KR20070110162A - 폴리에틸렌 글리콜-인터페론 알파 접합체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 접합체 내의 폴리에틸렌 글리콜 단위의 평균분자량이 400 내지 45,000 돌턴(dalton)인 아래와 같은 화학식(1)로 표시되는 삼중가지형 폴리에틸렌 글리콜-인터페론 알파(Tri-branched polyethylene glycol-interferon α) 접합체 및 이를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

[화학식 1]

상기 식에서

n은 1 에서 1,000, m은 10 에서 1,000까지의 정수값을 가지며, Z는 인터페론 알파와 폴리에틸렌 글리콜 사이의 연결쇄(linker) 역할을 하는 (CH₂)_S 또는 (CH₂)_SNHCO(CH₂)_S의 알킬렌그룹으로 S는 1에서 6까지의 정수값을 가진다. Y는 인터페론 분자내의 NH₂ 작용기와 폴리에틸렌 글리콜 유도체의 작용기간의 결합반응에 의해 생성된 아미드결합이거나 2차 아민구조이다. 상기와 같은 식으로 표시되는 생리적으로 활성인 폴리에틸렌 글리콜-인터페론 알파 접합체는 항바이러스 활성 및 항종양 활성을 가지며 제조시 높은 반응성에 기인한 높은 생산수율과 순도의 개선을 나타내고 인터페론의 생리활성 감소가 최소화되어 혈중 반감기가 현저하게 증가하는 작용효과를 나타낸다.

폴리에틸렌 글리콜, 인터페론 알파, 접합체

Description

폴리에틸렌 글리콜-인터페론 알파 접합체{polyethylene glycol-interferon alpha conjugate}

도 1은 실시예 1에서 제조된 반응물을 크기배제 고속액상크로마토그래피법 으로 분석한 결과를 나타낸다.

도 2는 실시예 2에서 제조된 반응물을 크기배제 고속액상크로마토그래피법 으로 분석한 결과를 나타낸다.

도 3은 비교예 1에서 제조된 반응물을 크기배제 고속액상크로마토그래피법 으로 분석한 결과를 나타낸다.

도 4은 비교예 2에서 제조된 반응물을 크기배제 고속액상크로마토그래피법 으로 분석한 결과를 나타낸다.

도 5는 비교예 3에서 제조된 반응물을 크기배제 고속액상크로마토그래피법 으로 분석한 결과를 나타낸다.

도 6은 비교예 4에서 제조된 반응물을 크기배제 고속액상크로마토그래피법 으로 분석한 결과를 나타낸다.

도 7은 실시예 1에서 얻어진 폴리에틸렌 글리콜이 수식된 인터페론 알파 접합체를 정제하여 매트릭스 지원 레이저 단백질 이온화-비행시간(MALDI-TOF) 질량분석기로 분석한 결과를 나타낸다.

도 8은 실시예 2에서 얻어진 폴리에틸렌 글리콜이 수식된 인터페론 알파 접합체를 정제하여 매트릭스 지원 레이저 단백질 이온화-비행시간(MALDI-TOF)질량분석기로 분석한 결과를 나타낸다.

도 9는 비교예 1에서 얻어진 폴리에틸렌 글리콜이 수식된 인터페론 알파 접합체를 정제하여 매트릭스 지원 레이저 단백질 이온화-비행시간(MALDI-TOF) 질량분석기로 분석한 결과를 나타낸다.

도 10은 비교예 2에서 얻어진 폴리에틸렌 글리콜이 수식된 인터페론 알파 접합체를 정제하여 매트릭스 지원 레이저 단백질 이온화-비행시간(MALDI-TOF) 질량분석기로 분석한 결과를 나타낸다.

도 11은 수포성 구내염 바이러스 및 마딘-다비 소 신장 세포 (Marbin-Darby Bovine Kidney, MDBK)를 이용한 실시예 1과 비교예 1 및 3에서 얻어진 폴리에틸렌 글리콜이 수식된 인터페론 알파 접합체들의 세포병변효과(cytophatic effect, CPE) 억제 분석을 나타낸다.

도 12는 실시예 1에서 얻어진 폴리에틸렌 글리콜이 수식된 인터페론 알파 접합체와 인터페론 알파의 약동력학 비교분석을 나타낸다.

도 13은 다우디 세포(Daudi cell)를 이용한 실시예 1에서 얻어진 폴리에틸렌 글리콜이 수식된 인터페론 알파 접합체와 인터페론 알파의 항종양 활성 효과 비교 를 나타낸다.

도 14는 인터페론 알파와 실시예 1에서 얻어진 삼중가지형 폴리에틸렌 글리콜(PEG, MW43,000)이 수식된 인터페론 알파 접합체의 온도변화에 따른 생물학적 활성 변화 비교를 나타낸다.

도 15는 인터페론 알파와 실시예 1에서 얻어진 폴리에틸렌 글리콜이 수식된 인터페론 알파 접합체들의 단백질 분해 효소에 대한 시간경과에 따른 생물학적 활성 변화 비교를 나타낸다.

본 발명은 삼중가지형 폴리에틸렌 글리콜-인터페론 알파 접합체에 관한 것이다.

인터페론은 지금으로부터 약 50년 전인 1957년 Isaacs과 Lindenmann에 의해 발견되었으며 강력한 항바이러스 작용이 있는 것으로 알려졌다(Isaacs 등, Virus interference, 147(1957)). 현재 인터페론은 Type I (IFN-α, β, ω) 과 Type II (IFN-γ)로 그 종류가 분류되고 있으며 생성하는 세포가 백혈구, 섬유모세포, T 세포 등으로 각기 다르다. 지금으로부터 약 20년 전인 1986년에 이르러 재조합 인터 페론 알파가 모양세포성백혈병 (hairy cell leukemia)의 치료제로 허가를 받고 사용되게 되었다. 이와 같이 인터페론은 유전자재조합기술로 생산되어 암치료에 사용된 최초의 사이토카인(cytokine)이다(Pestka 등, Semin. Oncol., 24(1997)).

인터페론 알파는 항바이러스성 항증식성 활성을 갖는 약학적 활성 단백질로서 세계적으로 40여 개국 이상에서 14종 이상의 암종과 바이러스 질환의 치료에 사용되고 있다. 임상적으로 유용한 치료분야는 모양세포성백혈병(hairy cell leukemia), 카포지 육종(Kaposi's sarcoma), 만성골수 백혈병(chronic Myelogenous Leukemia, CML), 비-세포 림프종(B-cell lymphoma), 티-세포 림프종(T-cell lymphoma), 흑색종(melanoma), 골수종(myeloma), 신세포암(renal cell carcinoma)가 있다(Nagabhushan T.L.등, Regulatory practice for biopharmaceutical production, 221-234(1994)). 인터페론은 암 환자의 수명을 증가시키는 최초의 인체 단백질로서 난소암, 유방암, 기관지계암, 방광암, 위장계암 등과 급성 백혈병과 같은 다른 암종에도 적용될 것으로 기대된다 (Mosbe Talpaz등, Seminars in Hepatology, 38(3), 22-27, (2001)). 특히 현재 B형 또는 C형 간염치료에 인터페론 알파-2에이(IFN alfa-2a), 인터페론 알파-2비(IFN alfa-2b)와 뮤테인(mutein)인 인터페론-콘1(IFN-con1)이 사용되고 있는데, B형간염 바이러스(HBV)나 C형 간염 바이러스(HCV) 와 같은 바이러스에 의해 만성적으로 감염이 지속되면 간암(hepatocellular carcinoma)으로 진행될 위험성이 보고되고 있으므로 암의 예방을 위해서도 인터페론이 사용될 수 있다.

임상적으로 유용한 단백질 치료제인 인터페론은 유전공학적 기법으로 생산된 효소, 단백질, 호르몬, 펩티드 등과 마찬가지로 낮은 체내 안정성, 빠른 체내소실, 반복 투여에 의한 항체 생성과 이로 인한 과민반응 등이 문제점으로 나타나고 있다. 특히 1 일 1 회, 주 3 회 등의 잦은 투여는 환자에게 고통을 주며, 특히 장기간 치료가 필요한 환자에 있어서는 양질의 생활을 유지하기가 어려운 점이 부각되었다. 이러한 문제점을 개선하고자 안정적이고 장기적으로 활성을 유지하는 약물의 개발을 위해 폴리에틸렌 글리콜을 수식한 단백질 치료제가 개발되어 상용화되었다.

폴리에틸렌 글리콜은 친수성이 강하여 치료용 단백질에 결합시 용해도를 증가시킬 수 있으며 효소활성, 수용체 결합과 같은 주요 생물학적 기능들을 유지하면서 결합된 단백질의 분자량을 증가시키는 효과를 나타내어 신장여과를 감소시키며 단백질 가수분해 효소로부터 단백질을 효과적으로 보호함으로써 단백질의 분해를 방지하고 안정성 및 순환시간을 증가시키고 면역원성을 감소시키는 장점을 갖는다.

선형의 폴리에틸렌 글리콜은 1,000~25,000 정도의 분자량을 갖는 것이 사용되고 있으나, 단백질 또는 펩티드의 한정된 생리활성 부위로 인해 활성을 유지하면서 다수의 선형 고분자를 단백질 또는 펩티드에 접합시키는 데에는 한계가 있다. Wana(Wana, H et al., Ann. N.Y.Acad.Sci. 613:95-108(1990))등은 이러한 선형 폴리에틸렌 글리콜이 갖는 한계를 극복하기 위해 트리 클로로 트리아진(trichlorotriazine)을 이용하여 가지달린 모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜(mPEG) 유도체를 단백질에 접합하고자 하였다. 그러나 이와 같은 활성화된 가지달린 폴리에틸렌 글리콜 유도체들은 그 크기가 거대하여 단백질 또는 펩티드의 표면에 입체적 장애(steric hinderance)를 유발하므로 수식된 단백질이나 펩티드의 활성을 떨어뜨리고 정제 수율 또한 낮은 것이 문제점으로 나타나고 있다.

대한민국 특허 등록번호10-0396983은 이러한 가지달린 고분자 유도체의 단점을 극복하고자 고분자와 단백질을 연결하는 연결쇄(linker)를 길게 하여 생리활성부위에 결합하는 수를 최소화하고 가지달린 고분자에 의한 입체적 장애를 감소시켜 단백질 구조의 보호를 통해 생리활성의 감소를 최소화하고자 하였다. 그러나 긴 연결쇄를 갖는 활성화된 가지달린 고분자 유도체인 Tri-PEG-NHS는 연결쇄 구조의 제조시 잉여의 작은 분자량의 선형 PEG-NHS와 Di-PEG-NHS가 불순물로 존재하게 되며 이는 인터페론과의 결합반응에 경쟁적으로 참여하여 정제되기 어려운 저분자량의PEG-인터페론 알파 접합체와 Di-PEG-인터페론 알파 접합체를 생성하므로 순도와 수율이 낮아지는 문제점을 갖고 있다.

따라서 인터페론 알파의 생리활성 감소를 최소화하면서 순도가 높고 안정성이 우수한 거대 폴리에틸렌 글리콜-인터페론 접합체가 요구되어지고 있다.

본 발명은 인터페론 알파 및 종래의 폴리에틸렌 글리콜-인터페론 알파 접합 체들에 비해 혈중 반감기를 늘리면서 인터페론의 생리활성 감소는 최소화하고 제조시 높은 순도와 생산수율을 갖는 삼중가지형 폴리에틸렌 글리콜-인터페론 알파 접합체, 이를 제조하는 방법 및 이를 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고순도의 삼중가지형 폴리에틸렌 글리콜 유도체를 인터페론 알파에 접합시킨 고분자 및 이를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 구체적으로 설명한다.

폴리에틸렌 글리콜 인터페론 알파 접합체는 삼중가지형 폴리에틸렌 글리콜 유도체와 인터페론 알파와의 결합반응으로 생성되며 아래와 같은 화학식(1)으로 표시된다.

[화학식 1]

상기 식에서

n은 1 에서 1,000, m은 10 에서 1,000까지의 정수값을 가진다. 접합체 내의 폴리에틸렌 글리콜 단위의 평균분자량은 약 400 내지 45,000 돌턴이고, 바람직하게는 30,000 내지 45,000 돌턴(dalton)이며, 보다 바람직하게는 43,000돌턴이다.

폴리에틸렌 글리콜의 분자량이 클수록 고분자 접합체의 약동력학은 개선되나 활성은 감소하게 되는 양면성을 띠게 되므로 적절한 분자량을 갖는 것이 중요하다. Z는 인터페론 알파와 폴리에틸렌 글리콜 사이의 연결쇄(linker) 역할을 하는 (CH₂)_S 또는 (CH₂)_SNHCO(CH₂)_S의 알킬렌그룹으로 S는 1에서 6까지의 정수값을 가진다. Y는 인터페론 분자내의 NH₂ 작용기와 폴리에틸렌 글리콜 유도체의 작용기간의 결합반응에 의해 생성된 아미드결합이거나 2차 아민구조이다.

또한 본 발명은 분지형 폴리에틸렌 글리콜 유도체와 인터페론 알파를 공유결합시켜 접합체 내의 폴리에틸렌 글리콜 단위의 평균분자량이 400 내지 45,000 돌턴(dalton)인 화학식(1)로 표시되는 삼중가지형 폴리에틸렌 글리콜과 인터페론 알파와의 접합체를 제조하는 방법과 그 조성물을 제공한다. 바람직하게는 접합체 내의 폴리에틸렌 글리콜 단위의 평균분자량이 30,000 내지 45,000돌턴인 화학식(1)로 표시되는 삼중가지형 폴리에틸렌 글리콜과 인터페론 알파의 접합체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 보다 바람직하게는 접합체 내의 폴리에틸렌 글리콜 단위의 평균분자량이 43,000돌턴인 화학식(1)로 표시되는 삼중가지형 폴리에틸렌 글리콜과 인터페론 알파의 접합체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 삼중가지형 폴리에틸렌 글리콜 유도체는 세 개의 선형 생체적합성 고분자가 결합되어 가지 구조를 갖는 활성화된 고분자이다. 글리세롤 골격구조에서 3 개의 OH기 중 3 개의 OH 부위 모두를 에틸렌 글리콜 구성단위 분자로 폴리머화한 후 그 중 한 부위의 끝을 작용기로 활성화하였다. 활성화된 부위를 제외한 나머지 두 부위는 끝 부분을 모노메톡시(monomethoxy)로 치환시켜 어떠한 반응도 일어나지 않도록 하였다. 상기의 분지형 폴리에틸렌 글리콜 유도체 제조시 각 선형의 폴리에틸렌 글리콜 고분자 크기는 자유롭게 조절이 가능하므로 이를 이용하여 적절한 구조 및 분자량의 고분자를 제조하여 인터페론 알파에 결합시킨다.

인터페론 알파와 결합하는 분지형 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 유도체는 하기 화학식(2)으로 표시된다.

[화학식 2]

상기 식에서

n은 1 에서 1,000, m은 10 에서 1,000까지의 정수값을 가진다. 접합체 내의 폴리에틸렌 글리콜 단위의 평균분자량은 약 400 내지 45,000돌턴이고, 바람직하게는 약 30,000 내지 45,000 돌턴(dalton)이며, 보다 바람직하게는 43,000돌턴 이다. X는 아래와 같은 화학식(3)으로 표시되는 인터페론 알파를 포함한 단백질 및 펩티드와 화학적으로 반응할 수 있는 작용기이다. 본 발명에서 바람직한 X는 화학식 3의 구조식 중 N-하이드록시석신이미드 (a) 혹은 알데히드(b)인 경우이며 인터페론과의 접합반응시 각각 높은 수율로 아미드결합과 2차아민구조의 결합을 형성한다.

[화학식 3]

Z는 인터페론 알파와 폴리에틸렌 글리콜 사이의 연결쇄(linker) 역할을 하는 (CH₂)_S 또는 (CH₂)_SNHCO(CH₂)_S의 알킬렌그룹으로 S는 1에서 6까지의 정수값을 가진다.

또한 본 발명은 인터페론 알파와 분지형 폴리에틸렌 글리콜 유도체의 반응 몰비가 1:0.5 에서 1: 50이다. 바람직하게는 몰비가 1:0.5에서 1:3 인 것이다. 폴리에틸렌 글리콜과 인터페론과의 접합반응시 폴리에틸렌 글리콜 유도체의 몰비가 증가할수록 단위시간당 모노 폴리에틸렌 글리콜-인터페론 알파접합체의 생성량이 감소하는 경향이 있다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 폴리에틸렌 글리콜 인터페론 알파 접합체를 유효성분으로 하는 인터페론 알파 감수성 질환 치료용 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효량의 본 발명의 폴리에틸렌 글리콜 인터페론 알파 접합체 및 약제학적으로 허용 가능한 희석제, 방부제, 가용화제, 유화제, 보조제 및/또는 담체로 구성될 수 있다.

이러한 본 발명에 따른 약제조성물은 통상의 방법으로 주사제, 캅셀제, 정제, 액제, 환제, 연고제, 안연고제, 점안제, 경피흡수제, 페이스트제, 카타플라스마제, 첩부제, 에어로솔제 등의 형태로 제제화 할 수 있다. 또한, 상기 본 발명에 따른 약제조성물의 유효투입량은 환자의 나이, 신체적 조건, 몸무게 등에 의해 다양화될 수 있지만, 일반적으로는 1주 내지 2주에 1회 투여로도 유효투여량의 투여가 가능하다. 그리고 1일 유효투입량 범위 내에서 하루 한번 또는 하루에 여러 번 나누어 투입될 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 접합체를 유효성분으로 하여 인터페론 알파 감수성 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

상기에서 언급된 인터페론 알파 감수성 질환은 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가에게 알려진 인터페론 알파에 의해 치료되는 질환을 의미하며, 보다 구체적으로는 모양세포성백혈병, 카포지 육종, 만성골수 백혈병, 비-세포 림프종, 티-세포 림프종, 흑색종, 골수종, 신세포암 등이 있다. 또한, 이 질환에는 난소암, 유 방암, 기관지계암, 방광암, 위장계암 등과 급성 백혈병과 같은 다른 암종을 포함한다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

<실시예 1> 삼중가지형 폴리에틸렌 글리콜 N-하이드록시석신이미드를 이용한 화학식 1의 삼중가지형 폴리에틸렌 글리콜(MW 43,000 Da)-인터페론 알파 접합체(I) 제조

인터페론 알파(Interferon a, 동아제약㈜) 10 mg을 pH8.0의 100 mM 바이신(bicine) 완충액으로 투석한 후, 분자량 43,000 돌턴(dalton)의 삼중가지형 폴리에틸렌 글리콜 N-하이드록시석신이미드(NOF, 일본) 68 mg을 넣어 실온에서 2 시간 동안 교반하면서 반응시킨 후 0.1 M 글리신(glycine)을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 40 mM 인산나트륨 (NaH₂PO_{4 ,} pH4.0) 완충액으로 평형화 된 Hiprep^TM 26/10 (Amersham Pharmacia Biotech)desalting column에 반응액을 주입한 후 같은 완충액으로써 용출시켜 완충액을 교환하였다. 이 반응으로 삼중가지형 폴리에틸렌 글리콜-N-하이드록시석신이미드에서 분리된 N-하이드록시석신이미드를 제거시켰다. 용출액을 pH4.0의 40 mM 인산나트륨 (NaH₂PO₄) 완충액으로 평형화된 SP-Sepharose Fast Flow 양이온 교환수지 (cation exchange chromatography, Amersham Pharmacia Biotech)에 주입한 후 폴리에틸렌 글리콜 인터페론 알파 접합체를 분리하였다. 분리 과정에서 사용된 염화나트륨(NaCl)을 0 ~ 500 mM의 농도구배를 주어 용출시켜 분획하였다. 분획한 용출액을 HPLC 및 SDS-PAGE를 이용하여 크기와 형태를 확인하였다. 이 후 인터페론 알파에 삼중가지형 폴리에틸렌 글리콜이 2개 이상 결합된 형태의 접합체와 반응하지 않은 인터페론 알파 등을 배제하여, 표제의 접합체인 삼중가지형 폴리에틸렌 글리콜(MW 43,000)이 하나만 결합된 폴리에틸렌 글리콜 인터페론 알파 접합체(또는 여기서, 모도-삼중가지형 폴리에틸렌 글리콜 인터페론 알파 접합체라 칭한다)만을 수득하였다.

반응혼합물을 크기배제 고속액상크로마토그래피법으로 확인한 결과, 반응혼합물은 약 47%의 모노-폴리에틸렌 글리콜 인터페론 알파 접합체(모노-PEG-IFNα)와 약 36%의 비변형된 인터페론 알파(IFNα) 그리고 나머지 디-폴리에틸렌 글리콜화된 인터페론 알파 접합체(디-PEG-IFNα)와 이산물인 N-하이드록시석신이미드(NHS)로 이루어짐을 확인하였다[도1 참고, 흡광도 280nm에서 측정하였으며, (a)디-PEG-IFNα는 약 8분에서, (b)모노-PEG-IFNα 는 약 9분에서, (c)IFNα는 약 13.5분에서, (d)NHS는 약 15.3분에서 관찰되었다]. 또한 분리된 모노-삼중가지형 폴리에틸렌 글리콜 인터페론 알파 접합체는 매트릭스 지원 레이저 단백질 이온화-비행시간(MALDI-TOF) 질량분석기 분석한 결과, 도7과 같았으며, 그 값은 65943.2(m/z)였다.

<실시예 2> 삼중가지형 폴리에틸렌 글리콜 알데히드를 이용한 화학식 1의 삼중가지형 폴리에틸렌 글리콜 (PEG, MW 43,000 Da)-인터페론 알파 접합체(II) 제조

인터페론 알파(Interferon a) 10mg을 pH4.0의 40mM 아세트산나트륨 (C₂H₃NaO₂) 완충액으로 투석한 후, 분자량 43,000 돌턴(dalton)의 삼중가지형 폴리에틸렌 글리콜 알데히드(NOF, 일본) 68 mg을 넣어 냉장조건에서 10 ~ 14 시간 동안 교반하면서 반응시켰다. pH4.0의 40 mM 인산나트륨 (NaH₂PO₄) 완충액으로 평형화 된 Hiprep^TM 26/10 (Amersham Pharmacia Biotech) desalting column에 반응액을 주입한 후 같은 완충액으로 용출시켜 완충액을 교환하였다. 그 후 용출액을 pH4.0의 40 mM 인산나트륨 (NaH₂PO₄) 완충액으로 평형화된 SP-Sepharose Fast Flow 양이온 교환수지 (cation exchange chromatography, Amersham Pharmacia Biotech)에 주입한 후 폴리에틸렌 글리콜 인터페론 알파 접합체를 분리하였다. 분리 과정에서 사용된 염화나트륨 (NaCl)을 0 ~ 500 mM의 농도구배를 주어 용출시켜 분획하였다. 분획된 용출액을 HPLC 및 SDS-PAGE 분석을 통하여 반응하지 않은 인터페론 알파를 배제시켜, 표제의 화합물인 삼중가지형 폴리에틸렌 글리콜이 N-말단에 하나만 결합된 폴리에틸렌 글리콜(MW 43,000)-인터페론 알파 접합체(II)를 수득하였다.

반응혼합물을 크기배제 고속액상크로마토그래피법으로 확인한 결과 반응혼합물은 약 42%의 모노-폴리에틸렌 글리콜 인터페론 알파 접합체(모노-PEG-IFNα)와 약 55%의 비변형된 인터페론 알파(IFNα)로 이루어짐을 확인하였다[도 2 참조, 흡광도 280nm에서 측정하였으며, (a)모노-PEG-IFNα 는 약 9.5분에서, (b)IFNα는 약 14분에서 관찰되었다].

또한 분리된 모노-삼중가지형 폴리에틸렌 글리콜 인터페론 알파 접합체는 SDS-PAGE와 MALDI-TOF 질량 분석기(MALDI-TOF mass spectrometer)로 각각 순도와 분자량을 확인하였으며, 그 값은 66141.9 (m/z)였다(도 8 참고).

<비교예 1> 이중가지형 폴리에틸렌 글리콜-N-하이드록시석신이미드를 이용한 이중가지형 폴리에틸렌 글리콜(PEG, MW 40,000 Da)-인터페론 알파 접합체(III) 제조

인터페론 알파(Interferon a)를 공지된 방법(Pestka, Sci. Am. 249, 36(1983))에 따라 10 mg 제조하고 pH8.0의 100 mM 바이신(bicine) 완충액으로 투석한 후, 폴리에틸렌 글리콜 분자량 40,000 돌턴(dalton)인 이중가지형 폴리에틸렌 글리콜-N-하이드록시석신이미드(NOF사, 일본) 63 mg을 넣어 실온에서 2시간 동안 교반하면서 반응시킨 후 0.1 M 글리신(glycine)을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 40 mM 인산나트륨 (NaH₂PO_{4 ,} pH4.0) 완충액으로 평형화 된 Hiprep^TM 26/10 (Amersham Pharmacia Biotech) desalting column에 반응액을 주입한 후 같은 완충액으로써 용출시켜 완충액을 교환하였다. 이 반응으로 이중가지형 폴리에틸렌 글리콜-N-하이드록시석신이미드에서 분리된 N-하이드록시석신이미드를 제거시켰다. 용출액을 pH4.0의 40 mM 인산나트륨 (NaH₂PO₄) 완충액으로 평형화된 SP-Sepharose Fast Flow 양이온 교환수지(cation exchange chromatography, Amersham Pharmacia Biotech)에 주입한 후 폴리에틸렌 글리콜 인터페론 알파 접합체를 분리하였다. 분리 과정에서 사용된 염화나트륨(NaCl)을 0 ~ 500 mM의 농도구배로 용출하여 분획하였다. 분획된 용출액은 HPLC 및 SDS-PAGE를 이용하여 크기와 형태를 확인한 후 인터페론 알파에 이중가지형 폴리에틸렌 글리콜이 2개 이상 결합된 형태의 접합체와 반응하지 않은 인터페론 알파 등을 배제하고 이중가지형 폴리에틸렌 글리콜이 하나만 결합된 폴리에틸렌 글리콜 인터페론 알파 접합체만을 분리하였다.

반응혼합물을 크기배제 고속액상크로마토그래피법으로 확인한 결과 반응혼합물은 약 40%의 모노-폴리에틸렌 글리콜 인터페론 알파 접합체(모노-PEG-IFNα)와 약 50%의 비변형된 인터페론 알파(IFNα) 그리고 나머지 디-폴리에틸렌 글리콜화된 인터페론 알파 접합체(디-PEG-IFNα)와 이산물인 N-하이드록시석신이미드(NHS)로 이루어졌음을 확인하였다[도3 참고, 흡광도 280nm에서 측정하였으며, (a)디-PEG-IFNα는 약 8분에서, (b)모노-PEG-IFNα 는 약 9분에서, (c)IFNα는 약 13.5분에서, (d)NHS는 약 15분에서 관찰되었다].

또한 분리된 모노-이중가지형 폴리에틸렌 글리콜 인터페론 알파 접합체는 매트릭스 지원 레이저 단백질 이온화-비행시간(MALDI-TOF) 질량분석기로 분자량을 확인하였으며, 그 결과는 도 9와 같으며, 그 값은 62708.3(m/z)였다.

<비교예 2> 이중가지형 폴리에틸렌 글리콜 알데히드를 이용한 이중가지형 폴리에틸렌 글리콜(PEG, MW 40,000 Da)-인터페론 알파 접합체(IV) 제조

인터페론 알파 (Interferon a) 10 mg을 pH4.0의 40mM 아세트산나트륨 (C₂H₃NaO₂) 완충액으로 투석한 후, 분자량 40,000 돌턴(dalton)의 이중가지형 폴리에틸렌 글리콜 알데히드(NOF, 일본) 63 mg을 넣어 냉장조건에서 10 ~ 14 시간 동안 교반하면서 반응시킨다. pH4.0의 40 mM 인산나트륨 (NaH₂PO₄) 완충액으로 평형화 된 Hiprep^TM 26/10 (Amersham Pharmacia Biotech) desalting column에 반응액을 주입한 후 같은 완충액으로 용출시켜 완충액을 교환한다. 용출액을 pH4.0의 40 mM 인산나트륨 (NaH₂PO₄) 완충액으로 평형화된 SP-Sepharose Fast Flow 양이온 교환수지 (cation exchange chromatography, Amersham Pharmacia Biotech)에 주입한 후 폴리에틸렌 글리콜 인터페론 알파 접합체를 분리하였다. 분리 과정에서 사용된 염화나트륨 (NaCl)을 0~500 mM의 농도구배로 용출하여 분획하였다. 분획된 용출액은 HPLC 및 SDS-PAGE 분석을 통하여 반응하지 않은 인터페론 알파를 배제시키고 이중가지형 폴리에틸렌 글리콜이 N-말단에 하나만 결합된 폴리에틸렌 글리콜 인터페론 알파 접합체만을 분리하였다.

반응혼합물을 크기배제 고속액상크로마토그래피법으로 확인한 결과 반응혼합물은 약 37%의 모노-폴리에틸렌 글리콜 인터페론 알파 접합체(모노-PEG-IFNα)와 약 60%의 비변형된 인터페론 알파(IFNα)로 이루어짐을 확인하였다[도 4 참고, 흡광도 280nm에서 측정하였으며, (a)모노-PEG-IFNα 는 약 9.5분에서, (b)IFNα는 약 14분에서 관찰되었다]. 또한 매트릭스 지원 레이저 단백질 이온화-비행시간(MALDI-TOF) 질량분석기로 분자량을 확인하였으며, 그 결과는 도 10과 같으며, 그 값은 62718.9(m/z) 였다.

<비교예 3> 인터페론 알파에 N-하이드록시석신이미드 에스테르 (N-hydroxysuccinimide ester, NHS ester) 작용기를 갖는 라이신 골격구조의 이중가지형 폴리에틸렌 글리콜 (MW 40,000)을 결합시킨 폴리에틸렌 글리콜-인터페론 알파 접합체 제조

대한민국 등록특허 10-0254097에 공개된 방법에 따라 인터페론 알파 (Interferon a) 50 mg을 평균분자량 40,000 돌턴(dalton)의 이중가지형 폴리에틸렌 글리콜 N-하이드록시석신이미드 (Nektar, 미국)와 반응시켜 이중가지형 폴리에틸렌 글리콜(MW 40,000) 인터페론 알파 접합체를 얻었다.

반응혼합물을 크기배제 고속액상크로마토그래피법으로 확인한 결과 반응혼합물은 약 17%의 모노-폴리에틸렌 글리콜 인터페론 알파 접합체(모노-PEG-IFNα)와 약 74%의 비변형된 인터페론 알파(IFNα) 그리고 나머지 디-폴리에틸렌 글리콜화된 인터페론 알파 접합체(디-PEG-IFNα)와 이산물인 N-하이드록시석신이미드(NHS)로 이루어졌음을 확인하였다.[도5 참고, 흡광도 280nm에서 측정하였으며, (a)디-PEG-IFNα는 약 8.5분에서, (b)모노-PEG-IFNα 는 약 9.5분에서, (c)IFNα는 약 14분에서, (d)NHS는 약 16.5분에서 관찰되었다].

<비교예 4> 인터페론 알파에 N-하이드록시석신이미드 에스테르 (N-hydroxysuccinimide ester, NHS ester) 작용기를 갖는 라이신 골격구조의 삼중가지 형 폴리에틸렌 글리콜 (MW 43,000)을 결합시킨 폴리에틸렌 글리콜-인터페론 알파 접합체 제조

대한민국 등록특허 10-0396983에 공개된 방법에 따라 12 mg의 Tri-PEG-NHS (43000) 을 제조하고 이를 3 mg의 인터페론 알파 (Interferon a)와 반응시켜 삼중가지형 폴리에틸렌 글리콜(MW 43,000) 인터페론 알파 접합체를 얻었다.

반응혼합물을 크기배제 고속액상크로마토그래피법으로 확인한 결과 반응혼합물은 약 32%의 모노-폴리에틸렌 글리콜 인터페론 알파 접합체(모노-PEG-IFNα)와 약 52%의 비변형된 인터페론 알파(IFNα) 그리고 나머지 디-폴리에틸렌 글리콜화된 인터페론 알파 접합체(디-PEG-IFNα)와 이산물인 N-하이드록시석신이미드(NHS)로 이루어졌음을 확인하였다[도6 참고, 흡광도 280nm에서 측정하였으며, (a)디-PEG-IFNα는 약 8.5분에서, (b)모노-PEG-IFNα 는 약 9.5분에서, (c)IFNα는 약 14분에서, (d)NHS는 약 16.5분에서 관찰되었다].

이하, 상기에서 합성한 접합체를 이용하여 물성실험 및 약리활성 실험을 하였으며, 그 결과는 하기와 같다.

<실험예 1> 폴리에틸렌 글리콜 유도체와 인터페론 알파의 반응성 시험

상기에 사용된 폴리에틸렌 글리콜 유도체들과 인터페론 알파와의 반응성을 조사하기 위해 상기 실시예 1 및 2와 비교예 1, 2, 3, 및 4에서와 같이 인터페론 알파와 폴리에틸렌 글리콜을 반응시킨 후 생성되는 모노-폴리에틸렌 글리콜 인터페론 알파 접합체의 양과 반응하지 않은 인터페론 알파의 양을 크기배제 고속액상크로마토그램의 피크면적(도1, 2, 3, 4, 5, 6)으로부터 결정하였으며, 폴리에틸렌 글리콜 구조에 따른 인터페론 알파의 반응성을 알 수 있었다(표 1 및 표 2 참고). 반응하지 않은 인터페론 알파의 잔량과 형성된 모노-폴리에틸렌 글리콜 인터페론 알파 접합체의 양을 고려하였을 때, 실시예 1와 실시예 2의 삼중가지형 폴리에틸렌 글리콜과 인터페론 알파와의 결합반응이 가장 우수함을 관찰할 수 있었다.

<실험예 2> 폴리에틸렌 글리콜 인터페론 알파 접합체 분자량 확인 및 수율

상기 실시예 1 및 2와 비교예 1 및 2로부터 얻은 다른 불순물이 포함되지 않은 고순도의 폴리에틸렌 글리콜 인터페론 알파 접합체들을 매트릭스 지원 레이저 단백질 이온화-비행시간(MALDI-TOF) 질량분석기로 분석한 결과 예상 분자량과 일치함을 확인하였다(도 7, 8, 9, 10). 반응하지 않은 인터페론 잔량 및 모노-폴리에틸렌 글리콜 인터페론 알파 접합체의 수율 간의 관계에서 실시예 1 및 2가 우수한 정제 수율을 나타냄을 알 수 있다(표 1 및 표 2 참고).

[표 1] N-하이드록시석신이미드를 이용한 폴리에틸렌 글리콜 유도체와 인터페론 알파와의 반응성 및 수율 비교

PEG-IFNα	생성된 mono-PEG-IFNα(%)	반응하지 않은 IFNα (%)	수율 (%)
실시예 1	47	36	23
비교예 1	41	50	20
비교예 3	17	74	11
비교예 4	32	52	16

[표 2] 알데히드를 이용한 폴리에틸렌 글리콜 유도체와 인터페론 알파와의 반응성 및 수율 비교

PEG-IFNα	생성된 mono-PEG-IFNα(%)	반응하지 않은 IFNα (%)	수율 (%)
실시예 2	42	55	28
비교예 2	37	60	24

<실험예 3> 폴리에틸렌 글리콜-인터페론 알파 접합체의 항바이러스 활성 확인과 인비트로(in vitro) 활성 측정

상기에 사용된 고분자 유도체들과 인터페론 알파와 접합 산물이 인터페론 알파의 활성에 얼마나 영향을 미치는지에 대하여 조사하기 위하여 수포성 구내염 바이러스로 포화시킨 마딘-다비 소 신장 세포 (Marbin-Darby Bovine Kidney, MDBK)를 이용한 세포병변효과(cytophatic effect, CPE) 분석법을 실시하여 상기 실시예 1 과 비교예 1 및 3에서 얻어진 각각의 모노-폴리에틸렌 글리콜 인터페론 알파 접합체들의 항바이러스 활성을 확인하였고 생물학적 활성을 측정하여 인터페론 알파에 대한 상대 활성을 구하였다(도 11). 상대활성의 측정을 위해 인터페론 알파는 10⁵배, 비교예 1의 폴리에틸렌 글리콜 인터페로 알파 접합체는 2X10⁵배, 실시예 1의 폴 리에틸렌 글리콜 인터페로 알파 접합체는 10⁵배, 비교예 3의 폴리에틸렌 글리콜 인터페로 알파 접합체는 2X10⁴배 희석시켰으며, 이후 다시 2단계 연속 희석시킨 후 마딘-다비 소 신장 세포 (Marbin-Darby Bovine Kidney, MDBK)에 처리하고 수포성 구내염 바이러스로 포화시켰다. 이후 TCID₅₀값(tissue culture infective dose, 조직배양세포의 50% 감염량)을 나타내는 연속희석배율값을 구하여 통계적 방법에 의해 각각의 활성값을 구하였다. 폴리에틸렌 글리콜의 수식으로 인한 활성의 감소는 이중가지형 폴리에틸렌 글리콜 인터페론 알파 접합체 보다 삼중가지형 폴리에틸렌 글리콜 인터페론 알파 접합체에서 적게 일어남을 관찰할 수 있었다(표 3).

[표 3] 폴리에틸렌 글리콜 인터페론 알파 접합체의 생물학적 활성

종류	생물학적 활성(%)
IFN a	100
실시예 1	4.3
비교예 1	3.4
비교예 3	3.6

<실험예 4> 폴리에틸렌 글리콜 인터페론 알파 접합체의 약동력학 시험

인터페론 알파와 실시예 1의 폴리에틸렌 글리콜 인터페론 알파 접합체를 체중이 240 내지 260g인 랫드 (Sprague Dawley)에 피하 주사하여 약동력학시험을 실시하였다. 랫드 당 1X10⁷ IU의 약물 투여 후 0분, 30분, 1시간, 4시간, 10시간, 24 시간, 34시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 그리고 7일째의 혈액 시료를 채취하였으며, 각 시료의 항바이러스 활성을 세포병변효과(cytophatic effect, CPE) 분석법으로 측정하여 인터페론 알파와 폴리에틸렌 글리콜 인터페론 알파 접합체에 대한 T_{1 / 2}값을 얻었다(도 12). 실시예 1의 삼중가지형 폴리에틸렌 글리콜 인터페론 알파 접합체의 혈중 반감기는 인터페론 알파에 비하여 9.2배 증가되었음을 관찰할 수 있었다 (표 4).

[표 4] 랫드(Sprague Dawley rat)에서 인터페론 알파와 폴리에틸렌 글리콜 인터페론 알파 접합체들의 약동력학

	IFN a	실시예 1
Cmax	2413	47214
Tmax	1	48
MRT (hr)	5.4	87.9
CL/F (ml/hr/kg)	893.6	2.52
Vss/F (ml/kg)	4803.8	221.4
t1/2 (hr)	4.5	41.5
AUC (IU*hr/ml)	1.12E+04	3.97E+06

*상기 표에서, Tmax는 최고혈중농도 도달시간(time to maximum concentration), Cmax는 최고혈중농도(maximum concentration), MRT는 평균 혈중(약물)잔류 시간(mean residence time)을 나타내고, CL/F는 대사율(total plasma clearance)을 나타내며, Vss/F 는 정상상태 분포용적(apparent volume of distribution at steady state)을 나타내고, t1/2는 소실 반감기(elimination half-life)를 나타내며, AUC는 혈중(약물)농도 곡선하면적 (area under the concentration time curve)을 나타낸다.

<실험예 5> 폴리에틸렌 글리콜 인터페론 알파 접합체의 항종양 활성 시험

다우디 세포(Daudi cell, ATCC CCL-213)를 RAPI 1640 (Gibco, 미국) 배지에 fetal bovine serum 10%와 penicillin-streptomycin 0.5%를 첨가하여 제조한 배지를 이용하여 37℃의 CO₂ 배양기에서 2일간 배양하였다. 배양이 끝나면 세포를 배지로 1회 세척한 후 10⁶ cell/ml이 되도록 희석하였다. 인터페론 알파와 실시예 1의 삼중가지형 폴리에틸렌 글리콜 인터페론 알파 접합체를 각각 2mg/ml, 19.2 mg/ml이 되도록 희석하고 이 용액을 계속 1/10씩 연속 희석하여 모두 10개의 다른 농도를 가진 시료를 만들었다. 이후, 이렇게 희석된 시료들을 96웰 플레이트의 2-10열에 각가 100 ㎕씩 3회 분주하고 1열과 12열에는 배지만 100 ㎕씩 분주하였다. 앞서 희석한 세포를 모든 웰에 100 ㎕씩 분주하고 잘 섞어준 후 37℃의 CO₂ 배양기에서 5일간 배양하였다. 5일 후 각 웰에 40㎕의 PMS가 혼합된 MTS 용액(Promega, 미국)을 첨가하여 1.5시간 배양하고 490nm에서 흡광도를 측정하여 EC₅₀을 계산하였다. 실험결과 폴리에틸렌 글리콜 인터페론 알파 접합체는 인터페론과 유사한 양상의 항종양활성을 나타냈다(도 13).

<실험예 6> 폴리에틸렌 글리콜 인터페론 알파 접합체의 온도 안정성 시험

인터페론 알파와 실시예 1의 삼중가지형 폴리에틸렌 글리콜 인터페론 알파 접합체를 40mM NaH₂PO₄ (pH 5.0)의 완충액에 1mg/ml의 농도로 조제하고 각각 15분간 0℃, 20℃, 37℃, 50℃, 70℃, 100℃에서 일정시간 배양한 후 상온으로 온도를 조정하여 생물학적 활성을 측정하여 비교하였다(도 14). 실시예 1의 삼중가지형 폴리에틸렌 글리콜 인터페론 알파 접합체는 폴리에틸렌 글리콜이 수식되지 않은 인터페론 알파보다 약제학적으로 안정한 결과를 보였다.

<실험예 7> 폴리에틸렌 글리콜 인터페론 알파 접합체의 트립신에 대한 안정성 시험

인터페론 알파와 실시예 1의 각 폴리에틸렌 글리콜 인터페론 알파 접합체를 완충액에 1mg/ml의 농도로 조제하고 1ml 당 트립신 1mg(pH7.0)을 첨가하여 상온에서 단백분해 반응을 시켰다. 반응실시 후 5분, 10분, 20분, 40분, 60분에 각각 반응액을 취하여 잔존하는 생물학적 활성을 측정하여 비교하였다(도 15). 삼중가지형 폴리에틸렌 글리콜 인터페론 알파 접합체가 폴리에틸렌 글리콜이 수식되지 않은 인터페론 알파보다 단백질 분해효소에 보다 안정함을 알 수 있다.

본 발명은 생리적으로 활성인 글리세롤 골격구조의 새로운 삼중가지형 폴리에틸렌 글리콜-인터페론 알파 접합체에 관한 것으로 선형의 폴리에틸렌 글리콜이 갖는 다수의 선형 고분자를 단백질 또는 펩티드에 접합시킬 수 없는 한계, 가지 달린 고분자 유도체가 갖는 단백질 또는 펩티드의 표면에의 과도한 입체적 장애(steric hinderance) 유발 문제, 연결쇄를 길게한 가지달린 고분자 유도체가 갖는 낮은 순도 및 이로인한 정제 수율의 문제 등을 극복하여 보다 높은 순도와 생산수율을 나타내고 생리활성 감소는 최소화하며 혈중 반감기는 늘어나는 특징을 갖는다.

따라서 본 발명의 항바이러스 활성과 항종양 활성을 갖는 폴리에틸렌 글리콜 인터페론 알파 접합체를 포함하는 약제학적 조성물은 기존의 인터페론 알파 치료제에 비하여 최소화된 활성감소 효과와 길어진 체내 반감기로 인해 투여빈도를 줄임으로써 환자의 불편을 줄일 수 있고 치료 효과도 개선시킬 수 있는 효과를 갖는다.

Claims (12)

1. 접합체 내의 폴리에틸렌 글리콜 단위의 평균분자량이 400 내지 45,000 돌턴(dalton)인 아래 화학식(1)로 표시되는 삼중가지형 폴리에틸렌 글리콜(tri-branched polyethylene glycol)과 인터페론 알파의 접합체.

   [화학식 1]

   

   상기 식에서

   n은 1 에서 1,000, m은 10에서 1,000까지의 정수값을 나타내며,

   Z는 인터페론 알파와 폴리에틸렌 글리콜 사이의 연결쇄(linker) 역할을 하는 (CH₂)_S 또는 (CH₂)_SNHCO(CH₂)_S의 알킬렌그룹으로 S는 1에서 6까지의 정수값을 나타내고,

   Y는 인터페론 분자내의 NH₂ 작용기와 폴리에틸렌 글리콜 유도체의 작용기간의 결합 반응에 의해 생성된 아미드결합이거나 2차 아민구조를 나타낸다.
2. 제1항에 있어서, 접합체 내의 폴리에틸렌 글리콜 단위의 평균분자량이 30,000 내지 45,000인 돌턴인 접합체.
3. 제1항에 있어서, 접합체 내의 폴리에틸렌 글리콜 단위의 평균분자량이 43,000 돌턴인 접합체.
4. 하기의 화학식(2)로 표시되는 분지형 폴리에틸렌 글리콜 유도체와 인터페론 알파를 공유결합시켜 접합체 내의 폴리에틸렌 글리콜 단위의 평균분자량이 400 내지 45,000 돌턴(dalton)인 화학식(1)로 표시되는 삼중가지형 폴리에틸렌 글리콜과 인터페론 알파와의 접합체를 제조하는 방법.

   [화학식 1]

   

   상기 식에서

   n은 1 에서 1,000, m은 10에서 1,000까지의 정수값을 나타내며,

   Z는 인터페론 알파와 폴리에틸렌 글리콜 사이의 연결쇄(linker) 역할을 하는 (CH₂)_S 또는 (CH₂)_SNHCO(CH₂)_S의 알킬렌그룹으로 S는 1에서 6까지의 정수값을 나타내고,

   Y는 인터페론 분자내의 NH₂ 작용기와 폴리에틸렌 글리콜 유도체의 작용기간의 결합반응에 의해 생성된 아미드결합이거나 2차 아민구조를 나타내며,

   [화학식 2]

   

   상기식에서

   n은 1 에서 1,000,

   m은 10 에서 1,000까지의 정수값을 가지며,

   X는 아래와 같은 화학식(3)으로 표시되는 인터페론 알파를 포함한 단백질 및 펩티드와 화학적으로 반응할 수 있는 작용기이고,

   [화학식 3]

   

   Z는 인터페론 알파와 폴리에틸렌 글리콜 사이의 연결쇄(linker) 역할을 하는 (CH₂)_S 또는 (CH₂)_SNHCO(CH₂)_S의 알킬렌그룹으로 S는 1에서 6까지의 정수값을 가진다.
5. 제4항에 있어서, 접합체 내의 폴리에틸렌 글리콜 단위의 평균분자량이 30,000 내지 45,000 돌턴인 제조 방법
6. 제4항에 있어서, 접합체 내의 폴리에틸렌 글리콜 단위의 평균분자량이 43,000 돌턴인 제조 방법
7. 제4항에 있어서, X가 화학식 3에서 (a) 또는 (b)인 제조방법.
8. 제4항에 있어서, 인터페론 알파와 분지형 폴리에틸렌 글리콜 유도체의 반응 몰비가 1:0.5에서 1:50인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
9. 제8항에 있어서, 인터페론 알파와 분지형 폴리에틸렌 글리콜 유도체의 반응 몰비가 1:0.5 에서 1: 3인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 접합체를 유효성분으로 하는 인터페론 알파 감수성 질환 치료용 또는 예방용 약제학적 조성물.
11. 제10항에 있어서, 인터페론 알파 감수성 질환이 모양세포성백혈병, 카포지 육종, 만성골수 백혈병, 비-세포 림프종, 티-세포 림프종, 흑색종, 골수종, 신세포암인 약제학적 조성물.
12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 접합체를 유효성분으로 하여 인터페론 알파 감수성 질환을 치료 또는 예방하는 방법.

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