 다른 실시예에서는 인간 인터페론-베타 R27T 변이체의 17번째 아미노산인 시스테인을 세린으로 치환(C17S)하고 정제한 후 냉동/해동을 반복하면서 SEC-HPLC 분석을 수행하여 단백질 단량체의 비율을 확인해 보았다. 그 결과, C17S를 포함하고 있는 R27T 변이체가 냉동/해동의 과정을 반복한 후 단량체의 비율이 C17S를 포함하고 있지 않은 R27T 변이체와 비교해 향상된 것으로 확인되었다.
본 발명에서 "인간 인터페론-베타 R27T 변이체"는 인간 인터페론-베타에서 유래된 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 지니고, 서열번호 1의 야생형 인간 인터페론-베타에서 27번째 아미노산인 아르기닌이 트레오닌으로 치환되었으면서 인간 인터페론-베타의 활성을 지니는 모든 폴리펩티드를 나타낸다.
본 발명에서 인간 인터페론-베타의 27번째 아미노산인 아르기닌이 트레오닌으로 치환된 인간 인터페론-베타 R27T 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고, 구체적으로는 서열번호 2의 아미노산 서열로 필수적으로 구성되는(consisting essentially of) 것일 수 있으며, 보다 구체적으로는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
서열번호 2
MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGTLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN
또한, 상기 인간 인터페론-베타 R27T 변이체는 서열번호 1의 야생형 인간 인터페론-베타 단백질의 27번째 아미노산이 트레오닌으로 고정되고, 이와 80% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 본 발명의 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성 또는 동일성을 가지는 단백질을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면 서열번호 1의 야생형 인간 인터페론-베타 단백질의 27번째 아미노산 위치 이외에, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 발명에서 인간 인터페론-베타 R27T 변이체의 17번째 아미노산인 시스테인을 세린으로 치환하는 단계는 당업계에서 아미노산의 점 돌연변이를 도입하기 위해 사용되는 공지의 방법이 제한없이 사용될 수 있다.
예를 들어, 서열번호 1의 야생형 인간 인터페론-베타의 27번째 아미노산인 아르기닌이 트레오닌으로 치환되고, 17번째 아미노산인 시스테인이 세린으로 치환된 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 후, 이를 배지에서 배양하는 방법에 의해 수행될 수 있다.
이와 관련된 구체적인 설명은, R27T 및 C17S 이중 돌연변이를 포함하는 인간 인터페론-베타 변이체를 생산하는 방법에 관한 내용이 그대로 적용될 수 있다.
본 발명에서 상기 인간 인터페론-베타 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 서열번호 1의 야생형 인간 인터페론-베타의 27번째 아미노산인 아르기닌이 트레오닌으로 치환되고, 17번째 아미노산인 시스테인이 세린으로 치환된 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서 상기 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다.
상기 배양에 의하여 생산된 인간 인터페론-베타 변이체는 배지 중으로 배출되거나 미처 배출되지 못하고 세포 내에 잔류할 수 있다.
본 발명의 방법에서는 상기 배양된 세포 또는 배지에서 17번째 아미노산인 시스테인이 세린으로 치환된 인간 인터페론-베타 R27T 변이체를 회수하는 단계가 추가로 포함될 수 있다.
상기 배양 단계에서 생산된 인간 인터페론-베타 변이체를 회수하는 방법은 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 단백질을 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들면, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 세포로부터 목적하는 변이체를 회수할 수 있다.
또한, 상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법, 예를 들면 막을 이용한 여과 등을 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 일 양태에서 상기 안정성이란 정제 안정성, 보관 안정성 및 냉동/해동 안정성으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 정제 안정성이란 숙주세포 또는 세포 배양액으로부터 회수한 단백질을 정제하는 과정에서 발생할 수 있는 단백질의 변성 비율이 낮아지는 것을 의미하며, 상기 정제는 당업계에서 단백질을 정제하는 통상적인 방법이 제한없이 포함될 수 있다. 예를 들어, 상기 정제란 염석(예를 들어, 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 칼럼 크로마토그래피를 포함하며, 바람직하게는 칼럼 크로마토그래피일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 정제 안정성이란 전술한 단백질의 정제과정 전후에서 단백질의 당화(glycosylation) 수준에 변화가 낮아지는 것을 의미할 수 있으며, 구체적으로는 인간 인터페론-베타 R27T 변이체에 있어서, 2당화 단백질의 정제율이 향상되는 것을 의미할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 정제 안정성이란 단백질의 농축 및 완충액 교환(buffer exchange)시 단백질 응집현상(aggregation) 및 분해(degradation) 감소인 것을 특징으로 할 수 있다. 일반적으로, 단백질 또는 폴리펩타이드는 정제과정 중/또는 후에 수행되는 농축 및 완충액 교환 단계에서 응집 또는 분해가 일어날 수 있으나, 인간 인터페론-베타 R27T 변이체의 17번째 아미노산인 시스테인이 세린으로 치환하면, 농축 및 완충액 교환 과정에서의 단백질 변성이 감소할 수 있다.
단백질은 당업계에 알려진 방법을 사용하여 농축될 수 있다. 단백질 농축에 사용될 수 있는 비제한적인 예시적 방법은 한외여과, 접선 유동 여과, 막 농축기(예: 셀룰로스 막 농축기)를 이용한 원심력에 의한 농축, 수분 흡수 물질(예: 수분 흡수 폴리머)에 대한 투석, 염석(예를 들어, 황산암모늄을 사용), 및 크로마토그래피(예: 크기 배제 크로마토그래피)를 포함한다.
단백질의 농축을 위한 한외여과법은 수압이 분자와 용매가 입자 크기, 또한 값의 차단 크기(cut-off size)로 알려진 기공으로 이루어진 막을 가로지르게 하는데 사용되는 분리방법이다. 더 큰 분자량을 가진 분자들은 막을 통과하지 않기 때문에 막의 차단 값보다 더 작은 분자량을 갖는 분자만이 막을 통과할 수 있으며 이른바 보전액을 형성할 수 있다. 그것에 의해 보전액에 존재하는 분자는 용매가 막을 가로질러 흐르는 것과 같이 농축된다. 한외여과법은 단백질 농축 또는 완충액 교환에 사용되거나, 목적 단백질을 원하는 용액 또는 원하는 완충액으로 제형화하는 데 사용될 수 있다.
특정한 구현예에서 목적하는 단백질을 포함하는 용액 또는 조성물의 농축은 접선 유동 여과(tangential flow filtration, TFF)에 의해 수행될 수 있다. 이 방법은 특히 큰 스케일의 농축, 즉 1 리터로부터 수백 리터에 이르는 부피의 용액의 농축에 유용하다. 그러므로, 이 방법은 특히 산업적 스케일에서 목적 단백질의 농축된 용액의 생산에 유용하다.
상기 TFF 기술은 여과된 용액이 단지 막의 기공보다 더 작은 분자만이 막을 통하여 통과할 수 있는 반투과막을 가로질러 흐르도록 하고, 여과액을 형성하고, 더 큰 물질이 모이도록(보유액) 남겨두는 특정한 장치의 사용에 기초한다. TFF 방법과 함께 두개의 다른 압력이 적용되는데; 하나는 용액을 시스템으로 공급하고 용액을 시스템 안에서 순환하도록 하는 것이고(입구 압력), 다른 압력은 작은 분자와 용매가 막을 가로지르게 하는 막에 걸쳐서 적용된다(막 압력). 입구 압력은 전형적으로 1-3 bar 범위, 예를 들어 1.5-2 bar 사이일 수 있다. 막 압력은 전형적으로 1 bar보다 클 수 있다.
TFF가 조성물의 농축에 사용될 때 목적 단백질의 농축된 조성물은 완충액에 모여질 수 있다. TFF용으로 유용한 막은 전형적으로 재생된 셀룰로오스 또는 폴리에테르술폰(PES)으로 만들어질 수 있다. 막의 기공 크기는 전형적으로 10,000 Mw 보다 작은, 예를 들어 10-10,000 Mw 범위의 분자량 차단을 가질 수 있다.
다른 구현예에서, 목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물의 농축은 원심분리 장치의 사용에 의해 수행될 수 있다. 이 경우, 목적하는 단백질은 막에 대한 원심력의 적용에 의해서 막에 의하여 여과된다는 것이다. 그러한 막은 종종 분자량(Mw) 차단, 즉 막을 통과할 수 있는 화합물의 최대 분자 크기에 의해 특징화되며, 이보다 분자 크기가 더 큰 화합물은 막을 통과할 수 없다.
상기 막은 특히 폴리에테르술폰(PES) 또는 재생된 셀룰로오스로 만들어질 수 있다. 그러한 적당한 상업적인 필터 장치의 예는 Centricon Plus-80 또는 Centricon Plus-15일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
농축은 일반적으로 2000-4500g, 예를 들어 2500-4000g 사이, 또는 2750-3500g 사이, 또는 3000-3500g 사이, 예를 들어 3000g 또는 3100g 또는 3200g 또는 3300g 또는 3400g 또는 3500g에서 수행될 수 있다.
상기 농축된 목적 단백질을 포함하는 조성물의 완충액 교환은 특히 a) 완충액 또는 제제(formulation)에서 농축된 목적 단백질을 포함하는 조성물을 예를 들어 5-15회 희석, b) 희석된 조성물을 다시 농축, 및 상기 단계가 수행된 후에 이들 단계 전에 조성물에 존재하는 완충액 또는 제제에 포함된 첨가제의 양이 상기 조성물에 존재하는 완충액 또는 제제의 첨가제를, 예를 들어 5 v/v% 이하 또는 1 v/v% 이하로 구성하도록 하기 위하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 보관 안정성이란 정제된 인간 인터페론-베타 R27T 변이체를 완충액에서 보관하거나 완충액의 조성을 변경하는 과정에서 발생할 수 있는 단백질의 변성 비율이 낮아지는 것을 의미한다.
본 발명에서 상기 완충액은 pH 2.0 내지 6.0일 수 있고, 바람직하게는 pH 2.0 내지 5.0일 수 있고, 가장 바람직하게는 pH 2.0 내지 4.0일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 완충액은 아세트산, 인산, 암모니움 카보네이트, 암모니움 포스페이트, 붕산, 시트르산, 락트 산, 포타슘 시트레이트, 포타슘 메타포스페이트, 포타슘 포스페이트 일염기, 소듐 아세테이트, 소듐 시트레이트, 소듐 락테이트 용액, 이염기 소듐 포스페이트, 일염기 소듐 포스페이트, 비카보네이트, 트리스 (트리스(히드록시메틸)아미노메탄), MOPS (3-(N-모르폴리노)프로판술폰 산), HEPES (N-(2-히드록시에틸)피페라진-N'-(2-에탄술폰 산), ACES (2-(2-아미노-2-옥소에틸)아미노에탄술폰 산), ADA (N-(2-아세트아미도)2-이미노디아세트 산), AMPSO (3-(1,1-디메틸-1,2-히드록시에틸아미노-2-프로판술폰 산), BES (N,N-비스(2-히드록시에틸)-2-아미노에탄술폰 산, 비신 (N,N-비스(2-히드록시에틸글리신), 비스-트리스 (비스-(2-히드록시에틸)이미노-트리스(히드록시메틸)메탄, CAPS (3-(사이클로헥실아미노)-1-프로판술폰 산) , CAPSO (3-(사이클로헥실아미노)-2-히드록시-1-프로판술폰 산), CHES (2-(N-사이클로헥실아미노)에탄술폰 산), DIPSO (3-N,N-비스(2-히드록시에틸아미노-2-히드록시-프로판술폰 산), HEPPS (N-(2-히드록시에틸피페라진)-N'-(3-프로판술폰 산), HEPPSO (N-(2-히드록시에틸)피페라진-N'-(2-히드록시프로판술폰 산), MES (2-(N-모르폴리노)에탄술폰 산), 트리에탄올아민, 이미다졸, 글리신, 에탄올아민, 포스페이트, MOPSO (3-(N-모르폴리노)-2-히드록시프로판술폰 산), PIPES (피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰 산), POPSO (피페라진-N,N'-비스(2-히드록시프로판술폰 산), TAPS (N-트리스히드록시메틸)메틸-3-아미노프로판술폰 산), TAPSO (3-N-트리스(히드록시메틸)메틸아미노-2-히드록시-프로판술폰 산), TES (N-트리스(히드록시메틸)메틸-2-아미노에탄술폰 산), 트리신 (N-트리스(히드록시메틸)메틸글리신), 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올, 및 2-아미노-2-메틸-1-프로판올로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 냉동/해동 안정성이란 완충액에 보관된 인간 인터페론-베타 R27T 변이체를 냉동하고 해동하는 사이클을 반복했을 때 단백질의 변성 가능성이 낮아지는 것을 의미하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 냉동/해동 안정성은 -100℃내지 -10℃에서의 냉동 후 해동 안정성인 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 -90℃내지 -30℃에서의 냉동 후 해동 안정성인 것을 특징으로 할 수 있으며, 가장 바람직하게는 -80℃내지 -50℃에서의 냉동 후 해동 안정성인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 냉동/해동 안정성은 아세트산 완충액에서의 냉동/해동 안정성인 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 pH 3.0 내지 5.0의 아세트산 완충액에서의 냉동/해동 안정성인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 냉동/해동 안정성은 3회 이상의 냉동/해동 사이클 후 단백질의 응집현상(aggregation) 및 분해(degradation) 감소인 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 4회 이상의 냉동/해동 사이클 후 단백질의 응집현상(aggregation) 및 분해(degradation) 감소인 것을 특징으로 할 수 있으며, 가장 바람직하게는 4회 이상의 냉동/해동 사이클 후 단백질의 응집현상(aggregation) 및 분해(degradation) 감소인 것을 특징으로 할 수 있다.
인간 인터페론-베타의 생물학적 활성은 1형 인터페론 수용체와의 상호작용에 의하여 변화할 수 있다. 본 발명에서 인간 인터페론-베타 R27T 변이체의 안정성을 향상시키기 위해 변이를 유도한 17번째 아미노산은 1형 인터페론 수용체인 IFNAR2와의 결합면에 위치하며, 특히 15번째부터 23번째 부위는 주요한 수용체 결합 부위로써 어느 하나 이상의 아미노산 서열에 변이가 발생했을 경우 생물학적 활성이 변화될 수도 있다. 특히 자유로운 시스테인(free cysteine) 잔기는 이황화결합을 하고 있는 시스테인 잔기(disulfide bonding cystein)에 비해 강한 소수성(hydrophobicity)을 가지고 있기 때문에 17번째 아미노산인 시스테인을 치환하는 것은 활성의 변화를 야기할 수 있다. 예상한 바와 같이, 인간 인터페론-베타 R27T 변이체에 추가적으로 C17S 변이를 도입함으로 인해 R27T 변이체의 소수성이 낮아지는 변화가 나타났으나, 단백질 활성에는 영향이 없었고 정제 안정성, 보관 안정성 및 냉동/해동 안정성이 향상되는 결과가 나타났다. 또한, C17S 변이의 도입은 세린 잔기에 의한 단백질 내 수소결합을 유도하여 안정성을 향상시킬 수 있다.
본 발명은 다발성 경화증, 암, 자가 면역 장애, 바이러스 감염, HIV와 관련된 질병, C형 간염으로 구성된 군에서 선택되는 질병에 대한 천연형 인간 인터페론-베타가 가지는 약리 효과를 갖는 제제를 제조하기 위한 상기 인간 인터페론-베타 변이체의 용도를 제공한다.
본 발명은 천연형 인간 인터페론-베타가 가지는 약리 효과를 가지며, 상기 인간 인터페론-베타 변이체를 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 다발성 경화증, 암, 자가 면역 장애, 바이러스 감염, HIV와 관련된 질병, C형 간염으로 구성된 군에서 선택되는 질병 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 ‘유효량’이란 개체에게 투여하였을 때, 다발성 경화증, 암, 자가 면역 장애, 바이러스 감염, HIV와 관련된 질병, C형 간염으로 구성된 군에서 선택되는 질병의 개선, 치료, 예방, 검출, 진단 또는 상기 질병의 억제 또는 감소 효과를 나타내는 양을 말하며, 상기 ‘개체’란 동물, 바람직하게는 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며, 동물에서 유래한 세포, 조직, 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 상기 효과가 필요한 환자(patient)일 수 있다.
본 발명의 상기 ‘치료’는 다발성 경화증, 암, 자가 면역 장애, 바이러스 감염, HIV와 관련된 질병, C형 간염으로 구성된 군에서 선택되는 질병 또는 상기 질병의 증상을 개선시키는 것을 포괄적으로 지칭하고, 이는 상기 질병을 치유하거나, 실질적으로 예방하거나, 또는 상태를 개선시키는 것을 포함할 수 있으며, 암으로부터 비롯된 한 가지 증상 또는 대부분의 증상을 완화시키거나, 치유하거나 예방하는 것을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 '을 포함하는(comprising)'이란 '함유하는(including)’또는 ‘특징으로 하는(characterized by)’과 동일한 의미로 사용되며, 본 발명에 따른 조성물 또는 방법에 있어서, 구체적으로 언급되지 않은 추가적인 구성 성분 또는 방법의 단계 등을 배제하지 않는다. 또한 용어 ‘로 이루어지는(consisting of)’이란 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소, 단계 또는 성분 등을 제외하는 것을 의미한다. 용어 ‘필수적으로 이루어지는(essentially consisting of)’이란 조성물 또는 방법의 범위에 있어서, 기재된 물질 또는 단계와 더불어 이의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계 등을 포함할 수 있는 것을 의미한다.
따라서, 본 발명이 제공하는 이중 돌연변이를 가지는 인간 인터페론-베타 변이체는 우수한 인터페론 베타의 활성을 가지면서 정제과정 상의 효율도 매우 향상되어 이를 활용한 치료제 생산에 유용하게 활용이 될 수 있다.
또한, 본 발명의 인간 인터페론-베타 R27T 변이체의 안정성을 향상시키는 방법에 따르면, 인간 인터페론-베타의 27번째 아미노산인 아르기닌이 트레오닌으로 치환된 인간 인터페론-베타 R27T 변이체의 활성은 유지되면서 정제과정, 보관과정 및 냉동/해동 과정에서의 단백질 안정성이 향상되어 제조 및 유통과정에서의 단백질 품질이 균일하게 보장될 수 있다.
도 1은 단백질 발현 DNA 제작 실험에서 PCR 조건에 관한 것이다.
도 2는 단백질 발현 DNA 제작 실험에서 제한효소 처리 및 클로닝에 관한 것이다.
도 3은 단백질 발현 DNA 제작 실험에서 T4 DNA ligase(NEB)를 사용한 클로닝의 진행에 관한 것이다.
도 4는 단백질 발현 DNA 제작 실험에서 colony PCR 조건에 관한 것이다.
도 5a 및 도 5b는 ABN 101(NT) 및 ABN 101(CS) 형질 도입 후 세포 생존율 관찰 결과에 관한 것이다 (ABN 101(NT) : R27T 돌연변이 인터페론-베타, ABN 101(CS) : C17S, R27T 이중 돌연변이 인터페론-베타).
도 6a 및 도 6b는 ABN 101(NT) 및 ABN 101(CS) 50ml scale Fed-batch 결과에 관한 것이다.
도 7은 ABN 101(NT) 및 ABN 101(CS) 1L scale Fed-batch 결과에 관한 것이다.
도 8은 인터페론-베타 변이체 안정성 확인 실험에서 농축 및 버퍼 교환에 관한 것이다.
도 9a 및 도 9b는 인터페론-변이체 RP-HPLC 결과에 관한 것이다.
도 10a 내지 도 10d는 인터페론-변이체 버퍼 교환 시 Monomer 함량 변화에 관한 것이다.
도 11a 내지 도 11f는 인터페론-변이체의 20mM Na-Pi 버퍼에서 F/T 안정성 비교 확인에 관한 것이다.
도 12a 내지 도 12c는 인터페론-변이체의 20mM Na-OAc 버퍼에서 F/T 안정성 비교 확인에 관한 것이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
R27T mutation human interferon beta-1a 인 ABN 101(NT)과, R27T 및 C17S double mutation 형태인 ABN 101(CS)를 제작하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
실험방법
1. 단백질 발현 DNA 제작
ABN 101(NT)와 ABN 101(CS)를 pD2535nt-HDP vector의 human promoter 뒤에 클로닝하기 위해 XbaI과 PacI enzyme 제한효소 부위를 추가한 프라이머를 디자인하였으며, 시퀀스는 다음과 같다.
Forward: 5'-gg tctagagccaccAtgacca-3' (서열번호 4)
XbaI
Reverse: 5'-cacttagggattaattaatcagttcctcaggtag-3' (서열번호 5)
PacI
두 insert는 119번의 DNA 시퀀스만 변경하여 cysteine을 serine으로 변경하였기 때문에 클로닝을 위한 프라이머는 공통으로 사용하였다. 두 insert는 AccuPower PCR PreMix(Bioneer)를 통해 증폭시켰으며 PCR 조건은 하기 도 1과 같다.
PCR을 통해 얻은 PCR product는 0.8% agarose gel을 통해 size 확인을 하였고, MEGAquick-spin쪠 Plus Total Fragment DNA Purification Kit(Intron)을 사용하여 gel extraction을 진행하였다. purification까지 진행한 PCR product와 pD2535nt-HDP vector를 하기 도 2와 같이 제한효소를 처리하여 클로닝을 진행하였다. 제한효소와 그 버퍼는 모두 ThermoFisher 제품을 사용했다.
제한효소 처리 후, MEGAquick-spin쪠 Plus Total Fragment DNA Purification Kit(Intron)를 사용하여 순수한 DNA 조각만을 얻어 클로닝 효율을 높이고자 했으며, purification 진행 후, T4 DNA ligase(NEB)를 하기 도 3과 같이 사용하여 클로닝을 진행하였다.
Ligation 후, DH5a Chemically Competent E. coli(Enzynomics) 제품을 사용하여 transformation을 진행하였다. 먼저 DH5a cell을 얼음 안에서 천천히 녹인 뒤 20 ㎕의 반응물을 전부 넣고 30분간 ice에 놓는다. 그리고 42℃에서 heat shock을 30초 준 뒤 2분간 ice에서 안정화시킨다. 400 ㎕ SOC media(enzynomics 제공)를 넣고 1시간동안 37℃ shaking incubation 시킨다. Healing이 끝나면 3000rpm에 3분간 centrifuge를 진하고 50 ㎍ kanamycin이 들어간 LB 배지에 세포를 도말한뒤 37℃에서 overnight으로 세포를 키운다. Plate에 뜬 colony를 떼어 클로닝이 되었는지 확인하기 위해 colony PCR을 진행한다. 최대한 다른 콜로니와 겹치지 않은 single colony를 10p tip을 사용하여 긁어낸 다음 AccuPower PCR PreMix(Bioneer) tube 안에 묻힌다. Horizon에서 제공한 pD2535nt-HDP vector의 colony PCR 용 프라이머를 가지고 PCR을 진행하였으며 조건은 하기 도 4와 같다.
PCR 산물은 0.8% agarose gel을 통해 size를 확인하여 cloning의 완료 여부를 확인하였으며, 클로닝이 완료된 pD2535nt-HDP::ABN101(NT)와 pD2535nt-HDP::ABN101(CS)는 nucleobond Xtra Maxi Plus(MACHEREY-NAGEL)를 통해 CHO-K1 cell transfection용 DNA prep을 진행하였다.
2. 형질 도입
발현 플라스미드를 가지고 있는 대장균을 100 ㎍/mL의 kanamycin이 들어있는 LB 배지에서 배양하여 수확하였고, QIAGEN Plasmid Midi prep kit을 이용하여 DNA를 분리하였다. 분리된 DNA 50 ㎍에 10x cutsmart buffer 30 ㎕, NrU1-HF 제한효소 2.5 ㎕를 첨가하여 최종 300 ㎕ 부피로 만든다. 그 다음 37℃에서 2시간동안 incubation하여 선형화한다. 2시간 뒤에 1/10 부피의 3M, pH5.5 sodium acetate solution 30 ㎕과 750 ㎕ 부피의 ice-cold 에탄올을 첨가하여 -80℃에서 overnight incubation을 진행한다. 다음 날 에탄올 침전을 시킨 DNA를 centrifuge 및 70% 에탄올 wash 과정을 거쳐 순도 높은 DNA를 확보하고 Nanodrop을 이용하여 농도를 측정한다. 형질도입을 위하여 첫 날, L-Glutamine 이 4 mM 농도로 첨가된 CDFortiCHO 배양액을 이용하여 CHO-K1 세포를 3x10 5/ml이 되도록 E125 shake flask에 seed하여 37℃ 5% CO 2, 125rpm 조건으로 24시간 배양한다. 둘째 날, 첫 날 seed 한 세포수를 측정하여 5x10 5/ml이 되도록 seed하여 37℃ 5% CO 2, 125rpm 조건으로 24시간 배양한다. 셋째 날, seed한 세포수를 측정하여 1x10 6/ml에 도달하였는지 확인하고, 도달하였을 경우, 1x10 6/ml로 최종 seed하여 형질도입을 준비한다. OptiPRO SFM 배지 600ul에 각각 선형화시킨 DNA 37.5 ㎍와 Freestyle MAX reagent 37.5 ㎕를 첨가하여 5분간 상온에서 반응시킨다. 그 다음 DNA가 들어있는 혼합물을 Freestyle MAX reagent가 들어있는 혼합물에 옮겨 섞고 다시 상온에서 25분간 반응시킨다. 반응이 끝난 DNA-lipid 혼합물을 앞에서 seed한 CHO-K1 세포에 조심스럽게 첨가한다. 37℃ 5% CO 2, 125rpm 조건으로 48시간 배양하여 형질도입을 진행한다. 형질 도입 48시간 후, MSX(methionine sulfoximine)저항세포 선별을 시작한다. 25, 50uM 농도의 MSX가 첨가 된 선별배지에서 약 25일 동안 배양하면서, 형질이 완전히 도입된 세포를 배양 및 2-3일에 한 번씩 모니터링한다. 2-3일 마다 모니터링하면서 생존율이 70%이상 및 생존 세포수가 0.5-1.2x10 6/ml에 도달하게 되면 이 세포들을 pool로 선정하여 37℃ 5% CO 2, 125rpm 조건으로 선별배지 상에서 suspension culture를 3계대 이상 진행하면서 세포를 안정화시킨다.
3. Fed-batch
앞서 형질 도입하여 제작한 pool 상태의 세포를 이용하여 Fed-batch를 수행한다. MSX가 없는 CDFortiCHO 배지를 이용하여 세포를 3x10 5/ml이 되도록 50ml을 E250 shake flask에 seed하여 37℃ 5% CO 2, 125rpm 조건으로 약12일 간 배양한다. 이때, cedex bio를 이용하여 세포 배양액의 글루코오즈 대사체를 분석하고, 세포의 생존율과 생존세포수를 측정한다. 3, 5, 7일 차에 5%(V/V)의 CD Efficient Feed C+ 용액을 첨가하고, 4, 6일 차에 45% Glucose solution을 첨가하여 준다. Fed-batch 가 종료된 후에는 배양액을 centrifuge 하여 상층액만 취하여 냉장 혹은 냉동 조건에서 보관한다.
4. Interferon beta-1a 생물학적 활성 확인(ELISA)
제작한 발현 세포주로 human Interferon beta-1a가 발현한 단백질이 어느 정도의 생물학적 활성을 가지는지 TORAY사의 HuIFN-β ELISA KIT를 사용하여 분석을 한다. Fed-batch로 확보한 배양액은 KIT 내의 Diluent를 이용하여 초기 10,000배 희석하여 2배씩 serial dilution하여 1,280,000 배 희석 샘플까지 준비한다. KIT내의 생물학적 활성 측정용 standard 물질을 protocol에 따라 200IU/ml부터 3.125IU/ml 까지 diluent를 이용하여 준비한다. ELISA 플레이트는 KIT 내의 wash buffer를 이용하여 priming하여 준비한다. Priming 후 ELISA 플레이트에 준비된 샘플 및 standard 물질을 100ul/well로 첨가하고, 각 well에 HRP-conjugated antibody를 50ul/well로 첨가한다. 플레이트는 27℃에서 2시간동안 incubation하여 반응시킨다. 반응 종료 후 플레이트를 wash 한 뒤, 발색시약을 100ul/well로 첨가하여 27℃에서 30분 동안 incubation하여 발색반응을 유도한다. 그 다음 발색 반응을 종료하기 위해 stop solution을 100ul/well로 첨가하고, spectrophotometer기기를 이용하여 측정 450nm/참조 620nm 파장에서 플레이트 detection을 진행한다. 여기서 얻어진 흡광도를 기반으로 4-parameter 방법을 사용하여 standard curve를 그리고 샘플의 생물학적 활성을 환산한다. Standard curve에서 환산하여 얻은 샘플의 활성에 희석배수를 곱하여 다시 원래 샘플의 생물학적 활성을 확인한다.
5. Interferon beta-1a 발현(농도) 확인(ELISA)
제작한 발현 세포주로 human Interferon beta-1a가 발현한 단백질이 어느 정도로 발현되었는지 확인하기 위해 TORAY사의 HuIFN-β ELISA KIT를 사용하여 분석을 한다. 생물학적 활성 확인법과 동일하게 Fed-batch로 확보한 배양액을 KIT 내의 Diluent를 이용하여 초기 10,000배 희석하여 2배씩 serial dilution하여 1,280,000 배 희석 샘플까지 준비한다. 기존 자사 reference standard 물질을 2.5ng/ml부터 0.039ng/ml 까지의 농도로 2배씩 serial dilution 하여 준비한다. 이후의 ELISA 실험과정은 상기 생물학적 활성 확인 ELISA 실험 방법과 동일하다. 얻어진 흡광도를 기반으로 4-parameter 방법을 사용하여 standard curve를 그리고 샘플의 Interferon beta-1a 발현량을 환산한다. Standard curve에서 환산하여 얻은 발현량에 희석배수를 곱하여 다시 원래 샘플의 농도를 확인한다.
6. 인터페론-베타 변이체의 정제
상기 실시예에서 제작한 세포주를 셀 팩토리 (cell factory; Nunc사, Cat No. 170069)를 사용하여 배양하였다. 10% FBS가 포함된 alpha-MEM 배지로 각 발현세포주를 5X10 4세포/㎖로 셀 팩토리에 계대하고, 5% CO 2, 37℃에서 72시간 동안 배양하여 세포성장을 확인하였다. PBS로 3회 세척하여 혈청성분을 최대한 제거하고 무혈청 배지(Sigma C8730)으로 교체하였다. 무혈청 배지로 교체한 후 24시간 마다 배양액을 수확하고, 새로운 무혈청 배지를 첨가하였다. 총 4회 동안 배양액을 수확하였고 이를 정제하였다. 블루 세파로즈 레진(Amersham-Pharmacia) 200 ㎖를 XK50/20 칼럼 (Amersham-Pharmacia)에 충진 후 완충액 A (20mM 인산나트륨, 1M NaCl, pH 7.4)를 10 C.V.(column volume) 흘려주어 평형상태에 도달하게 하였다. 평형상태의 칼럼에 제균여과한 배양액을 20 ㎖/min유속으로 흘려주었고, 파장 280nm의 UV 검출기를 연결하여 모니터링 하였다. 완충액 B (20mM 인산나트륨, 1M NaCl, 30% Ethylen Glycol, pH 7.4)로 컬럼에 흘려주어 미흡착 성분을 세척하였고, 완충액 C (20mM 인산나트륨, 1M NaCl, 60% Ethylen Glycol, pH 7.4)로 레진에 붙은 단백질을 용출하였다. 용출액을 PBS(Phosphate Buffered Saline)으로 투석하였고, 농축기(Centricon, Cut off 10,000)로 농축하고 PBS(Phosphate Buffered Saline)으로 투석하였다.
7. 인터페론-베타 R27T 변이체 및 인터페론-베타 이중 변이체(R27T 및 C17S)의 2 당화 정제 효율 비교
블루 세파로즈 레진을 이용하여 정제한 인터페론-베타 변이체(ABN 101(NT))와 인터페론-베타 이중 변이체(ABN 101(CS))를 각각 Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography (RP-HPLC)를 이용하여 2당화 형태의 인터페론-베타 변이체 함량을 측정하였다.
각각의 인터페론 변이체를 0.5 mg/mL로 희석한 후, acetonitrile (ACN)을 초기 이동상 비율로 섞은 후 분석하였다. RP-HPLC 분석은 YMC-C4 column으로 분석하였으며, 이에 사용한 용매는 각각 다음과 같다. 이동상 A는 0.1% trifluoroacetic acid (TFA)를 3차 증류수에 섞은 후 0.2 ㎛ PVDF filter 후 1시간 탈기하여 사용하였다. 이동상 B는 0.1% TFA를 ACN에 섞은 후 0.2 ㎛ PVDF filter 후 1시간 가량 탈기하여 사용하였다.
분석 조건은 다음 표에 표기하였다.
Parameter Condition
Column TMC Pack C4, 4x250 mm, 5 ㎛
Column Temperature 25 ℃
Flow Rate 1.0 mL/min
Autosampler Temperature 4 ℃
Wavelength 214 nm or 280 nm
Injection Volume 50 ㎕
Time (min) Eluent A (%) Eluent B (%)
0.0 70.0 30.0
1.0 70.0 30.0
18.0 45.0 55.0
18.1 0.0 100.0
22.0 0.0 100.0
22.1 70.0 30.0
30.3 70.0 30.0
8. 버퍼 조성 변경에 따른 인터페론-베타 변이체 안정성 확인
블루 세파로즈 레진을 이용하여 정제한 인터페론-베타 변이체(ABN 101(NT))와 인터페론-베타 이중 변이체(ABN 101(CS))를 각각 centricon을 이용하여 버퍼를 치환하였다. 인터페론 약물의 버퍼 치환 시 발생하는 응집현상에 의해 품질이 저하되는 정도를 확인하기 위하여, 블루 세파로즈 레진으로부터 용출된 각각의 단백질을 얻은 후, centricon에서 20 mM sodium phosphate (pH2.9) 버퍼를 이용하여 농축 및 버퍼 교환을 약 7배 volume ratio로 수행하였다. Centricon으로 버퍼 교환을 완료한 후 0.2 ㎛ PES syringe filter를 거친 후 UV spectrophotometer로 280 nm 파장에서 단백질 농도를 측정하여 그 회수율을 확인하였다.
또한, 다른 제형 버퍼에 대한 저장 안정성을 확인하기 위하여, 20 mM phosphate (pH2.9)로 버퍼 교환을 완료한 단백질을 다시 각각 centricon을 이용하여 20 mM sodium acetate (pH3.8)로 같은 volume ratio 수준으로 버퍼 교환을 하여 그 수율을 확인하였다. 상기 과정을 도 8에 나타내었다.
9. 버퍼 조성 변경에 따른 Freeze/thawing 보관 안정성 확인
Freeze/thawing 안정성을 확인하기 위하여, 각각의 버퍼로 조성된 인터페론 약물을 -70℃에서 12시간 이상 freezing하고, 25℃에서 4시간 thawing하는 freeze/thawing cycle을 3회 또는 5회까지 수행한 후 Size Exclusion High Performance Liquid Chromatography (SEC-HPLC) 분석을 수행하여 high molecular weight (HMWs) 로 분석되는 응집현상과 low molecular weight (LMWs)로 분석되는 degradation 형태의 비율을 확인하여 해당 단백질의 단량체(monomer) 변화율을 분석하여 인터페론-베타 변이체의 보관 안정성을 측정하였다. SEC-HPLC는 Tosoh社의 size exclusion column (TSKG2000)을 이용하였으며 사용한 용매는 다음과 같다. 이동상 A는 3차 증류수를 0.2 ㎛ PVDF filter 후 1시간 탈기하여 사용하였으며, 이동상 B는 (150 mM sodium chloride, 100 mM sodium phosphate dibasic dihydrate)를 3차 증류수에 혼합한 후 Phosphoric Acid로 pH 7.0으로 적정하고 0.2 ㎛ PVDF filter한 후 탈기하여 사용하였다.
분석 조건은 다음 표에 표기하였다.
Parameter Condition
Column TSKgel G2000SKxL, 7.8mm x 300mm
Column Temperature 25 ℃
Flow Rate 0.5 mL/min
Autosampler Temperature 4 ℃
Wavelength 214 nm or 280 nm
Injection Volume Sample : 50 ㎕
GFS : 10 ㎕
Time (min) Eluent A (%) Eluent B (%)
0.0 0.0 100.0
40.0 0.0 100.0
결과 및 해석
1. ABN 101(NT) 및 ABN 101(CS) 유전자 형질 도입 후 MSX 농도에 따른 pool 개발결과
pD2535nt-HDP vector에 cloning 한 DNA를 CHO-K1 세포에 형질 도입한 뒤, 48 시간 후 세포의 수와 생존율을 확인하였으며, 이를 기반으로 MSX 두 가지 농도로 저항세포 선별을 25일 동안 진행하였다. 그 결과 ABN 101(NT)이 ABN 101(CS) 보다 먼저 저항세포를 획득하였으며, ABN 101(CS) 50uM 의 경우 최종 3x10 5/ml의 생존세포수와 48%의 생존율을 보이면서 가장 더디게 저항세포를 획득하는 것을 확인하였다. 생존율이 낮지만, interferon beta-1a의 발현에 따른 생장성 및 생존율에 영향일 것으로 판단하였다. 상기의 결과를 하기 도 5a 및 도 5b에 나타내었다.
2. ABN 101(NT) 및 ABN 101(CS) pool 상태에서의 fed-batch 결과
Pool 상태의 세포로 50ml small scale Fed-batch를 수행한 결과는 다음과 같다. ABN 101(NT) pool과 ABN 101(CS) pool 모두 MSX 농도 25uM보다 50uM인 pool에서 생존율이 더 오래 유지되는 것을 확인하였으며, 두 pool 모두 MSX 농도 25uM보다 50uM인 pool에서 생존 세포수가 더 적게 유지됨을 확인하였다. 그러나 MSX 농도 25uM보다 50uM인 pool에서 생존 세포수가 더 적게 유지되는데도 불구하고, Fed-batch 마지막 일자의 배양액 Interferon beta-1a의 생물학적 활성은 더 높게 나타났으며, ABN 101(NT) pool 보다 ABN 101(CS) pool의 생물학적 활성이 2배 이상 높음을 확인할 수 있었다. 상기의 결과를 하기 도 6a 및 도 6b에 나타내었다.
3. ABN 101(NT) 및 ABN 101(CS) pool의 1L scale fed-batch 결과
앞서 small scale의 fed-batch 결과를 토대로, MSX 농도 50uM인 pool을 이용하여 1L scale fed-batch를 수행하였다. 그 결과, 배양 4일차의 생물학적 활성은 ABN 101(NT)의 경우 0.69MIU/ml, ABN 101(CS)의 경우 5.99MI/ml로 ABN 101(CS)의 생물학적 활성이 약 8.6배 더 높은 것을 확인하였다. 배양 12일차의 생물학적 활성을 비교해 보았을 때도 ABN 101(CS)의 생물학적 활성이 약 4.5배 더 높은 것을 확인하였다. 상기의 결과를 하기 도 7에 나타내었다.
4. 인터페론-베타 변이체의 정제 결과
인터페론-베타 변이체의 정제 결과, 기존의 인간 인터페론-베타에 비해 정제 효율이 더 높게 나타났다. 이로써 17번째 아미노산인 시스테인이 세린으로 치환되고 27번째 아미노산인 아르기닌이 트레오닌으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 인간 인터페론-베타 변이체가 정제 효율이 더 높다는 것을 확인하였다.
5. 인터페론-베타 R27T 변이체 및 인터페론-베타 이중 변이체 (R27T 및 C17S)의 2 당화 정제 비율 결과
블루 세파로즈 레진을 이용하여 정제된 각각의 인터페론-베타 변이체를 각각 2당화 : 1당화 함량을 분석하였다. 그 결과 하기의 표 5 및 도 9a 및 도 9b에서 보듯이, ABN 101(CS) 이중 변이체의 2 당화 함량이 ABN 101(NT)보다 약 10% 높은 것을 확인하였다. 각 물질의 생물학적 활성을 ELISA를 통해 비교하였을 때 큰 차이는 없었으나, 같은 scale에서 인터페론-베타 변이체를 발현, 정제하였을 때 2당화 형태의 단백질 정제 효율이 높은 것을 확인하였다.
Material 2 glycosylation 1 glycosylation MIU/mg
ABN 101(NT) 82.8 17.1 351
ABN 101(CS) 93.1 6.9 360
6. 버퍼 조성 변경에 따른 인터페론-베타 변이체 안정성 결과
인터페론-베타 변이체의 버퍼 조성별 안정성 확인을 위해, centricon으로 버퍼별 교환을 통해 단백질 회수율과 SEC-HPLC 분석을 수행하였다. 각 단백질을 정제한 후 20 mM sodium phosphate (pH2.9)로 버퍼 교환하였을 때, 그 회수율은 하기의 표 6와 같이 ABN 101(CS)에서 높은 것을 확인하였다.
Material Initial Conc.
(mg/mL)		 20mM Na-Pi
(mg/mL)		 Recovery (%)
ABN 101(NT) 0.56 (30mL) 1.1 (8mL) 52
ABN 101(CS) 0.40 (15mL) 0.7 (8mL) 93
또한, 해당 버퍼로 교환된 각각의 단백질을 다시 다른 제형 기반의 버퍼로 치환하기 위하여 같은 방법으로 centricon을 이용하여 20 mM sodium acetate (pH3.8)로 버퍼를 치환하여 회수율을 확인하였다. 그 결과 표 7에서와 같이 acetate 기반의 버퍼로 교환할 때 역시 ABN 101(CS)의 회수율이 ABN 101(NT)보다 높은 것을 확인하였다. 이는 이중 변이체에 의한 안정성 증가에 의해 centricon과 같은 물리적 요인으로부터 단백질 구조적 안정성으로 해석된다.
Material Initial Conc.
(mg/mL)		 20mM Na-OAc
(mg/mL)		 Recovery (%)
ABN 101(NT) 1.1 (1mL) 0.86 (1mL) 78
ABN 101(CS) 1.7 (1.1mL) 1.7 (1mL) 91
각 버퍼 조성 변경 별 단백질 회수율과 monomer 분석결과는 하기의 표 8 및 도 10a 내지 도 10d에 나타내었다.
Material 20mM Na-Pi
(Monomer %)		 20mM Na-OAc
(Monomer %)		 Monomer
Recovery (%)
ABN 101(NT) 86.8% 80.4% 92.6
ABN 101(CS) 98.1% 90.2% 91.8
7. 버퍼 조성 변경에 따른 Freeze/thawing 안정성 결과
인터페론-베타 변이체의 버퍼 조성별 Freeze/thawing 안정성 확인을 위해, 각각 치환된 버퍼 형태의 인터페론-변이체를 각각 3회 또는 5회 동결-융해를 반복하여 수행하여 SEC-HPLC 분석을 통해 단량체 변화율을 확인하였다. 그 결과, 20 mM sodium phosphate (pH2.9)기반의 버퍼로 보관하여 동결-융해를 반복한 후 monomer 분석하였을 때, 두 인터페론-베타 변이체간의 차이는 크지 않았다(표 9, 표 10 및 도 11a 내지 도 11f 참조).
ABN 101(NT) HMWs (%) Monomers (%) LMWs (%)
F/T 1cy 5 76 19
F/T 3cy 6 76 18
F/T 5cy 5 77 18
ABN 101(CS) HMWs (%) Monomers (%) LMWs (%)
F/T 1cy 8 89 3
F/T 3cy 11 86 3
F/T 5cy 13 84 3
그러나, 20 mM sodium acetate (pH3.8)로 버퍼를 교환한 후 동결-융해 시험을 수행하여 분석한 결과, ABN 101(CS)는 단량체 함량을 유지하였으나, ABN 101(NT)는 HMWs가 ABN 101(CS)에 비해 급격하게 증가(5배 증가) 하였다(표 11, 표 12 및 도 12a 내지 도 12c 참조). 이 결과를 통해 ABN 101(CS)의 이중 변이체의 안정성 증가 효과로 인하여, acetate 기반의 인터페론-변이체 약물의 보관 불안정성을 보완할 수 있을 것으로 예상할 수 있다.
ABN 101(NT)
(20mM Na-OAc)		 HMWs (%) Monomers (%) LMWs (%)
Origin 10 80 < 10
F/T 3cy 28 63 < 9
ABN 101(CS)
(20mM Na-OAc)		 HMWs (%) Monomers (%) LMWs (%)
Origin 9 90 < 1
F/T 3cy 5 94 < 1
따라서, 본 발명은 인간 인터페론-베타의 27번째 아미노산인 아르기닌이 트레오닌으로 치환되고 17번째 아미노산인 시스테인이 세린으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 인간 인터페론-베타 변이체를 제공한다. 본 발명은 정제 효율이 향상된 인간 인터페론-베타 변이체를 제공하여 이를 활용한 치료제 생산에 유용하게 활용이 될 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 우수하다.

Claims (21)

  1. 인간 인터페론-베타의 17번째 아미노산인 시스테인이 세린으로 치환되고 27번째 아미노산인 아르기닌이 트레오닌으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 인간 인터페론-베타 변이체.
  2. 제1항의 인간 인터페론-베타 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 인간 인터페론-베타 변이체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 인간 인터페론-베타 변이체인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  4. 제2항 기재의 폴리뉴클레오티드를 포함함으로써 동물 세포에서 인간 인터페론-베타를 발현시키는 발현 벡터.
  5. 제4항 기재의 발현 벡터로 형질 전환된 동물 세포.
  6. 제5항 기재의 동물 세포를 배양하는 단계를 포함하는 인간 인터페론-베타 변이체의 제조 방법.
  7. 제1항의 인간 인터페론-베타 변이체를 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물로서,
    상기 약제학적 조성물은 천연형 인간 인터페론-베타가 가지는 약리 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물은 천연형 인간 인터페론-베타가 가지는 약리 효과를 가지고, 그 약리 효과는 다발성 경화증, 암, 자가 면역 장애, 바이러스 감염, HIV와 관련된 질병, C형 간염으로 구성된 군에서 선택되는 질병의 예방 또는 치료의 약리 효과인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  9. 인간 인터페론-베타의 27번째 아미노산인 아르기닌이 트레오닌으로 치환된 인간 인터페론-베타 R27T 변이체의 17번째 아미노산인 시스테인을 세린으로 치환하는 단계를 포함하는, 인간 인터페론-베타 R27T 변이체의 안정성을 향상시키는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 인간 인터페론-베타 R27T 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 안정성은 정제 안정성, 보관 안정성 및 냉동/해동 안정성으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 정제 안정성은 2당화(glycosylation) 단백질의 정제 효율 향상인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 정제 안정성은 농축 및 완충액 교환시(buffer exchange) 단백질 응집현상(aggregation) 및 분해(degradation) 감소인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 보관 안정성은 pH 2.0 내지 6.0의 완충액에서의 보관 안정성인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 완충액은 아세트산, 인산, 암모니움 카보네이트, 암모니움 포스페이트, 붕산, 시트르산, 락트 산, 포타슘 시트레이트, 포타슘 메타포스페이트, 포타슘 포스페이트 일염기, 소듐 아세테이트, 소듐 시트레이트, 소듐 락테이트 용액, 이염기 소듐 포스페이트, 일염기 소듐 포스페이트, 비카보네이트, 트리스 (트리스(히드록시메틸)아미노메탄), MOPS (3-(N-모르폴리노)프로판술폰 산), HEPES (N-(2-히드록시에틸)피페라진-N'-(2-에탄술폰 산), ACES (2-(2-아미노-2-옥소에틸)아미노에탄술폰 산), ADA (N-(2-아세트아미도)2-이미노디아세트 산), AMPSO (3-(1,1-디메틸-1,2-히드록시에틸아미노-2-프로판술폰 산), BES (N,N-비스(2-히드록시에틸)-2-아미노에탄술폰 산, 비신 (N,N-비스(2-히드록시에틸글리신), 비스-트리스 (비스-(2-히드록시에틸)이미노-트리스(히드록시메틸)메탄, CAPS (3-(사이클로헥실아미노)-1-프로판술폰 산) , CAPSO (3-(사이클로헥실아미노)-2-히드록시-1-프로판술폰 산), CHES (2-(N-사이클로헥실아미노)에탄술폰 산), DIPSO (3-N,N-비스(2-히드록시에틸아미노-2-히드록시-프로판술폰 산), HEPPS (N-(2-히드록시에틸피페라진)-N'-(3-프로판술폰 산), HEPPSO (N-(2-히드록시에틸)피페라진-N'-(2-히드록시프로판술폰 산), MES (2-(N-모르폴리노)에탄술폰 산), 트리에탄올아민, 이미다졸, 글리신, 에탄올아민, 포스페이트, MOPSO (3-(N-모르폴리노)-2-히드록시프로판술폰 산), PIPES (피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰 산), POPSO (피페라진-N,N'-비스(2-히드록시프로판술폰 산), TAPS (N-트리스히드록시메틸)메틸-3-아미노프로판술폰 산), TAPSO (3-N-트리스(히드록시메틸)메틸아미노-2-히드록시-프로판술폰 산), TES (N-트리스(히드록시메틸)메틸-2-아미노에탄술폰 산), 트리신 (N-트리스(히드록시메틸)메틸글리신), 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올, 및 2-아미노-2-메틸-1-프로판올로 이루어진 군에서 선택된 완충액인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제11항에 있어서, 상기 냉동/해동 안정성은 -100℃내지 -10℃에서의 냉동 후 해동 안정성인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제11항에 있어서, 상기 냉동/해동 안정성은 아세트산 완충액에서의 냉동/해동 안정성인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제11항에 있어서, 상기 냉동/해동 안정성은 3회 이상의 냉동/해동 사이클 후 단백질의 응집현상(aggregation) 및 분해(degradation) 감소인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 다발성 경화증, 암, 자가 면역 장애, 바이러스 감염, HIV와 관련된 질병, C형 간염으로 구성된 군에서 선택되는 질병에 대한 천연형 인간 인터페론-베타가 가지는 약리 효과를 갖는 제제를 제조하기 위한 제1항의 인간 인터페론-베타 변이체의 용도.
  20. 천연형 인간 인터페론-베타가 가지는 약리 효과를 가지며, 제1항의 인간 인터페론-베타 변이체를 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 다발성 경화증, 암, 자가 면역 장애, 바이러스 감염, HIV와 관련된 질병, C형 간염으로 구성된 군에서 선택되는 질병 치료 방법.
  21. 서열번호 1의 인간 인터페론-베타의 17번째 아미노산인 시스테인이 세린으로 치환되고 27번째 아미노산인 아르기닌이 트레오닌으로 치환되고, 서열번호 1의 야생형 인터페론 베타와 90%이상의 서열 상동성을 가지며, 인터페론 베타의 활성을 가지는 인간 인터페론-베타 변이체.
PCT/KR2021/005487 2020-04-29 2021-04-29 이중 돌연변이를 가지는 인간 인터페론-베타 변이체 및 인간 인터페론-베타 변이체의 안정성을 향상시키는 방법 WO2021221485A1 (ko)

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