NO344612B1 - Farmasøytisk preparat omfattende interferon beta (IFN β) og konjugat omfattende reaksjonsprodukter av en aktivert polyalkylenglykolpolymer samt fremgangsmåte for fremstilling av slike. - Google Patents

Farmasøytisk preparat omfattende interferon beta (IFN β) og konjugat omfattende reaksjonsprodukter av en aktivert polyalkylenglykolpolymer samt fremgangsmåte for fremstilling av slike. Download PDF

Info

Publication number
NO344612B1
NO344612B1 NO20151082A NO20151082A NO344612B1 NO 344612 B1 NO344612 B1 NO 344612B1 NO 20151082 A NO20151082 A NO 20151082A NO 20151082 A NO20151082 A NO 20151082A NO 344612 B1 NO344612 B1 NO 344612B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
ifn
kda mpeg
methylpropionaldehyde
kda
alkyl
Prior art date
Application number
NO20151082A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20151082A1 (no
Inventor
Darren P Baker
Russell C Petter
Ko-Chung Lin
Ling Ling Chen
Donna M Hess
Edward Y Lin
Blake Pepinsky
Original Assignee
Biogen Ma Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biogen Ma Inc filed Critical Biogen Ma Inc
Publication of NO20151082A1 publication Critical patent/NO20151082A1/no
Publication of NO344612B1 publication Critical patent/NO344612B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/31—Somatostatins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/34—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from hydroxy compounds or their metallic derivatives
    • C08G65/48—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L71/00—Compositions of polyethers obtained by reactions forming an ether link in the main chain; Compositions of derivatives of such polymers
    • C08L71/02—Polyalkylene oxides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L2203/00—Applications
    • C08L2203/02—Applications for biomedical use

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Polyethers (AREA)

Description

Oppfinnelsen angår nye polyalkylenglykolforbindelser, konjugater av polymerene og proteiner, samt anvendelser av disse.
Kovalent tilknytning av hydrofile polymerer, så som polyalkylenglykolpolymerer, også kjent som polyalkylenoksider, til biologisk aktive molekyler og overflater er aktuelt innenfor bioteknologi og medisin.
Spesielt har mye forskning fokusert på anvendelse av poly(etylenglykol) (PEG), også kjent som poly(etylenoksid) (PEO), konjugater for forøking av solubilitet og stabilitet og for forlengelse av molekylers halveringstid i blodsirkulasjonen.
I sin mest alminnelige form er PEG en lineær polymer som er avsluttet i hver ende med hydroksylgrupper:
H0-CH2CH20-(CH2CH20)n-CH2CH2-0H.
Ovennevnte polymer, alfa-, omega-dihydroksylpoly(etylenglykol), kan også representeres som HO-PEG-OH, hvor det er underforstått at -PEG-symbolet representerer følgende strukturenhet:
-CH2CH20-(CH2CH20)n-CH2CH2-,
hvor n typisk er i området fra ca. 4 til ca. 10000. PEG anvendes vanligvis som metoksy-PEG-OH, eller mPEG, hvor én ende er den relativt inerte metoksygruppe, mens den andre ende er en hydroksylgruppe som er utsatt for lett kjemisk modifikasjon. Dessuten kan tilfeldige eller blokk-kopolymerer av forskjellige alkylenoksider (f.eks. etylenoksid og propylenoksid) som er nær beslektet med PEG i sin kjemi, innsettes i stedet for PEG ved mange av dens anvendelser.
For kopling av PEG til et aktuelt molekyl er det ofte nødvendig å aktivere PEG ved fremstilling av et derivat av PEG med en reaktiv funksjonell gruppe i det minste i én ende. Den funksjonelle gruppe velges basert på typen tilgjengelig reaktiv gruppe på molekylet som vil bli koplet til PEG.
PEG er en polymer med egenskapene for løselighet i vann og i mange organiske løsningsmidler, mangel på toksisitet og mangel på immunogenitet. Én anvendelse av PEG er å knytte polymeren kovalent til uløselige molekyler for å gjøre det resulterende PEG-molekyl-"konjugat" løselig. Det er for eksempel vist at det vann-uløselige medikament paclitaxel blir vannløselig ved kopling til PEG. Greenwald et al, J. Org Chem., 60:331-336 (1995).
Prodroge-fremgangsmåten, hvor medikamenter frigjøres ved nedbrytning av mer komplekse molekyler (prodroger) under fysiologiske betingelser, er en kraftig virkende komponent ved medikamentavgivelse. Prodroger kan for eksempel dannes ved binding av PEG til medikamenter via bindinger som kan nedbrytes under fysiologiske betingelser. PEG-prodrogers levetid in vivo avhengiger av typen av funksjonell(e) gruppe(r) som danner bindinger mellom PEG og medikamentet. Vanligvis hydrolyserer esterbindinger, dannet ved reaksjon mellom PEG-karboksylsyrer eller aktiverte PEG-karboksylsyrer og alkoholgrupper på medikamentet, under fysiologiske betingelser under frigjøring av medikamentet, mens amid- og karbamatbindinger, dannet av amingrupper på medikamentet, er stabile og ikke hydrolyserer under frigjøring av det frie medikament. Det er vist at hydrolytisk avgivelse av medikamenter fra PEG-estere med hell kan reguleres i en viss utstrekning ved regulering av antallet sammenbindende metylengrupper i et avstandsmateriale mellom det terminale PEG-oksygen og karbonylgruppen på den tilknyttede karboksylsyre elter karboksylsyrederivat. For eksempel beskriver Harris et al. i US-patent nr. 5672 662 PEG-smørsyre og PEG-propansyre, og aktiverte derivater derav, som alternativer til karboksylmetyl-PEG for forbindelser hvor mindre hydrolytisk reaktivitet i de tilsvarende esterderivater er ønskelig. Se generelt PCT-publikasjon WO 01/46291.
Én faktor som begrenser anvendeligheten av proteinholdige substanser for medisinske behandlingsanvendelser, er at de ved parenteral tilførsel elimineres fra kroppen på kort tid. Denne eliminering kan finne sted som resultat av nedbrytning ved proteaser elter ved "clearance" under anvendelse av normale veier for proteineliminering så som ved filtrering i nyrene. Oral administrering av disse substanser er enda mer problematisk på grunn av at den høye surhet i magesekken, i tillegg til proteolyse i magesekken, ødelegger disse substanser før de når sitt påtenkte målvev. Problemene som er forbundet med disse administreringsmåter, er velkjente innenfor den farmasøytiske industri, og forskjellige strategier anvendes i forsøk på å løse dem. Det er publisert en stor mengde arbeid som angår proteinstabilisering. Det er kjent forskjellige måter til konjugering av proteiner med polymermaterialer, innbefattende anvendelse av dekstraner, polyvinylpyrrolidoner, glykopeptider, polyetylenglykol og polyaminosyrer. De resulterende konjugerte polypeptider er rapportert å bibeholde sine biologiske aktiviteter og løselighet i vann for parenterale anvendelser.
Av spesiell interesse er øking av den biologiske aktivitet av interferoner mens toksisiteten som inngår ved anvendelse av disse proteiner for behandling av mennesker, reduseres. Interferoner er en familie av naturlig forekommende små proteiner og glykoproteiner dannet og utskilt av de fleste celler med kjerne, som svar på virusinfeksjon samt på andre antigene stimuli. Interferoner gjør celler resistente mot virusinfeksjon og oppviser mange forskjellige virkninger på celler. De utøver sine celleaktiviteter ved binding til spesifikke membranreseptorer på celleoverflaten. Når interferoner er blitt bundet til cellemembranen, setter de i gang en kompleks sekvens av intracellulære hendelser. In vitro-undersøkelser har vist at disse innbefatter induksjon av visse enzymer; undertrykking av celleproliferasjon, immunmodulerings-aktiviteter så som øking av den fagocytiske aktivitet av makrofager; forsterkning av den spesifikke cytotoksisitet av lymfocytter for målceller; og inhibering av virusreplikasjon i virus-infiserte celler.
Interferoner er blitt testet ved behandling av forskjellige kliniske sykdomstilstander. Anvendelse av humant interferon beta er blitt etablert ved behandling av multippel sklerose. Det er nylig gitt lisens for to former for rekombinant interferon beta i Europa og USA for behandling av denne sykdom: interferon-beta-1 a (AVONEX®, Biogen, Inc., Cambridge, MA og REBIF®, Serono, Geneve, Sveits) og interferon-beta-1 b (BETASERON®, Berlex, Richmond, CA). Interferon beta-1a dannes i pattedyrceller ved anvendelse av den naturlige humane gensekvens og er glykosylert, mens interferon beta-1b dannes i E. colibakterier ved anvendelse av en modifisert human gensekvens som inneholder en genteknologisk frembrakt cystein-til-serin-substitusjon ved aminosyrestilling 17, og er ikke-glykosylert.
Ikke-immun-interferoner, som innbefatter både alfa- og beta-interferoner, er kjent for å undertrykke humant immunsviktvirus (HIV) både i akutt og kronisk infiserte celler. Se Poli og Fauci, 1992, AIDS Research and Human Retroviruses 8(2): 191 -197. På grunn av sin antivirus-aktivitet har interferoner, spesielt alfainterferoner, fått betydelig oppmerksomhet som terapeutiske midler ved behandling av heptatitt C-virus-(HCV)-tilknyttet sykdom. Se Hoofnagle et al., i: Viral Hepatitis 1981 International Symposium, 1982, Philadelphia, Franklin Institute Press; Hoofnagle et al., 1986, New Eng. J. Med. 315:1575-1578;
Thomson, 1987, Lancet 1:539-541 Kiyosawa et al., 1983, i: Zuckerman, red., Viral Hepatitis and Liver Disease, Allen K. Liss, New York s. 895-897; Hoofnagle et al., 1985, Sem. Liv. Dis., 1985, 9:259-263.
Interferon-polymer-konjugater er beskrevet for eksempel i US-patent nr. 4 766 106, US-patent nr. 4917 888, europeisk patentsøknad nr. 0236987, europeisk patentsøknad nr. 0510 356 og publisert internasjonal patentsøknad nr. WO 95/13090. WO 00/23114 beskriver polymerkonjugater av interferon 3-la og deres anvendelse.
Kronisk hepatitt C er en snikende sykdom med langsom utvikling med en betydelig påvirkning på livskvaliteten. Til tross for forbedring i kvaliteten av bloddonor-reserven og den nylige implementering av testing av donert blod med henblikk på HCV, er den beregnede forekomst av akutt infeksjon blant personer som får transfusjoner, 5-10%. Se Alter et al. i: Zuckerman, red., Viral Hepatitis and Liver Disease, Allen K. Liss, New York, 1988, s. 537-542. Således vil det blant de omtrent 3 millioner personer som får transfusjoner i USA hvert år, utvikles akutt hepatitt C hos ca. 150000. Skjønt mange pasienter som pådrar seg hepatitt C, vil ha subklinisk eller mild sykdom, vil ca. 50% fortsette til en kronisk sykdomstilstand kjennetegnet ved vekslende serumtransaminase-abnormiteter og inflammatoriske lesjoner ved leverbiopsi. Det er beregnet at cirrhose vil utvikles hos opp til ca. 20% i denne gruppe. Se Koretz et al., 1985, Gastroenterology 88:1251-1254.
Interferoner er kjent for å påvirke forskjellige cellefunksjoner, innbefattende DNA-replikasjon, samt RNA- og proteinsyntese, både i normale og unormale celler. Følgelig er cytotoksiske virkninger av interferon ikke begrenset til tumor eller virusinfiserte celler, men viser seg også i normale, friske celler. Som resultat kan det oppstå uønskede bivirkninger under interferonterapi, spesielt når det er nødvendig med høye doser. Admininstrering av interferon kan føre til myelosuppresjon, noe som resulterer i redusert mengde av røde blodlegemer og reduserte nivåer av hvite blodlegemer og blodplater. Interferoner gir vanligvis opphav til influensaliknende symptomer (f.eks. feber, tretthet, hodepine og forkjølelse), gastrointestinale forstyrrelser (f.eks. anoreksi, kvalme og diaré), svimmelhet og hoste. Ofte er den vedvarende respons hos HCV-pasienter overfor ikke-PEGylert interferonbehandling lav, og behandlingen kan indusere alvorlige bivirkninger, innbefattende retinopati, tyreoiditt, akutt pankreatitt og depresjon.
De uønskede bivirkninger som ledsager interferonterapi begrenser ofte den terapeutiske anvendelighet av interferonbehandlingsregimener. Følgelig er det et behov for å opprettholde eller forbedre de terapeutiske fordeler ved slik terapi mens de uønskede bivirkninger reduseres eller elimineres.
Beskrivelsen angår nye polyalkylenglykolforbindelser, konjugater av disse forbindelser og anvendelser av dem.
Basert på foreliggende beskrivelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et farmasøytisk preparat omfattende et konjugat og en farmasøytisk akseptabel bærer, adjuvans, fortynningsmiddel, konserveringsmiddel og/eller solubiliseringsmiddel,
hvor konjugatet omfatter reaksjonsproduktet av en aktivert polyalkylenglykol polymer og B, hvor
B er en interferon beta (IFN 3); og
nevnte aktivert polyalkylenglykolpolymer er 20 kDa mPEG-O-2-metylpropionaldehyd, 20 kDa mPEG-O-p-metylfenyl-O-2-metylpropionaldehyd, 20 kDa mPEG-O-m-metylfenyl-O-2-metylpropionaldehyd, 20 kDa mPEG-O-p- fenylacetaldehyd, 20 kDa mPEG-O-p-fenylpropionaldehyd eller 20 kDa mPEG-O-mfenylacetaldehyd.
I et relatert aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av det farmasøytiske preparat ifølge oppfinnelsen omfattende følgende trinn:
(a) tilsetning av en aktivert polyalkylenglykolpolymer til en IFn 3 løsning for å danne en blanding, hvor nevnte aktiverte polyalkylenglykolpolymer er 20 kDa mPEG-O-2- metylpropionaldehyd, 20 kDa mPEG-O-p-metylfenyl-O-2-metylpropionaldehyd, 20 kDa mPEG-O-m-metylfenyl-O-2-metylpropionaldehyd, 20 kDa mPEG-O-p- fenylacetaldehyd, 20 kDa mPEG-O-p-fenylpropionaldehyd eller 20 kDa mPEG-O-mfenylacetaldehyd;
(b) omsetning av nevnte aktiverte polyalkylen glykolpolymer med nevnte IFN 3 i nærvær av natriumcyanoborhydrid via reduktiv alkylering for å danne et konjugat; og
(c) kombinasjon av nevnte konjugat med en farmasøytisk akseptabel bærer, adjuvans, fortynningsmiddel, konserveringsmiddel og/eller
solubiliseringsmiddel.
Foreliggende oppfinnelse og utførelsesformer er definert i vedlagte krav.
Foreliggende beskrivelse samt foreliggende oppfinnelse vil bli bedre forstått ut fra følgende beskrivelse med henvisning til tabellene, hvor:
FIG. 1 er en reduserende SDS-PAGE-gel som viser renheten av umodifisert IFN-3-1a og 20 kDa mPEG-O-2-metylpropionaldehyd-modifisert IFN-3-1a: Bane A: molekylvektmarkører (fra topp til bunn; henholdsvis 100 kDa, 68 kDa, 45 kDa, 27 kDa og 18 kDa); Bane B: 4 pg umodifisert IFN-3-1a; Bane C: 4 pg 20 kDa mPEG-0-2metylpropionaldehyd-modifisert IFN-3-1a.
FIG. 2 viser spor av størrelseseksklusjonskromatografi av umodifisert IFN-3-la og 20 kDa mPEG-O-2-metylpropionaldehyd-modifisert IFNβ-1a: Felt A: molekylvektstandarder; Felt B: 20 kDa mPEG-O-2-metylpropionaldehyd-modifisert IFNβ-1a; Felt C, umodifisert IFNβ-1a.
FIG. 3 er et spor av størrelseseksklusjonskromatografi av 20 kDa mPEG-O-m-metylfenyl-O-2-metylpropionaldehyd-modifisert IFNβ-1a.
FIG. 4 er en reduserende SDS-PAGE-gel som viser renheten av umodifisert IFN-3-la og 20 kDa mPEG-O-p-fenylacetaldehyd-modifisert ΙFN-3-la: Bane A: 2,5 μg 20 kDa mPEG-O-p-fenylacetaldehyd-modifisert ΙΡΝ-3-la; Bane B: 2,5 pg umodifisert ΙFΝ-3-la; Bane C: molekylvektmarkører (fra topp til bunn; henholdsvis 100 kDa, 68 kDa, 45 kDa, 27 kDa og 18 kDa).
FIG. 5 viser spor av størrelseseksklusjonskromatografi av 20 kDa mPEG-O-pfenylacetaldehyd-modifisert IFNβ-1a; Felt A: molekylvektstandarder; Felt B: 20 kDa mPEG-O-p-fenylacetaldehyd-modifisert IFNβ-1a.
FIG. 6 er en reduserende SDS-PAGE-gel som viser stabiliteten av 20 kDa mPEG-O-p-fenylacetaldehyd-modifisert ΙFΝ-3-la: Bane A: molekylvektmarkører (fra topp til bunn; henholdsvis 100 kDa, 68 kDa, 45 kDa, 27 kDa, 18 kDa og 15 kDa); Baner B, C, D og E: 2 pg 20 kDa mPEG-O-p-fenylacetaldehyd-modifisert IFN-3-Ι a fjernet for analyse på henholdsvis dag 0, 2, 5 og 7.
FIG. 7A-B viser den antivirale aktivitet av forskjelige PEGylerte humane IFNβ-1a-prøver som funksjon av proteinkonsentrasjon: FIG. 7A; umodifisert IFN-3-la (O), 20 kDa mPEG-O-2-metylpropionaldehyd-modifisert IFNβ-1a (□), 20 kDa mPEG-O-p-metylfenyl-O-2-metylpropionaldehyd-modifisert IFNβ-1a (Δ) og 20 kDa mPEG-O-m-metylfenyl-O-2-metylpropionaldehyd-modifisert IFNβ-1a (O).
FIG. 7B; umodifisert IFN-3-1a (O), 20 kDa mPEG-O-p-fenylacetaldehyd-modifisert IFN-3-1a (□), 20 kDa mPEG-O-p-fenylpropionaldehyd-modifisert IFN-3-1a (Δ) og 20 kDa mPEG-O-m-fenylacetaldehyd-modifisert IFN-3-1a (O).
FIG. 8 A-B er diagrammer som viser farmakokinetikken for umodifisert og forskjellige PEGylerte humane IFN-3-1a-prøver: FIG. 8A: Umodifisert IFN-3-1a (øvre felt) og IFN-3-1a modifisert med 20 kDa mPEG-O-2-metylpropionaldehyd (nedre felt); FIG. 8B: IFN-3-1a modifisert med 20 kDa mPEG-O-p-metylfenyl-O-2-metylpropionaldehyd (øvre felt) og 20 kDa mPEG-O-p-fenylacetaldehyd (nedre felt).
FIG. 9 A-B er diagrammer som viser farmakokinetikken for umodifisert og forskjellige PEGylerte humane IFN-3-1a-prøver: FIG. 9A: Umodifisert IFN-3-1a (øvre felt) og IFN-3-1a modifisert med 20 kDa mPEG-O-p-fenylpropionaldehyd (nedre felt); FIG. 9B: IFN-3-1a modifisert med 20 kDa mPEG-O-mfenylacetaldehyd (øvre felt) og 20 kDa mPEG-O-m-metylfenyl-O-2-metylpropionaldehyd (nedre felt).
FIG. 10 er et søylediagram som sammenlikner en enkelt administrering av 20 kDa mPEG-O-2-metylpropionaldehyd-modifisert IFN-3-1a med daglig administrering av umodifisert IFN-3-1a med henblikk på redusering av antallet radialt orienterte nye kar i nu/nu-mus som bærer humane maligne SK-MEL-1-melanomceller: behandling med bærerkontroll én gang bare på dag 1 (søyle A); behandling med 1 ME (5 μg) umodifisert IFN-3-1a daglig på dagene fra og med 1 til og med 9 (søyle B);
behandling med 1 ME (10 μg) 20 kDa mPEG-O-2-metylpropionaldehyd-modifisert IFN-3-1a én gang bare på dag 1 (søyle C); og behandling med bærerkontroll daglig på dagene fra og med 1 til og med 9 (søyle D).
Beskrivelsen er rettet mot forbindelser og fremgangsmåter som er anvendelige til behandling av forskjellige sykdommer og forstyrrelser. Som forklart detaljert nedenfor, innbefatter slike sykdommer og forstyrrelser spesielt slike som er mottakelige for behandling med interferonterapi, innbefattende virusinfeksjoner så som hepatittinfeksjoner og autoimmune sykdommer så som multippel sklerose.
Forbindelsene ifølge beskrivelsen innbefatter nye, aktiverte polyalkylenglykol-forbindelser ifølge formel I:
Formel I
hvor P er en vannløselig polymer så som en polyalkylenglykol-polymer. En liste over slike polymerer innbefatter andre polyalkylenoksid-homo-polymerer så som polypropylenglykoler, polyoksyetylenerte polyoler, kopolymerer av disse og blokkkopolymerer av disse. Andre eksempler på egnede vannløselige og ikkepeptidiske polymerskjeletter innbefatter poly(oksyetylert polyol), poly(olefinisk alkohol), poly(vinylpyrrolidon), poly(hydroksypropylmetakrylamid), poly(ochydroksy-syre), poly(vinylalkohol), polyfosfazen, polyoksazolin, poly(N-akryloylmorfolin) og kopolymerer, terpolymerer og blandinger av disse. I ett tilfelle er polymerskjelettet poly(etylenglykol) eller monometoksypolyetylen-glykol (mPEG) med en gjennomsnittlig molekylvekt på fra ca. 200 Da til ca. 400000 Da. Det må være klart at andre beslektede polymerer også er egnet for anvendelse ved utøvelse av denne beskrivelsen, og at anvendelse av betegnelsen PEG eller poly(etylenglykol) er ment å være inkluderende og ikke ekskluderende i denne henseende. Betegnelsen PEG innbefatter poly(etylenglykol) i hvilken som helst av dens former, innbefattende alkoksy-PEG, difunksjonell PEG, multi-armet PEG, gaffelgrenet PEG, forgrenet PEG, vedhengende PEG eller PEG med nedbrytbare bindinger.
I klassen av forbindelser representert ved formel I er det mellom null og fem metylengrupper mellom Y og det Z-holdige karbon (f.eks. er n null eller et helt tall fra én til fem) og m er null eller én; f.eks. er Y til stede eller fraværende.
X og Y er uavhengig O, S, CO, C02, COS, SO, SO2, CONR', S02NR' eller NR'. I noen tilfeller er X og Y oksygen.
Q er et mettet eller umettet cyklisk C3- til Cs-alkyl eller -heteroalkyl (innbefattende kondenserte bicykliske og brosammenknyttede bicykliske ringstrukturer), en substituert eller usubstituert aryl- eller heteroarylgruppe eller et substituert eller usubstituert alkaryl hvor alkylet er en mettet eller umettet C1- til C2o-alkyl- eller -heteroalkarylgruppe. Substituentene kan være halogen, hydroksyl, karbonyl, karboksylat, ester, formyl, acyl, tiokarbonyl, tioester, tioacetat, tioformiat, alkoksyl, fosforyl, fosfonat, fosfinat, amino, amido, amidin, imin, cyano, nitro, azido, sulfhydryl, sulfat, sulfonamido, sulfonyl, heterocyklyl, aralkyl, aromatic del, heteroaromatisk del, imino, sulfamoyl, sulfonat, silyl, eter eller alkyltio.
Z-substituenten er hydrogen, en rettkjedet eller forgrenet, mettet eller umettet Ci- til C20- alkyl- eller -heteroalkylgruppe, mettet eller umettet cyklisk C3- til Cs-alkyl eller -heteroalkyl, en substituert eller usubstituert aryl- eller heteroarylgruppe eller et substituert eller usubstituert alkaryl hvor alkylet er en mettet eller umettet C1- til C2o-alkyl- eller -heteroalkarylgruppe. Substituentene kan være halogen, hydroksyl, karbonyl, karboksylat, ester, formyl, acyl, tiokarbonyl, tioester, tioacetat, tioformiat, alkoksyl, fosforyl, fosfonat, fosfinat, amino, amido, amidin, imin, cyano, nitro, azido, sulfhydryl, sulfat, sulfonat, sulfamoyl, sulfonamido, sulfonyl, heterocyklyl, aralkyl, aromatisk del, heteroaromatisk del, imino, sulfamoyl, sulfonat, silyl, eter eller alkyltio.
Når X eller Y er NR', kan R' være hydrogen, en rettkjedet eller forgrenet, mettet eller umettet C1- til C2o-alkyl- eller -heteroalkylgruppe, et mettet eller umettet cyklisk C3- til Cs-alkyl eller -heteroalkyl, en substituert eller usubstituert aryl- eller heteroarylgruppe eller et substituert eller usubstituert alkaryl, hvor alkylet er en mettet eller umettet C1- til C2o-alkyl- eller -heteroalkarylgruppe.
Substituentene kan være halogen, hydroksyl, karbonyl, karboksylat, ester, formyl, acyl, tiokarbonyl, tioester, tioacetat, tioformiat, alkoksyl, fosforyl, fosfonat, fosfinat, amino, amido, amidin, imin, cyano, nitro, azido, sulfhydryl, sulfat, sulfonat, sulfamoyl, sulfonamido, sulfonyl, heterocyklyl, aralkyl, aromatisk del, heteroaromatisk del, imino, sulfamoyl, sulfonat, silyl, eter eller alkyltio.
R er en reaktiv funksjonell gruppe, dvs. en aktiverende del som kan reagere under dannelse av en binding eller en kopling mellom forbindelsen med formel I og en biologisk aktiv forbindelse eller en forløper for denne. R representerer således den "aktiverende gruppe" av de aktiverte polyalkylenglykolforbindelser (PGC) representert ved formel I. R kan for eksempel være en karboksylsyre, ester, aldehyd, aldehyd-hydrat, acetal, hydroksy, beskyttet hydroksy, karbonat, alkenyl, akrylat, metakrylat, akrylamid, substituert eller usubstituert tiol, halogen, substituert eller usubstituert am in, beskyttet am in, hydrazid, beskyttet hydrazid, suksinimidyl, isocyanat, isotiocyanat, ditiopyridin, vinylpyridin, jodacetamid, epoksid, hydroksysuksinimidyl, azol, maleimid, sulfon, allyl, vinylsulfon, tresyl, sulfo-N-suksinimidyl, dion, mesyl, tosyl eller glyoksal. I spesielle tilfeller er R et aldehydhydrat.
Spesifikke eksempler på R i litteraturen innbefatter N-suksinimidylkarbonat (se f.eks. US-patenter nr. 5281 698 og 5468 478), amin (se f.eks. Buckmann et al. Makromol. Chem. 182:1379 (1981), Zaplipsky et al. Eur. Polym. J. 19:1177 (1983)), hydrazid (se f.eks. Andresz et al. Makromol. Chem. 179:301 (1978)), suksinimidyl-propionat og suksinimidyl-butanoat (se f.eks. Olson et al. i Po/y (ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, s. 170-181, Harris & Zaplipsky red., ACS, Washington, DC, 1997; se også US-patent nr. 5672 662), suksinimidylsuksinat (se f.eks. Abuchowski et al. Cancer Biochem. Biophys. 7:175 (1984) og Joppich et al. Macrolol. Chem. 180:1381(1979), suksinimidylester (see f.eks. US-patent nr. 4670 417), benzotriazolkarbonat (se f.eks. US-patent nr. 5 650 234), glycidyleter (se f.eks. Pitha et al. Eur. J. Biochem. 94:11(1979), Elling et al., Biotech. Appl. Biochem. 13:354 (1991), oksykarbonylimidazol (se f.eks. Beauchamp et al., Anal. Biochem. 131:25 (1983). Tondelli et al. J. Controlled Release 1:251 (1985)), p-nitrofenylkarbonat (se f.eks. Veronese, et al., Appl.
Biochem. Biotech., 11:141 (1985); og Sartore et al., Appl. Biochem. Biotech., 27:45 10 (1991)), aldehyd (se f.eks. Harris et al. J. Polym. Sci. Chem. red. 22:341 (1984), US-patent nr. 5824 784, US-patent 5252 714), maleimid (se f.eks.
Goodson et al. Bio/Technology 8:343 (1990), Romani et al. i Chemistry of Peptides and Proteins 2:29 (1984)), og Kogan, Synthetic Comm. 22:2417 (1992)), orthopyridyl-disulfide (se f.eks. Woghiren, et al. Bioconj. Chem. 4:314 (1993)), akrylol (se f.eks. Sawhney 15 et al., Macromolecules, 26:581 (1993)), vinylsulfon (se f.eks. US-patent nr. 5900 461). Dessuten kan to molekyler av polymeren ifølge denne beskrivelsen også knyttes til aminosyren lysin under dannelse av et di-substituert lysin, som så kan aktiveres ytterligere med N-hydroksysuksinimid under dannelse av en aktiv N-suksinimidyl-del (se f.eks. US-patent nr. 5932462).
Betegnelsene "funksjonell gruppe", "aktiv del", "aktiv gruppe", "aktiverende gruppe", "aktiverende del", "reaktivt sete", "kjemisk reaktiv gruppe" og "kjemisk reaktiv del" er anvendt på fagområdet og i det foreliggende for henvisning til atskilte, definerbare deler eller enheter av et molekyl. Betegnelsene er noe synonyme på de kjemiske områder og er anvendt i det foreliggende for å angi delene av molekyler med en karakteristisk kjemisk aktivitet og som typisk er reaktive med andre molekyler. Betegnelsen "aktiv" anvendt i forbindelse med funksjonelle grupper er ment å innbefatte de funksjonelle grupper som lett reagerer med elektrofile eller nukleofile grupper på andre molekyler, i motsetning til de grupper som fordrer sterke katalysatorer eller meget upraktiske reaksjonsbetingelserfor å reagere. Som fagfolk på området vil være klar over, vil betegnelsen "aktiv ester" innbefatte de estere som lett reagerer med nukleofile grupper så som aminer. En aktiv ester vil typisk reagere med et amin i vandig medium i løpet av få minutter, mens visse estere, så som metyl- eller etylestere, fordrer en sterk katalysator for å reagere med en nukleofil gruppe.
I forbindelsene ifølge beskrivelsen som definert ovenfor blir den funksjonelle gruppe R en sammenbindende del, R*, etter at den har reagert med et biologisk aktivt molekyl under dannelse av en forbindelse eller binding mellom den aktiverte polyalkylenglykol-forbindelse (PGC) og den biologisk aktive forbindelse. Således er B en biologisk aktiv forbindelse etter konjugering til PGC, og R* er en del dannet ved reaksjon mellom R på den aktiverte PGC og én eller flere reaktive funksjonelle grupper på den biologisk aktive forbindelse, B, slik at resultatet blir en enkelt kovalent tilknytning mellom PGC og den biologisk aktive forbindelse. I et foretrukket tilfelle er R* en del dannet ved reaksjon mellom R på den aktiverte PGC og en enkelt reaktiv funksjonell gruppe på den biologisk aktive forbindelse, slik at resultatet er en kovalent sammenknytning mellom den aktiverte polyalkylenglykol-forbindelse (PGC) og den biologisk aktive forbindelse.
Den biologisk aktive forbindelse eller forløperen for denne (B) blir fortrinnsvis ikke ugunstig påvirket ved tilstedeværelsen av PGC. Dessuten har B enten naturlig en funksjonell gruppe som er i stand til å reagere med og danne en binding med den aktiverte PGC, eller den er modifisert til å inneholde en slik reaktiv gruppe.
Anvendt i det foreliggende er en forløper for B en inaktiv eller mindre aktiv form av B som forandres til henholdsvis den aktive eller mer aktive form ved kontakt med fysiologiske betingelser, f.eks. administrering til et individ. Slike forandringer kan være konformasjonelle eller strukturelle forandringer, innbefattende forandring fra en beskyttet form til en ikke-beskyttet form av B. Anvendt i det foreliggende innbefatter ikke en slik forandring frigjøring av de konjugerte PGCer ifølge denne beskrivelse.
Som fagfolk på området vil være klar over, angir betegnelsen "beskyttet" tilstedeværelse av en beskyttende gruppe eller del som hindrer reaksjon av den kjemisk reaktive funksjonelle gruppe under visse reaksjonsbetingelser. Den beskyttende gruppe vil variere avhengig av typen kjemisk reaktiv gruppe som beskyttes. Hvis for eksempel den kjemisk reaktive gruppe er et amin eller et hydrazid, kan den beskyttende gruppe være valgt fra gruppen av tertbutyloksykarbonyl (t-Boc) og 9-fluorenylmetoksykarbonyl (Fmoc). Hvis den kjemisk reaktive gruppe er en tiol, kan den beskyttende gruppe være ortopyridyldisulfid. Hvis den kjemisk reaktive gruppe er en karboksylsyre, så som smørsyre eller propionsyre, eller en hydroksylgruppe, kan den beskyttende gruppe være benzyl eller en alkylgruppe så som metyl eller etyl. Andre beskyttende grupper kjent på området kan også anvendes ifølge beskrivelsen.
Betegnelsene "sammenbindende del", "binding" eller "binder" er anvendt i det foreliggende for å angi deler eller bindinger som er dannet som resultat av en kjemisk reaksjon, og er typisk kovalente bindinger. Følgelig er bindingen representert ved kopling R*-B i ovennevnte formler et resultat av reaksjon mellom en aktivert del, R, på PGC med en biologisk aktiv forbindelse, dvs. B'. R* er den sammenbindende del dannet ut fra R ved reaksjon med B', og B er den biologisk aktive forbindelse konjugert til PGC ved reaksjon mellom en funksjonell gruppe på B' og R.
Anvendt i det foreliggende angir betegnelsen "biologisk aktiv forbindelse" de forbindelser som viser én eller flere biologiske responser eller virkninger ved administrering til et individ, og inneholder reaktive grupper som inneholder reaktive deler som er i stand til å reagere med og konjugeres til minst én aktivert PGC ifølge beskrivelsen. Betegnelsen "biologisk aktivt molekyl", "biologisk aktiv del" eller "biologisk aktivt middel" anvendt i det foreliggende angir hvilken som helst substans som kan påvirke eventuelle fysiske eller biokjemiske egenskaper hos hvilket som helst individ, innbefattende virus, bakterier, sopp, planter, dyr og mennesker. Som anvendt i det foreliggende, innbefatter biologisk aktive molekyler hvilken som helst substans påtenkt for diagnostisering, helbredelse, lindring, behandling eller forebygging av sykdommer hos mennesker eller andre dyr, eller for på annen måte å forbedre fysisk eller mentalt velvære for mennesker eller dyr.
Eksempler på biologisk aktive molekyler innbefatter peptider, peptidanaloger, proteiner, enzymer, små molekyler, fargestoffer, lipider, nukleosider, oligonukleotider, analoger til oligonukleotider, sukkerarter, oligosakkarider, celler, virus, liposomer, mikropartikler, overflater og miceller.
Klasser av biologisk aktive midler som er egnet for anvendelse ifølge beskrivelsen, innbefatter , lymfokiner, antistoffer, løselige reseptorer, antitumormidler, angstlindrende midler, hormoner, vekstfaktorer, antibiotika, fungicider, fungistatiske midler, anti-virale midler, steroide midler, antimikrobielle midler, germicide midler, antipyretiske midler, antidiabetiske midler, bronkodilatorer, antidiaré-midler, hjertedilatasjonsmidler, glykosider, spasmolytiske midler, antihypertensive midler, antidepressiva, angstlindrende midler, andre psykoterapeutiske midler, kortikosteroider, analgetika, befruktningshindrende midler, ikke-steroide anti-inflammatoriske medikamenter, blodglukose-senkende midler, kolesterolsenkende midler, krampestillende midler, andre antiepileptiske midler, immunmodulatorer, anticholinerge midler, sympatolytiske midler, sympatomimetika, vasodilatoriske midler, antikoagulanter, antiarytmiske midler, prostaglandiner med forskjellige farmakologiske virkninger, diuretika, sovemedisiner, antihistaminmidler, antineoplastiske midler, onkolytiske midler, antiandrogener, antimalariamidler, antilepramidler og forskjellige andre typer medikamenter. Se Goodman og Gilman's The Basis of Therapeutics (niende utgave, Pergamon Press, Inc., USA, 1996) og The Merck Index (trettende utgave, Merck & Co., Inc., USA, 2001).
Biologisk aktive forbindelser innbefatter hvilken som helst forbindelse som viser biologisk respons i sin nåværende form, eller hvilken som helst forbindelse som viser en biologisk respons som resultat av en kjemisk omdannelse av sin struktur fra sin nåværende form. For eksempel vil biologisk aktive forbindelser innbefatte hvilken som helst forbindelse som inneholder en beskyttende gruppe som ved spaltning resulterer i en forbindelse som viser en biologisk respons. Slik spaltning kan for eksempel være resultatet av en in vivo-reaksjon mellom forbindelsen og endogene enzymer eller en for-administreringsreaksjon hos forbindelsen, innbefattende reaksjon mellom den og de aktiverte PGCer ifølge beskrivelsen. Som et ytterligere eksempel vil biologisk aktive forbindelser også innbefatte hvilken som helst forbindelse som gjennomgår stereotransformasjon, in vivo eller ex vivo, under dannelse av en forbindelse som viser en biologisk respons eller virkning.
Biologisk aktive forbindelser inneholder typisk flere reaktive seter hvor kovalent tilknytning av den aktiverte PGC er mulig. For eksempel kan amingrupper gjennomgå acyleringer, sulfhydrylgrupper kan gjennomgå addisjonsreaksjoner og alkyleringer, karbonyl- og karboksylgrupper kan gjennomgå acyleringer, og aldehyd- og hydroksylgrupper kan gjennomgå aminering og reduktiv aminering. Én eller flere av disse reaksjoner kan anvendes ved fremstilling av de polyalkylenglykol-modifiserte biologisk aktive forbindelser ifølge beskrivelsen.
Dessuten kan biologisk aktive forbindelser modifiseres til å danne reaktive deler på forbindelsen som gjør slike reaksjoner og den resulterende konjugering til den aktiverte PGC lettere.
Vanlige fagpersoner vil være klar over tallrike reaksjonsmekanismer som er tilgjengelige for å gjøre konjugering av den aktiverte PGC til en biologisk aktiv forbindelse lettere. Når for eksempel den aktiverende del, R, er en hydrazidgruppe, kan den koples kovalent til sulfhydryl-, sukker- og karbonyldeler på de biologisk aktive forbindelser (etter at disse deler gjennomgår oksidasjon under dannelse av aldehyder). Reaksjon mellom hydrazid-aktiverende deler (R) og aldehyder på biologisk aktive forbindelser (Β') frembringer en hydrazonbinding (R*-B). Når R er en maleimidgruppe, kan den omsettes med en sulfhydrylgruppe under dannelse av en stabil tioeterbinding. Hvis det ikke finnes sulfhydrylgrupper på den biologisk aktive forbindelse, kan de frembringes via disulfidreduksjon eller via tiolering med 2-iminotiolan eller SATA. Når R er en imidoester, vil den reagere med primære aminer på B' under dannelse av en imidoamidbinding.
Imidoesterkonjugering utføres vanligvis mellom pH 8,5 og 9,0. Ved tilknytning av de aktiverte PGC'er til biologisk aktive proteiner gir imidoestere en fordel fremfor andre R-grupper siden de ikke påvirker proteinets totale ladning. De bærer en positiv ladning ved fysiologisk pH, slik som de primære aminer de erstatter.
Imidoester-reaksjoner utføres mellom 0°C og romtemperatur (f.eks. ved 4°C) eller ved forhøyede temperaturer under vannfrie betingelser. Når R er en NHS-ester, er dens hovedmål primære aminer. Tilgjengelige oc-aminogrupper, for eksempel slike som finnes på de N-terminale ender av peptider og proteiner, reagerer med NHS-estere under dannelse av en kovalent amidbinding.
I noen tilfeller er R*-B en hydrolytisk stabil binding. En hydrolytisk stabil binding betyr at bindingen er hovedsakelig stabil i vann og ikke reagerer med vann ved anvendelige pH-verdier, f.eks. er bindingen stabil under fysiologiske betingelser i et langvarig tidsrom, kanskje til og med i det uendelige. I andre tilfeller er R*-B en hydrolytisk ustabil eller nedbrytbar binding. En hydrolytisk ustabil binding betyr at bindingen er nedbrytbar i vann eller i vandige oppløsninger, innbefattende for eksempel blod. Enzymatisk ustabile eller nedbrytbare bindinger betyr også at bindingen kan nedbrytes av ett eller flere enzymer.
Som fagfolk på området vil være klar over, kan polyalkylen og beslektede polymerer innbefatte nedbrytbare bindinger i polymerskjelettet eller i linkergruppen mellom polymerskjelettet og én eller flere av de terminale funksjonelle grupper på PGC-molekylet. For eksempel hydrolyseres esterbindinger dannet ved reaksjon mellom f.eks. PGC-karboksylsyrer eller aktiverte PGC-karboksylsyrer og alkoholgrupper på en biologisk aktiv forbindelse vanligvis under fysiologiske betingelser under frigjøring av midlet. Andre hydrolytisk nedbrytbare bindinger innbefatter karbonatbindinger; iminbindinger som er et resultat av reaksjon mellom et amin og et aldehyd (se f.eks. Ouchi et al., Polymer Preprints, 38(1):582-3 (1997)); fosfatesterbindinger dannet ved omsetting av en alkohol med en fosfatgruppe; acetalbindinger som er produktet fra reaksjonen mellom et aldehyd og en alkohol; ortoesterbindinger som er produktet fra reaksjonen mellom et formiat og en alkohol; peptidbindinger dannet ved en amingruppe, f.eks. i en ende av PGC, samt en karboksylgruppe på et peptid; og oligonukleotidbindinger dannet ved en fosforamidittgruppe, f.eks. i enden av en polymer, og en 5'-hydroksylgruppe på et oligonukleotid.
Polyalkylenglykolen, P, kan være polyetylenglykol, med strukturen ifølge formel II:
hvor a er et helt tall fra 4 til 10000 og E er hydrogen eller en rettkjedet eller forgrenet Ci- til C2o-alkylgruppe, en påvisbar merkesubstans eller en del egnet for dannelse av en binding mellom forbindelsen ifølge formel I og en biologisk aktiv forbindelse eller en forløper for denne.
Når således E er en del egnet for dannelse av en binding mellom forbindelsen ifølge formel I og en biologisk aktiv forbindelse eller en forløper for denne, kan E være en karboksylsyre, ester, aldehyd, aldehyd-hydrat, acetal, hydroksy, beskyttet hydroksy, karbonat, alkenyl, akrylat, metakrylat, akrylamid, substituert eller usubstituert tiol, halogen, substituert eller usubstituert amin, beskyttet amin, hydrazid, beskyttet hydrazid, suksinimidyl, isocyanat, isotiocyanat, ditiopyridin, vinylpyridin, jodacetamid, epoksid, hydroksysuksinimidyl, azol, maleimid, sulfon, allyl, vinylsulfon, tresyl, sulfo-N-suksinimidyl, dion, mesyl, tosyl eller glyoksal. Det er underforstått at E bør være forenlig med R slik at det ikke skjer reaksjon mellom E og R.
Med "påvisbar merkesubstans" menes hvilken som helst merkesubstans som kan påvises. Eksempler innbefatter radioaktive isotoper, fluorescerende deler, fosforescerende deler, kjemiluminescerende deler og kvantepunkter. Andre påvisbare merkesubstanser innbefatter biotin-, cystein-, histidin-, hemagglutinineller myc- eller flag-merkesubstanser.
I noen tilfeller har E strukturen ifølge formel III eller formel IV:
Formel III
Hver Q, X, Y, Z, m og n er som definert ovenfor, og hver W er uavhengig hydrogen eller et C1- til C7-alkyl.
I denne klasse av forbindelser er R" en del egnet for dannelse av en binding mellom forbindelsen med formel III og en biologisk aktiv forbindelse eller en forløper for denne; og R'" er en del egnet for dannelse av en binding mellom forbindelsen med formel IV og en biologisk aktiv forbindelse eller en forløper for denne.
R" og R'" kan være karboksylsyre, ester, aldehyd, aldehyd-hydrat, acetal, hydroksy, beskyttet hydroksy, karbonat, alkenyl, akrylat, metakrylat, akrylamid, substituert eller usubstituert tiol, halogen, substituert eller usubstituert amin, beskyttet amin, hydrazid, beskyttet hydrazid, suksinimidyl, isocyanat, isotiocyanat, ditiopyridin, vinylpyridin, jodacetamid, epoksid, hydroksysuksinimidyl, azol, maleimid, sulfon, alkyl, vinylsulfon, tresyl, sulfo-N-suksinimidyl, dion, mesyl, tosyl eller glyoksal. Det må være klart at R" og R'" må være forenlige med R slik at det ikke finner sted reaksjon med R.
Anvendt i det foreliggende danner R" og R'", ved konjugering til en biologisk aktiv forbindelse eller en forløper for denne, sammenbindende deler som definert ovenfor. Følgelig er R** er en sammenbindende del dannet ved reaksjon mellom R"- eller R"'-gruppen på den aktiverte PGC og en reaktiv funksjonell gruppe på den biologisk aktive forbindelse, slik at det fås en kovalent forbindelse mellom PGC og den biologisk aktive forbindelse. R og R" eller R'" kan være den samme del eller forskjellige deler, og den biologisk aktive forbindelse bundet til hver av dem kan være den samme eller forskjellig.
Anvendt i det foreliggende angir betegnelsen "alkyl" radikalet av mettede alifatiske grupper, innbefattende rettkjedede alkylgrupper, forgrenede alkylgrupper, cykloalkyl-(alicykliske)-grupper, alkylsubstituerte cykloalkylgrupper og cykloalkylsubstituerte alkylgrupper. I foretrukne tilfeller har et rettkjedet eller forgrenet alkyl 30 eller færre karbonatomer i sitt skjelett (f.eks. Ci-C3ofor rettkjedet, C3-C30 for forgrenet), og mer foretrukket 20 eller færre. Likeledes har foretrukne cykloalkyler fra 3 til 10 karbonatomer i sin ringstruktur, og har mer foretrukket 5, 6 eller 7 karbonatomer i ringstrukturen.
Videre er betegnelsen "alkyl" (eller "lavere alkyl") ment å innbefatte både "usubstituerte alkylgrupper" og "substituerte alkylgrupper", idet sistnevnte angir alkyldeler med substituenter som erstatter et hydrogen på ett eller flere karbonatomer i hydrokarbonatomskjelettet. Slike substituenter kan for eksempel innbefatte et halogen, en hydroksyl-, en karbonyl- (så som en karboksyl-, en alkoksykarbonyl-, en formyl- eller en acyl-), en tiokarbonyl- (så som en tioester-, en tioacetat- eller en tioformiat-), en alkoksyl-, en fosforyl-, en fosfonat-, en fosfinat-, en amino-, en amido-, en amidin-, en imin-, en cyano-, en nitro-, en azido-, en sulfhydryl-, en alkyltio-, en sulfat-, en sulfonat-, en sulfamoyl-, en sulfonamido-, en sulfonyl-, en heterocyklyl-, en aralkyl-del eller en aromatisk eller heteroaromatisk del. Fagfolk på området vil være klar over at delene som er substituert på hydrokarbonkjeden, selv kan være substituert, hvis passende.
Substituentene i et substituert alkyl kan for eksempel innbefatte substituerte og usubstituerte former av amino-, azido-, imino-, amido-, fosforyl- (innbefattende fosfonat og fosfinat), sulfonyl- (innbefattende sulfat-, sulfonamido-, sulfamoyl- og sulfonat-) og silylgrupper, samt etere, alkyltiogrupper, karbonylgrupper (innbefattende ketoner, aldehyder, karboksylater og estere), -CF3,
-CN. Cykloalkyler kan være ytterligere substituert med alkylgrupper, alkenylgrupper, alkoksygrupper, alkyltiogrupper, aminoalkylgrupper, karbonylsubstituerte alkylgrupper, -CF3, -CN.
Betegnelsen "aralkyl" anvendt i det foreliggende angir en alkylgruppe substituert med en arylgruppe (f.eks. en aromatisk eller heteroaromatisk gruppe). Eksempler på aralkylgrupper innbefatter benzyl, og mer generelt (CH2)nPh, hvor Ph er fenyl eller substituert fenyl og n er 1 , 2 eller 3.
Betegnelsene "alkenyl" og "alkynyl" angirt umettede alifatiske grupper analoge med hensyn til lengde og eventuell substitusjon til alkylgruppene beskrevet ovenfor, men som inneholder henholdsvis minst én dobbelt- eller trippelbinding.
Dersom ikke antallet karbonatomer er spesifisert på annen måte, angir "lavere alkyl" anvendt i det foreliggende en alkylgruppe, som definert ovenfor, men med fra én til ti karbonatomer, mer foretrukket fra én til seks karbonatomer, i sin skjelettstruktur. Likeledes har "lavere alkenyl" og "lavere alkynyl" liknende kjedelengder. Foretrukne alkylgrupper er lavere alkyler. Ved foretrukne utførelsesformer er en substituent betegnet i det foreliggende som alkyl, en lavere alkyl.
Betegnelsen "aryl" anvendt i det foreliggende innbefatter 5-, 6-, og 7-leddede aromatiske enkeltringgrupper som kan innbefatte fra null til fire heteroatomer, for eksempel benzen, pyrrol, furan, tiofen, imidazol, oksazol, tiazol, triazol, pyrazol, pyridin, pyrazin, pyridazin og pyrimidin. Arylgrupper som har heteroatomer i ringstrukturen, kan også omtales som "heterocykliske arylgrupper" eller "heteroaromatiske grupper". Den aromatiske ring kan være substituert i én eller flere ringstillinger med slike substituenter som beskrevet ovenfor, for eksempel halogen, azid, alkyl, aralkyl, alkenyl, alkynyl, cykloalkyl, hydroksyl, alkoksyl, amino, nitro, sulfhydryl, imino, amido, fosfonat, fosfinat, karbonyl, karboksyl, silyl, eter, alkyltio, sulfonyl, sulfonamido, keton, aldehyd, ester, heterocyklyl, aromatiske eller heteroaromatiske deler, -CF3, -CN eller liknende. Betegnelsen "aryl" innbefatter også polycykliske ringsystemer med to eller flere cykliske ringer hvor to eller flere karbonatomer er felles for to tilstøtende ringer (ringene er "kondenserte ringer") hvor minst én av ringene er aromatiske, f.eks. kan de andre cykliske ringer være cykloalkyler, cykloalkenyler, cykloalkynyler, aryler og/eller heterocykliske ringer.
Betegnelsene orto, meta og para gjelder henholdsvis 1 ,2-, 1 ,3- og 1 ,4-disubstituerte benzener. For eksempel er navnene 1 ,2-dimetylbenzen og ortodimetylbenzen synonyme.
Betegnelsene "heterocyklyl" eller "heterocyklisk gruppe" angir 3- til 10-leddede ringstrukturer, mer foretrukket 3- til 7-leddede ringer, hvis ringstrukturer innbefatter fra én til fire heteroatomer. Heterocykliske grupper kan også være polycykliske grupper. Heterocyklylgrupper innbefatter for eksempel tiofen, tiantren, furan, pyran, isobenzofuran, kromen, xanten, fenoxatin, pyrrol, imidazol, pyrazol, isotiazol, isoxazol, pyridin, pyrazin, pyrimidin, pyridazin, indolizin, isoindol, indol, indazol, purin, kinolizin, isokinolin, kinolin, ftalazin, naftyridin, kinoksalin, kinazolin, cinnolin, pteridin, karbazol, karbolin, fenantridin, akridin, pyrimidin, fenantrolin, fenazin, fenarsazin, fenotiazin, furazan, fenoksazin, pyrrolidin, oksolan, tiolan, oksazol, piperidin, piperazin, morfolin, laktoner, laktamer så som azetidinoner og pyrrolidinoner, sultamer, sultoner. Den heterocykliske ring kan være substituert i én eller flere stillinger med substituenter som beskrevet ovenfor, så som for eksempel halogen, alkyl, aralkyl, alkenyl, alkynyl, cykloalkyl, hydroksyl, amino, nitro, sulfhydryl, imino, amido, fosfonat, fosfinat, karbonyl, karboksyl, silyl, eter, alkyltio, sulfonyl, keton, aldehyd, ester, et heterocyklyl, en aromatisk eller heteroaromatisk del, -CF3, -CN eller liknende.
Betegnelsen "karbocyklus" anvendt i det foreliggende angir en aromatisk eller ikke-aromatisk ring hvor hvert atom i ringen er karbon.
Heterocykliske og karbocykliske strukturer innbefatter kondenserte bicykliske og brosammenknyttede bicykliske ringstrukturer.
Anvendt i det foreliggende angir betegnelsen "nitro" -NO2; betegnelsen "halogen" angir -F, -Cl, -Br eller -I; betegnelsen "sulfhydryl" angir -SH; betegnelsen "hydroksyl" angir -OH; og betegnelsen "sulfonyl" angir -SO2-.
Betegnelsene "amin" og "amino" er kjent på området og angir både usubstituerte og substituerte aminer, f.eks. en del som kan være representert ved den generelle formel:
hvor hver av R9, R10 og R'10 uavhengig representerer et hydrogen, et alkyl, et alkenyl eller -(CH2)m-Rs, eller R9 og R10 utgjør, sammen med N-atomet som de er bundet til, en heterocyklisk struktur med fra 4 til 8 atomer i ringstrukturen; R8 representerer et aryl, et cykloalkyl, et cykloalkenyl, en heterocyklus eller en polycyklus; og m er null eller et helt tall i området 1 til 8.
Betegnelsen "alkylamin" anvendt i det foreliggende angir en amingruppe, som definert ovenfor, med et substituert eller usubstituert alkyl tilknyttet, det vil si at minst én av R9 og R10 er en alkylgruppe.
Betegnelsen "acylamino" er kjent på området og angir en del som kan representeres ved den generelle formel:
hvor R9 er som definert ovenfor og R'n representerer et hydrogen, et alkyl, et alkenyl eller -(CH2)m-R8, hvor m og R8 er som definert ovenfor.
Betegnelsen "amido" er kjent på området som et amino-substituert karbonyl, og innbefatter en del som kan representeres ved den generelle formel:
hvor R9 og R10 er som definert ovenfor. Foretrukne utførelsesformer av amidet vil ikke innbefatte imider, som kan være ustabile.
Betegnelsen "amidin" er kjent på området som en gruppe som kan representeres ved den generelle formel:
hvor R9 og R10 er som definert ovenfor.
Betegnelsen "guanidin" er kjent på området som en gruppe som kan representeres ved den generelle formel:
hvor R9 og R10 er som definert ovenfor.
Betegnelsen "alkyltio" angir en alkylgruppe, som definert ovenfor, med et tilknyttet svovel rad i kal. Ved foretrukne utførelsesformer er "alkyltio"-delen representert ved én av -S-alkyl, -S-alkenyl, -S-alkynyl og -S-(CH2)m-R8, hvor m og R8 er definert ovenfor. Representative alkyltiogrupper innbefatter metyltio, ethyltio.
Betegnelsen "karbonyl" er kjent på området og innbefatter deler som kan representeres ved den generelle formel:
hvor X er en binding eller representerer et oksygen- eller svovelatom, og R11 representerer et hydrogen, et alkyl, et alkenyl, -(CH2)m-R8 eller et farmasøytisk akseptabelt salt, R'n representerer et hydrogen, et alkyl, et alkenyl eller -(CH2)m-R11 hvor m og R8 er som definert ovenfor. Når X er et oksygen og
ikke er hydrogen, representerer formelen en "ester". Når X er et oksygen, og Rn er som definert ovenfor, omtales delen i det foreliggende som en karboksylgruppe, og spesielt når Rn er et hydrogen, representerer formelen en "karboksylsyre". Når X er et oksygen, og R'n er hydrogen, representerer formelen et "formiat". Når oksygen-atomet i ovenstående formel er erstattet av svovel, representerer formelen en "tiolkarbonyl"-gruppe. NårX er et svovelatom og Rn eller R'n ikke er hydrogen, representerer formelen en "tioester". NårX er et svovelatom og Rn er hydrogen, representerer formelen en "tiokarboksylsyre". Når X er et svovelatom og R'11 er hydrogen, representerer formelen et "tioformiat". Når på den annen side X er en binding og Rn ikke er hydrogen, representerer ovenstående formel en "keton"-gruppe. Når X er en binding og Rn er hydrogen, representerer ovenstående formel en "aldehyd"-gruppe.
Betegnelsene "alkoksyl" eller "alkoksy" anvendt i det foreliggende angir en alkylgruppe, som definert ovenfor, med et tilknyttet oksygenradikal. Representative alkoksylgrupper innbefatter metoksy, etoksy, propyloksy, tert-butoksy. En "eter" er to hydrokarbonatomer kovalent sammenknyttet med et oksygen. Følgelig er eller likner substituenten i et alkyl som gjør dette alkyl til en eter, et alkoksyl, som kan representeres ved én av -O-alkyl, -O-alkenyl, -O-alkynyl, -0-(CH2)m-R8, hvor m og R8 er beskrevet ovenfor.
Betegnelsen "sulfonat" er kjent på området og innbefatter en del som kan representeres ved den generelle formel:
hvor R41 er et elektronpar, hydrogen, alkyl, cykloalkyl eller aryl.
Betegnelsen "sulfat" er kjent på området og innbefatter en del som kan representeres ved den generelle formel:
hvor R41 er som definert ovenfor.
Betegnelsen "sulfonamido" er kjent på området og innbefatter en del som kan representeres ved den generelle formel:
hvor R9 og R'n er som definert ovenfor.
Betegnelsen "sulfamoyl" er kjent på området og innbefatter en del som kan representeres ved den generelle formel:
hvor R9 og R10 er som definert ovenfor.
Betegnelsen "sulfonyl" anvendt i det foreliggende angir en del som kan representeres ved den generelle formel:
hvor R44 er valgt fra gruppen bestående av hydrogen, alkyl, alkenyl, alkynyl, cykloalkyl, heterocyklyl, aryl og heteroaryl.
Betegnelsen "sulfoksido" anvendt i det foreliggende angir en del som kan representeres ved den generelle formel:
hvor R44 er valgt fra gruppen bestående av hydrogen, alkyl, alkenyl, alkynyl, cykloalkyl, heterocyklyl, aralkyl eller aryl.
Det vil være klart at "substitusjon" eller "substituert med" innbefatter det uttrykkelige forbehold at slik substitusjon er i henhold til tillatt valens av det substituerte atom og substituenten, og at substitusjonen resulterer i en stabil forbindelse, f.eks. som ikke spontant gjennomgår transformasjon så som ved rearrangement, syklisering, eliminering osv.
Anvendt i det foreliggende er betegnelsen "substituert" påtenkt å innbefatte alle tillatelige substituenter av organiske forbindelser. Ved et vidt aspekt innbefatter de tillatelige substituenter acykliske og cykliske, forgrenede og uforgrenede, karbocykliske og heterocykliske, aromatiske og ikke-aromatiske substituenter på organiske forbindelser. Illustrerende substituenter innbefatter for eksempel slike som er beskrevet i det foregående. De tillatelige substituenter kan være én eller flere og de samme eller forskjellige for passende organiske forbindelser. For denne oppfinnelses formål kan heteroatomene så som nitrogen ha hydrogensubstituenter og/eller eventuelle tillatelige substituenter på organiske forbindelser beskrevet i det foreliggende som tilfredsstiller heteroatomenes valenser.
En omfattende liste over forkortelsene anvendt av organiske kjemikere med vanlig fagkunnskap på området fremkommer i den første utgave av hvert volum av Journal of Organic Chemistry ; denne liste er typisk presentert i en tabell med tittelen Standard List of Abbreviations.
I noen tilfeller har forbindelsene ifølge oppfinnelsen strukturen ifølge formel V:
Formel V
X, Y, m, n, Z og R' er som definert ovenfor, og R er en aktiverende del som definert ovenfor, egnet for dannelse av en binding mellom forbindelsen ifølge formel V og en biologisk aktiv forbindelse eller forløper. I spesielle tilfeller er R et aldehyd-hydrat.
P er som definert ovenfor, og kan være representert ved formel II:
Formel II:
E-(0-CH2CH2)ahvor E er som beskrevet ovenfor, og kan i noen tilfeller være representert ved formel III eller IV.
Ti og T2 er uavhengig fraværende eller en rettkjedet eller forgrenet, mettet eller umettet Ci- til C2o-alkyl- eller -heteroalkylgruppe, en mettet eller umettet cyklisk C3- til Cs-alkyl eller -heteroalkyl, en substituert eller usubstituert aryl- eller heteroarylgruppe eller et substituert eller usubstituert alkaryl hvor alkylet er en mettet eller umettet Ci- til C2o-alkyl- eller -heteroalkarylgruppe. Substituentene kan være halogen, hydroksyl, karbonyl, karboksylat, ester, formyl, acyl, tiokarbonyl, tioester, tioacetat, tioformiat, alkoksyl, fosforyl, fosfonat, fosfinat, amino, amido, amidin, imin, cyano, nitro, azido, sulfhydryl, sulfat, sulfonat, sulfamoyl, sulfonamido, sulfonyl, heterocyklyl, aralkyl, aromatisk del, heteroaromatisk del, imino, silyl, eter eller alkyltio.
Når d er null, er det ingen ytterligere substituenter (L) på den aromatiske ring. Når d er et helt tall fra 1 til 4, kan substituentene (L) være en rettkjedet eller forgrenet, mettet eller umettet Ci- til C2o-alkyl- eller -heteroalkylgruppe, mettet eller umettet cyklisk C3- til Cs-alkyl eller -heteroalkyl, en substituert eller usubstituert aryl- eller heteroarylgruppe eller et substituert eller usubstituert alkaryl hvor alkylet er en mettet eller umettet Ci- til C2o-alkyl- eller -heteroalkarylgruppe.
Substituentene kan være halogen, hydroksyl, karbonyl, karboksylat, ester, formyl, acyl, tiokarbonyl, tioester, tioacetat, tioformiat, alkoksyl, fosforyl, fosfonat, fosfinat, amino, amido, amidin, imin, cyano, nitro, azido, sulfhydryl, sulfat, sulfonat, sulfamoyl, sulfonamido, sulfonyl, heterocyklyl, aralkyl, aromatisk del, heteroaromatisk del, imino, silyl, eter eller alkyltio.
Når R er et aldehyd, er forbindelsene innenfor slike som er representert ved formel VI:
Formel VI
hvor alle andre variabler er som definert ovenfor.
Når for eksempel X og Y er oksygen og R er et aldehyd, er forbindelsene ifølge beskrivelsen representert ved forbindelse J.
Forbindelse J
hvor Ti- og T2-substituentene kan være i orto-, meta- eller paraarrangement.
Når Ti- og T2-substituentene er rettkjedede alkylgrupper, og d er null, er forbindelsene representert ved formel IX:
Formel IX:
hvor hver u uavhengig er null eller et helt tall fra én til fem, og alle andre variabler er som definert ovenfor. I spesielle tilfeller er Z hydrogen eller metyl.
Spesielle klasser av forbindelser som er innenfor formel IX, kan være representert ved formlene VII og VIII:
Formel VII:
En del representative aktiverte polyalkylenglykolforbindelser innbefatter følgende, hvor polyalkylenglykol-polymeren er PEG eller mPEG:
18
I noen tilfeller er forbindelsene ifølge beskrivelsen representert ved formel X:
Formel X:
hvor, som ovenfor, n er null eller et helt tall fra én til fem, og X er 0, S, CO, CO2, COS, SO, SO2, CONR', S02NR' eller NR'.
Når X er NR', kan R' være hydrogen, en rettkjedet eller forgrenet, mettet eller umettet C1- til C2o-alkyl- eller -heteroalkylgruppe, mettet eller umettet cyklisk C3- til Cs-alkyl eller -heteroalkyl, en substituert eller usubstituert aryl- eller heteroarylgruppe eller et substituert eller usubstituert alkaryl hvor alkylet er en mettet eller umettet C1- til C2o-alkyl- eller -heteroalkarylgruppe, hvor substituentene er valgt fra gruppen bestående av halogen, hydroksyl, karbonyl, karboksylat, ester, formyl, acyl, tiokarbonyl, tioester, tioacetat, tioformiat, alkoksyl, fosforyl, fosfonat, fosfinat, amino, amido, amidin, imin, cyano, nitro, azido, sulfhydryl, sulfat, sulfonat, sulfamoyl, sulfonamido, sulfonyl, heterocyklyl, aralkyl, aromatisk del, heteroaromatisk del, imino, silyl, eter og alkyltio. Z kan være en rettkjedet eller forgrenet, mettet eller umettet C1- til C2o-alkyl- eller -heteroalkylgruppe, mettet eller umettet cyklisk C3- til Cs-alkyl eller -heteroalkyl, en substituert eller usubstituert aryl- eller heteroarylgruppe eller et substituert eller usubstituert alkaryl hvor alkylet er en mettet eller umettet C1- til C2o-alkyl- eller -heteroalkarylgruppe. Når til stede, kan substituentene være halogen, hydroksyl, karbonyl, karboksylat, ester, formyl, acyl, tiokarbonyl, tioester, tioacetat, tioformiat, alkoksyl, fosforyl, fosfonat, fosfinat, amino, amido, amidin, imin, cyano, nitro, azido, sulfhydryl, sulfat, sulfonat, sulfamoyl, sulfonamido, sulfonyl, heterocyklyl, aralkyl, aromatisk del, heteroaromatisk del, imino, silyl, eter eller alkyltio.
Som definert ovenfor, er R en aktiverende del egnet for dannelse av en binding mellom forbindelsen ifølge formel X og en biologisk aktiv forbindelse eller en forløper for denne. I noen tilfeller er R et aldehyd-hydrat.
P er en polyalkylenglykol-polymer som definert ovenfor, og kan være representert ved formel II:
Formel II:
E-(0-CH2CH2)a-,
hvor E og a er som beskrevet ovenfor, og kan i noen tilfeller være representert ved formel III eller IV. I noen tilfeller er E metyl, og derfor er P mPEG.
Når R er et aldehyd og X er oksygen, er forbindelsene innenfor strukturen ifølge formel XI:
Formel XI:
hvor P, Z og n er som definert for Formel X.
Når P er mPEG, er forbindelsene beskrevet ved formel XII:
Formel XII:
og når n er én og Z er metyl, er forbindelsen representert ved formel XIII:
Formel XIII:
hvor a er et helt tall fra 4 til 10000.
Eksempler på syntetiske veier for fremstilling av forbindelser ifølge beskrivelsen er vist i eksemplene nedenfor.
Beskrivelsen innbefatter også preparater av de aktiverte polyalkylenglykolforbindelser (PGC) ifølge beskrivelsen og én eller flere biologisk aktive forbindelser. Som beskrevet ovenfor, er biologisk aktive forbindelser forbindelser som viser en biologisk respons eller virkning ved administrering til et individ. Ikkekonjugerte biologisk aktive forbindelser kan administreres til et individ i tillegg til forbindelsene ifølge oppfinnelsen. I tillegg kan biologisk aktive forbindelser inneholde reaktive grupper som er i stand til å reagere med og konjugeres til minst én aktivert PGC ifølge beskrivelsen.
Beskrivelsen innbefatter også konjugater av de nye PGC med biologisk aktive forbindelser. I ett tilfelle er konjugatene dannet av en forbindelse med formel I og en biologisk aktiv forbindelse (B) og er beskrevet ifølge formel XIV:
Formel XIV:
Som ovenfor, er m null eller én slik at Y er til stede eller fraværende, n er null eller et helt tall fra én til fem og X og Y er uavhengig 0, S, CO, CO2, COS, SO, SO2, CONR', S02NR' eller NR'.
Q er et mettet eller umettet cyklisk C3- til Cs-alkyl eller -heteroalkyl (innbefattende kondenserte bicykliske og brosammenknyttede bicykliske ringstrukturer), en substituert eller usubstituert aryl- eller heteroarylgruppe eller et substituert eller usubstituert alkaryl hvor alkylet er en mettet eller umettet C1- til C2o-alkyl- eller -heteroalkarylgruppe. Når til stede, kan substituentene være halogen, hydroksyl, karbonyl, karboksylat, ester, formyl, acyl, tiokarbonyl, tioester, tioacetat, tioformiat, alkoksyl, fosforyl, fosfonat, fosfinat, amino, am ido, amidin, imin, cyano, nitro, azido, sulfhydryl, sulfat, sulfonat, sulfamoyl, sulfonamido, sulfonyl, heterocyklyl, aralkyl, aromatisk del, heteroaromatisk del, imino, silyl, eter eller alkyltio.
Hver R' og Z er uavhengig hydrogen, en rettkjedet eller forgrenet, mettet eller umettet C1- til C2o-alkyl- eller -heteroalkylgruppe, mettet eller umettet cyklisk C3- til Cs- alkyl eller -heteroalkyl, en substituert eller usubstituert aryl- eller heteroarylgruppe eller et substituert eller usubstituert alkaryl hvor alkylet er en mettet eller umettet C1- til C2o-alkyl- eller -heteroalkarylgruppe, hvor substituentene er valgt fra gruppen bestående av halogen, hydroksyl, karbonyl, karboksylat, ester, formyl, acyl, tiokarbonyl, tioester, tioacetat, tioformiat, alkoksyl, fosforyl, fosfonat, fosfinat, amino, amido, amidin, imin, cyano, nitro, azido, sulfhydryl, sulfat, sulfonat, sulfamoyl, sulfonamido, sulfonyl, heterocyklyl, aralkyl, aromatisk del, heteroaromatisk del, imino, silyl, eter og alkyltio;
R* er en sammenbindende del dannet ved reaksjon mellom R og en tilsvarende funksjonell gruppe på den biologisk aktive forbindelse, B, som beskrevet ovenfor. For eksempel er R* dannet ved reaksjon mellom en del så som en karboksylsyre-, ester-, aldehyd-, aldehyd-hydrat-, acetal-, hydroksy-, beskyttet hydroksy-, karbonat-, alkenyl-, akrylat-, metakrylat-, akrylamid-, substituert eller usubstituert tiol-, halogen-, substituert eller usubstituert amin-, beskyttet amin-, hydrazid-, beskyttet hydrazid-, suksinimidyl-, isocyanat-, isotiocyanat-, ditiopyridin-, vinylpyridin-, jodacetamid-, epoksid-, hydroksysuksinimidyl-, azol-, maleimid-, sulfon-, allyl-, vinylsulfon-, tresyl-, sulfo-N-suksinimidyl-, dion-, mesyl-, tosyl- eller glyoksal-funksjonalitet og en biologisk aktiv forbindelse eller en forløper for denne.
P er en polyalkylenglykol-polymer som definert ovenfor, og kan være representert ved formel II:
Formel II:
hvor E er hydrogen, en rettkjedet eller forgrenet Ci- til C2o-alkylgruppe (f.eks. metyl), en påvisbar merkesubstans eller en del egnet for dannelse av en binding mellom forbindelsen med formel XIV og en biologisk aktiv forbindelse eller en forløper for denne. Som ovenfor, er a et helt tall fra 4 til 10000.
Når E er en påvisbar merkesubstans, kan merkesubstansen for eksempel være en radioaktiv isotop, en fluorescerende del, en fosforescerende del, en kjemiluminescerende del eller et kvantepunkt.
Når E er en del egnet for dannelse av en binding mellom forbindelsen med formel XIV og en biologisk aktiv forbindelse eller en forløper for denne, kan E danne en binding til et annet molekyl av den biologisk aktive forbindelse (B) slik at den aktiverte polyalkylenglykol-forbindelse er bundet i én ende til et molekyl av samme type biologisk aktiv forbindelse, under dannelse av en dimer av molekylet.
I noen tilfeller danner E en binding til en annen biologisk aktiv forbindelse enn B, under frembringelse av en heterodimer av biologisk aktive forbindelser eller forløpere for disse.
I andre tilfeller danner E en ytterligere binding til den biologisk aktive forbindelse, B, slik at både E og R er bundet via forskjellige funksjonelle grupper på samme molekyl av den biologisk aktive forbindelse eller en forløper for denne.
Når E er i stand til å danne en binding til et biologisk aktivt molekyl eller en forløper for dette, kan E være den samme som eller forskjellig fra R og er valgt blant karboksylsyre, ester, aldehyd, aldehyd-hydrat, acetal, hydroksy, beskyttet hydroksy, karbonat, alkenyl, akrylat, metakrylat, akrylamid, substituert eller usubstituert tiol, halogen, substituert eller usubstituert amin, beskyttet amin, hydrazid, beskyttet hydrazid, suksinimidyl, isocyanat, isotiocyanat, ditiopyridin, vinylpyridin, jodacetamid, epoksid, hydroksysuksinimidyl, azol, maleimid, sulfon, allyl, vinylsulfon, tresyl, sulfo-N-suksinimidyl, dion, mesyl, tosyl og glyoksal.
Når E er i stand til å danne en binding til et biologisk aktivt molekyl eller en forløper for dette, kan E ha strukturen ifølge formel III eller formel IV:
Formel III
hvor hver Q, X, Y, Z, m og n er uavhengig som definert ovenfor, hver W er uavhengig hydrogen eller et C1- til Cz-alkyl, R" er en del egnet for dannelse av en binding mellom forbindelsen med formel III og en biologisk aktiv forbindelse eller en forløper for denne, og R'" er en del egnet for dannelse av en binding mellom forbindelsen med formel IV og en biologisk aktiv forbindelse eller en forløper for denne.
R" og R'" er uavhengig valgt blant karboksylsyre, ester, aldehyd, aldehydhydrat, acetal, hydroksy, beskyttet hydroksy, karbonat, alkenyl, akrylat, metakrylat, akrylamid, substituert eller usubstituert tiol, halogen, substituert eller usubstituert amin, beskyttet am in, hydrazid, beskyttet hydrazid, suksinimidyl, isocyanat, isotiocyanat, ditiopyridin, vinylpyridin, jodacetamid, epoksid, hydroksysuksinimidyl, azol, maleimid, sulfon, allyl, vinylsulfon, tresyl, sulfo-N-suksinimidyl, dion, mesyl, tosyl og glyoksal.
Når Q i Formel XIV er et substituert eller usubstituert alkaryl, er konjugatet dannet av en aktivert polyalkylenglykol ifølge formel V og et biologisk aktivt molekyl (B), og er beskrevet ifølge formel XV:
Formel XV
hvor Ti og T2 uavhengig er fraværende eller en rettkjedet eller forgrenet, mettet eller umettet C1- til C2o-alkyl- eller -heteroalkylgruppe, et mettet eller umettet cyklisk C3- til Cs-alkyl- eller -heteroalkyl, en substituert eller usubstituert aryl- eller heteroarylgruppe eller et substituert eller usubstituert alkaryl hvor alkylet er en mettet eller umettet C1- til C2o-alkyl- eller -heteroalkarylgruppe. Når til stede, kan substituentene være halogen, hydroksyl, karbonyl, karboksylat, ester, formyl, acyl, tiokarbonyl, tioester, tioacetat, tioformiat, alkoksyl, fosforyl, fosfonat, fosfinat, amino, amido, amidin, imin, cyano, nitro, azido, sulfhydryl, sulfat, sulfonat, sulfamoyl, sulfonamido, sulfonyl, heterocyklyl, aralkyl, aromatisk del, heteroaromatisk del, imino, silyl, eter eller alkyltio. I noen tilfeller er Ti og T2, hvis til stede, en rettkjedet eller forgrenet, mettet eller umettet C1- til C2o-alkyl- eller -heteroalkylgruppe.
d er null (f.eks. er det ingen L-substituenter på den aromatiske ring) eller et helt tall fra 1 til 4. Hver L er, når til stede, en rettkjedet eller forgrenet, mettet eller umettet C1- til C2o-alkyl- eller -heteroalkylgruppe, mettet eller umettet cyklisk C3- til Cs-alkyl- eller -heteroalkyl, en substituert eller usubstituert aryl- eller heteroarylgruppe eller et substituert eller usubstituert alkaryl hvor alkylet er en mettet eller umettet C1- til C2o-alkyl- eller -heteroalkarylgruppe. Substituentene kan være halogen, hydroksyl, karbonyl, karboksylat, ester, formyl, acyl, tiokarbonyl, tioester, tioacetat, tioformiat, alkoksyl, fosforyl, fosfonat, fosfinat, amino, amido, amidin, imin, cyano, nitro, azido, sulfhydryl, sulfat, sulfonat, sulfamoyl, sulfonamido, sulfonyl, heterocyklyl, aralkyl, aromatisk del, heteroarornatic del, imino, silyl, eter eller alkyltio.
Alle andre variabler er som beskrevet ovenfor, innbefattende P, som er en polyalkylenglykol-polymer, og kan være representert ved formel II:
Formel II:
E-(0-CH2CH2)a-,
hvor E er hydrogen, en rettkjedet eller forgrenet C1- til C2o-alkylgruppe (f.eks. metyl), en påvisbar merkesubstans eller en del egnet for dannelse av en binding mellom forbindelsen med formel XV og en biologisk aktiv forbindelse eller en forløper for denne. Som ovenfor, er a et helt tall fra 4 til 10000.
Når E er en påvisbar merkesubstans, kan merkesubstansen for eksempel være en radioaktiv isotop, en fluorescerende del, en fosforescerende del, en kjemiluminescerende del eller et kvantepunkt.
Når E er en del egnet for dannelse av en binding mellom forbindelsen med formel XV og en biologisk aktiv forbindelse, B, kan E danne en binding til et annet molekyl av den biologisk aktive forbindelse (B) slik at den aktiverte polyalkylenglykol-forbindelse er bundet i hver ende til et molekyl av samme type biologisk aktiv forbindelse, under dannelse av en dimer av molekylet.
I noen tilfeller danner E en binding til en annen biologisk aktiv forbindelse enn B, under frembringelse av en heterodimer av biologisk aktive forbindelser eller forløpere for disse.
I andre tilfeller danner E en ytterligere binding til den biologisk aktive forbindelse, B, slik at både E og R er bundet via forskjellige funksjonelle grupper på det samme molekyl av den biologisk aktive forbindelse eller en forløper for denne.
Når E er i stand til å danne en binding til et biologisk aktivt molekyl eller en forløper for dette, kan E være den samme som, eller forskjellig fra R, og er valgt blant karboksylsyre, ester, aldehyd, aldehyd-hydrat, acetal, hydroksy, beskyttet hydroksy, karbonat, alkenyl, akrylat, metakrylat, akrylamid, substituert eller usubstituert tiol, halogen, substituert eller usubstituert amin, beskyttet amin, hydrazid, beskyttet hydrazid, suksinimidyl, isocyanat, isotiocyanat, ditiopyridin, vinylpyridin, jodacetamid, epoksid, hydroksysuksinimidyl, azol, maleimid, sulfon, allyl, vinylsulfon, tresyl, sulfo-N-suksinimidyl, dion, mesyl, tosyl og glyoksal.
Når E kan danne en binding med en biologisk aktiv forbindelse eller en forløper for denne, kan E ved i noen tilfeller være formel III eller formel IV:
Formel III
hvor hver Q, X, Y, Ζ, m og η uavhengig er som definert ovenfor, hver W er uavhengig hydrogen eller et C1- til Cz-alkyl, R" er en del egnet for dannelse av en binding mellom forbindelsen ifølge formel III og en biologisk aktiv forbindelse eller en forløper for denne, og R'" er en del egnet for dannelse av en binding mellom forbindelsen med formel IV og en biologisk aktiv forbindelse eller en forløper for denne.
R" og R" er uavhengig valgt blant karboksylsyre, ester, aldehyd, aldehydhydrat, acetal, hydroksy, beskyttet hydroksy, karbonat, alkenyl, akrylat, metakrylat, akrylamid, substituert eller usubstituert tiol, halogen, substituert eller usubstituert amin, beskyttet am in, hydrazid, beskyttet hydrazid, suksinimidyl, isocyanat, isotiocyanat, ditiopyridin, vinylpyridin, jodacetamid, epoksid, hydroksysuksinimidyl, azol, maleimid, sulfon, allyl, vinylsulfon, tresyl, sulfo-N-suksinimidyl, dion, mesyl, tosyl og glyoksal.
Når disse bifunksjonelle molekyler er bundet i begge ender til en biologisk aktiv forbindelse eller en forløper for denne, kan de være representert ved formel XX eller formel XXI:
Formel XX:
hvor hver X og Y, Ti og T2, R<'>og Z, L, Q, m, n, a og n er som beskrevet ovenfor, og hver W er uavhengig hydrogen eller et C1- til C7-alkyl. R* og R** er uavhengig sammenbindende deler dannet ved reaksjon mellom R og R" og en biologisk aktiv forbindelse eller en forløper for denne, og hver av B og B<1>er en biologisk aktiv forbindelse eller en forløper for denne, etter konjugering med henholdsvis R og R".
I noen tilfeller er B og B<'>den samme type biologisk aktiv forbindelse. I andre tilfeller er B og B<'>forskjellige biologisk aktive forbindelser. I enda andre tilfeller er B og B<'>det samme biologisk aktive molekyl. I ytterligere tilfeller er R* og R** like. I andre tilfeller er R* og R** forskjellige. I andre tilfeller kan E for eksempel danne en binding til et annet molekyl av den biologisk aktive forbindelse (B = B<'>) slik at den aktiverte PGC er bundet i hver ende til et molekyl av samme type biologisk aktiv forbindelse, under dannelse av en dimer av molekylet. I noen tilfeller danner E en binding til en annen biologisk aktiv forbindelse enn B (B er ikke B<'>), under dannelse av en heterodimer av biologisk aktive forbindelser eller forløpere for disse. I noen tilfeller danner E en ytterligere binding til den biologisk aktive forbindelse, B, slik at både E (via R" eller R'") og R er bundet via forskjellige funksjonelle grupper på det samme molekyl av den biologisk aktive forbindelse eller en forløper for denne.
I noen tilfeller er R<*>eller R<**>en metylengruppe og B eller B' er et biologisk aktivt molekyl inneholdende en aminogruppe, hvor metylengruppen danner en binding med aminogruppen på B. For eksempel kan aminet være den aminoterminale ende av et peptid, et amin i en aminosyre-sidekjede av et peptid eller et amin i en glykosylerings-substituent i et glykosylert peptid. I noen tilfeller er peptidet et interferon, så som interferon-beta, f.eks. interferon-beta-1a. I noen tilfeller er denne type binding dannet ved en reduktiv alkyleringsreaksjon.
Flvor Ti- og T2-substituentene ifølge formel XV er rettkjedede alkylgrupper, X og Y er oksygen, og d er null, er konjugatene representert ved formel XIX:
Formel XIX:
hvor hver u uavhengig er null eller et helt tall fra én til fem, og alle andre variabler er som definert ovenfor. I spesielle tilfeller er Z hydrogen eller metyl.
Spesielle klasser forbindelser som er innenfor formel XV, kan representeres ved formlene XVII og XVIII dannet ved reaksjon mellom henholdsvis formel VII og VIII og en biologisk aktiv forbindelse, eller en forløper for denne:
Formel XVII:
Formel XVIII:
hvor n er null eller et helt tall fra én til fem, P er en polyalkylenglykolpolymer, som beskrevet ovenfor, Z er hydrogen, en rettkjedet eller forgrenet, mettet eller umettet C1- til C2o-alkyl- eller -heteroalkylgruppe, R* er en sammenbindende del som beskrevet ovenfor og B er et biologisk aktivt molekyl. Disse forbindelser kan være bifunksjonelle eller monofunksjonelle, avhengig av identitel noen tilfeller er R* en metylengruppe, og B er et biologisk aktivt molekyl inneholdende en aminogruppe, hvor metylengruppen danner en binding med aminogruppen på B. For eksempel kan aminet være den aminoterminale ende av et peptid, et amin i en aminosyre-sidekjede av et peptid eller et amin i en glykosylerings-substituent i et glykosylert peptid. I en del tilfeller er peptidet et interferon, så som interferon-beta, f.eks. interferon-beta-1 a. I en del tilfeller er denne type binding dannet ved en reduktiv alkyleringsreaksjon.
Konjugatene ifølge beskrivelsen kan også dannes ved reaksjon mellom forbindelser compounds ifølge formel X og en biologisk aktiv forbindelse eller en forløper for denne, under dannelse av konjugater ifølge formel XXII:
Formel XXII:
hvor B er et biologisk aktivt molekyl, som beskrevet ovenfor, og n er null eller et helt tall fra én til fem.
X er 0, S, CO, C02, COS, SO, SO2, CONR', S02NR' eller NR'; når X er NR', er R' hydrogen, en rettkjedet eller forgrenet, mettet eller umettet C1- til C20-alkyl- eller
-heteroalkylgruppe, mettet eller umettet cyklisk C3- til Cs-alkyl eller -heteroalkyl, en substituert eller usubstituert aryl- eller heteroarylgruppe eller et substituert eller usubstituert alkaryl hvor alkylet er en mettet eller umettet C1- til C2o-alkyl- eller -heteroalkaryl gruppe. Hvis til stede, kan substituentene være halogen, hydroksyl, karbonyl, karboksylat, ester, formyl, acyl, tiokarbonyl, tioester, tioacetat, tioformiat, alkoksyl, fosforyl, fosfonat, fosfinat, amino, amido, amidin, imin, cyano, nitro, azido, sulfhydryl, sulfat, sulfonat, sulfamoyl, sulfonamido, sulfonyl, heterocyklyl, aralkyl, aromatisk del, heteroaromatisk del, imino, silyl, eter eller alkyltio.
Z er en rettkjedet eller forgrenet, mettet eller umettet Ci- til C2o-alkyl- eller -heteroalkylgruppe, mettet eller umettet cyklisk C3- til Cs-alkyl eller -heteroalkyl, en substituert eller usubstituert aryl- eller heteroarylgruppe eller et substituert eller usubstituert alkaryl hvor alkylet er en mettet eller umettet Ci- til C2o-alkyl- eller -heteroalkarylgruppe. Substituentene kan være halogen, hydroksyl, karbonyl, karboksylat, ester, formyl, acyl, tiokarbonyl, tioester, tioacetat, tioformiat, alkoksyl, fosforyl, fosfonat, fosfinat, amino, amido, amidin, imin, cyano, nitro, azido, sulfhydryl, sulfat, sulfonat, sulfamoyl, sulfonamido, sulfonyl, heterocyklyl, aralkyl, aromatisk del, heteroaromatisk del, imino, silyl, eter eller alkyltio.
R<*>er en sammenbindende del dannet ved reaksjon mellom R og en tilsvarende funksjonell gruppe på den biologisk aktive forbindelse, B, som beskrevet ovenfor. For eksempel er R<*>dannet ved reaksjon mellom en del så som en karboksylsyre-, ester-, aldehyd-, aldehyd-hydrat-, acetal-, hydroksy-, beskyttet hydroksy-, karbonat-, alkenyl-, akrylat-, metakrylat-, akrylamid-, substituert eller usubstituert tiol-, halogen-, substituert eller usubstituert amin-, beskyttet amin-, hydrazid-, beskyttet hydrazid-, suksinimidyl-, isocyanat-, isotiocyanat-, ditiopyridin-, vinylpyridin-, jodacetamid-, epoksid-, hydroksysuksinimidyl-, azol-, maleimid-, sulfon-, allyl-, vinylsulfon-, tresyl-, sulfo-N-suksinimidyl-, dion-, mesyl-, tosyl- eller glyoksal-funksjonalitet og en biologisk aktiv forbindelse eller en forløper for denne.
I en del tilfeller er Z metyl og n er én.
P er en polyalkylenglykol-polymer som definert ovenfor, og kan være representert ved formel II:
Formel II:
E-(0-CH2CH2)a-,
hvor E er hydrogen, en rettkjedet eller forgrenet Ci- til C2o-alkylgruppe (f.eks. metyl), en påvisbar merkesubstans eller en del egnet for dannelse av en binding mellom forbindelsen med formel XXII og en biologisk aktiv forbindelse eller en forløper for denne. Som ovenfor, er a et helt tall fra 4 til 10 000.
Når E er en påvisbar merkesubstans, kan merkesubstansen for eksempel være en radioaktiv isotop, en fluorescerende del, en fosforescerende del, en kjemiluminescerende del eller et kvantepunkt.
Når E er i stand til å danne en binding til et biologisk aktivt molekyl eller en forløper for dette, er resultatet et bifunksjonelt molekyl. E kan danne en binding til et annet molekyl av den biologisk aktive forbindelse (B) slik at den aktiverte polyalkylenglykol-forbindelse i hver ende er bundet til et molekyl av samme type biologisk aktiv forbindelse, under dannelse av en dimer av molekylet.
I en del tilfeller danner E en binding til en annen biologisk aktiv forbindelse enn B, under dannelse av en heterodimer av biologisk aktive forbindelser eller forløpere for disse.
I andre tilfeller danner E en ytterligere binding til den biologisk aktive forbindelse, B, slik at både E og R er bundet via forskjellige funksjonelle grupper i det samme molekyl av den biologisk aktive forbindelse eller en forløper for denne.
Når E er i stand til å danne en binding til et biologisk aktivt molekyl eller en forløper for dette, kan E være den samme som eller forskjellig fra R og er valgt blant karboksylsyre, ester, aldehyd, aldehyd-hydrat, acetal, hydroksy, beskyttet hydroksy, karbonat, alkenyl, akrylat, metakrylat, akrylamid, substituert eller usubstituert tiol, halogen, substituert eller usubstituert amin, beskyttet amin, hydrazid, beskyttet hydrazid, suksinimidyl, isocyanat, isotiocyanat, ditiopyridin, vinylpyridin, jodacetamid, epoksid, hydroksysuksinimidyl, azol, maleimid, sulfon, ally], vinylsulfon, tresyl, sulfo-N-suksinimidyl, dion, mesyl, tosyl og glyoksal.
I en del tilfeller kan E ha strukturen ifølge formel III eller formel
IV:
Formel III
Formel IV
hvor hver Q, X, Y, Z, m og n uavhengig er som definert ovenfor, hver W er uavhengig hydrogen eller et C1- til Cz-alkyl, R" er en del egnet for dannelse av en binding mellom forbindelsen med formel III og en biologisk aktiv forbindelse eller en forløper for denne, og R'" er en del egnet for dannelse av en binding mellom forbindelsen med formel IV og en biologisk aktiv forbindelse eller en forløper for denne.
R" og R'" er uavhengig valgt blant karboksylsyre, ester, aldehyd, aldehydhydrat, acetal, hydroksy, beskyttet hydroksy, karbonat, alkenyl, akrylat, metakrylat, akrylamid, substituert eller usubstituert tiol, halogen, substituert eller usubstituert amin, beskyttet amin, hydrazid, beskyttet hydrazid, suksinimidyl, isocyanat, isotiocyanat, ditiopyridin, vinylpyridin, jodacetamid, epoksid, hydroksysuksinimidyl, azol, maleimid, sulfon, allyl, vinylsulfon, tresyl, sulfo-N-suksinimidyl, dion, mesyl, tosyl og glyoksal, og kan være de samme som eller forskjellige fra R.
Ved binding i begge ender til en biologisk aktiv forbindelse eller en forløper for denne, kan disse bifunksjonelle molekyler være representert ved formel XXIV eller formel XXV:
Formel XXIV:
hvor hver X og Y uavhengig er 0, S, CO, CO2, COS, SO, SO2, CONR<1>, SO2NR' eller NR', og hver R' og Z er uavhengig hydrogen, en rettkjedet eller forgrenet, mettet eller umettet C1- til C2o-alkyl- eller -heteroalkylgruppe.
Q er et mettet eller umettet cyklisk C3- til Cs-alkyl eller -heteroalkyl (innbefattende kondenserte bicykliske og brosammenknyttede bicykliske ringstrukturer), en substituert eller usubstituert aryl- eller heteroarylgruppe eller et substituert eller usubstituert alkaryl hvor alkylet er en mettet eller umettet C1- til C2o-alkyl- eller -heteroalkarylgruppe. Hvis til stede, kan substituentene være halogen, hydroksyl, karbonyl, karboksylat, ester, formyl, acyl, tiokarbonyl, tioester, tioacetat, tioformiat, alkoksyl, fosforyl, fosfonat, fosfinat, amino, am ido, amidin, imin, cyano, nitro, azido, sulfhydryl, sulfat, sulfonat, sulfamoyl, sulfonamido, sulfonyl, heterocyklyl, aralkyl, aromatisk del, heteroaromatisk del, imino, silyl, eter eller alkyltio.
Hver W er uavhengig hydrogen eller et Ci- til C7-alkyl, m er null eller én, a er et helt tall fra 4 til 10000 og hver n er uavhengig 0 eller et helt tall fra 1 til 5.
R* og R** er uavhengig sammenbindende deler som beskrevet ovenfor, B og B' er uavhengig biologisk aktive molekyler og kan være like eller forskjellige.
E kan (gjennom R" eller R'") danne en binding til et annet molekyl av den biologisk aktive forbindelse (B) slik at den aktiverte polyalkylenglykol-forbindelse er bundet i hver ende til et molekyl av den samme type biologisk aktiv forbindelse, under dannelse av en dimer av molekylet.
I en del tilfeller danner E (gjennom R" eller R'") en binding til en annen biologisk aktiv forbindelse enn B, under frembringelse av en heterodimer av biologisk aktive forbindelser eller forløpere for disse.
I andre tilfeller danner E (gjennom R" eller R'") en ytterligere binding til den biologisk aktive forbindelse, B, slik at både E og R er bundet gjennom forskjellige funksjonelle grupper på det samme molekyl av den biologisk aktive forbindelse eller en forløper for denne.
R" og R'" kan være de samme som eller forskjellige fra R, og er valgt blant karboksylsyre, ester, aldehyd, aldehyd-hydrat, acetal, hydroksy, beskyttet hydroksy, karbonat, alkenyl, akrylat, metakrylat, akrylamid, substituert eller usubstituert tiol, halogen, substituert eller usubstituert amin, beskyttet amin, hydrazid, beskyttet hydrazid, suksinimidyl, isocyanat, isotiocyanat, ditiopyridin, vinylpyridin, jodacetamid, epoksid, hydroksysuksinimidyl, azol, maleimid, sulfon, allyl, vinylsulfon, tresyl, sulfo-N-suksinimidyl, dion, mesyl, tosyl og glyoksal.
I en del tilfeller er R* eller R** en metylengruppe, og B eller B' er et biologisk aktivt molekyl inneholdende en aminogruppe, hvor metylengruppen danner en binding med aminogruppen på B. For eksempel kan aminet være den aminoterminale ende av et peptid, et amin i en aminosyre-sidekjede av et peptid eller et amin i en glykosylerings-substituent i et glykosylert peptid. I en del tilfeller er peptidet et interferon, så som interferon-beta, f.eks. interferon-beta-1 a. I en del tilfeller er denne type binding dannet ved en reduktiv alkyleringsreaksjon.
Konjugatene ifølge beskrivelsen kan fremstilles ved kopling av en biologisk aktiv forbindelse til en polyalkylenglykol-forbindelse som beskrevet i eksemplene. I en del tilfeller oppnås koplingen via en reduktiv alkyleringsreaksjon.
Aktuelle biologisk aktive forbindelser innbefatter hvilken som helst substans påtenkt for diagnose, helbredelse, lindring, behandling eller forebygging av sykdom hos mennesker eller andre dyr, eller for på annen måte å forbedre fysisk eller mentalt velvære hos mennesker eller dyr. Eksempler på biologisk aktive molekyler innbefatter peptider, peptidanaloger, proteiner, enzymer, små molekyler, fargestoffer, lipider, nukleosider, oligonukleotider, analoger til oligonukleotider, sukkerarter, oligosakkarider, celler, virus, liposomer, mikropartikler, overflater og miceller. Denne klasse forbindelser innbefatter også forløpere for disse typer molekyler. Klasser av biologisk aktive midler som er egnet for anvendelse ved beskrivelsen, innbefatter cytokiner, kjemokiner, lymfokiner, løselige reseptorer, antistoffer, antibiotika, fungicider, anti-virale midler, antiinflammatoriske midler, antitumormidler, kardiovaskulære midler, angstlindrende midler, hormoner, vekstfaktorer, steroide midler.
Den biologisk aktive forbindelse kan være et peptid, så som et interferon, innbefattende interferon-beta (f.eks. interferon-beta-1 a) eller interferon-alfa.
På grunn av at den polymere modifikasjon med en PGC ifølge beskrivelsen reduserer antigene responser, behøver ikke et fremmed peptid være fullstendig autologt for å anvendes som et terapeutisk middel. For eksempel kan et peptid, så som et interferon, anvendt til fremstilling av polymerkonjugater, fremstilles ut fra et pattedyrekstrakt, så som et humant, drøvtygger- eller bovint interferon, eller det kan fremstilles syntetisk eller rekombinant.
Ved ett aspekt er beskrivelsen for eksempel rettet mot forbindelser og fremgangsmåter for behandling av tilstander som er mottakelige for behandling med interferon-alfa eller -beta. Admininstrering av et polyalkylenglykol-konjugert interferon-beta (i det følgende "PGC IFN-beta", "PGC IFN-β", f.eks. "PEG IFN-beta", "PEG IFN-β" "PEGylert IFN-beta" eller "PEGylert IFN-β") gir forbedrede terapeutiske fordeler, mens det i vesentlig grad reduserer eller fullstendig eliminerer de uønskede bivirkninger som normalt er forbundet med vanlig utførte interferon-alfa- eller -beta-behandlingsregimener.
PGC IFN-beta kan fremstilles ved tilknytting av en polyalkylenpolymer til den terminale aminogruppe på IFN-beta-molekylet. Et enkelt aktivert polyalkylenglykol-molekyl kan konjugeres til den N-terminale ende av IFN beta via en reduktiv alkyleringsreaksjon.
PGC IFN-beta-konjugatet kan for eksempel utformes som en væske eller et lyofilisert pulver for injeksjon. Formålet med konjugering av IFN beta med en PGC er å forbedre avgivelsen av proteinet ved at dets plasma-halveringstid forlenges i betydelig grad, og derved tilveiebringes langvarig aktivitet av IFN beta.
Betegnelsen "interferon" eller "IFN" anvendt i det foreliggende angir familien av sterkt homologe artsspesifikke proteiner som inhiberer virusreplikasjon og celleproliferasjon og modulerer immunrespons. Flumane interferoner er gruppert i to klasser: Type I, innbefattende a- og β-interferon, og Type II, som er representert bare ved γ-interferon. Rekombinante former av hver gruppe er blitt utviklet og er kommersielt tilgjengelige. Subtyper i hver gruppe er basert på antigene/strukturelle egenskaper.
Betegnelsene "beta interferon", "beta-interferon", "beta IFN", "beta-IFN", "β interferon", "β-interferon", "β IFN", "β-IFN", "interferon beta", "interferon-beta", "interferon β", "interferon-β", "IFN beta", "IFN-beta", "IFN β", "IFN-β" og "humant fibroblast-interferon" er anvendt om hverandre i det foreliggende for å beskrive medlemmer av gruppen av interferon beta som har atskilte aminosyresekvenser som er blitt identifisert ved isolering og sekvensering av DNA som koder for peptidene.
I tillegg er betegnelsene "beta interferon 1a", "beta interferon-1a" "betainterferon 1a", "beta-interferon-1 a", "beta IFN 1a", "beta IFN-1a", "beta-IFN 1a", "beta-IFN-1a", "β interferon 1a", "β interferon-1 a", "β-interferon 1a", "β-interferon-1a", "β IFN 1a", "β IFN-1a", "β-IFN-la", "β-IFN-la", "interferon beta 1a", "interferon beta-1 a", "interferon-beta 1a", "interferon beta-1 a", "interferon β 1a", "interferon β-1a", "interferon-β 1a", "interferon-β-Ι a", "IFN beta 1a", "IFN beta-1 a", "IFN-beta 1 a", "IFN-beta-1 a", "IFN β 1 a", "IFN β-1 a", "IFN-β 1 a", "IFN β-1 a" anvendt om hverandre i det foreliggende for å beskrive rekombinant eller syntetisk fremstilt interferon beta som har de naturlig forekommende (villtype) aminosyresekvenser.
Fremkomsten av rekombinant DNA-teknologi anvendt for interferonproduksjon har muliggjort at flere humane interferoner kan syntetiseres med hell, hvorved fermentering, produksjon, isolasjon og rensing av forskjellige interferoner til homogenitet, i stor målestokk, er mulig. Rekombinant fremstilt interferon bibeholder noen eller de fleste av sine antivirale og immunmodulerende aktiviteter in vitro og in vivo. Det er også underforstått at rekombinante teknikker også kan innbefatte et glykosyleringssete for addisjon av en karbohydrat-del på det rekombinant oppnådde polypeptid.
Konstruering av rekombinante DNA-plasmider inneholdende sekvenser som koder for i det minste en del av humant fibroblast-interferon og ekspresjon av et polypeptid med immunologisk eller biologisk aktivitet som humant fibroblastinterferon, er også påtenkt. Konstruering av hybride beta-interferon-gener inneholdende kombinasjoner av forskjellige subtype-sekvenser kan utføres ved teknikker kjent for fagfolk på området.
Typiske egnede rekombinante beta-interferoner som kan anvendes ved utøvelse av oppfinnelsen, innbefatter interferon beta-1a så som AVONEX®, som leveres fra Biogen, Inc., Cambridge, MA, og interferon-beta-1 b så som BETASERON®, som leveres av Berlex, Richmond, CA.
Det er mange mekanismer ved hvilke IFN-induserte genprodukter gir beskyttende virkninger mot virusinfeksjon. Slike inhiberende virale effekter fremkommer på forskjellige stadier av virusets livssyklus. Se US-patent nr.
6 030 785. For eksempel kan IFN inhibere avkledning av viruspartikler, gjennomtrengning og/eller fusjon forårsaket av virus.
Tilstander som kan behandles i henhold til foreliggende beskrivelse, er generelt slike som er mottakelige for behandling med interferon. Mottakelige tilstander innbefatter for eksempel slike som vil respondere positivt eller gunstig (slik disse betegnelser er kjent på de medisinske områder) på interferon betabasert terapi. For beskrivelsens formål innbefatter tilstander som kan behandles med interferon beta-terapi beskrevet i det foreliggende, de tilstander hvor behandling med et interferon beta viser en viss effektivitet, men hvor de negative bivirkninger av IFNβ-behandling oppveier fordelene. Behandling i henhold til fremgangsmåtene ifølge beskrivelsen resulterer i hovedsakelig reduserte eller eliminerte bivirkninger sammenliknet med vanlig interferon beta-behandling. Dessuten kan tilstander som trandisjonelt antas å være refraktære overfor IFN-βbehandling, eller slike for hvilke det er upraktisk å behandle med en lettstyrt dose av IFN-β, behandles i henhold til fremgangsmåtene ifølge foreliggende beskrivelse.
PGC IFNβ-forbindelsene ifølge beskrivelsen kan anvendes alene eller i kombinasjon med ett eller flere midler som er anvendelige for behandling av en spesiell tilstand. Det er blitt utført minst én pilotundersøkelse av rekombinant interferon beta-1a for behandling av kronisk hepatitt C. Se generelt Habersetzer et al., Liver 30:437-441 (2000). For eksempel kan forbindelsene administreres i kombinasjon med kjente antivirale midler for behandling av en virusinfeksjon. Se Kakumu et al., Gastroenterology 105:507-12 (1993) og Pepinsky, et al., J.
Pharmacology and Experimental Therapeutics, 297:1059-1066 (2001).
Anvendt i det foreliggende kan betegnelsen "antivirale midler" innbefatte for eksempel små molekyler, peptider, sukkerarter, proteiner, virus-avledede molekyler, proteaseinhibitorer, nukleotidanaloger og/eller nukleosidanaloger. Et "lite molekyl" slik betegnelsen er anvendt i det foreliggende angir et organisk molekyl med mindre enne ca. 2500 amu (atomiske masse-enheter), fortrinnsvis mindre enn ca. 1000 amu. Eksempler på egnede antivirale forbindelser innbefatter ribavirin, levovirin, MB6866, zidovudin, 3TC, FTC, acyklovir, gancyklovir, viramid, VX-497, VX-950 og ISIS-14803.
Eksempler på tilstander som kan behandles med interferon, innbefatter celleproliferasjonsforstyrrelser, spesielt multippel sklerose, cancer (f.eks. hårcelleleukemi, Kaposis sarkom, kronisk myelogen leukemi, multippelt myelom, basalcellekarsinom og malignt melanom, ovariecancer, kutant T-cellelymfom) og virusinfeksjonerer. Uten begrensning kan behandling med interferon anvendes til behandling av tilstander som vil ha fordel av inhibering av replikasjon av interferon-sensitive virus. For eksempel kan interferon anvendes alene eller i kombinasjon med AZT ved behandling av humant immunsvikt-virus (HIV)/AIDS eller i kombinasjon med ribavirin ved behandling av HCV. Virusinfeksjoner som kan behandles i henhold til bskrivelsen, innbefatter hepatitt A, hepatitt B, hepatitt C, annen ikke-A/ikke-B-hepatitt, herpesvirus, Epstein-Barr-virus (EBV), cytomegalovirus (CMV), herpes simplex, humant herpesvirus type 6 (HHV-6), papilloma, poxvirus, picornavirus, adenovirus, rhinovirus, humant T lymfotropt virus type 1 og 2 (HTLV-1/-2), humant rotavirus, rabiesvirus, retrovirus innbefattende HIV, encefalitt og respiratoriske virusinfeksjoner. Fremgangsmåtene ifølge beskrivelsen kan også anvendes til modifisering av forskjellige immunresponser.
Det er blitt observert en korrelasjon mellom HCV-genotype og respons overfor interferonterapi. Se US-patent nr. 6030 785; Enomoto et al., N. Engl. J. Med. 334:77-81 (1996); Enomoto et al., J. Clin. Invest. 96:224-30 (1995).
Respons-prosentverdien for pasienter infisert med HCV-1b er lavere enn 40%. Se US-patent nr. 6030 785. Liknende lave respons-prosentverdier er også observert for pasienter infisert med HCV-1a. Se id.; Hoofnagel et al., Intervirology 37:87-100 (1994). Imidlertid er respons-prosentverdien for pasienter infisert med HCV-2 nesten 80%. Se US-patent nr. 6030785; Fried et al., Semin. Liver Dis. 15:82-91 (1995). Faktisk ble en aminosyresekvens av en diskret region av NS5A-proteinet fra HCV genotype 1b funnet å samsvare med følsomhet overfor interferon. Se US-patent nr. 6030 785. Se også Enomoto et al. 1996; Enomoto et al. 1995. Denne region er blitt identifisert som den interferonsensitivitets-bestemmende region (ISDR). Se id.
PGC IFN-beta-konjugatet administreres i en farmakologisk effektiv mengde for behandling av hvilken som helst av tilstandene beskrevet ovenfor, og er basert på IFN beta-aktiviteten av polymerkonjugatet. Betegnelsen "farmakologisk effektiv mengde" angir mengden av et medikament eller farmasøytisk middel som vil fremkalle den biologiske eller medisinske respons hos et vev, system, dyr eller menneske som søkes av en forsker eller lege. Det er en mengde som er tilstrekkelig til i betydelig grad å bevirke en positiv klinisk respons mens reduserte nivåer av bivirkninger opprettholdes. Mengden av PGC IFN-beta som kan administreres til et individ som trenger det, er i området 0,01-100 pg/kg, eller mer foretrukket 0,01-10 pg/kg, administrert i enkeltdoser eller delte doser.
Administrering av de ønskede doser kan skje hver annen dag, men finner fortrinnsvis sted én gang i uken eller én gang hver annen uke. Doser administreres i løpet av minst et 24 ukers tidsrom ved injeksjon.
Administrering av dosen kan skje oralt, topisk, intravenøst, subkutant, intramuskulært eller ved hvilken som helst annen akseptabel systemisk metode. Basert på den behandlende leges bedømmelse vil mengden administrert medikament og det anvendte behandlingsregimen selvfølgelig være avhengig av alder, kjønn og medisinsk historie for pasienten som behandles, mengden av nøytrofile celler (f.eks. graden av nøytropeni), graden av den spesifikke sykdomstilstand, samt pasientens toleranse overfor behandlingen vist ved lokal toksisitet og ved system iske bivirkninger.
I praksis administreres konjugatene ifølge beskrivelsen i mengder som vil være tilstrekkelige til å inhibere eller forebygge uønskede medisinske tilstander eller sykdom hos et individ, så som et pattedyr, og anvendes i den form som er mest egnet for slike formål. Preparatene er fortrinnsvis egnet for innvortes bruk og innbefatter en effektiv mengde av en farmakologisk aktiv forbindelse ifølge beskrivelsen, alene eller i kombinasjon med andre aktive midler, med én eller flere farmasøytisk akseptable bærere. Forbindelsene er spesielt anvendelige ved at de har meget lav, hvis noen, toksisitet.
Konjugatene beskrevet i det foreliggende kan utgjøre den aktive bestanddel i et farmasøytisk preparat, og administreres typisk i en blanding med egnede farmasøytiske fortynningsmidler, tilsetningsstoffer eller bærere passende valgt med hensyn til den påtenkte administreringsform, det vil si oraltabletter, kapsler, eliksirer, siruptyper. Preparatene vil typisk innbefatte en effektiv mengde av aktiv forbindelse eller det farmasøytisk akseptable salt derav, og i tillegg kan de også innbefatte hvilke som helst bærermaterialer som vanligvis anvendes innenfor de farmasøytiske vitenskaper. Avhengig av den påtenkte administreringsmåte kan preparatene være i fast, halvfast eller flytende doseringsform, så som for eksempel injiserbare preparater, tabletter, stikkpiller, piller, kapsler som frigjøres over tid, pulvere, væsker, suspensjoner eller liknende, fortrinnsvis i enhetsdoser.
Konvensjonelle farmasøytiske preparater omfattende en farmakologisk effektiv mengde av et konjugat, f.eks. PGC IFN-beta, sammen med farmasøytisk akseptable bærere, adjuvanser, fortynningsmidler, konserveringsmidler og/eller solubiliseringsmidler kan anvendes ved utøvelse av beskrivelsen, innklusive foreliggense oppfinnelsen. Farmasøytiske preparater av interferon innbefatter fortynningsmidler for forskjellige buffere (f.eks.
arginin, T ris-HCI, acetat, fosfat) med et visst område av pH og ionestyrke, bærere (f.eks. humant serumalbumin), solubiliseringsmidler (f.eks. Tween, polysorbat), og konserveringsmidler (f.eks. benzylalkohol). Se for eksempel US-patent nr.
4 496 537.
Administrering av de aktive forbindelser beskrevet i det foreliggende kan skje via hvilken som helst av de aksepterte administreringsmåter for terapeutiske midler. Disse metoder innbefatter system isk eller lokal administrering så som orale, nasale, parenterale, transdermael, subkutane eller topiske administreringsmåter.
For oral administrering i form av en tablett eller kapsel (f.eks. en gelatinkapsel) kan den aktive medikamentkomponent for eksempel være kombinert med en oral, ikke-toksisk farmasøytisk akseptabel inert bærer så som etanol, glycerol, vann. Om ønsket eller nødvendig, kan dessuten egnede bindemidler, smøremidler, oppløsingsmidler og fargestoffer også innarbeides i blandingen. Egnede bindemidler innbefatter stivelse, magnesiumaluminiumsilikat, stivelsespasta, gelatin, metylcellulose, natriumkarboksy-metylcellulose og/eller polyvinylpyrrolidon, sukkerarter, mais-søtningsstoffer, naturlige og syntetiske gummiarter så som akasie, tragant eller natriumalginat, polyetylenglykol, voksarter. Smøremidler som anvendes i disse doseringsformer, innbefatter natriumoleat, natriumstearat, magnesiumstearat, natriumbenzoat, natriumacetat, natriumklorid, silisiumdioksid, talk, stearinsyre, dens magnesium- eller kalsiumsalt, og/eller polyetylenglykol. Oppløsingsmidler innbefatter, uten begrensning, stivelse, metylcellulose, agar, bentonitt, xantangummi-stivelsestyper, agar, alginsyre eller dens natriumsalt, eller bruseblandinger. Fortynningsmidler innbefatter f. eks. laktose, dekstrose, sakkarose, mannitol, sorbitol, cellulose og/eller glycin.
Konjugatene ifølge beskrivelsen kan også administreres i slike oraldoseringsformer som tabletter eller kapsler, piller, pulvere, granuler, eliksirer, tinkturer, suspensjoner, siruptyper og emulsioner med tidsregulert frigjøring og langvarig frigjøring.
Flytende, spesielt injiserbare, preparater kan for eksempel fremstilles ved oppløsing, dispergering osv. Den aktive forbindelse oppløses i eller blandes med et farmasøytisk rent løsningsmiddel så som for eksempel vann, saltoppløsning, vandig dekstrose, glycerol hvorved den injiserbare oppløsning eller suspensjon dannes. Dessuten kan det utformes faste former egnet for oppløsing i væske før injeksjon. Injiserbare preparater er fortrinnsvis vandige isotoniske oppløsninger eller suspensjoner. Preparatene kan steriliseres og/eller inneholder adjuvanser, så som konserverings-, stabiliserings-, fukte- eller emulgeringsmidler, oppløsningsbefordrende midler, salter for regulering av det osmotiske trykk og/eller buffere. Dessuten kan de også inneholde andre terapeutisk verdifulle substanser.
Konjugatene ifølge foreliggende beskrivelse kan administreres i intravenøs (f.eks. bolus eller infusjon), intraperitoneal, subkutan eller intramuskulærform, alle anvendelsesformer velkjente for vanlige fagfolk på de farmasøytiske områder. Injiserbare preparater kan fremstilles i vanlige former, enten som flytende oppløsninger eller suspensjoner.
Parenteral injiserbar administrering anvendes vanligvis for subkutane, intramuskulære eller intravenøes injeksjoner og infusjoner. Når det for eksempel anvendes en subkutan injeksjon for avgivelse av 0,01-100 pg/kg, eller mer foretrukket 0,01-10 pg/kg, PEGylert IFN-beta i løpet av én uke, kan det administreres to injeksjoner av henholdsvis 0,005-50 pg/kg eller mer foretrukket 0,005-5 pg/kg etter 0 og 72 timer. I tillegg anvender én fremgangsmåte for parenteral administrering implantasjon av et system med langsom frigjøring eller langvarig frigjøring, noe som sikrer at det opprettholdes et konstant dosenivå, ifølge US-patent nr. 3710795.
Videre kan foretrukne konjugater for foreliggende beskrivelse administreres i intranasal form ved topisk anvendelse av egnede intranasal-bærermaterialer eller transdermalt, under anvendelse av former av transdermale hudplaster som er velkjente for vanlige fagfolk på området. For administrering i form av et transdermalt avgivelsessystem vil doseringsadministreringen selvfølgelig være kontinuerlig heller enn intermitterende i hele doseringsregimenet. Andre foretrukne topiske preparater innbefatter kremer, salver, losjoner, aerosoler, sprayer og geler, hvor den administrerte mengde vil være 10-100 ganger dosen som typisk gis ved parenteral administrering.
For faste preparater kan det som tilsetningsstoffer anvendes farmasøytiske kvaliteter av mannitol, laktose, stivelse, magnesiumstearat, natriumsakkarin, talk, cellulose, glukose, sakkarose, magnesiumkarbonat. Den aktive forbindelse definert ovenfor kan også utformes som stikkpiller, for eksempel under anvendelse av polyalkylenglykoler, for eksempel propylenglykol, som bærer. I en del tilfeller fremstilles stikkpiller med fordel av fettemulsjoner eller - suspensjoner.
Konjugatene ifølge foreliggende beskrivelse kan også administreres i form av liposom-avgivelsessystemer, så som små unilamellære vesikler, store unilamellære vesikler og multilamellære vesikler. Liposomer kan utformes ut fra forskjellige fosfolipider, inneholdende kolesterol, stearylamin eller fosfatidylkoliner. Ved en del utførelsesformer blir en film av lipidkomponenter hydratisert med en vandig oppløsning av medikament under dannelse av lipidlag som innkapsler medikamentet, som beskrevet i US-patent nr. 5262 564.
Konjugater ifølge foreliggende beskrivelse kan også avgis ved anvendelse av immunglobulinfusjoner som individuelle bærere til hvilke forbindelsesmolekylene koples. Forbindelsene ifølge foreliggende beskrivelse kan også koples med løselige polymerer som målsiktende medikamentbærere. Slike polymerer kan innbefatte polyvinylpyrrolidon, pyran-kopolymer, polyhydroksypropyl-metakrylamid-fenol, polyhydroksyetylaspanamidfenol eller polyetylenoksidpolylysin substituert med palmitoylrester. Konjugatene kan også koples til proteiner, så som for eksempel reseptorproteiner og albumin. Videre kan forbindelsene ifølge foreliggende beskrivelse koples til en klasse av bionedbrytbare polymerer som er anvendelige for oppnåelse av regulert frigjøring av et medikament, for eksempel polymelkesyre, polyepsilon-kaprolakton, polyhydroksysmørsyre, polyortoestere, polyacetaler, polydihydropyraner, polycyanoakrylater og kryssbundne eller amfipatiske blokk-kopolymerer av hydrogeler.
Hvis ønskelig, kan det farmasøytiske preparat som skal administreres, også inneholde mindre mengder av ikke-toksiske hjelpesubstanser så som fukte- eller emulgeringsmidler, pH-bufringsm idler og andre substanser så som for eksempel natriumacetat, trietanolaminoleat osv.
Doseringsregimenet hvor konjugatene anvendes, velges i henhold til forskjellige faktorer innbefattende pasientens type, spesies, alder, vekt, kjønn og medisinske tilstand; graden av tilstanden som skal behandles; administreringsmåten; pasientens nyre- og leverfunksjon; og den spesielle forbindelse eller saltet derav som anvendes. Aktiviteten av forbindelsene ifølge beskrivelse og pasientens følsomhet overfor bivirkninger tas også i betraktning. En lege eller veterinær med vanlige fagkunnskaper kan lett bestemme og foreskrive den effektive mengde av medikamentet som fordres for å forebygge, motvirke eller stoppe tilstandens utvikling.
Oraldoser ifølge foreliggende beskrivelse vil, ved anvendelse for de angitte virkninger, være i området ca. 0,01 -100 μg/kg/dag oralt, eller mer foretrukket 0,01 -10 pg/kg/dag oralt. Preparatene tilveiebringes fortrinnsvis i form av tabletter med hakk inneholdende 0,5-5000 pg, eller mer foretrukket 0,5-500 pg aktiv bestanddel.
For hvilken som helst administreringsmåte kan det anvendes delte eller enkeltdoser. For eksempel kan forbindelser ifølge foreliggende beskrivelse administreres daglig eller ukentlig, i en enkelt dose, eller den totale dose kan administreres i delte doser på to, tre eller fire.
Hvilket som helst av de ovennevnte farmasøytiske preparater kan inneholde 0,1-99%, 1-70% eller fortrinnsvis 1-50% av de aktive forbindelser ifølge beskrivelsen som aktive bestanddeler.
Som beskrevet ovenfor, kan sykdommens forløp og dens respons overfor medikamentbehandlinger følges ved klinisk undersøkelse og laboratoriefunn.
Effektiviteten av terapien ifølge beskrivelsen bestemmes ved i hvilket omfang de tidligere beskrevne tegn og symptomer på en tilstand, f.eks. kronisk hepatitt, lindres, og i hvilket omfanget de normale bivirkninger av interferon (dvs. influensaliknende symptomer så som feber, hodepine, forkjølelse, myalgi, tretthet osv. og sentralnervesystem-tilknyttede symptomer så som depresjon, parestesi, nedsatt konsentrasjon osv.) elimineres eller vesentlig reduseres.
I en del tilfeller administreres en polyalkylert forbindelse ifølge beskrivelsen (f.eks. et PEGylert interferon) sammen med ett eller flere farmasøytiske midler som er egnet for behandling av en spesiell tilstand. For eksempel kan et polyalkylert protein administreres i kombinasjon med et kjent antiviralt middel eller middel for behandling av en virusinfeksjon. Slike antiviale forbindelser innbefatter for eksempel ribavirin, levovirin, MB6866 og zidovudin 3TC, FTC, acyklovir, gancyklovir, viramid, VX-497, VX-950 og ISIS-14803.
Konjugatet og antivirusmidlet kan administreres samtidig (f.eks. administreres midlene sammen til en pasient); sekvensielt (f.eks. administreres midlene til pasientene etter hverandre); eller vekslende (f.eks. administreres midlene i en repeterende serie, så som middel A, deretter middel B, deretter middel A, osv.).
Ved utøvelse av beskrivelsen kan det foretrukne PGC IFN-beta (f.eks. PEG IFN-beta) administreres til pasienter som er infisert med hepatitt C-viruset.
Anvendelse av PEG IGN-beta-1a er foretrukket.
Pasienter velges for behandling blant anti-FICV-antistoff-positive pasienter med biopsi-dokumentert kronisk aktiv hepatitt.
For å følge forløpet av FICV-replikasjon i individer som svar på medikantbehandling kan FICV-RNA måles i serumprøver for eksempel ved en "nested" polymerasekjedereaksjonsanalyse som anvender to sett primere avledet fra de ikke-strukturelle NS3- og NS4-genregioner av FICV-genomet. Se Farci et al., 1991, New Eng. J. Med. 325:98-104. Ulrich et al., 1990. J. Clin. Invest., 86:1609-1614.
Antiviral aktivitet kan måles ved forandringer i FICV-RNA-titer. FICV-RNA-data kan analyseres ved sammenlikning av titere ved slutten av behandling med en for-behandlings-basislinjemåling. Reduksjon i FICV-RNA etter uke 4 gir bevis for antiviral aktivitet av en forbindelse. Se Kleter et al., 1993, Antimicrob. Agents Chemother. 37(3):595-97; Orito et al., 1995, J. Medical Virology, 46:109-115. Forandringer på minst to størrelsesordener (>2 log) tolkes som tegn på antiviral aktivitet.
En person som lider av kronisk hepatitt C-infeksjon, kan vise ett eller flere av følgende tegn eller symptomer: (a) forhøyet serum-alaninaminotransferase (ALAT), (b) positiv test med hensyn til anti-FICV-antistoffer, (c) tilstedeværelse av FICV ifølge påvisning ved en positiv test med henblikk på FICV-RNA, (d) kliniske stigmaer på grunn av kronisk leversykdom, (e) hepatocellulær ødeleggelse. Slike kriterier vil ikke bare kunne anvendes til diagnostisering av hepatitt C, men kan anvendes til å forhøye en pasients respons overfor medikamentbehandling.
Forhøyet alaninaminotransferase (ALAT) og aspartataminotransferase (ASAT) er kjent for å forekomme ved ukontrollert hepatitt C, og en fullstendig respons overfor behandling er generelt definert som normalisering av disse serumenzymer, spesielt ALAT. Se Davis et al., 1989, New Eng. J. Med. 321:1501-1506. ALAT er et enzym som frigjøres når leverceller ødelegges, og er symptomatisk for HCV-infeksjon. Interferon forårsaker syntese av enzymet 2', 5'-oligoadenylatsyntetase (2'5'OAS), som i sin tur resulterer i nedbryting av virusmRNA. Se Houglum, 1983, Clinical Pharmacology 2:20-28. Økninger i serumnivåer av 2'5'OAS stemmer overens med reduksjon i ALAT-nivåene.
Histologisk undersøkelse av leverbiopsiprøver kan anvendes som et andre kriterium for evaluering. Se f.eks. Knodell et al., 1981, Hepatology 1:431-435, hvis histologiske aktivitetsindeks (portveneinflammasjon, stykkevis eller brodannende nekrose, lobulærskade og fibrose) gir en bedømmelsesmetode for sykdomsaktivitet.
Sikkerhet og toleranse ved behandling kan bestemmes ved kliniske evalueringer og tellinger av hvite blodlegemerog nøytrofile celler. Dette kan fastsettes ved periodisk overvåking av hematologiske parametere, f.eks. tellinger av hvite blodlegemer, nøytrofile celler, blodplater og røde blodlegemer).
Forskjellige andre utformninger med forlenget eller langvarig frigjøring kan fremstilles under anvendelse av vanlige metoder som er velkjente på området.
EKSEMPLER
EKSEMPEL 1: Syntese av aktiverte polyalkylenglykoler
A) Alkylering av alkoholer
Aktiverte polyalkylenglykoler syntetiseres ved alkylering av en polyalkylenglykol med en fri terminal hydroksylfunksjonalitet. En generisk reaksjon er skissert i reaksjonsskjema I:
Reaksjonsskjema I
P-OH.+
Polyalkylenglykolen (P-OH) omsettes med alkylhalogenidet (A) under dannelse av eteren (B). Forbindelse B blir så hydroksylert under dannelse av alkoholen (C), som oksideres til aldehydet (D). I disse forbindelser er n et helt tall fra null til fem, og Z kan være en rettkjedet eller forgrenet, mettet eller umettet Citil C2o-alkyl- eller
-heteroalkylgruppe. Z kan også være et mettet eller umettet cyklisk C3- til C7-alkyl eller -heteroalkyl, en substituert eller usubstituert aryl- eller heteroarylgruppe eller en substituert eller usubstituert alkaryl- (alkylet er et mettet eller umettet C1- til C20-alkyl) eller heteroalkarylgruppe. Når det gjelder substituerte forbindelser, kan substituentene være halogen, hydroksyl, karbonyl, karboksylat, ester, formyl, acyl, tiokarbonyl, tioester, tioacetat, tioformiat, alkoksyl, fosforyl, fosfonat, fosfinat, amino, amido, amidin, imin, cyano, nitro, azido, sulfhydryl, sulfat, sulfonat, sulfamoyl, sulfonamido, sulfonyl, heterocyklyl, aralkyl, aromatisk del, heteroaromatisk del, imino, silyl, eter eller alkyltio. P-OH er typisk polyetylenglykol (PEG) eller monometoksy-polyetylenglykol (mPEG) med en molekylvekt på fra 5 000 til 40000 Dalton (Da).
Syntesen av mPEG-O-2-metylpropionaldehyd er for eksempel skissert i reaksjonsskjema II.
Reaksjonsskjema II:
mPEG-OH med en molekylvekt på 20000 Da (mPEG-OH 20 kDa; 2,0 g, 0,1 mmol, Sunbio) ble behandlet med NaH (12 mg, 0,5 mmol) i THF (35 ml). Femti ekvivalenter 3-brom-2-m etyl propen (3,34 g, 5 mmol) og en katalytisk mengde av Kl ble så tilsatt til blandingen. Den resulterende blanding ble oppvarmet til tilbakeløp i 16 timer. Vann (1 ml) ble så tilsatt, og løsningsmidlet ble fjernet under vakuum. Til residuet ble det tilsatt CFI2CI2 (25 ml), og den organiske fase ble fraskilt og tørket over vannfritt Na2S04, og volumet ble redusert til omtrent 2 ml. Denne CH2Cl2oppløsning ble tilsatt dråpevis til eter (150 ml). Den resulterende hvite utfelning ble oppsamlet, hvorved man fikk 1 ,9 g av forbindelse 1.<1>HI-NMR (CDCl, 400 MHz) viste δ 4,98 (s, 1 H), 4,91 (s, 1 H), 1.74 (s, 3H).
Til forbindelse 1 (1 ,9 g, 0,1 mmol) i THF (20 ml) og CH2CI2 (2 ml) ved 0°C ble det tilsatt BH3 i THF (1 ,0 M, 3,5 ml). Blandingen ble omrørt i isbad i 1 time. Til denne blanding ble NaOH tilsatt langsomt (2,0 M, 2,5 ml), fulgt av 30% H2O2 (0,8 ml). Reaksjonsblandingen ble oppvarmet til romtemperatur og omrørt i 16 timer. Ovennevnte opparbeidelses-fremgangsmåte ble fulgt (CH2CI2, utfelt fra eter) hvorved man fikk 1 ,8 g av 2 som et hvitt faststoff.<1>H-NMR (CDCb, 400 MHz) viste δ 1,80 (m, 1 H), 0,84 (d, 3H).
Forbindelse 2 (250 mg) ble oppløst i CH2CI2 (2,5 ml), og Dess-Martinperjodat (DMP; 15 mg) ble tilsatt under omrøring i 30 minutter ved romtemperatur. Til blandingen ble det tilsatt mettet NaHC03 og Na2S203 (2 ml), og blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 1 time. Ovennevnte opparbeidelses-fremgangsmåte ble fulgt, hvorved man fikk 3 (mPEG-O-2-metylpropionaldehyd, 120 mg) som et hvitt faststoff.<1>H-NMR (CDCIs, 400 MHz) viste δ 9.75 (s, 1 H), 2.69 (m, 1 H), 1,16 (d, 3H).
En liknende fremgangsmåte følges for aromatiske alkoholer, som vist i reaksjonsskjema III:
Generelt omsettes den aromatiske alkohol (E) med alkylhalogenidet (A) under dannelse av monoeteren (F). Den gjenværende alkoholgruppe i forbindelse F blir så omdannet til halogenidet (f.eks. bromid) i forbindelse G, som omsettes med polyalkylenglykolen (P-OFI) , hvorved man får eteren (Fl). Denne forbindelse blir så omdannet til aldehydet (J) via en hydroborering til den primære alkohol (I) fulgt av oksidasjon. I disse forbindelser er n et helt tall fra null til fem, d er null eller et helt tall fra én til fire og Z kan være en rettkjedet eller forgrenet, mettet eller umettet Ci- til C2o-alkyl- eller -heteroalkylgruppe. Z kan også være et mettet eller umettet cyklisk C3- til C7-alkyl eller -heteroalkyl, en substituert eller usubstituert aryl- eller heteroaryl-gruppe eller en substituert eller usubstituert alkaryl- (alkylet er et mettet eller umettet C1- til C2o-alkyl) eller heteroalkaryl gruppe. Når det gjelder substituerte forbindelser, kan substituentene være halogen, hydroksyl, karbonyl, karboksylat, ester, formyl, acyl, tiokarbonyl, tioester, tioacetat, tioformiat, alkoksyl, fosforyl, fosfonat, fosfinat, amino, amido, amidin, imin, cyano, nitro, azido, sulfhydryl, sulfat, sulfonat, sulfamoyl, sulfonamido, sulfonyl, heterocyklyl, aralkyl, aromatisk del, heteroaromatisk del, imino, silyl, eter eller alkyltio.
Dessuten er T1 og T2 uavhengig fraværende eller en rettkjedet eller forgrenet, mettet eller umettet C1- til C2o-alkyl- eller -heteroalkylgruppe, og kan være orto, meta eller para i forhold til hverandre. Hver L (når til stede) er uavhengig en rettkjedet eller forgrenet, mettet eller umettet C1- til C2o-alkyl- eller -heteroalkylgruppe, mettet eller umettet cyklisk C3- til C7-alkyl eller -heteroalkyl, en substituert eller usubstituert aryl- eller heteroarylgruppe eller et substituert eller usubstituert alkaryl hvor alkylet er en mettet eller umettet C1- til C2o-alkyl- eller -heteroalkarylgruppe. Substituentene kan være halogen, hydroksyl, karbonyl, karboksylat, ester, formyl, acyl, tiokarbonyl, tioester, tioacetat, tioformiat, alkoksyl, fosforyl, fosfonat, fosfinat, amino, amido, amidin, imin, cyano, nitro, azido, sulfhydryl, sulfat, sulfonat, sulfamoyl, sulfonamido, sulfonyl, heterocyklyl, aralkyl, aromatisk del, heteroaromatisk del, imino, silyl, eter eller alkyltio.
P-OH er vanligvis polyetylenglykol (PEG) eller monometoksypolyetylenglykol (mPEG) med en molekylvekt på 5 000 til 40 000 Da.
For eksempel er syntesen av mPEG-O-p-metylfenyl-O-2-metylpropionaldehyd (8) er vist i reaksjonsskjema IV:
Reaksjonsskjema IV:
Til en oppløsning av 4-hydroksybenzylalkohol (2,4 g, 20 mmol) i THF (50 ml) og vann (2,5 ml) ble det først tilsatt natriumhydroksid (1 ,5 g, 37,5 mmol) og deretter 3-brom-2-metylpropen (4,1 g, 30 mmol). Denne reaksjonsblanding ble oppvarmet til tilbakeløp i 16 timer. Til blandingen ble det tilsatt 10% citronsyre (2,5 ml), og løsningsmidlet ble fjernet under vakuum. Residuet ble ekstrahert med etylacetat (3 x 15 ml), og de blandede organiske faser ble vasket med mettet NaCI (10 ml), tørket og konsentrert, hvorved man fikk forbindelse 4. (3,3 g, 93%).<1>H-NMR (CDCb, 400 MHz) viste δ 7,29 (m, 2H), 6,92 (m, 2H), 5,14 (s, 1 H), 5,01 (s, 1 H), 4,56 (s, 2H), 4,46 (s, 2H), 1,85 (s, 3H).
Mesylklorid (MsCI; 2,5 g, 15,7 mmol) og trietylamin (TEA; 2,8 ml, 20 mmol) ble tilsatt til en oppløsning av forbindelse 4 (2,0 g, 11 ,2 mmol) i CH2CI2 (25 ml) ved 0°C, og reaksjonsblandingen ble satt i kjøleinnretning i 16 timer. En vanlig opparbeidelse ga en blekgul olje (2,5 g, 87%).<1>H-NMR (CDl3, 400 MHz) viste δ 7,31 (m, 2H), 6,94 (m, 2H), 5,16 (s, 1H), 5,01 (s, 1H), 5,03 (s, 2H), 4,59 (s, 2H), 4,44 (s, 2H), 3.67 (s, 3H), 1,85 (s, 3H). Denne olje (2,4 g, 9,4 mmol) ble oppløst i THF (20 ml), og LiBr (2,0 g, 23,0 mmol) ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble oppvarmet til tilbakeløp i 1 time og ble så avkjølt til romtemperatur. Vann (2,5 ml) ble tilsatt til blandingen, og løsningsmidlet ble fjernet under vakuum. Residuet ble ekstrahert med etylacetat (3 x 15 ml), og de blandede organiske faser ble vasket med mettet NaCI (10 ml), tørket over vannfritt Na2S04 og konsentrert, hvorved man fikk det ønskede bromid 5 (2,3 g, 96%) som en blekgul olje.<1>H-NMR (CDCb, 400 MHz) viste δ 7,29 (m, 2H), 6,88 (m, 2H), 5,11 (s, 1 H), 4,98 (s, 1 H), 4,53 (s, 2H), 4,44 (s, 2H), 1,83 (s, 3H).
mPEG-OH 20 kDa (2,0 g, 0,1 mmol, Sunbio) ble behandlet med NaH (12 mg, 0,5 mmol) i THF (35 ml), og forbindelse 5 (0,55 g, 22,8 mmol) ble tilsatt til blandingen med en katalytisk mengde av Kl. Den resulterende blanding ble oppvarmet til tilbakeløp i 16 timer. Vann (1 ,0 ml) ble tilsatt til blandingen, og løsningsmidlet ble fjernet under vakuum. Til residuet ble det tilsatt CH2CI2 (25 ml), og den organiske fase ble fraskilt og tørket over vannfritt Na2S04, og volumet ble redusert til omtrent 2 ml. Dråpevis tilsetting til en eteroppløsning (150 ml) resulterte i en hvit utfelning, som ble oppsamlet, hvorved man fikk 6 (1 ,5 g) som et hvitt pulver.<1>H-NMR (CDCb, 400 MHz) viste δ 7,21 (d, 2H), 6,90 (d, 2H), 5,01 (s, 1 H), 4,99 (s, 1 H), 4,54 (s, 2H), 4,43 (s, 2H), 1 ,84 (s, 3H).
Til en oppløsning av forbindelse 6 (1 ,0 g, 0,05 mmol) i THF (10 ml) og CH2CI2 (2 ml) avkjølt til 0°C ble BH3/THF (1,0 M, 3,5 ml) tilsatt, og reaksjonsblandingen ble omrørt i 1 time. En 2,0 M NaOFI-oppløsning (2,5 ml) ble tilsatt langsomt, fulgt av 30% FI2O2 (0,8 ml). Reaksjonsblandingen fikk oppvarmes til romtemperatur og ble omrørt i 16 timer. Ovennevnte opparbeidelsesfremgangsmåte ble fulgt (CH2CI2, utfelt fra eter), hvorved man fikk 7 (350 mg) som et hvitt faststoff.<1>H-NMR (CDCl3 400 MHz) viste δ 7,21 (d, 2H), 6,84 (d, 2H), 4,54 (s, 2H), 2,90 (m, 2 H), 1,96 (d, 3H).
Forbindelse 7 (150 mg, 0,0075 mmol) ble oppløst i CFI2CI2 (1 ,5 ml), og DMP (15 mg) ble tilsatt mens reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i VA time.<1>H-NMR (CDCI3, 400 MHz) viste δ 9,76 (s,1H), 7,21 (d, 2H), 6,78 (d, 2H), 4,44 (s, 2H), 4,14 (m, 2H), 2,85 (m, 1 H), 1 ,21 (d, 3H). Til blandingen ble det tilsatt mettet NaHC03 (0,5 ml) og Na2S203 (0,5 ml), og omrøringen ble fortsatt ved romtemperatur i 1 time. Ovennevnte opparbeidelses-fremgangsmåte ble fulgt (CH2Cl2-oppløsning, utfelt fra eter), hvorved man fikk 8 (92 mg) som et hvitt faststoff.
Likeledes ble mPEG-O-m-metylfenyl-O-2-metylpropionaldehyd (9) syntetisert som skissert i reaksjonsskjema V.
Reaksjonsskjema V:
Til en oppløsning av 3-hydroksybenzylalkohol (2,4 g, 20 mmol) i THF (50 ml) og vann (2,5 ml) ble det først tilsatt natriumhydroksid (1 ,5 g, 37,5 mmol) og deretter 3-brom-2-metylpropen (4,1 g, 30 mmol). Denne reaksjonsblanding ble oppvarmet til tilbakeløp i 16 timer. Til blandingen ble det tilsatt 10% citronsyre (2,5 ml), og løsningsmidlet ble fjernet under vakuum. Residuet ble ekstrahert med etylacetat (3 x 15 ml), og de blandede organiske faser ble vasket med mettet NaCI (10 ml), tørket og konsentrert, hvorved man fikk forbindelse 10 (3,2 g, 90%).<1>H-NMR (CDCl3400 MHz) viste δ 7,26 (m, 1 H), 6,94 (m, 2H), 6,86 (m, 1 H), 5,11 (s, 1 H), 5,01 (s, 1 H), 4.61 (s, 1 H), 4,44 (s, 2H), 1 ,82 (s, 3H).
MsCI (2,5 g, 15,7 mmol) og TEA (2,8 ml, 20 mmol) ble tilsatt til en oppløsning av forbindelse 10 (2,0 g, 11 ,2 mmol) i CH2CI2 (25 ml) ved 0°C, og reaksjons-blandingen ble satt i kjøleinnretning i 16 timer. En vanlig opparbeidelse ga en blekgul olje (2,5 g, 87%).<1>H-NMR (CDCl3 400 MHz) viste δ 7,31 (m, 1 H), 7,05 (m, 2H), 6,91 (m, 1 H), 5,16 (s, 1 H), 5,04 (s, 1 H), 4,59 (s, 1 H), 4,46 (s, 2H), 3,71 (s, 3H), 1,84 (s, 3H). Denne olje (2,4 g, 9,4. mmol) ble oppløst i THF (20 ml), og LiBr (2,0 g, 23,0 mmol) ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble oppvarmet til tilbakeløp i 1 time, og ble så avkjølt til romtemperatur. Til blandingen ble det tilsatt vann (2,5 ml), og løsningsmidlet ble fjernet under vakuum. Residuet ble ekstrahert med etylacetat (3 x 15 ml), og de blandede organiske faser ble vasket med mettet NaCI (10 ml), tørket over vannfritt Na2S04 og konsentrert, hvorved man fikk det ønskede bromid 11 (2,2 g, 92%) som en blekgul olje.<1>H-NMR (CDCb, 400 MHz) viste δ 7,29 (m, 1 H), 6,98 (m, 2H), 6,85 (m, 1H), 5,14 (s, 2H), 4,98 (s, 2H), 4,50 (s, 2H), 4,44 (s, 2H), 1,82 (d, 3H).
mPEG-OH 20 kDa (2,0 g, 0,1 mmol, Sunbio) ble behandlet med NaH (12 mg, 0,5 mmol) i THF (35 ml), og forbindelse 11 (0,55 g, 22,8 mmol) ble tilsatt til blandingen med en katalytisk mengde av Kl. Den resulterende blanding ble oppvarmet til tilbakeløp i 16 timer. Vann (1 ,0 ml) ble tilsatt til blandingen, og løsningsmidlet ble fjernet under vakuum. Til residuet ble det tilsatt CH2CI2 (25 ml), og den organiske fase ble fraskilt og tørket over vannfritt Na2S04, og volumet ble redusert til omtrent 2 ml. Dråpevis tilsetting til en eteroppløsning (150 ml) resulterte i en hvit utfelning, som ble oppsamlet, hvorved man fikk 12 (1,8 g) som et hvitt pulver.<1>H-NMR (CDCb, 400 MHz) viste δ 7,19 (m, 1H), 6,88 (m, 2H), 6,75 (m, 1 H), 4,44 (s, 2H), 4,10 (m, 2H), 1,82 (d, 3H).
Til en oppløsning av forbindelse 12 (1,0 g, 0,05 mmol) i THF (7,5 ml) og CH2CI2 (2,5 ml) avkjølt til 0°C ble det tilsatt BH3/THF (1 ,0 M, 3,5 ml), og reaksjonsblandingen ble omrørt i 1 time. En 2,0 M NaOH-oppløsning (3 ml) ble tilsatt langsomt, fulgt av 30% H2O2 (0,85 ml). Reaksjonsblandingen fikk oppvarmes til romtemperatur og ble omrørt i 16 timer. Ovennevnte opparbeidelsesfremgangsmåte ble fulgt (CH2CI2, utfelt fra eter), hvorved man fikk 13 (450 mg) som et hvitt faststoff.<1>H-NMR (CDCI3, 400 MHz) viste δ 7,15 (m, 1 H), 6,84 (m, 2H), 6.69 (m, 1H), 4,50 (s, 2H), 2,90 (m, 2H), 1,95 (d, 3H).
Forbindelse 13 (200 mg, 0,01 mmol) ble oppløst i CH2Cl2(1,5 ml), og DMP (20 mg) ble tilsatt, mens reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 1 time.<1>H-NMR (CDCIs, 400 MHz) viste δ 9,74 (s, 1H), 7,17 (m, 1H), 6,86 (m, 2H), 6,74 (m, 1 H), 4,48 (s, 2H), 4,15 (m, 2H), 2,78 (m, 1H), 1,22 (d, 3H). Til blandingen ble det tilsatt mettet NaHCOs (0,5 ml) og Na2S203 (0,5 ml), og omrøringen ble fortsatt ved romtemperatur i 1 time. Ovennevnte opparbeidelsesfremgangsmåte ble fulgt (CH2Cl2-oppløsning, utfelt fra eter), hvorved man fikk 9 (142 mg) som et hvitt faststoff.
B) Dannelse via omsetting med aromatiske alkoholer
Aktiverte polyalkylenglykoler syntetiseres ved en Mitsunobu-reaksjon mellom en polyalkylenglykol og en fri terminal hydroksylfunksjonalitet og en aromatisk alkohol. Reaksjonsskjemaet er skissert i reaksjonsskjema VI.
Reaksjonsskjema VI:
Polyalkylenglykolen (P-OH) omsettes med en alkohol (K) under dannelse av eteren (L). I disse forbindelser er m null eller én, d er null eller et helt tall fra én til fire, og n er null eller et helt tall fra én til fem. Y er O, S, CO, CO2, COS, SO, SO2, CONR', SO2NR' og NR'. Ti og T2 er uavhengig fraværende eller en rettkjedet eller forgrenet, mettet eller umettet C1- til C20 alkyl- eller -heteroalkylgruppe.
R' og Z er uavhengig hydrogen, en rettkjedet eller forgrenet, mettet eller umettet Ci- til C2o-alkyl- eller -heteroalkylgruppe.
Hver L (hvis til stede) er uavhengig en rettkjedet eller forgrenet, mettet eller umettet Ci- til C2o-alkyl- eller -heteroalkylgruppe, mettet eller umettet cyklisk C3- til
C7- alkyl eller -heteroalkyl, en substituert eller usubstituert aryl- eller heteroarylgruppe eller et substituert eller usubstituert alkaryl. Alkylet er en mettet eller umettet Ci- til C2o-alkyl- eller -heteroalkarylgruppe, og substituentene kan være halogen, hydroksyl, karbonyl, karboksylat, ester, formyl, acyl, tiokarbonyl, tioester, tioacetat, tioformiat, alkoksyl, fosforyl, fosfonat, fosfinat, amino, amido, amidin, imin, cyano, nitro, azido, sulfhydryl, sulfat, sulfonat, sulfamoyl, sulfonamido, sulfonyl, heterocyklyl, aralkyl, aromatisk del, heteroaromatisk del, imino, silyl, eter eller alkyltio.
P er en polyalkylenglykol-polymer. Vanligvis er P-OH polyetylenglykol (PEG) eller monometoksypolyetylenglykol (mPEG) med en molekylvekt på 5000 til 40000 Da.
En syntese av mPEG-0 p-fenylacetaldehyd (16) er for eksempel skissert i reaksjonsskjema VII.
Reaksjonsskjema VII:
4-hydroksyfenylacetaldehyd (15) ble syntetisert som beskrevet i Heterocycles, 2000, 53, 777-784. 4-Hydroksyfenetylalkohol (forbindelse 14, 1,0 g, 7,3 mmol, Aldrich) ble oppløst i dimetylsulfoksid (8 ml, Aldrich). Under omrøring ble TEA (2,2 ml, 16 mmol, Aldrich) tilsatt langsomt. Pyridin-svoveltrioksid-(S03<e>py)-kompleks (2,5 g, 16 mmol, Aldrich) ble fullstendig oppløst i dimetylsulfoksid (9 ml, Aldrich), og denne oppløsning ble tilsatt dråpevis til alkoholen, med kraftig omrøring. Etter omrøring i 1 time ved romtemperatur, ble reaksjonsblandingen fortynnet med CH2CI2 og deretter vasket med iskaldt vann. Den organiske fase ble tørket over Na2S04, filtrert og konsentrert til tørrhet.
Rensing med anvendelse av silikagel-kromatografi med heksan-etylacetat som elueringsmiddel (5:1, deretter 2:1) ga 488 mg (49%) 4-hydroksyfenyl-acetaldehyd (15).
mPEG-OH 20 kDa (101 mg, 0,005 mmol) og 4-hydroksyfenylacetaldehyd (15) (39 mg, 0,29 mmol) ble azeotrop-destillert ("azeotroped") fire ganger med toluen og deretter tatt opp i vannfritt CH2CI2 (2 ml, Aldrich). Til denne oppløsning ble det tilsatt trifenylfosfin (PPh3; 66 mg, 0,25 mmol, Aldrich) og deretter diisopropylazo-dikarboksylat (DIAD; 49 μΙ, 0,25 mmol, Aldrich) under omrøring. Etter omrøring i 3 dager ved romtemperatur, ble reaksjonsblandingen tilsatt dråpevis til kraftig omrørt dietyleter. Den resulterende utfelning ble isolert ved filtrering og vasket tre ganger med dietyleter. Det ubearbeidede materiale ble tatt opp i CH2CI2 og vasket med vann. Den organiske fase ble tørket over Na2S04, filtrert og konsentrert til tørrhet. Materialet ble tatt opp i minimum CH2CI2 og deretter utfelt ved dråpevis tilsetting til omrørt dietyleter. Dette materiale ble oppsamlet ved filtrering, vasket tre ganger med dietyleter og tørket, hvorved man fikk 63 mg (62%) mPEG-0 p-fenylacetaldehyd (16).
En syntese av mPEG-O-p-fenylpropionaldehyd (17) ble foretatt på liknende måte.
4-hydroksyfenylpropionaldehyd ble fremstilt ved en syntese analogt til syntesen for 4-hydroksyfenylacetaldehyd ( Heterocycles , 2000, 53, 777-784). 3-(4-Hydroksy-fenyl)-1 -propanol (1,0 g, 6,6 mmol, Aldrich) ble oppløst i dimetylsulfoksid (8 ml, Aldrich). TEA (2,0 ml, 14 mmol, Aldrich) ble langsomt tilsatt under omrøring. Pyridin-svoveltrioksid-(S03<●>py)-kompleks (2,3 g, 15 mmol, Aldrich) ble fullstendig oppløst i dimetylsulfoksid (9 ml, Aldrich), og denne oppløsning ble tilsatt dråpevis til alkoholen, med kraftig omrøring. Etter omrøring i 1 time ved romtemperatur, ble reaksjonsblandingen fortynnet med CH2CI2 og deretter vasket med iskaldt vann. Den organiske fase ble tørket over Na2S04, filtrert og konsentrert til tørrhet.
Rensing med anvendelse av silikagel-kromatografi med heksan-etylacetat som elueringsmiddel (5:1, deretter 2:1) ga 745 mg (75%) 4-hydroksyfenylpropionaldehyd.
mPEG-OH 20 kDa (100 mg, 0,005 mmol) og 4-hydroksyfenylpropionaldehyd (40 mg, 0,27 mmol) ble azeotropdestillert fire ganger med toluen og deretter tatt opp i vannfritt CH2CI2 (2 ml, Aldrich). Til denne oppløsning ble det tilsatt trifenylfosfin (66 mg, 0,25 mmol, Aldrich) og deretter diisopropylazodikarboksylat (49 pl, 0,25 mmol, Aldrich) under omrøring. Etter 3 dagers omrøring ved romtemperatur, ble reaksjonsblandingen tilsatt dråpevis til kraftig omrørt dietyleter. Den resulterende utfelning ble isolert ved filtrering og vasket tre ganger med dietyleter. Det ubearbeidede materiale ble tatt opp i CH2CI2 og vasket med vann. Den organiske fase ble tørket over Na2S04, filtrert og konsentrert til tørrhet. Materialet ble tatt opp i minimum CH2CI2 og deretter utfelt ved dråpevis tilsetting til omrørt dietyleter. Dette materiale ble oppsamlet ved filtrering, vasket tre ganger med dietyleter og tørket, hvorved man fikk 60 mg (60%) mPEG-O-p-fenylpropionaldehyd (17).
mPEG-O-m-fenylacetaldehyd (18) ble også fremstilt på denne måte.
3-hydroksyfenylacetaldehyd ble fremstilt ved en syntese analog til syntesen av 4-hydroksyfenylacetaldehyd ( Heterocycles , 2000, 53, 777-784). 3-Hydroksyfenetyl-alkohol (1,0 g, 7,5 mmol, Aldrich) ble oppløst i dimetylsulfoksid (8 ml, Aldrich). TEA (2,0 ml, 14 mmol, Aldrich) ble tilsatt langsomt under omrøring. Pyridin-svoveltrioksid-(S03<●>py)-kompleks (2,4 g, 15 mmol, Aldrich) ble fullstendig oppløst i dimetylsulfoksid (8 ml, Aldrich), og denne oppløsning ble tilsatt dråpevis til alkoholen, med kraftig omrøring. Etter omrøring i 1 time ved romtemperatur, ble reaksjonen brått avsluttet med iskaldt vann og deretter ekstrahert med CH2CI2. Den organiske fase ble tørket over Na2S04, filtrert og konsentrert til tørrhet.
Rensing under anvendelse av silikagel-kromatografi med heksan-etylacetat som elueringsmiddel (3:1, deretter 1:1) ga 225 mg (22%) 3-hydroksyfenylacetaldehyd.
mPEG-OH 20 kDa (307 mg, 0,015 mmol) og 3-hydroksyfenylacetaldehyd (117 mg, 0,86 mmol) ble azeotropdestillert fire ganger med toluen og deretter tatt opp i vannfritt CH2CI2 (5 ml, Aldrich). Til denne oppløsning ble det tilsatt trifenylfosfin (200 mg, 0,76 mmol, Aldrich) og deretter diisopropylazodikarboksylat (147 pl, 0,75 mmol, Aldrich) under omrøring. Etter omrøring i 3 dager ved romtemperatur, ble reaksjons-blandingen tilsatt dråpevis til kraftig omrørt dietyleter. Den resulterende utfelning ble isolert ved filtrering og vasket tre ganger med dietyleter og tørket, hvorved man fikk 284 mg (93%) mPEG-O-mfenylacetaldehyd (18).
Kirale PEG-cinnamat-N-hydroksysuksinimat-(NHS)-forbindelser frembringes for eksempel som vist i reaksjonsskjemaer VIII og IX:
Reaksjonsskjema VIII
dihydroksydihydrocinnamat
Reaksjonsskjema IX
α-Metyl-β-hydroksycinnamat
PEG-Dihydrourocanat-NHS-forbindelser frembringes også via en Mitsunobu-reaksjon, som vist i reaksjonsskjema X:
Reaksjonsskjema X
PEG-Dihydrocinnamat-NHS-forbindelser frembringes også ut fra en aromatisk alkohol som vist i reaksjonsskjema XI:
Reaksjonsskjema XI
PEG-benzofuraner og PEG-indoler frembringes som vist i reaksjonsskjemaer XII og XIII:
Reaksjonsskjema XII
C) Frembringelse via omsetting av PEG-aminer
PEG-aminer omsettes med alkylhalogenider under frembringelse av PEG-amider. Et eksempel på frembringelse av et PEG-amid-bicyklooktan-NHS-konjugat er vist i reaksjonsskjema XIV:
Reaksjonsskjema XIV
Et primært PEG-amin konjugeres med et arylhalogenid under dannelse av et sekundært PEG-amin-konjugat, som så omsettes under Heck-betingelser (en stereospesifikk palladiumkatalysert kopling av et alken med et organisk halogenid eller triflat som mangler sp<3>-hybridiserte β-hydrogenatomer) med et NHS-alken under dannelse av det ønskede PEG-konjugat. Syntesen av et pyrimidinholdig konjugat er vist i reaksjonsskjema XV:
Reaksjonsskjema XV
PEG-sulfonamid-konjugater syntetiseres også på denne måte, som vist i reaksjonsskjema XVI:
Reaksjonsskjema XVI
dihydrocinnamat-3-sulfonamid
og
dihydrocinnamat-4-sulfonamid
D) Forbindelser frembrakt via reaksjon med heterocykliske forbindelser PEG-forbindelser omsettes med ring- eller ikkering-nitrogenatomer i heterocykliske forbindelser under dannelse av reaktive PEG-forbindelser.
Representative reaksjoner er vist i reaksjonsskjema XVII for aminopyrrolidin og XVIII for forskjellige piperaziner:
Reaksjonsskjema XVII
EKSEMPEL 2: Fremstilling av peptidkonjugater
Peptidkonjugatene i henhold til foreliggende oppfinnelse kan fremstilles ved omsetting av et protein med et aktivert PGC-molekyl. For eksempel kan interferon (IFN) omsettes med et PEG-aldehyd i nærvær av et reduksjonsmiddel (f.eks. natriumcyanoborohydrid) via reduktiv alkylering under dannelse av PEG-proteinkonjugatet, tilknyttet via en aminbinding. Se f.eks. europeisk patent 0154316 B1.
Flumant IFN-β-1a ble PEGylert med følgende aktiverte polyalkylenglykoler ifølge oppfinnelsen: 20 kDa mPEG-O-2-metylpropionaldehyd, 20 kDa mPEG-O-pmetylfenyl-O-2-metylpropionaldehyd, 20 kDa mPEG-O-m-metylfenyl-O-2-metylpropionaldehyd, 20 kDa mPEG-O-p-fenylacetaldehyd, 20 kDa mPEG-O-p fenylpropionaldehyd og 20 kDa mPEG-O-m-fenylacetaldehyd. De PEGylerte proteiner ble renset til homogenitet fra sine respektive reaksjonsblandinger og underkastet en serie karakteriseringstester for å finne ut identiteten, renheten og potensen av de modifiserte proteiner.
En detaljert beskrivelse av fremstillingen og karakteriseringen av humant IFN-β-1a modifisert med 20 kDa mPEG-O-2-metylpropionaldehyd, 20 kDa mPEG-O-m-metylfenyl-O-2-metylpropionaldehyd og 20 kDa mPEG-O-p-fenylacetaldehyd følger.
A) Fremstilling og karakterisering av 20 kDa mPEG-O-2-metylpropionaldehvdmodifisert IFN-β-1a
Flumant IFN-β-1a ble PEGylert i sin N-terminale ende med 20 kDa mPEG-0-2metylpropionaldehyd. Produktet fra den reduktive alkyleringskjemi anvendt til innlemming av PEG på IFN-β-1a-skjelettet resulterte i dannelse av en aminbinding som er meget stabil overfor nedbrytning. Det PEGylerte IFN-β-1a ble underkastet utstrakt karakterisering, innbefattende analyse ved SDS-PAGE, størrelseseksklusjonskromatografi (SEC), peptidkartlegging og vurdering av aktivitet ved en antivirus-analyse in vitro. Produktets renhet, målt ved SDS-PAGE og SEC, var større enn 90%. I den PEGylerte prøve var det intet tegn på aggregater.
Restnivåer av umodifisert IFN-β-Ι a i produktet var under grensen for kvantifikasjon, men ser ut til å representere ca. 1% av produktet. Den spesifikke aktivitet av det PEGylerte IFN-β-1a i antivirusaktivitetsanalysen var redusert ca. 2 ganger sammenliknet med det umodifiserte IFN-β-1a (ECso = 32 pg/ml for 20 kDa mPEG-O-2-metylpropionaldehyd-modifisert IFN-β-1a sammenstilt med ECso = 14 pg/ml for umodifisert IFN-β-1a). Den PEGylerte IFN-β-1a-masse ble utformet i en konsentrasjon på 30 pg/ml i fosfatbufret saltoppløsning (PBS) pH 7,3, inneholdende 14 mg/ml humant serumalbumin (FISA), i likhet med utformingen anvendt for AVON EX® (Biogen, Cambridge, MA), som er blitt underkastet utstrakt karakterisering. Materialet ble levert som en frossen væske som ble oppbevart ved -70 °C.
Egenskapene hos 20 kDa mPEG-O-2-metylpropionaldehyd-modifisert IFN-β-1 a er oppsummert i Tabell 1 :
Tabell 1. Egenskaper hos 20 kDa mPEG-O-2-metylpropionaldehyd-modifisert
1. Fremstilling av 20 kDa mPEG-O-2-metvlpropionaldehvd-modifisert IFN-βl a.
10 ml ikke-utformet AVONEXO® (IFN-β-1a-masse-mellomprodukt, en klinisk sats av medikamentmasse som besto alle tester for anvendelse for mennesker, i en konsentrasjon på 250 μg/ml i 100 mM natriumfosfat pH 7,2, 200 mM NaCI) ble fortynnet med 12 ml 165 mM MES pH 5,0 og 50 μΙ 5 N HCI. Prøven ble påsatt på en 300 μΙ SP-Sepharose FF-kolonne (Pharmacia). Kolonnen ble vasket med 3 x 300 μΙ 5 mM natriumfosfat pH 5,5, 75 mM NaCI, og proteinet ble eluert med 5 mM natriumfosfat pH 5,5, 600 mM NaCI. Elueringsfraksjonene ble analysert med henblikk på absorbans ved 280 nm, og konsentrasjonen av IFN-β-1a i prøven ble beregnet under anvendelse av en ekstinksjonskoeffisient på 1,51 for en oppløsning på 1 mg/ml. Toppfraksjonene ble blandet, hvorved man fikk en IFN-β-1 a-konsentrasjon på 3,66 mg/ml, som deretter ble fortynnet til 1 ,2 mg/ml med vann.
Til 0,8 ml ΙFΝ-β-la fra den fortynnede SP-Sepharose eluatblanding ble 0,5 M natriumfosfat pH 6,0 tilsatt til 50 mM, natriumcyanoborhydrid (Aldrich) ble tilsatt til 5 mM, og 20 kDa mPEG-O-2-metylpropionaldehyd ble tilsatt til 5 mg/ml. Prøven ble inkubert ved romtemperatur i 16 timer i mørke. Det PEGylerte ΙFΝ-β-la ble renset fra reaksjonsblandingen på en 0,5 ml SP-Sepharose FF-kolonne som følger: 0,6 ml av reaksjonsblandingen ble fortynnet med 2,4 ml 20 mM MES pH 5,0 og påsatt på SP-Sepharose-kolonnen. Kolonnen ble vasket med natriumfosfat pH 5,5, 75 mM NaCI, og deretter ble det PEGylerte ΙFΝ-β-la eluert fra kolonnen med 25 mM MES pH 6,4, 400 mM NaCI. Det PEGylerte IFΝ-β-la ble renset videre på en Superose 6 FIR 10/30 FPLC-størrelsessorteringskolonne med 5 mM natriumfosfat pH 5,5, 150 mM NaCI som den mobile fase.
Størrelsessorteringskolonnen (25 ml) ble kjørt med en hastighet på 20 ml/time, og 0,5 ml-fraksjoner ble oppsamlet. Elueringsfraksjonene ble analysert med henblikk på proteininnhold ved absorbans ved 280 nm, og blandet, og proteinkonsentrasjonen i blandingen ble bestemt. Konsentrasjonen av det PEGylerte IFN-β-la er rapportert i IFN-ekvivalenter, siden PEG-delen ikke bidrar til absorbans ved 280 nm. Prøver av blandingen ble fjernet for analyse, og resten ble fortynnet til 30 μg/ml med HSA-holdig utformningsbuffer, porsjonert med 0,25 ml pr. glass og oppbevart ved -70°C.
2. UV-spektrum for renset 20 kDa mPEG-O-2-metylpropionaldehvdmodifisert
IFN-β-1a. UV-spektret (240-340 nm) for 20 kDa mPEG-O-2-metylpropionaldehydmodifisert IFN-β-1a ble opptatt under anvendelse av den pre-HSA-utformede masseprøve. Den PEGylerte prøve viste et absorbansmaksimum ved 278-279 nm og et absorbansminimum ved 249-250 nm, i overensstemmelse med det som ble observert for det umodifiserte IFN-β-1a-masse-mellomprodukt. Proteinkonsentrasjonen i det PEGylerte produkt ble beregnet ut fra spektret under anvendelse av en ekstinksjonskoeffisient på ε280°'<1%>= 1,51.
Proteinkonsentrasjonen i den PEGylerte masse var 0,23 mg/ml. Det var ingen turbiditet i prøven påvist ved mangel på absorbans ved 320 nm.
3. Karakterisering av 20 kDa mPEG-O-2-metylpropionaldehvd-modifisert IFN-β-1a ved SDS-PAGE. 4 μg umodifisert og 20 kDa mPEG-O-2-metylpropionaldehyd-modifisert IFN-β-1a ble underkastet SDS-PAGE under reduserende betingelser på en 10-20% gradient-gel. Gelen ble farget med Coomassie-brilliantblått R-250 og er vist på figur 1 (Bane A: molekylvektmarkører (fra topp til bunn; henholdsvis 100 kDa, 68 kDa, 45 kDa, 27 kDa og 18 kDa); Bane B: umodifisert IFN-β-1a; Bane C: 20 kDa mPEG-O-2-metylpropionaldehydmodifisert IFN-β-1a). SDS-PAGE-analyse av 20 kDa mPEG-O-2-metylpropionaldehyd-modifisert IFN-β-1a viste et enkelt hovedbånd med en tilsynelatende masse på 55 kDa, i overensstemmelse med modifikasjon ved en enkelt PEG. Det ble ikke påvist noen høyere masseformer som resultat av tilstedeværelse av ytterligere PEG-grupper. I det rensede, PEGylerte produkt ble det påvist umodifisert IFN-β-1a; imidlertid er mengden under kvantifiseringsnivået. Nivået av umodifisert IFN-β-1a i preparatet er beregnet å utgjøre bare ca. 1% av det totale protein.
4. Karakterisering av 20 kDa mPEG-O-2-metylpropionaldehvd-modifisert IFN-β-1a ved størrelseseksklusionskromatografi. Umodifisert og 20 kDa mPEG-O-2metylpropionaldehyd-modifisert IFN-β-1a ble underkastet SEC på en analytisk Superose 6 FIR10/30 FPLC-størrelsessorteringskolonne under anvendelse av PBS pH 7,2 som den mobile fase. Kolonnen ble kjørt med en hastighet på 20 ml/time og elueringsmidlet overvåket med hensyn til absorbans ved 280 nm, som vist på figur 2: Felt A: molekylvektstandarder (670 kDa: tyreoglobulin; 158 kDa: gammaglobulin; 44 kDa: ovalbumin; 17 kDa: myoglobin; 1,3 kDa: vitamin B12), Felt B: 20 kDa mPEG-O-2-metylpropionaldehyd-modifisert IFN-β-1a; Felt C: umodifisert IFN-β-1a. Det 20 kDa mPEG-O-2-metylpropionaldehyd-modifiserte IFN-β-1a ble eluert som en enkelt skarp topp med en tilsynelatende molekylmasse på ca. 200 kDa, i overensstemmelse med det store hydrodynamiske volum av PEG. Det ble ikke observert noe tegn til aggregater. Umodifisert IFN-β-1a i preparatet ble påvist, men var under kvantifiseringsgrensen. Basert på størrelsen av toppen, utgjør det umodifiserte IFN-β-1a 1% eller mindre av produktet, i overensstemmelse med observering ved anvendelse av SDS-PAGE.
5. Analyse av 20 kDa mPEG-O-2-metylpropionaldehyd-modifisert IFN-β-1a ved peptidkartlegging. Soesifisiteten av PEGyleringsreaksjonen ble evaluert ved peptidkartlegging. Umodifisert og 20 kDa mPEG-O-2-metylpropionaldehydmodifisert IFN-β-1a ble nedbrutt med endoproteinase Lys-C fra Achromobacter (Wako Bioproducts), og de resulterende spaltningsprodukter ble fraksjonert ved revers fase-FIPLC på en Vydac C4-kolonne under anvendelse av en 30 min gradient fra 0 til 70% acetonitril i 0,1% TFA. Kolonne-elueringsmidlet ble overvåket med hensyn til absorbans ved 214 nm.
Alle de forutsette peptiderfra endoproteinase Lys-C-nedbrytningsproduktet av IFN-β-1a er identifisert tidligere ved N-terminal sekvensering og massespektrometri (Pepinsky et al., (2001) J. Pharmacology and Experimental Therapeutics 297:1059), og blant disse ble bare peptidet som inneholder den N-terminale ende av IFN-β-Ι a, forandret ved modifikasjon med 20 kDa mPEG-O-2-metylpropionaldehyd; påvist ved at det er forsvunnet fra peptidkartet.
Kartleggingsdataene viser derfor at PEG-delen er spesifikt knyttet til dette peptid. Dataene viser videre at PEG-modifikasjonen er rettet inn mot den N-terminale ende av proteinet, siden bare den N-terminale modifikasjon vil resultere i det spesifikke tap av dette peptid.
B) Fremstilling og karakterisering av 20 kDa mPEG-O-m-metylfenyl-O-2-metylpropionaldehyd-modifisert IFN-β-1 a
Humant IFN-β-1a ble PEGylert i den N-terminale ende med 20 kDa mPEG-O-m-metylfenyl-O-2-metylpropionaldehyd. Produktet fra den reduktive alkyleringskjemi som ble anvendt til innlemming av PEG på IFN-β-Ι a-skjelettet, resulterte i dannelse av en aminbinding som er meget stabil overfor nedbrytning. Det PEGylerte IFN-β-1a ble underkastet utstrakt karakterisering, innbefattende analyse ved SDS-PAGE, (SEC), peptidkartlegging og fastsettelse av aktivitet ved en antivirus-analyse in vitro. Renheten av produktet, målt ved SDS-PAGE og SEC, var større enn 95%. I den PEGylerte IFN-β-1a-prøve var det intet tegn til aggregater. Restnivåer av umodifisert IFN-β-1a i produktet var under grensen for kvantifikasjon, men ser ut til å representere ca. 1% av produktet. Den spesifikke aktivitet av det PEGylerte IFN-β-1a i antivirusaktivitetsanalysen var redusert ca. 2 ganger sammenliknet med det umodifiserte IFN-β-1a (ECso = 31 pg/ml for 20 kDa mPEG-O-m-metylfenyl-O-2-metylpropionaldehyd-modifisert IFN-β-1a sammenstilt med ECso = 14 pg/ml for umodifisert IFN-β-1a). Den PEGylerte IFN-β-1a-masse ble utformet i en konsentrasjon på 30 pg/ml i PBS pH 7,2, inneholdende 15 mg/ml HSA, i likhet med utformingen anvendt for AVONEX®, som er blitt underkastet utstrakt karakterisering. Materialet ble levert som en frossen væske, som ble oppbevart ved -70°C.
Egenskapene hos 20 kDa mPEG-O-m-metylfenyl-O-2-metylpropionaldehyd-modifisert IFN-β-1a er oppsummert i tabell 2:
Tabell 2. Egenskaper hos 20 kDa mPEG-O-m-metylfenyl-O-2-metylpropionaldehyd-modifisert IFN-β-Ι a
1 . Fremstilling av 20 kDa mPEG-O-m-metylfenyl-O-2-metylpropionaldehvdmodifisert IFN-β-1a. 80 ml ikke-utformet AVONEX® (ΙFΝ-β-la mellomproduktmasse, en klinisk sats av medikamentmasse som besto alle tester for anvendelse for mennesker, i en konsentrasjon på 254 μF/ml i 100 mM natriumfosfat pH 7,2, 200 mM NaCI) ble fortynnet med 96 ml 165 mM MES pH 5,0 og 400 pl 5 N HCI. Prøven ble påsatt på en 1 ,2 ml SP-Sepharose FF-kolonne (Pharmacia). Kolonnen ble vasket med 6,5 ml 5 mM natriumfosfat pH 5,5, 75 mM NaCI, og proteinet ble eluert med 5 mM natriumfosfat pH 5,5, 600 mM NaCI. Elueringsfraksjonene ble analysert med hensyn til absorbans ved 280 nm, og konsentrasjonen av ΙFΝ-β-la i prøvene ble beregnet under anvendelse av en ekstinksjonskoeffisient på 1 ,51 for en 1 mg/ml oppløsning. Toppfraksjonene ble blandet, hvorved man fikk en IFN-β-1 a-konsentrasjon på 4,4 mg/ml. Til 2,36 ml av de 4,4 mg/ml ΙFF-β-la fra SP-Sepharose-eluat-blandingen ble 0,5 M natriumfosfat pH 6,0 tilsatt til 50 mM, natriumcyano-borhydrid (Aldrich) ble tilsatt til 5 mM og 20 kDa mPEG-O-mmetylfenyl-O-2-metylpropionaldehyd ble tilsatt til 10 mg/ml. Prøven ble inkubert ved romtemperatur i 21 timer i mørke. Det PEGylerte ΙFΝ-β-la ble renset fra reaksjonsblandingen på en 8,0 ml SP-Sepharose FF-kolonne som følger: 9,44 ml av reaksjonsblandingen ble fortynnet med 37,7 ml 20 mM MES pH 5,0 og påsatt på SP-Sepharose-kolonnen. Kolonnen ble vasket med natriumfosfat pH 5,5, 75 mM NaCI, og deretter ble det PEGylerte ΙFΝ-β-la eluert fra kolonnen med 25 mM MES pH 6,4, 400 mM NaCI. Det PEGylerte ΙFΝ-β-la ble renset videre på en Superose 6 FIR 10/30 FPLC-størrelsessorteringskolonne med 5 mM natriumfosfat pH 5,5, 150 mM NaCI som den mobile fase. Størrelsessorteringskolonnen (25 ml) ble kjørt med en hastighet på 24 ml/time, og 0,25 ml-fraksjoner ble oppsamlet. Elueringsfraksjonene ble analysert med henblikk på proteininnhold ved SDS PAGE og blandet, og proteinkonsentrasjonen i blandingen bestemt.
Konsentrasjonen av det PEGylerte IFN-β-1a er angitt i IFN-ekvivalenter etter justering for bidraget av PEG til absorbansen ved 280 nm under anvendelse av en ekstinksjonskoeffisient på 2 for en 1 mg/ml-oppløsning av det PEGylerte IFN-β-1a. Prøver av blandingen ble uttatt for analyse, og resten ble fortynnet til 30 μg/ml med FISA-holdig utform ingsbuffer, oppdelt i porsjoner med 0,25 ml pr. glass og lagret ved -70°C.
2. UV-spektrum for renset 20 kDa mPEG-O-m-metylfenyl-O-2-metylpropionaldehyd-modifisert IFN-β-1 a. UV-spektret (240-340 nm) for 20 kDa mPEG-O-m-metylfenyl-O-2-metylpropionaldehyd-modifisert IFN-β-1a ble oppnådd under anvendelse av den for-FISA-utformede masseprøve. Den PEGylerte prøve viste et absorbansmaksimum ved 278-279 nm og et absorbansminimum ved 249-250 nm, i overensstemmelse med det som ble observert for den umodifiserte IFN-β-la-mellomproduktmasse. Proteinkonsentrasjonen i det PEGylerte produkt ble beregnet ut fra spektret under anvendelse av en ekstinksjonskoeffisient på ε28o°'<1%>= 2,0. Proteinkonsentrasjonen for den PEGylerte masse var 0,42 mg/ml. Ingen turbiditet var til stede i prøven påvist ved mangel på absorbans ved 320 nm.
3. Karakterisering av 20 kDa mPEG-O-m-metylfenyl-O-2-metylpropionaldehydmodifisert IFN-B-1 a ved SDS-PAGE. 2,1 μg 20 kDa mPEG-O-m-metylfenyl-0-2metylpropionaldehyd-modifisert IFN-β-1a ble underkastet SDS-PAGE under reduserende betingelser på en 4-20% gradient-gel. Gelen ble farget med Coomassie-brilliantblått R-250. SDS-PAGE-analyse av 20 kDa mPEG-O-mmetylfenyl-O-2-metylpropionaldehydmodifed IFN-β-1a viste et enkelt hovedbånd med en tilsynelatende masse på 55 kDa, i overensstemmelse med modifikasjon ved en enkelt PEG. I det rensede PEGylerte produkt ble umodifisert IFN-β-1a påvist; imidlertid er mengden under kvantifiseringsgrensen. Det er beregnet at nivået av umodifisert IFN-β-1a i preparatet bare utgjør ca. 1% av det totale protein.
4. Karakterisering av 20 kDa mPEG-O-m-metylfenyl-O-2-metylpropionaldehydmodifisert IFN-B-1 a ved størrelseseksklusionskromatografi.
20 kDa mPEG-O-m-metylfenyl-O-2-metylpropionaldehyd-modifisert IFN-β-1a ble underkastet SEC μå en analytisk Superose 6 HR10/30 FPLC-størrelsessorteringskolonne under anvendelse av PBS μH 7,0 som den mobile fase. Kolonnen ble kjørt med en hastighet μå 24 ml/time, og elueringsmidlet ble overvåket med hensyn til absorbans ved 280 nm. Det PEGylerte IFN-β-1a ble eluert som en enkelt skarμ toμμ uten noe tegn til aggregater fig. 3).
5. Analyse av 20 kDa mPEG-O-m-metylfenyl-O-2-metylpropionaldehvdmodifisert IFN-β-1a ved peptidkartleqqinq. Sμesifisiteten av PEGyleringsreaksjonen ble evaluert ved peptidkartlegging. 13,3 μg umodifisert og 20 kDa mPEG-O-m-metylfenyl-O-2-metylμroμionaldehyd-modifisert IFN-β-1a ble nedbrutt med 20% (μå vektbasis) endoμroteinase Lys-C fra Achromobacter (Wako Bioμroducts) i PBS inneholdende 5 mM DTT, 1 mM EDTA, ved μH 7,6, ved romtemperatur i 30 timer (endelig volum = 100 μΙ). 4 μl 1 M DTT og 100 μΙ 8 M urea ble så tilsatt og prøvene inkubert i 1 time ved romtemperatur. Peptidene ble separert ved revers fase-FIPLC μå en Vydac Cis-kolonne (214TP51 ) under anvendelse av en 70 min gradient fra 0 til 63% acetonitril, i 0,1 % TFA, fulgt av en 10 min gradient fra 63-80% acetonitril, i 0,1% TFA. Kolonne-elueringsmidlet ble overvåket med hensyn til absorbans ved 214 nm.
Alle de forutsette μeμtider fra endoμroteinase-Lys-C-nedbrytningsμroduktet av IFN-β-1a er identifisert tidligere ved N-terminal sekvensering og massespektrometri (Peμinsky et al., (2001) J Pharmacology and Exμerimental Theraμeutics 297:1059), og blant disse ble bare peptidet som inneholder den N-terminale ende av IFN-β-Ι a, forandret ved modifikasjon med 20 kDa mPEG-O-mmetylfenyl-O-2-metylμroμion-aldehyd; påvist ved at det er forsvunnet fra kartet. Kartleggingsdataene viser derfor at PEG-delen er spesifikt knyttet til dette ppμtid. Dataene viser videre at PEG-modifikasjonen er rettet inn mot den N-terminale ende av proteinet, siden bare den N-terminale modifikasjon vil resultere i sμesifikt tap av dette peptid.
C) Fremstilling og karakterisering av 20 kDa mPEG-O-p-fenylacetaldehydmodifisert IFN-β-1a
Flumant IFN-β-1a ble PEGylert i sin N-terminale ende med 20 kDa mPEG-O-μ-fenylacetaldehyd. Produktet fra den reduktive alkyleringskjemi som ble anvendt til innlemming av PEG μå IFN-β-Ι a-skjelettet, resulterer i dannelse av en aminbinding som er meget stabil overfor nedbrytning. Det PEGylerte ΙΕΝ-β-la ble underkastet omfattende karakterisering, innbefattende analyse ved SDS-PAGE, SEC, peptidkartlegging og fastsettelse av aktivitet ved en antiviral-analyse in vitro. Renheten av μroduktet, målt ved SDS-PAGE og SEC, var større enn 95%. I den PEGylerte ΙΕΝ-β-la-μrøve var det intet tegn til aggregater. Restnivåer av umodifisert ΙΕΝ-β-la i μroduktet var under kvantifiseringsgrensen, men ser ut til å reμresentere ca. 1 % av μroduktet. Ved en stabilitetstest var det ikke synlig noen aggregering eller nedbrytning av 20 kDa mPEG-O-p-fenylacetaldehyd-modifisert ΙΕΝ-β-la i Tris-buffer μH 7,4, etter en inkubering ved 37°C i oμμ til 7 dager. Den spesifikke aktivitet av det PEGylerte ΙΕΝ-β-la i antivirusaktivitetsanalysen var redusert ca. 2 ganger sammenliknet med det umodifiserte ΙΕΝ-β-la (ECso = 31 μg/ml for 20 kDa mPEG-O-p-fenylacetaldehyd-modifisert ΙΕΝ-β-la sammenstilt med ECso = 14 μg/ml for umodifisert ΙΕΝ-β-la). Den PEGylerte ΙΕΝ-β-la-masse ble utformet i en konsentrasjon μå 30 μg/ml i PBS μH 7,3, inneholdende 14 mg/ml HSA, i likhet med utformingen anvendt for AVONEX®, som er blitt underkastet omfattende karakterisering. Materialet ble levert som en frossen væske, som ble oμμbevart ved
-70 °C.
Egenskaμene hos 20 kDa mPEG-O-μ-fenylacetaldehyd-modifisert ΙΕΝ-β-la er oμμsummert i tabell 3:
Tabell 3. Egenskaμer hos 20 kDa mPEG-O-μ-fenylacetaldehyd-modifisert IFN-β-1a
1. Fremstilling av 20 kDa mPEG-O-p-fenvIacetaldehvd-modifisert IFN-β-1a.
20 ml ikke-utformet AVONEX® (IFN-β-1a-mellomproduktmasse, en klinisk sats av medikamentmasse som besto alle tester for anvendelse for mennesker, i en konsentrasjon μå 250 μg/ml i 100 mM natriumfosfat μH 7,2, 200 mM NaCI) ble fortynnet med 24 ml 165 mM MES pH 5,0, 100 μl 5 N HCI og 24 ml vann. Prøven ble påsatt μå en 600 μΙ SP-Seμharose FF-kolonne (Pharmacia). Kolonnen ble vasket med 2 x 900 μΙ 5 mM natriumfosfat pH 5,5, 75 mM NaCI, og proteinet ble eluert med 5 mM natriumfosfat μH 5,5, 600 mM NaCI. Elueringsfraksjonene ble analysert med hensyn til absorbans ved 280 nm, og konsentrasjonen av IFN-β-1a i prøvene ble beregnet under anvendelse av en ekstinksjonskoeffisient μå 1 ,51 for en 1 mg/ml oppløsning. Toppfraksjonene ble blandet, hvorved man fikk en IFN-β-1 a-konsentrasjon på 2,3 mg/ml. Til 1,2 ml av IFN-β-1a fra SP-Sepharose-eluatblandingen ble 0,5 M natriumfosfat pH 6,0 tilsatt til 50 mM, natriumcyanoborhydrid (Aldrich) ble tilsatt til 5 mM og 20 kDa mPEG-O-μ-fenylacetaldehyd ble tilsatt til 10 mg/ml. Prøven ble inkubert ved romtemμeratur i 18 timer i mørke. Det PEGylerte IFN-β-1a ble renset fra reaksjonsblandingen μå en 0,75 ml SP-Sepharose FF-kolonne som følger: 1 ,5 ml av reaksjonsblandingen ble fortynnet med 7,5 ml 20 mM MES pH 5,0, 7,5 ml vann og 5 μΙ 5 N HCI og påsatt μå SP-Sepharosekolonnen. Kolonnen ble vasket med natriumfosfat μH 5,5, 75 mM NaCI, og deretter ble det PEGylerte IFN-β-1a eluert fra kolonnen med 20 mM MES pH 6,0, 600 mM NaCI. Det PEGylerte IFN-β-1a ble renset videre μå en Suμerose 6 FIR 10/30 FPLC-størrelsessorteringskolonne med 5 mM natriumfosfat μH 5,5, 150 mM NaCI som den mobile fase. Størrelses-sorteringskolonnen (25 ml) ble kjørt med en hastighet på 20 ml/time, og 0,5 ml-fraksjoner ble oppsamlet. Elueringsfraksjonene ble analysert med henblikk på proteininnhold ved absorbans ved 280 nm, blandet, og proteinkonsentrasjonen i blandingen bestemt. Konsentrasjonen av det PEGylerte IFN-β-1a er angitt i IFN-ekvivalenter etter justering for bidraget av PEG (20 kDa mPEG-O-p-fenylacetaldehyd har en ekstinksjonskoeffisient ved 280 nm μå 0,5 for en 1 mg/ml oμμløsning) til absorbansen ved 280 nm under anvendelse av en ekstinksjons-koeffisient μå 2 for en 1 mg/ml-oppløsning av det PEGylerte IFN-β-1a. Prøver av blandingen ble uttatt for analyse, og resten ble fortynnet til 30 μg/ml med HSA-holdig utform ingsbuffer, oppdelt i porsjoner med 0,25 ml pr. glass og lagret ved -70°C.
2. UV-spektrum for renset 20 kDa mPEG-O-p-fenvIacetaldehvd-modifisert IFN-β-1a. UV-spektret (240-340 nm) for 20 kDa mPEG-O-p-fenylacetaldehydmodifisert IFN-β-1a ble opppådd under anvendelse av den for-FISA-utformede masseprøve. Den PEGylerte prøve viste et absorbansmaksimum ved 278-279 nm og et absorbansminimum ved 249-250 nm, i overensstemmelse med det som ble observert for den umodifiserte IFN-β-1a-mellomμroduktmasse. Proteinkonsentrasjonen av det PEGylerte μrodukt ble beregnet ut fra spektret under anvendelse av en ekstinksjonskoeffisient μå Proteinkonsentrasjonen for den PEGylerte masse var 0,10 mg/ml. Ingen turbiditet var til stede i μrøven påvist ved mangel på absorbans ved 320 nm.
3. Karakterisering av 20 kDa mPEG-O-p-fenvIacetaldehvd-modifisert IFN-β-1a ved SDS-PAGE. 2,5 μg umodifisert og 20 kDa mPEG-O-p-fenylacetaldehydmodifisert IFN-β-1a ble underkastet SDS-PAGE under reduserende betingelser μå en 10-20% gradientgel. Gelen ble farget med Coomassie-brilliantblått R-250, og er vist μå fig. 4 (Bane A: 20 kDa mPEG-O-p-fenylacetaldehyd-modifisert IFN-β-1a; Bane B: umodifisert IFN-β-1a; Bane C: molekylvektmarkører (fra topp til bunn; henholdsvis 100 kDa, 68 kDa, 45 kDa, 27 kDa og 18 kDa)). SDS-PAGE-analyse av 20 kDa mPEG-O-p-fenylacetaldehyd-modifisert IFN-β-1a viste et enkelt hovedbånd med en tilsynelatende masse μå 55 kDa, i overensstemmelse med modifikasjon ved en enkelt PEG. Det ble ikke μåvist noen høyere masseformer som resultat av tilstedeværelse av ytterligere PEG-gruμμer. I det rensede PEGylerte produkt ble umodifisert IFN-β-1a μåvist; imidlertid er mengden under kvantifiseringsgrensen. Det er beregnet at nivået av umodifisert IFN-p-1a i preparatet bare utgjør ca. 1 % av det totale protein.
4. Karakterisering av 20 kDa mPEG-O-p-fenvIacetaldehvd-modifisert IFN-β-1a ved størrelseseksklusionskromatografi. 20 kDa mPEG-O-fenylacetaldehydmodifisert IFN-β-1a ble underkastet SEC på en analytisk Superose 6 HR10/30 FPLC-størrelsessorteringskolonne under anvendelse av PBS pH 7,2 som den mobile fase. Kolonnen ble kjørt med en hastighet μå 20 ml/time, og elueringsmidlet ble overvåket med hensyn til absorbans ved 280 nm, som vist μå fig. 5: Felt A: molekylvekt-standarder (670 kDa: thyroglobulin; 158 kDa: gammaglobulin; 44 kDa: ovalbumin; 17 kDa: myoglobin; 1,3 kDa: vitamin B12), Felt B: 20 kDa mPEG-O-p-fenylacetaldehyd-modifisert IFN-β-1a. Det PEGylerte IFN-β-1a ble eluert som en enkelt skarp topp med en tilsynelatende molekylmasse μå ca. 200 kDa i overensstemmelse med det store hydrodynamiske volum av PEG. Det ble ikke observert noe tegn til aggregater. Umodifisert IFN-β-1a i preparatet ble påvist, men var under kvantifiseringsgrensen. Basert på størrelsen av toppen utgjør det umodifiserte IFN-β-1a 1% eller mindre av μroduktet, i overensstemmelse med det som ble observert under anvendelse av SDS-PAGE.
5. Analyse av 20 kDa mPEG-O-p-fenylacetaldehyd-modifisert IFN-β-1a ved peptidkartleqqinq. Sμesifisiteten av PEGyleringsreaksjonen ble evaluert ved peptidkartlegging. Umodifisert og 20 kDa mPEG-O-p-fenylacetaldehyd-modifisert IFN-β-1a ble nedbrutt med Lys-C fra Achromobacter (Wako Bioμroducts), og de resulterende spaltningsμrodukter ble fraksjonert ved revers-fase-FIPLC på en Vydac C4-kolonne under anvendelse av en 30 min-gradient fra 0 til 70% acetonitril, i 0,1% TFA. Kolonne-elueringsmidlet ble overvåket med hensyn til absorbans ved 214 nm.
Alle de forutsette peptiderfra endoμroteinase Lys-C-nedbrytningsμroduktet av IFN-β-1a er identifisert tidligere ved N-terminal sekvensering og massespektrometri (Peμinsky et al., (2001) J Pharmacology and Exμerimental Theraμeutics 297:1059), og blant disse ble bare μeμtidet som inneholder den N-terminale ende av IFN-β-Ι a, forandret ved modifikasjon med 20 kDa mPEG-O-pfenylacetaldehyd; μåvist ved at det er forsvunnet fra kartet. Kartleggingsdataene viser derfor at PEG-delen er sμesifikt knyttet til dette peptid. Dataene viser videre at PEG-modifikasjonen er innrettet mot den N-terminale ende av proteinet, siden bare den N-terminale modifikasjon vil resultere i spesifikt tap av dette peptid.
6. Stabilitet av 20 kDa mPEG-O-p-fenvIacetaldehvd-modifisert IFN-β-1a. For å teste stabiliteten av 20 kDa mPEG-O-p-fenylacetaldehyd-modifisert IFN-β-Ι a ble prøvene fortynnet til 0,1 μg/ml med 100 mM T ris-HCI-buffer, pH 7,4, og ble deretter inkubert ved 37°C i opp til 7 dager. 20 μl prøve (2 μg) ble fjernet μå dagene 0, 2, 5 og 7 og analysert ved SDS-PAGE under reduserende betingelser, som vist på figur 6: Bane A: molekylvektmarkører (fra topp til bunn; henholdsvis 100 kDa, 68 kDa, 45 kDa, 27 kDa, 18 kDa og 15 kDa); banene B, C, D og E: mPEG-0 p-fenylacetaldehyd-modifisert IFN-β-Ι a fjernet på henholdsvis dagene 0, 2, 5 og 7. Det ble ikke observert noen tegn til aggregering eller nedbryting av PEGylert IFN-β-1a selv etter 7 dager ved 37 °C.
EKSEMPEL 3. Spesifikk aktivitet av PEGylert humant IFN-β-1a i en in vitroantivirusanalyse
Den spesifikke antivirale aktivitet av PEGylerte IFN-β-1a-prøver ble testet på humane lungekarsinomceller (A549-celler) som var blitt eksμonert for encefalomyokarditt-(EMC)-virus og under anvendelse av det metabolske fargestoff 2,3-bis[2-metoksy-4-nitro-5-sulfo-fenyl]-2FI-tetrazolium-5-karboksyanilid (MTT; M-5655, Sigma, St. Louis, MO) som et mål for metabolsk aktive celler som var igjen etter eksμonering for viruset. Kort angitt ble A549-celler for-behandlet i 24 timer med enten umodifisert eller PEGylert IFN-β-1a (idet man startet med 66,7 μg/ml og seriefortynnet 1 ,5 ganger til 0,8 μg/ml) før de ble utsatt for virus. Cellene ble deretter utsatt for EMC-virus i 2 dager i en fortynning som resulterte i fullstendig celledraμ i fravær av IFN. Platene ble deretter fremkalt med MTT. En forrådsoppløsning av MTT ble tillaget med en konsentrasjon på 5 mg/ml i PBS og sterilfiltrert, og 50 μl av denne oμμløsning ble fortynnet i cellekulturer (100 μl μr. brønn). Etter inkubering ved romtemperatur i 30-60 min, ble MTT/mediumoppløsningen kastet, cellene ble vasket med 100 μΙ PBS, og til slutt ble det metaboliserte fargestoff solubilisert med 100 μΙ 1,2 N HCI i isoμroμanol.
Levedyktige celler (bestemt ved tilstedeværelse av fargestoffet) ble kvantifisert ved absorbans ved 450 nm. Dataene ble analysert ved avsetting av absorbans mot konsentrasjonen av IFN-β-Ι a, og aktiviteten av ΙFF-β-la ble definert som konsentrasjonen ved hvilken 50% av cellene ble drept, dvs. 50% cytoμatisk effekt (EC50) eller 50% maksimal OD450. Analysen ble utført åtte ganger med henblikk μå umodifisert IFN-β-Ι a, og tre til fire ganger med de forskjellige PEGylerte ΙFΝ-β-laprøver. For hver analyse ble det oppnådd duplikat-dataμunkter for hver proteinkonsentrasjon. Representative avsettinger av celle-levedyktighet sammenstilt med konsentrasjonen av umodifisert eller PEGylert ΙFΝ-β-la er vist μå fig. 7A og 7B. På figur 7A er symbolene som følger: umodifisert ΙFΝ-β-la (O), 20 kDa mPEG-O2metylpropionaldehyd-modifisert IFN-β-1a (□), 20 kDa mPEG-O-p-metylfenyl-O-2metylpropionaldehyd-modifisert IFN-β-1a (Δ) og 20 kDa mPEG-O-m-metylfenyl-
O-2-metylpropionaldehyd-modifisert IFN-β-1a (0). På figur 7 B er symbolene som følger: umodifisert IFN-β-1a (O), 20 kDa mPFG-O-p-fenylacetaldehyd-modifisert IFN-β-1a (□), 20 kDa mPEG-O-p-fenylpropionaldehyd-modifisert IFN-β-1a (Δ) og
20 kDa mPEG-O-m-fenylacetaldehyd-modifisert IFN-β-1a (0).
EC50-verdiene (konsentrasjonen ved halvmaksimal virusbeskyttelse) for IFN-β-1a modifisert med 20 kDa mPEG-O-2-metylpropionaldehyd, 20 kDa mPEG-O-p-metylfenyl-O-2-metylpropionaldehyd, 20 kDa mPEG-O-m-metylfenyl-O-2-metylpropionaldehyd, 20 kDa mPEG-O-p-fenylacetaldehyd, 20 kDa mPEG-O-pfenylpropionaldehyd og 20 kDa mPEG-O-m-fenylacetaldehyd er vist i tabell 4. Alle de PEGylerte IFN-β-1a ble modifisert og renset til homogenitet hovedsakelig som beskrevet for 20 kDa mPEG-O-2-metylpropionaldehyd-modifisert 1 FN-β-1a, 20 kDa mPEG-O-m-metylfenyl-O-2-metylpropionaldehyd-modifisert IFN-β-1a og 20 kDa mPEG-O-p-fenylacetaldehyd-modifisert IFN-β-1a som beskrevet ovenfor.
Tabell 4. Spesifikk antiviral aktivitet av umodifiserte og PEGylerte IFN-β-1a
EKSEMPEL 4. Farmakokinetikk for intravenøst administrerte umodifiserte og PEGylerte IFN-β-1a hos rotter
Kanylerte Lewis-hunnrotter ble injisert intravenøst med enten 80 μg/kg umodifisert IFN-β-1a eller 24 pg/kg av de følgende PEGylerte IFN-β-1a; 20 kDa
mPEG-O-2-metylpropionaldehyd-modifisert IFN-β-1 a, 20 kDa mPEG-O-pmetylfenyl-O-2-metylpropionaldehyd-modifisert IFN-β-Ι a, 20 kDa mPEG-O-pfenylacetaldehyd-modifisert IFN-β-Ι a, 20 kDa mPEG-O-p-fenylpropionaldehydmodifisert IFN-β-1 a, 20 kDa mPEG-O-m-fenylacetaldehyd-modifisert IFN-β-1a og 20 kDa mPEG-O-m-metylfenyl-O-2-metylpropionaldehyd-modifisert IFN-β-1a. Både de umodifiserte og PEGylerte proteiner ble utformet i nærvær av 14-15 mg/ml FISA som bærer. Når det gjaldt det umodifiserte protein, ble blod (0,2 ml) tatt via kanylen på forskjellige tidspunkter; umiddelbart før administrering og 0,083, 0,25, 0,5, 1 ,25, 3 og 5 timer etter administrering. Når det gjaldt de PEGylerte proteiner, ble blod (0,2 ml) tatt via kanylen umiddelbart før administrering og 0,083, 0,25, 0,5, 1,25, 3, 24, 48 og 72 timer etter administrering. Fullblod ble oppsamlet i serumseparator-rør (Beckton Dickinson nr. 365956) og inkubert ved romtemperatur i 60 min for å gi mulighet for koagulering. Det koagulerte blod ble sentrifugert i 10 min ved 4°C, og serumet ble fjernet og lagret ved -70°C til analysetidspunktet.
Serumprøvene ble deretter ting og testet i antivirusanalyser. Serumprøvene ble fortynnet 1:50 i serumholdig medium (Dulbecco's Modifisert Eagles Medium inneholdende 10% (på volumbasis) føtalt bovint serum, 100 E av hver av penicillin og streptomycin og 2 mM L-glutamin) og testet i antivirusanalyser. Prøvene ble titrert i utpekte brønner i en 96-brønns vevsdyrkningsplate inneholdende humane lungekarsinomceller (A549, #CCL-185, ATCC, Rockville, MD). Fortynniger av en standard (66,7, 44,4, 29,6, 19,8, 13,2, 8,8, 5,9, 3,9, 2,6, 1,7, 1,2 og 0,8 pg/ml av den samme form av IFN-β-1a administrert til rotten) og av tre serumprøver ble analysert for hver plate. A549-cellene ble for-behandlet med fortynnede serumprøver i 24 timer før stimulering med encefalomyelokarditt-(EMC)-virus. Etter en 2 dagers inkubering med virus ble levedyktige celler farget med en oppløsning av MTT (i en konsentrasjon på 5 mg/ml i fosfatbuffer) i 1 time, vasket med fosfat og solubilisert med 1,2 N HCI i isopropanol. Brønnene ble deretter avlest ved 450 nm. Standardkurver for det umodifiserte eller PEGylerte IFN-β-1a ble frembrakt for hver plate og anvendt til bestemmelse av mengden av umodifisert eller PEGylert IFN-β-1a i hver testprøve. Farmakokinetiske parametere ble deretter beregnet under anvendelse av ikke-oppdelt analyse ("noncompartmental analysis") med programvare WinNonLin versjon 3.0 eller 3.3.
Figur 8A viser konsentrasjonen sammenstilt med tids-avsetninger for umodifisert IFN-β-1a (øvre felt) og IFN-β-1a modifisert med 20 kDa mPEG-O-2-metylpropionaldehyd (nedre felt), og figur 8B viser konsentrasjonen sammenstilt med tids-avsetninger for IFN-β-1a modifisert med 20 kDa mPEG-O-p-metylfenyl-O-2-metylpropionaldehyd (øvre felt) og 20 kDa mPEG-O-p-fenylacetaldehyd (nedre felt). Det er beregnet middelverdi for datapunktene fra 3 rotter.
Tabell 5 viser de farmakokinetiske parametere Cmaks (maksimal observert konsentrasjon), t1/2(eliminerings-halveringstid) AUC (areal under kurven), Vss (fordelingsvolum ved likevekt), clearance-hastighet og MRT (middel-oppholdstid) for umodifisert IFN-β-1 a og disse former av PEGylert IFN-β-Ι a. Dataene vist på figurene 8A og 8B og i tabell 5 ble oppnådd i samme undersøkelse.
Figur 9A viser konsentrasjonen sammenstilt med tids-avsetninger for umodifisert IFNβ-1a (øvre felt) og IFNβ-1a modifisert med 20 kDa mPEG-O-pfenylpropionaldehyd (nedre felt). Datapunktene er gjennomsnitt fra målinger fra 2 rotter. Figur 9B viser konsentrasjonen sammenstilt med tids-avsetninger for IFN-β-1a modifisert med 20 kDa mPEG-O-m-fenylacetaldehyd (øvre felt) og 20 kDa mPEG-O-m-metylfenyl-O-2-metylpropionaldehyd (nedre felt). Datapunktene er gjennomsnitt fra målinger fra 3 rotter.
Tabell 6 viser de farmakokinetiske parametere for umodifisert IFN^-1a og disse former for PEGylert IFN-β-Ι a. Dataene vist på figurene 9A og 9B og i tabell 6 ble oppnådd i samme undersøkelse; uavhengig av dataene vist på figurene 8A og 8B, og i tabell 5.
Som det fremgår av dataene vist på figurene 8A, 8B, 9A og 9B og i tabellene 5 og 6, forbedrer PEGylering av ΙFΝ-β-la med PEG-molekylene ifølge oppfinnelsen de farmakokinetiske egenskaper hos ΙFΝ-β-la. I alle tilfeller ble de PEGylerte proteiner uttømt mindre hurtig enn umodifisert IFN-β-Ι a, noe som resulterte i clearance-hastigheter på 3, 9-8, 3 ml/time/kg sammenliknet med 160-170 ml/time/kg for det umodifiserte protein. Som en følge av de reduserte clearance-hastigheter, økte middel-oppholdstiden (MRT) fra ca. 1 time for det umodifiserte protein til 4, 8-7, 6 timer for de PEGylerte proteiner. Likeledes økte eliminerings-halveringstiden (ti/2) fra ca. 1 time for det umodifiserte protein til 5,2-13 timer for de PEGylerte proteiner. Areal under kurve-(AUC)-verdiene var også øket i betydelig grad ved PEGylering av ΙFΝ-β-la. For umodifisert IFNβ-1a var AUC ca. 0,5 μg<●>time/ml, mens AUC-verdiene for de PEGylerte proteiner var i området ca. 3-6 μg<●>time/ml, til tross for at de PEGylerte proteiner ble dosert i et nivå 3,3 ganger lavere enn det umodifiserte protein. For den maksimale observerte konsentrasjon (Cmaks) var verdiene generelt høyere for umodifisert IFN-p-1 a enn for de PEGylerte proteiner, noe som gjenspeiler den lavere dose av de administrerte modifiserte proteiner. Når det gjaldt distribusjonsvolumet ved likevekt (Vss), var verdiene for alle de PEGylerte proteiner lavere enn for umodifisert IFN-P-1 a, noe som viste en restriksjon i deres evne til å komme ut av det sentrale blodkammer.
Tabell 5: Farmakokinetiske parametere for umodifisert I FN-β-Ι a, 20 kDa mPEG-O-2-metylpropionaldehyd-modifisert I FN-β-Ι a, 20 kDa mPEG-O-p-metylfenyl-O-2--metylpropionaldehyd-modifisert IFN-p-1a og 20 kDa mPEG-O-p-fenylacetaldehyd-modifisert IFN-p-1a etter intravenøs administrering til rotter<a>
De farmakokinetiske data for e viste umodifiserte og PEGylerte IFN-p-1a ble oppnådd i samme undersøkelse
Tabell 6: Farmakokinetiske parametere for umodifisert IFN-β-Ι a, 20 kDa mPEG-O-pfenylpropionaldehyd-modifisert I FN-β-Ι a, 20 kDa mPEG-O-m-fenylacetaldehyd-modifisert IFN-p-1a og 20 kDa mPEG-O-m-metylfenyl-O-2-metylpropionaldehyd-modifisert IFN-p-1a etter intravenøs administrering til rotter<a>
<3>De farmakokinetiske data for de viste umodifiserte og PEGylerte ble oppnådd i samme undersøkelse
EKSEMPEL 5: Sammenliknende farmakokinetikk og farmakodynamikk for umodifisert og PEGylert humant IFN-p-1a i ikke-humane primater Sammenliknende enkelt- og gjentatt-dose-undersøkelser utføres med umodifisert og PEGylert IFN-p-1a for bestemmelse av deres relative stabilitet og aktivitet i ikke-humane primater. I disse undersøkelser sammenliknes farmakokinetikken og farmakodynamikken for de PEGylerte IFN-p-1a-konjugater med farmakokinetikken og farmakodynamikken for umodifisert IFN-p-1 a, og rimelige prinsipper kan overføres til mennesker.
Dyr og metoder
Undersøkelse 1 (gjentatt dose)
Dette er en parallellgruppe-, gjentatt dose-undersøkelse for evaluering av den komparative farmakokinetikk og farmakodynamikk for umodifisert og PEGylert IFN-p-1 a. Friske primater (f.eks. rhesusaper) anvendes for denne undersøkelse. Før dosering evalueres alle dyrene med henblikk på tegn til dårlig helse av en laboratoriedyr-veterinær ved to tilfeller innenfor 14 dager før administrering av testartikkel; én evaluering må skje innenfor 24 timer før den første administrering av testartikkel. Bare friske dyr får testartikkelen. Vurderingene innbefatter en generell fysisk undersøkelse og førdoserings-blodprøvetakingerfor klinisk basislinje-patologi og basislinje-antistoffnivå overfor IFN-β-1a. Alle dyrene veies, og kropps-temperaturene registreres innen 24 timer før administreringer av testartikkel. Tolv individer tas med og henføres til grupper på tre som mottar 1 x 10<6>E/kg av umodifisert eller PEGylert IFN-β-Ι a, men ellers identisk IFN-β-1a. Administreringen skjer enten subkutant (SC) eller intravenøst (IV). Seks hanndyr får testartikkel ved IV-administrering (3 pr. behandling), og ytterligere 6 hanndyr får testartikkel ved SC-administrering (3 pr. behandling). Alle dyr må være rene for IFN-β-behandling. Hvert dyr blir dosert to ganger, dosene er atskilt med fire uker. Dosevolumet er 1 ,0 ml/kg. Blod uttas for farmakokinetisk testing 0, 0,083, 0,25, 0,5, 1, 1 ,5, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 72 og 96 timer etter hver injeksjon. Blodprøver for måling av den IFN-induserte biologiske responsmarkør, serum-neopterin, uttas 0, 24, 48, 72, 96, 168, 336 og 504 timer etter administrering av undersøkelsesmedikamentet. Vurderinger i løpet av undersøkelsestidsrommet innbefatter kliniske observasjoner utført 30 min og 1 time etter dosering med henblikk på tegn til toksisitet. Daglige observasjoner fra utsiden av buret utføres, og generelt utseende, tegn til toksisitet, ubehag og forandringer i oppførsel registreres.
Kroppsvekter og kroppstemperaturer registreres med regelmessige mellomrom i 21 dager etter dosering.
Undersøkelse 2 (enkeltdose)
Dette er en parallellgruppe-, enkeltdoseundersøkelse for vurdering av den komparative farmakokinetikk og farmakodynamikk for umodifisert og PEGylert IFN-1 β-1 a. Friske primater (f.eks. rhesusaper) anvendes for denne undersøkelse. Før dosering vurderes alle dyrene med henblikk på tegn til dårlig helse av en laboratoriedyr-veterinær ved to tilfeller innenfor 14 dager før administrering av testartikkel; en vurdering må skje innenfor 24 timer før den første administrering av testartikkel. Bare friske dyr får testartikkelen. Vurderingene innbefatter en generell fysisk undersøkelse og førdoserings-blodprøvetakinger for klinisk basislinjepatologi og basislinje-antistoffnivå overfor IFN-β-1a. Alle dyrene veies, og kropps-temperaturene registreres innen 24 timer før administreringer av testartikkel. Tjue individer tas med og henføres til én av fem grupper på fire dyr (2 hanner og 2 hunner pr. gruppe) som mottar enten 1 x 10<6>E/kg av umodifisert eller PEGylert IFN-β-Ι a intramuskulært (IM), eller 2 x 10<5>E/kg, 1 x 10<6>E/kg eller 4 x 10<6>E/kg av PEGylert IFN-(-1a intravenøst (IV). Alle dyr må være rene for IFN-(-behandling. Dosevolumet er vanligvis 1 ,0 ml/kg. Blod tappes for farmakokinetisk testing 0, 0,5, 1 , 2, 4, 6, 8, 12, 24, 36, 48 og 96 timer og 7, 14, 21 og 28 dager etter administrering av undersøkelses-medikament. Blodprøver for måling av den IFN-induserte biologiske responsmarkør, 2'-5'-oligoadenylatsyntase (2'-5'-OAS), tappes 0, 12, 24, 48, 72 og 96 timer og 7, 14, 21 og 28 dager etter administrering av undersøkelsesmedikamentet. Vurderinger i løpet av undersøkelsestidsrommet innbefatter kliniske observasjoner utført 30 min og 1 time etter dosering med henblikk på tegn til toksisitet. Daglige observasjoner fra utsiden av buret utføres, og generelt utseende, tegn til toksisitet, ubehag og forandringer i oppførsel registreres. Kroppsvekter og kroppstemperaturer registreres med regelmessige mellomrom i 28 dager etter dosering.
Analysemetoder
Nivåer av IFN-(-1a i serum kvantifiseres under anvendelse av en cytopatisk effekt-(CPE)-bioanalyse. CPE-analysen måler nivåer av IFN-mediert antiviral aktivitet. Nivået av antiviral aktivitet i en prøve gjenspeiler antallet molekyler av aktiv IFN som finnes i denne prøve på tidspunktet for blodtapping. Denne fremgangsmåte har vært standardmetoden for fastsettelse av farmakokinetikken for IFN-(. CPE-analysen påviser evnen hos IFN-( til å beskytte humane lungekarsinomceller (A549, #CCL-185, ATCC, Rockville, MD) mot cytotoksisitet på grunn av encefalomyokarditt-(EMC)-virus. Cellene for-inkuberes i 15-20 timer med serumprøverfor å muliggjøre induksjon og syntese av IFN-induserbare proteiner som er ansvarlige for den antivirale respons. EMC-virus blir så tilsatt, og det blir inkubert i ytterligere 30 timer før bedømmelse av cytotoksisitet utføres under anvendelse av krystallfiolettfarging. En indre IFN-(-standard samt en intern PEGylert IFN-(-1a-standard testes samtidig med prøver på hver analyseplate. Denne standard kalibreres mot en naturlig human fibroblast-IFN-referansestandard (WHO Second International Standard for Interferon, Human Fibroblast, Gb-23-902-53). Hver analyseplate innbefatter også cellevekstkontrollbrønner som verken inneholder IFN-( av noen slags type eller EMC, og viruskontrollbrønner som inneholder celler og EMC, men ikke IFN-(. Kontrollplater som inneholder standarden og prøvene, prepareres også for bestemmelse av virkningen, hvis noen, av prøvene på cellevekst. Disse plater farges uten tilsetting av virus. Prøver og standarder testes in duplo på hver av to kopi-analyseplater, noe som gir fire datapunkter pr. prøve. Den geometriske middelkonsentrasjon for de fire paralleller rapporteres. Påvisningsgrensen for denne analyse er 10 E/ml. Serum konsentrasjoner av neopterin bestemmes ved den kliniske farmakologienhet under anvendelse av kommersielt tilgjengelige analyser.
Serumkonsentrasjoner av 2'-5'-OAS bestemmes ved et kontraktlaboratorium under anvendelse av en godkjent kommersielt tilgjengelig analyse.
Farmakokinetiske og statistiske metoder
RstripTM-programvare (MicroMath, Inc., Salt Lake City, UT) anvendes for å tilpasse data til farmakokinetiske modeller. Geometriske middelkonsentrasjoner avsettes mot tiden for hver gruppe. Siden analyseresultatene uttrykkes i fortynninger, anses geometriske middelverdier for å være mer passende enn aritmetiske middelverdier. Serum-IFN-nivåene justeres med hensyn til basislinjeverdier, og ikke-påvisbare serumkonsentrasjoner settes til 5 E/ml, som representerer halvdelen av den nedre påvisningsgrense. For IV-infusjonsdata tilpasses en tokammer-IV-infusjonsmodell til de påvisbare serumkonsentrasjoner for hvert individ, og SC-dataene tilpasses til en tokammer-injeksjonsmodell.
Følgende farmakokinetiske parametere beregnes:
(i) observert toppkonsentrasjon, Cmaks (E/ml);
(ii) areal under kurven fra 0 til 48 timer, AUC (E x timer/ml) under anvendelse av trapesoideregelen;
(iii) eliminerings-halveringstid (timer);
og, ut fra IV infusjonsdata (hvis IV anvendes):
(iv) distribusjons-halveringstid (timer);
(v) clearance (ml/t/kg)
(vi) tilsynelatende distribusjonsvolum, Vd (ml/kg).
WinNonlin-programvare (Versjon 1.0, Scientific Consulting Inc., Apex, NC) anvendes til beregning av eliminerings-halveringstidene etter IV og SC injeksjon. Når det gjelder neopterin og 2'-5'-OAS, er aritmetiske middelverdier pr. tidsenhet presentert for hver gruppe. Emaks, den maksimale forandring fra basislinjen, beregnes. Cmaks, AUC og Emaks underkastes énveis-variansanalyse for sammenlikning av doseringsgrupper. Cmaks og AUC blir logaritmisk transformert før analyse; geometriske middelverdier er rapportert.
EKSEMPEL 6: Anti-angiogene virkninger av PEGylert humant IFN-β-1a;
evnen hos PEGylert IFN-β-1a til å inhibere endotelcelleproliferasjon in vitro
Human vene-endotelceller (Cell Systems, kat. nr. 2V0-P75) og humane dermale mikrovaskulære endotelceller (Cell Systems, kat. nr. 2M1-C25) holdes i kultur med CS-C Medium Kit (Cell Systems, kat. nr. 4Z0-500). 24 timer før forsøket blir cellene trypsinert og gjenoppslemmet i analysemedium, 90% M199 og 10% føtalt bovint serum (FBS) og justeres til ønsket celletetthet. Cellene blir så utplatet på gelatinbelagte 24- eller 96-brønnsplater, hver med henholdsvis enten 12 500 celler pr. brønn eller 2000 celler pr. brønn. Etter inkubering natten over, erstattes analysemediet med friskt medium inneholdende 20 ng/ml av human rekombinant basis-Fibroblast Growth Factor (bFGF) (Becton Dickinson, kat. nr. 40060), og forskjellige konsentrasjoner av umodifisert eller PEGylert IFN-β-1a ifølge beskrivelsen eller positiv kontroll (endostatin kan anvendes som positiv kontroll, og likeledes et antistoff mot bFGF) tilsettes. Sluttvolumet justeres til 0,5 ml i 24-brønnsplaten eller 0,2 ml i 96-brønnsplaten. Etter 72 timer blir cellene trypsinert for Coulter-telling, frosset for CyQuant-fluorescensavlesning eller merket med [<3>H]-thymidin. Denne in vitro-analyse tester de PEGylerte humane IFN-β-1amolekyler ifølge beskrivelsen med hensyn til virkninger på endotelcelleproliferasjonen, som kan være en indikasjon på anti-angiogene virkninger in vivo. Se O'Reilly, et al., Cell 88: 277-285 (1997).
EKSEMPEL 7: In vivo-modeller for testing av anti-angiogene og neovaskulariseringsvirkninger av PEGylert humant IFN-β-1a og PEGylerte gnager-IFN-β
Umodifisert IFN-β-1a og 20 kDa mPEG-O-2-metylpropionaldehyd-modifisert IFN-β-1a ble testet med henblikk på sin evne til å inhibere dannelsen av radialt orienterte kar som kommer inn i periferien av humane maligne SK-MEL-1-melanomtumorer i athymiske hårløse homozygote (nu/nu) mus. SK-MEL-1 -celler ble dyrket i kultur til 80% konfluens, og deretter ble 2 x 10<6>celler inokulert intradermalt (0,1 ml volum på dag 0) i siden av midt-aksillærlinjen i tre uker gamle athymiske hårløse homozygote (nu/nu) NCR-mus (Taconic, Germantown, NY). 24 timer senere (dag 1 ) fikk grupper med tre mus i hver følgende subkutane doser av bærerkontroll, umodifisert IFN-β-1a eller 20 kDa mPEG-O-2-metylpropionaldehydmodifisert IFN-β-Ι a:
Gruppe A: 0,1 ml av 45,6 mg/ml humant serumalbumin (bærerkontroll) én gang bare på dag 1
Gruppe B: 0,1 ml av 45,6 mg/ml humant serumalbumin inneholdende 1 ME (5 μg) umodifisert IFN-β-1a daglig på dagene fra og med 1 til og med 9 Gruppe C: 0,1 ml av 45,6 mg/ml humant serumalbumin inneholdende 1 ME-enheter (10 pg) av 20 kDa mPEG-O-2-metylpropionaldehyd-modifisert IFN-β-la én gang bare på dag 1
Gruppe D: 0,1 ml av 45,6 mg/ml humant serumalbumin (bærerkontroll) daglig på dagene fra og med 1 til og med 9
Musene ble avlivet på dag 10 (Avertin, 0,5 ml intraperitonealt) og tumorinokuleringsstedet bedømt med hensyn til neovaskularisering, målt ved en observerings-blindprøve med hensyn til behandlingsgruppen. Karene ble tellet under fast forstørrelse under et disseksjonsmikroskop. Hvert radialt orientert kar som kom inn i tumorens periferi, ble bedømt som et enkelt kar. Hver gruppe besto av tre mus.
Som vist på fig. 10, var en enkelt administrering av 1 ME av 20 kDa mPEG-O-2-metylpropionaldehyd-modifisert ΙFΝ-β-la (gruppe C) like effektiv til redusering av antallet nye kar som daglig administrering av 1 ME av umodifisert ΙFΝ-β-la (gruppe B). Imidlertid er virkningen av det 20 kDa mPEG-O-2-metylpropionaldehyd-modifiserte ΙFΝ-β-la mer uttalt når det tas i betraktning at daglig administrering av bærermaterialet alene hadde en viss inhiberende effekt (sammenlikn gruppe A, bare gitt bærermateriale, med gruppe D, bærermateriale gitt daglig).
Det er også utviklet forskjellige andre modeller som kan anvendes til testing av de anti-angiogene virkninger og anti-neovaskulariseringsvirkningene av de PEGylerte molekyler ifølge oppfinnelsen. Noen av disse modeller er beskrevet i US-patenter 5733 876 (31. mars 1998: "Method of inhibiting angiogenesis") og 5 135919 (4. aug. 1992: "Method and a pharmaceutical composition for the inhibition of angiogenesis"). Andre analyser innbefatter analysen av den skallmanglende chorioallantoinmembran (CAM), ifølge Taylor og Folkman; Nature 297:307 (1982) og Crum et al., Science 230:1375 (1985); muse-dorsalluftputemetode-antiangiogenesemodellen ifølge Folkman et al.; J. Exp. Med. 133: 275 (1971) og rottekornea-mikrolommeanalysen ifølge Gimbrone, Jr. et al., J. Natl. Cancer Inst. 52:413 (1974) hvor kornea-vaskularisering induseres hos voksne hannrotter av Sprague-Dawley-stammen (Charles River, Japan) ved implantering av 500 ng bFGF (bovint, R & D Systems, Inc.), impregnert i etylenvinylacetatkopolymer-pellet, i hver kornea. Dessuten finnes det en modell hvor angiogenese induseres i NIFI-Swiss- eller athymiske hårløse (nu/nu) mus etter implantasjon av MCF-7-brystkarsinom- eller NIFI-OVCAR-3-ovariekarsinomceller som beskrevet av Lindner og Borden; Int. J. Cancer 71:456 (1997). Ytterligere tumorcellelinjer innbefattende humane maligne SK-MEL-1-melanomceller kan også anvendes til indusering av angiogenese som beskrevet ovenfor. Forskjellige doser, med forskjelligee doseringsfrekvenser og med forskjellig varighet, kan testes med henblikk på både de umodifiserte og de PEGylerte IFN-β-1a-proteiner ifølge beskrivelsen.
Andre metoder for testing av PEGylert muse- og rotte-IFN-β med henblikk på anti-angiogene virkninger i en dyremodell innbefatter protokoller for screening av nye potensielle anticancermidler som beskrevet i de opprinnelige Cancer Chemotherapy Reports, Del 3, Vol. 3, nr. 2, september 1972, og supplementet In Vivo Cancer Models, 1976-1982, NIH Publication nr. 84-2635, februar 1984. På grunn av artsspesifisiteten av interferoner type I når det gjelder å fastsette den anti-angiogene aktivitet av PEGylert IFN-β i gnagermodeller, frembringes PEGylerte gnager-IFNβ-preparater (f.eks. mus og rotte). Slike screeningmetoder er eksemplifisert ved en protokoll for testing med henblikk på de anti-angiogene virkninger av PEGylert muse-IFN-β på subkutant implantert Lewis Lungekarsinom:
Tumorlinieopprinnelse
Denne tumorlinje oppsto spontant i 1951 som et karsinom i lungen hos en C57BL/6-mus.
Oppsummering av testmetode
Et tumorfragment implanteres subkutant i aksillærregionen hos en B6D2F1-mus. Testmidlet (dvs. et PEGylert interferon ifølge beskrivelsen) administreres i forskjellige doser, subkutant (SC) eller intraperitonealt (IP) på flere dager etter tumorimplantasjon. Den målte parameter er middel-overlevelsestid. Resultatene uttrykkes som prosentandel av kontroll-overlevelsestid.
Dyr
Formering: C57BL/6 mus.
Testing: B6D2F1-mus.
Vekt: Musene er innenfor et vektområde på 3 g, med en minimumsvekt på 18 g for hanner og 17 g for hunner.
Kjønn: Ett kjønn anvendes for alle test- og kontrolldyr i ett forsøk.
Kilde: Én kilde, hvis mulig, for alle dyr i ett forsøk.
Forsøksstørrelse
Ti dyr pr. testgruppe.
Tumoroverføring
FORMERING:
Fragment: Preparer et 2-4 mm fragment av en SC donor-tumor.
Tid: Dag 13-15.
Sted: Implanter fragmentet SC i aksillærregionen med en punksjon i ingvinalregionen
TESTING:
Fragment: Preparer et 2-4 mm fragment av SC donor-tumoren.
Tid: Dag 13-15.
Sted: Implanter fragmentet SC i aksillærregionen med en punksjon i ingvinalregionen.
Testprogram
Dag 0: Implanter tumor. Kjør bakteriekulturer. Test positiv kontrollforbindelse i hvert oddetalls-forsøk. Tilbered materialer. Registrer dødsfall daglig.
Dag 1 : Kontroller kulturene. Vrak forsøk hvis forurenset. Plukk ut dyrene tilfeldig. Behandle som instruert (på dag 1 og på etterfølgende dager).
Dag 2: Kontroller kulturene på nytt. Vrak forsøk hvis forurenset.
Dag 5: Vei Dag 2 og dag for innledende testmiddel-toksisitetsevaluering. Dag 14: Kontroller dagen for tidlig død.
Dag 48: Kontroller dag uten inntak ("no-take day").
Dag 60: Avslutt og evaluer forsøk. Undersøk lunger med henblikk på tumor.
Kvalitetskontroll
Fastsett ("schedule") den positive kontrollforbindelse (NSC 26271; Cytoxan i en dose på 100 mg/kg/injeksjon) i hvert oddetallsforsøk, for hvilket regimenet er intraperitonealt kun på dag 1. Den nedre test/kontroll-grense for den positive kontroll er 140%. Den akseptable middeloverlevelsestid for ubehandlet kontroll er 19-35,6 dager.
Evaluering
Den målte parameter er middel-overlevelsestid. Beregn middeldyrekroppvektene for dag 1 og dag 5, beregn test/kontroll-forhold for alle testgrupper. Middel-dyrekroppvektene for oppsettingsdag og dag for endelig evaluering beregnes. Test/kontroll-forholdet beregnes for alle testgrupper med >65% overlevende på dag 5. En test/kontroll-forholdsverdi på <86% angir toksisitet. En overdreven forandring av kroppsvekt (test minus kontroll) kan også anvendes til evaluering av toksisitet.
Kriterier for aktivitet
Et innledende test/kontroll-forhold større enn eller lik 140% anses nødvendig for påvisning av moderat aktivitet. En reproduserbar test/kontrollforholdsverdi på mer enn eller lik 150% anses for signifikant aktivitet.
EKSEMPEL 8: In vivo-modeller for testing av den antiproliferative virkning og anti-tumor-virkningen av PEGylert humant IFN-β-1a og PEGylerte gnager-IFN-β
Forskjellige in vivo-modeller er tilgjengelige for å teste den antiproliferative virkning og anti-tumorvirkningen av umodifiserte og PEGylerte humane IFN-β-1a ifølge beskrivelsen. I en modell beskrevet av Bailon et al., Bioconjugate Chemistry 12:195 (2001) implanteres athymiske hårløse mus (Flarlan) subkutant med 2 x 10<6>humane nyre-A498-, humane nyre-ACFIN- eller humane nyre-G402-celler under den bakre side ("rear flank"), og det får gå 3-6 uker slik at tumorene kan utvikles.
Umodifisert eller PEGylert humant IFN-β-1a blir så administrert i forskjellige doser, med forskjellige doserings-hyppigheter og med forskjellige varighet, og tumorvolumet måles og sammenliknes mellom behandlingene. I en annen modell beskrevet av Lindner og Borden, J. Interferon Cytokine Res 17: 681 (1997) implanteres athymiske hårløse (nu/nu) oophorektomiserte hunnmus av typen BALB/c med 2 x 10<6>humane MCF-7 (pluss østradiol), humane MDA-MB-231-, MDA-MB-468- eller BT-20-brystkarsinomceller, humane NIH-OVCAR-3-ovariekarsinomceller, humane HT-29-colonkarsinomceller eller humane maligne SK-MEL-1- eller FEMX-melanomceller, i dermis som ligger utenpå brystkjertlene nærmest aksillen, og tumorenes størrelse fastsettes som funksjon av tiden.
Umodifisert eller PEGylert humant IFN-β-1a blir så administrert i forskjellige doser, med forskjellige doseringshyppigheter og med forskjellig varighet, og tumorvolumet måles og sammenliknes mellom behandlingene. Andre modeller for testing av den anti-proliferative virkning og antitumorvirkningen av PEGylert humant IFN-β-1a innbefatter lokale og metastatiske lungecancer-modeller beskrevet av Qin et al., Molecular Therapy 4: 356 (2001) og hårløse musxenotransplantatmodeller av humane colorektalcancer-levermetastaser beskrevet av Tada et al., J Clinical Investigation 108: 83 (2001 ).
Andre metoder for testing av PEGylert muse- og rotte-IFN-β med henblikk på anti-proliferativ virkning og anti-tumorvirkning i dyremodeller innbefatter en musemodell av malignt mesoteliom beskrevet av Odaka et al., Cancer Res 61 : 6201 (2001), lokale og metastatiske lungecancer-modeller beskrevet av Qin et al., Molecular Therapy 4: 356 (2001) og syngeneiske musemodellerfor colorektalcancer-levermetastaser beskrevet av Tada et al., J Clinical Investigation 108: 83 (2001).
EKSEMPEL 9: In vivo-modeller for testing av antivirus-virkninger av PEGylert muse-IFN-β og PEGylert humant ΙFΝ-β-la
En in vivo-musemodel er tilgjengelig for å teste effekten av umodifisert og PEGylert muse-IFN-β på nivåene for humant Hepatitt B-virus (HBV) i HBV-transgene SCID-mus. Larkin et al., Nature Medicine 5:907 (1999). I denne modell har transgene SCID-mus som bærer en hode-til-hale-dimer av det humane HBV-genom, påvisbare nivåer av HBV-replikative former og pre-genomisk RNA i leveren, og HBV-virus i serum. Hepatocytter fra de transgene mus er også positive med hensyn til HBsAg-, HBcAg- og HbxAg-proteinene, noe som tyder på virusreplikasjon. Et eksempel på en protokoll for sammenlikning av umodifisert og PEGylert muse-IFN-β in denne modell er gitt nedenfor:
30 mus (5 grupper på 5 pluss 5 ekstra) med sammenliknbar virustiter titreres på to uavhengige tidspunkter (med minst 1 ukes mellom) for opprettelse av en basislinjetiter og for å sikre at deres titere forblir konstante før dosering med muse-IFN-β. Grupper på 5 mus doseres 3 ganger ukentlig (mandag, onsdag og fredag) subkutant med følgende prøver, som vist i tabell 7.
Tabell 7
Gruppe Doserinqsprøve
1 Bærerkontroll (1 mg/ml muse-serumalbumin, MSA)
2 30 E umodifisert muse-IFN-β i 1 mg/ml MSA
3 300 E umodifisert muse-IFN-β i 1 mg/ml MSA
4 3000 E umodifisert muse-IFN-β i 1 mg/ml MSA
5 30 E PEGylert muse-IFN-β i 1 mg/ml MSA
6 300 E PEGylert muse-IFN-β i 1 mg/ml MSA
7 3000 E PEGylert muse-IFN-β i 1 mg/ml MSA
Virustitere bestemmes ukentlig under dosering og ukentlig til hver annen uke i 6 måneder etter dosering. Avsetninger av virustiter mot tiden konstrueres for sammenlikning av bærermateriale og IFN^-behandlede dyr med hensyn til clearance og gjenoppretting av virustiter. En andre undersøkelse blir så utført med de passende doser av umodifiseret og PEGylert muse-IFN-β med 10-20 mus pr. gruppe i totalt 30-60 mus (10-20 for kontroll, 10-20 for umodifisert muse-IFN-β og 10-20 for PEGylert muse-IFN-β). Virustitere fastsettes som ovenfor, og ved avliving analyseres serum med henblikk på virustiter samt med henblikk på FlbsAg ved SDS-PAGE og Western-blotting. Levere blir også fjernet, frosset eller fiksert etter behov, og farget med henblikk på tilstedeværelse av HbsAg, HbcAg og HbxAg. Andre passende histologiske, histokjemiske eller biokjemiske tester som er kjent for fagfolk på området, kan også utføres for serum- og vevsprøver.
En in vivo-musemodell er også tilgjengelig for testing av virkningen av umodifisert og PEGylert humant ΙΡΝ-β-la på nivåene av humant hepatitt C-virus (HCV) hos mus som bærer kimæriske humane levere. Mercer et al., Nature Medicine 7:927 (2001). I denne modell podes normale humane hepatocytter i SCID-mus som bærer et plasm inogenaktivator-transgen ( Alb-uPA ), og musene inokuleres med serum fra mennesker som er infisert med de forskjellige genotyper av HCV. De podede humane leverceller blir infisert med viruset, og viruset replikeres. Nivåer av HCV-RNA i serum kan kvantifiseres ved PCR samt nivåene av positivt og negativt (replikativ form) RNA i levercellene. En passende undersøkelsesprotokoll i likhet med den som er beskrevet ovenfor for umodifisert og PEGylert muse-IFN-β i transgene HBV-SCID-mus utføres for fastsettelse av effektiviteten av umodifisert og PEGylert humant IFN-β-1a i denne modell, dvs. for bestemmelse av virkningen av behandling på HCV-titer, leverhistologi, serum-ALT-nivåer og tilstedeværelse av HCV-replikative former i det innpodede humane levervev. Andre passende histologiske, histokjemiske eller biokjemiske tester som er kjent for fagfolk på området, kan også utføres på serum- og vevsprøver.

Claims (13)

Patentkrav
1. Farmasøytisk preparat omfattende et konjugat og en farmasøytisk akseptabel bærer, adjuvans, fortynningsmiddel, konserveringsmiddel og/eller solubiliseringsmiddel,
hvor konjugatet omfatter reaksjonsproduktet av en aktivert polyalkylenglykol polymer og B, hvor
B er en interferon beta (IFN β); og
nevnte aktivert polyalkylenglykolpolymer er 20 kDa mPEG-O-2-metylpropionaldehyd, 20 kDa mPEG-O-p-metylfenyl-O-2-metylpropionaldehyd, 20 kDa mPEG-O-m-metylfenyl-O-2-metylpropionaldehyd, 20 kDa mPEG-O-p- fenylacetaldehyd, 20 kDa mPEG-O-p-fenylpropionaldehyd eller 20 kDa mPEG-O-mfenylacetaldehyd.
2. Farmasøytisk preparat ifølge krav 1, hvor nevnte aktiverte polyalkylenglykol polymer er 20 kDa mPEG-O-2-metylpropionaldehyd.
3. Farmasøytisk preparat ifølge krav 1 eller 2, hvor nevnte IFN-β er IFN^-1a.
4. Farmasøytiske preparat ifølge krav 1, hvor nevnte solubiliseringsmiddel er valgt fra tween eller polysorbat.
5. Farmasøytiske preparat ifølge krav 1, hvor nevnte fortynningsmiddel omfatter en buffer.
6. Farmasøytisk preparatet ifølge krav 5, hvor nevnte buffer er valgt fra arginin, Tris-HCI, acetat eller fosfat.
7. Farmasøytisk preparat ifølge krav 1, hvor nevnte preparat inneholder fukteeller emulgeringsmidler, pH buffermidler, natriumacetat og/eller trietanolaminoleat.
8. Fremgangsmåte for fremstilling av det farmasøytiske preparat ifølge krav 1 omfattende følgende trinn:
(a) tilsetning av en aktivert polyalkylenglykolpolymer til en IFn β løsning for å danne en blanding, hvor nevnte aktiverte polyalkylenglykolpolymer er 20 kDa mPEG-0-2- metylpropionaldehyd, 20 kDa mPEG-O-p-metylfenyl-O-2-metylpropionaldehyd, 20 kDa mPEG-O-m-metylfenyl-O-2-metylpropionaldehyd, 20 kDa mPEG-O-p- fenylacetaldehyd, 20 kDa mPEG-O-p-fenylpropionaldehyd eller 20 kDa mPEG-O-m- fenylacetaldehyd;
(b) omsetning av nevnte aktiverte polyalkylen glykolpolymer med nevnte IFN β i nærvær av natriumcyanoborhydrid via reduktiv alkylering for å danne et konjugat; og
(c) kombinasjon av nevnte konjugat med en farmasøytisk akseptabel bærer, adjuvans, fortynningsmiddel, konserveringsmiddel og/eller solubiliseringsmiddel.
9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, hvor den aktiverte polyalkylenglykolpolymeren er 20 kDa mPEG-O-2-metylpropionaldehyd.
10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, hvor nevnte prosess har en pegyleringseffektivitet på >90%.
11. Fremgangsmåte ifølge krav 9, hvor nevnte prosess har et IFN-β/polyalkylenglykol forhold på 1 :1.
12. Fremgangsmåte ifølge krav 9, videre omfattende rensning av nevnte konjugat til en renhet på >90% før kombinasjon av nevnte konjugat med en farmasøytisk akseptabel bærer, adjuvans, fortynningsmiddel, konserveringsmiddel og/eller solubiliseringsmiddel.
13. Fremgangsmåte ifølge krav 8 eller krav 9, hvor nevnte IFN-β er IFNβ-la.
NO20151082A 2002-01-18 2015-08-26 Farmasøytisk preparat omfattende interferon beta (IFN β) og konjugat omfattende reaksjonsprodukter av en aktivert polyalkylenglykolpolymer samt fremgangsmåte for fremstilling av slike. NO344612B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US34991702P 2002-01-18 2002-01-18
PCT/US2003/001559 WO2003061577A2 (en) 2002-01-18 2003-01-17 Polyalkylene glycol with moiety for conjugating biologically active compound

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20151082A1 NO20151082A1 (no) 2015-08-26
NO344612B1 true NO344612B1 (no) 2020-02-10

Family

ID=27613339

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20043422A NO339857B1 (no) 2002-01-18 2004-08-17 Konjugat inneholdende polyalkylenglykol, farmasøytisk preparat inneholdende samme samt anvendelse av samme for behandling av sykdom
NO20151082A NO344612B1 (no) 2002-01-18 2015-08-26 Farmasøytisk preparat omfattende interferon beta (IFN β) og konjugat omfattende reaksjonsprodukter av en aktivert polyalkylenglykolpolymer samt fremgangsmåte for fremstilling av slike.
NO2017013C NO2017013I2 (no) 2002-01-18 2017-04-10 peginterferon beta-1a

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20043422A NO339857B1 (no) 2002-01-18 2004-08-17 Konjugat inneholdende polyalkylenglykol, farmasøytisk preparat inneholdende samme samt anvendelse av samme for behandling av sykdom

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO2017013C NO2017013I2 (no) 2002-01-18 2017-04-10 peginterferon beta-1a

Country Status (35)

Country Link
US (2) US8017733B2 (no)
EP (3) EP1476181B1 (no)
JP (5) JP2005526151A (no)
KR (1) KR100964411B1 (no)
CN (2) CN1630530A (no)
AU (1) AU2003210564B2 (no)
BE (1) BE2016C040I2 (no)
BG (1) BG66525B1 (no)
BR (1) BRPI0306993B8 (no)
CA (4) CA2952488C (no)
CY (2) CY2016027I1 (no)
CZ (1) CZ2004877A3 (no)
DK (2) DK1476181T3 (no)
EA (2) EA009783B1 (no)
EE (1) EE05509B1 (no)
ES (2) ES2566797T3 (no)
GE (2) GEP20074024B (no)
HK (3) HK1072721A1 (no)
HU (4) HUE028163T2 (no)
IL (1) IL163006A (no)
IS (1) IS2989B (no)
LU (1) LU93162I2 (no)
ME (2) ME00239B (no)
MX (1) MXPA04006855A (no)
NL (1) NL300826I2 (no)
NO (3) NO339857B1 (no)
NZ (1) NZ534708A (no)
PL (2) PL397261A1 (no)
PT (1) PT3025726T (no)
RS (1) RS55578B1 (no)
SI (2) SI1476181T1 (no)
SK (1) SK3102004A3 (no)
UA (1) UA82184C2 (no)
WO (1) WO2003061577A2 (no)
ZA (1) ZA200406555B (no)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1476181B1 (en) * 2002-01-18 2016-03-23 Biogen MA Inc. Polyalkylene polymer compounds and uses thereof
US20150246097A9 (en) * 2002-01-18 2015-09-03 Biogen Idec Ma Inc. Polyalkylene Polymer Compounds and Uses Thereof
WO2004022630A2 (en) 2002-09-09 2004-03-18 Nektar Therapeutics Al, Corporation Water-soluble polymer alkanals
US8129330B2 (en) 2002-09-30 2012-03-06 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
AU2003303635B2 (en) * 2002-12-26 2009-07-23 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates of interferon-beta with enhanced biological potency
TWI364295B (en) * 2002-12-26 2012-05-21 Mountain View Pharmaceuticals Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity
US7432331B2 (en) 2002-12-31 2008-10-07 Nektar Therapeutics Al, Corporation Hydrolytically stable maleimide-terminated polymers
CA2530136C (en) 2003-06-26 2012-10-16 Control Delivery Systems, Inc. In-situ gelling drug delivery system
US8815284B2 (en) 2003-06-26 2014-08-26 Psivida Us, Inc. Bioerodible sustained release drug delivery systems
WO2005118537A2 (en) * 2004-05-31 2005-12-15 Ranbaxy Laboratories Limited Arylpiperazine derivatives as adrenergic receptor antagonists
AU2005318984B2 (en) 2004-12-21 2011-12-01 Nektar Therapeutics Stabilized polymeric thiol reagents
US20070004635A1 (en) * 2005-06-02 2007-01-04 Schering Corporation Method of treating interferon non-responders using HCV protease inhibitor
SG196786A1 (en) * 2005-07-08 2014-02-13 Elan Pharm Inc Preparation of polymer conjugates of therapeutic, agricultural, and food additive compounds
US8138272B2 (en) * 2006-05-22 2012-03-20 Elan Pharmaceuticals, Inc. Preparation of polymer conjugates of therapeutic, agricultural, and food additive compounds
WO2008066816A2 (en) * 2006-11-28 2008-06-05 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Derivatization or ligaton of peptides
EP2176404A4 (en) * 2007-07-11 2014-11-19 Belrose Pharma Inc POLYMERIC DRUG DELIVERY SYSTEMS WITH AN AROMATIC ALLYLIC ACID
CA2693616A1 (en) * 2007-07-11 2009-01-15 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Polymeric drug delivery system containing a multi-substituted aromatic moiety
CL2008002399A1 (es) * 2007-08-16 2009-01-02 Pharmaessentia Corp Conjugado sustancialmente puro que posee una porcion polimerica, una porcion proteica (interferon alfa 2b) y un ligante alifatico de 1 a 10 atomos de carbono, util en el tratamiento de las hepatitis b o c.
JP2011522834A (ja) * 2008-06-05 2011-08-04 ザイモジェネティクス リミテッド ライアビリティ カンパニー Ｃ型肝炎の治療のためのペグ化ｉｉｉ型インターフェロンの使用
BRPI0911722B1 (pt) * 2008-07-31 2022-09-13 Pharmaessentia Corp Conjugado de peptídeo-polímero
GB0823309D0 (en) * 2008-12-19 2009-01-28 Univ Bath Functionalising reagents and their uses
EP2439736A1 (en) 2009-06-02 2012-04-11 Panasonic Corporation Down-mixing device, encoder, and method therefor
UA109646C2 (uk) * 2009-12-10 2015-09-25 Терапевтичне застосування кон'югатів білка з полімером
US20130225789A1 (en) * 2012-02-29 2013-08-29 Yi Sun Polyethylene Glycol Having Hetero Multiple Functional Groups
US8993614B2 (en) 2012-03-15 2015-03-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Substituted pyrrolidine-2-carboxamides
KR101475630B1 (ko) * 2013-05-31 2014-12-22 동국대학교 산학협력단 포도근 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 c형 간염의 예방 또는 치료용 조성물
WO2016013911A1 (ko) * 2014-07-24 2016-01-28 에이비온 주식회사 페길화된 인터페론 -베타 변이체
SI3183264T1 (sl) * 2014-08-19 2021-03-31 Biogen Ma Inc. Metoda pegilacije
GB201419108D0 (en) 2014-10-27 2014-12-10 Glythera Ltd Materials and methods relating to linkers for use in antibody drug conjugates
HRP20231732T1 (hr) 2014-11-06 2024-03-15 Pharmaessentia Corporation Režim doziranja pegiliranog interferona
ES2831079T3 (es) * 2017-06-28 2021-06-07 Construction Research & Technology Gmbh Dispersante para partículas inorgánicas
US11472894B2 (en) 2018-07-23 2022-10-18 Carnegie Mellon University Enzyme-assisted ATRP procedures
CN109232898A (zh) * 2018-08-02 2019-01-18 张玲 一种具有抗凝血功能的聚酰亚胺新材料的制备方法
CN111534458B (zh) * 2020-04-13 2022-01-14 浙江工业大学 无色杆菌tbc-1及其在降解1,3,6,8-四溴咔唑中的应用
CN113716982B (zh) * 2021-08-24 2022-05-06 重庆云瑞肥业有限公司 一种食品垃圾回收用发酵制肥装置

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000023114A2 (en) * 1998-10-16 2000-04-27 Biogen, Inc. Polymer conjugates of interferon beta- 1a and their uses

Family Cites Families (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3710795A (en) 1970-09-29 1973-01-16 Alza Corp Drug-delivery device with stretched, rate-controlling membrane
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4002531A (en) 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
EP0082481B2 (en) 1981-12-23 1990-09-12 Schering Corporation Stabilised alpha-interferon formulations and their preparation
WO1985003934A1 (en) * 1984-03-06 1985-09-12 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein and process for its preparation
GB8334102D0 (en) 1983-12-21 1984-02-01 Searle & Co Interferons with cysteine pattern
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
EP0206448B1 (en) 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
US4917888A (en) 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
JP2524586B2 (ja) 1985-06-26 1996-08-14 シタス コーポレイション ポリマ−接合を利用する医薬組成物用蛋白質の可溶化
JP2514950B2 (ja) 1986-03-10 1996-07-10 エフ・ホフマン―ラ ロシユ アーゲー 化学修飾蛋白質，その製造法および中間体
US4894226A (en) 1986-11-14 1990-01-16 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polyproline conjugation
US5080891A (en) 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5135919A (en) 1988-01-19 1992-08-04 Children's Medical Center Corporation Method and a pharmaceutical composition for the inhibition of angiogenesis
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5286637A (en) * 1989-08-07 1994-02-15 Debiopharm, S.A. Biologically active drug polymer derivatives and method for preparing same
US5252714A (en) * 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
US5595732A (en) 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US5281698A (en) 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
WO1993012145A1 (en) 1991-12-19 1993-06-24 Baylor College Of Medicine Pva or peg conjugates of peptides for epitope-specific immunosuppression
ZA933926B (en) 1992-06-17 1994-01-03 Amgen Inc Polyoxymethylene-oxyethylene copolymers in conjuction with blomolecules
US5382657A (en) 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
US5262564A (en) 1992-10-30 1993-11-16 Octamer, Inc. Sulfinic acid adducts of organo nitroso compounds useful as retroviral inactivating agents anti-retroviral agents and anti-tumor agents
US5298410A (en) 1993-02-25 1994-03-29 Sterling Winthrop Inc. Lyophilized formulation of polyethylene oxide modified proteins with increased shelf-life
US5681811A (en) 1993-05-10 1997-10-28 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized therapeutic agent compositions, delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5359030A (en) 1993-05-10 1994-10-25 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5874075A (en) 1993-10-06 1999-02-23 Amgen Inc. Stable protein: phospholipid compositions and methods
US5951974A (en) 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
DK0730470T3 (da) 1993-11-10 2002-06-03 Enzon Inc Forbedrede interferonpolymerkonjugater
US5446090A (en) 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
US5639725A (en) 1994-04-26 1997-06-17 Children's Hospital Medical Center Corp. Angiostatin protein
US5730990A (en) * 1994-06-24 1998-03-24 Enzon, Inc. Non-antigenic amine derived polymers and polymer conjugates
US5650234A (en) 1994-09-09 1997-07-22 Surface Engineering Technologies, Division Of Innerdyne, Inc. Electrophilic polyethylene oxides for the modification of polysaccharides, polypeptides (proteins) and surfaces
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5738846A (en) 1994-11-10 1998-04-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates and process for preparing the same
AU697440B2 (en) 1994-12-07 1998-10-08 Novozymes A/S Polypeptide with reduced allergenicity
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
SE9503380D0 (sv) * 1995-09-29 1995-09-29 Pharmacia Ab Protein derivatives
EP0856026A1 (en) * 1995-10-19 1998-08-05 Receptagen Corporation Discrete-length polyethylene glycols
US5702717A (en) 1995-10-25 1997-12-30 Macromed, Inc. Thermosensitive biodegradable polymers based on poly(ether-ester)block copolymers
US5908621A (en) 1995-11-02 1999-06-01 Schering Corporation Polyethylene glycol modified interferon therapy
US5747639A (en) 1996-03-06 1998-05-05 Amgen Boulder Inc. Use of hydrophobic interaction chromatography to purify polyethylene glycols
JP2001508783A (ja) 1997-01-29 2001-07-03 ポリマスク・ファーマシューティカルズ・パブリック・リミテッド・カンパニー Ｐｅｇ化法
EP0975809A4 (en) 1997-03-05 2002-10-30 Univ Washington EXAMINATION PROCEDURE FOR DETECTING AGENTS FOR SELECTIVE INHIBITION OF HCV REPLICATION
US5990237A (en) * 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
US7642323B2 (en) 1997-11-06 2010-01-05 Nektar Therapeutics Heterobifunctional poly(ethylene glycol) derivatives and methods for their preparation
US6448369B1 (en) 1997-11-06 2002-09-10 Shearwater Corporation Heterobifunctional poly(ethylene glycol) derivatives and methods for their preparation
US6180095B1 (en) 1997-12-17 2001-01-30 Enzon, Inc. Polymeric prodrugs of amino- and hydroxyl-containing bioactive agents
WO1999030727A1 (en) * 1997-12-17 1999-06-24 Enzon, Inc. Polymeric prodrugs of amino- and hydroxyl-containing bioactive agents
US5981709A (en) 1997-12-19 1999-11-09 Enzon, Inc. α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same
US5985263A (en) 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
US5965119A (en) 1997-12-30 1999-10-12 Enzon, Inc. Trialkyl-lock-facilitated polymeric prodrugs of amino-containing bioactive agents
PT1411075E (pt) * 1998-03-12 2008-08-05 Nektar Therapeutics Al Corp Método para a preparação de conjugados de polímeros
DK1421956T3 (da) 1998-04-28 2007-10-01 Applied Research Systems Polyol-IFN-beta-konjugater
US6703381B1 (en) 1998-08-14 2004-03-09 Nobex Corporation Methods for delivery therapeutic compounds across the blood-brain barrier
CA2376714A1 (en) * 1999-06-11 2001-01-04 Shearwater Corporation Hydrogels derived from chitosan and poly(ethylene glycol) or related polymers
US7144574B2 (en) 1999-08-27 2006-12-05 Maxygen Aps Interferon β variants and conjugates
US6531122B1 (en) 1999-08-27 2003-03-11 Maxygen Aps Interferon-β variants and conjugates
CZ2002521A3 (cs) 1999-08-27 2002-05-15 Maxygen Aps Nové molekuly podobné interferonu beta
AU781839B2 (en) * 1999-12-22 2005-06-16 Nektar Therapeutics Sterically hindered derivatives of water soluble polymers
US6413507B1 (en) * 1999-12-23 2002-07-02 Shearwater Corporation Hydrolytically degradable carbamate derivatives of poly (ethylene glycol)
EP1324779B1 (en) * 2000-09-29 2011-07-20 Schering Corporation Pegylated interleukin-10
TW593427B (en) 2000-12-18 2004-06-21 Nektar Therapeutics Al Corp Synthesis of high molecular weight non-peptidic polymer derivatives
US7053150B2 (en) 2000-12-18 2006-05-30 Nektar Therapeutics Al, Corporation Segmented polymers and their conjugates
GEP20063916B (en) * 2001-02-01 2006-09-11 Biogen Idec Inc Polymer conjugates of neublastin and methods of using same
BR0207576A (pt) 2001-02-27 2004-04-27 Maxygen Aps Variante glicosilada de um polipeptìdeo de interferon beta precursor (ifnb), processos de aumentar a glicosilação in vivo de uma molécula de ifnb precursora, de produzir uma molécula de ifnb glicosilada, para preparar uma variante conjugada e de tratar um mamìfero com esclerose múltiplam composição farmacêutica, molécula de ifnb variante, sequência de nucleotìdeo, vetor de expressão, célula hospedeira de glicosilação conjugado, e, uso de um conjugado
US7009033B2 (en) 2001-07-02 2006-03-07 Polymer Source Inc. Heterofunctional polyethylene glycol and polyethylene oxide, process for their manufacture
DK1436012T3 (en) * 2001-10-18 2018-01-22 Nektar Therapeutics Polymer Conjugates of Opioid Antagonists
JP2005525302A (ja) * 2001-11-20 2005-08-25 ファルマシア・コーポレーション 化学的に修飾されたヒト成長ホルモンコンジュゲート
US7041855B2 (en) 2001-12-11 2006-05-09 Sun Bio, Inc. Monofunctional polyethylene glycol aldehydes
AU2002357806A1 (en) * 2001-12-11 2003-06-23 Sun Bio, Inc. Novel monofunctional polyethylene glycol aldehydes
KR100488351B1 (ko) 2001-12-11 2005-05-11 선바이오(주) 신규한 폴리에틸렌글리콜-프로피온알데히드 유도체
US6956135B2 (en) 2001-12-11 2005-10-18 Sun Bio, Inc. Monofunctional polyethylene glycol aldehydes
US6916962B2 (en) 2001-12-11 2005-07-12 Sun Bio, Inc. Monofunctional polyethylene glycol aldehydes
EP1476181B1 (en) * 2002-01-18 2016-03-23 Biogen MA Inc. Polyalkylene polymer compounds and uses thereof
WO2004022630A2 (en) 2002-09-09 2004-03-18 Nektar Therapeutics Al, Corporation Water-soluble polymer alkanals
AU2003303635B2 (en) 2002-12-26 2009-07-23 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates of interferon-beta with enhanced biological potency
US20110165122A1 (en) * 2009-11-10 2011-07-07 The Regents Of The University Of California Method for targeted and sustained antiviral therapy

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000023114A2 (en) * 1998-10-16 2000-04-27 Biogen, Inc. Polymer conjugates of interferon beta- 1a and their uses

Also Published As

Publication number Publication date
DK1476181T3 (en) 2016-05-23
EP3025726B1 (en) 2019-11-20
PL213322B1 (pl) 2013-02-28
PT3025726T (pt) 2020-01-09
GEP20074024B (en) 2007-01-10
HUE047557T2 (hu) 2020-04-28
NO2017013I2 (no) 2018-08-20
HK1224185A1 (zh) 2017-08-18
CZ2004877A3 (cs) 2004-12-15
BG108839A (bg) 2005-04-30
JP6030717B2 (ja) 2016-11-24
HK1072721A1 (zh) 2005-09-09
EP3669887A1 (en) 2020-06-24
HK1143553A1 (en) 2011-01-07
ZA200406555B (en) 2005-11-30
JP2016014022A (ja) 2016-01-28
MEP35608A (en) 2011-02-10
KR20040081463A (ko) 2004-09-21
JP2005526151A (ja) 2005-09-02
LU93162I2 (fr) 2016-10-03
HUE028163T2 (en) 2016-11-28
CY1122841T1 (el) 2021-10-29
HUS1600035I1 (hu) 2016-10-28
NZ534708A (en) 2007-05-31
CA2952488A1 (en) 2003-07-31
NO2017013I1 (no) 2017-04-10
EA011829B1 (ru) 2009-06-30
CA2952488C (en) 2019-05-07
NL300826I2 (no) 2017-03-16
NO20151082A1 (no) 2015-08-26
WO2003061577A2 (en) 2003-07-31
CA2473526A1 (en) 2003-07-31
AU2003210564B2 (en) 2008-10-23
PL372728A1 (en) 2005-08-08
GEP20064024B (en) 2007-01-10
US8524660B2 (en) 2013-09-03
HU230473B1 (hu) 2016-07-28
IS7353A (is) 2004-07-15
HUP0500457A3 (en) 2012-09-28
ES2774801T3 (es) 2020-07-22
KR100964411B1 (ko) 2010-06-15
CN101700401A (zh) 2010-05-05
WO2003061577A8 (en) 2008-11-20
HUP0500457A2 (hu) 2005-08-29
CA2840490A1 (en) 2003-07-31
CA2753899C (en) 2014-03-25
MXPA04006855A (es) 2005-04-19
EP1476181B1 (en) 2016-03-23
DK3025726T3 (da) 2019-12-09
CA2840490C (en) 2017-02-28
WO2003061577A3 (en) 2003-10-02
CA2473526C (en) 2013-10-22
EA200400962A1 (ru) 2005-06-30
SI3025726T1 (sl) 2020-03-31
EE200400105A (et) 2004-12-15
BE2016C040I2 (no) 2022-05-17
RS63504A (en) 2007-02-05
US20050107277A1 (en) 2005-05-19
IS2989B (is) 2017-11-15
ME00239B (me) 2011-05-10
US8017733B2 (en) 2011-09-13
NO20043422L (no) 2004-10-11
ES2566797T3 (es) 2016-04-15
BG66525B1 (bg) 2016-04-28
CA2753899A1 (en) 2003-07-31
PL397261A1 (pl) 2012-03-26
BR0306993A (pt) 2005-09-06
CN1630530A (zh) 2005-06-22
JP2009235409A (ja) 2009-10-15
JP2012255156A (ja) 2012-12-27
EP3025726A1 (en) 2016-06-01
NO339857B1 (no) 2017-02-06
CN101700401B (zh) 2013-08-14
EP1476181A4 (en) 2008-11-19
JP2013136756A (ja) 2013-07-11
CY2016027I2 (el) 2017-06-28
CY2016027I1 (el) 2017-06-28
EA009783B1 (ru) 2008-04-28
US20120014916A1 (en) 2012-01-19
EA200701386A1 (ru) 2007-10-26
JP5275125B2 (ja) 2013-08-28
BRPI0306993B1 (pt) 2020-03-10
RS55578B1 (sr) 2017-06-30
SI1476181T1 (sl) 2016-10-28
IL163006A (en) 2011-01-31
BRPI0306993B8 (pt) 2021-05-25
SK3102004A3 (sk) 2005-01-03
UA82184C2 (uk) 2008-03-25
EP1476181A2 (en) 2004-11-17
EE05509B1 (et) 2012-02-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO344612B1 (no) Farmasøytisk preparat omfattende interferon beta (IFN β) og konjugat omfattende reaksjonsprodukter av en aktivert polyalkylenglykolpolymer samt fremgangsmåte for fremstilling av slike.
AU2003210564A1 (en) Polyalkylene glycol with moiety for conjugating biologically active compound
JP2005526151A5 (no)
US20170049904A1 (en) Polyalkylene polymer compounds and uses thereof
KR20070110162A (ko) 폴리에틸렌 글리콜-인터페론 알파 접합체

Legal Events

Date Code Title Description
MK1K Patent expired