ES2566797T3 - Compuestos de polímero de polialquileno y usos de éstos - Google Patents
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Abstract
Un conjugado que tiene la estructura según la Fórmula XXIIa: Fórmula XXIIa:**Fórmula** en la que P es un polímero de polialquilen glicol; X es O; Z es un grupo alquilo o heteroalquilo C1 a C20 de cadena lineal o ramificada, saturado o insaturado, alquilo cíclico o heteroalquilo cíclico C3 a C8 saturado o insaturado, un grupo arilo o heteroarilo sustituido o no sustituido o un alcarilo sustituido o no sustituido en el que el alquilo es un grupo alquilo o heteroalcarilo C1 a C20 saturado o insaturado, en el que los sustituyentes se seleccionan del grupo que consiste en halógeno, hidroxilo, carbonilo, carboxilato, éster, formilo, acilo, tiocarbonilo, tioéster, tioacetato, tioformato, alcoxilo, fosforilo, fosfonato, fosfinato, amino, amido, amidina, imina, ciano, nitro, azido, sulfhidrilo, sulfato, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, sulfonilo, heterociclilo, aralquilo, resto aromático, resto heteroaromático, imino, sililo, éter, y alquiltiol; R* es un resto de unión formado de la reacción de un resto seleccionado del grupo que consiste en aldehído, hidrato de aldehído, y acetal con un compuesto biológicamente activo; B es un compuesto biológicamente activo, en el que el compuesto biológicamente activo es un interferón-beta; y n es 0 o un número entero de 1 a 5.
Description
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análogos de oligonucleótidos, azúcares, oligosacáridos, células, virus, liposomas, micropartículas, superficies y micelas.
Las clases de agentes biológicamente activos que son adecuados para uso con la descripción incluyen, pero no están limitados a, quimioquinas, linfoquinas, anticuerpos, receptores solubles, agentes anti-tumorales, agentes antiansiedad, hormonas, factores de crecimiento, antibióticos, fungicidas, agentes fungiestáticos, agentes anti-virales, agentes esteroideos, agentes antimicrobianos, agentes germicidas, agentes antipiréticos, agentes antidiabéticos, broncodilatadores, agentes antidiarreicos, agentes de dilatación coronaria, glicósidos, espasmolíticos, agentes antihipertensores, antidepresivos, agentes antiansiedad, otros agentes psicoterapéuticos, corticosteroides, analgésicos, anticonceptivos, fármacos anti-inflamatorios no esteroideos, agentes que disminuyen la glucosa en sangre, agentes que disminuyen el colesterol, agentes antiiconvulsivos, otros agentes antiepilépticos, inmunomoduladores, anticolinérgicos, simpatolíticos, simpaticomiméticos, agentes vasodilatadores, anticoagulantes, antiarrítmicos, prostaglandinas que tienen varias actividades farmacológicas, diuréticos, auxiliares de sueño, agentes antihistamínicos, agentes antineoplásicos, agentes oncolíticos, antiandrógenos, agentes antimalaria, agentes antilepra, y varios otros tipos de fármacos. Véase Goodman and Gilman's The Basis of Therapeutics (Novena Edición, Pergamon Press Inc., EEUU, 1996) y el Índice Merck (Decimotercera Edición, Merck & Co., Inc., EEUU, 2001).
Los compuestos biológicamente activos incluyen cualquier compuesto que presenta una respuesta biológica en su forma presente, o cualquier compuesto que presenta una respuesta biológica como resultado de una conversión química de su estructura de su forma presente. Por ejemplo, los compuestos biológicamente activos incluirán cualquier compuesto que contiene un grupo protector que, cuando se escinde, resulta en un compuesto que presenta una respuesta biológica. Dicha escisión puede ser el resultado, por ejemplo, de una reacción in vivo del compuesto con enzimas endógenas o una reacción de pre-administración del compuesto, incluyendo su reacción con los PGC activados de esta descripción. Como ejemplo adicional, los compuestos biológicamente activos también incluirán cualquier compuesto que experimenta estereotransformación, in vivo o ex vivo, para formar un compuesto que presenta una respuesta o acción biológica.
Los compuestos biológicamente activos contienen típicamente varios sitios reactivos en los que es factible la unión covalente del PGC activado. Por ejemplo, los grupos amino pueden experimentar acilaciones, los grupos sulfhidrilo pueden experimentar reacciones de adición y alquilaciones, los grupos carbonilo y carboxilo pueden experimentar acilaciones, y los grupos aldehído e hidroxilo pueden experimentar aminación y aminación reductora. Una o más de estas reacciones puede usarse en la preparación de los compuestos biológicamente activos modificados con polialquilen glicol de la descripción. Además, los compuestos biológicamente activos pueden modificarse para formar restos reactivos en el compuesto que facilitan dichas reacciones y la conjugación resultante al PGC activado.
Los expertos en la técnica reconocerán numerosos mecanismos de reacción disponibles para facilitar la conjugación del PGC activado a un compuesto biológicamente activo. Por ejemplo, cuando el resto activador, R, es un grupo hidrazida, puede acoplarse covalentemente a restos sulfhidrilo, azúcar, y carbonilo en los compuestos biológicamente activos (después de que estos restos hayan experimentado oxidación para producir aldehídos). La reacción de restos activadores de hidrazida (R) con aldehídos en los compuestos biológicamente activos (B') crea una unión hidrazona (R*-B). Cuando R es un grupo maleimida, puede hacerse reaccionar con un grupo sulfhidrilo para formar una unión tioéter estable. Si no están presentes sulfhidrilos en el compuesto biológicamente activo, pueden crearse mediante reducción de disulfuro o a través de la tiolación con 2-iminotiolano o SATA. Cuando R es un imidoéster reaccionará con aminas primarias en B' para formar una unión imidoamida. La conjugación imidoéster se realiza habitualmente entre pH 8,5-9,0. Cuando se conectan los PGC activados a proteínas biológicamente activas, los imidoésteres proporcionan una ventaja sobre otros grupos R ya que no afectan la carga global de la proteína. Portan una carga positiva a pH fisiológico, como las aminas primarias que reemplazan. Las reacciones imidoéster se llevan a cabo entre 00C y la temperatura ambiente (por ejemplo, a 40C), o a temperaturas elevadas en condiciones anhidras. Cuando R es un NHS-éster, su diana principal son las aminas primarias. Los grupos α-amino accesibles, por ejemplo aquellos presentes en el extremo N de péptidos y proteínas, reaccionan con los NHSésteres para formar un enlace amida covalente.
En algunos casos, R*-B es una unión hidrolíticamente estable. Una unión hidrolíticamente estable significa que la unión es sustancialmente estable en agua y que no reacciona con agua a pH útiles, por ejemplo, la unión es estable en condiciones fisiológicas durante un periodo de tiempo prolongado, quizá incluso indefinidamente. En otros casos, R*-B es una unión hidrolíticamente inestable o degradable. Una unión hidrolíticamente inestable significa que la unión es degradable en agua o en disoluciones acuosas, incluyendo por ejemplo, la sangre. Las uniones enzimáticamente inestables o degradables también significa que la unión puede degradarse por una o más enzimas.
Como se entiende en la técnica, los polímeros de polialquileno y relacionados pueden incluir uniones degradables en el núcleo del polímero o en el grupo conector entre el núcleo del polímero y uno o más de los grupos funcionales terminales de la molécula de PGC. Por ejemplo, las uniones éster formadas por la reacción, por ejemplo, de PGC ácidos carboxílicos o PGC activado ácidos carboxílicos con grupos alcohol en un compuesto biológicamente activo se hidrolizan generalmente en condiciones fisiológicas para liberar el agente. Otras uniones hidrolíticamente degradables incluyen uniones carbonato; uniones imina que resultan de la reacción de una amina y un aldehído (Véase, por ejemplo, Ouchi et al., Polymer Preprints, 38(1): 582-3 (1997)); uniones éster fosfato formadas por la
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reacción de un alcohol con un grupo fosfato; uniones acetal que son el producto de reacción de un aldehído y un alcohol; uniones ortoéster que son el producto de reacción de un formato y un alcohol; uniones peptídicas formadas por un grupo amino, por ejemplo, en un extremo del PGC, y un grupo carboxilo de un péptido; y uniones oligonucleotídicas formadas por un grupo fósforamidita, por ejemplo, en el extremo de un polímero, y un grupo hidroxilo 5' de un oligonucleótido.
El polialquilen glicol P, puede ser polietilen glicol, que tiene la estructura de Fórmula II:
Fórmula II:
en la que a es un número entero de 4 a 10.000 y E es hidrógeno o un grupo alquilo C1 a C20 de cadena lineal o ramificada, un marcador detectable, o un resto adecuado para formar un enlace entre el compuesto de Fórmula I y un compuesto biológicamente activo o precursor de éste.
Así, cuando E es un resto adecuado para formar un enlace entre el compuesto de Fórmula I y un compuesto biológicamente activo o precursor de éste, E puede ser un ácido carboxílico, éster, aldehído, hidrato de aldehído, acetal, hidroxi, hidroxi protegido, carbonato, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, tiol sustituido o no sustituido, halógeno, amina sustituida o no sustituida, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida, succinimidilo, isocianato, isotiocianato, ditiopiridina, vinilpiridina, yodoacetamida, epóxido, hidroxisuccinimidilo, azol, maleimida, sulfona, alilo, vinilsulfona, tresilo, sulfo-N-succinimidilo, diona, mesilo, tosilo, o glioxal. Debe entenderse que E debe ser compatible con R de manera que no ocurra la reacción entre E y R.
Por "marcador detectable" se quiere decir cualquier marcador capaz de detección. Los ejemplos no limitativos incluyen isótopos radiactivos, restos fluorescentes, restos fosforescentes, restos quimioluminiscentes, y puntos cuánticos. Otros marcadores detectables incluyen etiquetas de biotina, cisteína, histidina, hemaglutinina, myc o flag.
En algunos casos, E tiene la estructura según la Fórmula III o Fórmula IV:
Fórmula III
Fórmula IV
Cada Q, X, Y, Z, m, y n son como se han definido anteriormente, y cada W es, independientemente, hidrógeno o un alquilo C1 a C7.
En esta clase de compuestos, R'' es un resto adecuado para formar un enlace entre el compuesto de Fórmula III y un compuesto biológicamente activo o precursor de éste; y R''' es un resto adecuado para formar un enlace entre el compuesto de Fórmula IV y un compuesto biológicamente activo o precursor de éste.
R'' y R''' pueden ser de ácido carboxílico, éster, aldehído, hidrato de aldehído, acetal, hidroxi, hidroxi protegido, carbonato, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, tiol sustituido o no sustituido, halógeno, amina sustituida o no sustituida, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida, succinimidilo, isocianato, isotiocianato, ditiopiridina, vinilpiridina, yodoacetamida, epóxido, hidroxisuccinimidilo, azol, maleimida, sulfona, alilo, vinilsulfona, tresilo, sulfo-Nsuccinimidilo, diona, mesilo, tosilo, o glioxal. Debe entenderse que R'' y R''' deben ser compatibles con R de manera que no ocurra la reacción con R.
Tal y como se usa en la presente memoria, R'' y R''', después de conjugación con un compuesto biológicamente activo o precursor de éste, forman restos de unión como se ha definido anteriormente. Así, R** es un resto de unión formado por la reacción del grupo R'' o R''' en el PGC activado con un grupo funcional reactivo en el compuesto biológicamente activo, de manera que resulta una unión covalente entre el PGC y el compuesto biológicamente activo. R y R'' o R''' pueden ser el mismo resto o restos diferentes, y el compuesto biológicamente activo unido a cada uno puede ser el mismo o diferente.
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Tal y como se usa en la presente memoria, el término "alquilo" se refiere al radical de grupos alifáticos saturados, incluyendo grupos alquilo de cadena lineal, grupos alquilo de cadena ramificada, grupos cicloalquilo (alicíclico), grupos cicloalquilo sustituidos con alquilo, y grupos alquilo sustituidos con cicloalquilo. En casos preferidos, un alquilo de cadena lineal o cadena ramificada tiene 30 o menos átomos de carbono en su núcleo (por ejemplo, C1-C30 para cadena lineal, C3-C30 para cadena ramificada), y más preferiblemente 20 o menos. Asimismo, los cicloalquilos preferidos tienen de 3-10 átomos de carbono en su estructura de anillo, y más preferiblemente tienen 5, 6, ó 7 carbonos en la estructura de anillo.
Además, el término "alquilo" (o "alquilo inferior") se pretende que incluya tanto "alquilos no sustituidos" como "alquilos sustituidos", refiriéndose los últimos a restos alquilo que tienen sustituyentes que reemplazan un hidrógeno en uno o más carbonos del núcleo hidrocarbonado. Dichos sustituyentes pueden incluir, por ejemplo, un halógeno, un hidroxilo, un carbonilo (tal como un carboxilo, un alcoxicarbonilo, un formilo, o un acilo), un tiocarbonilo (tal como un tioéster, un tioacetato, o un tioformato), un alcoxilo, un fosforilo, un fosfonato, un fosfinato, un amino, un amido, una amidina, una imina, un ciano, un nitro, un azido, un sulfhidrilo, un alquiltio, un sulfato, un sulfonato, un sulfamoilo, un sulfonamido, un sulfonilo, un heterociclilo, un aralquilo, o un resto aromático o heteroaromático. Los expertos en la técnica entenderán que los restos sustituidos en la cadena hidrocarbonada pueden estar ellos mismos sustituidos, si es apropiado. Por ejemplo, los sustituyentes de un alquilo sustituido pueden incluir formas sustituidas y no sustituidas de grupos amino, azido, imino, amido, fosforilo (incluyendo fosfonato y fosfinato), sulfonilo (incluyendo sulfato, sulfonamido, sulfamoilo, y sulfonato), y sililo, así como éteres, alquiltios, carbonilos (incluyendo cetonas, aldehídos, carboxilatos, y ésteres), -CF3, -CN. Los cicloalquilos pueden estar sustituidos además con alquilos, alquenilos, alcoxis, alquiltios, aminoalquilos, alquilos sustituidos con carbonilo, -CF3, -CN.
El término "aralquilo", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a un grupo alquilo sustituido con un grupo arilo (por ejemplo, un grupo aromático o heteroaromático). Los grupos aralquilo ejemplares incluyen, pero no están limitados a, bencilo y más generalmente (CH2)nPh, en el que Ph es un fenilo o fenilo sustituido, y n es 1, 2, ó 3.
Los términos "alquenilo" y "alquinilo" se refieren a grupos alifáticos insaturados análogos en longitud y posible sustitución a los alquilos descritos anteriormente, pero que contienen al menos un enlace doble o triple, respectivamente.
A no ser que el número de carbonos se especifique de otra forma, "alquilo inferior" tal y como se usa en la presente memoria significa un grupo alquilo, como se ha definido anteriormente, pero que tiene de uno a diez carbonos, más preferiblemente de uno a seis átomos de carbono en su estructura de núcleo. Asimismo, "alquenilo inferior" y "alquinilo inferior" tienen longitudes de cadena similares. Los grupos alquilo preferidos son alquilos inferiores. En realizaciones preferidas, un sustituyente designado en la presente memoria como alquilo es un alquilo inferior.
El término "arilo" tal y como se usa en la presente memoria incluye grupos aromáticos de un único anillo de 5, 6, y 7 miembros que pueden incluir de cero a cuatro heteroátomos, por ejemplo, benceno, pirrol, furano, tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol, triazol, pirazol, piridina, pirazina, piridazina y pirimidina. Aquellos grupos arilo que tienen heteroátomos en la estructura de anillo también pueden referirse como "heterociclos arilo" o "heteroaromáticos". El anillo aromático puede estar sustituido en una o más posiciones del anillo con los sustituyentes que se han descrito anteriormente, por ejemplo, halógeno, azida, alquilo, aralquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, hidroxilo, alcoxilo, amino, nitro, sulfhidrilo, imino, amido, fosfonato, fosfinato, carbonilo, carboxilo, sililo, éter, alquiltio, sulfonilo, sulfonamido, cetona, aldehído, éster, heterociclilo, restos aromáticos o heteroaromáticos, -CF3, -CN, o semejantes. El término "arilo" también incluye sistemas de anillo policíclicos que tiene dos o más anillos cíclicos en los que dos o más carbonos son comunes a dos anillos adyacentes (los anillos son "anillos fusionados") en los que al menos uno de los anillos es aromático, por ejemplo, los otros anillos cíclicos pueden ser cicloalquilos, cicloalquenilos, cicloalquinilos, arilos, y/o heterociclilos.
Los términos orto, meta y para se aplican a bencenos disustituidos en 1,2, 1,3, y 1,4, respectivamente. Por ejemplo, los nombres 1,2-dimetilbenceno y orto-dimetilbenceno son sinónimos.
Los términos “heterociclilo” o “grupo heterocíclico” se refieren a estructuras de anillo de 3 a 10 miembros, más preferiblemente anillos de 3 a 7 miembros, cuyas estructuras de anillo incluyen uno a cuatro heteroátomos. Los heterociclos también pueden ser policiclos. Los grupos heterociclilo incluyen, por ejemplo, tiofeno, , tiantreno, furano, pirano, isobenzofurano, cromeno, xanteno, fenoxatiina, pirrol, imidazol, pirazol, isotiazol, isoxazol, piridina, pirazina, pirimidina, piridazina, indolizina, isoindol, indol, indazol, purina, quinolizina, isoquinolina, quinolina, ftalazina, naftiridina, quinoxalina, quinazolina, cinolina, pteridina, carbazol, carbolina, fenantridina, acridina, pirimidina, fenantrolina, fenazina, fenarsazina, fenotiazina, furazán, fenoxazina, pirrolidina, oxolano, tiolano, oxazol, piperidina, piperazina, morfolina, lactonas, lactamas tales como azetidinonas y pirrolidinonas, sultamas, sultonas. El anillo heterocíclico puede estar sustituido en una o más posiciones con sustituyentes como se ha descrito anteriormente, tales como, por ejemplo, halógeno, alquilo, aralquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, hidroxilo, amino, nitro, sulfhidrilo, imino, amido, fosfonato, fosfinato, carbonilo, carboxilo, sililo, éter, alquiltio, sulfonilo, cetona, aldehído, éster, un heterociclilo, un resto aromático o heteroaromático. -CF3, -CN.
El término "carbociclo", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a un anillo aromático o no aromático en el que cada átomo del anillo es carbono.
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en la que R9 y R'11 son como se han definido anteriormente. El término "sulfamoilo" se reconoce en la técnica e incluye un resto que puede representarse por la fórmula general:
en la que R9 y R10 son como se han definido anteriormente.
El término "sulfonilo", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a un resto que puede representarse por la fórmula general:
en la que R44 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, 10 heterociclilo, arilo, o heteroarilo.
El término "sulfóxido" tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a un resto que puede representarse por la fórmula general:
en la que R44 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, 15 heterociclilo, aralquilo, o arilo.
Se entenderá que "sustitución" o "sustituido con" incluye la condición implícita de que dicha sustitución está de acuerdo con la valencia permitida del átomo sustituido y el sustituyente y que la sustitución resulta en un compuesto estable, por ejemplo, que no experimenta espontáneamente una transformación tal como por reorganización, ciclación, eliminación, etc.
20 Tal y como se usa en la presente memoria, el término "sustituido" se contempla que incluya todos los sustituyentes permisibles de compuestos orgánicos. En un aspecto amplio, los sustituyentes permisibles incluyen sustituyentes acíclicos y cíclicos, ramificados y no ramificados, carbocíclicos y heterocíclicos, aromáticos y no aromáticos de compuestos orgánicos. Los sustituyentes ilustrativos incluyen, por ejemplo, los descritos anteriormente en la presente memoria. Los sustituyentes permisibles pueden ser uno o más y el mismo o diferente para compuestos
25 orgánicos apropiados. Para los propósitos de esta invención, los heteroátomos tales como nitrógeno pueden tener sustituyentes hidrógeno y/o cualesquiera sustituyentes permisibles de compuestos orgánicos descritos en la presente memoria que satisfagan las valencias de los heteroátomos. Esta invención no se pretende que esté limitada de ninguna manera por los sustituyentes permisibles de compuestos orgánicos.
Una lista completa de las abreviaturas utilizadas por los químicos orgánicos con experiencia en la técnica aparece
30 en el primer número de cada volumen del Journal of Organic Chemistry; esta lista se presenta típicamente en una tabla titulada Standard List of Abbreviations.
En algunos casos, los compuestos de la descripción tienen la estructura según la Fórmula V:
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Cuando E es un marcador detectable, el marcador puede ser, por ejemplo, un isótopo radiactivo, un resto fluorescente, un resto fosforescente, un resto quimioluminiscente, o un punto cuántico.
Cuando E es un resto adecuado para formar un enlace entre el compuesto de Fórmula XV y un compuesto biológicamente activo B, E puede formar un enlace con otra molécula del compuesto biológicamente activo (B) de manera que el compuesto de polialquilen glicol activado se une en cualquier extremo a una molécula del mismo tipo de compuesto biológicamente activo, para producir un dímero de la molécula.
En algunos casos, E forma un enlace con un compuesto biológicamente activo distinto de B, creando un heterodímero de compuestos biológicamente activos o precursores de éstos.
En otros casos, E forma un enlace adicional con el compuesto biológicamente activo, B, de manera que tanto E como R están unidos a través de diferentes grupos funcionales de la misma molécula del compuesto biológicamente activo o precursor de éste.
Cuando E es capaz de formar un enlace con una molécula biológicamente activa o precursor de ésta, E puede ser igual a o diferente de R y se elige de restos ácido carboxílico, éster, aldehído, hidrato de aldehído, acetal, hidroxi, hidroxi protegido, carbonato, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, tiol sustituido o no sustituido, halógeno, amina sustituida o no sustituida, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida, succinimidilo, isocianato, isotiocianato, ditiopiridina, vinilpiridina, yodoacetamida, epóxido, hidroxisuccinimidilo, azol, maleimida, sulfona, alilo, vinilsulfona, tresilo, sulfo-N-succinimidilo, diona, mesilo, tosilo, y glioxal.
Cuando E puede formar un enlace con un compuesto biológicamente activo o precursor de éste, en algunos casos, E puede tener la Fórmula III o Fórmula IV:
Fórmula III
Fórmula IV
en la que cada Q, X, Y, Z, m, y n son, independientemente, como se ha definido anteriormente, y cada W es, independientemente, hidrógeno o un alquilo C1 a C7, R'' es un resto adecuado para formar un enlace entre el compuesto de Fórmula III y un compuesto biológicamente activo o precursor de éste, y R''' es un resto adecuado para formar un enlace entre el compuesto de Fórmula IV y un compuesto biológicamente activo o precursor de éste.
R'' y R''' se eligen, independientemente, de restos ácido carboxílico, éster, aldehído, hidrato de aldehído, acetal, hidroxi, hidroxi protegido, carbonato, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, tiol sustituido o no sustituido, halógeno, amina sustituida o no sustituida, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida, succinimidilo, isocianato, isotiocianato, ditiopiridina, vinilpiridina, yodoacetamida, epóxido, hidroxisuccinimidilo, azol, maleimida, sulfona, alilo, vinilsulfona, tresilo, sulfo-N-succinimidilo, diona, mesilo, tosilo, y glioxal.
Cuando se une en ambos extremos a un compuesto biológicamente activo o precursor de éste, estas moléculas bifuncionales pueden representarse según la Fórmula XX o Fórmula XXI:
Fórmula XX:
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isotiocianato, ditiopiridina, vinilpiridina, yodoacetamida, epóxido, hidroxisuccinimidilo, azol, maleimida, sulfona, alilo, vinilsulfona, tresilo, sulfo-N-succinimidilo, diona, mesilo, tosilo, y glioxal, y pueden ser iguales o diferentes de R.
Cuando se unen a ambos extremos a un compuesto biológicamente activo o precursor de éste, estas moléculas bifuncionales pueden representarse según la Fórmula XXIV o Fórmula XXV:
Fórmula XXIV:
Fórmula XXV:
en la que cada X e Y es independientemente O, S, CO, CO2, COS, SO, SO2, CONR′, SO2NR′, o NR′, y cada R' y Z es, independientemente, hidrógeno, un grupo alquilo o heteroalquilo C1 a C20 de cadena lineal o ramificada, saturado
o insaturado.
Q es un alquilo cíclico o heteroalquilo cíclico C3 a C8 saturado o insaturado (incluyendo estructuras de anillo bicíclicas fusionadas y bicíclicas con puente), un grupo arilo o heteroarilo sustituido o no sustituido, o un alcarilo sustituido o no sustituido en el que el alquilo es un grupo alquilo o heteroalcarilo C1 a C20 saturado o insaturado. Si están presentes, los sustituyentes pueden ser halógeno, hidroxilo, carbonilo, carboxilato, éster, formilo, acilo, tiocarbonilo, tioéster, tioacetato, tioformato, alcoxilo, fosforilo, fosfonato, fosfinato, amino, amido, amidina, imina, ciano, nitro, azido, sulfhidrilo, sulfato, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, sulfonilo, heterociclilo, aralquilo, resto aromático, resto heteroaromático, imino, sililo, éter, o alquiltio.
Cada W es, independientemente, hidrógeno o un alquilo C1 a C7, m es cero o uno, a es un número entero de 4 a 10.000, y cada n es independientemente 0 o un número entero de 1 a 5.
R* y R** son independientemente restos de unión como se ha descrito anteriormente, B y B' son independientemente moléculas biológicamente activas y pueden ser iguales o diferentes.
E (a través de R'' o R''') puede formar un enlace con otra molécula del compuesto biológicamente activo (B) de manera que el compuesto de polialquilen glicol activado se une en cualquier extremo a una molécula del mismo tipo de compuesto biológicamente activo, para producir un dímero de la molécula.
En algunos casos, E (a través de R'' o R''') forma un enlace con un compuesto biológicamente activo distinto de B, creando un heterodímero de compuestos biológicamente activos o precursores de éstos.
En otros casos, E (a través de R'' o R''') forma un enlace adicional con el compuesto biológicamente activo, B, de manera que tanto E como R están unidos a través de diferentes grupos funcionales de la misma molécula del compuesto biológicamente activo o precursor de éste.
R'' y R''' pueden ser iguales que o diferentes de R, y se eligen de restos ácido carboxílico, éster, aldehído, hidrato de aldehído, acetal, hidroxi, hidroxi protegido, carbonato, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, tiol sustituido o no sustituido, halógeno, amina sustituida o no sustituida, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida, succinimidilo, isocianato, isotiocianato, ditiopiridina, vinilpiridina, yodoacetamida, epóxido, hidroxisuccinimidilo, azol, maleimida, sulfona, alilo, vinilsulfona, tresilo, sulfo-N-succinimidilo, diona, mesilo, tosilo, y glioxal.
En algunos casos, R* o R** es grupo metileno y B o B' es una molécula biológicamente activa que contiene un grupo amino, en el que el grupo metileno forma un enlace con el grupo amino en B. Por ejemplo, la amina puede ser el extremo amino de un péptido, una amina de la cadena lateral de un aminoácido de un péptido, o una amina de un sustituyente de glicosilación de un péptido glicosilado. En algunos casos, el péptido es un interferón, tal como interferón-beta, por ejemplo, interferón-beta-1a. En algunos casos, este tipo de enlace se forma por una reacción de alquilación reductora.
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El conjugado PGC IFN-beta se administra en una cantidad farmacológicamente efectiva para tratar cualquiera de las afecciones descritas anteriormente, y se basa en la actividad de IFN beta del conjugado polimérico. El término "cantidad farmacológicamente efectiva" significa la cantidad de un fármaco o agente farmacéutico que incitará la respuesta biológica o médica de un tejido, sistema, animal o ser humano que se busca por el investigador o médico. Es una cantidad que es suficiente para producir significativamente una respuesta clínica positiva mientras se mantienen niveles disminuidos de efectos secundarios. La cantidad de PGC IFN-beta que puede administrarse a un sujeto que lo necesita está en el intervalo de 0,01-100 μg/kg, o más preferiblemente 0,01-10 μg/kg, administrado en dosis únicas o divididas.
La administración de las dosificaciones descritas puede ser en días alternos, pero preferiblemente ocurre una vez a la semana o una vez cada dos semanas. Las dosis se administran durante al menos un periodo de 24 semanas por inyección.
La administración de la dosis pueden ser oral, tópica, intravenosa, subcutánea, intramuscular, o cualquier otro método sistémico aceptable. Tomando como base el criterio del médico responsable, la cantidad de fármaco administrada y el régimen de tratamiento usado dependerá, por supuesto, de la edad, sexo e historial médico del paciente que se está tratando, el recuento de neutrófilos (por ejemplo, la gravedad de la neutropenia), la gravedad de la afección patológica específica y la tolerancia del paciente al tratamiento como se manifiesta por toxicidad local y por efectos secundarios sistémicos.
En la práctica, los conjugados de la descripción, incluyendo la presente invención, se administran en cantidades que serán suficientes para inhibir o prevenir afecciones o enfermedades médicas no deseadas en un sujeto, tal como un mamífero, y se usan en la forma más adecuada para dichos propósitos. Las composiciones son preferiblemente adecuadas para uso interno e incluyen una cantidad efectiva de un compuesto farmacológicamente activo de la descripción, solo o en combinación con otros agentes activos, con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. Los compuestos son especialmente útiles porque tienen una toxicidad muy baja, si es que la tienen.
Los conjugados descritos en la presente memoria pueden formar el ingrediente activo de una composición farmacéutica, y se administran típicamente en una mezcla con diluyentes, excipientes o vehículos farmacéuticos adecuados (referidos colectivamente en la presente memoria como materiales "vehiculares") seleccionados adecuadamente respecto a la forma pretendida de administración, esto es, comprimidos orales, cápsulas, elixires, jarabes. Las composiciones incluirán típicamente una cantidad efectiva de un compuesto activo o la sal farmacéuticamente aceptable de éste, y además, también puede incluir cualesquiera materiales vehiculares como se usan habitualmente en las ciencias farmacéuticas. Dependiendo del modo pretendido de administración, las composiciones pueden estar en forma de dosificación sólida, semi-sólida o líquida tal como, por ejemplo, inyectables, comprimidos, supositorios, píldoras, cápsulas de liberación prolongada, polvos, líquidos, suspensiones,
o semejantes, preferiblemente en dosificaciones unitarias.
Las composiciones farmacéuticas convencionales que comprenden una cantidad farmacológicamente efectiva de un conjugado, por ejemplo, PGC IFN-beta, junto con vehículos, adyuvantes, diluyentes, conservantes y/o solubilizantes farmacéuticamente aceptables pueden usarse en la práctica de la descripción, incluyendo la presente invención. Las composiciones farmacéuticas de interferón incluyen diluyentes de varios tampones (por ejemplo, arginina, Tris-HCl, acetato, fosfato) que tienen un intervalo de pH y fuerza iónica, vehículos (por ejemplo, albúmina de suero humano), solubilizantes (por ejemplo, tween, polisorbato), y conservantes (por ejemplo, alcohol bencílico). Véase, por ejemplo, la Pat. U.S. No. 4.496.537.
La administración de los compuestos activos descritos en la presente memoria puede ser mediante cualquiera de los modos de administración aceptados para agentes terapéuticos. Estos métodos incluyen administración sistémica o local tal como modos de administración oral, nasal, parenteral, transdérmico, subcutáneo, o tópico.
Por ejemplo, para administración oral en la forma de un comprimido o cápsula (por ejemplo, una cápsula de gelatina), el componente de fármaco activo puede combinarse con un vehículo inerte oral, no tóxico, farmacéuticamente aceptable tal como etanol, glicerol, agua. Además, cuando se desea o es necesario, también pueden incorporarse en la mezcla aglutinantes, lubricantes, agentes disgregantes, y agentes colorantes adecuados. Los aglutinantes adecuados incluyen almidón, silicato de magnesio aluminio, pasta de almidón, gelatina, metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio y/o polivinilpirrolidona, azúcares, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas tales como goma arábiga, de tragacanto o alginato de sodio, polietilen glicol, ceras. Los lubricantes usados en estas formas de dosificación incluyen oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio, sílice, talco, ácido esteárico, su sal de magnesio o calcio, y/o polietilen glicol. Los disgregantes incluyen, sin limitación, almidón, metil celulosa, agar, bentonita, almidones de goma de xantano, agar, ácido algínico o su sal de sodio, o mezclas efervescentes. Los diluyentes incluyen, por ejemplo, lactosa, dextrosa, sacarosa, manitol, sorbitol, celulosa y/o glicina.
Los conjugados de la descripción, incluyendo la presente invención, también pueden administrarse en dichas formas de dosificación oral como comprimidos o cápsulas de liberación prolongada y liberación sostenida, píldoras, polvos, gránulos, elixires, tinturas, suspensiones, jarabes, y emulsiones.
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Las composiciones líquidas, particularmente inyectables, pueden prepararse, por ejemplo, mediante disolución, dispersión, etc. El compuesto activo se disuelve en o se mezcla con un disolvente farmacéuticamente puro tal como, por ejemplo, agua, disolución salina, dextrosa acuosa, glicerol, etanol, para formar de esta manera la disolución o suspensión inyectable. Además, pueden formularse formas sólidas adecuadas para disolución en líquido antes de la inyección. Las composiciones inyectables son preferiblemente disoluciones o suspensiones acuosas isotónicas. Las composiciones pueden esterilizarse y/o contener adyuvantes, tales como agentes conservantes, estabilizantes, humectantes o emulsionantes, estimuladores de la disolución, sales para regular la presión osmótica y/o tampones. Además, también pueden contener otras sustancias terapéuticamente valiosas.
Los conjugados de la presente descripción, incluyendo la presente invención, pueden administrarse en forma intravenosa (por ejemplo, bolo o infusión), intraperitoneal, subcutánea o intramuscular, todas usando formas muy conocidas para los expertos en las técnicas farmacéuticas. Los inyectables pueden prepararse en formas convencionales, bien como disoluciones o suspensiones líquidas.
La administración parenteral inyectable se usa generalmente para inyecciones o infusiones subcutáneas, intramusculares o intravenosas. Por ejemplo, cuando se usa una inyección subcutánea para administrar 0,01-100 μg/kg, o más preferiblemente 0,01-10 μg/kg de IFN-beta PEGilado durante una semana, pueden administrarse dos inyecciones de 0,005-50 μg/kg, o más preferiblemente 0,005-5 μg/kg, respectivamente, a las 0 y 72 horas. Además, una estrategia para administración parenteral emplea el implante de un sistema de liberación lenta o liberación sostenida, que asegura que se mantiene un nivel constante de dosificación, según la Pat. U.S. No. 3.710.795.
Además los conjugados preferidos para la presente descripción, incluyendo la presente invención, pueden administrarse en forma intranasal mediante el uso tópico de vehículos intranasales adecuados, o mediante rutas transdérmicas, usando las formas de parches cutáneos transdérmicos muy conocidas para los expertos en la técnica. Para ser administrada en la forma de un sistema de administración transdérmico, la administración de la dosificación será, por supuesto, continua en lugar de intermitente a lo largo del régimen de dosificación. Otras preparaciones tópicas preferidas incluyen cremas, pomadas, lociones, aerosoles, pulverizadores y geles, en los que la cantidad administrada será 10-100 veces la dosis proporcionada típicamente por administración parenteral.
Para las composiciones sólidas, pueden usarse excipientes que incluyen grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio. El compuesto activo definido anteriormente, también puede formularse como supositorios usando, por ejemplo, polialquilen glicoles, por ejemplo, propilen glicol, como el vehículo. En algunos casos, los supositorios se preparan ventajosamente a partir de emulsiones o suspensiones grasas.
Los conjugados de la presente descripción, incluyendo la presente invención, también pueden administrarse en la forma de sistemas de administración de liposomas, tales como vesículas unilamelares pequeñas, vesículas unilamelares grandes y vesículas multilamelares. Los liposomas pueden formarse a partir de una variedad de fosfolípidos, que contienen colesterol, estearilamina, o fosfatidilcolinas. En algunas realizaciones, una película de componentes lipídicos se hidrata con una disolución acuosa de fármaco para formar una capa lipídica que encapsula el fármaco, como se describe en la Pat. U.S. No. 5.262.564.
Los conjugados de la presente descripción también pueden administrarse por el uso de fusiones de inmunoglobulina como vehículos individuales a los que se acoplan las moléculas de compuesto. Los compuestos de la presente descripción también pueden acoplarse con polímeros solubles como vehículos de fármaco dirigibles. Dichos polímeros pueden incluir polivinilpirrolidona, copolímero de pirano, polihidroxipropil-metacrilamida-fenol, polihidroxietilaspanamidafenol, o polietilenoxidepolilisina sustituida con residuos de palmitoilo. Los conjugados también pueden acoplarse a proteínas, tales como, por ejemplo, proteínas receptoras y albúmina. Además, los compuestos de la presente descripción pueden acoplarse a una clase de polímeros biodegradables útiles para conseguir la liberación controlada de un fármaco, por ejemplo, ácido poliláctico, poliépsilon caprolactona, ácido polihidroxi butírico, poliortoésteres, poliacetales, polidihidropiranos, policianoacrilatos y copolímeros en bloque de hidrogeles entrecruzados o anfipáticos.
Si se desea, la composición farmacéutica que se va a administrar también puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponadores del pH, y otras sustancias tales como, por ejemplo, acetato de sodio, oleato de trietanolamina, etc.
El régimen de dosificación que utiliza los conjugados se selecciona según una variedad de factores incluyendo tipo, especie, edad, peso, sexo y afección médica del paciente; la gravedad de la afección que se va a tratar; la ruta de administración; la función renal y hepática del paciente; y el compuesto particular o sal de éste empleada. También se consideran la actividad de los compuestos de la descripción y la sensibilidad del paciente a efectos secundarios. Un médico o veterinario experto en la técnica puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad efectiva del fármaco requerida para prevenir, contrarrestar o parar el progreso de la afección.
Las dosificaciones orales de la presente descripción, cuando se usan para los efectos indicados, variarán entre aproximadamente 0,01-100 μg/kg/día oralmente, o más preferiblemente 0,01-10 μg/kg/día oralmente. Las composiciones se proporcionan preferiblemente en la forma de comprimidos ranurados que contienen 0,5-5.000 μg,
o más preferiblemente 0,5-500 μg de ingrediente activo.
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Para cualquier ruta de administración, pueden usarse dosis divididas o únicas. Por ejemplo, los compuestos de la presente invención pueden administrarse diariamente o semanalmente, en una dosis única, o la dosificación total puede administrarse en dosis divididas de dos, tres o cuatro.
Cualquiera de las composiciones farmacéuticas anteriores puede contener 0,1-99%, 1-70%, o, preferiblemente, 150% de los compuestos activos de la descripción como ingredientes activos.
Como se ha descrito anteriormente, el curso de la enfermedad y su respuesta a tratamientos con fármaco puede seguirse por el examen clínico y los datos de laboratorio. La eficacia de la terapia de la invención se determina mediante el grado en el que se alivian los signos y síntomas previamente descritos de una afección, por ejemplo, hepatitis crónica, y el grado en el que se eliminan o reducen sustancialmente los efectos secundarios normales del interferón (es decir, síntomas semejantes a la gripe tales como fiebre, dolor de cabeza, enfriamiento, mialgia, fatiga, etc. y síntomas relacionados con el sistema nervioso central tales como depresión, parestesia, concentración alterada etc.).
En algunas realizaciones, un compuesto polialquilado de la descripción (por ejemplo, un interferón PEGilado) se administra conjuntamente con uno o más agentes farmacéuticos útiles para el tratamiento de una afección particular. Por ejemplo, una proteína polialquilada puede administrarse en combinación con un agente antiviral conocido o agente para el tratamiento de una infección viral. Dichos compuestos antivirales incluyen, por ejemplo, ribavirina, levovirina, MB6866, y zidovudina 3TC, FTC, aciclovir, ganciclovir, viramida, VX497, VX-950, e ISIS-14803.
El conjugado y antiviral pueden administrarse simultáneamente (por ejemplo, los agentes se administran a un paciente conjuntamente); administrarse secuencialmente (por ejemplo, los agentes se administran al paciente uno después del otro); o administrarse alternativamente (por ejemplo, los agentes se administran en una serie repetida, tal como agente A después agente B, después agente A, etc.).
En la práctica de la descripción, el PGC IFN-beta preferido (por ejemplo, PEG IFN-beta) puede administrarse a pacientes infectados con el virus de la hepatitis C. Se prefiere el uso de PEG IFN-beta-1a.
Los pacientes se seleccionan para tratamiento a partir de pacientes positivos para anticuerpo anti-VHC con hepatitis activa crónica documentada por biopsia.
Con el fin de seguir el curso de la replicación de VHC en los sujetos en respuesta al tratamiento con fármaco, el ARN de VHC puede medirse en muestras de suero, por ejemplo, mediante un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa anidada que usa dos conjuntos de cebadores derivados de las regiones génicas no estructurales NS3 y NS4 del genoma de VHC. Véanse, Farci et al., 1991, New Eng. J. Med. 325:98-104. Ulrich et al., 1990. J. Clin. Invest., 86:1609-1614.
La actividad antiviral puede medirse por cambios en la titulación del ARN de VHC. Los datos del ARN de VHC pueden analizarse comparando las titulaciones al final del tratamiento con una medida de línea base pre-tratamiento. La reducción en el ARN de VHC sobre la semana 4 proporciona evidencia de actividad antiviral de un compuesto. Véanse, Kleter et al., 1993, Antimicrob. Agents Chemother. 37(3):595-97; Orito et al., 1995, J. Medical Virology, 46:109-115. Los cambios de al menos dos órdenes de magnitud (>2 log) se interpretan como evidencia de actividad antiviral.
Una persona que padece infección de hepatitis C crónica puede presentar uno o más de los signos o síntomas siguientes: (a) alanina aminotransferasa (ALT) sérica elevada, (b) ensayo positivo para anticuerpos anti-VHC, (c) presencia de VHC como se demuestra por un ensayo positivo para ARN de VHC, (d) estigmas clínicos de enfermedad hepática crónica, (e) daño hepatocelular. Dichos criterios no sólo pueden usarse para diagnosticar hepatitis C, sino que pueden usarse para evaluar la respuesta de un paciente al tratamiento con fármaco.
Se sabe que la alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) elevadas ocurren en hepatitis C incontrolada, y una respuesta completa al tratamiento se define generalmente como la normalización de estas enzimas séricas, particularmente ALT. Véase, Davis et al., 1989, New Eng. J. Med. 321:1501-1506. ALT es una enzima liberada cuando las células del hígado se destruyen y es sintomática de infección por VHC. El interferón causa la síntesis de la enzima 2′,5′-oligoadenilato sintetasa (2′5′OAS), que a su vez, resulta en la degradación del ARNm viral. Véase, Houglum, 1983, Clinical Pharmacology 2:20-28. El incremento en los niveles séricos de la 2'5'OAS coincide con la disminución de los niveles de ALT.
El examen histológico de muestras de biopsia de hígado puede usarse como un segundo criterio para evaluación. Véase, por ejemplo, Knodell et al., 1981, Hepatology 1:431-435, cuyo Índice de Actividad Histológica (inflamación portal, necrosis fragmentaria en puentes, daño lobular, y fibrosis) proporciona un método de puntuación para la actividad de la enfermedad.
La seguridad y tolerabilidad o tratamiento pueden determinarse por evaluaciones clínicas y medida de los recuentos de células sanguíneas blancas y neutrófilos. Esto puede evaluarse mediante monitorización periódica de parámetros hematológicos, por ejemplo, recuentos de células sanguíneas blancas, neutrófilos, plaquetas, y células sanguíneas rojas).
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En general, el alcohol aromático (E) se hace reaccionar con el haluro de alquilo (A) para formar el mono éter (F). El grupo alcohol remanente del compuesto F se convierte en el haluro (por ejemplo, bromuro) en el Compuesto G, que se hace reaccionar con el polialquilen glicol (P-OH) para proporcionar el éter (H). Este compuesto se convierte en el aldehído (J) a través de hidroboración al alcohol primario (I) seguido de oxidación. En estos compuestos, n es un número entero de cero a cinco, d es cero o un número entero de uno a cuatro, y Z puede ser un grupo alquilo o heteroalquilo C1 a C20 de cadena lineal o ramificada, saturado o insaturado. Z también puede ser un alquilo cíclico o heteroalquilo cíclico C3 a C7 saturado o insaturado, un grupo arilo o heteroarilo sustituido o no sustituido o un alcarilo sustituido o no sustituido (el alquilo es un alquilo C1 a C20 saturado o insaturado) o grupo heteroalcarilo. Para los compuestos sustituidos, los sustituyentes pueden ser halógeno, hidroxilo, carbonilo, carboxilato, éster, formilo, acilo, tiocarbonilo, tioéster, tioacetato, tioformato, alcoxilo, fosforilo, fosfonato, fosfinato, amino, amido, amidina, imina, ciano, nitro, azido, sulfhidrilo, sulfato, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, sulfonilo, heterociclilo, aralquilo, resto aromático, resto heteroaromático, imino, sililo, éter, o alquiltio.
Además, T1 y T2 son, independientemente, ausente, o un grupo alquilo o heteroalquilo C1 a C20 de cadena lineal o ramificada, saturado o insaturado, y puede estar en orto, meta, o para entre sí. Cada L (cuando está presente) es, independientemente, un grupo alquilo o heteroalquilo C1 a C20 de cadena lineal o ramificada, saturado o insaturado, alquilo cíclico o heteroalquilo cíclico C3 a C7 saturado o insaturado, un grupo arilo o heteroarilo sustituido o no sustituido o un alcarilo sustituido o no sustituido en el que el alquilo es un grupo alquilo o heteroalcarilo C1 a C20 saturado o insaturado. Los sustituyentes pueden ser halógeno, hidroxilo, carbonilo, carboxilato, éster, formilo, acilo, tiocarbonilo, tioéster, tioacetato, tioformato, alcoxilo, fosforilo, fosfonato, fosfinato, amino, amido, amidina, imina, ciano, nitro, azido, sulfhidrilo, sulfato, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, sulfonilo, heterociclilo, aralquilo, resto aromático, resto heteroaromático, imino, sililo, éter, o alquiltio.
Habitualmente, P-OH es polietilen glicol (PEG) o monometoxi polietilen glicol (mPEG) que tiene un peso molecular de 5.000 a 40.000 Da.
Por ejemplo, la síntesis de mPEG-O-p-metilfenil-O-2-metilpropionaldehído (8) se muestra en el Esquema IV;
Esquema IV:
A una disolución de 4-hidroxibencilalcohol (2,4 g, 20 mmoles) en THF (50 mL) y agua (2,5 mL) se añadió en primer lugar hidróxido de sodio (1,5 g, 37,5 mmoles) y entonces 3-bromo-2-metilpropeno (4,1 g, 30 mmoles). Esta mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 16 h. A la mezcla se añadió 10% ácido cítrico (2,5 mL) y el disolvente se eliminó en vacío. El residuo se extrajo con acetato de etilo (3×15 mL) y las capas orgánicas combinadas se lavaron con NaCl saturado (10 mL), se secaron y se concentraron para proporcionar el compuesto 4, (3,3 g, 93%). La 1HRMN (CDCl3, 400 MHz) mostró δ 7,29 (m, 2H), 6,92 (m, 2H), 5,14 (s, 1H), 5,01 (s, 1H), 4,56 (s, 2H), 4,46 (s, 2H), 1,85 (s, 3H).
Se añadieron cloruro de mesilo (MsCl; 2,5 g, 15,7 mmoles) y trietil amina (TEA; 2,8 mL, 20 mmoles) a una disolución del compuesto 4 (2,0 g, 11,2 mmoles) en CH2Cl2 (25 mL) a 00C. y la reacción se puso en la nevera durante 16 h. Un procesamiento habitual rindió un aceite amarillo claro (2,5 g, 87%). La 1HRMN (CDCl3, 400 MHz) mostró δ 7,31 (m,
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Los compuestos PEG-Dihidrourocanato-NHS también se generan mediante una reacción de Mitsunobu, como se muestra en el Esquema X:
Esquema X
Los compuestos PEG-Dihidrocinamato-NHS también se generan a partir de un alcohol aromático como se muestra en el Esquema XI:
Esquema XI
Los PEG-benzofuranos y PEG-indoles se generan como se muestra en los Esquemas XII y XIII:
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Esquema XVI
5 D) Compuestos generados mediante reacción con heterociclos
Los compuestos PEG se hacen reaccionar con nitrógenos en anillo o no en anillo en heterociclos para formar especies PEG reactivas. Las reacciones representativas se muestran en los Esquemas XVII para aminopirrolidina y XVIII para varias piperazinas:
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sus mezclas de reacción respectivas y se sometieron a una serie de ensayos de caracterización para averiguar la identidad, pureza, y potencia de las proteínas modificadas.
A continuación aparece una descripción detallada de la preparación y caracterización de IFN-β-1a humano modificado con mPEG-O-2-metilpropionaldehído de 20 kDa, mPEG-O-m-metilfenil-O-2-metilpropionaldehído de 20 kDa, y mPEG-O-p-fenilacetaldehído de 20 kDa.
A) Preparación y caracterización de IFN-β-1a modificado con mPEG-O-2-metilpropionaldehído de 20 kDa
Se PEGiló IFN-β-1a humano en su extremo N con mPEG-O-2-metilpropionaldehído de 20 kDa. El producto de la química de alquilación reductora usado para incorporar el PEG en el núcleo de IFN-β-1a resultó en la formación de una unión amina que es extremadamente estable frente a la degradación. El IFN-β-1a PEGilado se sometió a caracterización extensa, incluyendo análisis por SDS-PAGE, cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), mapeo peptídico, y evaluación de actividad en un ensayo antiviral in vitro. La pureza del producto, según se mide por SDS-PAGE y SEC, fue mayor del 90%. En la muestra PEGilada no hubo evidencia de agregados. Los niveles residuales de IFN-β-1a no modificado en el producto estuvieron por debajo del límite de cuantificación, pero parecieron representar aproximadamente 1% del producto. La actividad específica del IFN-β-1a PEGilado en el ensayo de actividad antiviral se redujo aproximadamente 2 veces comparado con el IFN-β-1a no modificado (CE50= 32 pg/mL para IFN-β-1a modificado con mPEG-O-2-metilpropionaldehído de 20 kDa frente a CE50= 14 pg/mL para IFN-β-1a no modificado). El IFN-β-1a PEGilado a granel se formuló a 30 μg/mL en disolución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,3, que contenía 14 mg/mL de albúmina de suero humano (HSA), similar a la formulación usada para AVONEX® (Biogen, Cambridge, Mass.) que se ha sometido a caracterización extensa. El material fue suministrado como un líquido congelado que se almacenó a -700C.
Las propiedades del IFN-β-1a modificado con mPEG-O-2-metilpropionaldehído de 20 kDa se resumen en la Tabla 1:
Tabla 1. Propiedades del IFN-β-1a modificado con mPEG-O-2-metilpropionaldehído de 20 kDa
Eficiencia de PEGilación >90%
Proporción IFN-β-1a/PEG 1:1
Pureza >90%
Sitio de unión Extremo N
Actividad antiviral CE50 32 pg/mL
1. Preparación de IFN-β-1a modificado con mPEG-O-2-metilpropionaldehído de 20 kDa.
Se diluyeron 10 mL de AVONEX® no formulado (IFN-β-1a a granel intermedio, un lote clínico de fármaco a granel que pasó todos los ensayos para uso en seres humanos, a 250 μg/mL en 100 mM fosfato de sodio pH 7,2, 200 mM NaCl) con 12 mL de 165 mM MES pH 5,0 y 50 μL de 5 N HCl. La muestra se cargó en una columna de SP-Sefarosa FF de 300 μL (Pharmacia). La columna se lavó con 3 x 300 μL de 5 mM fosfato de sodio pH 5,5, 75 mM NaCl, y la proteína se eluyó con 5 mM fosfato de sodio pH 5,5, 600 mM NaCl. Las fracciones de elución se analizaron para su absorbancia a 280 nm y se estimó la concentración de IFN-β-1a en las muestras usando un coeficiente de extinción de 1,51 para una disolución de 1 mg/mL. Las fracciones del pico se combinaron para proporcionar una concentración de IFN-β-1a de 3,66 mg/mL, que se diluyó posteriormente a 1,2 mg/mL con agua.
A 0,8 mL del IFN-β-1a del combinado eluido de la SP-Sefarosa diluido, se añadieron 0,5 M fosfato de sodio pH 6,0 hasta 50 mM, se añadió cianoborohidruro de sodio (Aldrich) hasta 5 mM, y se añadió mPEG-O-2metilpropionaldehído de 20 kDa hasta 5 mg/mL. La muestra se incubó a temperatura ambiente durante 16 h en la oscuridad. El IFN-β-1a PEGilado se purificó de la mezcla de reacción en una columna SP-Sefarosa FF de 0,5 mL como sigue: 0,6 mL de la mezcla de reacción se diluyeron con 2,4 mL de 20 mM MES pH 5,0, y se cargó en la columna de SP-Sefarosa. La columna se lavó con fosfato de sodio pH 5,5, 75 mM NaCl y el IFN-β-1a PEGilado se eluyó de la columna con 25 mM MES pH 6,4, 400 mM NaCl. El IFN-β-1a PEGilado se purificó adicionalmente en una columna de FPLC de exclusión molecular Superosa 6 HR 10/30 con 5 mM fosfato de sodio pH 5,5, 150 mM NaCl como la fase móvil. La columna de de exclusión molecular (25 mL) se corrió a 20 mL/h y se recogieron fracciones de 0,5 mL. Las fracciones de elución se analizaron para contenido de proteína por absorbancia a 280 nm, se combinaron, y se determinó la concentración de proteína del combinado. La concentración de IFN-β-1a PEGilado se indica en equivalentes de IFN ya que el resto de PEG no contribuye a la absorbancia a 280 nm. Se tomaron para análisis muestras del combinado, y el resto se diluyó hasta 30 μg/mL con tampón de formulación que contenía HSA, se alicuotó a 0,25 mL/vial, y se almacenó a -700C.
2. Espectro UV de IFN-β-1a modificado con mPEG-O-2-metilpropionaldehído de 20 kDa purificado.
El espectro UV (240-340 nm) de IFN-β-1a modificado con mPEG-O-2-metilpropionaldehído de 20 kDa se obtuvo usando la muestra a granel formulada pre-HSA. La muestra PEGilada presentó un máximo de absorbancia a 278279 nm y un mínimo de absorbancia a 249-250 nm, consistente con la observada para el intermedio a granel IFN-β
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1a no modificado. La concentración de proteína del producto PEGilado se estimó a partir del espectro usando un coeficiente de extinción de ε2800,1%=1,51. La concentración de proteína del granel PEGilado fue 0,23 mg/mL. No había turbidez presente en la muestra como es evidente por una ausencia de absorbancia a 320 nm.
- 3.
- Caracterización de IFN-β-1a modificado con mPEG-O-2-metilpropionaldehído de 20 kDa por SDS-PAGE.
Se sometieron 4 μg de IFN-β-1a no modificado y modificado con mPEG-O-2-metilpropionaldehído de 20 kDa a SDS-PAGE en condiciones reductoras en un gel con un gradiente 10-20%. El gel se tiñó con azul brillante de Coomassie R-250, y se muestra en la Figura 1 (Carril A, marcadores de peso molecular (desde la parte superior a la inferior; 100 kDa, 68 kDa, 45 kDa, 27 kDa, y 18 kDa, respectivamente); Carril B, IFN-β-1a no modificado; Carril C, IFN-β-1a modificado con mPEG-O-2-metilpropionaldehído de 20 kDa). El análisis por SDS-PAGE de IFN-β-1a modificado con mPEG-O-2-metilpropionaldehído de 20 kDa reveló una única banda principal con una masa aparente de 55 kDa, consistente con la modificación por un único PEG. No se detectaron formas de masa superior que resultan de la presencia de grupos PEG adicionales. En el producto purificado, PEGilado, se detectó IFN-β-1a no modificado; sin embargo, la cantidad está por debajo del límite de cuantificación. El nivel de IFN-β-1a no modificado en la preparación se estima que representa sólo aproximadamente el 1% de la proteína total.
- 4.
- Caracterización de IFN-β-1a modificado con mPEG-O-2-metilpropionaldehído de 20 kDa por cromatografía de exclusión por tamaño.
Se sometieron IFN-β-1a no modificado y modificado con mPEG-O-2-metilpropionaldehído de 20 kDa a SEC en una columna de FPLC de exclusión molecular analítica Superosa 6 HR10/30 usando PBS pH 7,2 como la fase móvil. La columna se corrió a 20 mL/h y el eluyente se monitorizó para absorbancia a 280 nm, como se muestra en la Figura
2: Panel A: estándares de peso molecular (670 kDa, tiroglobulina; 158 kDa, gamma globulina; 44 kDa, ovalbúmina; 17 kDa, mioglobina; 1,3 kDa, vitamina B12), Panel B: IFN-β-1a modificado con mPEG-O-2-metilpropionaldehído de 20 kDa; Panel C: IFN-β-1a no modificado. El IFN-β-1a modificado con mPEG-O-2-metilpropionaldehído de 20 kDa eluyó como un único pico afilado con una masa molecular aparente de aproximadamente 200 kDa, consistente con el volumen hidrodinámico grande del PEG. No se observó evidencia de agregados. Se detectó IFN-β-1a no modificado en la preparación pero estaba por debajo del límite de cuantificación. Tomando como base el tamaño del pico, el IFN-β-1a no modificado representa el 1% o menos del producto, consistente con lo observado usando SDS-PAGE.
5. Análisis de IFN-β-1a modificado con mPEG-O-2-metilpropionaldehído de 20 kDa por mapeo peptídico.
La especificidad de la reacción de PEGilación se evaluó por mapeo peptídico. El IFN-β-1a no modificado y modificado con mPEG-O-2-metilpropionaldehído de 20 kDa se digirieron con endoproteinasa Lys-C de Achromobacter (Wako Bioproducts) y los productos de escisión resultantes se fraccionaron por HPLC de fase reversa en una columna Vydac C4 usando un gradiente de 30 min de 0 a 70% acetonitrilo, en 0,1% TFA. El eluyente de la columna se monitorizó para absorbancia a 214 nm.
Todos los péptidos predichos de la digestión por endoproteinasa Lys-C de IFN-β-1a se han identificado previamente por secuenciación N-terminal y espectrometría de masas (Pepinsky et al., (2001) J Pharmacology and Experimental Therapeutics 297:1059), y, de éstos, sólo el péptido que contiene el extremo N de IFN-β-1a se alteró por modificación con mPEG-O-2-metilpropionaldehído de 20 kDa; como es evidente por su desaparición del mapa peptídico. Los datos de mapeo indican por lo tanto que el resto PEG se une específicamente a este péptido. Los datos indican además que la modificación por PEG está dirigida al extremo N de la proteína ya que sólo la modificación N-terminal resultaría en la pérdida específica de este péptido.
B) Preparación y caracterización de IFN-β-1a modificado con mPEG-O-m-metilfenil-O-2-metilpropionaldehído de 20 kDa
Se PEGiló IFN-β-1a humano en el extremo N con mPEG-O-m-metilfenil-O-2-metilpropionaldehído de 20 kDa. El producto de la química de alquilación reductora que se usó para incorporar el PEG en el núcleo de IFN-β-1a resulta en la formación de una unión amina que es extremadamente estable frente a la degradación. El IFN-β-1a PEGilado se sometió a caracterización extensa, incluyendo análisis por SDS-PAGE, SEC, mapeo peptídico, y evaluación de actividad en un ensayo antiviral in vitro. La pureza del producto, según se mide por SDS-PAGE y SEC, fue mayor del 95%. En la muestra de IFN-β-1a PEGilado no hubo evidencia de agregados. Los niveles residuales de IFN-β-1a no modificado en el producto estuvieron por debajo del límite de cuantificación, pero parecieron representar aproximadamente 1% del producto. La actividad específica del IFN-β-1a PEGilado en el ensayo de actividad antiviral se redujo aproximadamente 2 veces comparado con el IFN-β-1a no modificado (CE50= 31 pg/mL para IFN-β-1a modificado con mPEG-O-m-metilfenil-O-2-metilpropionaldehído de 20 kDa frente a CE50= 14 pg/mL para IFN-β-1a no modificado). El IFN-β-1a PEGilado a granel se formuló a 30 μg/mL en PBS pH 7,2, que contenía 15 mg/mL de HSA, similar a la formulación usada para AVONEX® que se ha sometido a caracterización extensa. El material fue suministrado como un líquido congelado que se almacenó a -700C.
Las propiedades del IFN-β-1a modificado con mPEG-O-m-metilfenil-O-2-metilpropionaldehído de 20 kDa se resumen en la Tabla 2:
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como se muestra en la Figura 6: Carril A: marcadores de peso molecular (desde la parte superior a la inferior; 100 kDa, 68 kDa, 45 kDa, 27 kDa, 18 kDa, y 15 kDa, respectivamente); Carriles B, C, D, y E: IFN-β-1a modificado con mPEG-O-p-fenilacetaldehído tomado en el día 0, 2, 5, y 7, respectivamente. No se observó evidencia de agregación
o degradación de IFN-β-1a PEGilado incluso después de 7 días a 370C.
EJEMPLO 3. Actividad específica de IFN-β-1a humano PEGilado en un ensayo antiviral in vitro
La actividad antiviral específica de muestras de IFN-β-1a PEGilado se ensayó en células de carcinoma de pulmón humano (células A549) que se habían expuesto al virus de la encefalomiocarditis (EMC), y usando el agente de tinción metabólico 2,3-bis[2-Metoxi-4-nitro-5-sulfo-fenil]-2H-tetrazolio-5-carboxianilida (MTT; M-5655, Sigma, St. Louis, MO) como una medida de las células metabólicamente activas que permanecen después de la exposición al virus. Brevemente, las células A549 se pretrataron durante 24 h bien con IFN-β-1a no modificado o PEGilado (empezando a 66,7 pg/mL y diluyendo de manera seriada 1,5 veces hasta 0,8 pg/mL) antes del pulso con el virus. Las células se pulsaron durante 2 días con virus EMC a una dilución que resultó en la muerte celular completa en ausencia de IFN. Las placas se revelaron con MTT. Se preparó una disolución madre de MTT a 5 mg/mL en PBS y se esterilizó por filtración, y 50 μL de esta disolución se diluyeron en los cultivos celulares (100 μL por pocillo). Después de incubar a temperatura ambiente durante 30-60 min, la disolución MTT/medio se desechó, las células se lavaron con 100 μL PBS, y finalmente el agente de tinción metabolizado se solubilizó con 100 μL 1,2 N HCl en isopropanol. Las células viables (según se determina por la presencia del agente de tinción) se cuantificaron por absorbancia a 450 nm. Los datos se analizaron representando la absorbancia frente a la concentración de IFN-β-1a, y la actividad de IFN-β-1a se definió como la concentración a la que el 50% de las células estaban muertas, es decir, el 50% de efecto citopático (CE50) o 50% de DO450 máxima, El ensayo se realizó ocho veces para IFN-β-1a no modificado y tres a cuatro veces con las diferentes muestras de IFN-β-1a PEGilado. Para cada ensayo, se obtuvieron puntos de datos en duplicado para cada concentración de proteína. Las representaciones representativas de viabilidad celular frente a la concentración de IFN-β-1a no modificado o PEGilado se muestran en las Figuras 7A y 7B. En la Figura 7A, los símbolos son como sigue: IFN-β-1a no modificado (O), IFN-β-1a modificado con mPEG-O2-metilpropionaldehído de 20 kDa (), IFN-β-1a modificado con mPEG-O-p-metilfenil-O-2-metilpropionaldehído de 20 kDa (∆), e IFN-β-1a modificado con mPEG-O-m-metilfenil-O-2-metilpropionaldehído de 20 kDa (◊). En la Figura 7B, los símbolos son como sigue: IFN-β-1a no modificado (O), IFN-β-1a modificado con mPEG-O-pfenilacetaldehído de 20 kDa (), IFN-β-1a modificado con mPEG-O-p-fenilpropionaldehído de 20 kDa (∆), e IFN-β-1a modificado con mPEG-O-m-fenilacetaldehído de 20 kDa (◊).
Los valores CE50 (la concentración a protección viral mitad de la máxima) para IFN-β-1a modificado con mPEG-O-2metilpropionaldehído de 20 kDa, mPEG-O-p-metilfenil-O-2-metilpropionaldehído de 20 kDa, mPEG-O-m-metilfenil-O2-metilpropionaldehído de 20 kDa, mPEG-O-p-fenilacetaldehído de 20 kDa, mPEG-O-p-fenilpropionaldehído de 20 kDa, y mPEG-O-m-fenilacetaldehído de 20 kDa se muestran en la Tabla 4. Todos los IFN-β-1a PEGilados se modificaron y purificaron a homogeneidad esencialmente como se describe para IFN-β-1a modificado con mPEG-O2-metilpropionaldehído de 20 kDa, IFN-β-1a modificado con mPEG-O-m-metilfenil-O-2-metilpropionaldehído de 20 kDa, e IFN-β-1a modificado con mPEG-O-p-fenilacetaldehído de 20 kDa como se ha descrito anteriormente.
Tabla 4. Actividad antiviral específica de IFN-β-1a no modificados y PEGilados
- Proteína
- CE50 media (pg/mL)
- IFN-β-1a no modificado
- 14 (intervalo 12-16)
- IFN-β-1a modificado con mPEG-O-2-metilpropionaldehído de 20 kDa
- 32 (intervalo 26-37)
- IFN-β-1a modificado con mPEG-O-p-metilfenil-O-2-metilpropionaldehído de 20 kDa
- 41 (intervalo 36-47)
- IFN-β-1a modificado con mPEG-O-m-metilfenil-O-2-metilpropionaldehído de 20 kDa
- 31 (intervalo 27-35)
- IFN-β-1a modificado con mPEG-O-p-fenilacetaldehído de 20 kDa
- 31 (intervalo 25-39)
- IFN-β-1a modificado con mPEG-O-p-fenilpropionaldehído de 20 kDa
- 31 (intervalo 27-34)
- IFN-β-1a modificado con mPEG-O-m-fenilacetaldehído de 20 kDa
- 27 (intervalo 25-29)
EJEMPLO 4. Farmacocinética de IFN-β-1a no modificados y PEGilados administrados intravenosamente en ratas
Se inyectaron intravenosamente a ratas Lewis hembra canuladas bien 80 μg/kg de IFN-β-1a no modificado ó 24 μg/kg de los IFN-β-1a PEGilados siguientes; IFN-β-1a modificado con mPEG-O-2-metilpropionaldehído de 20 kDa, IFN-β-1a modificado con mPEG-O-p-metilfenil-O-2-metilpropionaldehído de 20 kDa, IFN-β-1a modificado con mPEG-O-p-fenilacetaldehído de 20 kDa, IFN-β-1a modificado con mPEG-O-p-fenilpropionaldehído de 20 kDa, IFNβ-1a modificado con mPEG-O-m-fenilacetaldehído de 20 kDa , e IFN-β-1a modificado con mPEG-O-m-metilfenil-O
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contaron bajo aumento fijo en un microscopio de disección. Cada vaso orientado radialmente que entra en la periferia del tumor se puntuó como un único vaso. Cada grupo consistió en tres ratones.
Como se muestra en la Figura 10, una única administración de 1 MU de IFN-β-1a modificado con mPEG-O-2metilpropionaldehído de 20 kDa (grupo C) fue tan efectiva en la reducción del número de neovasos como una administración diaria de 1 MU de IFN-β-1a no modificado (grupo B). Sin embargo, el efecto del IFN-β-1a modificado con mPEG-O-2-metilpropionaldehído de 20 kDa es más pronunciado cuando se considera que la administración diaria del vehículo solo tenía algún efecto inhibidor (comparar el grupo A, vehículo administrado una vez, con el grupo D, vehículo administrado diariamente).
También se ha desarrollado una variedad de otros modelos que pueden usarse para ensayar los efectos antiangiogénicos y anti-neovascularización de las moléculas PEGiladas de la invención. Algunos de estos modelos se han descrito en las Patentes de los Estados Unidos 5.733.876 (31 mar., 1998: “Method of inhibiting angiogenesis”) y
5.135.919 (4 ago., 1992: “Method and a pharmaceutical composition for the inhibition of angiogenesis”). Otros ensayos incluyen el ensayo de la membrana corioalantoidea sin cáscara (CAM) de Taylor y Folkman; Nature
297:307 (1982) y Crum et al., Science 230:1375 (1985); el modelo de anti-angiogénesis del método del saco de aire dorsal de ratón de Folkman et al.; J. Exp. Med. 133: 275 (1971), y el ensayo del microbolsillo corneal en rata Gimbrone, Jr. et al., J. Natl. Cancer Inst. 52:413 (1974) en el que se induce la vascularización corneal en ratas macho adultas de la cepa Sprague-Dawley (Charles River, Japón) implantando 500 ng de bFGF (bovino, R & D Systems, Inc.), impregnado en gránulos de copolímero de etileno-acetato de vinilo, en cada córnea. Además, existe un modelo en el que se induce la angiogénesis en ratones NIH-Swiss o desnudos atímicos (nu/nu) después del implante de células de carcinoma de mama MCF-7 o células de carcinoma de ovario NIH-OVCAR-3 como describen Lindner y Borden; Int. J. Cancer 71:456 (1997). También pueden usarse líneas celulares tumorales adicionales incluyendo (pero no limitado a) células de melanoma maligno humano SK-MEL-1 para inducir la angiogénesis como se ha descrito anteriormente. Pueden ensayarse varias dosis, con varias frecuencias de dosificación, y durante varias duraciones tanto para proteínas IFN-β-1a no modificadas como PEGiladas de la descripción.
Otros métodos para ensayar IFN-β-1 murino PEGilado y de rata para efectos anti-angiogénicos en un modelo animal incluyen (pero no están limitados a) protocolos para el cribado de nuevos agentes anticancerosos potenciales como se describe en el original Cancer Chemotherapy Reports, Parte 3, Vol. 3, No. 2, septiembre 1972 y el suplemento In Vivo Cancer Models, 1976-1982, NIH Publication No. 84-2635, febrero 1984. Debido a la especificidad de especie de los interferones de Tipo I, para evaluar la actividad anti-angiogénica de IFN-β PEGilado en modelos de roedores, se generan preparaciones de IFN-β de roedor PEGilado (por ejemplo, murino y de rata). Dichos métodos de cribado se ejemplifican por un protocolo para ensayar los efectos anti-angiogénicos de IFN-β murino PEGilado en Carcinoma de Pulmón de Lewis implantado subcutáneamente:
Origen de la línea tumoral
Esta línea tumoral surgió espontáneamente en 1951 como un carcinoma del pulmón en un ratón C57BL/6.
Resumen del procedimiento de ensayo
Un fragmento de tumor se implanta subcutáneamente en la región axilar de un ratón B6D2F1. El agente de ensayo (es decir, un interferón PEGilado de la invención) se administra a varias dosis, subcutáneamente (SC) o intraperitonealmente (IP) en múltiples días después del implante del tumor. El parámetro medido es el tiempo de supervivencia medio. Los resultados se expresan como un porcentaje del tiempo de supervivencia control.
Animales
Propagación: ratones C57BL/6.
Ensayo: ratones B6D2F1.
Peso: los ratones están en un intervalo de peso de 3 g, con un peso máximo de 18 g para machos y 17 g para hembras.
Sexo: se usa un sexo para todos los animales de ensayo y control en un experimento.
Fuente: una fuente, si es factible, para todos los animales en un experimento.
Tamaño del experimento
Diez animales por grupo de ensayo.
Transferencia tumoral
PROPAGACIÓN:
Fragmento: preparar un fragmento de 2-4 mm de un tumor donante SC.
53 5
10
15
20
25
30
35
40
45
Tiempo: día 13-15.
Sitio: implantar el fragmento SC en la región axilar con una punción en la región inguinal.
ENSAYO:
Fragmento: preparar un fragmento de 2-4 mm de un tumor donante SC.
Tiempo: día 13-15.
Sitio: implantar el fragmento SC en la región axilar con una punción en la región inguinal.
Programa de ensayo
Día 0: implantar el tumor. Realizar cultivos bacterianos. Ensayar compuesto control positivo en cada experimento con numeración impar. Preparar los materiales. Registrar las muertes diariamente.
Día 1: evaluar los cultivos. Desechar el experimento si está contaminado. Aleatorizar a los animales. Tratar como se instruye (en el día 1 y en los días siguientes).
Día 2: volver a evaluar los cultivos. Desechar el experimento si está contaminado.
Día 5: pesar Día 2 y día de la evaluación de la toxicidad del agente de ensayo inicial.
Día 14: día de control de muerte temprana.
Día 48: día de control no recogida.
Día 60: final y evaluar el experimento. Examinar los pulmones para tumor.
Control de calidad
Programar el compuesto control positivo (NSC 26271; Citoxán a una dosis de 100 mg/kg/inyección) en cada experimento con numeración impar, cuyo régimen es intraperitoneal en el Día 1 solo. El límite menor para Ensayo/Control para el control positivo es 140%. El tiempo de supervivencia medio control no tratado aceptable es 19-35,6 días.
Evaluación
El parámetro medido es tiempo de supervivencia medio. Computar los pesos corporales medios de los animales para el Día 1 y Día 5, computar la proporción Ensayo/Control para todos los grupos de ensayo. Se computan los pesos corporales medios de los animales para día de estadificación y día de evaluación final. La proporción Ensayo/Control se computa para todos los grupos de ensayo con >65% supervivientes en el Día 5. Un valor de la proporción Ensayo/Control <86% indica toxicidad. Una diferencia excesiva en el cambio de peso corporal (ensayo menos control) también puede usarse para evaluar la toxicidad.
Criterios para actividad
Una proporción Ensayo/Control inicial mayor de o igual a 140% se considera necesaria para demostrar actividad moderada. Un valor de la proporción Ensayo/Control reproducible de más de o igual a 150% se considera actividad significativa.
EJEMPLO 8: Modelos in vivo para ensayar los efectos anti-proliferativos y anti-tumorales de IFN-β-1a humano PEGilado e IFN-β de roedor PEGilados
Varios modelos in vivo están disponibles para ensayar los efectos anti-proliferativos y anti-tumorales de los IFN-β-1a humanos no modificados y PEGilados de la descripción. En un modelo descrito por Bailon et al., Bioconjugate Chemistry 12:195 (2001), se implanta a ratones desnudos atímicos (Harlan) subcutáneamente 2 x 106 células renales humanas A498, renales humanas ACHN, o renales humanas G402 bajo el flanco trasero y se deja 3-6 semanas para permitir que los tumores se desarrollen. Se administra IFN-β-1a humano no modificado o PEGilado a varias dosis, con varias frecuencias de dosificación, y durante varias duraciones, y se mide el volumen tumoral y se compara entre los tratamientos. En otro modelo descrito por Lindner y Borden, J. Interferon Cytokine Res 17: 681 (1997), se implanta a ratones BALB/c hembra ooferectomizadas desnudas atímicas (nu/nu) 2 x 106 células de carcinoma de mama humano MCF-7 (más estradiol), MDA-MB-231, MDA-MB468, o BT-20, células de carcinoma de ovario humano NIH-OVCAR-3, células de carcinoma de colon humano HT-29, o células de melanoma maligno humano SK-MEL-1 o FEMX, en la dermis que cubre las glándulas mamarias cerca de las axilas, y se evalúa el tamaño de los tumores como una función del tiempo. Se administra IFN-β-1a humano no modificado o PEGilado a varias dosis, con varias frecuencias de dosificación, y durante varias duraciones, y se mide el volumen tumoral y se compara entre los tratamientos. Otros modelos para ensayar los efectos anti-proliferativos y anti-tumorales de IFN-β1a humano PEGilado incluyen (pero no están limitados a) modelos de cáncer de pulmón locales y metastásicos
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