WO2016013911A1 - 페길화된 인터페론 -베타 변이체 - Google Patents

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WO2016013911A1
WO2016013911A1 PCT/KR2015/007754 KR2015007754W WO2016013911A1 WO 2016013911 A1 WO2016013911 A1 WO 2016013911A1 KR 2015007754 W KR2015007754 W KR 2015007754W WO 2016013911 A1 WO2016013911 A1 WO 2016013911A1
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ifn
mpeg
disease
pegylated ifn
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PCT/KR2015/007754
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신영기
김영덕
송경
나동희
정성훈
김대덕
윤인수
이희정
이세형
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에이비온 주식회사
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Definitions

  • the present invention relates to pegylated interferon-beta variants.
  • Interferons are a type of cytokine that exhibit antiviral activity, inhibit cell proliferation, and regulate natural immune responses.
  • Dual interferon-beta is a 22 kDa globular protein with five alpha helices, resulting in 18 kDa when sugar chains are removed (Arduini et al., Protein Science 8: 1867-1877C 1999).
  • IFN- ⁇ has Hing-I virus activity, cellular sign-inhibition or Hing growth activity, lymphocyte cytotoxicity activity, immunomodulatory activity, target cell differentiation induction or inhibition activity, macrophage activation activity, cytokine production
  • Various immunological activities such as increased activity of cytotoxic T cells, increased activity of cytotoxic T cells, steam-activation of natural killing cells, cancer, autoimmune and viral infections, and HIV-related diseases. It has been reported to be effective in the treatment of hepatitis C, rheumatoid arthritis, etc.
  • the present inventors earnestly researched to develop IFN— ⁇ variants in which the therapeutic effects against various diseases were greatly improved by further improving the immunomodulatory activity, cell proliferation inhibitory activity, and anti-viral activity of IFN ⁇ ⁇ .
  • 3 ⁇ 4r3 ⁇ 4 ⁇ conjuggate
  • polyethyleneglycol derivatives were bound to IFN- ⁇ variants that substituted specific amino acids or induced bisulfation
  • improved pharmacokinetics compared to native IF ⁇ N- ⁇ and nonpegylated IFN— ⁇ variants By confirming that it has a pharmacokinetic profile and pharmacological properties. I have completed the present invention.
  • An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of hyperprol i ferative disease, inflammatory disease, autoimmune disease or viral infection disease.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating a hyperproliferative disease, an inflammatory disease, an autoimmune disease or a viral infection.
  • the invention is a PEGylated (PEgylated) IFN- ⁇ (interferon-beta) variant, wherein the IFN- ⁇ variant is CH 3 0- (CH 2 to the amine group, carboxyl group or Cys residue thereof CH 2 0) n (n is an integer from 2-4000) is carbonyl, PEGylated IFNs covalently linked through amides, urethanes, secondary amines, thioethers, disulfides or hydrazones, and PEGylated, consisting of an amino acid sequence in which the 27th Arg residue in SEQ ID NO: 1 is substituted with another amino acid Provides one ⁇ variant.
  • the present inventors have further improved the immunomodulatory activity, cell proliferation inhibitory activity and anti-viral activity of iFN- ⁇ , thereby significantly improving the therapeutic effect against various diseases .
  • I have worked hard to develop a variant.
  • conjugates in which polyethyleneglycol derivatives were conjugated to IFN- ⁇ variants that substituted specific amino acids-induced bisulfation improved pharmacokinetic profiles and pharmacological properties compared to native IFN— ⁇ and non-pegylated IFN- ⁇ variants. I confirmed that I have-.
  • the amino acid sequence of the first sequence of the sequence moktok is the amino acid sequence of human IFN- ⁇ -.
  • the present invention relates to an IFN- ⁇ variant having an amino acid sequence in which the 27th Arg residue of Sequence Listing 1 is substituted with another amino acid.
  • the scope of the IFN- ⁇ variant of the present invention is also interpreted to include an amino acid sequence showing a substantial identity (substantial identity) with respect to the amino acid sequence in which the 27th residue of the first sequence of SEQ ID NO: 1-.
  • the above substantial identity is at least 80 when the amino acid sequence of the present invention and any other sequence are aligned as closely as possible and the aligned sequence is analyzed using algorithms commonly used in the art.
  • amino acid sequence it shows% homology, more preferably at least 90% homology, even more preferably at least 95% homology.
  • the scope of the IFN- ⁇ variant of the present invention is construed to include amino acid sequence variants with additional mutations in addition to those of the 27th amino acid residue. Such variants include those of the present invention .
  • amino acid sequence of the IFN- ⁇ variant and one or more amino acid residues is meant a protein having a different sequence by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution or a combination thereof.
  • Amino acid exchange in a protein that does not change the activity of the molecule as a whole and peptides are known in the art, itdi -. (H Neurath, RL Hi ll, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).
  • the most commonly occurring exchanges are amino acid residues Ala / Ser, Val / IIe, Asp / Glu, Thr / Ser, Ala / Gly, Ala / Thr, Ser / Asn, Ala / Val, Ser / Gly, Tyr / Phe Ala / Pro . It is an exchange between Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / I le, Leu / Val, Ala / Glu and Asp / Gly.
  • the IFN- ⁇ variant is phosphorylation. It may be modified by sulfation, acrylation, glycosylation, methylation, or farnesylat ion.
  • the IFN- ⁇ variant of the present invention has an amino acid sequence in which the 27th Arg residue of SEQ ID NO: 1 is replaced with Thr or Ser residue.
  • the ⁇ - ⁇ variant of the present invention has an amino acid sequence in which the 27th Arg residue of SEQ ID NO: 1 is substituted with a Thr residue.
  • PEG polyethylene glycol
  • the pulley ethylene glycol derivatives contain various end groups for PEGylation, whereby the polyethylene glycol derivatives are amines of IFN- ⁇ variants via carbonyl, amide, urethane, secondary amines, thioethers, disulfides and hydrazones. It may be covalently linked to a group, carboxyl group or Cys residue.
  • the sing-group PEGylated IFN- ⁇ variant has a mesophilic group at one terminus ; It is formed by PEGylation with a polyethylene glycol derivative having an aldehyde, hydrazide, maleimide, succinimide or 0-pyridyl disulfide (orthopyridyl cHsulfKle) at the other end.
  • the PEGylated IFN— ⁇ variant is formed by PEGylation with a polyethylene glycol derivative represented by Formula 1 below:
  • X is -O0- or S;
  • R 1 is dC 4 alkylene, Ci-C 4 alkyleneoxy, alkyleneoxy C 3 alkylene or CL-C4 alkyleneamino;
  • R 2 is hydrogen, hydrazide, NHS (N-Hydroxysuccinimide), maleimide dC 4 alkylene or 0-pyridyl disulfide C, -C 4 alkylene;
  • R 1 is S and R 2 is 0-pyridinedi-.
  • alkylene means a bivalent radical derived from a straight or branched saturated hydrocarbon group and includes, for example, methylene, ethylene, propylene isopropylene, etc.
  • Cr alkylene Means a divalent radical having an alkylene unit having 1 to 4 carbon atoms, and when the CrC 4 alkylene is bonded, the carbon number of the substituent is not included.
  • alkyleneoxy refers to a bivalent radical formed by the removal of hydrogen bound to oxygen and hydrogen bound to carbon in alcohol, respectively, and when CC and alkyleneoxy are bonded, the number of carbon atoms of the substituent is It is not included.
  • alkyleneamino refers to a bivalent radical formed by gig-geek-removing hydrogen bonded to nitrogen and hydrogen bonded to nitrogen in an alkylamine, when dd alkyleneoxy is absent. The carbon number of a substituent is not included.
  • R 1 of Formula 1 is ethylen 1. ethyleneoxy, ethyleneoxymethylene or ethyleneamino; R 2 is hydrogen. Hydrazide, NHS (N Hydroxysuccinimide), maleimide ethylene or pyridyl disulfide ethylene.
  • polyethyleneglycol derivative of Formula 1 usable in the present invention is as follows:
  • n is an integer of 2 to 4000.
  • the PEG derivative used for PEGylation in the present invention is not particularly limited in its molecular weight.
  • the IFN ⁇ ⁇ variants of the invention are PEGylated with PEG derivatives having a molecular weight of 2-50 kDa, 5-50 kDa or 10-40 kDa.
  • the PEGylation of the IFN— ⁇ variants of the invention is monopeptylation (mon PEGylation).
  • the term "mono-pegylated” means to conjugate a PEG derivative single molecule at a specific position of FNl ⁇ .
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of hyperproliferative diseases, inflammatory diseases, autoimmune vaginal white or viral infection diseases comprising the PEGylated IFN ⁇ ⁇ variant of the present invention as an active ingredient. To provide a composition.
  • the present invention provides a method for preventing or treating a hyperproliferative disease, inflammatory disease, autoimmune disease or viral infection disease, comprising administering the pharmaceutical composition of the present invention to a subject in need thereof. To provide.
  • Human IFN- ⁇ has been used primarily for the treatment of multiple sclerosis, but it is known that it can be used for the treatment of cancer, autoimmune disorders, viral infections, HIV-related diseases and hepatitis C (Pi lling et al., European Journal of Immunology 29: pp 1041-1050, 1999), its pharmacological effects have been reported continuously.
  • compositions of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Sing-gi pharmaceutically acceptable carriers are conventionally used in the preparation, lactose, dextrose, sucrose, sorbol, manny, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatinous silicate, microcrystalline Cellulose, polyvinylpyridone, cellulose, water. Syrups, mesocellulose, methylhydroxythoxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oils, and the like.
  • compositions of the present invention may further comprise lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives and the like, in addition to the sing-based ingredients.
  • lubricants wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives and the like, in addition to the sing-based ingredients.
  • suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).
  • compositions of this invention may be administered orally or non-, oral, in the case of parenteral administration, it can be administered in an intravenous injection, subcutaneous injection muscle injection, peritoneal injection, topical administration, transdermal administration, articular cavity administration such as .
  • the composition of the invention is administered intravenously, subcutaneously or intramuscularly.
  • the composition of the present invention exhibits excellent pharmacokinetic properties during intravenous, subcutaneous and intramuscular injection. (See Fig. 4-6), especially in the case of subcutaneous injection has an AUC of about 1.3 times compared to Rebif l, the administration efficiency is significantly improved compared to the conventional interferin preparation, and the patient convenience in terms of administration is excellent (see Fig. 5). ).
  • hyperproliferative disease encompasses a comprehensive pathologic condition caused by pathological proliferation of cells or excessive neovascularization.
  • hyperproliferative diseases include cancer. Diabetic retinopathy, rheumatoid arthritis, psoriasis, chronic inflammation, atherosclerosis, non-minus, macular degeneration and cardiovascular disease.
  • the hyperproliferative disease to be prevented or treated with the composition of the present invention is cancer.
  • the inflammatory disease to be prevented or treated with the composition of the present Bill-myung is chronic obstructive pulmonary disease, septic shock, glomerulonephritis, Crohn's disease , Ulcerative colitis, atherosclerosis, diabetes and stroke.
  • the autoimmune disease to be prevented or treated with the composition of the present invention is selected from the group consisting of rheumatoid arthritis, psoriasis, allergic dermatitis, multiple sclerosis and asthma.
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention may vary depending on factors such as formulation, method of administration, age of patient, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of excretion and response to response. It may be prescribed.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is, for example, 0.0001-1.00 nig / kg per day.
  • compositions of the present invention may be formulated with pharmaceutically acceptable carriers and / or excipients in a manner that can be readily carried out by one of ordinary skill in the art to which the present invention pertains. It can be prepared by or incorporated into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of extracts, powders, granules, tablets or capsules, and may further include a dispersant or stabilizer.
  • the present invention provides a pegylated IFN- ⁇ variant and a composition for preventing or treating a hyperproliferative disease, inflammatory disease, autoimmune disease or viral infection disease comprising the same as an active ingredient.
  • Pegylated IFN- ⁇ variants of the present invention exhibit superior anti-viral efficacy, immunomodulatory and anti-cell growth efficacy due to superior pharmacokinetic properties compared to native IFN ⁇ ⁇ and non-pegylated IFN- ⁇ variants. It can be usefully used in various diseases (dysproliferative diseases, inflammatory vaginosis, autoimmune diseases and viral infection diseases, etc.).
  • the present invention exhibits excellent pharmacological activity upon administration, and significantly increases the blood half-life of the existing interferon preparation body
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of a process of synthesizing an mPEG-R27T conjugate by selectively conjugating PEG to the N ′ terminus of the IFN- ⁇ variant (R27T).
  • Figure 2 shows the result of confirming the mPEG-R27T conjugates of various sizes produced by SDS-PAGE.
  • FIG. 3 shows the results of analyzing the produced PEG ⁇ R27T conjugate by size exclusion chromatogram by size exclusion chromatogram and calculating the production rate of the mono-mPEG-R27T conjugate.
  • Figure 4 shows the results of pharmacokinetic analysis by administering the mono-mPFXi-20K-R27T and mono-niPEG-40l (-27T conjugate and the control drug intravenously in mice.
  • FIG. 5 shows the results of pharmacokinetic analysis of the prepared monc) -niPEG-20K-R27T and mono-mPEG-40K-R27T conjugates and a control drug by subcutaneous injection in mice.
  • Figure 6 shows the results of the pharmacokinetic analysis of the prepared mono-mPEG-20K-R27T and mono-mPEG-40 -R27T conjugates and the control drug administered to the mice by intramuscular injection.
  • 7 shows the structure of various PEG derivatives used in the present invention.
  • 9a is nionc) -mPEG-20K- secondary isolated by Zorbax-250 chromatography.
  • FIG. 9B shows the SDS-PAGE analysis of the mPEG-20K-SC-R27T conjugate separated and purified in FIG. 8.
  • 10A shows the HPLC profile of mPEG-20 Hz-R27T conjugate separated and purified by SLiperdex—200 size exclusion chromatography.
  • FIG. 10B shows the results of SDS-PAGE analysis on the mPEG-20-Hz-R27T conjugate separated and purified in FIG. 10A.
  • FIG. 11 shows HPLC profiles of mono—mPEG—20K-ALD7—R27T (pH 7.0) conjugates.
  • 12a shows an mPEG-20K-ALD7-R27T conjugate (pH) using an ion exchange column.
  • FIG. 12B shows the results of SDS-PAGE analysis on the R.27T conjugate purified and separated in FIG. 12A.
  • Figure 13 shows HPLX: profile of mono-niPEG-20K-ALD6-R27T conjugate (pH ' 6.0).
  • 14A shows the results of separation and purification of 20K-ALD6-R27T (pH 6.0) using an ion exchange column.
  • FIG. 14B shows the results of SDS-PAGE analysis of the mPEG-20K-ALD6-R27T conjugate (pH 6.0) separated and purified in FIG. 14A.
  • Figure 15 shows the HPLC profile of the mono-mPEG- 30K- ALD4.4- R27Ti3 (pH 4.4) conjugate.
  • Figure 16a shows the result of separation and purification of the niPEG-30K-ALD4.4-R27T conjugate (pH 4.4) using an ion exchange column.
  • FIG. 16B shows the SDS-PAGE analysis of mPEG-3 for (-ALD4.4-R27T conjugate (pH 4.4).
  • Figure 17 shows the HPLC profile of mPEG- 30K-ALD6- R27T conjugate (pH 6.0) with mon.
  • 18A shows the results of separation and purification of mPEG-30K-ALD6-R27T conjugate (pH 6.0) using an ion exchange column.
  • FIG. 18B shows the results of SDS-PAGE analysis of the mPEG-30K-ALD6-R27T conjugate (pH6.0) separated and purified in FIG. 18A.
  • 20A shows the results of separation and purification of mPEG '30K-ALD7-R27T conjugate (pH 7.0) using an ion exchange column.
  • FIG. 20B shows the SDS-PAGE analysis of the mPEG-30K-ALD7-R27T conjugate (pH 7.0) separated and purified in FIG. 20A.
  • FIG. 21A shows the results of separation and purification of mPEG-20R-Mal- 27T conjugates by Zorbax-250 chromatography.
  • FIG. 21B shows the mPEG ⁇ 20K-Mal-R27T conjugate isolated and isolated in FIG. 21A
  • Figure 23 shows the results of the biological activity analysis of the mono-mPEG-20K-Hz-R27T conjugate.
  • Figure 24 shows the results of the biological activity analysis of the mono-mPEG-20K—AUT7-R27T conjugate.
  • FIG. 25 shows the results of biological activity analysis of mono-mPEG-30K-ALD4.4 ′ R27T conjugate.
  • Figure 26 shows the results of the biological activity of the mono-mPEG-20K-Ma ⁇ R27T conjugate.
  • 27 is a reaction product of R27T and iiiPEG-OPSS-20K, isolated niono-mPEG '0PSS'
  • lane 2 is R27T
  • lane 3 is a reference drug
  • native IFN- ⁇ native IFN- ⁇
  • lanes 4-7 are reactants between R27T and mPEG-ALD of each size. 2, it was confirmed that mPEG-R27T was produced by mono-pegylated ⁇ .
  • the unmodified R27T was 41..8 min 1
  • mono-PEG-10 -R27T was 32.6 min
  • nioncrPEG ⁇ 20K—R27T was 29.4 min
  • mono- mPEG-30 -R27T eluted at 27.1 minutes
  • mono-mPEG-40K-R27T at 25.5 minutes, respectively.
  • mono-mPEG ⁇ R27T of each molecular weight were separated and concentrated using Amicon Ultra-4 (Mi 1 ipore, USA). Based on SEC results, it was confirmed that niono-mPEG-R27T generated in each PEGylation reaction was 66-75% (Table 1).
  • Injectable formulations were prepared for animal experiments on mono—mPEG R27T synthesized, purified and analyzed in the above examples. 0.01 'phosphate of pH 2.9 of M (or acetate) nirol only 22.5 mg of the complete cheungaek. MPEG-R27T with various molecular weights of the desired concentration was prepared in a solution containing 0.25 nig of plasmamer -188, 0.06 g of methionine and 2.5 mg of benzylyl_col at a concentration of 000 ⁇ 1 ' 1 £.
  • Example 5 Pharmacokinetic Experiments of mono-mPEG-R27T
  • mice were allowed to rest for one week before placing cateca in the thighs before the experiment.
  • Rebif R purchase formulations and mono-mPEG-R27T of various molecular weights prepared in Example 1 were administered arterial, subcutaneous and intramuscular injection at doses of 2,000,000 IU / Kg. 0, 15, 30, 45, 60, 120, 180 minutes after dosing.
  • blood was collected from the femoral arteries of each rat, and then the plasma was separated.
  • CPE analysis was performed using the above-described method to determine the concentration of IFN- ⁇ in plasma, and the pharmacokinetic analysis of time / concentration Tried.
  • FIG. 4 shows the pharmacokinetic relationship between time and drug efficacy for intravenous injection
  • FIG. 5 shows the inverse pharmacokinetic relationship between time and drug efficacy for subcutaneous injection
  • FIG. 6 shows time and drug efficacy for muscle injection.
  • Example 6 Preparation of mono-mPEG-20K-SC-R27T conjugate
  • the purified mono-PEG-R27T fragment was separated from FIG. 8 and re-separated into a Zorbax GF-250 column (PBS buffer, 1 m / min flow rate; 220 nm, Agilent, USA) as shown in FIG. 9.
  • Example 7 Preparation of mono-mPEG—20K-Hz-R27T conjugate
  • R27T 1 mg was diafiltered with 50 mM MES complete solution (pH 4.0) using an UF membrane (Amicon R Ultra-2, Mi 11 pore, 10K MWCO) to a concentration of 5 mg / ni £. Maintained.
  • niPEG 20KH> CH 2 CH 2 HIz 10 mg (0.0005 ⁇ ole, 10 ratio)
  • EDAC 2 mg was added to 50 mM MES complete solution (pH 4.0) 20. After dissolution, 10 (0.005 ⁇ l ol, 100 times) was added and the reaction proceeded under stirring for 1 hour at room temperature.
  • R27T was diafiltered with buffer using UF membrane (Amicon R Ultra-2, Milore, 10K MWCO), followed by addition of mPEG—Aldehyde (20K, NOF, Japan) to the prepared R27T solution 20 ⁇ knot cyanoborohydride was added to the [TM ⁇ complex solution and reacted at 4 ° C. for 12 ⁇ 14 hours.
  • mPEG—Aldehyde (20K, NOF, Japan) was added to the [TM ⁇ complex solution and reacted at 4 ° C. for 12 ⁇ 14 hours.
  • Table 2 Detailed reaction conditions were as shown in Table 2 below. After the reaction was completed, dilute to 1 mg / m with 50 ⁇ sodium acetate, pH 4.4 complete solution, and measure the degree of PEGylation reaction by SDS-PAGE (4—12% Gradient, Invitrogen, USA) and size exclusion.
  • R27T was observed to elute at 7.5 min and 8.2 min in HPLC using the size exclusion column Zorbax-250, respectively.
  • mPEG-20K-ALD7- R27T conjugate pH 7.0
  • the mono-mPt -20K-ALD7-R27T pH 7.0
  • the gig-section UF Membranes were concentrated using a membrane (1 ⁇ 2icon R UItra-2. ⁇ 1 i pore, 10 MWCO) and each section was identified by SDS—PAGE.
  • the reaction results of di-niPEG-R27T and mono-mPEG-RBL-R27T were observed to elute at 7.5 minutes and 8.2 minutes, respectively, on HPLC using Zorbax-250, a size exclusion column.
  • the prepared mPEG-20K-ALD6 R27T conjugate (pH 6.0) was used to isolate mono-mPEG-20K- ALD6-R27T (pH 6.0) using ion exchange column as shown in Figure 14, and each fragment was divided into UF membrane (1 ⁇ 2icon R Ultra). -2, Mi li pore, and then concentrated using a 10K MWCO) ⁇ D did check each slice with SDS- PAGE.
  • R27T was diafiltered into complete solution using an UF membrane (AmiccV 1 'UItra-2, Mi 1 ipore, 10 MWCO), followed by addition of mPEG-Aldehyde (30K, NOF, Japan) to the prepared R27T solution. 20 mM sodium cyanoborohydride The mixture was added to the R27T solution as much as possible and reacted for 12 to 14 hours at 4 ° C. Detailed reaction conditions were as shown in Table 3 below.
  • the degree of PEGylation was determined by SDS-PAGE (4-12% gradient, Invitrogen, USA) and size exclusion chromatography ( Zorbax GF-250, PBS buffer, 1 mi ', / min flow rate, 220 nm.Agi lent, USA), and the niono-mPEG— R27T and di-mPEG-R27T of the prepared mPFX; -R27T conjugate were excluded from size. Separation and purification in a linear or stepwise gradient using a column (Superdex 250, Pharmacia, USA) or an ion exchange column.
  • reaction results showed that di-mPEG-R27T and niono-mPEG-R27T were eluted at 7.5 and 8.2 minutes in HPLC using Zorbax-250, a size exclusion column, respectively.
  • the prepared mPEG—30K-ALD4.4 ⁇ R27T conjugate (pH 4.4) was used to separate mono-mPEG-30K-ALD4.4-R27T (pH 4.4) using an ion exchange column, and each fragment was separated into an UF membrane (Amicon R). Ultra- 2, Mi 1 i pore, and then concentrated using a 10K MWCO) was confirmed that each fragment in SDS PAGE eu i (Fig L6).
  • reaction masses-di-iiiPEG-R27T and mono-mPEG-R27T were observed to elute at 7.5 and 8.2 minutes in HPLC using Zorbax-250, a size exclusion column, respectively.
  • the prepared mPEG— 30K-ALD7-R27T conjugate (pH 7.0) was separated from the mono-mPEG ⁇ 30 -ALD7-R27T (pH 7.0) using a silver exchange column as shown in FIG. 20, and each fragment was separated by an UF membrane (1 ⁇ 2icon).
  • K , Ultra-2, Mi lipore, 10K MWCO), and GDS-sections were confirmed by SDSPAGE.
  • Example 9 Preparation of raono-mPEG-20K-MAL-R27T Conjugate
  • R27T was diafiltered using a UF membrane (1 ⁇ 2icon R Ultra-2, Mi 11 pore, 10K MWCO) with a pH 8.0 phosphate supernatant followed by a 20-fold molar ratio of mPEG—MAL (20K ⁇ N0F, Japan) prepared above. After addition to the R27T solution it was reacted with stirring for 1 hour at 25 ° C. After completion of the reaction, the degree of PEGylation reaction was determined by HPLC with SDS—PAGE (4 ⁇ 12% gradient, Invitrogen, USA) and a size exclusion column (Zorbax-250, PBS buffer, .1. NiPV fractional flow rate, 220 ⁇ s).
  • the degree of PEGylation reaction was analyzed with each other, and the sections were separated and purified. As shown in FIG. 21, it was found that di / mono-mPEG—ML-R27T and mPEG-MAL eluted at 6.5-7.5 minutes and 8.2 minutes, respectively, on HPLC. Each fragment was concentrated using an UF membrane (Amicon R Ultra-2, Mi lipore, 10 MWCO), and each fragment was identified by SDS-PAGE.
  • Example 10 Biological Activity Tests and Results of mPEG-R27T in mon
  • A549 cells were counted with a hemocytometer and suspended at a concentration of 3 ⁇ 10 5 cells / ⁇ , 1OT FBS / MEM.
  • Encephaloniyocarditis virus (EMV, PANGEN) was diluted to a concentration of 1000TCID 50 ⁇ and added at 100 ⁇ , followed by incubation for 22 hours in the incubator. After removal of the 96 well plate myocarditis virus (EMCV, PANGEN) medium solution, add 0.05% crystal viol 3 ⁇ 4 stain solution per 50 / 3 ⁇ 4 and measure the OD for each 3 ⁇ 4 at a wavelength of 570 nm of the microplate reader to measure the standard IFN. The activities of ⁇ , R27T and the mono-mPEG-R27T conjugates prepared in the above examples were calculated (Table 4, FIGS. 22-26).
  • mPEG-0PSS-20K mPEG-orthopyridyl disulfide
  • SEC size exclusion chromatography
  • the column used Superose 6 10/300 GL (GE Healthcare, USA), the mobile phase was loaded with 20 ⁇ phosphate buffer (pH 5.5) at a flow rate of 0.5 mP, / min and the protein eluted at UV 215 nm was detected. .
  • unmodified R27T eluted at 36.1 minutes and mono-mPEG-OPSS-R27T at 27.7 minutes.
  • the fraction corresponding to Mono-mPEG-0PSS-R27T was separated and concentrated using Amicon Ultra-4 (Mi 11 ipore, USA).

Abstract

본 발명은 페길화된 IFN-β 변이체 및 이를 유효성분으로 포함하는 과대증식성 질환, 염증성 질환, 자가면역 질환 또는 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 페길화된 IFN-β 변이체는 천연형 IFN-β와 비페길화 IFN-β 변이체에 비하여 우수한 약동학적 성질로 인해 뛰어난 항-바이러스 효능, 면역 조절기능 및 항-세포 성장 효능을 갖는바 다양한 질환에 유용하게 이용될 수 있다. 본 발명은 투여 시 뛰어난 약리활성 효과를 나타내고, 기존 인터페론 제제보다 혈중 반감기가 유의하게 증가하는바 투여 측면에서 환자 편이성이 우수하다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
페길화된 인터페론—베타 변이체
【기술분야】
본 발명은 페길화된 인터페론 -베타 변이체에 관한 것이다.
【배경기술】
인터페론 (IFNs)은 사이토카인의 일종으로서 항-바이러스 활성을 나타내고， 세포 증식을 억제하며, 자연 면역 반응을 조절하는 기능을 갖는다. 이중 인터페론 -베타 (IFN— β )는 5개의 알파 헬릭스를 가지는 22 kDa의 구형 단백질로서 당쇄를 제거하면 18 kDa이 된다 (Arduini et al . , Protein Science 8： 1867-1877C 1999) ) .
IFN-β의 임상 적용에 관한 연구는 활발하게 진행 중에 있고 , 톡히 다발성 경화증 (Multiple Sclerosis)에 대한 증상의 완화, 경감 또는 치료제로 각광을 받고 있다 (Goodkin et al . , Multiple sclerosis: Treatmen - opt i ons for patients with re 1 aps i ng-remi tt ing and secondary progressive multiple sclerosis, 1999) . 다발성 경화증 이외에도 IFN-β는 힝 -一바이러스 활성, 세포성징- 억제 또는 힝 성장 활성, 림프구 세포독성 증대 활성 , 면역 조절 활성 , 표적세포의 분화 유도 또는 억제 활성 , 대식세포의 활성화 활성 , 사이토카인 생성의 증가 활성， 세포독성 T세포의 효과 증가 활성 , 자연 살해 세포 (natural ki l l ing cel l)의 증기- 활성 등의 다양한 면역학적 활성으로 암, 자가 면역 질환 및 바이러스 감염 , HIV와 관련된 질병 . C형 간염 , 류마티스성 관절염 등에 치료 등의 효과가 있다고 보고되어 있다 (Pi 11 ing et al . , European Journal of Immunology 29:1041— 1050(1999) , Young et al . , Neurology 51： 682-689 ( 1998) , Cirel 1 i et al . , Major therapeutic uses of interferons, Clin. Iwmunother . 3:27— 87(1995)) .
그러나. 혈액 및 조직에 존재하는 펩타이드의 경우 그 체내 반감기가 수 분 정도로 아주 짧은 것으로 알려져 있으며, 1 ᅳ{3와 같은 단백질 치료제의 생물학적 이용도는 짧은 혈장 반감기 및 프로테아제 열화에 대한 감수성에 의해 종종 제한되어 , 최대 임상 효능을 이루기가 어렵디- . 따라서 , IFN— β의 의약품으로 개발하기 위해서는 알려진 면역조절 , 항바이러스 효과 및 항 -성장 /증식 효과를 더욱 향상시키는 것 외에도 체내에서의 안정성 개선이 필수적이다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】 '
본 발명자들은 IFNᅳ β의 면역조절 활성 , 세포증식 억제활성 및 항一 바이러스 활성 등을 더욱 향상시킴으로써 다양한 질병에 대한 치료효과가 크게 개선된 IFN— β 변이체를 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과， 특정 아미노산을 치환하거나 초당화를 유도한 IFN-β 변이체에 폴리에틸렌글리콜 유도체를 결합시킨 ¾r¾^(conjugate)가 천연형 IFᅳ Ν-β와 비페길화 IFN—β 변이체에 비히ᅵ , 향상된 약동학적 프로파일 (pharmacokinetic profile)과 약리적 성질을 가지고 있음을 확인함으로써 . 본 발명을 완성하게 되었디 ·.
띠-리 -서 , 본 발명의 목적은 페길화된 (PEGylated)된 IFN-β 변이체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다론 목적은 과대증식성 질환 (hyperprol i ferative disease), 염증성 질환, 자가면역 질환 또는 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 과대증식성 질환, 염증성 질환, 자가면역 질환 또는 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료방법을 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된디- .
【기술적 해결방법】
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 페길화된 (PEgylated) IFN- β (interferon-beta) 변이체로서 , 상기 IFN-β 변이체는 이의 아민기 , 카르복실기 또는 Cys 잔기에 CH30-(CH2CH20)n(n은 2-4000의 정수)이 카보닐, 아미드, 우레탄, 이차 아민, 티오에테르, 디설파이드 또는 하이드라존을 통하여 공유결합 되어 페길화되고, 서열목록 게 1서열의 27번째 Arg 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 것인 페길화된 IFN一 β 변이체를 제공한다. - 본 발명자들은 iFN-β의 면역조절 활성 , 세포증식 억제활성 및 항- 바이러스 활성 등을 더욱 향상시킴으로써 다양한 질병에 대한 치료효과가 크게 개선된 IFN-β 변.이체를 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였디 ·. 그 결과, 특정 아미노산을 치환하거니- 초당화를 유도한 IFN-β 변이체에 폴리에틸렌글리콜 유도체를 결합시킨 접합체가 천연형 IFN— β와 비페길화 IFN-β 변이체에 비해, 향상된 약동학적 프로파일과 약리적 성질을 가지고 있음을 확인하였디-.
본 발명에 따르면 , 서열목톡 제 1서열의 아미노산 서열은 인간의 IFN- β의 아미노산 서열이디-. 본 발명은 서열목록 제 1서열의 27번째 Arg 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 IFN-β 변이체에 관한 것이디-.
본 발명의 IFN- β 변이체의 범위에는 서열목록 제 1서열의 27번째 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성 (substantial identity)을 나타내는 아미노산 서열도 포함하는 것으로 해석된디-. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도톡 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에 , 최소 80%의 상동성 , 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성 , 보다 더 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 의미한다 . 또힌 ·, 본 발명의 IFN-β 변이체의 범위에는 27번째 아미노산 잔기의 변이 외에 추가적인 변이를 깆ᅳ는 아미노산 서열 변이체도 포함되는 것으로 해석된다-. 이러한 변이체에는 본 발명의. IFN-β 변이체의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실 , 삽입 , 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다 . 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어' 있디 -(H. Neurath, R. L. Hi ll, The Proteins, Academic Press , New York, 1979) .
가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/IIe, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val , Ser/Gly, Tyr/Phe Ala/Pro. Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/I le, Leu/Val , Ala/Glu 및 Asp/Gly 간의 교환이다.
경우에 따라서는 IFN-β 변이체는 인산화 (phosphorylation). 황화 (sulfation) , 아크릴화 (acrylat ion) , 당화 (glycosy 1 at i dn) , 메틸화 (methylation) 또는 파네실화 (f arnesylat ion) 등으로 수식 (modification)될 수도 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면， 본 발명의 IFN-β 변이체는 서열목록 제 1서열의 27번째 Arg 잔기가 Thr 또는 Ser 잔기로 치환된 아미노산 서열을 갖는다.
하나의 특정예에서 , 본 발명의 ΙΡΝ-β 변이체는 서열목록 제 1서열의 27번째 Arg 잔기가 Thr 잔기로 치환된 아미노산 서열올 갖는다.
본 명세서에서 사용된 용어 , "페길화(?£〔; 3^위" 는 CH30-
(CH2CH20)n(n은 2-4000의 정수)으로 표현되는 구조식을 포함하는 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 유도체를 IFN-β에 컨쥬게이션 시키는 것을 의미힌 -다. 상기 풀리에틸렌글리콜 유도체는 페길화를 위한 다양한 말단기를 포함하며, 이에 따라 상기 폴리에틸렌글리콜 유도체는 카보닐, 아미드, 우레탄, 이차 아민, 티오에테르, 디설파이드 및 하이드라존을 통하여 IFN- β 변이체의 아민기, 카르복실기 또는 Cys 잔기에 공유결합 될 수 있다. 본 발명의 일구현예에 따르면, 싱-기 페길화된 IFN-β 변이체는 일 말단에 메특시기를 가지며 ; 타 말단에 알데하이드, 하이드라지드, 말레이미드, 숙신이미드 또는 0-피리딜 디설파이드 (orthopyridyl cHsulfKle)를 갖는 폴리에틸렌글리콜 유도체로 페길화되어 형성된다.
본 발명의 보다 구체적인 일구현예에 따르면, 상기 페길화된 IFN— β 변이체는 하기의 화학식 1로 표시되는 폴리에틸렌글리콜 유도체로 페길화되어 형성된디-:
화학식 1
CHsO- CHzCI- Wn-R^X-R2
상기 화학식에서, X는 -O0- 또는 S이고; X가 C=0-인 경우, R1은 d-C4 알킬렌, Ci-C4 알킬렌옥시, 알킬렌옥시 C3 알킬렌 또는 CL-C4 알킬렌아미노이고; R2는 수소, 하이드라지드, NHS(N-Hydroxysuccinimide), 말레이미드 d-C4 알킬렌 또는 0-피리딜 디설파이드 C ,-C4 알킬렌이며;
X가 S인 경우 , R1은 S이고, R2는 0-피리딘이디-.
본 명세서에서 사용된 용어， "알킬렌' ' 은 직쇄 또는 분쇄의 포화 탄화수소기로부터 유래한 이가 (bivalent) 라디칼을 의미하며 , 예를 들어 메틸렌 , 에틸렌 , 프로필렌 이소프로필렌 등을 포함한다. Cr 알킬렌은 탄소수 1 내지 4의 알킬렌 유니트를 가지는 이가 라디칼을 의미하며 , CrC4 알킬렌이 결합된 경우 치환체의 탄소수는 포함되지 않은 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어， "알킬렌옥시 " 는 알코을에서 산소에 결합한 수소 및 탄소에 결합한 수소가 각각 제거되어 형성된 이가 (bivalent) 라디칼을 의미하며 , C-C, 알킬렌옥시가 결합한 경우 치환체의 탄소수는 포함되지 않은 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어, "알킬렌아미노" 는- 알킬아민에서 질소에 결합한 수소 및 탄소에 결합한 수소가 긱 -긱- 제거되어 형성된 이가 (bivalent) 라디칼을 의미하며, d-d 알킬렌옥시가 결 경우 치환체의 탄소수는 포함되지 않은 것이다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 화학식 1의 R1은 에틸런 1. 에틸렌옥시 , 에틸렌옥시메틸렌 또는 에틸렌아미노이고; R2는 수소 . 하이드라지드, NHS(N Hydroxysuccinimide), 말레이미드 에틸렌 또는 피리딜 디설파이드 에틸렌이다.
예를 들어, 본 발명에서 이용 가능한 상기 화학식 1의 폴리에틸렌글리콜 유도체는 다음과 같다:
화학식 2
Figure imgf000007_0001
화학식 3 0
CH.0 (CH, C H , C¾CH,C O CH Γ Η Η , 화학식 4
Figure imgf000008_0001
CH50(CH:CH:0)nCH2CKjCH 화학식 5
Figure imgf000008_0002
Figure imgf000008_0003
화학식 7
Figure imgf000008_0004
싱-기 화학식 2 내지 7에서 , n은 2— 4000의 정수이다.
본 발명에서 페길화에 이용되는 PEG 유도체는 그 분자량에 특별한 제한은 없디-. 본 발명의 일구현예에 따르면 , 본 발명의 IFNᅳ β 변이체는 2- 50 kDa, 5-50 kDa 또는 10-40 kDa의 분자량을 갖는 PEG 유도체로 페길화된다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 IFN— β 변이체의 페길화는 모노ᅳ페길화 (mon으 PEGylation)이다. 상기 용어, "모노-페길화" 는 [FN一 β의 특정 위치에 PEG 유도체 단일 분자를 컨쥬게이션 시키는 것을 의미한다 . 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 페길화된 IFNᅳ β 변이체를 유효성분으로 포함하는 과대증식성 질환, 염증성 질환, 자가면역 질흰 · 또는 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 과대증식성 질환, 염증성 질환, 자가면역 질환 또는 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
인간 IFN-β는 다발성 경화증 치료제로서 주로 사용되어 왔지만, 암 , 자가 면역 장애, 바이러스 감염, HIV와 관련된 질병 및 C형 간염 등의 치료에도 이용될 수 있음이 알려져 있으며 (Pi l l ing 등 European Journal of Immunology 29： pp 1041-1050, 1999) , 그 약리 효과는 계속하여 보고되어지고 있디-.
본 발명의 약제학적 조성물에는 약제학적으로 허용되는 담체가 포함될 수 있디-. 싱-기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로스, 수크로오스, 솔비롤, 만니를, 전분， 아카시아 고무 , 인산칼슘 , 알기네이트 , 젤라틴 규산칼슴 , 미세결정성 셀롤로오스, 폴리비닐피를리돈, 셀를로오스， 물. 시럽, 메¾ 셀를로스, 메틸히드톡시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석 , 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하며， 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물은 싱-기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed. , 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비'경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥 내 주입, 피하 주입 근육 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여， 관절강 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 정맥주사, 피하주사 또는 근육주사로 투여된다 . 본 발명에 따르면 , 본 발명의 조성물은 정맥주사, 피하주사 및 근육주사 시에 우수한 약동학적 특성을 가지며 (도 4-6 참조), 특히 피하주사의 경우 Rebif l 비해 약 1.3배의 AUC를 가지고 있어 기존의 인터페른 제제보다 투여 효율이 크게 개선되었는바 투여 측면에서 환자 편이성이 우수하다 (도 5 참조).
본 명세서에서 사용된 용어. "과대증식성 질환" 은 세포의 병적인 증식 또는 과도한 혈관의 신생에 의해 유발되는 종합적인 병적상태 (pathologic condition)를 망라한다. 과대증식성 질환의 예에는 암. 당뇨성 망막증, 류마티스 관절염, 건선 , 만성염증, 죽상경화증, 비민-, 황반변성 및 심혈관 질환 등이 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면， 본 발명의 조성물로 예방 또는 치료되는 과대증식성 질환은 암이다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 빌 -명의 조성물로 예방 또는 치료되는 염증성 질환은 만성폐쇄성 폐질환 (chronic obstructive pulmonary disease), 패혈성 쇼크 (septic shock), 사구체 신염 , 크론병 (Crohn's disease) , 궤양성 대장염 (ulcerative colitis), 아테름성 동맥경화증, 당뇨 및 뇌졸중으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 조성물로 예방 또는 치료되는 자가면역 질환은 류마티스 관절염, 건선, 알러지성 피부염 , 다발성 경화증 및 천식으로 구성된 군으로부터 선택된디-.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제희- 방법 , 투여 방식, 환자의 연령 , 체중, 성, 병적 상태, 음식 , 투여 시간 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 , 예를 들어 1일 당 0.0001—1.00 nig/kg이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 띠 -라, 약제학적으로 허용되는 담체 및 /또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액， 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제， 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 【유리한 효괴-】
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
( i ) 본 발명은 페길화된 IFN-β 변이체 및 이를 유효성분으로 포함하는 과대증식성 질환, 염증성 질환, 자가면역 질환 또는 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
(ii) 본 발명의 페길화된 IFN-β 변이체는 천연형 IFNᅳ β와 비페길화 IFN-β 변이체에 비하여 우수한 약동학적 성질로 인해 뛰어난 항-바이러스 효능, 면역 조절기능 및 항 -세포 성장 효능을 갖는바 다양한 질환 (이상증식성 질환， 염증성 질흰-, 자가면역 질환 및 바이러스 감염 질환 등)에 유용하게 이용될 수 있다.
(iii) 본 발명은 투여 시 뛰어난 약리활성 효과를 나타내고, 기존 인터페론 제제보디ᅵ 혈중 반감기가 유의하게 증가하는바 투여 측면에서 환자 편이성이 우수하다. .
【도면의 간단한 설명】
도 1은 IFN-β 변이체 (R27T)의 Nᅳ말단에 선별적으로 PEG를 접합하여 mPEG-R27T 접합체를 합성하는 공정의 모식도를 나타낸다.
도 2 는 제작된 다양한 크기의 mPEG-R27T 접합체를 SDS-PAGE 를 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 3 은.제작된 iiᅵ PEGᅳ R27T 접합체를 크기별 배제 크로마토그램 (size exclusion chromatogram)으로 분석하여 크기별로 분석하고, mono-mPEG-R27T 접합체의 생성율을 계산한 결과를 나타낸다.
도 4 는 제작된 mono-mPFXi-20K-R27T 및 mono-niPEG-40l(- 27T 접합체와 대조약물을 쥐에 정맥주사로 투여하여 약물약동학적 분석을 수행한 결과를 나타낸다.
도 5 는 제작된 monc)-niPEG-20K-R27T 및 mono-mPEG-40K-R27T 접합체와 대조약물을 쥐에 피하주사로 투여하여 약물약동학적 분석을 수행한 결과를 나타낸다.
도 6 은 제작된 mono-mPEG-20K-R27T 및 mono-mPEG-40 -R27T 접합체와 대조약물을 쥐에 근육주사로 투여하여 약물약동학적 분석을 수행한 결과를 나타낸다. 도 7 은 본 발명에서 이용되는 다양한 PEG 유도체들의 구조를 나타낸다.
도 8 은 Superdex-200 크기 배제 크로마토그래피로 분리 정제된 mPEG-20K- SC-R27T 접합체의 HPLC 프로파일을 나타낸다.
도 9a 는 Zorbax-250 크로마토그래피로 2 차 분리된 nionc)-mPEG-20K-
SC-R27T 접합체의 HPLC 프로파일을 나타낸다.
도 9b 는 도 8 에서 분리 정제된 mPEG-20K-SC-R27T 접합체에 대한 SDS-PAGE 분석결과를 나타낸다 .
도 10a 는 SLiperdex— 200 크기 배제 크로마토그래피로 분리 정제된 mPEG- 20 Hz-R27T 접합체의 HPLC 프로파일을 나타낸다 .
도 10b 는 도 10a 에서 분리 정제된 mPEG-20 -Hz-R27T 접합체에 대한 SDS-PAGE 분석결과를 나타낸다.
도 11 은 mono— mPEG— 20K-ALD7— R27T(pH 7.0) 접합체의 HPLC 프로파일을 나타낸다.
도 12a 는 이온교환칼럼을 이용한 mPEG-20K-ALD7-R27T 접합체 (pH
7.0)의 분리 정제 결과를 나타낸다.
도 12b 는 도 12a 에서 분리 정제된 R.27T 접합체에 대한 SDS-PAGE 분석결과를 나타낸다.
도 13 은 mono-niPEG-20K-ALD6-R27T 접합체 (pH ' 6.0)의 HPLX: 프로파일을 나타낸다.
도 14a 는 이온교환칼럼을 이용한 20K-ALD6-R27T(pH 6.0)의 분리 정제 결과를 나타낸다.
도 14b 는 도 14a 에서 분리 정제된 mPEG-20K-ALD6-R27T 접합체 (pH 6.0 )에 대한 SDS-PAGE 분석결과를 나타낸다 .
도 15 는 mono-mPEG— 30K— ALD4.4— R27Ti3 (pH 4.4)접합체의 HPLC 프로파일을 나타낸다.
도 16a 는 이온교환칼럼을 이용한 niPEG-30K-ALD4.4-R27T 접합체 (pH 4.4)의 분리 정제 결과를 나타낸다.
도 16b 는 mPEG-3이 (-ALD4.4-R27T 접합체 (pH 4.4)에 대한 SDS-PAGE 분석결과를 나타낸다. 도 17 은 mon으 mPEG— 30K-ALD6— R27T 접합체 (pH 6.0)의 HPLC 프로파일을 나타낸 다.
도 18a 는 이온교환칼럼을 이용한 mPEG-30K-ALD6-R27T 접합체 (pH 6.0)의 분리 정제 결과를 나타낸다.
도 18b 는 도 18a 에서 분리 정제된 mPEG-30K-ALD6-R27T 접합체 (pH6.0)에 대한 SDS-PAGE 분석결과를 나타낸다.
도 19 는 motio-iiiPEG-30K-ALI)그 R27T 접합체 (pH 7.0)의 HPLC 프로파일을 나타낸 다.
도 20a 는 이온교환칼럼을 이용한 mPEGᅳ 30K-ALD7-R27T 접합체 (pH 7.0)의 분리 정제 결과를 나타낸디-.
도 20b 는 도 20a 에서 분리 정제된 mPEG-30K-ALD7-R27T 접합체 (pH 7.0)에 대한 SDS-PAGE 분석결과를 나타낸다.
도 21a 는 Zorbax-250 크로마토그래피로 mPEG-20R-Mal- 27T 접합체의 분리 정제 결과를 나타낸다.
도 21b는 도 21a에서 분리 정계된 mPEGᅳ 20K-Mal-R27T 접합체에 대한
SDS-PAGE 분석결과를 나타낸다.
도 22 는 mono-mPEG-20K-SC-R27T 접합체의 생물학적 활성 분석결과를 나타낸다.
도 23 은 mono-mPEG-20K-Hz-R27T 접합체의 생물학적 활성 분석결과를 나타낸디-.
도 24 는 mono-mPEG-20K— AUT7-R27T 접합체의 생물학적 활성 분석결과를 나타낸디ᅳ .
도 25 는 mono-mPEG-30K-ALD4.4ᅳ R27T 접합체의 생물학적 활성 분석결과를 나타낸다.
도 26 은 mono-mPEG-20K-Ma卜 R27T 접합체의 생물학적 활성 분석결과를 나타낸다 .
도 27 은 R27T 와 iiiPEG-OPSS-20K 의 반응물, 분리한 niono-mPEGᅳ 0PSSᅳ
R27T 및 R27T 원물질의 크기 배제 크로마토그램들을 나타낸다.
【발명을 실시를 위한 형태】
이히. , 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한디-. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서 , 본 발명의 요지에 따리- 본 발명의 범위기- 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예
5 실시예 1. 인간 IFN-β변이체의 N-말단 특이적 페길화
인간 IFN-β 변이체 (R27T)의 N—말단에 선택적으로 PEG 를 결합시키기 위하여, 약산성 조건에서 모노메톡시 알데하이드 (monomethoxy PEG- aldehyde, πι— PEG— ALD)를 이용하여 부착실험을 실시하였으며, 도 1 에 개략적인 합성과정을 나타내었다. 사용한 πιᅳ PEG— ALD 는 평균분자량이 각각
L0 10, 20. 30 및 40 kDa 에 해당하는 mPEG- 1.0K-ALD , mPE(;-20K-ALD, mPFXrᅳ 30Kᅳ ALD 및 mPEG-40K-ALD(N0F Corp. , Japan)를 사용하였으며 , R27T 는 CH0 세포주에서 발현하여 분석완료한 단백질 (에이비온 (주) , 한국)을 사용하였으며 , 0.864 nig/m.P 농도로 측정한 R27T 1 ,에 1:2 (R27T:PEG)의 몰비가 되도록 PEG 용액을 가하여 실험을 하였다. R27T 와 PEG 를 혼합 후
15 최종 농도가 20 ηιΜ 이 되도록 소듬 시아노보로하이드라이드 (와코, 일본)를 가하고, 5초 간 잘 섞어준 다음, 41：에서 12시간 동안 반웅시켰다. 실시예 2. 인간 IFN— β변이체의 Ν-말단 특이적 페길화 확인
R27T 의 Ν-말단 페길화를 확인하기 위하여 SDS-PAGE 를 수행하였디-. 20 도 2와 같이 레인 2는 R27T이고, 레인 3은 대조약물인 천연형 IFN-β이며 레인 4-7은 R27T와 각 크기별 mPEG-ALD 간의 반응물들이다. 도 2를 통하여 모노 페길화된 (niono-PEgylated) πιοη으 mPEG-R27T 가 생성되었음을 확인할 수 있었다.
25 실시예 3. Mono— mPEG-R27T의 분리
페길화 반웅 후, mono— mPEG-R27T 를 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 이용하여 분리하였다. 컬럼은 Superose 6 10/300 GL(GE Healthcare, 미국)을 사용하였고, 이동상은 20 mM 포스페이트 완충액 (pH 5.0)을 0.5 m.(V분의 유속으로 홀렸으며 . UV 215 nm 에서 용출되는 '30 단백질을 검출하였다. 도 3에 나타난 바와 같이 , 비변형 R27T는 41..8분어 1, mono-PEG-10 -R27T 는 32.6 분에, nioncrPEGᅳ 20K— R27T 는 29.4 분에, mono- mPEG-30 -R27T 는 27.1 분에, mono-mPEG-40K-R27T 는 25.5 분에 각각 분자 크기별로 용출되었다. 추가 분석을 위하여 각 분자량의 mono-mPEGᅳ R27T 에 해당되는 분획만을 분리하여 Amicon Ultra-4(Mi 1 ipore, 미국)를 이용하여 농축하였다 ·. SEC 결과를 토대로 각 페길화 반응에서 생성되는 niono-mPEG- R27T는 66-75%에 해당함을 확인하였다 (표 1).
【표 1】
RP—HPLC로 측정한 IFNᅳ P(R.27T)와 mono-P['X;— [FN-p(niPEG-R27T)의 농도
Figure imgf000015_0001
실시예 4. mono-mPEG-R27T의 제형
상기 실시예에서 합성 및 정제하고 분석한 mono— mPEG R27T 에 대한 동물실험을 위해 주사용 제형을 제작하였다. 0.01 ' M 의 pH 2.9 의 포스페이트 (또는 아세테이트) 완층액에 22.5 mg 의 만니롤. 0.25 nig 의 플락사머 -188, 0.06 g 의 메치오닌 , 2.5 mg 의 벤질 일_콜을 포함한 용액에 원하는 농도의 다양한 분자량의 πιοη으 mPEG-R27T 를 000 쀠1'1£의 농도로 제작하였다. 실시예 5 mono-mPEG-R27T의 약동학적 실험
마우스를 일주일간 안정기를 거친 뒤 실험 전 대퇴부에 카테카를 설치하였다. RebifR 의 구매제형과 실시예 1 에서 제조한 다양한 분자량의 mono-mPEG— R27T 를 2,000,000 IU/Kg 의 투여량으로 동맥주사, 피하주사 및 근육주사 하였다. 투여 후 0분, 15분, 30분, 45분, 60분, 120분, 180분. 240 분, 360 분, 480 분, 720 분 및 1440 분에 각 흰쥐의 대퇴 동맥에서 채혈한 뒤 죽시 혈장을 분리하였다. 혈장 중 IFN-β의 농도를 상술한 방법으로 CPE 분석을 실시하여, 시간 /농도 프로과일의 약동학적 분석을 시도하였다. 도 4 는 정맥주사에 대한 시간과 약효 사이의 약물 약동학적인 연관관계를 나타내고, 도 5 는 피하주사에 대한 시간과 약효 사이의 역물 약동학적인 연관관계를 나타내며, 도 6 은 근육주사에 대한 시간과 약효 사이의 역물 약동학적인 연관관계를 나타낸다. 3 가지의 투여 방법을 비교할 때 , mono-mPEG-R27T 는 Rebi fR과 비교하여 약효가 유지되고 있었으며 , 특히 피하주사의 경우 RebifR 에 비해 약 13 배의 AUC 를 가지고 있어 약효가 층분하였고, 이는 기존의 IFN 제제보다ᅵ 투여방법이 크게 개선되어 환자 편이성을 증대시킬 수 있음을 보여준다. 실시예 6. mono-mPEG-20K-SC-R27T 접합체의 제조
1 mg 꾀 R27T 0.00005 瞧 ole)을 UF 막 (AniiconR Ultra-2, Mi li pore, 10K MWCO)을 사용하여 pH 7.0 의 50 mM 인산나트륨 완층용액으로 투석여과 하여 1 iiig/m,의 최종농도를 만든 후 2.1 nig 의 PEG— SC(20K, 2 moral excess, 0.0001 niinole, IDB)를 준비된 R27T 용액에 첨가하여 25°C에서 .1 시간 동안 교반하였다.
반응이 종료된 후 SI)S-PAGE(4-12% Gradient, Invitrogen, USA)와 크기 배제 (siiperdex-200, PBS 버퍼 , 0.6 m /분 유속 220 nm, GE healthcare, USA)을 부착시킨 HPLC 로 페길화 반응 정도를 분석하였다. 도 8에 나타난 바와 같이 . tri-및 higher PEG— R27T는 .1.3.8분， di-PEG— R27T는 16.3분, niono-PEG-R27T는 18.8분, 그리고 반웅하지 않은 R27T가 26.9분에 각긱- 용출되었으며 , 긱- 절편을 UF 막 ( Am 1 conR UItra-2. Mi li pore, 10K MWCO)을 사용하여 농축한 후 SDS-PAGE 로 각 절편을 확인하였다. 도 8 에서 분리 정제된 mono-PEG-R27T 절편을 도 9 와 같이 2 차로 Zorbax GF-250 컬럼 (PBS 버퍼, 1 m /분 유속； 220 nm, Agilent, USA)으로 재분리 하였다. 실시예 7. mono-mPEG— 20K-Hz-R27T 접합체의 제조
1 mg 의 R27T( 0.00005 画 ole)를 UF 막 (AmiconR Ultra-2, Mi 11 pore, 10K MWCO)을 사용하여 50 mM MES 완층액 (pH 4.0)으로 투석여과 하여 농도를 5 mg/ni£로 유지시켰다. 여기에 niPEG(20KH>CH2CH2 HIz 10 mg( 0.0005 隱 ole, 10 비ᅵ)을 가하였디-. 2 mg 의 EDAC 를 50 mM MES 완층액 (pH 4.0) 20 에 용해시킨 후 10 (0.005 隱 ol , 100 배)를 가한 후 실온에서 1 시간 동안 교반 하에 반응을 진행시켰다.
반응이 종료된 후 SDS-PAGE(4— 12% Gradient, Invitrogen, USA)와 크기 배제 컬럼 (superdex-200, PBS 버퍼 , 0.6 m.(V분 유속, 220 nm, GE healthcare, USA)을 부착시킨 HPLC 로 페길화 반응 정도를 분석하였으며 각각 절편을 받았다. 도 10 과 같이 tri—및 higher PEG— R27T(F1)는 13.8 분. di-PEG-R27T(F2)는 16.3 분, mono— PEG— R27T(F3)는 18.8 분, 그리고 반응하지 않은 R27T F4)가 26.9 분에 각각 용출되었으며, 각 절편을 UF 막 (½iconR Ultra— 2, Mi 1 ipore, 10K MWCO)을 사용하여 농축한 후 SDS— PAGE 로 각 절편을 확인하였다. 참고로 30 분 이후 용출되는 절편은 과량으로 첨가한 시약이라고 추측할 수 있다. 실시예 8. mono-raPEG— ALD-R27T 접합체의 제조
V mono-mPEG-20K-ALD-R27T 접합체의 제조
R27T 를 UF 막 (AmiconR Ultra— 2， Mi l ipore, 10K MWCO)을 사용하여 완충액으로 투석여과 한 후 mPEG— Aldehyde (20K, NOF, Japan)를 위의 준비된 R27T 용액에 첨가한 후 최종농도가 20 ηιΜ 소듭 시아노보로하이드라이드가 되도록 [™ β 흔합물 용액에 첨가하여 4°C 냉장상태에서 12ᅳ 14 시간 동안 반응시켰디-. 자세한 반웅조건은 하기의 표 2 와 같았디-. 반웅이 종료된 후 50 ιιιΜ 소듐 아세테이트, pH 4.4 완층액으로 1 mg/m.이 되게 희석한 후 페길화 (PEGylation) 반웅 정도를 SDS-PAGE(4— 12% Gradient, Invitrogen, USA)와 크기 배제 크로마토그래피 (Zorbax GF-250, PBS 버퍼, 1 m(V분 유속, 220 nm, Agi lent, USA)로 분석하였으며 제조된 mPEG— R27T 접합체의 mono— mPEG-R27T, di-niPEG-R27T는 크기 배제 칼럼 (Superdex 250, Pharmacia, USA) 또는 이온 교환 칼럼을 사용하여 선형 또는 단계적 구배로 분리 정제하였다. 【표 2]
-ALD-IFN β ¾합체의 제조를위한반응조건
Figure imgf000018_0001
1-1) mPEG-20K-ALD7-R27T(pH 7.0) 접합체 분석
도 11 에서 보는 것처럼, 반웅 결과 di-mPEG-R27T 외- mono-mPEG-
R27T 는 크기 배제 컬럼인 Zorbax-250 을 사용하는 HPLC 에서 7.5 분, 8.2 .분에서 각각 용출되는 것으로 관찰되었다. 제조된 mPEG-20K-ALD7— R27T 접합체 (pH 7.0)는 도 12 에서 보는 바와 같이, 이온교환 컬럼을 이용하여 mono-mPt -20K-ALD7-R27T(pH 7.0)를 분리하였고, 긱- 절편을 UF 막 (½iconR UItra-2. Μί 1 i pore, 10 MWCO)을 사용하여 농축한 후 SDS— PAGE 로 각 절편을 확인하였디-.
1-2) mPEG-20K-ALD6-R27T 접합체 (pH 6.0) 분석
도 13 에서 보는 것처럼， 반응 결과 di-niPEG-R27T 와 mono-mPEG-RBL- R27T 는 크기 배제 컬럼인 Zorbax-250 을 사용하는 HPLC 에서 7.5 분 8.2 분에서 각각 용출되는 것으로 관찰되었다. 제조된 mPEG-20K-ALD6 R27T 접합체 (pH 6.0)는 도 14 에서처럼 이온교환 ¾럼을 이용하여 mono-mPEG-20K- ALD6-R27T(pH 6.0)를 분리하였고, 각 절편을 UF 막 (½iconR Ultra-2, Mi li pore, 10K MWCO)을 사용하여 농축한 후 SDS— PAGE 로 각 절편을 확인하였디■.
2) wono~ PEG-30K-ALD-R27T 접합체의 제조
R27T 를 UF 막 (AmiccV1' UItra-2, Mi 1 ipore, 10 MWCO)을 사용하여 완층액으로 투석여과 한 후 mPEG-Aldehyde(30K, NOF, Japan)를 위의 준비된 R27T 용액에 첨가한 후 최종농도가 20 mM 소듐 시아노보로하이드라이드가 되도록 R27T 혼합물 용액에 첨가하여 4°C 냉장상태에서 12—14 시간 반응시켰다 . 자세한 반응 조건은 하기의 표 3과 같았다.
반응이 종료된 후 50 mM 소듬 아세테이트， pH 4.4 완층액으로 1 mg/iii>이 되게 회석한 후 페길화 반응 정도를 SDS—PAGE(4-12% 구배, Invitrogen, USA)와 크기 배제 크로마토그래피 (Zorbax GF-250, PBS buffer, 1 mi',/분 유속. 220 nm . Agi lent, USA)로 분석하였으며, 제조된 mPFX;-R27T 접합체의 niono-mPEG— R27T 및 di-mPEG-R27T 는 크기 배제 컬럼 (Superdex 250, Pharmacia, USA) 또는 이온 교환 컬럼을 사용하여 선형 또는 단계적 구배로 분리 정제하였다.
[표 3】 mPEGᅳ 30Kᅳ AL으 R27T접합체의 제조를위한반웅조건
Figure imgf000019_0001
2-1) mPEG-30K-ALD4.4-R27T(pH 4.4) 접합체 분석
도 15 에서 보는 것처럼， 반웅 결과 di-mPEG-R27T 와 niono-mPEG- R27T 는 크기배제 컬럼인 Zorbax-250 을 사용하는 HPLC 에서 7.5 분, 8.2 분에서 각각 용출되는 것으로 관찰되었다. 제조된 mPEG— 30K-ALD4.4ᅳ R27T 접합체 (pH 4.4)는 이온교환 컬럼을 이용하여 mono-mPEG-30K-ALD4.4-R27T( pH 4.4)를 분리하였고, 각 절편을 UF 막 (AmiconR Ultra— 2, Mi 1 i pore, 10K MWCO)을 사용하여 농축한 후 SDSᅳ PAGE로 각 절편을 확인하였다ᅵ (도 L6) .
2-2) mPEG-30K-ALD6-R27T(pH 6. OX접합체 분석
도 17 에서 보는 것처럼, 반응 결과 di~mPEG-R27T 와 mono— mPFX;- R27T 는 크기 배제 컬럼인 Zorbax-250 을 사용하는 HPLC 에서 7.5 분, 8.2 분에서 각각 용출되는 것으로 관찰되었다. 제조된 mPEG-30K-ALD6-R27T 접합체 (pH 6.0)는 이온교환 컬럼을 이용하여 mon으 niPEG— 30K— ALD6— R27 pH 6.0)를 분리하였고, 각 절편을 UF 막 (AmiconR Ultra-2, Mi 1ί pore, 10Κ MWCO)을 사용하여 농축한 후 SDS-PAGE로 각 절편을 확인하였다 (도 18).
2-3) mPEG-30K-ALD-R27T(pH 7.0) 접합체 분석
도 19 에서 보는 것처럼 , 반응 결괴- di-iiiPEG-R27T 와 mono— mPEG- R27T 는 크기 배제 컬럼인 Zorbax-250 을 사용하는 HPLC 에서 7.5 분, 8.2 분에서 각각 용출되는 것으로 관찰되었다. 제조된 mPEG— 30K-ALD7-R27T 접합체 (pH 7.0)는 도 20 에서와 같이 이은교환 컬럼을 이용하여 mono-mPEG一 30 -ALD7-R27T(pH 7.0)를 분리하였고， 각 절편을 UF 막 (½iconK, Ultra-2, Mi lipore, 10K MWCO)을 사용하여 농축한 후 SDSPAGE 로 긱― 절편을 확인하였다. 실시예 9. raono-mPEG-20K-MAL-R27T 접합체의 제조
R27T 를 UF 막 (½iconR Ultra-2, Mi 11 pore, 10K MWCO)을 사용하여 pH 8.0 의 인산완층액으로 투석여과 한 후 20 배 몰비의 mPEG— MAL(20Kᅳ N0F, Japan)를 위의 준비된 R27T 용액에 첨가한 후 25°C에서 한 시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응이 종료된 후 페길화 반웅 정도를 SDS— PAGE(4ᅳ 12% 구배 , Invitrogen, USA)와 크기 배제 컬럼 (Zorbax-250, PBS 버퍼 , .1. niPV분 유속, 220 隨)을 부착시킨 HPLC로 페길화 반웅 정도를 분석하였으며 , 각각 절편을 분리 정제하였다. 도 21 에서 보는 것처럼, 반웅 결과 di/mono- mPEG— ML-R27T 와 mPEG-MAL 이 HPLC 에서 6.5-7.5 분, 8.2 분에서 각각 용출되는 것으로 판찰되었다. 각 절편을 UF 막 (AmiconR Ultra-2, Mi lipore, 10 MWCO)을 사용하여 농축한 후 SDS-PAGE로 각 절편을 확인하였다. 실시예 10. mon으 mPEG-R27T의 생물학적 활성 시험 및 결과
A549 세포를 헤모사이토미터 (hemocytometer)로 계수하여 1OT FBS/MEM 으로 3 X 105 세포 /ιη, 농도로 희석하여 현탁시켰다. 상기 실시예에서 제조 정제된 mono-niPEG-R27T 접합체를 각각 50 IU-0.39 IU(1 mg/m-C = 1.6 X 10s IU)의 농도로 회석하여 각각의 웰에 100 씩을 넣었다. 이어서， 각각의 웰에 세포 현탁액을 100 , 씩 넣고 배양기에서 22 시간 동안 배양시켰다.
뇌심근염 바이러스 (Encephaloniyocarditis virus ： EMCV, PANGEN)를 1000TCID 50Λ 의 농도로 희석시켜 100 ^씩 가한 후, 다시 배양기에서 22 시긴- 동안 배양시켰다 . 96 웰 플레이트의 뇌심근염 바이러스 (EMCV, PANGEN) 배지 용액을 제거한 후, 0.05% 크리스탈 바이올 ¾ 염색액을 ¾ 당 50 / 씩 넣고 마이크로플레이트 판독기의 파장 570 nm 에서 각 ¾에 대한 O.D.를 측정하여 표준 IFN β , R27T 및 상기 실시예에서 제조된 mono-mPEG- R27T 접합체의 활성을 계산하였다 (표 4, 도 22-26).
【표 4】
A549세포를 이용한 mono-PEG-R27T의 생물학적 활성
Figure imgf000021_0001
실시예 11. mon으 mPEG— 0PSS-R27T 접합체의 제조
R27T 의 시스테인 (CysL7)의 -SH 기에 선택적으로 PEG 를 결합시키기 위하여 , mPEG-orthopyridyl di sul f ide(mPEG-0PSS-20K, 분자량 20 , 000 Da)를 0.1 M 포스페이트 완층액 (pH 3.0)에서 R27T 외- 반응시켰다. 37°C에서 3 시간 동안 반웅시킨 후 , 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 이용하여 monoᅳ mPEG- 0PSS-R27T 를 분리하였다. 컬럼은 Superose 6 10/300 GL(GE Healthcare, 미국)을 사용하였고, 이동상은 20 ηιΜ 포스페이트 완충액 (pH 5.5)을 0.5 m.P,/분의 유속으로 홀렸으며 , UV 215 nm 에서 용출되는 단백질을 검출하였다. 도 27 에서 보는 바와 같이， 비변형 R27T 는 36.1 분에 , mono-mPEG-OPSS- R27T 는 27.7 분에 용출되었디-. Mono-mPEG-0PSS-R27T 에 해당하는 분획을 분리하여 Amicon Ultra-4(Mi 11 ipore, 미국)를 이용하여 농축하였다. 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바， 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 비-람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
페길화된 (PEgylated) IFN— β ( interferon— beta) 변이체로서 , 상기
IFN-β 변이체는 이의 아민기， 카르복실기 또는 Cys 잔기에 CH30- (CH2CH20)n(n 은 2ᅳ 4000 의 정수)이 카보닐, 아미드, 우레탄, 이차 아민, 티오에테르, 디설파이드 또는 하이드라존을 통하여 공유결합 되어 페길화되고, 서열목록 제 1 서열의 27 번째 Arᅳ g 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 것인 페길화된 IFN-β 변이체.
【청구항 2】
제 1 항에 있어서, 상기 페길화된 IFN— β 변이체는 일 말단에 메톡시기를 가지며. 타 말단에 알데하이드, 하이드라지드, 말레이미드, 숙신이미드 또는 0-피리딜 디설파이드 (orthopyndyl disulfide)를 갖는 폴리에틸렌글리콜 유도체로 페길화되어 형성된 것을 특징으로 하는 페길화된 IFN-β 변이체.
【청구항 3】
제 1 항에 있어서, 상기 페길화된 IFN-β 변이체는 하기의 화학식 1 로 표시되는 폴리에틸렌글리콜 유도체로 페길화되어 형성된 것을 특징으로 하는 페길화된 IFN-β 변이체:
화학식 1
CH30-(CH2CH20)n-R1-X-R2
싱-기 화학식에서 , X는 — C=0- 또는 S이고;
X 가 —00-인 경우. 은 d- 알킬렌, d-C4 알킬렌옥시, 에4 알¾렌옥시 d— C3 알킬렌 또는 d-C4 알킬렌아미노이고; R2 는 수소, 하이드라지드, NHS(N-Hydroxysuccininiide), 말레이미드 CrCi 알킬렌 또는 0-피리딜 디설파이드 C C4 알킬렌이며;
X가 S인 경우, R1은 S이고, R2는 0-피리딘임 .
【청구항 4】 제 3 항에 있어서, 상기 화학식 1 의 R1 은 에틸렌 , 에틸렌옥시 , 에틸렌옥시메틸렌 또는 에틸렌아미노이고; R2 는 수소 , 하이드라지드, NHS(N-Hydroxysuccinimide), 말레이미드 에틸렌 또는 으피리딜 디설파이드 에틸렌인 것을 특징으로 하는 페길화된 IFNᅳ β 변이체.
5
【청구항 5】
제 1 항에 있어서, 상기 페길화된 IFN-β 변이체는 서열목록 제 1 서열의 27 번째 Arg 잔기가 Thr 또는 Ser 잔기로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 페길화된 IFNᅳ β 변이체.
L0
【청구힝- 6】
제 1 힝-에 있어서 , 페길화된 lFN-β 변이체의 페길화는 모노- 페길화 (HI이 K)-PEGylatkm)인 것을 특징으로 하는 페길화된 IFN-β 변이체.
15
【청구항 7】
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 페길화된 1.FN— β 변이체를 유효성분으로 포함하는 과대증식성 질환 (hyperprol.iferative disease) , 염증성 질환, 자가면역 질환 또는 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
0
【청구항 8】 '
제 7 힝-에 있어서, 상기 과대증식성 질환은 암인 것을 특징으로 하는 조성물. 5
【청구항 9】
제 7 항에 있어서, 상기 염증성 질환은 만성폐쇄성 폐질환 (d onic obstructive pulmonary disease), 피]혈성 쇼크 (septic shock) , 人)"구체 신염 크론병 (Crohn's disease), 궤양성 대장염 (ulcerative colitis), 아테름성 동맥경화증ᅣ 당뇨 및 뇌졸중으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 0 특징으로 하는 조성물.
【청구항 10]
제 7 항에 있어서 , 상기 자가면역 질환은 류마티스 관절염 , 건선, 알러지성 피부염 , 다발성 경화증 및 천식으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 11】
제 7 항에 있어서, 상기 조성물은 정맥주사, 피하주사 또는 근육주사로 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 12】
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 페길화된 IFN- β 변이체를 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 과대증식성 질환, 염증성 질환, 자가면역 질환 또는 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료방법 .
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