EA009783B1 - Полиалкиленгликоль с остатком для конъюгации биологически активного соединения - Google Patents

Полиалкиленгликоль с остатком для конъюгации биологически активного соединения Download PDF

Info

Publication number
EA009783B1
EA009783B1 EA200400962A EA200400962A EA009783B1 EA 009783 B1 EA009783 B1 EA 009783B1 EA 200400962 A EA200400962 A EA 200400962A EA 200400962 A EA200400962 A EA 200400962A EA 009783 B1 EA009783 B1 EA 009783B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
group
alkyl
substituted
saturated
residue
Prior art date
Application number
EA200400962A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200400962A1 (ru
Inventor
КоЧунг Лин
Р. Блэйк Пепински
Лин Лин Чэнь
Донна М. Хесс
Эдвард Й. Лин
Расселл К. Петтер
Даррен П. Бэйкер
Original Assignee
Байоджен Айдек Ма Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Байоджен Айдек Ма Инк. filed Critical Байоджен Айдек Ма Инк.
Publication of EA200400962A1 publication Critical patent/EA200400962A1/ru
Publication of EA009783B1 publication Critical patent/EA009783B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/31—Somatostatins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/34—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from hydroxy compounds or their metallic derivatives
    • C08G65/48—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L71/00—Compositions of polyethers obtained by reactions forming an ether link in the main chain; Compositions of derivatives of such polymers
    • C08L71/02—Polyalkylene oxides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L2203/00—Applications
    • C08L2203/02—Applications for biomedical use

Abstract

Изобретение относится к новым соединениям полиалкиленгликоля и способам их применения. В частности, соединения, содержащие новый конъюгат полиэтиленгликоля, применяют отдельно или в комбинации с противовирусными средствами для лечения вирусной инфекции, такой как хронический гепатит С.

Description

Область изобретения
Данное изобретение относится к новым соединениям полиалкиленгликоля, конъюгатам полимеров и белков и их применениям.
Предпосылка изобретения
Ковалентное связывание гидрофильных полимеров, таких как полимеров полиалкиленгликоля, также называемые полиалкиленоксидами, с биологически активными молекулами и поверхностями представляет интерес в биотехнологии и медицине.
В частности, многие исследования были сосредоточены на применении конъюгатов поли(этиленгликоля) (РЕО), также называемого поли(этиленоксидом) (ПЭО), для повышения растворимости и стабильности и пролонгирования времени полужизни молекул в системе кровообращения.
В своей наиболее общей форме РЕО является линейным полимером, заканчивающимся на каждом из концов гидроксильными группами:
НО-СН2СН2О- (СН2СН2О)П-СН2СН2-ОН
Указанный выше полимер, альфа-, омега-дигироксиполи(этиленгликоль) также можно представить в виде НО-РЕО-ОН, при этом подразумевается, что символ -РЕО- означает следующую структурную единицу:
-СН2СН2О- (СН2СН2О) П-СН2СН2где η обычно находится в пределах примерно от 4 до 10000.
РЕО обычно используют в виде метокси-РЕО-ОН, или тРЕО, в котором один конец представляет собой относительно инертную метоксигруппу, тогда как другой конец является гидроксильной группой, которая легко подвергается химической модификации. Кроме того, во многих применениях РЕО может быть заменен случайными или блок-сополимерами различных алкиленоксидов (например, этиленоксида и пропиленоксида), которые являются близко родственными РЕО по своей химической природе.
Чтобы связать РЕО с представляющей интерес молекулой часто необходимо активировать РЕО путем получения производного РЕО, имеющего реакционноспособную функциональную группу по меньшей мере на одном конце. Функциональную группу выбирают на основе типа доступной реакционноспособной группы в молекуле, которая будет связана с РЕО.
РЕО является полимером, обладающим свойствами растворимости в воде и многих органических растворителях, отсутствием токсичности и отсутствием иммуногенности. Одним из применений РЕО является ковалентное связывание полимера с нерастворимыми молекулами, чтобы сделать полученный в результате «конъюгат» РЕО-молекула растворимым. Например, показано, что нерастворимое в воде лекарственное средство паклитаксел при связывании с РЕО становится водорастворимым. ОгеепшаЮ е! а1., I. Огд. Скет., 60: 331-336 (1995).
Способ на основе пролекарств, при котором лекарственные средства высвобождаются в результате деградации более сложных молекул (пролекарств) при физиологических условиях, является эффективным элементом доставки лекарственного средства. Пролекарства, например, можно образовать в результате связывания РЕО с лекарственными средствами посредством связей, которые разрушаются при физиологических условиях. Время жизни пролекарств на основе РЕО ίη νίνο зависит от типа функциональной группы(групп), образующих связи между РЕО и лекарственным средством. В общем, сложноэфирные связи, образованные в результате взаимодействия РЕО-карбоновых кислот или активированных РЕО-карбоновых кислот со спиртовыми группами лекарственного средства, гидролизуются в физиологических условиях, высвобождая лекарственное средство, тогда как амидные и карбаматные связи, образованные на основе аминогрупп лекарственного средства, стабильны и не гидролизуются с высвобождением свободного лекарственного средства. Показано, что гидролитическую доставку лекарственных средств из сложных эфиров РЕО можно в определенной степени легко регулировать посредством регулирования количества связывающих метиленовых групп в спейсере между концевым кислородом РЕО и карбонильной группой связанной карбоновой кислоты или производного карбоновой кислоты. Например, Нагпз е! а1. в патенте США № 5672662 описывают РЕО-бутановую кислоту и РЕО-пропановую кислоту и их активированные производные в качестве альтернативы карбоксиметил-РЕО для соединений в тех случаях, когда желательна меньшая гидролитическая реакционная способность соответствующих сложноэфирных производных. В общем, см. публикацию РСТ ШО 01/46291.
Одним фактором, ограничивающим пригодность протеинизированных веществ для применений в лечебных целях, является то, что при парентеральном введении они элиминируются из организма в течение короткого периода времени. Указанная элиминация может происходить в результате деградации протеазами или в результате выведения с использованием обычных путей элиминации белка, таких как фильтрация в почках. Пероральное введение указанных веществ еще более проблематично, поскольку кроме протеолиза в желудке высокая кислотность желудка разрушает указанные вещества до того, как они достигают намеченной ткани-мишени. Проблемы, связанные с указанными путями введения белков, хорошо известны в фармацевтической промышленности, и при попытках их решения используются различные методики. Опубликовано много работ, связанных со стабилизацией белка. Известны различные способы конъюгации белков с полимерными материалами, включая использование декстранов, поливи
- 1 009783 нилпирролидонов, гликопептидов, полиэтиленгликоля и полиаминокислот. Сообщается, что полученные в результате конъюгированные полипептиды сохраняют свои биологические активности и растворимость в воде для парентеральных применений.
Особый интерес представляет повышение биологической активности интерферонов наряду с уменьшением токсичности, вызванной применением указанных белков для лечения больных людей. Интерфероны являются семейством встречающихся в природе небольших белков и гликопротеидов, продуцируемых и секретируемых большинством ядерных клеток в ответ на вирусную инфекцию, а также другие антигенные стимулы. Интерфероны делают клетки резистентными к вирусной инфекции и проявляют широкое множество действий на клетки. Они проявляют свои клеточные активности посредством связывания со специфичными мембранными рецепторами на поверхности клеток. После связывания с клеточной мембраной интерфероны инициируют сложную последовательность внутриклеточных событий. Исследования ίη νίΐτο показали, что указанные активности включают индукцию некоторых ферментов; подавление пролиферации клеток, иммуномодулирующие активности, такие как усиление фагоцитарной активности макрофагов; увеличение специфичной цитотоксичности лимфоцитов по отношению к клеткам-мишеням; и ингибирование репликации вирусов в инфицированных вирусом клетках.
Интерфероны тестировали при лечении различных клинических патологических состояний. Применение человеческого интерферона бета введено для лечения множественного склероза. Две формы рекомбинантного интерферона бета недавно лицензированы в Европе и в США для лечения данного заболевания: интерферон-бета-1а (ΑνΟΝΕΧ®, Вюдеп, 1пс., СатЬпбде, МА и ΒΕΒΙΕ®, 8етопо, Сспсча. 8\\'Ц/ег1апб) и интерферон-бета-1Ь (ΒΕΤΑ8ΕΚ.ΟΝ®, Вег1ех, Ктсйтопб, СА). Интерферон бета-1а продуцируется в клетках млекопитающих при использовании природной последовательности гена человека и гликозилируется, тогда как интерферон-бета-1Ь продуцируется в бактериях Ε. сой при использовании модифицированной последовательности гена человека, которая содержит генетически сконструированную замену цистеина на серин в положении аминокислоты 17, и не гликозилируется.
Известно, что неиммунные интерфероны, которые включают как альфа-, так и бета-интерфероны, подавляют вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) как в остроинфицированных, так и в хронически инфицированных клетках. См. Рой апб Еаис1, 1992, ΑΙΌ8 Кекеатсй апб Нитап Кей^йикек 8 (2): 191-197. Благодаря своей противовирусной активности интерфероны, особенно альфа-интерфероны, привлекли большое внимание в качестве терапевтических средств для лечения заболевания, связанного с вирусом гепатита С (ΗΟν). См. НооГпаДе й а1., в: νίΓηΙ Нераййк 1981 1Щегпа1юпа1 Бутрокшт, 1982, РЫ1абе1рЫа, Егапкйп 1п81тйе Ргекк; НооГпад1е й а1., 1986, №\ν Епд. Е Меб. 315: 1575-1578; Тйоткоп, 1987, Ьапсе!: 1: 539-541; Кдуока^а й а1., 1983, в: 2искегтап, еб., νίπ·ι1 Нера11118 апб БАег О18еа8е, А11еп К. Ь188, №\ν Уотк рр. 895-897; НооГпад1е й а1., 1985, 8ет. й-ίν. Όίκ., 1985, 9: 259-263.
Конъюгаты интерферон-полимер описаны, например, в патенте США № 4766106, патенте США № 4917888, Европейской заявке на выдачу патента № 0236987, Европейской заявке на выдачу патента № 0510356 и в публикации международной заявки на выдачу патента № АО 95/13090.
Хронический гепатит С является коварным и медленно прогрессирующим заболеванием, оказывающим значительное влияние на качество жизни. Несмотря на улучшение качества пула донорской крови и недавнее внедрение тестирования сданной крови на ВИЧ, доля острой инфекции среди лиц, получавших переливание, составляет согласно оценкам от 5 до 10%. См. АЙет й а1., в: 2искеттап, еб., νίη1 Нераййк апб йАег П18еа8е, А11еп К. Ь188, №\ν Уотк, 1988, рр. 537-542. Таким образом, примерно из 3 млн человек, которым ежегодно проводят переливание в Соединенных Штатах, примерно у 150000 разовьется гепатит С. Хотя у многих пациентов, которые заразились гепатитом С, будет иметь место субклиническое или умеренное заболевание, примерно у 50% будет наблюдаться прогрессирование до хронического состояния болезни, характеризуемого флуктуирующими нарушениями сывороточной трансаминазы и воспалительными повреждениями в ткани печени. По оценкам цирроз будет развиваться у части представителей данной группы, составляющей примерно до 20%. См. 1<оге1х й а1., 1985, Са81гоеп1его1оду 88:1251-1254.
Известно, что интерфероны влияют на множество клеточных функций, включая репликацию ДНК и синтез РНК и белка как в нормальных, так и аномальных клетках. Таким образом, цитотоксические действия интерферона не ограничены опухолевыми или инфицированными вирусом клетками, но также проявляются и в нормальных, здоровых клетках. В результате в ходе терапии интерферонами могут возникать нежелательные побочные эффекты, особенно в том случае, когда требуются высокие дозы. Введение интерферона может привести к миелосупрессии, тем самым приводя к сниженному числу красных кровяных клеток и пониженным уровням белых кровяных клеток и тромбоцитов. Интерфероны обычно вызывают подобные гриппу симптомы (например, жар, усталость, головные боли и озноб), желудочнокишечные расстройства (например, анорексию, тошноту и диарею), головокружение и кашель. Часто долговременный ответ ВИЧ-пациентов на лечение непегилированным интерфероном является низким, и лечение может индуцировать тяжелые побочные эффекты, включая, но не ограничиваясь указанным, ретинопатию, тиреоидит, острый панкреатит и депрессию.
Нежелательные побочные эффекты, которые сопровождают лечение интерфероном, часто ограни
- 2 009783 чивают терапевтическую пригодность схем лечения интерфероном. Таким образом, существует необходимость в сохранении или повышении терапевтической пользы такого лечения при снижении или исключении нежелательных побочных эффектов.
Сущность изобретения
Изобретение относится к новым соединениям полиалкиленгликоля, композициям на их основе, полимерным конъюгатам указанных соединений, фармацевтическим композициям на их основе, а также к способам лечения вирусных инфекций, множественного склероза и рака у пациента.
В одном аспекте изобретение относится к активированному полимеру полиалкиленгликолю, имеющему структуру согласно формуле X
где Р означает полимер полиалкиленгликоля;
X означает О, 8, СО, СО2, СО8, 80, 8О2, ΟΟΝΚ', 8Ο2ΝΒ' или ΝΒ;
К' означает водород, насыщенную или ненасыщенную С1-С20 алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью, С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил, замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил является С1-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксила, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остаткам иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтиогруппы;
Ζ и Ζ' в отдельности означают водород, насыщенную или ненасыщенную С1-С20 алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью, С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил, замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил является С1-С2о насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксила, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтиогруппы, при условии, что по меньшей мере один Ζ или Ζ' не является водородом;
К является остатком, подходящим для образования связи между соединением формулы X и биологически активным соединением или его предшественником;
каждый η независимо равен 0 или является целым числом от 1 до 5; и р равно 1, 2 или 3.
В другом аспекте изобретение включает активированное соединение полиалкиленгликоля (РОС), имеющее структуру согласно формуле Ха
Р---X---(СНгК---сн--К
В указанных соединениях Р означает полимер полиалкиленгликоля, такой как, например, РЕО или шРЕО.
X означает О, 8, СО, СО2, СО8, 80, 8О2, ΟΟΝΚ', 8Ο2ΝΒ' или ΝΒ', и В, в том случае, если присутствует, означает водород, насыщенную или ненасыщенную С1-С20 алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью, С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил, замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил является С1-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксила, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтиогруппы.
Ζ означает насыщенную или ненасыщенную С1-С2о алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью, С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил, замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещен
-3009783 ный или незамещенный алкарил, где алкил является С1-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксида, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтиогруппы.
К является остатком, подходящим для образования связи между соединением формулы X и биологически активным соединением или его предшественником; и η равно 0 или является целым числом от 1 до 5, так что имеется от 0 до 5 метиленовых групп между X- и Ζ-содержащим атомом углерода.
В одном варианте К выбран из группы, состоящей из карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида, ацеталя, гидроксильной группы, защищенной гидроксильной группы, карбоната, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, замещенного или незамещенного тиола, галогена, замещенного или незамещенного амина, защищенного амина, гидразида, защищенного гидразида, сукцинимидила, изоцианата, изотиоцианата, дитиопиридина, винилпиридина, йодацетамида, эпоксида, гидроксисукцинимидила, азола, малеимида, сульфона, аллила, винилсульфона, трезила, сульфо-Νсукцинимидила, диона, мезила, тозила и глиоксаля.
В другом варианте Р означает полиэтиленгликоль, имеющий структуру формулы II
Е- (О-СН2СН2) а- , где Е означает водород, С1-С20 алкильную группу с прямой или разветвленной цепью или регистрируемую метку; и а является целым числом от 4 до 10000. В следующем варианте Е может быть метилом.
В еще одном варианте Р означает полиэтиленгликоль, имеющий структуру формулы II, где Е является остатком, подходящим для образования связи между соединением формулы X и биологически активным соединением или его предшественником, и а является целым числом от 4 до 10000.
В дополнительном варианте Е выбран из группы, состоящей из карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида, ацеталя, гидроксильной группы, защищенной гидроксильной группы, карбоната, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, замещенного или незамещенного тиола, галогена, замещенного или незамещенного амина, защищенного амина, гидразида, защищенного гидразида, сукцинимидила, изоцианата, изотиоцианата, дитиопиридина, винилпиридина, йодацетамида, эпоксида, гидроксисукцинимидила, азола, малеимида, сульфона, аллила, винилсульфона, трезила, сульфо-Νсукцинимидила, диона, мезила, тозила и глиоксаля. Альтернативно Е может иметь структуру согласно формуле III
К---НС—(СН^---(Υ),η--Ω--х— С\У2С\¥2--где Р означает полимер полиалкиленгликоля;
X и Υ независимо означают О, 8, СО, СО2, СО8, 80, 8О2, ΟΟΝΚ', 8Ο2ΝΚ' или ΝΚ';
С означает Сз-Сз насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил (включая конденсированные бициклические и связанные мостиками бициклические кольцевые структуры), замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил является С1-С2о насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксида, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтиогруппы;
К' и каждый Ζ независимо имеют значения, описанные выше;
ш равно 0 или 1;
каждый независимо является водородом или С1-С7 алкилом;
каждый η независимо равен 0 или является целым числом от 1 до 5; и
К является остатком, подходящим для образования связи между соединением формулы III и биологически активным соединением или его предшественником. Гетероциклические и карбоциклические группы включают конденсированные бициклические и связанные мостиками бициклические кольцевые структуры.
В еще одном варианте Е имеет структуру согласно формуле IV км---нс—(СН2)^--X---СУ/2С^2---4 009783 где каждый X, Ζ и η независимо имеют значения, определенные выше;
каждый Ш независимо является водородом или С1-С7 алкилом; и
К'1' является остатком, подходящим для образования связи между соединением формулы IV и биологически активным соединением или его предшественником.
В дополнительном варианте К'' выбран из группы, состоящей из карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида, ацеталя, гидроксильной группы, защищенной гидроксильной группы, карбоната, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, замещенного или незамещенного тиола, галогена, замещенного или незамещенного амина, защищенного амина, гидразида, защищенного гидразида, сукцинимидила, изоцианата, изотиоцианата, дитиопиридина, винилпиридина, йодацетамида, эпоксида, гидроксисукцинимидила, азола, малеимида, сульфона, аллила, винилсульфона, трезила, сульфо-Νсукцинимидила, диона, мезила, тозила и глиоксаля.
В следующем варианте К''' выбран из группы, состоящей из карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида, ацеталя, гидроксильной группы, защищенной гидроксильной группы, карбоната, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, замещенного или незамещенного тиола, галогена, замещенного или незамещенного амина, защищенного амина, гидразида, защищенного гидразида, сукцинимидила, изоцианата, изотиоцианата, дитиопиридина, винилпиридина, йодацетамида, эпоксида, гидроксисукцинимидила, азола, малеимида, сульфона, аллила, винилсульфона, трезила, сульфо-Νсукцинимидила, диона, мезила, тозила и глиоксаля.
В другом варианте Е является регистрируемой меткой. Кроме того, Е может быть выбран из группы, состоящей из радиоактивных изотопов, флуоресцентных остатков, фосфоресцентных остатков, хе милюминесцентных остатков и квантовых меток.
В еще одном варианте активированный РОС согласно изобретению имеет структуру согласно формуле XI
где Р означает полимер полиалкиленгликоля; и η и Ζ имеют значения, которые определены.
В другом варианте активированный полиалкиленгликоль имеет структуру согласно формуле XII
где η, а и Ζ имеют значения, определенные выше. В одном варианте Ζ может быть метилом. В некоторых вариантах η равно 1.
В другом аспекте изобретение включает активированное соединение полиалкиленгликоля, имеющее структуру согласно формуле XIII
где а является целым числом от 4 до 10000.
Изобретение также относится к композиции активированных соединений полиалкиленгликоля согласно изобретению и биологически активного соединения или его предшественника. В различных вариантах биологически активное соединение или его предшественник выбраны из группы, состоящей из пептида, аналога пептида, белка, фермента, малой молекулы, красителя, липида, нуклеозида, олигонуклеотида, аналога олигонуклеотида, сахара, олигосахарида, клетки, вируса, липосомы, микрочастицы, поверхности и мицеллы.
В другом аспекте изобретение относится к полимерному конъюгату, имеющему структуру согласно формуле XXII
где Р означает полимер полиалкиленгликоля;
- 5 009783
X означает О, 8, СО, СО2, СО8, 80, 8О2, ΟΟΝΚ', 8Ο2ΝΚ' или ΝΚ';
К1 означает водород, насыщенную или ненасыщенную С1-С2о алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью, С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил, замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил является С1-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксила, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтиогруппы;
каждый Ζ и Ζ' независимо означает водород, насыщенную или ненасыщенную С1-С20 алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью, С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил, замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил является С1-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксила, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтиогруппы, при условии, что по меньшей мере один Ζ или Ζ' не является водородом;
К* означает связывающий остаток;
В означает биологически активную молекулу;
каждый η равен 0 или является целым числом от 1 до 5; и р равно 1, 2 или 3.
В следующем аспекте изобретение относится к полимерному конъюгату, имеющему структуру согласно формуле ХХ11а р--X--(СНДп- СН—к —в где Р означает полимер полиалкиленгликоля;
X означает О, 8, СО, СО2, СО8, 80, 8О2, СОМЬ, 8Ο2ΝΚ' или ΝΚ'; и η равно 0 или является целым числом от 1 до 5.
К' означает водород, насыщенную или ненасыщенную С1-С20 алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью, С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил, замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил является С1-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксила, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтиогруппы;
Ζ означает насыщенную или ненасыщенную С1-С20 алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью, С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил, замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил является С1-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксила, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтиогруппы;
К* означает связывающий остаток, образованный в результате взаимодействия К с биологически активным соединением или его предшественником, и
В означает биологически активное соединение или его предшественник после конъюгации с К.
В одном варианте К* образуется в результате взаимодействия остатка, выбранного из группы, состоящей из карбоновой кислотой, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида, ацеталя, гидроксильной группой, защищенной гидроксильной группой, остатком карбоната, алкенила, акрилата, метакрилата,
- 6 009783 акриламида, замещенного или незамещенного тиола, галогена, замещенного или незамещенного амина, защищенного амина, гидразида, защищенного гидразида, сукцинимидила, изоцианата, изотиоцианата, дитиопиридина, винилпиридина, йодацетамида, эпоксида, гидроксисукцинимидила, азола, малеимида, сульфона, аллила, винилсульфона, трезила, сульфо-И-сукцинимидила, диона, мезила, тозила или глиоксаля, с биологически активным соединением или его предшественником.
В дополнительном варианте Р означает полиэтиленгликоль, имеющий структуру формулы II
Е- (О-СН2СН2)а-, где Е означает водород, С1-С20 алкильную группу с прямой или разветвленной цепью или регистрируемую метку; и а является целым числом от 4 до 10000. В данном варианте Е может быть метилом.
В другом варианте Р означает полиэтиленгликоль, имеющий структуру формулы II
Е- (О-СН2СН2)а-, где Е является остатком, подходящим для образования связи между соединением формулы II и биологически активным соединением или его предшественником, и а является целым числом от 4 до 10000. В данном варианте Е может связываться с биологически активным соединением или его предшественником, отличным от В. В других вариантах Е образует дополнительную связь с биологически активным соединением В.
В различных вариантах Е может быть выбран из группы, состоящей из карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида, ацеталя, гидроксильной группы, защищенной гидроксильной группы, карбоната, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, замещенного или незамещенного тиола, галогена, замещенного или незамещенного амина, защищенного амина, гидразида, защищенного гидразида, сукцинимидила, изоцианата, изотиоцианата, дитиопиридина, винилпиридина, йодацетамида, эпоксида, гидроксисукцинимидила, азола, малеимида, сульфона, аллила, винилсульфона, трезила, сульфо-Х-сукцинимидила, диона, мезила, тозила и глиоксаля.
В других вариантах Е имеет структуру согласно формуле III к-—нс—(сн^—(¥)т—ς—х— су/2с\у2—
Ζ } где Р означает полимер полиалкиленгликоля;
каждый X и Υ независимо означают О, 8, СО, СО2, СО8, 80, 8О2, СОХК', 8О2ХК' или ΝΚ';
О означает С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил (включая конденсированные бициклические и связанные мостиками бициклические кольцевые структуры), замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил является С1-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксила, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтиогруппы;
К' и каждый Ζ независимо имеют значения, описанные выше;
т равно 0 или 1;
каждый η независимо равен 0 или является целым числом от 1 до 5;
К'' является остатком, подходящим для образования связи между соединением формулы III и биологически активным соединением или его предшественником; и каждый Ш независимо является водородом или С1-С7 алкилом.
В следующем варианте Е имеет структуру согласно формуле IV
к.”'----нс—(СНг>_---х---СУ/2СЛУ2--Ζ , где каждый X, Ζ и η независимо имеют значения, определенные выше;
каждый Ш независимо является водородом или С1-С7 алкилом; и
К''' является остатком, подходящим для образования связи между соединением формулы IV и биологически активным соединением или его предшественником.
В следующих вариантах К'' выбран из группы, состоящей из карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида, ацеталя, гидроксильной группы, защищенной гидроксильной группы, карбоната, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, замещенного или незамещенного тиола, галогена, замещенного или незамещенного амина, защищенного амина, гидразида, защищенного гидразида, сукцинимидила, изоцианата, изотиоцианата, дитиопиридина, винилпиридина, йодацетамида, эпоксида, гидроксисукцинимидила, азола, малеимида, сульфона, аллила, винилсульфона, трезила, сульфо-Νсукцинимидила, диона, мезила, тозила и глиоксаля.
- 7 009783
Еще в других вариантах К' выбран из группы, состоящей из карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида, ацеталя, гидроксильной группы, защищенной гидроксильной группы, карбоната, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, замещенного или незамещенного тиола, галогена, замещенного или незамещенного амина, защищенного амина, гидразида, защищенного гидразида, сукцинимидила, изоцианата, изотиоцианата, дитиопиридина, винилпиридина, йодацетамида, эпоксида, гидроксисукцинимидила, азола, малеимида, сульфона, аллила, винилсульфона, трезила, сульфо-Νсукцинимидила, диона, мезила, тозила и глиоксаля.
В дополнительных вариантах Е является регистрируемой меткой. Например, Е может быть выбран из группы, состоящей из радиоактивных изотопов, флуоресцентных остатков, фосфоресцентных остат ков, хемилюминесцентных остатков и квантовых меток.
В другом варианте К* является метиленом и В является биологически активной молекулой, связанной посредством амина. Например, амин является аминоконцом пептида. В следующем варианте пептид является интерфероном, таким как интерферон-бета-1а.
В другом варианте изобретение относится к полимерному конъюгату, имеющему структуру согласно формуле XXIII
где п, а, К*, В и Ζ имеют значения, определенные выше. В одном дополнительном варианте Ζ является метилом и п равно единице.
В следующем аспекте изобретение относится к полимерному конъюгату согласно формуле XXIV
где т равно 0 или 1; а является целым числом от 4 до 10000; каждый п независимо равен 0 или является целым числом от 1 до 5. Каждый X и Υ независимо означает О, 8, СО, СО2, СО8, 80, 8О2, ΟΟΝΚ', 8Ο2ΝΚ' или ΝΚ'; каждый К' и Ζ независимо означает водород, насыщенную или ненасыщенную С1-С20 алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью; и каждый А независимо означает водород или С1-С7 алкил.
О означает С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил (включая конденсированные бициклические и связанные мостиками бициклические кольцевые структуры), замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил означает С1-С20 насыщенный или ненасыщенный алкил, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксила, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтиогруппы.
К* и К** независимо являются связывающими остатками, образованными в результате взаимодействия К и К'' с биологически активным соединением или его предшественником, и каждый В и В' является биологически активным соединением или его предшественником после конъюгации с К и К'', соответственно.
В некоторых вариантах В и В' представляют собой один и тот же тип биологически активного соединения. В других вариантах В и В' являются разными биологически активными соединениями. В других вариантах В и В' являются одной и той же биологически активной молекулой. В дополнительных вариантах К* и К** представляют собой одно и то же. В других вариантах К* и К** являются разными.
В следующем аспекте изобретение относится к полимерному конъюгату согласно формуле XXV
где X означает О, 8, СО, СО2, СО8, 80, 8О2, СОКК', 8Ο2ΝΚ' или ΝΚ'; а является целым числом от 4 до 10000; и каждый п независимо равен 0 или является целым числом от 1 до 5.
- 8 009783
Каждый Ζ независимо означает водород, насыщенную или ненасыщенную С1-С20 алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью, и каждый XV независимо является водородом или С1-С7 алкилом.
К* и К** независимо являются связывающими остатками, образованными в результате взаимодействия К и К с биологически активным соединением или его предшественником, и каждый В и В' является биологически активным соединением или его предшественником после конъюгации с К и В', соответственно.
В некоторых вариантах В и В' представляют собой один и тот же тип биологически активного соединения. В других вариантах В и В' являются разными биологически активными соединениями. В других вариантах В и В' являются одной и той же биологически активной молекулой. В дополнительных вариантах В* и В** представляют собой одно и то же. В других вариантах В* и В** являются разными.
Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей композиции согласно изобретению вместе с фармацевтически приемлемым носителем. В различных вариантах фармацевтическая композиция также содержит дополнительное биологически активное средство. Например, биологически активное средство может быть выбрано из группы, состоящей из пептида, аналога пептида, белка, фермента, малой молекулы, красителя, липида, нуклеозида, олигонуклеотида, аналога олигонуклеотида, сахара, олигосахарида, клетки, вируса, липосомы, микрочастицы, поверхности и мицеллы. В другом варианте биологически активным средством является противовирусное средство.
В другом аспекте изобретение относится к полимерному конъюгату, содержащему продукт взаимодействия соединения формулы X и биологически активного соединения или его предшественника.
В одном варианте полимерный конъюгат имеет структуру согласно формуле XXII р--х--(СНА СН—к —в где все переменные имеют значения, определенные выше, Я* является связывающим остатком, образованным в результате взаимодействия Я с химически активным остатком в биологически активном соединении или его предшественнике; и В является биологически активным соединением или его предшественником.
В другом варианте полимерный конъюгат имеет структуру согласно формуле XXIV
в·—к— С|Н—(СНА—(Υ)™— О—X— С\¥2О¥— (О-СН2СН2)—х— (СН2)„ Ζ где все переменные имеют значения, определенные выше, каждый XV независимо означает водород или С; -С7 алкил. Я* является связывающим остатком, образованным в результате взаимодействия Я с химически активным остатком в биологически активном соединении В или его предшественнике, Я** является связывающим остатком, образованным в результате взаимодействия Я с химически активным остатком в биологически активном соединении В' или его предшественнике; и В и В' независимо являются биологически активным соединением или его предшественником. В некоторых вариантах В и В' представляют собой один и тот же тип биологически активного соединения. В других вариантах В и В' являются разными биологически активными соединениями. Еще в других вариантах В и В' являются одной и той же биологически активной молекулой. В дополнительных вариантах Я* и Я** представляют собой одно и то же. В других вариантах Я* и Я** являются разными.
В других вариантах полимерный конъюгат имеет структуру согласно формуле XXV
(О-СН2СН2)~X--(СН2)В
где все переменные имеют значения, определенные в формуле изобретения выше, каждый XV независимо означает водород или С]-С7 алкил.
Я* и Я** независимо являются связывающими остатками, образованными в результате взаимодействия Я и Я с биологически активным соединением или его предшественником, и каждый В и В' является биологически активным соединением или его предшественником после конъюгации с Я и Я, соответственно.
В некоторых вариантах В и В' представляют собой один и тот же тип биологически активного соединения. В других вариантах В и В' являются разными биологически активными соединениями. Еще в
-9009783 других вариантах В и В' являются одной и той же биологически активной молекулой. В дополнительных вариантах К* и К** представляют собой одно и то же. В других вариантах К* и К** являются разными.
В одном аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей композицию активированного полимера полиэтиленгликоля формулы X и биологически активного соединения или его предшественника в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.
В ещё одном аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей полимерный конъюгат согласно формуле XXIV и фармацевтически приемлемый носитель.
В ещё одном аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей полимерный конъюгат согласно формуле XXV и фармацевтически приемлемый носитель.
В ещё одном аспекте изобретение относится к композиции, содержащей продукт взаимодействия соединения по п.1 и биологически активного соединения или его предшественника.
В одном из вариантов композиция содержит продукт взаимодействия, имеющий структуру согласно формуле XXII р---х--(СН2)П СН—К*---В где все переменные имеют значения, определенные выше;
К* является связывающим остатком, образованным в результате взаимодействия К с химически активным остатком на биологически активном соединении или его предшественнике; и
В является биологически активным соединением или его предшественником.
В другом варианте композиция содержит продукт взаимодействия, имеющий структуру согласно формуле XXIV
где все переменные имеют значения, определенные выше;
каждый независимо означает водород или С1-С7 алкил;
К* является связывающим остатком, образованным в результате взаимодействия К с химически активным остатком на биологически активном соединении В или его предшественнике;
К** является связывающим остатком, образованным в результате взаимодействия К'' с химически активным остатком на биологически активном соединении В' или его предшественнике; и
В и В' независимо являются биологически активным соединением или его предшественником.
В другом варианте композиция содержит продукт взаимодействия, имеющий структуру согласно формуле XXV
где все переменные имеют значения, определенные выше;
каждый независимо означает водород или С1-С7 алкил;
К* является связывающим остатком, образованным в результате взаимодействия К с химически активным остатком на биологически активном соединении В или его предшественнике;
К** является связывающим остатком, образованным в результате взаимодействия К''' с химически активным остатком на биологически активном соединении В' или его предшественнике; и
В и В' независимо являются биологически активным соединением или его предшественником.
В другом аспекте изобретение относится к способу лечения пациента с поддающейся лечению вирусной инфекцией, включающему введение пациенту эффективного количества композиции, имеющей структуру согласно формуле XXII
где Р означает полимер полиалкиленгликоля;
X означает О, 8, СО, СО2, СО8, 80, 8О2, СОКК', 8Ο2ΝΚ или ΝΉ';
- 10 009783
К' означает водород, насыщенную или ненасыщенную С1-С20 алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью, С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил, замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил является С1-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксила, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтиогруппы;
каждый Ζ и Ζ' независимо означает водород, насыщенную или ненасыщенную С1-С20 алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью, С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил, замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил является С1-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксила, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтиогруппы, при условии, что по меньшей мере один Ζ или Ζ' не является водородом;
К* означает связывающий остаток;
В означает биологически активную молекулу;
т равно 0 или 1;
каждый η равен 0 или является целым числом от 1 до 5; и р равно 1, 2 или 3.
В другом аспекте изобретение относится к способу лечения пациента с поддающейся лечению вирусной инфекцией, включающему введение пациенту эффективного количества композиции, имеющей структуру согласно формуле ХХ11а где Р означает полимер полиалкиленгликоля;
т равно 0 или 1;
η равно 0 или является целым числом от 1 до 5;
X означает О, 8, СО, СО2, СО8, 80, 8О2, СОЫК', 8Ο2ΝΚ' или ΝΚ'; и
К' означает водород, насыщенную или ненасыщенную С1-С20 алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью, С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил, замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил является С1-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксила, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтиогруппы.
Ζ означает насыщенную или ненасыщенную С1-С20 алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью, С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил, замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил является С1-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксила, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтиогруппы.
К* означает связывающий остаток, образованный в результате взаимодействия К с биологически активным соединением или его предшественником, и В означает биологически активное соединение или его предшественник после конъюгации с К.
В различных вариантах В является биологически активным пептидом, таким как интерферон. На
- 11 009783 пример, В может быть интерфероном-бета-1а.
В другом варианте композиция, кроме того, содержит биологически активное средство, выбранное из группы, состоящей из противовирусного средства в виде малой молекулы, противовирусного средства в виде нуклеиновой кислоты и пептидного противовирусного средства. Например, противовирусное средство может быть выбрано из группы, состоящей из рибавирина, левовирина, 3ТС, РТС, МВ686, зидовудина, ацикловира, ганцикловира, вирамида, УХ-497, νΧ-950 и 1818-14803.
В следующем варианте вирусной инфекцией является хронический гепатит С.
Кроме того, в другом аспекте изобретение относится к способу лечения пациента с поддающейся лечению вирусной инфекцией путем введения пациенту эффективного количества композиции, имеющей структуру согласно формуле XXIV
где т равно 0 или 1;
а является целым числом от 4 до 10000;
каждый η независимо равен 0 или является целым числом от 1 до 5;
каждый X и Υ независимо означает О, 8, СО, СО2, СО8, 80, 8О2, СΟNΚ', 8Ο2ΝΚ' или ΝΚ';
каждый К' и Ζ независимо означает водород, насыщенную или ненасыщенную С1-С20 алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью; и каждый независимо означает водород или С1-С7 алкил.
О означает С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил (включая конденсированные бициклические и связанные мостиками бициклические кольцевые структуры), замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил означает С1-С20 насыщенный или ненасыщенный алкил, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксила, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтиогруппы.
К* и К** независимо являются связывающими остатками, образованными в результате взаимодействия К и К'' с биологически активным соединением или его предшественником, и каждый В и В' является биологически активным соединением или его предшественником после конъюгации с К и К'', соответственно.
В некоторых вариантах В и В' представляют собой один и тот же тип биологически активного соединения. В других вариантах В и В' являются разными биологически активными соединениями. Кроме того, в других вариантах В и В' являются одной и той же биологически активной молекулой. В дополнительных вариантах К* и К** представляют собой одно и то же. В других вариантах К* и К** являются разными.
В различных вариантах В является биологически активным пептидом, таким как интерферон. Например, В может быть интерфероном-бета-1а.
В других вариантах композиция, кроме того, содержит биологически активное средство, выбранное из группы, состоящей из противовирусного средства в виде малой молекулы, противовирусного средства в виде нуклеиновой кислоты и пептидного противовирусного средства. Например, противовирусное средство может быть выбрано из группы, состоящей из рибавирина, левовирина, 3ТС, РТС, МВ686, зидовудина, ацикловира, ганцикловира, вирамида, νΧ-497, νΧ-950 и 1818-14803.
Кроме того, в других вариантах вирусной инфекцией является хронический гепатит С.
В дополнительном аспекте изобретение относится к способу лечения пациента с поддающейся лечению вирусной инфекций путем введения пациенту эффективного количества композиции, имеющей структуру согласно формуле XXV
где каждый независимо означает водород или С1-С7 алкил; а является целым числом от 4 до 10000;
- 12 009783 каждый η независимо равен 0 или является целым числом от 1 до 5;
X означает О, 8, СО, СО2, СО8, 80, 8О2, ΟΟΝΚ', 8Ο2ΝΚ' или ΝΚ'; и каждый Ζ независимо означает водород, насыщенную или ненасыщенную С1-С20 алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью.
К* и К** независимо являются связывающими остатками, образованными в результате взаимодействия К и К'' с биологически активным соединением или его предшественником, и каждый В и В' является биологически активным соединением или его предшественником после конъюгации с К и К'', соответственно.
В некоторых вариантах В и В' представляют собой один и тот же тип биологически активного соединения. В других вариантах В и В' являются разными биологически активными соединениями. Кроме того, в других вариантах В и В' являются одной и той же биологически активной молекулой. В дополнительных вариантах К* и К** представляют собой одно и то же. В других вариантах К* и К** являются разными.
В различных вариантах В является биологически активным пептидом, таким как интерферон. Например, В может быть интерфероном-бета-1а.
В другом варианте композиция, кроме того, содержит биологически активное средство, выбранное из группы, состоящей из противовирусного средства в виде малой молекулы, противовирусного средства в виде нуклеиновой кислоты и пептидного противовирусного средства. Например, противовирусное средство может быть выбрано из группы, состоящей из рибавирина, левовирина, 3ТС, РТС, МВ686, зидовудина, ацикловира, ганцикловира, вирамида, УХ-497, УХ-950 и 1818-14803.
Кроме того, в других вариантах вирусной инфекцией является хронический гепатит С.
Данное изобретение также относится к способу лечения пациента, у которого предполагается инфекция гепатита С, путем введения пациенту комбинации любой из композиций согласно изобретению и противовирусного средства. В различных вариантах композицию и противовирусное средство вводят одновременно, последовательно или попеременно.
В одном варианте противовирусным средством является рибавирин.
В другом аспекте изобретение относится к способу лечения множественного склероза у пациента, включающему введение указанному пациенту эффективного количества полимерного конъюгата согласно формуле XXII, где формула XXII представляет собой
где Р означает полимер полиалкиленгликоля;
X означает О, 8, СО, СО2, СО8, 80, 8О2, СОт', 802^' или ΝΕ';
К' означает водород, насыщенную или ненасыщенную С1-С20 алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью, С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил, замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил является С1-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксила, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтиогруппы;
каждый Ζ и Ζ' независимо означает водород, насыщенную или ненасыщенную С1-С20 алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью, С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил, замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил является С1-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксила, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтиогруппы, при условии, что по меньшей мере один Ζ или Ζ' не является водородом;
К* образован в результате взаимодействия остатка, выбранного из группы, состоящей из карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида, ацеталя, гидроксильной группы, защищенной гидроксильной группы, карбоната, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, замещенного или незамещенного тиола, галогена, замещенного или незамещенного амина, защищенного амина, гидразида, защищенного гидразида, сукцинимидила, изоцианата, изотиоцианата, дитиопиридина, винилпиридина,
- 13 009783 йодацетамида, эпоксида, гидроксисукцинимидила, азола, малеимида, сульфона, аллила, винилсульфона, трезила, сульфо-№сукцинимидила, диона, мезила, тозила и глиоксаля, с биологически активным соеди нением или его предшественником.
В означает интерферон;
каждый η равен 0 или является целым числом от 1 до 5; и р равно 1, 2 или 3.
В другом аспекте изобретение относится к способу лечения множественного склероза у пациента, включающему введение указанному пациенту эффективного количества полимерного конъюгата согласно формуле XXIII, где формула XXIII представляет собой
где Ζ означает насыщенную или ненасыщенную С1-С20 алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью, С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил, замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил является С1-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксила, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтиогруппы;
К* образован в результате взаимодействия остатка, выбранного из группы, состоящей из карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида, ацеталя, гидроксильной группы, защищенной гидроксильной группы, карбоната, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, замещенного или незамещенного тиола, галогена, замещенного или незамещенного амина, защищенного амина, гидразида, защищенного гидразида, сукцинимидила, изоцианата, изотиоцианата, дитиопиридина, винилпиридина, йодацетамида, эпоксида, гидроксисукцинимидила, азола, малеимида, сульфона, аллила, винилсульфона, трезила, сульфо-№сукцинимидила, диона, мезила, тозила и глиоксаля, с биологически активным соеди нением или его предшественником.
В означает интерферон;
каждый η равен 0 или является целым числом от 1 до 5; и а является целым числом от 0 до 4.
В ещё одном аспекте изобретение относится к способу лечения рака у пациента, включающему введение указанному пациенту эффективного количества полимерного конъюгата согласно формуле XXII, где формула XXII представляет собой
где Р означает полимер полиалкиленгликоля;
X означает О, 8, СО, СО2, СО8, 80, 8О2, (ΌΝΚ, 80ДШ или ΝΚ';
К' означает водород, насыщенную или ненасыщенную С1-С20 алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью, С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил, замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил является С1-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксила, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтиогруппы;
каждый Ζ и Ζ' независимо означает водород, насыщенную или ненасыщенную С1-С20 алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью, С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил, замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил является С1-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокар
- 14 009783 бонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксила, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтиогруппы, при условии, что по меньшей мере один Ζ или Ζ' не является водородом;
Я* образован в результате взаимодействия остатка, выбранного из группы, состоящей из карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида, ацеталя, гидроксильной группы, защищенной гидроксильной группы, карбоната, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, замещенного или незамещенного тиола, галогена, замещенного или незамещенного амина, защищенного амина, гидразида, защищенного гидразида, сукцинимидила, изоцианата, изотиоцианата, дитиопиридина, винилпиридина, йодацетамида, эпоксида, гидроксисукцинимидила, азола, малеимида, сульфона, аллила, винилсульфона, трезила, сульфо-Ы-сукцинимидила, диона, мезила, тозила и глиоксаля, с биологически активным соединением или его предшественником.
В означает интерферон;
каждый η равен 0 или является целым числом от 1 до 5; и р равно 1, 2 или 3.
Если не оговорено особо все технические и научные термины, используемые в данном описании, имеют такое же значение, которое обычно подразумевается специалистом в данной области, к которой относится изобретение. Хотя на практике или при проверке данного изобретения можно использовать способы и вещества, сходные или эквивалентные способам и веществам, описанным в данном изобретении, подходящие способы и вещества описаны далее. Все публикации, заявки на выдачу патентов, патенты и другие ссылки, упоминаемые в данном описании, включены в виде ссылки в полном объеме. В случае конфликта данное описание, включая определения, будут проверены. Кроме того, вещества, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения.
Другие признаки и преимущества изобретения будут понятны из следующего подробного описания и из формулы изобретения.
Краткое описание чертежей
Данное изобретение будет более понятным из следующего описания со ссылками на фигуры, в которых:
на фиг. 1 представлен восстанавливающий δΌδ-ПААГ-гель, показывающий чистоту немодифицированного ΙΕΝ-β-1α и модифицированного 20 кДа шРЕС-О-2-метилпропиональдегидом ΙΕΝ-β-1α: Дорожка А: маркеры молекулярной массы (сверху вниз; 100 кДа, 68 кДа, 45 кДа, 27 кДа и 18 кДа, соответственно); Дорожка В: 4 мкг немодифицированного ΙΕΝ-β-1α; Дорожка С: 4 мкг модифицированного 20 кДа шРЕС-О-2-метилпропональдегидом ΙΕΝ-β-1α.
На фиг. 2 изображены кривые эксклюзионной хроматографии по размеру немодифицированного ΙΕΝ-β-1α и модифицированного 20 кДа шРЕС-О-2-метилпропиональдегидом ΙΕΝ-β-1α: Панель А: стандарты молекулярной массы; Панель В: модифицированный 20 кДа шРЕС-О-2-метилпропиональдегидом ΙΕΝ-β-1α; Панель С, немодифицированный ΙΕΝ-β-1α.
На фиг. 3 изображена кривая эксклюзионной хроматографии по размеру модифицированного 20 кДа шРЕС-О-мета-метилфенил-О-2-метилпропиональдегидом ΙΕΝ-β-1α.
На фиг. 4 представлен восстанавливающий δΌδ-ПААГ-гель, показывающий чистоту немодифицированного ΙΕΝ-β-1α и модифицированного 20 кДа шРЕС-О-пара-фенилацетальдегидом ΙΕΝ-β-1α: Дорожка А: 2,5 мкг модифицированного 20 кДа тРЕС-О-пара-фенилацетальдегидом ΙΕΝ-β-1α; Дорожка В: 2,5 мкг немодифицированного ΙΕΝ-β-1α; Дорожка С: маркеры молекулярной массы (сверху вниз; 100 кДа, 68 кДа, 45 кДа, 27 кДа и 18 кДа, соответственно).
На фиг. 5 изображены кривые эксклюзионной хроматографии по размеру модифицированного 20 кДа тРЕС-О-пара-фенилацетальдегидом ΙΕΝ-β-1α; Панель А: стандарты молекулярной массы; Панель В: модифицированный 20 кДа тРЕС-О-пара-фенилацетальдегидом ΙΕΝ-β-1α.
На фиг. 6 представлен восстанавливающий δΌδ-ПААГ-гель, показывающий стабильность модифицированного 20 кДа тРЕС-О-пара-фенилацетальдегидом ΙΕΝ-β-1α: Дорожка А: маркеры молекулярной массы (сверху вниз; 100 кДа, 68 кДа, 45 кДа, 27 кДа, 18 кДа и 15 кДа, соответственно); Дорожки В, С, Ό и Е: 2 мкг модифицированного 20 кДа тРЕС-О-пара-фенилацетальдегидом ΙΕΝ-β-1α. взятого для анализа в 0, 2, 5 и 7 день, соответственно.
На фиг. 7А-В показана противовирусная активность различных пегилированных образцов ΙΕΝ-β-1α человека в виде функции концентрации белка. Фиг. 7А: немодифицированный ΙΕΝ-β-1α (о), модифицированный 20 кДа тРЕС-О-2-метилпропиональдегидом ΙΕΝ-β-1α (□), модифицированные 20 кДа тРЕСО-пара-метилфенил-О-2-метилпропиональдегидом ΙΕΝ-β-1α(Δ) и модифицированный 20 кДа тРЕС-Омета-метилфенил-О-2-метилпропиональдегидом ΙΕΝ-β-1α (◊). Фиг. 7В: немодифицированный ΙΕΝ-β-1α (о), модифицированный 20 кДа тРЕС-О-2-пара-фенилацетальдегидом ΙΕΝ-β-1α (□), модифицированные 20 кДа тРЕС-О-пара-фенилпропиональдегидом ΙΕΝ-β-1 а (Δ) и модифицированный 20 кДа тРЕС-О
- 15 009783 мета-фенилацетальдегидом ΓΕΝ-β-Η (0).
Фиг. 8 А-В представляют собой графики, на которых изображена фармакокинетика ^модифицированного и различных пегилированных образцов ΣΕΝ-β-1α человека. Фиг. 8А: немодифицированный ΖΕΝв-1а (верхняя панель) и ΣΕΝ-β-1α, модифицированный 20 кДа тРЕС-О-2-метилпропиональдегидом (нижняя панель). Фиг. 8В: ΣΕΝ-β-1α, модифицированный 20 кДа тРЕС-О-пара-метилфенил-О-2метилпропиональдегидом (верхняя панель) и 20 кДа тРЕС-О-пара-фенилацетальдегидом (нижняя панель).
Фиг. 9 А-В представляют собой графики, на которых изображена фармакокинетика ^модифицированного и различных пегилированных образцов ΣΕN-β-1а человека. Фиг. 9А: немодифицированный ΣΕNβ-1α (верхняя панель) и ΣΕN-β-1а, модифицированный 20 кДа тРЕС-О-пара-фенилпропиональдегидом (нижняя панель). Фиг. 9В: ΣΕN-β-1а, модифицированный 20 кДа тРЕС-О-мета-фенилацетальдегидом (верхняя панель) и 20 кДа тРЕС-О-мета-метилфенил-О-2-метилпропиональдегидом (нижняя панель).
Фиг. 10 представляет собой гистограмму, на которой сравнивается однократное введение модифицированного 20 кДа РЕС-О-2-метилпропиональдегидом ΣΕN-β-1а с ежедневным введением ^модифицированного ΣΕN-β-1а по восстановлению количества радиально ориентированных новых сосудов у мышей пи/пи, несущих клетки злокачественной меланомы человека 8К-МЕБ-1: однократное лечение контрольным наполнителем только в 1 день (столбик А); лечение 1 МП (5 мкг) немодифицированного ΣΕN-β-1а ежедневно в 1-9 дни включительно (столбик В); лечение 1 Ми (10 мкг) модифицированного 20 кДа тРЕС-О-2-метилпропиональдегидом ΣΕN-β-1а только один раз в 1 день (столбик С); и лечение контрольным наполнителем ежедневно в 1-9 дни включительно (столбик Ώ).
Подробное описание изобретения
Изобретение направлено на соединения и способы, применимые для лечения различных заболеваний и расстройств. Как объясняется более подробно ниже, такие заболевания и расстройства, в частности, включают заболевания и расстройства, которые поддаются терапевтическому лечению интерфероном, включая, но не ограничиваясь указанным, вирусные инфекции, такие как инфекции гепатита, и аутоиммунные заболевания, такие как множественный склероз.
Представленные в описании соединения включают новые активированные соединения полиалкиленгликоля согласно формуле I
Р—X—9---(Υ)«—(СНА—сн—к ζ , где Р является водорастворимым полимером, таким как полимер полиалкиленгликоля. Неограничивающий список таких полимеров включает другие гомополимеры полиалкиленоксидов, такие как полипропиленгликоли, полиоксиэтиленированные полиолы, их сополимеры и их блок-сополимеры. Другие примеры подходящих водорастворимых и непептидных полимерных основных цепей включают поли(оксиэтилированный полиол), поли(олефиновый спирт), поли(винилпирролидон), поли(гидроксипропилметакриламид), поли(а-оксикислота), поли(виниловый спирт), полифосфазен, полиоксазолин, поли^-акриллоилморфолин) и сополимеры, тройные сополимеры и их смеси. В одном варианте основной цепью полимера является поли(этиленгликоль) или монометоксиполиэтиленгликоль (тРЕС), имеющий среднюю молекулярную массу примерно от 200 до 400000 Да. Следует понимать, что другие родственные полимеры также подходят для применения в практике данного изобретения и подразумевается, что в этом отношении использование термина РЕС или поли(этиленгликоль) является включающим, а не исключающим указанное. Термин РЕС включает поли(этиленгликоль) в любых его формах, включая алкокси-РЕС, бифункциональный РЕС, мультиветвящийся РЕС, раздвоенный РЕС, разветвленный РЕС, РЕС с подвешенными группами или РЕС с деградируемыми связями в молекуле.
В классе соединений, представленных формулой I, имеется от 0 до 5 метиленовых групп между Υ и атомом углерода, содержащим Ζ (например, п равно нулю или является целым числом от 1 до 5) и т равно 0 или 1, например, Υ присутствует или отсутствует.
X и Υ независимо являются О, 8, СО, СО2, СО8, 8О, 8О2, СΟNК', 8Ο2NК' или ΝΒ.'. В некоторых вариантах X и Υ являются кислородом.
Р означает С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил (включая конденсированные бициклические и связанные мостиками бициклические кольцевые структуры), замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил означает С1-С20 насыщенный или ненасыщенный алкил, или гетероалкарильную группу. Заместителями могут быть галоген, гидроксил, карбонил, карбоксилат, сложный эфир, формил, ацил, тиокарбонил, сложный тиоэфир, тиоацетат, тиоформиат, алкоксил, фосфорил, фосфонат, фосфинат, аминогруппа, амидогруппа, амидин, имин, цианогруппа, нитрогруппа, азидогруппа, сульфгидрил, сульфат, сульфонамидогруппа, сульфонил, гетероциклил, аралкил, ароматический остаток, гетероароматический остаток, иминогруппа, сульфамоил, сульфонат, силил, простой эфир или алкилтиогруппа.
- 16 009783
Заместитель Ζ является водородом, насыщенной или ненасыщенной С1-С20 алкильной или гетероалкильной группой с прямой или разветвленной цепью, С3-С8 насыщенным или ненасыщенным циклическим алкилом или циклическим гетероалкилом, замещенной или незамещенной арильной или гетероарильной группой или замещенным или незамещенным алкарилом, где алкил является С1-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильной группой. Заместителями могут быть галоген, гидроксил, карбонил, карбоксилат, сложный эфир, формил, ацил, тиокарбонил, сложный тиоэфир, тиоацетат, тиоформиат, алкоксил, фосфорил, фосфонат, фосфинат, аминогруппа, амидогруппа, амидин, имин, цианогруппа, нитрогруппа, азидогруппа, сульфгидрил, сульфат, сульфонат, сульфамоил, сульфонамидогруппа, сульфонил, гетероциклил, аралкил, ароматический остаток, гетероароматический остаток, иминогруппа, силил, простой эфир или алкилтиогруппа.
В том случае, когда X или Υ является ΝΒ.', К' может быть водородом, насыщенной или ненасыщенной С1-С20 алкильной или гетероалкильной группой с прямой или разветвленной цепью, С3-С8 насыщенным или ненасыщенным циклическим алкилом или циклическим гетероалкилом, замещенной или незамещенной арильной или гетероарильной группой или замещенным или незамещенным алкарилом, где алкил является С^С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильной группой. Заместителями могут быть галоген, гидроксил, карбонил, карбоксилат, сложный эфир, формил, ацил, тиокарбонил, сложный тиоэфир, тиоацетат, тиоформиат, алкоксил, фосфорил, фосфонат, фосфинат, аминогруппа, амидогруппа, амидин, имин, цианогруппа, нитрогруппа, азидогруппа, сульфгидрил, сульфат, сульфонат, сульфамоил, сульфонамидогруппа, сульфонил, гетероциклил, аралкил, ароматический остаток, гетероароматический остаток, иминогруппа, силил, простой эфир или алкилтиогруппа.
К является химически активной функциональной группой, т.е. активирующим остатком, способным взаимодействовать с образованием мостика или связи между соединением формулы I и биологически активным соединением или его предшественником. Таким образом, К представляет собой «активирующую группу» активированных соединений полиалкиленгликоля (РОС), представленных формулой I. К может быть, например, карбоновой кислотой, сложным эфиром, альдегидом, гидратом альдегида, ацеталем, гидроксильной группой, защищенный гидроксильной группой, карбонатом, алкенилом, акрилатом, метакрилатом, акриламидом, замещенным или незамещенным тиолом, галогеном, замещенным или незамещенным амином, защищенным амином, гидразидом, защищенным гидразидом, сукцинимидилом, изоцианатом, изотиоцианатом, дитиопиридином, винилпиридином, йодацетамидом, эпоксидом, гидроксисукцинимидилом, азолом, малеимидом, сульфоном, аллилом, винилсульфоном, трезилом, сульфо-Νсукцинимидилом, дионом, мезилом, тозилом или глиоксалем. В конкретных вариантах К является гидратом альдегидом.
Конкретные примеры К в литературе включают Ν-сукцинимидилкарбонат (см., например, патенты США № 5281698, 5468478), амин (см., например, Висктапп е! а1. Макгото1. Сйет. 182: 1379 (1981), Ζαρйрзку е! а1. Еиг. Ро1ут. 1. 19: 1177 (1983)), гидразид (см., например, Апбгехх е! а1. Макгото1. Сйет. 179: 301 (1978)), сукцинимидилпропионат и сукцинимидилбутаноат (см., например, Окоп е! а1. в Ро1у(е!йу1епе д1усо1) Сйеткйу апб Вю1одюа1 Аррйсабопк, рр. 170-181, Наггк апб Ζηρ1ίρ51ςν Ебк., АС8, ХУаЧипдЮп. ОС, 1997; см. также патент США № 5672662), сукцинимидилсукцинат (см., например, ЛЬисйо\\'5к| е! а1. Сапсег Вюсйет. Вюрйук. 7: 175 (1984) и 1оррюй е! а1. Масго1о1. Сйет. 180: 1381 (1979)), сложный сукцинимидиловый эфир (см., например, патент США № 4670417), карбонат бензотриазола (см., например, патент США № 5650234), глицидиловый эфир (см., например, Рййа е! а1. Еиг. 1. Вюсйет. 94: 11 (1979), Е1йпд е! а1., Вю!есй. Арр1. Вюсйет. 13: 354 (1991)), оксикарбонилимидазол (см., например, Веаисйатр, е! а1., Апа1. Вюсйет. 131: 25 (1983), ТопбеШ е! а1. 1. Соп1го11еб Ке1еаке 1: 251 (1985)), паранитрофенилкарбонат (см., например, Vе^оие8е, е! а1., Арр1. Вюсйет. Вю!есй., 11: 141 (1985); и 8аг!оге е! а1., Арр1. Вюсйет. Вю!есй., 27: 45 10 (1991)), альдегид (см., например, Наггк е! а1. 1. Ро1ут. 8с1. Сйет. Еб. 22: 341 (1984), патент США № 5824784, патент США 5252714), малеимид (см., например, Оообкоп е! а1. Вю/Тесйпо1оду 8: 343 (1990), Коташ е! а1. в Сйеткйу ок Рерйбек апб РгоГетк 2: 29 (1984) и Кодап, 8уп!йебс Сотт. 22: 2417 (1992)), ортопиридилдисульфид (см., например, ^одЫгеп, е! а1. Вюсоп). Сйет. 4: 314 (1993)), акрилол (см., например, 8а^йпеу 15 е! а1., Масгото1еси1е§, 26: 581 (1993)), винилсульфон (см., например, патент США № 5900461). Кроме того, две молекулы полимера согласно данному изобретению также могут быть связаны с аминокислотой лизином с образованием дизамещенного лизина, который затем можно дополнительно активировать Ν-гидроксисукцинимидом с образованием активного остатка Ν-сукцинимидила (см., например, патент США № 5932462).
Термины «функциональная группа», «активный остаток», «активная группа», «активирующая группа», «активирующий остаток», «реакционноспособный участок», «химически активная группа» и «химически реакционноспособный остаток» используют в данной области и в данном описании для указания отдельных, определяемых частей и элементов молекулы. Термины до некоторой степени являются синонимами в области химии и используются в данном описании для того, чтобы указать части молекул, обладающие характерной химической активностью, и которые обычно химически активны по отношению к другим молекулам. Подразумевается, что термин «активный» при использовании в связи с функциональными группами включает те функциональные группы, которые легко взаимодействуют с электрофильными или нуклеофильными группами других молекул, в отличие от тех групп, которые требуют
- 17 009783 сильных катализаторов или в значительно степени трудно осуществимых условий реакций для взаимодействия. Например, как может быть понятно в данной области, термин «активный сложный эфир» может включать такие сложный эфиры, которые легко взаимодействуют с нуклеофильными группами, такими как амины. Как правило, активный сложный эфир будет взаимодействовать с амином в водной среде в течение минут, тогда как некоторые сложные эфиры, такие как сложные метиловый или этиловый эфиры, требуют сильного катализатора для того, чтобы взаимодействовать с нуклеофильной группой.
В соединениях согласно изобретению, которые определены выше, функциональная группа Я становится связывающим остатком, Я*, после того, как она прореагировала с биологически активной молекулой с образованием связывания или связи между активированным соединением полиалкиленгликоля (РСС) и биологически активным соединением. Таким образом, В является биологически активным соединением после конъюгации с РОС, а Я* является остатком, образованным в результате взаимодействия Я на активированном РОС с одной или несколькими химически активными функциональными группами на биологически активном соединении В, так что в результате возникает одна ковалентная связь между РОС и биологически активным соединением. В предпочтительном варианте, Я* является остатком, образованным в результате взаимодействия Я на активированном РОС с одной химически активной функциональной группой на биологически активном соединении, так что в результате происходит ковалентное связывание между активированным соединением полиалкиленгликоля (РОС) и биологически активным соединением.
Присутствие РОС предпочтительно не оказывает неблагоприятного воздействия на биологически активное соединение или его предшественник (В). Кроме того, В либо естественно имеет функциональную группу, которая способна взаимодействовать и образовать связь с активированным РОС, либо модифицировано так, чтобы оно содержало такую реакционноспособную группу.
В используемом в данном описании смысле предшественник В является неактивной или менее активной формой В, которая превращается в активную или более активную форму, соответственно, при контактировании с физиологическими условиями, например, при введении субъекту. Такие изменения могут быть конформационными или структурными изменениями, включая, но не ограничиваясь указанным, превращение защищенной формы в незащищенную форму В. В используемом в данном описании смысле такое изменение не включает высвобождение конъюгированных РОС согласно данному изобретению.
Как подразумевается в данной области, термин «защищенный» относится к присутствию защитной группы или остатка, который препятствует взаимодействию химически активной функциональной группы при определенных условиях реакции. Защитная группа будет варьировать в зависимости от типа защищаемой химически активной группы. Например, если химически активной группой является амин или гидразид, защитная группа может быть выбрана из группы трет-бутилоксикарбонила (ΐ-Вос) и 9флуоренилметоксикарбонила (Ршос). Если химически активной группой является тиол, защитной группой может быть ортопиридилдисульфид. Если химически активной группой является карбоновая кислота, такая как бутановая или пропионовая кислота, или гидроксильная группа, защитной группой может быть бензил или алкильная группа, такая как метил или этил. Другие защитные группы, известные в данной области, также могут быть использованы в изобретении.
Термины «связывающий остаток», «связывание» или «линкер» в данном описании используются по отношению к остаткам или связям, которые образуются в результате химической реакции и, как правило, являются ковалентными связями. Таким образом, связывание, представленное связью Я*-В в указанных выше формулах, возникает в результате реакции между активированным остатком Я в РОС с биологически активным соединением, т.е. В'. Я* является связывающим остатком, образованным из Я при взаимодействии с В', и В является биологически активным соединением, конъюгированным с РОС в результате взаимодействия функциональной группы в В' с Я.
В используемом в данном описании смысле термин «биологически активное соединение» относится к таким соединениям, которые демонстрируют один или несколько биологических ответов или действий при введении субъекту и содержат химически активные остатки, которые способны взаимодействовать и конъюгировать по меньшей мере с одним активированным РОС согласно изобретению. Термин «биологически активная молекула», «биологически активный остаток» или «биологически активное средство» при использовании в данном описании означает любое вещество, которое может влиять на любые физические или биохимические свойства любого субъекта, включая, но не ограничивая указанным, вирусы, бактерии, грибы, растения, животных и человека. В частности, в используемом в данном описании смысле биологически активные молекулы включают любое вещество, предназначенное для диагностики, облегчения, лечения или профилактики заболевания человека или других животных или для улучшения иным образом физического или психического здоровья людей и животных.
Примеры биологически активных молекул включают, но не ограничены указанным, пептиды, аналоги пептидов, белки, ферменты, малые молекулы, красители, липиды, нуклеозиды, олигонуклеотиды, аналоги олигонуклеотидов, сахара, олигосахариды, клетки, вирусы, липосомы, микрочастицы, поверхности и мицеллы.
Классы биологически активных средств, которые подходят для применения в случае данного изо
- 18 009783 бретения, включают, но не ограничены указанным, хемокины, лимфокины, антитела, растворимые рецепторы, противоопухолевые средства, седативные средства, гормоны, факторы роста, антибиотики, фунгициды, фунгистатические средства, противовирусные средства, стероидные средства, противомикробные средства, гермицидные средства, антипиретики, антидиабетические средства, бронходилататоры, антидиарейные средства, средства расширения коронарных сосудов, гликозиды, спазмолитики, противогипертонические средства, антидепрессанты, успокоительные средства, другие психотерапевтические средства, кортикостероиды, анальгетики, контрацептивы, нестероидные противовоспалительные лекарственные средства, средства, понижающие уровень глюкозы в крови, средства, понижающие уровень холестерина, противосудорожные средства, другие противоэпилептические средства, иммуномодуляторы, антихолинергические средства, симпатолитики, симпатомиметики, сосудорасширяющие средства, антикоагулянты, противоаритмические средства, простагландины, имеющие различные фармакологические активности, диуретики, вспомогательные средства для сна, антигистаминные средства, противоопухолевые средства, онколитические средства, антиандрогены, противомалярийные средства, противолепрозные средства и различные другие типы лекарственных средств. См. Ооойтап апй Ойтап'5 Тке Ва515 о£ Ткегареийск (Νίηΐΐι Еййюп, Регдатоп Рге§5, 1пс., И8Л, 1996) и Тке Мегск 1пйех (ТЫйеейк Еййюп, Мегск апй Со., 1пс., И8Л, 2001), каждая из которых включена в данное описание в виде ссылки.
Биологически активные соединения включают любое соединение, которое демонстрирует биологический ответ в своей имеющейся форме, или любое соединение, которое демонстрирует биологический ответ в результате химического превращения его структуры из его имеющейся формы. Например, биологически активные соединения будут включать любое соединение, которое содержит защитную группу, которая при отщеплении приводит в результате к соединению, которое вызывает биологический ответ. Такое отщепление может быть, например, результатом взаимодействия соединения ίη νί\Ό с эндогенными ферментами или реакции соединения перед введением, включая его взаимодействие с активированными РОС согласно данному изобретению. В качестве следующего примера биологически активные соединения также будут включать любое соединение, которое подвергается стереопревращению ίη νί\Ό или ех νί\Ό с образованием соединения, которое вызывает биологический ответ или действие.
Биологически активные соединения обычно содержат несколько химически активных участков, в которых возможно ковалентное связывание активированного РОС. Например, аминогруппы могут подвергаться ацилированию, сульфгидрильные группы могут подвергаться реакциям присоединения и алкилированию, карбонильные и карбоксильные группы могут подвергаться ацилированию, и альдегидные и гидроксильные группы могут подвергаться аминированию или восстановительному аминированию. Одну или несколько из указанных реакций можно использовать при получении модифицированных полиалкиленгликолем биологически активных соединений согласно изобретению. Кроме того, биологически активные соединения можно модифицировать с образованием реакционноспособных остатков в соединении, которые облегчают такие реакции и получаемую в результате конъюгацию с активированным РОС.
Специалистам в данной области будут известны многочисленные имеющиеся механизмы реакций для облегчения конъюгации активированного РОС с биологически активным соединением. Например, в том случае, когда активирующим остатком К является группа гидразида, она может быть ковалентно связана с сульфгидрилом, остатками сахара и карбонильным остатком в биологически активных соединениях (после того, как указанные остатки подвергаются окислению с получением альдегидов). В реакции активирующих остатков гидразида (К) с альдегидами в биологически активных соединениях (В') создается гидразонная связь (К*-В). В том случае, когда К является малеимидной группой, она может взаимодействовать с сульфгидрильной группой с образованием стабильной тиоэфирной связи. Если сульфгидрильные группы не присутствуют в биологически активном соединении, то их можно создать посредством восстановления дисульфида или посредством тиолирования 2-иминотиоланом или 8ЛТЛ. Когда К является сложным имидоэфиром, он может взаимодействовать с первичными аминами в В' с образованием имидоамидной связи. Конъюгация сложного имидоэфира обычно осуществляется в диапазоне рН 8,5-9,0. При связывании активированных РОС с биологически активными белками сложные имидоэфиры обеспечивают преимущество по сравнению с другими К-группами, так как они не влияют на общий заряд белка. Они несут положительный заряд при физиологическом рН, как и первичные амины, которые они заменяют. Реакции со сложными имидоэфирами проводят в диапазоне от 0°С до комнатной температуры (например, при 4°С) или при повышенных температурах в безводных условиях. Когда К является сложным NН8-эфиром, его главной мишенью являются первичные амины. Доступные αаминогруппы, например группы, присутствующие на Ν-концах пептидов и белков, взаимодействуют со сложными NН8-эфирами с образованием ковалентной амидной связи.
В некоторых вариантах К*-В является гидролитически стабильной связью. Гидролитически стабильная связь означает, что связь в значительной степени стабильна в воде и не взаимодействует с водой при используемых значениях рН, например, связь является стабильной при физиологических условиях в течение длительного периода времени, возможно даже бесконечно. В других вариантах К*-В является гидролитически нестабильной или деградируемой связью. Гидролитически нестабильная связь означает,
- 19 009783 что связь разрушается в воде или в водных растворах, включая, например, кровь. Энзиматически нестабильные или деградируемые связи также означают, что связь может быть разрушена одним или несколькими ферментами.
Как известно в данной области, полиалкилен и родственные полимеры могут содержать деградируемые связи в основной цепи полимера или линкерную группу между основной цепью полимера и одной или несколькими концевыми функциональными группами молекулы РОС. Например, сложноэфирные связи, образованные в результате взаимодействия, например, карбоновых кислот РОС или активированных карбоновых кислот РОС со спиртовыми группами в биологически активном соединении, обычно гидролизуются при физиологических условиях с высвобождением средства. Другие гидролитически деградируемые связи включают карбонатные связи; иминные связи, возникающие в результате взаимодействия амина и альдегида (см., например, ОиеЫ е! а1., Ро1утег РгерпЩз, 38 (1): 582-3 (1997)); связи сложного фосфатного эфира, образованные в результате взаимодействия спирта с фосфатной группой; ацетальные связи, которые являются продуктом реакции альдегида и спирта; связи сложных ортоэфиров, которые являются продуктом реакции формиата и спирта; пептидные связи, образованные аминогруппой, например, на конце РОС и карбоксильной группой пептида; и олигонуклеотидные связи, образованные фосфорамидитной группой, например, на конце полимера и 5'-гидроксильной группой олигонуклеотида.
Полиалкиленгликоль Р может быть полиэтиленгликолем, имеющим структуру формулы II
Е- (О-СН2СН2)а-, где а является целым числом от 4 до 10000 и Е является водородом или С1-С2о алкильной группой с прямой или разветвленной цепью, регистрируемой меткой или остатком, подходящим для образования связи между соединением формулы I и биологически активным соединением или его предшественником.
Таким образом, когда Е является остатком, подходящим для образования связи между соединением формулы I и биологически активным соединением или его предшественником, Е может быть карбоновой кислотой, сложным эфиром, альдегидом, гидратом альдегида, ацеталем, гидроксильной группой, защищенной гидроксильной группой, карбонатом, алкенилом, акрилатом, метакрилатом, акриламидом, замещенным или незамещенным тиолом, галогеном, замещенным или незамещенным амином, защищенным амином, гидразидом, защищенным гидразидом, сукцинимидилом, изоцианатом, изотиоцианатом, дитиопиридином, винилпиридином, йодацетамидом, эпоксидом, гидроксисукцинимидилом, азолом, малеимидом, сульфоном, аллилом, винилсульфоном, трезилом, сульфо-№сукцинимидилом, дионом, мезилом, тозилом или глиоксалем. Должно быть понятно, что Е должен быть совместим с К, так чтобы не происходила реакция между Е и К.
Под «регистрируемой меткой» имеется в виду любая метка, поддающаяся регистрации. Неограничивающие примеры включают радиоактивные изотопы, флуоресцентные остатки, фосфоресцентные остатки, хемилюминесцентные остатки и квантовые метки. Другие регистрируемые метки включают биотин, цистеин, гистидин, гемагглютинин, тус- или Над-метки.
В некоторых вариантах Е имеет структуру согласно формуле III или формуле IV
Формула III
К.---НС—(СН2)^---(¥)т--О---X—С\У2СУ/2--Ζ >
Формула IV к-’--нс—(снд^—х—ον/2σν2— ζ .
Каждый 0, X, Υ, Ζ, т и η имеют значения, определенные выше, и каждый V независимо означает водород или С1-С7 алкил.
В данном классе соединений К'' является остатком, подходящим для образования связи между соединением формулы III и биологически активным соединением или его предшественником; и К''' является остатком, подходящим для образования связи между соединением формулы IV и биологически активным соединением или его предшественником.
К'' и К''' могут быть карбоновой кислотой, сложным эфиром, альдегидом, гидратом альдегида, ацеталем, гидроксильной группой, защищенной гидроксильной группой, карбонатом, алкенилом, акрилатом, метакрилатом, акриламидом, замещенным или незамещенным тиолом, галогеном, замещенным или незамещенным амином, защищенным амином, гидразидом, защищенным гидразидом, сукцинимидилом, изоцианатом, изотиоцианатом, дитиопиридином, винилпиридином, йодацетамидом, эпоксидом, гидроксисукцинимидилом, азолом, малеимидом, сульфоном, аллилом, винилсульфоном, трезилом, сульфо-Νсукцинимидилом, дионом, мезилом, тозилом или глиоксалем. Должно быть понятно, что К'' и К''' должны быть совместимы с К, так чтобы не происходила реакция с К.
- 20 009783
В используемом в данном описании смысле К'' и К''' при конъюгации с биологически активным соединением или его предшественником образуют связывающие остатки, которые определены выше. Таким образом, К** является связывающим остатком, образованным в результате взаимодействия К''группы или К'''-группы на активированном РОС с реакционноспособной функциональной группой на биологически активном соединении, так что происходит ковалентное связывание между РОС и биологически активным соединением. К и К'' или К''' могут представлять собой одни и те же остатки, и биологически активные соединения, связываемые с каждым из них, могут быть одинаковыми или разными.
В используемом в данном описании смысле термин «алкил» относится к радикалу насыщенных алифатических групп, включая алкильные группы с прямой цепью, алкильные группы с разветвленной цепью, циклоалкильные (алициклические) группы, замещенные алкилом циклоалкильные группы и замещенные циклоалкилом алкильные группы. В предпочтительных вариантах алкил с прямой цепью или разветвленной цепью содержит 30 или меньше атомов углерода в своей основной цепи (например, С1-С30 в случае прямой цепи, С3-С30 в случае разветвленной цепи) и более предпочтительно 20 или меньше. Подобным образом, предпочтительные циклоалкилы содержат 3-10 атомов углерода в своей циклической структуре и более предпочтительно содержат 5, 6 или 7 атомов углерода в своей циклической структуре.
Кроме того, подразумевается, что термин «алкил» (или «низший алкил») включает как «незамещенные алкилы», так и «замещенные алкилы», последние из которых относятся к алкильным остаткам, содержащим заместители, замещающие водород у одного или нескольких атомов углерода основной углеводородной цепи. Такие заместители могут, например, включать галоген, гидроксил, карбонил (такой как карбоксил, алкоксикарбонил, формил или ацил), тиокарбонил (такой как сложный тиоэфир, тиоацетат или тиоформиат), алкоксил, фосфорил, фосфонат, фосфинат, аминогруппу, амидогруппу, амидин, имин, цианогруппу, нитрогруппу, азидогруппу, сульфгидрил, алкилтиогруппу, сульфат, сульфонат, сульфамоил, сульфонамидогруппу, сульфонил, гетероциклил, аралкил или ароматический или гетероароматический остаток. Специалистам в данной области будет понятно, что остатки, введенные в качестве заместителей углеводородной цепи, сами по себе могут быть замещены, если это уместно. Например, заместители замещенного алкила могут включать замещенные и незамещенные формы аминогруппы, азидогруппы, иминогруппы, амидогруппы, фосфорила (включая фосфонат и фосфинат), сульфонила (включая сульфат, сульфонамидогруппу, сульфамоил и сульфонат) и силильной группы, а также простые эфиры, алкилтиогруппы, карбонилы (включая кетоны, альдегиды, карбоксилазы и сложные эфиры), -СЕ3, -ΟΝ и тому подобное. Циклоалкилы, кроме того, могут быть замещены алкилами, алкенилами, алкоксигруппами, алкилтиогруппами, аминоалкилами, замещенными карбонилом алкилами, -СЕ3, -ΟΝ и тому подобным.
Термин «аралкил» в используемом в данном описании смысле относится к алкильной группе, замещенной арильной группой (например, ароматической или гетероароматической группой). Примеры аралкильных групп включают, но не ограничены указанным, бензил и в более общем виде (СН2)пРй, где Р11 означает фенил или замещенный фенил и η равно 1, 2 или 3.
Термины «алкенил» и «алкинил» относятся к ненасыщенным алифатическим группам аналогичным по длине и возможному замещению описанным выше алкилам, но которые содержат по меньшей мере одну двойную или тройную связь, соответственно.
Если количество атомов углерода не оговорено особо, «низший алкил» в используемом в данном описании смысле означает алкильную группу, которая определена выше, но содержащую от одного до десяти атомов углерода, более предпочтительно от одного до шести атомов углерода в своей структуре основной цепи. Подобным образом «низший алкенил» и «низший алкинил» имеют сходные длины цепей. Предпочтительными алкильными группами являются низшие алкилы. В предпочтительных вариантах заместитель, указанный в данном описании как алкил, является низшим алкилом.
Термин «арил» в используемом в данном описании смысле включает 5-, 6- и 7-членные однокольцевые ароматические группы, которые могут содержать от нуля до четырех гетероатомов, например, бензол, пиррол, фуран, тиофен, имидазол, оксазол, тиазол, триазол, пиразол, пиридин, пиразин, пиридазин и пиримидин и тому подобное. Указанные арильные группы, содержащие гетероатомы в кольцевой структуре, также могут быть названы «арильными гетероциклами» или «гетероароматическими соединениями». Ароматический цикл может быть замещен в одном или нескольких положениях цикла такими заместителями, которые описаны выше, например, галогеном, азидом, алкилом, аралкилом, алкенилом, алкинилом, циклоалкилом, гидроксилом, алкоксилом, аминогруппой, нитрогруппой, сульфгидрилом, иминогруппой, амидогруппой, фосфонатом, фосфинатом, карбонилом, карбоксилом, силилом, простым эфиром, алкилтиогруппой, сульфонилом, сульфонамидогруппой, кетоном, альдегидом, сложным эфиром, гетероциклилом, ароматическими или гетероароматическими остатками, -СЕ3, -ϋΝ или тому подобным. Термин «арил» также включает полициклические кольцевые системы, содержащие два или более циклических колец, в которых два или более атомов углерода являются общими для двух соседних колец (кольца являются «конденсированными кольцами»), в которых по меньшей мере одно из колец является ароматическим, например, другие циклические кольца могут быть циклоалкилами, циклоалкенилами, циклоалкинилами, арилами и/или гетероциклилами.
Термины «орто», «мета» и «пара» применяются по отношению к 1,2-, 1,3- и 1,4-дизамещенным бен
- 21 009783 золам, соответственно. Например, названия 1,2-диметилбензол и орто-диметилбензол являются синонимами.
Термины «гетероциклил» или «гетероциклическая группа» относятся к 3-10-членным кольцевым структурам, более предпочтительно 3-7-членным кольцам, циклические структуры которых содержат от 1 до 4 гетероатомов. Гетероциклы также могут быть полициклами. Гетероциклические группы включают, например, тиофен, тиантрен, фуран, пиран, изобензофуран, хромен, ксантен, феноксатиин, пиррол, имидазол, пиразол, изотиазол, изоксазол, пиридин, пиразин, пиримидин, пиридазин, индолизин, изоиндол, индол, индазол, пурин, хинолизин, изохинолин, хинолин, фталазин, нафтиридин, хиноксалин, хиназолин, циннолин, птеридин, карбазол, карболин, фенантридин, акридин, пиримидин, фенантролин, феназин, фенарсазин, фенотиазин, фуразан, феноксазин, пирролидин, оксолан, тиолан, оксазол, пиперидин, пиперазин, морфолин, лактоны, лактамы, такие как азетидиноны и пирролидиноны, сультамы, сультоны и т.п. Гетероциклическое кольцо может быть замещено в одном или нескольких положениях заместите лями, которые описаны выше, такие, например, как галоген, алкил, аралкил, алкенил, алкинил, циклоалкил, гидроксил, аминогруппа, нитрогруппа, сульфгидрил, иминогруппа, амидогруппа, фосфонат, фосфинат, карбонил, карбоксил, силил, простой эфир, алкилтиогруппа, сульфонил, кетон, альдегид, сложный эфир, гетероциклил, ароматический или гетероароматический остаток, -СР3, -СЦ или тому подобное.
Термин «карбоцикл» в используемом в данном описании смысле относится к ароматическому или неароматическому кольцу, в котором каждый атом кольца является атомом углерода.
Гетероциклы и карбоциклы включают конденсированные бициклические и связанные мостиками бициклические кольцевые структуры.
В используемом в данном описании смысле термин «нитрогруппа» означает -Ν02; термин «галоген» означает -Р, -С1, -Вг или -I; термин «сульфгидрил» означает -8Н; термин «гидроксил» означает -ОН и термин «сульфонил» означает -802-.
Термины «амин» и «аминогруппа» являются общепризнанными в данной области и относятся как к незамещенным, так и замещенным аминам, например, остатку, который может быть представлен общей формулой
в которой К9, К10 и К'10 каждый независимо означает водород, алкил, алкенил, -(СН2)т-К8, или К9 и К10 вместе с атомом Ν, с которым они связаны, достраивают гетероцикл, имеющий от 4 до 8 атомов в кольцевой структуре; К8 означает арил, циклоалкил, циклоалкенил, гетероцикл или полицикл; и т равно 0 или является целым числом в пределах от 1 до 8.
Термин «алкиламин» в используемом в данном описании смысле означает аминогруппу, которая определена выше, имеющую связанный с ней замещенный или незамещенный алкил, т.е. по меньшей мере один из К9 и К10 является алкильной группой.
Термин «ациламиногруппа» является общепризнанным в данной области и относится к остатку, который может быть представлен общей формулой
где К9 имеет значение, определенное выше и К'п означает водород, алкил, алкенил или -(СН2)т-К8, где т и К8 имеют значения, определенные выше.
Термин «амидогруппа» является общепризнанным в данной области как аминозамещенный карбонил и включает остаток, который может быть представлен общей формулой
где К9, К10 имеют значения, определенные выше.
Предпочтительные варианты амида не будут включать имиды, которые могут быть нестабильными.
Термин «амидин» является общепризнанным в данной области как группа, которая может быть представлена общей формулой
- 22 009783
где Κ9, Κ10 имеют значения, определенные выше.
Термин «гуанидин» является общепризнанным в данной области как группа, которая может быть представлена общей формулой
где К9, К10 имеют значения, определенные выше.
Термин «алкилтиогруппа» относится к алкильной группе, которая определена выше, имеющей связанный с ней радикал серы. В предпочтительных вариантах «алкилтиоостаток» представлен одним из следующих остатков: -8-алкил, -8-алкенил, -8-алкинил и -8-(СН2)т-К8, где т и К8 определены выше. Типичные алкилтиогруппы включают метилтиогруппу, этилтиогруппу и тому подобное.
Термин «карбонил» является общепризнанным в данной области и включает остатки, которые могут быть представлены общей формулой
О О
-И-х-п,, л“_х_11-к.
г где X является связью или означает кислород или серу, и К11 означает водород, алкил, алкенил, -(СН2)т-К8 или фармацевтически приемлемую соль, К'11 означает водород, алкил, алкенил или -(СН2)т-К8, где т и К8 имеют значения, определенные выше. В том случае, когда X является кислородом и К11 или К'11 не являются водородом, формула представляет «сложный эфир». В том случае, когда X является кислородом и К11 имеет значение, определенное выше, остаток в данном описании называют карбоксильной группой, и, в частности, когда К11 является водородом, формула представляет «карбоновую кислоту». Когда X является кислородом и К'11 является водородом, формула означает «формиат». В общем, когда атом кислорода в указанной выше формуле заменен серой, формула означает «тиолкарбонильную» группу. Когда X является серой и К11 или К'11 не является водородом, формула означает «сложный тиоэфир». Когда X является серой и К11 является водородом, формула означает «тиокарбоновую кислоту». Когда X является серой и К'11 является водородом, формула означает «тиоформиат». С другой стороны, когда X является связью и К11 не является водородом, указанная выше формула означает «кетонную» группу. Когда X является связью и К11 является водородом, указанная выше формула оз начает «альдегидную» группу.
Термины «алкоксил» или «алкоксигруппа» в используемом в данном описании смысле относится к алкильной группе, которая определена выше, имеющей связанный с ней кислородный радикал. Типичные алкоксильные группы включают метокси-, этокси-, пропилокси-, трет-бутоксигруппу и тому подобное. «Простой эфир» представляет собой два углеводорода, ковалентно связанных кислородом. Соответственно, заместитель алкила, который превращает данный алкил в простой эфир, является или имеет сходство с алкоксилом, таким, который может быть представлен одной из групп: -О-алкил, -О-алкенил, -О-алкинил, -О-(СН2)т-К8, где т и К8 имеют значения, описанные выше.
Термин «сульфонат» является общепризнанным в данной области и включает остаток, который может быть представлен общей формулой
О
II
ОН41
II о в которой К41 является электронной парой, водородом, алкилом, циклоалкилом или арилом.
Термин «сульфат» является общепризнанным в данной области и включает остаток, который может быть представлен общей формулой
в которой К41 имеет значение, определенное выше. Термин «сульфонамидогруппа» является общепризнанным в данной области и включает остаток, который может быть представлен общей формулой
- 23 009783
в которой К9 и К'11 имеют значения, определенные выше.
Термин «сульфамоил» является общепризнанным в данной области и включает остаток, который может быть представлен общей формулой
в которой К9 и К10 имеют значения, определенные выше.
Термин «сульфонил» в используемом в данном описании смысле относится к остатку, который может быть представлен общей формулой
I?
о в которой К44 выбран из группы, состоящей из водорода, алкила, алкенила, алкинила, циклоалкила, гетероциклила, арила или гетероарила.
Термин «сульфоксидогруппа» в используемом в данном описании смысле относится к остатку, который может быть представлен общей формулой
О
II —5-К„ в которой К44 выбран из группы, состоящей из водорода, алкила, алкенила, алкинила, циклоалкила, гетероциклила, аралкила или арила.
Будет понятно, что «замещение» или «замещенный» включает подразумеваемое условие, что такое замещение находится в соответствии с допустимой валентностью замещаемого атома и заместителя и что результатом замещения является стабильное соединение, например, соединение, которое спонтанно не подвергается такому превращению, как при перестановке, циклизации, элиминировании и т.д.
Предполагается, что используемый в данном описании термин «замещенный» включает все допустимые заместители органических соединений. В широком аспекте допустимые заместители включают ациклические и циклические, разветвленные и неразветвленные, карбоциклические и гетероциклические, ароматические и неароматические заместители органических соединений. Иллюстративные заместители включают, например, заместители, описанные выше. Допустимых заместителей может быть один или несколько, и они могут быть одинаковыми или разными в случае соответствующих органических соединений. В целях данного изобретения гетероатомы, такие как азот, могут иметь водородные заместители и/или любые допустимые заместители органических соединений, описанные в данном изобретении, которые удовлетворяют валентностям гетероатомов. Имеется в виду, что данное изобретение ни коим образом не ограничено допустимыми заместителями органических соединений.
Полный список сокращений, используемых химиками-органиками, специалистами в данной области, публикуется в первом выпуске каждого тома 1оигпа1 о£ Огдаше Сйет181гу; данный список обычно представлен в таблице, озаглавленной «Стандартный список сокращений». Сокращения, имеющиеся в указанном списке, и все сокращения, используемые химиками-органиками, специалистами в данной области, включены таким образом в виде ссылки.
В некоторых вариантах соединения согласно изобретению имеют структуру согласно формуле V
(Ь)а
X, Υ, т, η, Ζ и К' имеют значения, определенные выше, и К является активирующим остатком, который определен выше, подходящим для образования связи между соединением формулы V и биологически активным соединением или предшественником. В конкретных вариантах К является гидратом альдегида.
Р имеет значение, определенное выше, и может быть представлен формулой II
Е- (О-СН2СН2)а-, где Е имеет значение, описанное выше, и в некоторых вариантах может быть представлен формулами III или IV.
Т1 и Т2 независимо отсутствуют или являются насыщенным или ненасыщенным С1-С20 алкильной или гетероалкильной группой с прямой или разветвленной цепью, С3-С8 насыщенным или ненасыщен
- 24 009783 ным циклическим алкилом или циклическим гетероалкилом, замещенной или незамещенной арильной или гетероарильной группой или замещенным или незамещенным алкарилом, где алкил является С1-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильной группой. Заместителями могут быть галоген, гидроксил, карбонил, карбоксилат, сложный эфир, формил, ацил, тиокарбонил, сложный тиоэфир, тиоацетат, тиоформиат, алкоксил, фосфорил, фосфонат, фосфинат, аминогруппа, амидогруппа, амидин, имин, цианогруппа, нитрогруппа, азидогруппа, сульфгидрил, сульфат, сульфонат, сульфамоил, сульфонамидогруппа, сульфонил, гетероциклил, аралкил, ароматический остаток, гетероароматический остаток, иминогруппа, силил, простой эфир или алкилтиогруппа.
Когда ά равен 0, дополнительных заместителей (Р) в ароматическом цикле нет. Когда ά является целым числом от 1 до 4, заместителями (Р) могут быть насыщенная или ненасыщенная С1-С20 алкильная или гетероалкильная группа, С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил, замещенная или незамещенная арильная или гетероарильная группа или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил является С1-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильная группа. Заместителями могут быть галоген, гидроксил, карбонил, карбоксилат, сложный эфир, формил, ацил, тиокарбонил, сложный тиоэфир, тиоацетат, тиоформиат, алкоксил, фосфорил, фосфонат, фосфинат, аминогруппа, амидогруппа, амидин, имин, цианогруппа, нитрогруппа, азидогруппа, сульфгидрил, сульфат, сульфонат, сульфамоил, сульфонамидогруппа, сульфонил, гетероциклил, аралкил, ароматический остаток, гетероароматический остаток, иминогруппа, силил, простой эфир или алкилтиогруппа.
В том случае, когда К является альдегидом, соединения относятся к соединениям, представленным формулой VI
где все другие переменные имеют значения, определенные выше.
Например, когда X и Υ являются кислородом, а К является альдегидом, соединения согласно изобретению представлены соединением I
где заместители Т1 и Т2 могут быть в орто-, мета- или пара-положении.
В том случае, когда заместители Т1 и Т2 являются алкильными группами с прямой цепью и ά равно 0, соединения представлены формулой IX
где каждый и независимо равен 0 или является целым числом от 1 до 5, а все другие переменные имеют значения, определенные выше. В конкретных вариантах Ζ является водородом или метилом.
Конкретные классы соединений, относящихся к формуле IX, могут быть представлены формулами VII и VIII
Формула VII
- 25 009783
Некоторые типичные активированные соединения полиалкиленгликоля включают следующие соединения, в которых является полимером полиалкиленгликоля РЕО или тРЕО
Соединения согласно изобретению представлены формулой X
где как указано выше η равно 0 или является целым числом от 1 до 5 и X означает О, 8, СО, СО2, СО8, 80, 8О2, СОНК', 8Ο2NК' или ΝΒ'.
В том случае, когда X является ΝΕ.', К' может быть водородом, насыщенной или ненасыщенной С1-С20 алкильной или гетероалкильной группой с прямой или разветвленной цепью, С3-С8 насыщенным или ненасыщенным циклическим алкилом или циклическим гетероалкилом, замещенной или незамещенной арильной или гетероарильной группой или замещенным или незамещенным алкарилом, где алкил является С1-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильной группой, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксила, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира или алкилтиогруппы. Ζ может быть насыщенной или ненасыщенной С1-С20 алкильной или гетероалкильной группой с прямой или разветвленной цепью, С3-С8 насыщенным или ненасыщенным циклическим алкилом или циклическим гетероалкилом, замещенной или незамещенной арильной или гетероарильной группой или замещенным или незамещенным алкарилом, где алкил является С1-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильной группой. При наличии заместителями могут быть галоген, гидроксил, карбонил, карбоксилат, сложный эфир, формил, ацил, тиокарбонил, сложный тиоэфир, тиоацетат, тиоформиат, алкоксил, фосфорил, фосфонат, фосфинат, аминогруппа, амидогруппа, амидин, имин, цианогруппа, нитрогруппа, азидогруппа, сульфгидрил, сульфат, сульфонат, сульфамоил, сульфонамидогруппа, сульфонил, гетероциклил, аралкил, ароматический остаток, гетероароматический остаток, иминогруппа, силил, простой эфир или алкилтиогруппа.
Как определено выше, К является активирующим остатком, подходящим для образования связи между соединением формулы X и биологически активным соединением или его предшественником. В некоторых вариантах К является гидратом альдегида.
Р является полимером полиалкиленгликоля, который определен выше, и может быть представлен формулой II
Е- (О-СН2СН2)а-, где Е и а имеют значения, описанные выше, и в некоторых вариантах могут быть представлены формулой III или IV. В некоторых вариантах Е является метилом и, следовательно, Р представляет собой тРЕО.
В том случае, когда К является альдегидом и X является кислородом, соединения относятся к структуре согласно формуле XI
- 26 009783
где Р, Ζ и η имеют значения, определенные для формулы X. В том случае, когда Р является тРЕС, соединения описываются формулой XI.
и когда η равно 1 и Ζ является метилом, соединение представлено формулой XIII
где а является целым числом от 4 до 10000.
Примеры путей синтеза для получения соединений согласно изобретению приведены в примерах ниже.
Изобретение также включает в себя композиции активированных соединений полиалкиленгликоля (РСС) согласно изобретению и одного или нескольких биологически активных соединений. Как описано выше, биологически активными соединениями являются такие соединения, которые демонстрируют биологический ответ или действие при введении субъекту. Кроме соединений согласно изобретению субъекту могут быть введены неконъюгированные биологически активные соединения. Кроме того, биологически активные соединения могут содержать химически активные группы, которые способны взаимодействовать и конъюгировать по меньшей мере с одним активированным РСС согласно изобретению.
В описании также представлены конъюгаты новых РСС с биологически активными соединениями. В одном варианте конъюгаты образуются из соединения формулы I и биологически активного соединения (В) и описываются согласно формуле XIV
Р--X---О---(¥к-(СН2)—СН—к*—в
Ζ ,
Как указано выше т равно 0 или 1, так что Υ присутствует или отсутствует, η равно 0 или является целым числом от 1 до 5 и X и Υ независимо означают О, 8, СО, СО2, СО8, 80, 8О2, СОХК', 8Ο2ΝΚ' или ΝΚ'.
О означает С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил (включая конденсированные бициклические и связанные мостиками бициклические кольцевые структуры), замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил означает С1-С20 насыщенный или ненасыщенный алкил, или гетероалкарильную группу. В том случае, если заместители присутствуют, заместителями могут быть галоген, гидроксил, карбонил, карбоксилат, сложный эфир, формил, ацил, тиокарбонил, сложный тиоэфир, тиоацетат, тиоформиат, алкоксил, фосфорил, фосфонат, фосфинат, аминогруппа, амидогруппа, амидин, имин, цианогруппа, нитрогруппа, азидогруппа, сульфгидрил, сульфат, сульфонат, сульфамоил, сульфонамидогруппа, сульфонил, гетероциклил, аралкил, ароматический остаток, гетероароматический остаток, иминогруппа, силил, простой эфир или алкилтиогруппа.
Каждый К' и Ζ независимо означает водород, насыщенную или ненасыщенную С1-С20 алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью, С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил, замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил является С1-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксила, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтио группы;
- 27 009783
К* означает связывающий остаток, образованный в результате взаимодействия К с соответствующей функциональной группой на биологически активном соединении В, как описано выше. Например, К* образован в результате взаимодействия такого остатка, как функциональная группа карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида, ацеталя, гидроксила, защищенного гидроксила, карбоната, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, замещенного или незамещенного тиола, галогена, замещенного или незамещенного амина, защищенного амина, гидразида, защищенного гидразида, сукцинимидила, изоцианата, изотиоцианата, дитиопиридина, винилпиридина, йодацетамида, эпоксида, гидроксисукцинимидила, азола, малеимида, сульфона, аллила, винилсульфона, трезила, сульфо-Νсукцинимидила, диона, мезила, тозила или глиоксаля с биологически активным соединением или его предшественником.
Р является полимером полиалкиленгликоля, который определен выше, и может быть представлен формулой II
Е- (О-СН2СН2)а-, где Е означает водород, С1-С20 алкильную группу с прямой или разветвленной цепью (например, метил), регистрируемую метку или остаток, подходящий для образования связи между соединением формулы XIV и биологически активным соединением или его предшественником. Как указано выше, а является целым числом от 4 до 10000.
В том случае, когда Е является регистрируемой меткой, метка может быть, например, радиоактивным изотопом, флуоресцентным остатком, фосфоресцентным остатком, хемилюминесцентным остатком или квантовой меткой.
Когда Е является остатком, подходящим для образования связи между соединением формулы XIV и биологически активным соединением или его предшественником, Е может образовывать связь с другой молекулой биологически активного соединения (В), так что активированное соединение полиалкиленгликоля связано на каждом конце с молекулой одного и то же типа биологически активного соединения с образованием димера молекулы.
В некоторых вариантах Е образует связь с другим биологически активным соединением, отличным от В, с созданием гетеродимера биологически активных соединений или их предшественников.
В других вариантах Е образует дополнительную связь с биологически активным соединением В так что как Е, так и К связаны посредством разных функциональных групп одной и той же молекулы биологически активного соединения или его предшественника.
В том случае, когда Е способен образовывать связь с биологически активной молекулой или ее предшественником, Е может быть таким же как К или отличным от К и выбран из остатков карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида, ацеталя, гидроксильной группы, защищенной гидроксильной группы, карбоната, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, замещенного или незамещенного тиола, галогена, замещенного или незамещенного амина, защищенного амина, гидразида, защищенного гидразида, сукцинимидила, изоцианата, изотиоцианата, дитиопиридина, винилпиридина, йодацетамида, эпоксида, гидроксисукцинимидила, азола, малеимида, сульфона, аллила, винилсульфона, трезила, сульфо-Ц-сукцинимидила, диона, мезила, тозила и глиоксаля.
Когда Е способен образовывать связь с биологически активной молекулой или ее предшественником, Е может иметь структуру согласно формуле III или формуле IV
Формула III
К---НС—(СН2)5---(У)т--(?—х—С\У2С\У2--Ζ
Формула IV
К'----НС--(СН^---X---СУУ2С\У2--Ζ где каждый Ц, X, Υ, Ζ, т и η независимо имеют значения, которые определены выше, каждый независимо означает водород или С1-С7 алкил, К'' является остатком, подходящим для образования связи между соединением формулы III и биологически активным соединением или его предшественником, и К''' является остатком, подходящим для образования связи между соединением формулы IV и биологически активным соединением или его предшественником.
К'' и К''' независимо выбраны из остатков карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида, ацеталя, гидроксильной группы, защищенной гидроксильной группы, карбоната, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, замещенного или незамещенного тиола, галогена, замещенного или незамещенного амина, защищенного амина, гидразида, защищенного гидразида, сукцинимидила, изоцианата, изотиоцианата, дитиопиридина, винилпиридина, йодацетамида, эпоксида, гидроксисукцинимидила, азола, малеимида, сульфона, аллила, винилсульфона, трезила, сульфо-Ц-сукцинимидила, диона, мезила, тозила и глиоксаля.
- 28 009783
Когда Р в формуле XIV является замещенным или незамещенным алкарилом конъюгат образуется из активированного полиалкиленгликоля формулы V и биологически активной молекулы (В) и описывается согласно формуле XV
(Ь)а , где Т1 и Т2 независимо отсутствуют или являются насыщенной или ненасыщенной С1-С2о алкильной или гетероалкильной группой с прямой или разветвленной цепью, С3-С8 насыщенным или ненасыщенным циклическим алкилом или циклическим гетероалкилом, замещенной или незамещенной арильной или гетероарильной группой или замещенным или незамещенным алкарилом, где алкил является С1-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильной группой. В том случае, если присутствуют заместители, заместителями могут быть галоген, гидроксил, карбонил, карбоксилат, сложный эфир, формил, ацил, тиокарбонил, сложный тиоэфир, тиоацетат, тиоформиат, алкоксил, фосфорил, фосфонат, фосфинат, аминогруппа, амидогруппа, амидин, имин, цианогруппа, нитрогруппа, азидогруппа, сульфгидрил, сульфат, сульфонат, сульфамоил, сульфонамидогруппа, сульфонил, гетероциклил, аралкил, ароматический остаток, гетероароматический остаток, иминогруппа, силил, простой эфир или алкилтиогруппа. В некоторых вариантах Т1 и Т2 в случае присутствия являются насыщенной или ненасыщенной С1-С20 алкильной или гетероалкильной группой с прямой или разветвленной цепью.
ά равно 0 (например, в ароматическом цикле нет заместителей Ь) или является целым числом от 1 до 4. Каждый Ь в случае присутствия означает насыщенную или ненасыщенную СгС20 алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью, С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил, замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил является СГС20 насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильную группу. Заместителями могут быть галоген, гидроксил, карбонил, карбоксилат, сложный эфир, формил, ацил, тиокарбонил, сложный тиоэфир, тиоацетат, тиоформиат, алкоксил, фосфорил, фосфонат, фосфинат, аминогруппа, амидогруппа, амидин, имин, цианогруппа, нитрогруппа, азидогруппа, сульфгидрил, сульфат, сульфонат, сульфамоил, сульфонамидогруппа, сульфонил, гетероциклил, аралкил, ароматический остаток, гетероароматический остаток, иминогруппа, силил, простой эфир или алкилтиогруппа.
Все другие переменные имеют значения, описанные выше, включая Р, который означает полимер полиалкиленгликоля и может быть представлен формулой II
Е-(О-СН2СН2) а-, где Е означает водород, СГС20 алкильную группу с прямой или разветвленной цепью (например, метил), регистрируемую метку или остаток, подходящий для образования связи между соединением формулы XV и биологически активным соединением или его предшественником. Как указано выше, а является целым числом от 4 до 10000.
В том случае, когда Е является регистрируемой меткой, метка может быть, например, радиоактивным изотопом, флуоресцентным остатком, фосфоресцентным остатком, хемилюминесцентным остатком или квантовой меткой.
Когда Е является остатком, подходящим для образования связи между соединением формулы XV и биологически активным соединением В, Е может образовывать связь с другой молекулой биологически активного соединения (В), так что активированное соединение полиалкиленгликоля связано на каждом конце с молекулой одного и то же типа биологически активного соединения с образованием димера молекулы.
В некоторых вариантах Е образует связь с другим биологически активным соединением, отличным от В, с созданием гетеродимера биологически активных соединений или их предшественников.
В других вариантах Е образует дополнительную связь с биологически активным соединением В так что как Е, так и Я связаны посредством разных функциональных групп одной и той же молекулы биологически активного соединения или его предшественника.
В том случае, когда Е способен образовывать связь с биологически активной молекулой или ее предшественником, Е может быть таким же как Я или отличным от Я и выбран из остатков карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида, ацеталя, гидроксильной группы, защищенной гидроксильной группы, карбоната, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, замещенного или незамещенного тиола, галогена, замещенного или незамещенного амина, защищенного амина, гидразида, защищенного гидразида, сукцинимидила, изоцианата, изотиоцианата, дитиопиридина, винилпиридина, йодацетамида, эпоксида, гидроксисукцинимидила, азола, малеимида, сульфона, аллила, винилсульфона, трезила, сульфо-Х-сукцинимидила, диона, мезила, тозила и глиоксаля.
Когда Е может образовывать связь с биологически активным соединением или его предшественником, Е может быть представлен формулой III или формулой IV
- 29 009783
Формула ΙΙΙ
к.---нс—(сн2)^---(У)т—ς—х—са2са2— ζ
>
Формула Ιν
К'---НС—(СН^--X---СУГ2СУГ2--Ζ , где каждый (Э, X, Υ, Ζ, т и п независимо имеют значения, которые определены выше, каждый А независимо означает водород или С1-С7 алкил, К'' является остатком, подходящим для образования связи между соединением формулы ΙΙΙ и биологически активным соединением или его предшественником, и К''' является остатком, подходящим для образования связи между соединением формулы Ιν и биологически активным соединением или его предшественником.
К'' и К''' независимо выбраны из остатков карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида, ацеталя, гидроксильной группы, защищенной гидроксильной группы, карбоната, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, замещенного или незамещенного тиола, галогена, замещенного или незамещенного амина, защищенного амина, гидразида, защищенного гидразида, сукцинимидила, изоцианата, изотиоцианата, дитиопиридина, винилпиридина, йодацетамида, эпоксида, гидроксисукцинимидила, азола, малеимида, сульфона, аллила, винилсульфона, трезила, сульфо-^сукцинимидила, диона, мезила, тозила и глиоксаля.
В случае связывания на обоих концах с биологически активным соединением или его предшественником данные бифункциональные молекулы могут быть представлены согласно формуле XX или формуле ΧΧΙ
Формула XX
Формула XXI
где каждый X и Υ, Τι и Т2, К' и Ζ, Ь, (Э, т, п, а и п имеют значения, описанные выше, и каждый А независимо означает водород или С1-С7 алкил. К* и К** независимо являются связывающими остатками, образованными в результате взаимодействия К и К'' с биологически активным соединением или его предшественником, и каждый В и В' является биологически активным соединением или его предшественником после конъюгации с К и К'', соответственно.
В некоторых вариантах В и В' представляют собой один и тот же тип биологически активного соединения. В других вариантах В и В' являются разными биологически активными соединениями. Кроме того, в других вариантах В и В' являются одной и той же биологически активной молекулой. В дополнительных вариантах К* и К** являются одинаковыми. В других вариантах К* и К** являются разными. Например, в некоторых вариантах Ε может образовывать связь с другой молекулой биологически активного соединения (В=В'), так что активированное РОС на каждом конце связано с молекулой одного и того же типа биологически активного соединения с образованием димера молекулы. В некоторых вариантах Ε образует связь с другим биологически активным соединением, отличным от В (В не является В'), с образованием гетеродимера биологически активных соединений или их предшественников. В других вариантах Ε образует дополнительную связь с биологически активным соединением В, так что и Ε (посредством К'' или К'''), и К связаны посредством разных функциональных групп одной и той же молекулы биологически активного соединения или его предшественника.
В некоторых вариантах К* или К** является метиленовой группой и В или В' является биологически активной молекулой, содержащей аминогруппу, при этом метиленовая группа образует связь с аминогруппой на В. Например, амин может быть аминоконцом пептида, амином боковой цепи аминокислоты в пептиде или амином гликозилирующего заместителя гликозилированного пептида. В некоторых вариантах пептид является интерфероном, таким как интерферон-бета, например, интерферон-бета-1а. В некоторых вариантах указанный тип связи образуется в результате реакции восстановительного алкилирования.
- 30 009783
В том случае, когда заместители Т1 и Т2 формулы XV являются алкильными группами с прямой цепью, X и Υ являются кислородом и ά равно 0, конъюгаты представлены формулой XIX
где каждый и независимо равен 0 или является целым числом от 1 до 5, и все другие переменные имеют значения, определенные выше. В конкретных вариантах Ζ является водородом или метилом.
Конкретные классы соединений, относящихся к формуле XV, могут быть представлены формулами XVII и XVIII и образованы в результате взаимодействия соединений формул VII и VIII, соответственно, с биологически активным соединением или его предшественником
где η равно 0 или является целым числом от 1 до 5,
Р означает полимер полиалкиленгликоля, который описан выше,
Ζ означает водород, насыщенную или ненасыщенную С1-С20 алкильную или гетероалкильную группу,
К* является связывающим остатком, который описан выше,
В является биологически активной молекулой.
Данные соединения могут быть бифункциональными или монофункциональными в зависимости от особенностей Е, которые описаны выше.
В некоторых вариантах К* является метиленовой группой и В является биологически активной молекулой, содержащей аминогруппу, при этом метиленовая группа образует связь с аминогруппой на В. Например, амин может быть аминоконцом пептида, амином боковой цепи аминокислоты в пептиде или амином гликозилирующего заместителя гликозилированного пептида. В некоторых вариантах пептид является интерфероном, таким как интерферон-бета, например, интерферон-бета-1а. В некоторых вариантах указанный тип связи образуется в результате реакции восстановительного алкилирования.
Конъюгаты согласно изобретению также могут быть образованы в результате взаимодействия соединений согласно формуле X с биологически активным соединением или его предшественником с образованием конъюгатов согласно формуле XXII р—х— (СНА—сн—к*—в ζ
где В является биологически активной молекулой, как описано выше, и η равно 0 или является целым числом от 1 до 5.
X означает О, 8, СО, СО2, СО8, 8О, 8О2, СΟNК', 8О2\1<' или ΝΕ', в том случае, когда X является ΝΕ', К' означает водород, насыщенную или ненасыщенную С1-С20 алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью, С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил, замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил является С1-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильную группу. В случае наличия заместителями могут быть галоген, гидроксил, карбонил, карбоксилат, сложный эфир, формил, ацил, тиокарбонил, сложный тиоэфир, тиоацетат, тиоформиат, алкоксил, фосфорил, фосфонат, фосфинат, аминогруппа, амидогруппа, амидин, имин, цианогруппа, нитрогруппа, азидогруппа, сульфгидрил, сульфат, сульфонат, сульфамоил, сульфонамидогруппа, сульфонил, гетероциклил, аралкил, ароматический остаток, гетероароматический остаток, иминогруппа, силил, простой эфир и алкилтиогруппа.
Ζ означает насыщенную или ненасыщенную С1-С20 алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью, С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или цикличе
- 31 009783 ский гетероалкил, замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил является С1-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильную группу. Заместителями могут быть галоген, гидроксил, карбонил, карбоксилат, сложный эфир, формил, ацил, тиокарбонил, сложный тиоэфир, тиоацетат, тиоформиат, алкоксил, фосфорил, фосфонат, фосфинат, аминогруппа, амидогруппа, амидин, имин, цианогруппа, нитрогруппа, азидогруппа, сульфгидрил, сульфат, сульфонат, сульфамоил, сульфонамидогруппа, сульфонил, гетероциклил, аралкил, ароматический остаток, гетероароматический остаток, иминогруппа, силил, простой эфир и алкилтиогруппа.
К* означает связывающий остаток, образованный в результате взаимодействия К с соответствующей функциональной группой на биологически активном соединении В, которое описано выше. Например, К* образуется в результате взаимодействия такого остатка, как функциональная группа карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида, ацеталя, гидроксила, защищенного гидроксила, карбоната, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, замещенного или незамещенного тиола, галогена, замещенного или незамещенного амина, защищенного амина, гидразида, защищенного гидразида, сукцинимидила, изоцианата, изотиоцианата, дитиопиридина, винилпиридина, йодацетамида, эпоксида, гидроксисукцинимидила, азола, малеимида, сульфона, аллила, винилсульфона, трезила, сульфо-Νсукцинимидила, диона, мезила, тозила или глиоксаля, с биологически активным соединением или его предшественником.
В некоторых вариантах Ζ является метилом и η равно 1.
Р означает полимер полиалкиленгликоля, который определен выше и может быть представлен формулой II
Е- (О-СН2СН2) а , где Е означает водород, С1-С20 алкильную группу с прямой или разветвленной цепью (например, метил), регистрируемую метку или остаток, подходящий для образования связи между соединением формулы XXII и биологически активным соединением или его предшественником. Как указано выше, а является целым числом от 4 до 10000.
В том случае, когда Е является регистрируемой меткой, метка может быть, например, радиоактивным изотопом, флуоресцентным остатком, фосфоресцентным остатком, хемилюминесцентным остатком или квантовой меткой.
Когда Е является остатком, подходящим для образования связи с биологически активной молекулой или ее предшественником, в результате образуется бифункциональная молекула. Е может образовывать связь с другой молекулой биологически активного соединения (В), так что активированное соединение полиалкиленгликоля связано на каждом конце с молекулой одного и то же типа биологически активного соединения с образованием димера молекулы.
В некоторых вариантах Е образует связь с другим биологически активным соединением, отличным от В, с созданием гетеродимера биологически активных соединений или их предшественников.
В других вариантах Е образует дополнительную связь с биологически активным соединением В, так что как Е, так и К связываются посредством разных функциональных групп одной и той же молекулы биологически активного соединения или его предшественника.
В том случае, когда Е способен образовывать связь с биологически активной молекулой или ее предшественником, Е может быть таким же как К или отличным от К и выбран из остатков карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида, ацеталя, гидроксильной группы, защищенной гидроксильной группы, карбоната, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, замещенного или незамещенного тиола, галогена, замещенного или незамещенного амина, защищенного амина, гидразида, защищенного гидразида, сукцинимидила, изоцианата, изотиоцианата, дитиопиридина, винилпиридина, йодацетамида, эпоксида, гидроксисукцинимидила, азола, малеимида, сульфона, аллила, винилсульфона, трезила, сульфо-Ы-сукцинимидила, диона, мезила, тозила и глиоксаля.
В некоторых вариантах Е может иметь структуру согласно формуле III или формуле IV Формула III
К---НС—(СН2У;---(У)го--0--X— СУ/2СА2--Ζ ,
Формула IV
К'---НС—(СН^--X---С\У2СУ/2--Ζ , где каждый О, X, Υ, Ζ, т и η независимо имеют значения, которые определены выше, каждый А независимо означает водород или С1-С7 алкил, К'' является остатком, подходящим для образования связи между соединением формулы III и биологически активным соединением или его предшественником, и К''' является остатком, подходящим для образования связи между соединением формулы IV и биологически ак
- 32 009783 тивным соединением или его предшественником.
К'' и К''' независимо выбраны из остатков карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида, ацеталя, гидроксильной группы, защищенной гидроксильной группы, карбоната, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, замещенного или незамещенного тиола, галогена, замещенного или незамещенного амина, защищенного амина, гидразида, защищенного гидразида, сукцинимидила, изоцианата, изотиоцианата, дитиопиридина, винилпиридина, йодацетамида, эпоксида, гидроксисукцинимидила, азола, малеимида, сульфона, аллила, винил сульфона, трезила, сульфо-Ы-сукцинимидила, диона, мезила, тозила и глиоксаля и могут быть такими же как К или отличными от К.
В случае связывания на обоих концах с биологически активным соединением или его предшественником данные бифункциональные молекулы могут быть представлены согласно формуле XXIV или формуле XXV
Формула XXIV
где каждый X и Υ независимо означает О, 8, СО, СО2, СО8, 8О, 8О2, ΓΌΝΕ'. 8О2ИК' или ΝΡ.'. и каждый К' и Ζ независимо означает водород, насыщенную или ненасыщенную С1-С20 алкильную или гетероалькильную группу с прямой или разветвленной цепью.
О означает С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил (включая конденсированные бициклические и связанные мостиками бициклические кольцевые структуры), замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил означает С1-С20 насыщенный или ненасыщенный алкил, или гетероалкарильную группу. В случае присутствия заместителями могут быть галоген, гидроксил, карбонил, карбоксилат, сложный эфир, формил, ацил, тиокарбонил, сложный тиоэфир, тиоацетат, тиоформиат, алкоксил, фосфорил, фосфонат, фосфинат, аминогруппа, амидогруппа, амидин, имин, цианогруппа, нитрогруппа, азидогруппа, сульфгидрил, сульфат, сульфонамидогруппа, сульфонил, гетероциклил, аралкил, ароматический остаток, гетероароматический остаток, иминогруппа, сульфамоил, сульфонат, силил, простой эфир или алкилтиогруппа.
Каждый А независимо означает водород или С1-С7 алкил, т равно 0 или 1, а является целым числом от 4 до 10000 и каждый п независимо равен 0 или является целым числом от 1 до 5.
К* и К** независимо являются связывающими остатками, которые описаны выше, В и В' независимо являются биологически активными молекулами и могут быть одинаковыми или разными.
Е (посредством К'' или К''') может образовывать связь с другой молекулой биологически активного соединения (В), так что активированное соединение полиалкиленгликоля связывается на каждом конце с молекулой одного и того же типа биологически активного соединения с образованием димера молекулы.
В некоторых вариантах Е (посредством К'' или К''') образует связь с другим биологически активным соединением, отличным от В, с образованием гетеродимера биологически активных соединений или их предшественников.
В других вариантах Е (посредством К'' или К''') образует дополнительную связь с биологически активным соединением В, так что и Е, и К связываются посредством разных функциональных групп одной и той же молекулы биологически активного соединения или его предшественника.
К'' и К''' могут быть такими как К или отличными от К и выбраны из остатков карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида, ацеталя, гидроксильной группы, защищенной гидроксильной группы, карбоната, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, замещенного или незамещенного тиола, галогена, замещенного или незамещенного амина, защищенного амина, гидразида, защищенного гидразида, сукцинимидила, изоцианата, изотиоцианата, дитиопиридина, винилпиридина, йодацетамида, эпоксида, гидроксисукцинимидила, азола, малеимида, сульфона, аллила, винилсульфона, трезила, сульфо-И-сукцинимидила, диона, мезила, тозила и глиоксаля.
В некоторых вариантах К* или К** является метиленовой группой и В или В' является биологически активной молекулой, содержащей аминогруппу, при этом метиленовая группа образует связь с аминогруппой на В. Например, амин может быть аминоконцом пептида, амином боковой цепи аминокисло
- 33 009783 ты в пептиде или амином гликозилирующего заместителя гликозилированного пептида. В некоторых вариантах пептид является интерфероном, таким как интерферон-бета, например, интерферон-бета-1а. В некоторых вариантах указанный тип связи образуется в результате реакции восстановительного алкилирования.
Конъюгаты согласно изобретению могут быть получены посредством связывания биологически активного соединения с соединением полиалкиленгликоля, как описано в примерах. В некоторых вариантах связывание осуществляется посредством реакции восстановительного алкилирования.
Представляющие интерес биологически активные соединения включают любое вещество, предназначенное для диагностики, облегчения состояния, лечения или профилактики заболевания человека или других животных, или для улучшения иным образом физического или психического здоровья людей и животных. Примеры биологически активных молекул включают, но не ограничены указанным, пептиды, аналоги пептидов, белки, ферменты, малые молекулы, красители, липиды, нуклеозиды, олигонуклеотиды, аналоги олигонуклеотидов, сахара, олигосахариды, клетки, вирусы, липосомы, микрочастицы, поверхности и мицеллы. Данный класс соединений также включает предшественники указанных типов молекул. Классы биологически активных средств, которые подходят для применения в случае данного изобретения, включают, но не ограничены указанным, цитокины, хемокины, лимфокины, растворимые рецепторы, антитела, антибиотики, фунгициды, противовирусные средства, противовоспалительные средства, противоопухолевые средства, сердечно-сосудистые средства, седативные средства, гормоны, факторы роста, стероидные средства и тому подобное.
Биологически активным соединением может быть пептид, такой как интерферон, включая интерферон-бета (например, интерферон-бета-1а) или интерферон-альфа.
Так как модификация полимером РОС согласно изобретению снижает антигенные ответы, не требуется, чтобы чужеродный пептид был полностью аутологичным для того, чтобы его использовать в качестве терапевтического средства. Например, пептид, такой как интерферон, используемый для получения полимерных конъюгатов, может быть получен из экстракта из млекопитающего, как интерферон человека, жвачного животного или быка, или может быть получен синтетическим или рекомбинатным способом.
Например, в одном аспекте изобретение относится к соединениям и способам лечения состояний, которые поддаются лечению интерфероном альфа или бета. Введение конъюгированного с полиалкиленгликолем интерферона бета (в дальнейшем «РОС Ш№бета», «РОС ΣΕΝ-β», например, «РЕО ΕΝбета», «РЕО ΓΕΝ-β», «пегилированный [ΕΝ-бета» или «пегилированный 0-1'1») дает улучшенный терапевтический эффект наряду с существенным снижением или полным исключением нежелательных побочных эффектов, обычно связанных с обычно используемыми на практике схемами лечения интерфероном альфа или бета.
РОС ШЫ-бета может быть получен посредством связывания полиалкиленового полимера с концевой аминогруппой молекулы ШИ бета. Одна молекула активированного полиалкиленгликоля может быть конъюгирована с Ν-концом ШМ бета в результате реакции восстановительного алкилирования.
Конъюгат РОС ШК-бета может быть приготовлен, например, в виде жидкости или лиофилизованного порошка для инъекции. Целью конъюгации ΞΕΝ бета с РОС является улучшение доставки белка при значительном пролонгировании его времени полужизни в плазме и тем самым обеспечение продолжительной активности ΞΕΝ бета.
Термин «интерферон» или «ΞΕΝ» в используемом в данном описании смысле означает семейство высокогомологичных видоспецифичных белков, которые ингибируют репликацию вирусов и пролиферацию клеток и модулируют иммунный ответ. Интерфероны человека сгруппированы в два класса; тип 1, включающий α- и β-интерферон, и тип II, который представлен только γ-интерфероном. Сконструированы и коммерчески доступны рекомбинантные формы каждой группы. Подтипы в каждой группе основаны на антигенных/структурных признаках.
Термины «бета интерферон», «бета-интерферон», «бета ^ΕΝ», «бета-ШИ», «β интерферон», «βинтерферон», «β ΖΕΝ», «β-!ΕΝ», «интерферон бета», «интерферон-бета». «интерферон β», «интерферонβ», «ΧΕΝ бета», «ШИ-бета», «ΧΕΝ β», «IΕN-β» и «интерферон фибробластов человека» используются в данном описании взаимозаменяемо, чтобы описать представителей группы интерферонов бета, которые имеют особые аминокислотные последовательности, которые идентифицированы с помощью выделения и секвенирования ДНК, кодирующей пептиды.
Кроме того, термины «бета интерферон 1а», «бета интерферон-!;·!», «бета-интерферон 1а», «бетаинтерферон-1а», «бета 1а», «бета !ΕΝ-13», «бета-ШЛ 1а», «бета-[ΕN-1а». «β интерферон 1а», «β интерферон-1а», «β-интерферон 1а», «β-интерферон-1а», «β 1а», «β «β^ΕΝ 1а», «β-[ΕN-1а».
«интерферон бета 1а», «интерферон бета-1а», «интерферон-бета 1а», «интерферон-бета-1а», «интерферон β 1а», «интерферон β-Ηι», «интерферон-β-1а», «интерферон-β-1а». ^ΕΝ бета 1а», ^ΕΝ бета-1а», бета 1а», «IΕN-бета-1а», «ШИ' β 1а», ^ΕΝ (5-10^, ^ΕΝ-β 1а», «[ΕN-β-1а» используются в данном описании взаимозаменяемо, чтобы описать рекомбинантно или синтетически полученный интерферон бета, который имеет аминокислотные последовательности, встречающиеся в природе (дикого типа).
- 34 009783
Появление технологии рекомбинантной ДНК, применяемой для получения интерферона, позволило успешно синтезировать несколько интерферонов человека, тем самым сделав возможным крупномасштабную ферментацию, продуцирование, выделение и очистку различных интерферонов до гомогенности. Рекомбинантно полученный интерферон сохраняет некоторые или большинство его противовирусных и иммуномодулирующих активностей ίη νίίΓΟ и ίη νίνο. Также понятно, что рекомбинантные способы также могут включать сайты гликозилирования для добавления остатка углевода к рекомбинантно полученному полипептиду.
Также предполагается конструирование рекомбинантных ΌΝΆ-плазмид, содержащих последовательности, кодирующие по меньшей мере часть интерферона фибробластов человека, и экспрессия полипептида, обладающего иммунологической или биологической активностью интерферона фибробластов человека. Конструирование гибридных генов бета-интерферона, содержащих комбинации последовательностей различных подтипов, можно осуществить способами, известными специалистам в данной области.
Типичные подходящие рекомбинантные бета-интерфероны, которые можно использовать в практике изобретения, включают, но не ограничены указанным, интерферон бета-1а, такой как ΑVΟNЕX®, доступный от Бюдещ Σηο., СатЬпбде, МА, и интерферон-бета-1Ь, такой как ΒЕΤΑ8ЕКΟN®, доступный от Вег1ех, Шсйто^, СА.
Существует множество механизмов, с помощью которых ΣΕΝ-индуцированные генные продукты обеспечивают защитное действие против вирусной инфекции. Такое ингибирующее действие на вирусы происходит на разных стадиях жизненного цикла вирусов. См. патент США № 6030785. Например, ΣΕΝ может ингибировать снятие оболочки вирусных частиц, проникновение и/или слияние, вызванное вирусами.
Состояния, которые можно лечить согласно данному изобретению, обычно представляют собой состояния, которые поддаются лечению интерфероном. Например, поддающиеся лечению состояния включают состояния, которые могут положительно или благоприятно отвечать (как указанные термины известны в области медицины) на терапию, основанную на интерфероне бета. В целях данного изобретения состояния, которые можно лечить с помощью терапии интерфероном бета, описанной в данном изобретении, включают такие состояния, при которых лечение интерфероном бета проявляет определенную эффективность, но при которых отрицательные побочные эффекты лечения с помощью ΣΕN-β перевешивают полезный результат. Лечение способами согласно изобретению приводит к значительно сниженным побочным эффектам или их исключению по сравнению с обычным лечением интерфероном бета. Кроме того, состояния, традиционно считаемые неподдающимися лечению с помощью ΣΕN-β, или состояния, которые невозможно лечить достигаемой дозой ΣΕN-β, можно лечить способами согласно данному изобретению.
Соединения РОС ΣΕN-β согласно изобретению можно использовать отдельно или в комбинации с одним или несколькими средствами, применимыми для лечения конкретного состояния. Проведено по меньшей мере одно пилотное исследование рекомбинантного интерферона бета-1а для лечения хронического гепатита. См. в основном публикацию НаЬег5е1хег е! а1., Ыуег 30: 437-441 (2000), включенную в данное описание в виде ссылки. Например, соединения можно вводить в комбинации с известными противовирусными средствами для лечения вирусной инфекции. См. Какити е! а1., Са51гоеЩего1оду 105: 507-12 (1993) и Рерткку, е! а1., Σ. Рйагтасо1оду апб ЕхрептеЩа1 Тйегареибск, 297: 1059-1066 (2001), включенные в данное описание в виде ссылки.
В используемом в данном описании смысле термин «противовирусные средства» может включать, например, малые молекулы, пептиды, сахара, белки, молекулы, полученные из вирусов, ингибиторы протеаз, аналоги нуклеотидов и/или аналоги нуклеозидов. «Малая молекула» в качестве термина, который используется в данном описании, относится к органической молекуле примерно менее 2500 а.е.м. (атомные единицы массы), предпочтительно примерно менее 1000 а.е.м. Примеры подходящих противовирусных соединений включают, но не ограничены указанным, рибавирин, левовирин, МВ6866, зидовудин 3ТС, ЕТС, ацикловир, ганцикловир, вирамид, УК-497, УК-950 и Σ8Σ8-14803.
Примерные состояния, которые можно лечить с помощью интерферона, включают, но не ограничены указанным, нарушения пролиферации клеток, в частности множественный склероз, злокачественную опухоль (например, лейкоз ворсистых клеток, саркому Капоши, хронический миелогенный лейкоз, множественную миелому, карциному базальных клеток и злокачественную меланому, рак яичника, кожную Т-клеточную лимфому) и вирусные инфекции. Без ограничения лечение интерфероном можно использовать для лечения состояний, при которых лечение успешно в результате ингибирования репликации чувствительных к интерферону вирусов. Например, интерферон можно использовать отдельно или в комбинации с ΑΖΤ при терапии против вируса иммунодефицита человека (ВИЧ)/СПИД или в комбинации с рибавирином при терапии против НСУ. Вирусные инфекции, которые можно лечить согласно изобретению, включают, но не ограничены указанным, гепатит А, гепатит В, гепатит С, другой не-А/не-В гепатит, вирус герпеса, вирус Эпштейна-Барр (ЕВУ), цитомегаловирус (СМУ), простой герпес, вирус герпеса человека типа 6 (ННУ-6), папиллому, поксвирус, пикорнавирус, аденовирус, риновирус, Т
- 35 009783 лимфотропный вирус человека типа 1 и 2 (НТЬУ-1/-2), ротавирус человека, бешенство, ретровирусы, включая ВИЧ, энцефалит и респираторные вирусные инфекции. Способы согласно изобретению также можно использовать для модификации различных иммунных ответов.
Обнаружена корреляция между генотипом НСУ и ответом на терапию интерфероном. См. патент США № 6030785; ЕготоЮ е! а1., Ν. Еп§1. 1. Мей. 334: 77-81 (1996); ЕготоЮ е! а1., 1. С1ш. Ιηνοδ! 96: 22430 (1995). Процент ответа у пациентов, инфицированных НСУ-1Ь, составляет менее 40%. См. патент США № 6030785. Сходные низкие проценты ответа также наблюдались у пациентов, инфицированных НСУ-1а. См. там же; НооГпаде1 е! а1., ЮеЮгокду 37: 87-100 (1994). Однако процент ответа у пациентов, инфицированных НСУ-2, составляет около 80%. См. патент США № 6030785; Елей е! а1., 8етю. Ьтег Όίδ. 15: 82-91 (1995). В действительности обнаружено, что аминокислотная последовательность отдельной области белка Ν85Ά НСУ-генотипа 1Ь коррелирует с чувствительностью к интерферону. См. патент США № 6030785, включенный в данное описание в виде ссылки. См. также ЕпопюЮ е! а1. 1996; ЕпопюЮ е! а1. 1995. Данная область идентифицирована как область, определяющая чувствительность к интерферону (18ОК). См. там же.
Конъюгат РОС ΙΕΝ-бета вводят в фармакологически эффективном количестве для лечения любого из описанных выше состояний, и он основан на активности ΙΕΝ бета полимерного конъюгата. Термин «фармакологически эффективное количество» означает количество лекарственного средства или фармацевтического средства, которое будет вызывать биологический или терапевтический ответ ткани, системы, животного или человека, которого добивается исследователь или клиницист. Это такое количество, которое достаточно для того, чтобы в значительной степени повлиять на положительный клинический ответ при сохранении пониженных уровней побочных эффектов. Количество РОС ΙΕΝ-бета, которое можно вводить нуждающемуся в этом субъекту, находится в пределах 0,01-100 мкг/кг или более предпочтительно 0,01-10 мкг/кг, вводимых в виде однократной или дробных доз.
Введение описанных доз можно осуществлять через день, но предпочтительно его осуществляют раз в неделю или через неделю. Дозы вводят в течение периода времени, составляющего по меньшей мере 24 недели, путем инъекции.
Введение дозы может осуществляться пероральным, местным, внутривенным, подкожным, внутримышечным или любым другим приемлемым системным способом. По усмотрению лечащего врача количество вводимого лекарственного средства и используемая схема лечения конечно будет зависеть от возраста, пола и истории болезни пациента, подвергаемого лечению, числа нейтрофилов (например, тяжести нейтропении), тяжести конкретного состояния болезни и толерантности пациента к лечению, о которой свидетельствует местная токсичность и системные побочные эффекты.
На практике конъюгаты согласно изобретению вводят в количествах, которые будут достаточны для подавления или предотвращения нежелательных состояний здоровья или заболевания у субъекта, такого как млекопитающее, и используются в форме, наиболее подходящей для таких целей. Композиции предпочтительно приспособлены для внутреннего применения и содержат эффективное количество фармакологически активного соединения согласно изобретению отдельно или в комбинации с другими активными средствами с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями. Соединения особенно полезны, так как они обладают очень низкой токсичностью, если таковая имеет место.
Конъюгаты, описанные в данном изобретении, могут составлять активный ингредиент фармацевтической композиции и обычно их вводят в смеси с подходящими фармацевтическими разбавителями, эксципиентами и носителями (вместе называемыми в данном описании «веществами-носителями»), соответствующим образом выбранными в соответствии с предполагаемой формой введения, т.е. в форме пероральных таблеток, капсул, эликсиров, сиропов и т. п. Как правило, композиции буду содержать эффективное количество активного соединения или его фармацевтически приемлемой соли и, кроме того, также может содержать любые вещества-носители, которые обычно используются в фармацевтической области. В зависимости от предполагаемого способа введения композиции могут быть в твердой, полутвердой или жидкой дозированной форме, такой, например, как инъекционные препараты, таблетки, суппозитории, пилюли, капсулы замедленного высвобождения, порошки, жидкости, суспензии и т. п., предпочтительно в дозированной лекарственной форме.
Обычные фармацевтические композиции, содержащие фармакологически эффективное количество конъюгата, например, РОС ΙΕΝ-бета, вместе с фармацевтически приемлемыми носителями, адъювантами, разбавителями, консервантами и/или солюбилизаторами, можно использовать в практике данного изобретения. Фармацевтические композиции интерферона содержат разбавители различных буферов (например, аргинин, трис-НС1, ацетат, фосфат), имеющих пределы рН и ионной силы, носители (например, сывороточный альбумин человека), солюбилизаторы (например, твин, полисорбат) и консерванты (например, бензиловый спирт). См., например, патент США № 4496537.
Введение активных соединений, описанных в данном изобретении, может осуществляться с помощью любых приемлемых способов введения терапевтических средств. Указанные способы включают системное или местное введение, такое как пероральный, назальный, парентеральный, трансдермальный, подкожный или местный способы введения.
Например, для перорального введения в форме таблетки или капсулы (например, желатиновой кап
- 36 009783 сулы) активный компонент лекарственного средства можно комбинировать с пероральным, нетоксичным фармацевтически приемлемым инертным носителем, таким как этанол, глицерин, вода и тому подобное. Кроме того, при желании или необходимости в смесь также могут быть включены подходящие связующие, лубриканты, дезинтегранты и красители. Подходящие связующие включают крахмал, алюмосиликат магния, крахмальную пасту, желатин, метилцеллюлозу, натрий-карбоксиметилцеллюлозу и/или поливинилпирролидон, сахара, кукурузные подсластители, природные и синтетические камеди, такие как аравийская камедь, трагакантовая камедь или альгинат натрия, полиэтиленгликоль, воски и тому подобное. Лубриканты, используемые в указанных дозированных формах, включают олеат натрия, стеарат натрия, стеарат магния, бензоат натрия, ацетат натрия, хлорид натрия, диоксид кремния, тальк, стеариновую кислоту, ее магниевую или кальциевую соль и/или полиэтиленгликоль и т.п. Дезинтегранты включают без ограничения крахмал, метилцеллюлозу, агар, бентонит, ксантановую камедь, крахмалы, агар, альгиновую кислоту или ее натриевую соль или шипучие смеси и т.п. Разбавители включают, например, лактозу, декстрозу, сахарозу, маннит, сорбит, целлюлозу и/или глицин.
Конъюгаты согласно изобретению также можно вводить в таких пероральных дозированных формах, как таблетки или капсулы с рассчитанным по времени высвобождением и замедленным высвобождением, пилюли, порошки, гранулы, эликсиры, настои, суспензии, сиропы и эмульсии.
Жидкие, в частности инъекционные, композиции можно, например, приготовить растворением, диспергированием и т.д. Активное соединение растворяют или смешивают с фармацевтически чистым растворителем, таким как, например, вода, физиологический раствор, водная декстроза, глицерин, этанол и тому подобное, чтобы таким образом образовать инъекционный раствор или суспензию. Кроме того, можно приготовить твердые формы, подходящие для растворения в жидкости перед инъекцией. Инъекционные композиции предпочтительно представляют собой водные изотоничные растворы или суспензии. Композиции могут быть стерилизованными и/или могут содержать вспомогательные вещества, такие как консерванты, стабилизаторы, увлажнители или эмульгирующие агенты, активаторы растворения, соли для регулирования осмотического давления и/или буферы. Кроме того, они также могут содержать другие терапевтически полезные вещества.
Конъюгаты согласно данному изобретению можно вводить в виде внутривенной (например, в виде болюса или инфузии), внутрибрюшинной, подкожной или внутримышечной формы, все используемые формы хорошо известны специалистам в области фармации. Инъекционные препараты могут быть приготовлены в обычных формах, либо в виде жидких растворов, либо суспензий.
Парентеральное инъекционное введение обычно используют для подкожных, внутримышечных или внутривенных инъекций и инфузий. Например, в том случае, когда используют подкожную инъекцию для доставки 0,01-100 мкг/кг или более предпочтительно 0,01-10 мкг/кг пегилированного ΓΕΝ-бета в течение одной недели, можно вводить две инъекции по 0,005-50 мкг/кг или более предпочтительно 0,005-5 мкг/кг, соответственно, в 0 и 72 часа. Кроме того, в одном из способов парентерального введения используют имплантацию системы медленного высвобождения или длительного высвобождения, которая обеспечивает сохранение постоянного уровня дозы, согласно патенту США № 3710795, включенному в данное описание в виде ссылки.
Кроме того, предпочтительные для данного изобретения конъюгаты можно вводить в интраназальной форме посредством местного применения подходящих интраназальных наполнителей или посредством трансдермальных путей, используя формы трансдермальных кожных пластырей, которые хорошо известны специалистам в данной области. При введении в форме системы трансдермальной доставки введение дозы конечно будет непрерывным, а не периодическим в ходе всего режима дозирования. Другие предпочтительные местные препараты включают кремы, мази, примочки, аэрозоли, спреи и гели, при этом вводимое количество может быть 10-100-кратным по сравнению с дозой, обычно вводимой при парентеральном введении.
Для твердых композиций можно использовать эксципиенты, которые включают фармацевтически чистый маннит, лактозу, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, тальк, целлюлозу, глюкозу, сахарозу, карбонат магния и тому подобное. Активное соединение, определенное выше, также может быть приготовлено в виде суппозиториев с использованием в качестве носителя, например, полиалкиленгликолей, например, пропиленгликоля. В некоторых вариантах суппозитории преимущественно готовят из жировых эмульсий или суспензий.
Конъюгаты согласно данному изобретению также можно вводить в форме липосомных систем доставки, таких как небольшие однослойные везикулы, крупные однослойные везикулы и многослойные везикулы. Липосомы могут быть образованы из множества фосфолипидов, включающих холестерин, стеариламин или фосфатидилхолины. В некоторых вариантах пленка липидных компонентов гидратирована водным раствором лекарственного средства с образованием липидного слоя, инкапсулирующего лекарственное средство, как описано в патенте США № 5262564.
Конъюгаты согласно данному изобретению также могут доставляться с использованием слияний с иммуноглобулином, используемых в качестве отдельных носителей, с которыми связаны молекулы соединений. Соединения согласно данному изобретению также могут быть связаны с растворимыми полимерами в качестве направляемых к мишени носителей лекарственных средств. Такие полимеры могут
- 37 009783 включать поливинилпирролидон, сополимер пирана, полигидроксипропил-метакриламид-фенол, полигидроксиэтиласпанамидфенол или полиэтиленоксидполилизин, замещенный остатками пальмитоила. Конъюгаты также могут быть связаны с белками, такими, например, как рецепторные белки и альбумин. Кроме того, соединения согласно данному изобретению могут быть связаны с классом биодеградируемых полимеров, применимых для достижения контролируемого высвобождения лекарственного средства, например, полимолочной кислотой, полиэпсилонкапролактоном, полигидроксимасляной кислотой, сложными полиортоэфирами, полиацеталями, полидигидропиранами, полицианоакрилатами и сшитые или амфипатические блок-сополимеры гидрогелей.
При желании вводимая фармацевтическая композиция также может содержать минорные количества нетоксичных вспомогательных веществ, таких как увлажнители или эмульгирующие агенты, агенты для рН-буферов и другие вещества, такие, например, как ацетат натрия, олеат триэтаноламина и т.д.
Режим дозирования с использованием конъюгатов выбирают в соответствии с множеством факторов, включая тип, вид, возраст, массу, пол и состояние здоровья пациента; тяжесть состояния, которое необходимо лечить; путь введения; функционирование почек и печени пациента; и конкретное используемое соединение или его соль. Во внимание также принимаются активность соединений согласно изобретению и чувствительность пациента к побочным эффектам. Специалист, лечащий врач или ветеринар, легко может определить и назначить эффективное количество лекарственного средства, необходимое для предотвращения, оказания противодействия или сдерживания прогрессирования состояния.
Пероральные дозы согласно данному изобретению при использовании для получения идентичных эффектов будут находится в диапазоне примерно 0,01-100 мкг/кг/сутки перорально или более предпочтительно 0,01-10 мкг/кг/сутки перорально. Композиции предпочтительно готовят в форме таблеток с насечками, содержащих 0,5-5000 мкг или более предпочтительно 0,5-500 мкг активного ингредиента.
Для любого пути введения можно использовать дробные или однократные дозы. Например, соединения согласно данному изобретению можно вводить ежедневно или еженедельно в виде одной дозы или суммарную дозу можно водить дробными дозами в виде двух, трех или четырех доз.
Любая из указанных выше фармацевтических композиций может содержать 0,1-99%, 1-70% или предпочтительно 1-50% активных соединений согласно изобретению в качестве активных ингредиентов.
Как описано выше, за течением заболевания и его ответом на лечение лекарственными средствами можно следить с помощью клинического обследования и данных лабораторных исследований. Эффективность терапии согласно изобретению определяют по степени, с которой ослабляются описанные ранее признаки и симптомы состояния, например хронического гепатита, и степени, в которой исключаются или в существенно снижаются обычные побочные эффекты интерферона (т.е. подобные гриппу симптомы, такие как повышенная температура, головная боль, озноб, миалгия, усталость и т.д., и симптомы, связанные с центральной нервной системой, такие как депрессия, парестезия, нарушение концентрации и т.д.).
В некоторых вариантах полиалкилированное соединение согласно изобретению (например, пегилированный интерферон) вводят вместе с одним или несколькими фармацевтическими средствами, применимыми для лечения конкретного состояния. Например, полиалкилированный белок можно вводить в комбинации с известными противовирусным средством или средством для лечения вирусной инфекции. Такие противовирусные соединения включают, например, рибавирин, левовирин, МВ6866 и зидовудин, 3ТС, ТТС, ацикловир, ганцикловир, вирамид, УХ-497, УХ-950 и Ι8Ι8-14803.
Конъюгат и противовирусное средство можно водит одновременно (например, средства вводят пациенту вместе); вводить последовательно (например, средства вводят пациенту один за другим); или вводить попеременно (например, средства вводят в виде повторяющееся серии, такой как агент А, затем агент В, затем агент А и т.д.).
В практике изобретения предпочтительный РСС ΙΤΝ-бета (например, РЕС ΙΤΝ-бета) можно вводить пациентам, инфицированным вирусом гепатита С. Предпочтительно применение РЕС ГЕМ-бета-1а.
Пациентов для лечения выбирают из пациентов, позитивных по аити-НСУ-антителам с документально подтвержденным с помощью биопсии активным хроническим гепатитом.
Для того чтобы следить за ходом репликации НСУ у субъектов в ответ на лечение лекарственным средством, можно измерять НСУ-РНК в образцах сыворотки, например, с помощью анализа групповой полимеразной цепной реакции, в которой используют два набора праймеров, полученных из неструктурных областей генов Ν83 и Ν84 генома НСУ. См. Тага е! а1., 1991, Νο\ν Епд. I. Меб. 325: 98-104. ЫпсН е! а1., 1990. I. С11п. Шуей., 86: 1609-1614.
Противовирусную активность можно измерить по изменению титра НСУ-РНК. Данные о НСУРНК можно анализировать путем сравнения титров в конце лечения с измерением исходного уровня до лечения. Снижение НСУ-РНК к 4 неделе дает доказательство противовирусной активности соединения. См. К1е!ег е! а1., 1993, АпбтюгоЬ. Адеп18 СНето1йег. 37 (3): 595-97; Огйо е! а1., 1995, Т Меб1са1 У1го1оду, 46:109-115. Изменения величин по меньшей мере на два порядка (> 2 1од) интерпретируют как доказательство противовирусной активности.
У человека, страдающего в результате хронической инфекции гепатитом С, может проявляться один или несколько из следующих признаков или симптомов: (а) повышенный уровень аланинами
- 38 009783 нотрансферазы (АЬТ) в сыворотке, (Ь) положительный тест на анти-НСУ-антитела, (с) присутствие НСУ, о чем свидетельствует положительный тест на НСУ-РНК, (б) клинические признаки хронической болезни печени, (е) повреждение клеток печени. Такие критерии могут быть использованы не только для диагностики гепатита С, но могут быть использованы для оценки реакции пациента на лечение лекарственным средством.
Известно, что повышенный уровень аланинаминотрансферазы (АЬТ) и аспартатаминотрансферазы (АБТ) возникает в случае неконтролируемого гепатита С, и завершенный ответ на лечение обычно определяют как нормализацию уровней указанных ферментов в сыворотке, особенно АЬТ. См. Όανίδ е! а1., 1989, Νο\ν Епд. 1. Меб. 321: 1501-1506. АЬТ является ферментом, высвобождаемым когда разрушаются клетки печени, и является симптомом НСУ-инфекции. Интерферон вызывает синтез фермента 2',5'олигоаденилатсинтетазы (2'5'ОАБ), который в свою очередь приводит к деградации вирусной мРНК. См. Ноид1ит, 1983, С11шса1 Рйаттасо1оду 2: 20-28. Увеличения уровней 2'5'ОАБ в сыворотке соответствует снижению уровней АЬТ.
Гистологические исследования образцов биопсии печени можно использовать в качестве второго критерия для оценки. См., например, Кпобе11 е! а1., 1981, Нера1о1оду 1: 431-435, предложенный которым гистологический индекс активности (портальное воспаление, мелкоочаговый или мостовидный некроз, лобулярное повреждение и фиброз) обеспечивает способ оценки активности заболевания.
Безопасность и толерантность или эффективность лечения можно определить по клиническим оценкам и измерению количества лейкоцитов и нейтрофилов. Это можно оценить посредством периодического мониторинга гематологических параметров, например, количества лейкоцитов, нейтрофилов, тромбоцитов и эритроцитов.
Могут быть приготовлены различные другие препараты замедленного или длительного высвобождения с использованием обычных способов, хорошо известных в данной области.
Как будет понятно специалистам в данной области, может быть осуществлено множество модификаций и изменений данного изобретения, не отходя от сути и не выходя за рамки объема. Приведенные в данном описании конкретные варианты предложены только в качестве примера, и изобретение должно быть ограничено только условиями прилагаемой формулы изобретения, вместе с полным объемом эквивалентов, на которые указанная формула изобретения дает право. Все патенты и публикации, цитированные в данном описании, включены в виде ссылки.
Примеры
Пример 1. Синтез активированных полиалкиленгликолей.
А) Алкилирование спиртов.
Активированные полиалкиленгликоли синтезировали с помощью алкилирования полиалкиленгликоля, имеющего свободную концевую гидроксильную функциональную группу. Общая реакция изображена на схеме I.
Полиалкиленгликоль (Р-ОН) подвергают взаимодействию с алкилгалогенидом (А) с образованием простого эфира (В). Затем соединение В гидроксилируют с образованием спирта (С), который окисляют до альдегида (Ό). В указанных соединениях п является целым числом от 0 до 5 и Ζ может быть насыщенной или ненасыщенной С1-С20 алкильной или гетероалкильной группой с прямой или разветвленной цепью. Ζ также может быть С3-С7 насыщенным или ненасыщенным циклическим алкилом или циклическим гетероалкилом, замещенной или незамещенной арильной или гетероарильной группой или замещенной или незамещенной алкарильной (алкил является С4-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом) или гетероалкарильной группой. В случае замещенных соединений заместителями могут быть галоген, гидроксил, карбонил, карбоксилат, сложный эфир, формил, ацил, тиокарбонил, сложный тиоэфир, тиоацетат, тиоформиат, алкоксил, фосфорил, фосфонат, фосфинат, аминогруппа, амидогруппа, амидин, имин, цианогруппа, нитрогруппа, азидогруппа, сульфгидрил, сульфат, сульфонат, сульфамоил, сульфонамидогруппа, сульфонил, гетероциклил, аралкил, ароматический остаток, гетероароматический остаток, иминогруппа, силил, простой эфир или алкилтиогруппа. Обычно Р-ОН является полиэтиленгликолем
- 39 009783 (РЕС) или монометоксиполиэтиленгликолем (тРЕС), имеющим молекулярную массу от 5000 до 40000 Дальтон (Да).
Например, синтез тРЕС-О-2-метилпропиональдегида изображен на схеме II.
тРЕС-ОН с молекулярной массой 20000 Да (тРЕС-ОН 20 кДа; 2,0 г; 0,1 ммоль, 8ипЬю) обрабатывали ΝαΗ (12 мг; 0,5 ммоль) в ТГФ (35 мл). Затем к смеси добавляли пятьдесят эквивалентов 3-бром-2метилпропена (3,34 г; 5 ммоль) и каталитическое количество ΚΙ. Полученную в результате смесь кипятили с обратным холодильником в течение 16 ч. Затем добавляли воду (1 мл) и растворитель удаляли в вакууме. К остатку добавляли СН2С12 (25 мл) и органический слой отделяли, сушили над безводным Νη28Ο4 и объем уменьшали примерно до 2 мл. Указанный СН2С12-раствор по каплям добавляли к эфиру (150 мл). Полученный в результате белый осадок собирали, получая 1,9 г соединения 1.
1Н ЯМР (СБС1з, 400 МГц): δ 4,98 (с, 1Н), 4,91 (с, 1Н), 1,74 (с,3Н).
К соединению 1 (1,9 г; 0,1 ммоль) в ТГФ (20 мл) и СН2С12 (2 мл) при 0°С добавляли ВН3 в ТГФ (1,0 М; 3,5 мл). Смесь перемешивали на бане со льдом в течение 1 ч. К полученной смеси медленно добавляли №ЮН (2,0 М; 2.5 мл), затем 30% Н2О2 (0,8 мл). Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 16 ч. Следуя описанному выше способу обработки (СН2С12, осаждение из эфира), получали 1,8 г соединения 2 в виде белого твердого вещества.
1Н ЯМР (СБС1з, 400 МГц): δ 1,80 (м, 1Н), 0,84 (д, 3Н).
Соединение 2 (250 мг) растворяли в СН2С12 (2,5 мл) и добавляли периодинан Десс-Мартина (ЭМР; 15 мг) при перемешивании в течение 30 мин при комнатной температуре. К смеси добавляли насыщенный №1НСО3 и №282О3 (2 мл) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Следуя описанному выше способу обработки, получали 3 (тРЕС-О-2-метилпропиональдегид, 120 мг) в виде белого твердого вещества.
1Н ЯМР (СБС1з, 400 МГц): δ 9,75 (с, 1Н), 2,69 (м, 1Н), 1,16 (д, 3Н).
Сходному способу следуют в случае ароматических спиртов, как показано на схеме III.
- 40 009783
В общем, ароматический спирт (Е) подвергают взаимодействию с алкилгалогенидом (А) с образованием простого моноэфира (Г). Затем оставшуюся спиртовую группу соединения Г превращают в галогенид (например, бромид) в соединении С, которое подвергают взаимодействию с полиалкиленгликолем (Р-ОН), получая простой эфир (Н). Затем полученное соединение превращают в альдегид (I) через гидроборирование до первичного спирта (I) с последующим окислением. В указанных соединениях η является целым числом от 0 до 5, ά равно 0 или является целым числом от 1 до 4 и Ζ может быть насыщенной или ненасыщенной С1-С20 алкильной или гетероалкильной группой с прямой или разветвленной цепью. Ζ также может быть С3-С7 насыщенным или ненасыщенным циклическим алкилом или циклическим гетероалкилом, замещенной или незамещенной арильной или гетероарильной группой или замещенной или незамещенной алкарильной (алкил является С1-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом) или гетероалкарильной группой. В случае замещенных соединений заместителями могут быть галоген, гидроксил, карбонил, карбоксилат, сложный эфир, формил, ацил, тиокарбонил, сложный тиоэфир, тиоацетат, тиоформиат, алкоксил, фосфорил, фосфонат, фосфинат, аминогруппа, амидогруппа, амидин, имин, цианогруппа, нитрогруппа, азидогруппа, сульфгидрил, сульфат, сульфонат, сульфамоил, сульфонамидогруппа, сульфонил, гетероциклил, аралкил, ароматический остаток, гетероароматический остаток, иминогруппа, силил, простой эфир или алкилтиогруппа.
Кроме того, Т1 и Т2 независимо отсутствуют или являются насыщенной или ненасыщенной С1-С20 алкильной или гетероалкильной группой с прямой или разветвленной цепью и могут быть в орто-, метаили пара-положении друг к другу. Каждый Ь (если присутствует) независимо является насыщенной или ненасыщенной С1-С20 алкильной или гетероалкильной группой с прямой или разветвленной цепью, С3-С7 насыщенным или ненасыщенным циклическим алкилом или циклическим гетероалкилом, замещенной или незамещенной арильной или гетероарильной группой или замещенным или незамещенным алкарилом, где алкил является С1-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильной группой. Заместителями могут быть галоген, гидроксил, карбонил, карбоксилат, сложный эфир, формил, ацил, тиокарбонил, сложный тиоэфир, тиоацетат, тиоформиат, алкоксил, фосфорил, фосфонат, фосфинат, аминогруппа, амидогруппа, амидин, имин, цианогруппа, нитрогруппа, азидогруппа, сульфгидрил, суль
- 41 009783 фат, сульфонат, сульфамоил, сульфонамидогруппа, сульфонил, гетероциклил, аралкил, ароматический остаток, гетероароматический остаток, иминогруппа, силил, простой эфир или алкилтиогруппа.
Обычно Р-ОН является полиэтиленгликолем (РЕС) или монометоксиполиэтиленгликолем (тРЕС). имеющим молекулярную массу от 5000 до 40000 Да.
Например, синтез тРЕС-О-параметилфенил-О-2-метилпропиональдегида (8) показан на схеме IV.
Схема IV
К раствору 4-гидроксибензилового спирта (2,4 г; 20 ммоль) в ТГФ (50 мл) и воде (2,5 мл) сначала добавляли гидроксид натрия (1,5 г; 37,5 ммоль), а затем 3-бром-2-метилпропен (4,1 г; 30 ммоль). Полученную реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение 16 ч. К смеси добавляли 10% лимонную кислоту (2,5 мл) и растворитель удаляли в вакууме. Остаток экстрагировали этилацетатом (3x15 мл) и объединенные органические слои промывали насыщенным №1С1 (10 мл), сушили и концентрировали, получая соединение 4 (3,3 г; 93%).
1Н ЯМР (СБС13, 400 МГц): δ 1,29 (м, 2Н), 6,92 (м, 2Н), 5,14 (с, 1Н), 5,01 (с, 1Н), 4,56 (с, 2Н), 4,46 (с, 2Н), 1,85 (с, 3Н).
Мезилхлорид (М§С1; 2,5 г; 15,7 ммоль) и триэтиламин (ТЕА; 2,8 мл; 20 ммоль) добавляли к раствору соединения 4 (2,0 г; 11,2 ммоль) в СН2С12 (25 мл) при 0°С и реакционную смесь помещали в холодильник на 16 ч. Обычная обработка давала бледно-желтое масло (2,5 г; 87%).
1Н ЯМР (СБС13, 400 МГц): δ 7,31 (м, 2Н), 6,94 (м, 2Н), 5,16 (с, 1Н), 5,01 (с, 1Н), 5,03 (с, 2Н), 4,59 (с, 2Н), 4,44 (с, 2Н), 3,67 (с, 3Н), 1,85 (с, 3Н).
Полученное масло (2,4 г; 9,4 ммоль) растворяли в ТГФ (20 мл) и добавляли ЫВг (2,0 г; 23,0 ммоль). Реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение 1 ч и затем охлаждали до комнатной температуры. К смеси добавляли воду (2,5 мл) и растворитель удаляли в вакууме. Остаток экстрагировали этилацетатом (3x15 мл) и объединенные органические слои промывали насыщенным №1С1 (10 мл), сушили над безводным №ь8О4 и концентрировали, получая требуемый бромид 5 (2,3 г; 96%) в виде бледно-желтого масла.
1Н ЯМР (СБС13, 400 МГц): δ 7,29 (м, 2Н), 6,88 (м, 2Н), 5,11 (с, 1Н), 4,98 (с, 1Н), 4,53 (с, 2Н), 4,44 (с, 2Н), 1,83 (с, 3Н).
тРЕС-ОН 20 кДа (2,0 г; 0,1 ммоль, 8ипЫо) обрабатывали №1Н (12 мг; 0,5 ммоль) в ТГФ (35 мл) и к смеси добавляли соединение 5 (0,55 г; 22,8 ммоль) с каталитическим количеством КГ Полученную в результате смесь кипятили с обратным холодильником в течение 16 ч. К смеси добавляли воду (1,0 мл) и растворитель удаляли в вакууме. К остатку добавляли СН2С12 (25 мл) и органический слой отделяли, сушили над безводным №ь8О4 и объем уменьшали примерно до 2 мл. Добавление по каплям в раствору эфира (150 мл) давало белый осадок, который собирали, получая 6 (1,5 г) в виде белого порошка.
'|| ЯМР (СВС13, 400 МГц): δ 7,21 (д, 2Н), 6, 90 (д, 2Н), 5,01 (с, 1Н), 4,99 (с, 1Н), 4,54 (с, 2Н), 4,43 (с, 2Н), 1,84 (с, 3Н).
К раствору соединения 6 (1,0 г; 0,05 ммоль) в ТГФ (10 мл) и СН2С12 (2 мл), охлажденному до 0°С, добавляли ВН3/ТГФ (1,0 М; 3,5 мл) и реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч. Медленно добавляли 2,0 М раствор №1ОН (2,5 мл) и затем 30% Н2О2 (0,8 мл). Реакционной смеси давали возможность нагреться до комнатной температуры и перемешивали в течение 16 ч. Следуя описанному выше способу обработки (СН2С12, осаждение из эфира), получали 7 (350 мг) в виде белого твердого вещества.
'|| ЯМР (СПС13, 400 МГц): δ 7,21 (д, 2Н), 6,84 (д, 2Н), 4,54 (с, 2Н), 2,90 (м, 2Н), 1,96 (д, 3Н).
- 42 009783
Соединение 7 (150 мг; 0,0075 ммоль) растворяли в СН2С12 (1,5 мл) и добавляли ЭМР (15 мг) при перемешивании реакционной смеси при комнатной температуре в течение 1,5 ч.
Ή ЯМР (СБС13, 400 МГц): δ 9,76 (с, 1Н), 7,21 (д, 2Н), 6,78 (д, 2Н), 4,44 (с, 2Н), 4,14 (м, 2Н), 2,85 (м, 1Н), 1,21 (д, 3Н).
К смеси добавляли насыщенный ЫаНСО3 (0,5 мл) и Ыа282О3 (0,5 мл) и перемешивание продолжали при комнатной температуре в течение 1 ч. Следуя описанному выше способу обработки (раствор СН2С12, осажденный из эфира), получали 8 (92 мг) в виде белого твердого вещества.
Подобным образом синтезировали тРЕО-О-мета-метилфенил-О-2-метилпропиональдегид (9), как изображено на схеме V.
Схема V
К раствору 3-гидроксибензилового спирта (2,4 г; 20 ммоль) в ТГФ (50 мл) и воде (2,5 мл) сначала добавляли гидроксид натрия (1,5 г; 37,5 ммоль), а затем 3-бром-2-метилпропен (4,1 г; 30 ммоль). Полученную реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение 16 ч. К смеси добавляли 10% лимонную кислоту (2,5 мл) и растворитель удаляли в вакууме. Остаток экстрагировали этилацетатом (3x15 мл) и объединенные органические слои промывали насыщенным ЫаС1 (10 мл), сушили и концентрировали, получая соединение 10 (3,2 г; 90%).
Ή ЯМР (СБС13, 400 МГц): δ 7,26 (м, 1Н), 6,94 (м, 2Н), 6,86 (м, 1Н), 5,11 (с, 1Н), 5,01 (с, 1Н), 4,61 (С, 1Н), 4,44 (с, 2Н), 1,82 (с, 3Н).
М§С1 (2,5 г; 15,7 ммоль) и ТЕА (2,8 мл; 20 ммоль) добавляли к раствору соединения 10 (2,0 г; 11,2 ммоль) в СН2С12 (25 мл) при 0°С и реакционную смесь помещали в холодильник на 16 ч. Обычная обработка давала бледно-желтое масло (2,5 г; 87%).
Ή ЯМР (СВС13, 400 МГц): δ 7,31 (м, 1Н), 7,05 (м, 2Н), 6,91 (м, 1Н), 5,16 (с, 1Н), 5,04 (с, 1Н), 4,59 (с, 1Н), 4,46 (с, 2Н), 3,71 (с, 3Н), 1,84 (с, 3Н).
Полученное масло (2,4 г; 9,4 ммоль) растворяли в ТГФ (20 мл) и добавляли ЫВг (2,0 г; 23,0 ммоль). Реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение 1 ч и затем охлаждали до комнатной температуры. К смеси добавляли воду (2,5 мл) и растворитель удаляли в вакууме. Остаток экстрагировали этилацетатом (3x15 мл) и объединенные органические слои промывали насыщенным ЫаС1 (10 мл), сушили над безводным Ыа28О4 и концентрировали, получая требуемый бромид 11 (2,2 г; 92%) в виде бледно-желтого масла.
Ή ЯМР (СБС13, 400 МГц): δ 7,29 (м, 1Н), 6,98 (м, 2Н), 6,85 (м, 1Н), 5,14 (с, 2Н), 4,98 (с, 2Н), 4,50 (с, 2Н), 4,44 (с, 2Н), 1,82 (д, 3Н).
тРЕО-ОН 20 кДа (2,0 г; 0,1 ммоль, 8ииЫо) обрабатывали ЫаН (12 мг; 0,5 ммоль) в ТГФ (35 мл) и к смеси добавляли соединение 11 (0,55 г; 22,8 ммоль) с каталитическим количеством ΚΡ Полученную в результате смесь кипятили с обратным холодильником в течение 16 ч. К смеси добавляли воду (1,0 мл) и растворитель удаляли в вакууме. К остатку добавляли СН2С12 (25 мл) и органический слой отделяли, сушили над безводным №ь8О4 и объем уменьшали примерно до 2 мл. Добавление по каплям к раствору эфира (150 мл) давало белый осадок, который собирали, получая 12 (1,8 г) в виде белого порошка.
Ή ЯМР (СВС13, 400 МГц): δ 7,19 (м, 1Н), 6,88 (м, 2Н), 6,75 (м, 1Н), 4,44 (с, 2Н), 4,10 (м, 2Н), 1,82 (д, 3Н).
К раствору соединения 12 (1,0 г; 0,05 ммоль) в ТГФ (7,5 мл) и СН2С12 (2,5 мл), охлажденного до 0°С, добавляли ВН3/ТГФ (1,0 М; 3,5 мл) и реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч. Медленно
- 43 009783 добавляли 2,0 М раствор №ОН (3 мл), затем 30% Н2О2 (0,85 мл). Реакционной смеси давали возможность нагреться до комнатной температуры и перемешивали в течение 16 ч. Следуя описанному выше способу обработки (СН2С12, осаждение из эфира), получали 13 (450 мг) в виде белого твердого вещества.
'Н ЯМР (СЭС13, 400 МГц): δ 7,15 (м, 1Н), 6,84 (м, 2Н), 6,69 (м, 1Н), 4,50 (с, 2Н), 2,90 (м, 2Н), 1,95 (д, 3Н).
Соединение 13 (200 мг; 0,01 ммоль) растворяли в СН2С12 (1,5 мл) и добавляли ЭМР (20 мг) при перемешивании реакционной смеси при комнатной температуре в течение 1 ч.
!Н ЯМР (СЭС13, 400 МГц): δ 9,74 (с, 1Н), 7,17 (м, 1Н), 6,86 (м, 2Н), 6,74 (м, 1Н), 4,48 (с, 2Н), 4,15 (м, 2Н), 2,78 (м, 1Н), 1,22 (д, 3Н).
К смеси добавляли насыщенный №НСО3 (0,5 мл) и №282О3 (0,5 мл) и перемешивание продолжали при комнатной температуре в течение 1 ч. Следуя описанному выше способу обработки (СН2С12-раствор, осаждение из эфира), получали 9 (142 мг) в виде белого твердого вещества.
В) Получение посредством взаимодействия с ароматическими спиртами.
Активированные полиалкиленгликоли синтезировали с помощью реакции Митсунобу между полиалкиленгликолем, имеющим свободную концевую гидроксильную функциональную группу, и ароматическим спиртом. Схема реакции изображена на схеме VI.
Полиалкиленгликоль (Р-ОН) подвергают взаимодействию со спиртом (К) с образованием простого эфира (Б). В указанных соединениях т равно 0 или 1, ά равно 0 или является целым числом от 1 до 4 и п равно 0 или является целым числом от 1 до 5. Υ означает О, 8, СО, СО2, СО8, 8О, 8О2, СΟNК', 8О2МК' и ΝΒ.'. Т1 и Т2 независимо отсутствуют или являются насыщенной или ненасыщенной С1-С20 алкильной или гетероалкильной группой с прямой или разветвленной цепью.
К' и Ζ независимо означают водород, насыщенную или ненасыщенную С1-С20 алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью.
Каждый Б (если присутствует) независимо является насыщенной или ненасыщенной С1-С20 алкильной или гетероалкильной группой с прямой или разветвленной цепью, С3-С7 насыщенным или ненасыщенным циклическим алкилом или циклический гетероалкилом, замещенной или незамещенной арильной или гетероарильной группой или замещенным или незамещенным алкарилом. Алкил является С1-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом или гетероалкарильной группой, и заместителями могут быть галоген, гидроксил, карбонил, карбоксилат, сложный эфир, формил, ацил, тиокарбонил, сложный тиоэфир, тиоацетат, тиоформиат, алкоксил, фосфорил, фосфонат, фосфинат, аминогруппа, амидогруппа, амидин, имин, цианогруппа, нитрогруппа, азидогруппа, сульфгидрил, сульфат, сульфонат, сульфамоил, сульфонамидогруппа, сульфонил, гетероциклил, аралкил, ароматический остаток, гетероароматический остаток, иминогруппа, силил, простой эфир или алкилтиогруппа.
Р означает полимер полиалкиленгликоля. Обычно Р-ОН является полиэтиленгликолем (РЕС) или монометоксиполиэтиленгликолем (тРЕС), имеющим молекулярную массу от 5000 до 40000 Да.
Например, синтез тРЕС-О-пара-фенилацетальдегида (16) изображен на схеме VII.
- 44 009783
4-Гидроксифенилацетальдегид (15) синтезировали как описано в Не!егосус1е§, 2000, 53, 777-784. 4-Гидроксифенетиловый спирт (соединение 14; 1,0 г; 7,3 ммоль; А1бпсй) растворяли в диметилсульфоксиде (8 мл; А1бпсй). Медленно при перемешивании добавляли ТЕА (2,2 мл; 16 ммоль; А1бпсй). Комплекс пиридин-триоксид серы (8О3.ру) (2,5 г; 16 ммоль; А1бпсй) полностью растворяли в диметилсульфоксиде (9 мл, А1бпсй) и полученный раствор по каплям добавляли к спирту при энергичном перемешивании. После перемешивания в течение 1 ч при комнатной температуре реакционную смесь разбавляли СН2С12, затем промывали ледяной водой. Органический слой сушили над №28О4, фильтровали и концентрировали досуха. Очистка с использованием хроматографии на силикагеле со смесью гексан-этилацетат в качестве элюента (5:1, затем 2:1) давала 488 мг (49%) 4-гидроксифенилацетальдегида (15).
тРЕО-ОН 20 кДа (101 мг; 0,005 ммоль) и 4-гидроксифенилацетальдегид (15) (39 мг; 0,29 ммоль) подвергали четырехкратной азеотропной перегонке с толуолом, затем собирали безводным СН2С12 (2 мл, А1бпсй). К полученному раствору при перемешивании добавляли трифенилфосфин (РРй3; 66 мг; 0,25 ммоль; А1бпсй) и затем диизопропилазодикарбоксилат (ΩΜΩ; 49 мкл; 0,25 ммоль; А1бпсй). После перемешивания в течение 3 дней при комнатной температуре реакционную смесь по каплям добавляли к энергично перемешиваемому диэтиловому эфиру. Полученный в результате осадок выделяли фильтрованием и три раза промывали диэтиловым эфиром. Неочищенный продукт собирали в СНИСК и промывали водой. Органический слой сушили над №28О4, фильтровали и концентрировали досуха. Продукт собирали в минимальном количестве СН2С12, затем осаждали, добавляя по каплям к перемешиваемому диэтиловому эфиру. Полученный продуют собирали фильтрованием, три раза промывали диэтиловым эфиром и сушили, получая 63 мг (62%) тРЕО-О-пара-фенилацетальдегида (16).
Синтез тРЕО-О-пара-фенилпропиональдегид (17) осуществляли сходным образом.
4-Гидроксифенилпропиональдегид получали в результате синтеза, аналогичного синтезу 4гидроксифенилацетальдегида (Не!егосус1е§, 2000, 53, 777-784). 3-(4-Гидроксифенил)-1-пропанол (1,0 г; 6,6 ммоль, А1бпсй) растворяли в диметилсульфоксиде (8 мл, А1бпсй). Медленно при перемешивании добавляли ТЕА (2,0 мл; 14 ммоль; А1бпсй). Комплекс пиридин-триоксид серы (8О3.ру) (2,3 г; 15 ммоль; А1бпсй) полностью растворяли в диметилсульфоксиде (9 мл, А1бпсй) и полученный раствор по каплям добавляли к спирту при энергичном перемешивании. После перемешивания в течение 1 ч при комнатной температуре реакционную смесь разбавляли СН2С12, затем промывали ледяной водой. Органический слой сушили над №28О4, фильтровали и концентрировали досуха. Очистка с использованием хроматографии на силикагеле со смесью гексан-этилацетат в качестве элюента (5:1, затем 2:1) давала 745 мг (75%) 4-гидроксифенилпропиональдегида.
тРЕО-ОН 20 кДа (100 мг; 0,005 ммоль) и 4-гидроксифенилпропиональдегид (40 мг; 0,27 ммоль) подвергали четырехкратной азеотропной перегонке с толуолом, затем собирали безводным СН2С12 (2 мл, А1бпсй). К полученному раствору добавляли трифенилфосфин (66 мг; 0,25 ммоль; А1бпсй) и затем диизопропилазодикарбоксилат (49 мкл; 0,25 ммоль; А1бпсй) при перемешивании. После перемешивания в течение 3 дней при комнатной температуре реакционную смесь по каплям добавляли к энергично перемешиваемому диэтиловому эфиру. Полученный в результате осадок выделяли фильтрованием и три раза промывали диэтиловым эфиром. Неочищенный продукт собирали в СН2С12 и промывали водой. Органический слой сушили над №28О4, фильтровали и концентрировали досуха. Продукт собирали в минимальном количестве СН2С12, затем осаждали, добавляя по каплям к перемешиваемому диэтиловому эфи
- 45 009783 ру. Полученный продукт собирали фильтрованием, три раза промывали диэтиловым эфиром и сушили, получая 60 мг (60%) шРЕС-О-пара-фенилпропиональдегида (17).
Таким образом также получали шРЕС-О-мета-фенилацетальдегид (18).
3-Гидроксифенилацетальдегид получали в результате синтеза, аналогичного синтезу 4-гидроксифенилацетальдегида (Нс1сгосус1с5. 2000, 53, 777-784). 3-Гидроксифенетиловый спирт (1,0 г; 7,5 ммоль; Αΐάποίι) растворяли в диметилсульфоксиде (8 мл, ΑΙάποΙι). Медленно при перемешивании добавляли ТЕА (2,0 мл; 14 ммоль, А1с1пс11). Комплекс пиридин-триоксид серы (80,.ру) (2,4 г; 15 ммоль; А1с1пс11) полностью растворяли в диметилсульфоксиде (8 мл, ΑΙάποΙι) и полученный раствор по каплям добавляли к спирту при энергичном перемешивании. После перемешивания в течение 1 ч при комнатной температуре реакцию гасили ледяной водой, затем экстрагировали СН2С12. Органический слой сушили над Νη28Ο |. фильтровали и концентрировали досуха. Очистка с использованием хроматографии на силикагеле со смесью гексан-этилацетат в качестве элюента (3:1, затем 1:1) давала 225 мг (22%) 3 -гидроксифенилацетальдегида.
шРЕС-ОН 20 кДа (307 мг; 0,015 ммоль) и 3-гидроксифенилацетальдегид (117 мг; 0,86 ммоль) подвергали четырехкратной азеотропной перегонке с толуолом, затем собирали безводным СН2С12 (5 мл, ΑΙάποΙι). К полученному раствору добавляли трифенилфосфин (200 мг; 0,76 ммоль, ΑΙάποΙι) и затем диизопропилазодикарбоксилат (147 мкл; 0,75 ммоль; ΑΙάποΙι) при перемешивании. После перемешивания в течение 3 дней при комнатной температуре реакционную смесь по каплям добавляли к энергично перемешиваемому диэтиловому эфиру. Полученный в результате осадок выделяли фильтрованием и три раза промывали диэтиловым эфиром и сушили, получая 284 мг (93%) шРЕС-О-мета-фенилацетальдегида (18).
Хиральные соединения РЕС-циннамат-Х-гидроксисукцинимата (ΝΗ8) получали, например, как показано на схемах VIII и IX.
Схема VIII
дигидроксидигидроциннамат
-46009783
Схема IX
хиральная добавил
а-метил“Р-гидроксисукциннамат
Соединения РЕСг-дигидроуроканат-ΝΗδ также получали помощью реакции Митсунобу, как показано на схеме X.
Схема X
уроканиноеая кислота
Ι.δΟα,/ΜεΟΗ
Ζ Ме-РЕ6-ОН/
Митсунобу
Ι.Ηϊ/Ρά
2. РССУНО-ΝΗδ
Соединения РЕС-дигидроциннамат-ΝΗδ как показано на схеме XI.
соединения также создавали из ароматического спирта,
Схема XI
И%,ОЕАО,ТГФ шРЕС-ОН
РЕСг-бензофураны и РЕО-индолы получали, как показано на схемах XII и XIII.
-47009783
Схема XII
С) Получение с помощью реакции РЕС-аминов.
РЕС-амины подвергали взаимодействию с алкилгалогенидами с образованием РЕС-амидов. Пример образования конъюгата РЕС-амид-бициклооктанЛН8 показан на схеме XIV.
РЕС-первичный амин конъюгируют с арилгалогенидом с образованием конъюгата РЕС-вторичный амин, который затем подвергают взаимодействию в условиях Хека (стереоспецифичное катализируемое палладием связывание алкена с органическим галогенидом или трифлатом в отсутствии β-атомов водорода при 8р3-гибридизованных атомах) с NН8-алкеном с образованием требуемого РЕС-конъюгата. Синтез содержащего пиримидин конъюгата показан на схеме XV.
- 48 009783
Подобным способом также синтезируют конъюгаты РЕО-сульфонамид, как показано на схеме XVI. Схема XVI
Э) Соединения, образованные в результате реакции с гетероциклами.
РЕО-соединения подергают взаимодействию с находящимися в цикле или не в цикле атомами азота в гетероциклах с образованием химически активных видов РЕО. Типичные реакции показаны на схемах XVII для аминопирролидина и XVIII для различных пиперазинов.
- 49 009783
Схема XVII
ι.ΕΟΟΗΑτυ
1. Ангидрид трифторметансульфоновой кислоты Основание Хю ни га
2. Пиперазин
3. Акрилонитрил
4. ЦаВН^/СоСЬ
5. Н2С-СН8О2С1
РЕС
ОН
1. Ангидрид трифторметансульфоновой кислоты
Основание Хюнига
2. Пиперазин
3. Янтарный ангидрид
4. РСОНОМНЯ
Пример 2. Получение пептидных конъюгатов.
Пептидные конъюгаты согласно данному изобретению можно получить в результате взаимодействия белка с активированной молекулой РОС. Например, интерферон (ΙΡΝ) можно подвергнуть взаимодействию с РЕС-альдегидом в присутствии восстановителя (например, цианборогидрида натрия) посредством восстановительного алкилирования, чтобы получить конъюгат РЕС-белок, связанный амидной связью. См., например, Европейский патент 0154316 В1.
ΙΡΝ-β-1 а человека пегилировали следующими активированными полиалкиленгликолями согласно изобретению: 20 кДа тРЕС-О-2-метилпропиональдегидом, 20 кДа шРЕС-О-пара-метилфенил-О-2метилпропиональдегидом, 20 кДа тРЕС-О-мета-метилфенил-О-2-метилпропиональдегидом, 20 кДа шРЕС-О-пара-фенилацетальдегидом, 20 кДа тРЕС-О-пара-фенилпропиональдегидом и 20 кДа тРЕС-Омета-фенилацетальдегидом. Пегилированные белки очищали до гомогенности от соответствующих реакционных смесей и подвергали серии характеристических тестов, чтобы идентифицировать, выяснить чистоту и эффективность модифицированных белков.
Подробное описание получения и характеризации ΙΡΝ-β-1 а человека, модифицированного 20 кДа щРЕС-О-2-метилпропиональдегидом, 20 кДа тРЕС-О-мета-метилфенил-О-2-метилпропиональдегидом и 20 кДа шРЕС-О-пара-фенилацетальдегидом приведено ниже.
А) Получение и характеристика модифицированного 20 кДа тРЕС-О-2-метилпропинальдегидом ΙΡΝ-β-1 а ΙΡΝ-β-1 а человека пегилировали по его Ν-концу 20 кДа тРЕС-О-2-метилпропиональдегидом. Продукт химической реакции восстановительного алкилирования, используемой для включения РЕС в основную цепь I ΡΝ-β-1 а, приводил к образованию аминной связи, которая очень стабильна по отношению к деградации. Пегилированный ΙΡΝ-β-1 а подвергали всесторонней характеристике, включая анализ с помощью 8О8-ПААГ, эксклюзионной хроматографии по размеру (8ЕС), пептидного картирования и оценки активности при анализе противовирусной активности ίη νίίτο. Чистота продукта, которую оценивали с помощью 8О8-ПААГ и 8ЕС, составляла более 90%. В пегилированном образце не было признаков
-50009783 агрегатов. Остаточные уровни немодифицированного ΙΕΝ-β-Ιη в продукте были ниже предела количественного определения, но по-видимому составляли примерно 1% продукта.
Удельная активность пегилированного ΙΕΝ-β-Ιη в анализе противовирусной активности была снижена примерно в 2 раза по сравнению с немодифицированным ΙΡΝ-β-1 а (ЕС50=32 пг/мл для ΙΕΝ-β-Ιη. модифицированного 20 кДа шРЕСг-О-2-метилпропиональдегидом по сравнению с ЕС5о=14 пг/мл для немодифицированного ΙΕΝ-β-Ιη). Основную массу пегилированного ΙΕΝ-β-Ιη готовили в концентрации 30 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере (РВ8), рН 7,3, содержащем 14 мг/мл сывороточного альбумина человека (ЧСА), подобно составу, используемому для ΑνΟΝΕΧ® (Вю§еи, СатЬпсЦс. МА), который был подвергнут всесторонней характеристике. Продукт предоставляли в виде замороженной жидкости, которую хранили при -70°С.
Свойства ΙΕΝ-β- 1а. модифицированного 20 кДа шРЕС-О-2-метилпропиональдегидом, суммированы в табл. 1.
Таблица 1
Свойства ΙΓΝ-β-1-а, модифицированного 20 кДа тРЕС-О-2метилпропиональдегидом
Эффективность пегилирования >90%
Отношение 1ГЫ-3-1а/РЕС 1:1
Чистота >90%
Положение связывания Ν-конец
Противовирусная активность ЕС$о 32 пг/мл
1. Получение ΙΡΝ-β-1 а. модифицированного 20 кДа шРЕС-О-2-метилпропиональдегидом.
мл ΑνΟΝΕΧ®, не приготовленного в виде препарата (нефасованный промежуточный продукт ΙΕΝ-β-Ιπ, клиническая партия нефасованного лекарственного средства, которая прошла все испытания для применения на человеке, в концентрации 250 мкг/мл в 100 мМ фосфате натрия, рН 7,2, 200 мМ №1С1). разбавляли 12 мл 165 мМ МЕ8, рН 5,0, и 50 мкл 5 N НС1. Образец наносили на колонку ЕЕ с 8Рсефарозой объемом 300 мкл (РЬаттас1а). Колонку промывали 3x300 мкл 5 мМ фосфата натрия рН 5,5, 75 мМ №1С1 и белок элюировали 5 мМ фосфатом натрия рН 5,5, 600 мМ №1С1. Элюированные фракции анализировали в отношении поглощения при 280 нм и концентрацию ΙΡΝ-β-1 а в образцах оценивали, используя коэффициент экстинкции 1,51 для раствора 1 мг/мл. Фракции пика объединяли, получая раствор с концентраций ΙΕΝ-β- 1а 3,66 мг/мл, который затем разбавляли до 1,2 мг/мл водой.
К 0,8 мл ΙΡΝ-β-1 а из разбавленного пула элюата с 8Р-сефарозы добавляли 0,5 М фосфат натрия рН 6,0 до 50 мМ, добавляли цианоборогидрид натрия (Αΐάήοΐι) до 5 мМ и добавляли 20 кДа шРЕС-О-2метилпропиональдегид до 5 мг/мл. Образец инкубировали при комнатной температуре в течение 16 ч в темноте. Пегилированный ΙΡΝ-β-1 а очищали из реакционной смеси на ЕЕ-колонке с 8Р-сефарозой объемом 0,5 мл следующим образом: 0,6 мл реакционной смесь разбавляли 2,4 мл 20 мМ МЕ8 рН 5,0 и наносили на колонку с 8Р-сефарозой. Колонку промывали фосфатом натрия рН 5,5, 75 мМ №1С1 и затем пегилированный I ΡΝ-β-1 а элюировали с колонки с помощью 25 мМ МЕ8 рН 6,4, 400 мМ №1С1. Затем пегилированный ΙΡΝ-β-1 а очищали на фракционирующей по размеру колонке 8ирето8е 6 НК 10/30 ЕРЬС, используя 5 мМ фосфат натрия рН 5,5, 150 мМ №1С1 в качестве подвижной фазы. Фракционирующую колонку (25 мл) элюировали при 20 мл/ч и собирали фракции по 0,5 мл. Элюированные фракции анализировали в отношении содержания белка по поглощению при 280 нм, объединяли и определяли концентрацию белка в пуле. Концентрацию пегилированного ΙΡΝ-β-1 а выражали в эквивалентах ΙΕΝ, так как остаток РЕС не вносит вклада в поглощение при 280 нм. Отбирали образцы пула для анализа и остаток разбавляли до 30 мкг/мл буфером для приготовления препарата, содержащим ЧСА, делили на аликвоты 0,25 мл/флакон и хранили при -70°С.
2. УФ-спектр очищенного ΙΕΝ-β- 1а. модифицированного 20 кДа шРЕС-О-2-метилпропиональдегидом.
УФ-спектр (240-340 нм) ΙΕΝ-β-Ιη. модифицированного 20 кДа шРЕС-О-2-метилпропиональдегидом, получали с использованием предварительно приготовленного в виде препарата с ЧСА нефасованного образца. Пегилированный образец проявлял максимум поглощения при 278-279 нм и минимум поглощения при 249-250 нм, что согласуется с данными, наблюдаемыми в случае немодифицированного нефасованного промежуточного продукта ΙΕΝ-β- 1а. Концентрацию белка пегилированного продукта оценивали на основании спектра, используя коэффициент экстинкции е280°’1%= 1,51. Концентрация белка в пегилированном нефасованном продукте составляла 0,23 мг/мл. В образце не было мутности, о чем свидетельствует отсутствие поглощения при 320 нм.
3. Характеристика ΙΕΝ-β-1а. модифицированного 20 кДа шРЕС-О-2-метилпропиональдегидом, с помощью 8О8-ПААГ.
-51 009783 мкг немодифицированного и модифицированного 20 кДа тРЕС-О-2-метилпропиональдегидом [ΕΝ-β-1;·ι подвергали электрофорезу в ЗЭЗ-ПААГ в восстанавливающих условиях в геле с 10-20% градиентом. Гель окрашивали Кумасси бриллиантовым синим К-250, и он показан на фиг. 1 (дорожка А, маркеры молекулярной массы (сверху вниз; 100 кДа, 68 кДа, 45 кДа, 27 кДа и 18 кДа, соответственно); дорожка В, немодифицированный дорожка С, модифицированный 20 кДа тРЕС-О-2метилпропиональдегидом). Анализ в ЗЭЗ-ПААГ модифицированного 20 кДа тРЕС-О-2-метилпропиональдегидом ΓΕΝ-β-1α выявил одну основную полосу с кажущейся массой 55 кДа, что согласуется с модификацией одним РЕС. Не выявлено форм с более высокой массой, возникающих в результате присутствия дополнительных групп РЕС. В очищенном пегилированном продукте обнаружен немодифицированный ΓΕΝ-β-1α; однако его количество ниже предела количественного определения. Уровень немодифицированного ΓΕΝ-β-1α в препарате по оценкам составляет только около 1% суммарного белка.
4. Характеристика Ш^вАа, модифицированного 20 кДа тРЕС-О-2-метилпропиональдегидом, с помощью эксклюзионной хроматографии по размеру.
Немодифицированный и модифицированный 20 кДа тРЕС-О-2-метилпропиональдегидом ΓΕΝ-β-1α подвергали ЗЕС на аналитической фракционирующей колонке Зирегоке 6 НК10/30, для РРЬС используя РВЗ рН 7,2 в качестве подвижной фазы. Колонку элюировали при 20 мл/ч и элюент контролировали в отношении поглощения при 280 нм, как показано на фиг. 2: панель А: стандарты молекулярной массы (670 кДа, тиреоглобулин; 158 кДа, гамма-глобулин; 44 кДа, овальбумин; 17 кДа, миоглобин; 1,3 кДа, витамин В12), панель В: Ш^вАа, модифицированный 20 кДа тРЕС-О-2-метилпропиональдегидом; панель С: немодифицированный ΓΕΝ-β-^. Модифицированный 20 кДа тРЕС-О-2-метилпропиональдегидом Ш^вАа элюировался в виде отдельного острого пика с кажущейся молекулярной массой примерно 200 кДа, что согласуется большим гидродинамическим объемом РЕС. Не наблюдалось признаков агрегатов. В препарате выявляли немодифицированный Ш^вАа, но его количество было ниже предела количественного определения. На основании величины пика количества немодифицированного IΕN-β-1а составляли 1% или меньше всего продукта, что согласуется с наблюдениями с использованием ЗЭЗ-ПААГ.
5. Анализ Ш^вАа, модифицированного 20 кДа тРЕС-О-2-метилпропиональдегидом, с помощью пептидного картирования.
Специфичность реакции пегилирования оценивали пептидным картированием. Немодифицированный и модифицированный 20 кДа тРЕС-О-2-метилпропиональдегидом Ш^вАа расщепляли эндопротеиназой Ьу5-С из Ас11готоЬас1ег (\Уако Вюргодисй) и полученные в результате продукты расщепления фракционировали обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке Уу4ас С4, используя 30-минутный градиент от 0 до 70% ацетонитрила в 0,1% ТФУ. Элюент из колонки контролировали по поглощению при 214 нм.
Все предполагаемые пептиды, получаемые при расщеплении Ш^вАа эндопротеиназой Ьук-С, идентифицированы ранее Ν-концевым секвенированием и масс-спектрометрией (Рерпъку е! а1., (2001) 1 Р11агтасо1оду ап4 Ехрептеп1а1 ТкегареиРск 297: 1059), и из них только пептид, который содержит Νконец Ж^вАа, был изменен модификацией 20 кДа тРЕС-О-2-метилпропиональдегидом; о чем свидетельствует его исчезновение на пептидной карте. Таким образом, данные картирования свидетельствуют, что остаток РЕС специфично связывается с данным пептидом. Данные, кроме того, свидетельствуют, что мишенью модификации РЕС является Ν-конец белка, так как только Ν-концевая модификация может приводить к специфичной утрате данного пептида.
В) Получение и характеристика Ж^вАа, модифицированного 20 кДа тРЕС-О-мета-метилфенилО-2-метилпропиональдегидом.
Ш^вАа человека пегилировали по его Ν-концу 20 кДа тРЕС-О-мета-метилфенил-О-2-метилпропиональдегидом. Продукт химической реакции восстановительного алкилирования, используемой для включения РЕС в основную цепь Ш^вАа, приводил к образованию аминной связи, которая очень стабильна по отношению к деградации. Пегилированный Ш^вАа подвергали всесторонней характеристике, включая анализ с помощью ЗОЗ-ПААГ, ЗЕС, пептидного картирования и оценки активности при анализе противовирусной активности ίη νίΙΐΌ. Чистота продукта, которую оценивали с помощью 8Ό8ПААГ и ЗЕС, составляла более 95%. В пегилированном образце ΉΝ-β-Β не было признаков агрегатов. Остаточные уровни немодифицированного IΕN-β-1а в продукте были ниже предела количественного определения, но, по-видимому, составляли примерно 1% продукта. Удельная активность пегилированного IΕN-β-1а при анализе противовирусной активности была снижена примерно в 2 раза по сравнению с немодифицированным ΉΝ-β-Β (ЕС50=31 пг/мл для IΕN-β-1а, модифицированного тРЕС-О-метаметилфенил-О-2-метилпропиональдегидом по сравнению с ЕС50=14 пг/мл для немодифицированного IΕN-β-1а). Основную массу пегилированного IΕN-β-1а готовили в концентрации 30 мкг/мл в РВЗ, рН 7,2, содержащем 15 мг/мл ЧСА, подобно составу, используемому для АVОNЕX®, который был подвергнут всесторонней характеристике. Продукт предоставляли в виде замороженной жидкости, которую хранили при -70°С.
Свойства IΕN-β-1а, модифицированного 20 кДа тРЕС-О-мета-метилфенил-О-2- 52 009783 метилпропиональдегидом, обобщены в табл. 2.
Таблица 2
Свойства 1ГИ-р-1а, модифицированного 20 кДа гпРЕС-О-мета метилфенил-О-2-метилпропиональдегидом
Эффективность пегилирования
Отношение 1ЕЫ-₽-1а/РЕС
Чистота
Положение связывания
Противовирусная активность ЕСм >80% >95%
Ν-конец пг/мл
1. Получение ΙΕΝ-β-Ιη. модифицированного 20 кДа шРЕ6-О-мета-метилфенил-О-2метилпропиональдегидом.
мл ΑνΟΝΕΧ®, не приготовленного в виде препарата (нефасованный промежуточный продукт ΙΕΝ-β-Ιπ, клиническая партия нефасованного лекарственного средства, которая прошла все испытания для применения на человеке, в концентрации 254 мкг/мл в 100 мМ фосфате натрия, рН 7,2, 200 мМ №С1). разбавляли 96 мл 165 мМ МЕ8, рН 5,0, и 400 мкл 5 N НС1. Образец наносили на колонку ЕЕ с 8Рсефарозой объемом 1,2 мл (Рйагташа). Колонку промывали 6,5 мл 5 мМ фосфата натрия рН 5,5, 75 мМ №С1 и белок элюировали 5 мМ фосфатом натрия рН 5,5, 600 мМ №1С1. Элюированные фракции анализировали в отношении поглощения при 280 нм и концентрацию ΙΕΝ-β-Ιπ в образцах оценивали, используя коэффициент экстинкции 1,51 для раствора 1 мг/мл. Фракции пика объединяли, получая раствор с концентраций ΙΕΝ-β-ϋ 4,4 мг/мл. К 2,36 мл ΙΕΝ-β-Ιη с концентрацией 4,4 мг/мл из пула элюата с 8Рсефарозы добавляли 0,5 М фосфат натрия рН 6,0 до 50 мМ, добавляли цианоборогидрид натрия (Αΐάήοΐι) до 5 мМ и добавляли 20 кДа шРЕС-О-мета-метилфенил-О-2-метилпропиональдегид до 10 мг/мл. Образец инкубировали при комнатной температуре в течение 21 ч в темноте. Пегилированный ΙΕΝ-β-Ιη очищали из реакционной смеси на ЕЕ-колонке с 8Р-сефарозой объемом 8,0 мл следующим образом: 9,44 мл реакционной смесь разбавляли 37,7 мл 20 мМ МЕ8 рН 5,0 и наносили на колонку с 8Р-сефарозой. Колонку промывали фосфатом натрия рН 5,5, 75 мМ ΝηΟ и затем пегилированный ΙΡΝ-β-1 а элюировали с колонки с помощью 25 мМ МЕ8 рН 6,4, 400 мМ №1С1. Затем пегилированный ΙΡΝ-β-1 а очищали на фракционирующей по размеру колонке 8ирсго5с 6 НК 10/30 для ЕРЬС, используя 5 мМ фосфат натрия рН 5,5, 150 мМ ΝηΟ в качестве подвижной фазы. Фракционирующую колонку (25 мл) элюировали при 24 мл/ч и собирали фракции по 0,2 5 мл. Элюированные фракции анализировали в отношении содержания белка с помощью 8Э8-ПААГ. объединяли и определяли концентрацию белка в пуле. Концентрацию пегилированного ΙΡΝ-β-1 а выражали в эквивалентах ΙΕΝ после корректировки, связанной со вкладом РЕО в поглощение при 280 нм, используя коэффициент экстинкции 2 для раствора 1 мг/мл пегилированного I ΡΝ-β-1 а. Отбирали образцы пула для анализа и остаток разбавляли до 30 мкг/мл буфером для приготовления препарата, содержащим ЧСА, делили на аликвоты 0,25 мл/флакон и хранили при -70°С.
2. УФ-спектр очищенного ΙΡΝ-β-1 а. модифицированного 20 кДа шРЕ6-О-мета-метилфенил-О-2метилпропиональдегидом.
УФ-спектр (240-340 нм) ΙΕΝ-β-ϋ, модифицированного 20 кДа шРЕ6-О-мета-метилфенил-О-2метилпропиональдегидом, получали с использованием предварительно приготовленного в виде препарата с ЧСА нефасованного образца. Пегилированный образец проявлял максимум поглощения при 278-279 нм и минимум поглощения при 249-250 нм, что согласуется с данными, наблюдаемыми в случае немодифицированного нефасованного промежуточного продукта ΙΕΝ-β-ϋ. Концентрацию белка пегилированного продукта оценивали на основании спектра, используя коэффициент экстинкции ε28Ο ο·1ο/ο=2,Ο. Концентрация белка в пегилированном нефасованном продукте составляла 0,42 мг/мл. В образце не было мутности, о чем свидетельствует отсутствие поглощения при 320 нм.
3. Характеристика ΙΕΝ-β-Ιη. модифицированного 20 кДа шРЕС-О-мета-метилфенил-О-2метилпропиональдегидом, с помощью 8О8-ПААГ.
2,1 мкг модифицированного 20 кДа шРЕС-О-мета-метилфенил-О-2-метилпропиональдегидом ΙΕΝβ-Ιη подвергали электрофорезу в 8Э8-ПААГ в восстанавливающих условиях в 10-20% градиентном геле. Гель окрашивали Кумасси бриллиантовым синим К-250. Анализ в 8О8-ПААГ модифицированного 20 кДа тРЕС-О-мета-метилфенил-О-2-метилпропиональдегидом ΙΡΝ-β-1 а выявил одну основную полосу с кажущейся массой 55 кДа, что согласуется с модификацией одним РЕО. В очищенном пегилированном продукте обнаружен ^модифицированный ΙΡΝ-β-1 а: однако его количество ниже предела количественного определения. Оценено, что уровень немодифицированного ΙΕΝ-β-ϋ в препарате составляет только около 1% суммарного белка.
4. Характеристика ΙΕΝ-β-Ιη. модифицированного 20 кДа шРЕ6-О-мета-метилфенил-О-2метилпропиональдегидом, с помощью эксклюзионной хроматографии по размеру.
Модифицированный 20 кДа шРЕС-О-мета-метилфенил-О-2-метилпропиональдегидом ΙΕΝ-β-Ιη
-53 009783 подвергали 8 ЕС на аналитической фракционирующей колонке Зпрегозе 6 НК10/30 для ЕРЬС, используя РВ8 рН 7,2 в качестве подвижной фазы. Колонку элюировали при 20 мл/ч и элюент контролировали в отношении поглощения при 280 нм. Пегилированный ΙΡΝ-β-1 а элюировался в виде отдельного острого пика, при этом не было признаков агрегатов (фиг. 3).
5. Анализ ΙΕΝ-β-18, модифицированного 20 кДа тРЕО-О-мета-метилфенил-О-2мети лир опиональ дегид ом, с помощью пептидного картирования.
Специфичность реакции пегилирования оценивали пептидным картированием. 13,3 мкг немодифицированного и модифицированного 20 кДа тРЕО-О-мета-метилфенил-О-2-метилпропиональдегидом ΙΕΝ-β-1а расщепляли 20% (мас./мас.) эндопротеиназой Ьуз-С из Ас1ггошоЬас1ег (АУако Вюргобис1д) в РВ8, содержащем 5 мМ ДТТ, 1 мМ ЕЭТА при рН 7,6 при комнатной температуре в течение 30 ч (конечная концентрация =100 мкл). Затем добавляли 4 мкл 1 М ДТТ и 100 мкл 8 М мочевины и образцы инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Пептиды разделяли обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке Уубас Сщ (214ТР51), используя 70-минутный градиент 0-63% ацетонитрила в 0,1% ТФУ с последующим 10-минутным градиентом 63-80% ацетонитрила в 0,1% ТФУ. Элюент с колонки контролировали в отношении поглощения при 214 нм.
Все предполагаемые пептиды, получаемые при расщеплении ΙΕΝ-β-ΐΒ эндопротеиназой Ьуз-С, идентифицированы ранее Ν-концевым секвенированием и масс-спектрометрией (Рершзку е! а1., (2001) I РИагтасо1о£у апб Ехрептеп1а1 ТИегареийсз 297: 1059), и из них только пептид, который содержит Νконец ΙΕΝ-β-ΐΒ, был изменен модификацией 20 кДа тРЕО-О-мета-метилфенил-О-2-метилпропиональдегидом; о чем свидетельствует его исчезновение на карте. Таким образом, данные картирования свидетельствуют, что остаток РЕО специфично связывается с данным пептидом. Данные, кроме того, свидетельствуют, что мишенью модификации РЕО является Ν-конец белка, так как только Νконцевая модификация может приводить к специфичной утрате данного пептида.
С) Получение и характеристика ΙΕΝ-β-18, модифицированного 20 кДа шРЕО-О-парафенилацетальдегидом.
ΙΡΝ-β-1 а человека пегилировали по его Ν-концу 20 кДа тРЕО-О-пара-фенилацетальдегидом. Продукт химической реакции восстановительного алкилирования, используемой для включения РЕО в основную цепь ΙΡΝ-β-1 а, приводил к образованию аминной связи, которая очень стабильна по отношению к деградации. Пегилированный ΙΕΝ-β-1а подвергали всесторонней характеристике, включая анализ с помощью 8Э8-ПААГ, 8ЕС, пептидное картирование и оценку активности при анализе противовирусной активности ίη νίίτο. Чистота продукта, которую оценивали с помощью 8Э8-ПААГ и 8ЕС, составляла более 95%. В пегилированном образце ΙΕΝ-β-1а не было признаков агрегатов. Остаточные уровни немодифицированного ΙΕΝ-β-1а в продукте были ниже предела количественного определения, но, по-видимому, составляли примерно 1% продукта. В тесте на стабильность не наблюдали агрегации и деградации ΙΕΝβ-1а, модифицированного 20 кДа шРЕО-О-пара-фенилацетальдегидом, в трис-буфере с рН 7,4 в ходе инкубации при 37°С до 7 дней. Удельная активность пегилированного ΙΕΝ-β-1а в анализе противовирусной активности была снижена примерно в 2 раза по сравнению с ^модифицированным ΙΠΝ-β-1 а (ЕС50 = 31 пг/мл для ΙΕΝ-β-1а, модифицированного шРЕСг-О-пара- фенилацетальдегидом по сравнению с ЕС50 =14 пг/мл для немодифицированного ΙΕΝ-β-1а). Основную массу пегилированного ΙΕΝ-β-1а готовили в концентрации 30 мкг/мл в РВ8, рН 7,3, содержащем 14 мг/мл ЧСА, подобно составу, используемому для ΑνΟΝΕΧ®, который был подвергнут всесторонней характеристике. Продукт предоставляли в виде замороженной жидкости, которую хранили при -70°С.
Свойства ΙΡΝ-β-1 а, модифицированного 20 кДа шРЕО-О-пара-фенилацетальдегидом, обобщены в табл. 3.
Таблица 3
Свойства ΙΓΝ-β-1ΰΐ, модифицированного 20 кДа тРЕС-О-парафенилацетальдегидом
Эффективность пегилирования >80%
Отношение 1ГП-р-1а/РЕС 1:1
Чистота >95%
Положение связывания Ν-конец
Противовирусная активность ЕС50 31 пг/мл
1. Получение ΙΕΝ-β-18, модифицированного 20 кДа шРЕО-О-пара-фенилацетальдегидом.
мл ΑνΟΝΕΧ®, не приготовленного в виде препарата (нефасованный промежуточный продукт ΙΕΝ-β-1а, клиническая партия нефасованного лекарственного средства, которая прошла все испытания для применения на человеке, в концентрации 250 мкг/мл в 100 мМ фосфате натрия, рН 7,2, 200 мМ №С1), разбавляли 24 мл 165 мМ МЕ8, рН 5,0 и 400 мкл 5 N НС1 и 24 мл воды. Образец наносили на колонку ЕЕ с 8Р-сефарозой объемом 600 мкл (Р11агтас1а). Колонку промывали 2x900 мкл 5 мМ фосфата
- 54009783 натрия рН 5,5, 75 мМ №1С1 и белок элюировали 5 мМ фосфатом натрия рН 5,5, 600 мМ №С1. Элюированные фракции анализировали в отношении поглощения при 280 нм и концентрацию ΙΕΝ-β-1η в образцах оценивали, используя коэффициент экстинкции 1,51 для раствора 1 мг/мл. Фракции пика объединяли, получая раствор с концентраций ΙΕΝ-β-1η 2,3 мг/мл. К 1,2 мл ΙΕΝ-β-1η из пула элюата с 8Р-сефарозы добавляли 0,5 М фосфат натрия рН 6,0 до 50 мМ, добавляли цианоборогидрид натрия (А1бпс11) до 5 мМ и добавляли 20 кДа тРЕС-О-пара-фенилацетальдегид до 10 мг/мл. Образец инкубировали при комнатной температуре в течение 18 ч в темноте. Пегилированный ΙΕΝ-β-1η очищали из реакционной смеси на ЕЕколонке с 8Р-сефарозой объемом 0,75 мл следующим образом: 1,5 мл реакционной смесь разбавляли 7,5 мл 20 мМ Меб рН 5,0, 7,5 мл воды и 5 мкл НС1 и наносили на колонку с 8Р-сефарозой. Колонку промывали фосфатом натрия рН 5,5, 75 мМ ЫаС1 и затем пегилированный ΙΕΝ-β-1η элюировали с колонки с помощью 20 мМ Меб рН 6,0, 600 мМ ЫаС1. Затем пегилированный ΙΕΝ-β-1η очищали на фракционирующей по размеру колонке для Бирегоке 6 НК 10/30 ЕРЬС, используя 5 мМ фосфат натрия рН 5,5, 150 мМ №1С1 в качестве подвижной фазы. Фракционирующую колонку (25 мл) элюировали при 20 мл/ч и собирали фракции по 0,5 мл. Элюированные фракции анализировали в отношении содержания белка по поглощению при 280 нм, объединяли и определяли концентрацию белка в пуле. Концентрацию пегилированного ΙΕΝ-β-1η выражали в эквивалентах ΙΕΝ после корректировки, связанной со вкладом РЕС (20 кДа тРЕС-О-пара-фенилацетальдегид имеет коэффициент экстинкции при 280 нм, равный 0,5 для раствора 1 мг/мл) в поглощение при 280 нм, используя коэффициент экстинкции 2 для раствора 1 мг/мл пегилированного ΙΕΝ-β-1;·ι. Отбирали образцы пула для анализа и остаток разбавляли до 30 мкг/мл буфером для приготовления препарата, содержащим ЧСА, делили на аликвоты 0,25 мл/флакон и хранили при -70°С.
2. УФ-спектр очищенного ΙΕΝ-β-1;·ι. модифицированного 20 кДа тРЕС-О-пара-фенилацетальдегидом.
УФ-спектр (240-340 нм) ΙΗΝ-β-Εκ модифицированного 20 кДа тРЕС-О-пара-фенилацетальдегидом, получали с использованием предварительно приготовленного в виде препарата с ЧСА нефасованного образца. Пегилированный образец проявлял максимум поглощения при 278-279 нм и минимум поглощения при 249-250 нм, что согласуется с данными, наблюдаемыми в случае немодифицированного нефасованного промежуточного продукта ΙΕΝ-β-1;·ι. Концентрацию белка пегилированного продукта оценивали на основании спектра, используя коэффициент экстинкции ε280 0,1%=2,0. Концентрация белка пегилированного нефасованного средства составляла 0,10 мг/мл. В образце не было мутности, о чем свидетельствует отсутствие поглощения при 320 нм.
3. Характеристика ΙΗΝ-β-Εκ модифицированного 20 кДа тРЕС-О-пара-фенилацетальдегидом, с помощью δΌδ-ПААГ.
2,5 мкг немодифицированного и модифицированного 20 кДа тРЕС-О-пара-фенилацетальдегидом ΙΕΝ-β-1;·ι подвергали электрофорезу в δΌδ-ПААГ в восстанавливающих условиях в 10-20% градиентном геле. Гель окрашивали Кумасси бриллиантовым синим К-250, и он показан на фиг. 4 (дорожка А: ΙΕΝ-β1а, модифицированный 20 кДа тРЕС-О-пара-фенилацетальдегидом; дорожка В: немодифицированный ΙΕΝ-β-1η; дорожка С: маркеры молекулярной массы (сверху вниз; 100 кДа, 68 кДа, 45 кДа, 27 кДа и 18 кДа, соответственно)). Анализ в δΌδ-ПААГ модифицированного 20 кДа тРЕС-О-парафенилацетальдегидом ΙΕΝ-β-1;·ι выявил одну основную полосу с кажущейся массой 55 кДа, что согласуется с модификацией одним РЕС. Не выявлено форм с более высокой массой, возникающих в результате присутствия дополнительных групп РЕС. В очищенном пегилированном продукте обнаружен немодифицированный ΙΕΝ-β-1η; однако его количество ниже предела количественного определения. Оценено, что уровень немодифицированного ΙΕΝ-β-1η в препарате составляет только около 1% суммарного белка.
4. Характеристика ΙΗΝ-β-Εκ модифицированного 20 кДа тРЕС-О-пара-фенилацетальдегидом, с помощью эксклюзионной хроматографии по размеру.
Модифицированный 20 кДа тРЕС-О-пара-фенилацетальдегидом ΙΕΝ-β-1η подвергали БЕС на аналитической фракционирующей колонке Бирегоке 6 НК10/30 для ЕРЬС, используя РВБ рН 7,2 в качестве подвижной фазы. Колонку элюировали при 20 мл/ч и элюент контролировали в отношении поглощения при 280 нм, как показано на фиг. 5: панель А: стандарты молекулярной массы (670 кДа, тиреоглобулин; 158 кДа, гамма-глобулин; 44 кДа, овальбумин; 17 кДа, миоглобин; 1,3 кДа, витамин В12), панель В: ΙΕΝβ-^, модифицированный 20 кДа тРЕС-О-пара-фенилацетальдегидом. Пегилированный ΙΕΝ-β-1η элюировался в виде отдельного острого пика с кажущейся молекулярной массой около 200 кДа, что согласуется с большим гидродинамическим объемом РЕС. Не наблюдалось признаков агрегатов. В препарате выявляли немодифицированный ΙΗΝ-β-Εκ но его количество было ниже предела количественного определения. На основании величины пика количества немодифицированного ΙΕΝ-β-1η составляли 1% или меньше от всего продукта, что согласуется с наблюдениями с использованием δΌδ-ПААГ.
5. Анализ ΙΗΝ-β-Εκ модифицированного 20 кДа тРЕС-О-пара-фенилацетальдегидом, с помощью пептидного картирования.
Специфичность реакции пегилирования оценивали пептидным картированием. Немодифицирован
- 55 009783 ный и модифицированный 20 кДа тРЕО-О-пара-фенилацетальдегидом ΣЕN-β-1а расщепляли эндопротеиназой Ьу5-С из АсйготоЬас!ег (Шако Вюргобиск) и полученные в результате продукты расщепления фракционировали обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке Уубас С4, используя 30-минутный градиент от 0 до 70% ацетонитрила в 0,1% ТФУ. Элюент с колонки контролировали в отношении поглощения при 214 нм.
Все предполагаемые пептиды, получаемые при расщеплении ΣЕN-β-1а эндопротеиназой Ьук-С, идентифицированы ранее Ν-концевым секвенированием и масс-спектрометрией (Рерткку е! а1., (2001) Σ Рйагтасо1оду апб Е.хрептеЩа1 ТйегареиЕск 297: 1059), и из них только пептид, который содержит Νконец ΣЕN-β-1а, был изменен модификацией 20 кДа тРЕО-О-пара-фенилацетальдегидом; о чем свидетельствует его исчезновение на карте. Таким образом, данные картирования свидетельствуют, что остаток РЕО специфично связывается с данным пептидом. Данные, кроме того, свидетельствуют, что мишенью модификации РЕО является Ν-конец белка, так как только Ν-концевая модификация может приводить к специфичной утрате данного пептида.
6. Стабильность ΣЕN-β-1а, модифицированного 20 кДа тРЕО-О-пара-фенилацетальдегидом.
Чтобы тестировать стабильность ΣЕN-β-1а, модифицированного 20 кДа тРЕО-О-парафенилацетальдегидом, образцы разбавляли до 0,1 мкг/мл 100 мМ трис-НС1-буфером, рН 7,4, и затем инкубировали при 37°С до 7 дней. Образцы объемом 20 мкл (2 мкг) отбирали в 0, 2, 5 и 7 дни и анализировали в 8Э8-ПААГ в восстанавливающих условиях, как показано на фиг. 6: дорожка А: маркеры молекулярной массы (сверху вниз; 100 кДа, 68 кДа, 45 кДа, 27 кДа, 18 кДа и 15 кДа, соответственно); дорожки В, С, Ό и Е: ΣЕN-β-1а, модифицированный тРЕО-О-пара-фенилацетальдегидом, отобранный в 0, 2, 5 и 7 дни, соответственно. Не наблюдали признаков агрегации или деградации пегилированного ΣЕN-β-1а даже после 7 дней при 37°С.
Пример 3. Удельная активность ΣЕN-β-1а человека в анализе противовирусной активности ίη νίΙΐΌ.
Удельную противовирусную активность образцов пегилированного ΣЕN-β-1а тестировали на клетках карциномы легкого человека (клетки А549), которые были подвергнуты воздействию вируса энцефаломиокардита (ЕМС), используя метаболический краситель 2,3-бис-[2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил]2Н-тетразолий-5-карбоксианилид (МТТ; М-5655, 8Цта, 8ΐ. Ьошк, МО) в качестве меры метаболически активных клеток, оставшихся после экспонирования с вирусом. Коротко, клетки А549 предварительно обрабатывали в течение 24 ч либо немодифицированным, либо пегилированным ΣЕN-β-1а (начиная с 66,7 пг/мл, проводя серийные разведения в 1,5 раза до 0,8 пг/мл) перед заражением вирусом. Затем клетки заражали в течение 2 дней вирусом ЕМС в разведении, которое давало полную гибель клеток в отсутствии ΣЕN. Затем планшеты проявляли с помощью МТТ. Маточный раствор МТТ готовили в концентрации 5 мг/мл в Р38 и стерильно фильтровали, и 50 мкл полученного раствора разбавляли в культурах клеток (100 мкл на лунку). После инкубации при комнатной температуре в течение 30-60 мин раствор МТТ/среда сливали, клетки промывали 100 мкл РВ8 и наконец метаболизируемый краситель солюбилизировали в 100 мкл 1,2 Ν НС1 в изопропаноле. Жизнеспособные клетки (которые определяли по наличию красителя) количественно оценивали по поглощению при 450 нм. Данные анализировали, нанося на графике поглощение против концентрации ΣЕN-β-1а, и активность ΣЕN-β-1а определяли в виде концентрации, при которой погибало 50% клеток, т.е. наблюдалось 50% цитопатическое действие (ЕС50) или 50% от максимума ОЭ.450. Анализ проводили восемь раз для немодифицированного ΣЕN-β-1а и от трех до четырех раз для разных пегилированных образцов ΣЕN-β-1а. Для каждого анализа получали точки данных в двух повторах для каждой концентрации белка. Типичные графики жизнеспособности клеток против концентрации немодифицированного или пегилированного ΣЕN-β-1а показаны на фиг. 7А и 7В. На фиг. 7А символы означают следующее: немодифицированный ΣЕN-β-1а (о), ΣЕN-β-1а, модифицированный 20 кДа тРЕО-О-2-метилпропиональдегидом (□), ΣЕN-β-1а, модифицированный 20 кДа тРЕО-О-параметилфенил-О-2-метилпропиональдегидом (Δ) и ΣЕN-β-1а, модифицированный 20 кДа тРЕО-О-метаметилфенил-О-2- метилпропиональдегидом (◊). На фиг. 7В символы означают следующее: немодифицированный ΣЕN-β-1а (о), ΣЕN-β-1а, модифицированный 20 кДа тРЕО-О-пара-фенилацетальдегидом (□), ΣЕN-β-1а, модифицированный 20 кДа тРЕО-О-пара-фенилпропиональдегидом (Δ) и ΣЕN-β-1а, модифицированный 20 кДа тРЕО-О-мета-фенилацетальдегидом (◊).
Значения ЕС50 (концентрация при полумаксимальной защите от вируса) для ΣЕN-β-1а, модифицированного 20 кДа тРЕО-О-2-метилпропиональдегидом, 20 кДа тРЕО-О-пара-метилфенил-О-2метилпропиональдегидом, 20 кДа тРЕО-О-мета-метилфенил-О-2-метилпропиональдегидом, 20 кДа тРЕО-О-пара-фенилацетальдегидом, 20 кДа тРЕО-О-пара-фенилпропиональдегидом и 20 кДа тРЕО-Омета-фенилацетальдегидом, показаны в табл. 4. Все пегилированные ΣЕN-β-1а модифицировали и очищали до гомогенности, по существу, как описано для ΣЕN-β-1а, модифицированного 20 кДа тРЕО-О-2метилпропиональдегидом, ΣЕN-β-1а, модифицированного 20 кДа тРЕО-О-мета-метилфенил-О-2метилпропиональдегидом, и ΣЕN-β-1а, модифицированного 20 кДа тРЕО-О-пара-фенилацетальдегидом, как описано выше.
- 56 009783
Таблица 4
Удельная противовирусная активность немодифицированного и пегилированного 1ЕЫ-р-1а
Средняя ЕС50 Белок (иг/мл)
Немодифицированный ΙΓΝ-β-Ιβ 14 (пределы 12-16)
1ГЫ-р-1а, модифицированный 2-метилпропиональдегидом 20 кДа тРЕС-О- 32 (пределы 26-37)
ΙΕΝ-β-1а, модифицированный 20 кДа тРЕС-О-
пара-метилфенил-О-2- 41 (пределы 36-47)
метилпропиональдегидом
ΙΕΝ-β-1а, модифицированный 20 кДа тРЕС-О-
мета-метилфенил-О-2- 31 (пределы 27-35)
метилпропиональдегидом 1ГЫ-₽-1а, модифицированный пара-фенилацетальдегидом 20 кДа тРЕС-О- 31 (пределы 25-39)
IΕΝ-β-1а, модифицированный пара-фенилпропиональдегидом 20 кДа тРЕС-О- 31 (пределы 27-34)
1ГЫ-₽-1а, модифицированный мета-фенилацетальдегидом 20 кДа тРЕС-О- 27 (пределы 25-29)
Пример 4. Фармакокинетика вводимого внутривенно немодифицированного и пегилированного ΙΤΝ-β-Хау крыс.
Канюлированным самкам крыс ЬеМк внутривенно вводили либо 80 мкг/кг немодифицированного ΙΕΝ-β-Ха, либо 24 мкг/кг одного из следующих пегилированных ΙΕΝ-β-1 а: ΙΕΝ-β-Ха, модифицированного 20 кДа шРЕС-О-2-метилпропиональдегидом, ΙΕΝ-β-Ιη. модифицированного 20 кДа шРЕС-О-параметилфенил-О-2-метилпропиональдегидом, ΙΕΝ-β-Ιη. модифицированного 20 кДа шРЕС-О-парафенилацетальдегидом, ΙΕΝ-β-1а. модифицированного 20 кДа шРЕС-О-пара-фенилпропиональдегидом, ΙΕΝ-β-1 а. модифицированного 20 кДа шРЕС-О-мета-фенилацетальдегидом и ΙΕΝ-β-Ιη. модифицированного 20 кДа шРЕСг-О-мета-метилфенил-О-2-метилпропиональдегидом. Как немодифицированный, так и пегилированные белки готовили в виде препарата в присутствии 14-15 мг/мл ЧСА в качестве носителя. В случае немодифицированного белка кровь (0,2 мл) получали через канюлю в разных временных точках; непосредственно перед введением и в 0,083; 0,25; 0,5; 1,25; 3 и 5 часов после введения. В случае пегилированных белков кровь (0,2 мл) получали через канюлю непосредственно перед введением и в 0,083; 0,25; 0,5; 1,25; 3; 24; 48 и 72 часа после введения. Цельную кровь собирали в пробирки для отделения сыворотки (ВескХои ΟίοΚίηδοη № 365956) и инкубировали при комнатной температуре в течение 60 мин, давая возможность свернуться. Свернувшуюся кровь центрифугировали в течение 10 мин при 4°С и извлекали сыворотку и хранили при -70°С вплоть до анализа.
Затем образцы сыворотки размораживали и тестировали в анализах на противовирусную активность. Образцы сыворотки разбавляли 1:50 в содержащей сыворотку среде (модифицированная по Дульбекко среда Игла, содержащая 10% (об./об.) фетальной сыворотки теленка, по 100 ед. пенициллина и стрептомицина и 2 мМ Ь-глутамина) и тестировали в анализах на противовирусную активность. Образцы титровали в размеченные лунки 96-луночного планшета для культуры ткани, содержащие клетки карциномы легкого человека (А549, #ССЬ-Х85, АТСС, КоскуйХе, МО). На каждом планшете анализировали разведения стандарта (66,7; 44,4; 29,6; 19,8; 13,2; 8,8; 5,9; 3,9; 2,6; 1,7; 1,2 и 0,8 пг/мл той же самой формы ΙΕΝ-β-Ха, вводимого крысам) и три образца сыворотки. Клетки А549 предварительно обрабатывали разведенными образцами сыворотки за 24 ч до заражения вирусом энцефаломнелокардита (ЕМС). После 2 дней инкубации с вирусом жизнеспособные клетки красили раствором МТТ (в концентрации 5 мг/мл в фосфатном буфере) в течение X ч, промывали фосфатным буфером и солюбилизировали с помощью 1,2 N НСХ в изопропаноле. Затем лунки считывали при 450 нм. Стандартные кривые немодифицированного или пегилированного ΙΕΝ-β-Ха получали для каждого планшета и использовали для определения количества немодифицированного или пегилированного ΙΕΝ-β-Ха в каждом тестируемом образце. Затем рассчитывали фармакокинетические параметры, используя непараметрический анализ с помощью компьютерной программы ΧνίηΝοηΕίη. версия 3.0 или 3.3.
На фиг. 8А показана концентрация против временных точек для немодифицированного ΙΕΝ-β-Ха (верхняя панель) и ΙΕΝ-β-1а, модифицированного 20 кДа шРЕС-О-2-метилпропиональдегидом (нижняя
-57009783 панель), и на фиг. 8В показана концентрация против временных точек для ΙΕΝ-β- 1а, модифицированного 20 кДа шРЕб-О-пара-метилфенил-О-2-метилпропиональдегидом (верхняя панель) и 20 кДа тРЕ6-0пара-фенилацетальдегидом (нижняя панель). Точки данных являются средними из измерений на 3 крысах.
В табл. 5 показаны фармакокинетические параметры Стах (максимально наблюдаемая концентрация), Ед (время полуэлиминации), АИС (площадь под кривой), (объем распределения в стационарном состоянии), скорость клиренса и МКТ (среднее время удержания) для немодифицированного ΙΕΝ-β1а и указанных форм пегилированного ΙΕΝ-β- 1а. Данные, показанные на фиг. 8А и 8В и в табл. 5, получали в одном и том же исследовании.
На фиг. 9А показана концентрация против временных точек для немодифицированного ΙΕΝ-β-1 а (верхняя панель) и ΙΕΝ-β-1 а. модифицированного 20 кДа шРЕСг-О^-фенилпропиональдегидом (нижняя панель). Точки данных являются средними из измерений для 2 крыс. На фиг. 9В показана концентрация против временных точек для ΙΕΝ-β-1 а. модифицированного 20 кДа шРЕС-О-мета-фенилацетальдегидом (верхняя панель) и 20 кДа тРЕС-О-мета-метилфенил-О-2-метилпропиональдегидом (нижняя панель). Точки данных являются средними из измерений для 3 крыс.
В табл. 6 показаны фармакокинетические параметра для немодифицированного ΙΕΝ-β-1 а и указанных форм пегилированного ΙΕΝ-β-1 а. Данные, показанные на фиг. 9А и 9В и в табл. 6, получали в одном и том же исследовании; независимо от данных, показанных на фиг. 8А и 8В и в табл. 5.
Как очевидно из данных, показанных на фиг. 8А, 8В, 9А и 9В и в табл. 5 и 6, пегилирование ΙΕΝ-β1а молекулами РЕС согласно изобретению улучшает фармакокинетические свойства ΙΕΝ-β-1 а. Во всех случаях пегилированные белки подвергались клиренсу менее быстро, чем ^модифицированный ΙΕΝ-β1а, что приводило к скоростям клиренса 3,9-8,3 мл/ч/кг по сравнению с 160-170 мл/ч/кг для немодифицированного белка. Вследствие сниженных скоростей клиренса среднее время удержания (МКТ) возрастало примерно с 1 ч для немодифицированного белка до 4,8-7,6 ч для пегилированных белков. Подобным образом время полуэлиминации (11/2) возрастало примерно от 1 ч для немодифицированного белка до 5,213 ч для пегилированных белков. Значения площади под кривой (АЕГС) также существенно увеличивались при пегилировании ΙΕΝ-β-1 а. Для немодифицированного ΙΕΝ-β-1 а АИС составляла примерно 0,5 мкг-ч/мл, тогда как для пегилированных белков значения АЕГС находятся в пределах примерно от 3 до 6 мкг-ч/мл, несмотря на тот факт, что дозы пегилированных белков были на уровне в 3,3 раза ниже, чем уровень немодифицированного белка. Для максимально наблюдаемой концентрации (Стах) значения были, как правило, выше для немодифицированного ΙΕΝ-β-1 а. чем для пегилированных белков, отражая более низкую дозу вводимых модифицированных белков. Для объема распределения в стационарном состоянии (У55) значения для всех пегилированных белков были ниже, чем для немодифицированного ΙΕΝ-β-1 а. что свидетельствует об ограничении их способности существовать в центральном отделе кровообращения.
Таблица 5 Фармакокинетические параметры для немодифицированного ΙΕΝ-β- 1а. ΙΕΝ-β- 1а. модифицированного 20 кДа шРЕб-О-2-метилпропиональдегидом, ΙΕΝ-β-Ιη. модифицированного 20 кДа тРЕ6-0-параметилфенил-О-2-метилпропиональдегидом и ΙΕΝ-β-Ιη. модифицированного 20 кДа шРЕС-О-парафенилацетальдегидом после внутривенного введения крысам3.
Параметр Единицы Немодифицированный 1ЕЫ-р-1а ΙΓΝ-β-13, модифицированный 20 кДа тРЕС-О-2ме тил про пи он ал ьдегидом ΙΓΝ-β-1-а, модифицированный 20кДа тРЕС’О-параметилфенил-0-2метилпропиональдегидом ΙΓΝ-β-1Δ, модифицированный 20 кДатпРЕС^О-парафенилацетальдегидом
С-πιβχ пг/мл 1400000 720000 710000 590000
£1/2 час 0,98 13 11 6,8
аос пг *час/мл 510000 4800000 4500000 2900000
мл/кг 160 39 40 53
Клиренс мл/час/кг 160 5, 0 5,3 8, 3
МКТ час 0,98 1,6 7,4 6,4
а Показанные фармакокинетические данные для немодифицированного и пегилированного ΙΡΝ-ρ-ΐΞ получали в одном и том же исследовании.
-58009783
Таблица 6 Фармакокинетические параметры для ^модифицированного ΙΕΝ-β-Ιη. ΙΕΝ-β-Ιη. модифицированного 20 кДа шРЕб-0-пара-фенилпропиональдегидом, ΙΕΝ-β-Ιη. модифицированного 20 кДа тРЕ6-0-метафенилацетальдегидом, и ΙΕΝ-β-Ιη. модифицированного 20 кДа шРЕС-О-мета-метилфенил-О-2метилпропиональдегидом, после внутривенного введения крысам3.
Параметр Единицы Немодифицированный ΐΕΝ-β-Та ΙΓΝ-β-14, модифицированный 20 кДа тРЕС-Опара^ фенилпропиональде гидом ΙΕΝ-β-Ιβ, модифицированный 20кДа тРЕО-О-метафенилацетальдегидом 1ПЬ[3-1а, модифицированный 20 кДа тРЕС-О-метаметилфенил-О’2метилпропиональдегидом
Стах пг/мл 670000 930000 550000 700000
^1/а час 0,92 5,2 7,7 7. 1
аос пг·час/мл 470000 4700000 3800000 6200000
Узз мл/кг 140 25 46 21
Клиренс мл/час/кг 170 5,1 6, 4 3, 9
МКГ час 0,81 4,8 7,2 5,5
а Показанные фармакокинетические данные для немодифицированного и пегилированного ΙΓΝ-β-Ιθ получали в одном и том же исследовании.
Пример 5. Сравнительная фармакокинетика и фармакодинамика немодифицированного и пегилированного ΙΕΝ-β-Ха человека у приматов, отличных от человека.
Сравнительные исследования однократных и повторяющихся доз проводили, используя немодифицированный и пегилированный ΙΡΝ-β-1 а, чтобы определить их относительную стабильность и активность у приматов, отличных от человека. В указанных исследованиях фармакокинетику и фармакодинамику конъюгатов пегилированного ΙΕΝ-β-Ιη сравниваются с фармакокинетикой и фармакодинамикой немодифицированного ΙΕΝ-β- 1а. и обоснованные выводы могут быть распространены на человека.
Животные и способы.
Исследование 1 (повторяющиеся дозы).
Данное исследование представляет собой исследование повторяющейся дозы в параллельных группах для оценки сравнительной фармакокинетики и фармакодинамики немодифицированного и пегилированного ΙΕΝ-β-Ха. Для данного исследования используют здоровых приматов (например, макак-резус). Перед введением доз ветеринарный врач оценивает всех лабораторных животных в отношении признаков нарушения здоровья два раза в пределах 14 дней до введения тестируемого продукта; при этом одна оценка должна проводиться в пределах 24 ч до первого введения тестируемого продукта. Тестируемый продукт получают только здоровые животные. Оценки включают общий медицинский осмотр и заборы крови до введения дозы для определения исходного уровня клинической патологии и исходного уровня антител к ΙΕΝ-β-Ιη. Всех животных взвешивают и регистрируют температуру тела в пределах периода времени, равного 24 ч, до введения тестируемого продукта. Набирают двенадцать субъектов и распределяют по группам из трех субъектов для получения ими 1х 106 ед./кг немодифицированного или пегилированного ΙΕΝ-β-Ιη. но в других отношениях идентичного ΙΕΝ-β-Ιη. Введение проводят либо подкожным (п/к), либо внутривенным (в/в) способами. Шесть животных мужского пола получают тестируемый продукт в/в путем (по 3 на обработку), другие 6 животных мужского пола получают тестируемый продукт п/к путем (по 3 на обработку). Ни одно из животных не должно было ранее подвергаться обработке ΙΕΝβ. Каждому животному вводят дозу два раза, дозы разделены периодом, составляющим четыре недели. Объем дозы составляет 1,0 мл/кг. Отбор крови для фармакокинетического тестирования проводят в 0; 0,083; 0,25; 0,5; 1; 1,5; 2; 4; 6; 8; 12; 24; 48; 72 и 96 ч после каждой инъекции. Образцы крови для измерения ΙΕΝ-индуцируемого маркера биологического ответа, неоптерина сыворотки, отбирают в 0, 24, 48, 72, 96, 168, 336 и 504 ч после введения исследуемого лекарственного средства. Оценки во время периода исследования включают клинические исследования, проводимые через 30 мин и 1 ч после введения дозы для выявления признаков токсичности. Проводят ежедневные наблюдения в клетках и регистрируют общий вид, симптомы токсичности, дискомфорта и изменения в поведении. Массу тела и температуру тела регистрируют с регулярными интервалами на протяжении 21 дня после введения дозы.
Исследование 2 (однократная доза).
Данное исследование представляет собой исследование однократной дозы в параллельных группах для оценки сравнительной фармакокинетики и фармакодинамики немодифицированного и пегилированного ΙΕΝ-β-Ιη. Для данного исследования используют здоровых приматов (например, макак-резус). Перед введением доз ветеринарный врач оценивает всех лабораторных животных в отношении признаков нарушения здоровья два раза в пределах 14 дней до введения тестируемого продукта; при этом одна оценка должна проводиться в пределах 24 ч до первого введения тестируемого продукта. Тестируемый
-59009783 продукт получают только здоровые животные. Оценки включают общий медицинский осмотр и заборы крови до введения дозы для определения исходного уровня клинической патологии и исходного уровня антител к ΙΕΝ-β-Ш. Всех животных взвешивают и регистрируют температуру тела в пределах периода времени, равного 24 ч, до введения тестируемого продукта. Набирают двадцать субъектов и распределяют их в одну из пяти групп, состоящих из четырех животных (2 самца и 2 самки на группу), для получения ими 1х106 ед./кг немодифицированного или пегилированного ΙΕΝ-β-1;·ι внутримышечно (в/м) или 2х105 ед./кг, 1х106 ед./кг или 5х106 ед./кг пегилированного ΙΕΝ-β-1;·ι внутривенно (в/в). Ни одно из животных не должно было ранее подвергаться обработке ΙΕΝ-β. Объем дозы обычно составляет 1,0 мл/кг. Отбор крови для фармакокинетического тестирования проводят в 0; 0,5; 1; 2; 4; 6; 8; 12; 24; 36; 48 и 96 часов и в 7, 14, 21 и 28 день после введения исследуемого лекарственного средства. Образцы крови для измерения ΙΕΝ-индуцируемого маркера биологического ответа, 2'-5'-олигоаденилатсинтазы (2'-5'ОА8), отбирают в 0, 12, 24, 48, 72 и 96 час и в 7, 14, 21 и 28 день после введения исследуемого лекарственного средства. Оценки во время периода исследования включают клинические исследования, проводимые через 30 мин и 1 ч после введения дозы для выявления признаков токсичности. Проводят ежедневные наблюдения в клетках и регистрируют общий вид, симптомы токсичности, дискомфорта и изменения в поведении. Массу тела и температуру тела регистрируют с регулярными интервалами на протяжении 28 дней после введения дозы.
Способы анализа.
Уровни ΙΕΝ-β-1;·ι в сыворотке количественно оценивают с использованием биоанализа цитопатического действия (СРЕ). В анализе СРЕ измеряют уровни опосредованной ΙΕΝ противовирусной активности. Уровень противовирусной активности в образце отражает число молекул активного ΙΕΝ, находящегося в данном образце во время отбора крови. Указанный способ был стандартным способом для оценки фармакокинетики ΙΕΝ-β-1;·ι. Анализ СРЕ выявляет способность ΙΕΝ-β защищать клетки карциномы легкого человека (А549, #ССЬ-185, АТСС, КосШШе, ΜΌ) от цитотоксичности, обусловленной вирусом энцефаломиокардита (ЕМС). Клетки предварительно инкубируют в течение 15-20 ч с образцами сыворотки, обеспечивая индукцию и синтез ΙΕΝ-индуцируемых белков. Которые ответственны за противовирусный ответ. Затем добавляют вирус ЕМС и инкубируют еще в течение 30 ч до того, как проводят оценку цитотоксичности с использованием кристаллического фиолетового красителя. Внутренний стандарт ΙΕΝβ, а также внутренний стандарт пегилированного IΕN-β-1а тестируют одновременно с образцами на каждом планшете для анализа. Указанный стандарт калибруют относительно стандартного образца природного ΙΕΝ фибробластов человека (Второй международный стандарт интерферона ВОЗ, фибробласты человека, ОЬ-23-902-53). Каждый планшет для анализа также содержит лунки контроля клеточного роста, не содержащие ни одного вида ΙΕΝ-β, ни ЕМС, и лунки для вирусного контроля, которые содержат клетки и ЕМС, но не содержат ΙΕΝ-β. Также готовят контрольные планшеты, содержащие стандарт и образцы, чтобы определить влияние, если таковое существует, образцов на рост клеток. Указанные планшеты красят без добавления вируса. Образцы и стандарты тестируют в двух повторах на каждом из двух планшетов для параллельного анализа, получая четыре точки данных на образец. Указывается геометрическая средняя концентрация четырех повторов. Предел определения в данном анализе составляет 10 ед./мл. Концентрации неоптерина в сыворотке определяют в единицах, принятых в клинической фармакологии, используя коммерчески доступные анализы. Концентрации 2'-5'-ОА8 в сыворотке определяли в лаборатории по контракту, используя утвержденный коммерчески доступный анализ.
Фармакокинетические и статистические способы.
Используют компьютерную программу КкШр™ (МюгоМаШ, Шс., 8а11 Ьаке Сйу, ИТ) для включения данных в фармакокинетические модели. Геометрические средние концентрации откладывают на графике по временным точкам для каждой группы. Так как результаты анализа выражают в разведениях, геометрические средние считаются более подходящими, чем арифметические средние. Уровни ΙΕΝ в сыворотке корректируют относительно значений исходного уровня и нерегистрируемые концентрации в сыворотке устанавливают на уровне 5 ед./мл, который соответствует половине нижнего предела определения. Для данных в случае в/в инфузии двухпараметрическую модель в/в инфузии подгоняют к регистрируемым концентрациям в сыворотке каждого субъекта и данные п/к введения подгоняют к двухпараметрической модели инъекции.
Рассчитывают следующие фармакокинетические параметры:
(ί) наблюдаемую пиковую концентрацию, Стах (ед./мл);
(ίί) область под кривой от 0 до 48 ч, АИС (ед. X ч/мл), используя формулу трапеций;
(ίίί) период полуэлиминации (ч);
и на основании данных в/в инфузии (при в/в использовании):
(ίν) полупериод распределения (ч);
(ν) клиренс (мл/ч/кг);
(νί) кажущийся объем распределения Vб (мл/кг).
Компьютерную программу АШЫопйп (версия 1.0, ЗаепЦПс СопкиШпд Шс., Арех, ΝΟ) используют для расчета периода полуэлиминации после в/в и п/к инъекции. Для неоптерина и 2'-5'-ОА8 представле
- 60 009783 ны арифметические средние для каждой группы. Рассчитывают Етах, максимальное изменение от исходного уровня. Стах, АИС и Етах подвергают однофакторному дисперсионному анализу, чтобы сравнить группы дозирования. Стах и АИС подвергали логарифмическому преобразованию перед анализом; представлены геометрические средние.
Пример 6. Антиангиогенное действие пегилированного [ΕΝ-β-Ιη человека; способность пегилированного ГЕХ-в-1а ингибировать пролиферацию эндотелиальных клеток ίη νίίτο.
Эндотелиальные венозные клетки человека (Се11 ЗуЧспъ. Са1. № 2У0-Р75) и эндотелиальные клетки капилляров кожи человека (Се11 8у81ет8, кат. № 2М1-С25) поддерживают в культуре с использованием набора для среды С8-С (Се11 8у81ет8, кат. № 4Ζ0-500). За 24 ч до эксперимента клетки обрабатывают трипсином и ресуспендируют в среде для анализа, 90% М199 и 10% фетальной сыворотки теленка (ЕВ8) и доводят до требуемой плотности клеток. Затем клетки высевают на покрытые желатином 24- или 96луночные планшеты, при плотности либо 12500 клеток/лунку, либо 2000 клеток/лунку, соответственно. После инкубации в течение ночи среду для анализа заменяют свежей средой, содержащей 20 нг/мл рекомбинантного основного фактора роста фибробластов человека (ЬЕОЕ) (ВесЮп Э1ск1П8оп, кат. № 40060) и добавляют различные концентрации немодифицированного или пегилированного ГЕХ-в-1а согласно изобретению или позитивный контроль (в качестве позитивного контроля можно использовать эндостатин, а также антитело к ЬЕОЕ). Конечный объем доводят до 0,5 мл в 24-луночном планшете или 0,2 мл в 96-луночном планшете. Через 72 ч клетки обрабатывают трипсином для подсчета на Сои11ет, замораживают для регистрации флуоресценции на СуОиаШ или метят [3Н]-тимидином. С помощью указанного анализа ίη νίΙΐΌ проводят тестирование пегилированных молекул ГЕХ-в-1а человека согласно изобретению в отношении влияния на пролиферацию эндотелиальных клеток, которое может быть показателем антиангиогенного действия ίη νί\Ό. См. О'ЯеШу, е1 а1., Се11 88: 277-285 (1997).
Пример 7. Модели ίη νί\Ό для тестирования антиангиогенного и неоваскуляризующего действия пегилированного ГЕЫ-в-1а человека и пегилированного ГЕХ-в-1а грызунов.
Немодифицированный ΖΕΝ-β-^ и ΖΕΝ-β-^, модифицированный 20 кДа тРЕО-О-2метилпропиональдегидом, тестировали в отношении их способности ингибировать образование радиально ориентированных сосудов, проникающих на периферию опухолей злокачественной меланомы человека 8К-МЕЬ-1 у бестимусных гомозиготных голых мышей (пи/пи). Клетки 8К-МЕЬ-1 выращивали в культуре до 80% слияния и затем 2х106 клеток инокулируют интрадермально (объем 0,1 мл в 0 день) сбоку от средней аксиллярной линии бестимусным гомозиготных голых мышей (пи/пи) ХСЯ (Тасошс, Оеттайотеп, ΝΥ) трехнедельного возраста. Спустя 24 ч (день 1) группам из трех мышей в каждой вводят следующие подкожные дозы контрольного наполнителя, немодифицированного ΖΕN-β-1а или ΖΕN-β-1а, модифицированного 20 кДа тРЕО-О-2-метилпропиональдегидом.
Группа А: 0,1 мл сывороточного альбумина человека в концентрации 45,6 мг/мл (контрольный наполнитель) только один раз в 1 день.
Группа В: 0,1 мл сывороточного альбумина человека в концентрации 45,6 мг/мл, содержащего 1 МИ (5 мкг) немодифицированного ΖΕN-β-1а ежедневно в 1-9 дни включительно.
Группа С: 0,1 мл сывороточного альбумина человека в концентрации 45,6 мг/мл, содержащего 1 МИ единиц (10 мкг) ΖΕN-β-1а, модифицированного 20 кДа тРЕО-О-2-метилпропиональдегидом только один раз в 1 день.
Группа Ό: 0,1 мл сывороточного альбумина человека в концентрации 45,6 мг/мл (контрольный наполнитель) ежедневно в 1-9 дни включительно.
Мышей забивали на 10 день (авертин, 0,5 мл внутрибрюшинно) и оценивали место инокуляции опухоли в отношении образования новых сосудов, измеряемого исследователем вслепую, не зная групп обработки. Сосуды подсчитывали при постоянном увеличении под препарационной лупой. Каждый радиально ориентированный сосуд, проникающий в периферию опухоли, считали как один сосуд. Каждая группа состояла из трех мышей.
Как показано на фиг. 10 однократное введение 1 МИ ΖΕN-β-1а, модифицированного 20 кДа тРЕОО-2-метилпропиональдегидом (группа С), было также эффективным в снижении количества новых сосудов, как и ежедневное введение 1 МИ немодифицированного ΖΕN-β-1а (группа В). Однако действие ΖΕNв-1а, модифицированного 20 кДа тРЕО-О-2-метилпропиональдегидом более выражено, если учесть, что ежедневное введение одного наполнителя оказывает некоторое ингибирующее действие (сравните группу А, однократное введение наполнителя, с группой Ό, ежедневное введение наполнителя).
Также разработано множество других моделей, которые можно использовать для тестирования антиангиогенного действия и действия, направленного против образования новых сосудов, пегилированных молекул согласно изобретению. Некоторые из указанных моделей описаны в патентах Соединенных Штатов 5733876 (Маг. 31, 1998: «МеШоб ок 1пН1Ь111пд апдюдепе818») и 5135919 (Аид. 4, 1992: «МеЛоб апб а ркаттасеибса1 сотроЩюп кот Не шЫЬбюп ок апдюдепе818»). Другие анализы включают анализ обнаженной хориоаллантоисной мембраны (САМ) Тау1ог апб Ео1ктап; №ш.1ге 297: 307 (1982) и Сгит е1 а1., 8с1епсе 230: 1375 (1985); модель антиангиогенеза на основе методики дорсального воздушного мешка у мышей Ео1ктап е1 а1.; ί. Ехр. Меб.133 : 275 (1971) и анализ микрокарманов роговицы крыс О1тЬгопе, Στ.
- 61 009783 с1 а1., 1. №111. Сапсег Σηκΐ. 52: 413 (1974), в котором индуцируют васкуляризацию роговицы у взрослых самцов крыс линии 8ргадие-Оа^1еу (Сйаг1е8 К1уег, 1арап) путем имплантации в каждую роговицу шариков из сополимера этилен-винилацетата, пропитанных 500 нг ВЕСЕ (бычий, К & Ό 8у51ет5. Шс.). Кроме того, существует модель, в которой ангиогенез индуцируют у мышей МН-8\\155 или бестимусных голых мышей (пи/пи) после имплантации клеток карциномы легкого МСЕ-7 или клеток карциномы яичников NIН-0VСΑК-3, как описано Ьтбпег апб Вогбеп; Σηΐ. 1. Сапсег 71: 456 (1997). Также можно использовать дополнительные линии опухолевых клеток, включая (но не ограничивая указанным) клетки злокачественной меланомы человека 8К-МЕЬ-1, чтобы индуцировать ангиогенез, как описано выше. Различные дозы с различной частотой дозирования и в течение разных по продолжительности периодов можно тестировать как в случае немодифицированного, так и пегилированного белков [ΕΝ-β-1Η согласно изобретению.
Другие способы тестирования пегилированного мышиного и крысиного [ΕΝ-β-1η в отношении антиангиогенного действия в модели на животных включают (но не ограничены указанным) протоколы скрининга новых потенциально противоопухолевых агентов, как описано в исходном Сапсег СВетоШегару Керойк, Рай 3, ^1. 3, № 2, 8ер!етЬег 1972 и в приложении Ш ^уо Сапсег Мобек, 1976-1982, ΝΣΗ РиЫюабоп № 84-2635, ЕеЬгиагу 1984. Из-за видовой специфичности интерферонов типа I для оценки антиангиогенной активности пегилированного ΓΕΝ-β в моделях на грызунах получают препараты пегилированного ΣΕΝ-β грызунов (например, мыши и крысы). Примером таких способов скрининга является протокол тестирования антиангиогенного действия пегилированного мышиного ΞΕΝ-β на имплантированную подкожно карциному легкого Льюиса.
Источник опухолевой линии.
Данная опухолевая линия возникла спонтанно в 1951 как карцинома легкого у мышей С57ВЬ/6. Краткое изложение способа тестирования.
Фрагмент опухоли имплантируют подкожно в подмышечную область мыши В6И2Е1. Тестируемое средство (т.е. пегилированный интерферон согласно изобретению) вводят в различных дозах подкожно (п/к) или внутрибрюшинно (в/б) в разные дни после имплантации опухоли. Измеряемым параметром является среднее время выживания. Результаты выражены в виде процента от контрольного времени выживания.
Животные.
Размножение: мыши С57ВЬ/6.
Тестирование: мыши В6И2Е1.
Масса: мыши с изменением по массе в пределах 3 г, при этом минимальная масса составляет 18 г для самцов и 17 г для самок.
Пол: и для тестируемых, и для контрольных животных в одном эксперименте использовали один пол.
Источник: по возможности один источник для всех животных в одном эксперименте.
Объем эксперимента.
Десять животных на группу тестирования.
Пересадка опухоли.
Размножение:
Фрагмент: готовят фрагмент размером 2-4 мм п/к-опухоли донора.
Время: 13-15 дни.
Место: имплантируют фрагмент п/к в аксиалярную область с помощью пункции в паховую область. Тестирование:
Фрагмент: готовят фрагмент размером 2-4 мм п/к-опухоли донора.
Время: 13-15 дни.
Место: имплантируют фрагмент п/к в аксиалярную область с помощью пункции в паховую область. Схема тестирования.
День 0: имплантируют опухоль. Размножают бактериальные культуры. Тестируют соединение позитивного контроля в каждом эксперименте с нечетным номером. Готовят материалы.
Регистрируют гибель за сутки.
День 1: проверяют культуры. Отбраковывают эксперимент в случае загрязнения. Рандомизируют животных. Обрабатывают согласно инструкции (в 1 день и последующие дни).
День 2: повторно проверяют культуры. Отбраковывают эксперимент в случае загрязнения.
День 5: день взвешивания 2 и день начальной оценки токсичности тестируемого средства.
День 14: день контроля ранней гибели.
День 48: день контроля отсутствия поглощения.
День 60: окончание и оценка эксперимента. Оценка легких в отношении опухоли.
Качественный контроль.
Регистрируют соединение позитивного контроля (И8С2 6271; цитоксан в дозе 100 мг/кг/инъекцию) в каждом эксперименте с нечетным номером, схема введения которого представляет собой внутрибрю
- 62 009783 шинное введение только в 1 день. Нижний предел тест/контроль для позитивного контроля составляет 140%. Допустимое среднее время выживания в случае контроля без обработки составляет 19-35,6 дня.
Оценка.
Измеряемым параметром является среднее время выживания. Подсчитывают средние массы тела животных в день 1 и день 5, подсчитывают отношение тест/контроль для всех тестируемых групп. Подсчитывают средние массы тела животных в день определенного этапа и день конечной оценки. Отношение тест/контроль рассчитывают для всех тестируемых групп при > 65% оставшихся в живых на 5 день. Значение отношение тест/контроль < 86% свидетельствует о токсичности. Завышенную разницу в изменении массы тела (тест минус контроль) также можно использовать для оценки токсичности.
Критерии активности.
Исходное отношение тест/контроль, большее или равное 140%, считается необходимым для доказательства умеренной активности. Воспроизводимое значение отношения тест/контроль, большее или равное 150%, рассматривается как значительная активность.
Пример 8. Модели ίη νίνο для тестирования антипролиферативного и противоопухолевого действия пегилированного !ΕΝ-β-1;·ι человека и пегилированных ΣΕΝ-β грызунов.
Имеются различные модели ίη νίνο для тестирования антипролиферативного и противоопухолевого действия немодифицированного и пегилированного [ΕΝ-β-1α человека согласно изобретению. В модели, описанной ВаБоп с1 а1., Вюсоп)ида1е С11епик1гу 12: 195 (2001), голым бестимусным мышам (Наг1ап) подкожно имплантируют 2х106 клеток почки человека А498, клеток почки человека АСНИ или клеток почки человека С402 с задней стороны и дают возможность развиваться опухолям в течение 3-6 недель. Затем вводят немодифицированный или пегилированный ШЫ-в-1а человека в разных дозах, с разной частотой дозирования и в течение периодов времени разной продолжительности и измеряют объем опухоли и проводят сравнения между обработками. В другой модели, описанной Ьтбпег апб Вогбеп, Σ. ЕиегГегоп СуЮкте Кек. 17: 681 (1997), бестимусным самкам голых мышей ВАЬВ/с (пи/пи), подвергнутым овариэктомии, имплантируют 2х106 клеток МСР-7 (плюс эстрадиол), МИА-МВ-231, МИА-МВ-468 или клеток карциномы легкого человека ВТ-20, клеток карциномы яичника человека NIН-ΟVСАК-3, клеток карциномы ободочной кишки человека НТ-29 или клеток злокачественной миеломы человека 8К-МЕЬ-1 или ΕЕМX, в дерму, покрывающую молочные железы, ближе всего к подмышечной впадине, и оценивают размер опухолей как функцию времени. Затем вводят немодифицированный или пегилированный IΕN-β1а человека в разных дозах, с разной частотой дозирования и в течение периодов времени разной продолжительности и измеряют объем опухоли и проводят сравнение между обработками. Другие модели для тестирования антипролиферативного и противоопухолевого действия пегилированного ШЫ-в-1а человека включают (но не ограничены указанным) модели локального и метастизирующего рака легкого, описанные Οίπ е1 а1., Мо1еси1аг Тйегару 4: 356 (2001), и модели ксенотрансплантатов у голых мышей метастазов злокачественной опухоли ободочной и прямой кишки из печени человека, описанные Таба е1 а1., ί С1шюа1 ^екбдаБоп 108: 83 (2001).
Другие способы тестирования пегилированного ΞΕΝ-β мыши и крысы в отношении антипролиферативного и противоопухолевого действия в моделях на животных включают (но не ограничены указанным) модель злокачественной мезотелиомы у мышей, описанную Обака е1 а1., Сапсег Кек. 61: 6201 (2001), модели локальной и метастазирующей злокачественной опухоли легкого, описанные Οίπ е1 а1., Мо1еси1аг Тйегару 4: 356 (2001), и модели метастазов злокачественной опухоли ободочной и прямой кишки в печени у сингенных мышей, описанные Таба е1 а1., ί СБшса1 ^екбдаБоп 108: 83 (2001).
Пример 9. Модели ш νί\Ό для тестирования противовирусного действия пегилированного ΖΕΝ-β мыши и пегилированного IΕN-β-1а человека.
Имеется мышиная модель ш νί\Ό для тестирования влияния немодифицированного и пегилированного мышиного ΕΕΝ-β на уровни вируса гепатита В человека (НВУ) у НВV-трансгенных мышей 8СШ. Ьагкт е1 а1., №11иге Мебюте 5: 907 (1999). В указанной модели трансгенные мыши 8СШ, несущие димер голова-к-хвосту генома НВV человека, имеют регистрируемые уровни репликативных форм НВV и прегеномной РНК в печени, и вируса НВV в сыворотке. Гепатоциты трансгенных мышей также позитивны в отношении белков НВкАд, НВсАд и НЬхАд, показателей репликации вируса. Пример протокола для сравнения немодифицированного и пегилированного мышиного IΕN-β в данной модели приведен ниже:
мышей (5 групп по 5, плюс 5 резервных) со сравнимым титром вируса титруют в двух независимых временных точках (по меньшей мере, с разницей в 1 неделю), чтобы установить титр исходного уровня и удостовериться, что их титры остаются постоянными до введения дозы мышиного IΕN-β. Группам по 5 мышей вводят дозу 3 раза в неделю (понедельник, среду и пятницу) подкожно, используя следующие образцы, которые указаны в табл. 7.
- 63 009783
Таблица 7
Группа Образец дозирования
Контрольный наполнитель (1 мг/мл мышиного сывороточного альбумина (МСА)
2 30 ед. МСА немодифицированного мышиного ΙΕΝ-β в 1 мл / мл
3 300 ед. . немодифицированного мышиного ΙΕΝ-β в 1 мл/мл
МСА
4 3000 ед. немодифицированного мышиного ΙΕΝ-β в 1 мл/мл
МСА
5 30 ед. пегилированного мышиного ΙΕΝ-β в 1 мл/мл МСА
300 ед. пегилированного мышиного ΙΕΝ-β в 1 мл/мл МСА
3000 ед. пегилированного мышиного ΙΕΝ-β в 1 мл/мл МСА
Титры вирусов определяют еженедельно во время введения доз и определяют еженедельно каждые две недели в течение 6 месяцев после введения доз. Строят графики титра вируса против времени для сравнения животных, обработанных наполнителем и ΣΡΝ-β в отношении клиренса и повторного установления титра вирусов. Затем проводят второе исследование с соответствующими дозами немодифицированного и пегилированного мышиного ΣΡΝ-β, используя 10-20 мышей на группу, всего 30-60 мышей (1020 для контроля, 10-20 для немодифицированного мышиного !ΡΝ-β и 10-20 для пегилированного мышиного !ΡΝ-β). Титры вирусов оценивают, как описано выше, и при забивании, сыворотку анализируют в отношении титра вирусов, а также в отношении НЬзАд с помощью 8Э8-ПААГ и Вестерн-блоттинга. Также извлекают печень, замораживают и фиксируют, как это требуется, и красят на наличие НЬзАд, НЬсАд и НЬхАд. На образцах сыворотки и ткани также можно проводить другие подходящие гистологические, гистохимические или биохимические тесты, знакомые специалистам в данной области.
Также имеется мышиная модель т у1уо для тестирования влияния немодифицированного и пегилированного ΉΝ-β^ человека на уровни вируса гепатита С человека (НСТ) у мышей. Несущих химерную печень человека. Мегсег е! а1., №1иге Мебюте 7: 927 (2001). В данной модели нормальные гепатоциты человека трансплантируют мышам 8СГО, несущим трансген активатора плазминогена (А1Ь-иРА) и мышам инокулируют сыворотку людей, инфицированных различными генотипами НСV. Привитые клетки печени человека становятся инфицированными вирусом, и вирус реплицируется. С помощью ПЦР могут быть количественно оценены уровни РНК НСV в сыворотке, а также уровни положительной и отрицательной (репликативной формы) РНК в клетках печени. Осуществляют соответствующий протокол исследования, подобный (но не ограничивающий) протоколу, описанному выше для немодифицированного и пегилированного мышиного !ΡΝ-β у трансгенных по НВV мышей 8СГО, чтобы оценить эффективность немодифицированного и пегилированного ΉΝ-β^ человека в данной модели, т.е. чтобы определить влияние обработки на титр НСV, гистологию печени, уровни АЬТ в сыворотке и наличие репликативных форм 11СУ в трансплантированной ткани печени человека. На образцах сыворотки и ткани также можно поводить другие подходящие гистологические, гистохимические или биохимические тесты, знакомые специалистам в данной области.

Claims (131)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Активированный полимер полиалкиленгликоля, имеющий структуру согласно формуле X Ζ*
    I (СНгк- -С- -(СНг)п---К р—хгде Р означает полимер полиалкиленгликоля;
    X означает О, 8, СО, СО2, СО8, 8О, 8О2, СОНК', 8О2ЫК' или ΝΕ';
    К' означает водород, насыщенную или ненасыщенную С1-С20 алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью, С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил, замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил является СГС20 насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксила, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтиогруппы;
    - 64 009783
    Ζ и Ζ' в отдельности означают водород, насыщенную или ненасыщенную С1-С20 алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью, С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил, замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил является С1-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксила, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтиогруппы, при условии, что по меньшей мере один Ζ или Ζ' не является водородом;
    К выбран из группы, состоящей из карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида, ацеталя, гидроксильной группы, защищенной гидроксильной группы, карбоната, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, замещенного или незамещенного тиола, галогена, замещенного или незамещенного амина, защищенного амина, гидразида, защищенного гидразида, сукцинимидила, изоцианата, изотиоцианата, дитиопиридина, винилпиридина, йодацетамида, эпоксида, гидроксисукцинимидила, азола, малеимида, сульфона, аллила, винилсульфона, трезила, сульфо-М-сукцинимидила, диона, мезила, тозила и глиоксаля, каждый η независимо равен 0 или является целым числом от 1 до 5 и р равно 1, 2 или 3.
  2. 2. Активированный полимер полиалкиленгликоля по п.1, где К означает остаток карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида или ацеталя.
  3. 3. Активированный полимер полиалкиленгликоля по п.1, где Р является полиэтиленгликолем, имеющим структуру формулы II
    Е- (О-СН2СН2)а-, где Е означает водород, СГС20 алкильную группу с прямой или разветвленной цепью или регистрируемую метку и а является целым числом от 4 до 10000.
  4. 4. Активированный полимер полиалкиленгликоля по п.3, где Е является метилом.
  5. 5. Активированный полимер полиалкиленгликоля по п.1, где Р означает полиэтиленгликоль, имеющий структуру формулы II
    Е-(О~СН2СН2) а-, где Е является остатком, подходящим для образования связи между соединением формулы X и биологически активным соединением или его предшественником, и а является целым числом от 4 до 10000.
  6. 6. Активированный полимер полиалкиленгликоля по п.5, где Е выбран из группы, состоящей из карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида, ацеталя, гидроксильной группы, защищенной гидроксильной группы, карбоната, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, замещенного или незамещенного тиола, галогена, замещенного или незамещенного амина, защищенного амина, гидразида, защищенного гидразида, сукцинимидила, изоцианата, изотиоцианата, дитиопиридина, винилпиридина, йодацетамида, эпоксида, гидроксисукцинимидила, азола, малеимида, сульфона, аллила, винилсульфона, трезила, сульфо-И-сукцинимидила, диона, мезила, тозила и глиоксаля.
  7. 7. Активированный полимер полиалкиленгликоля по п.5, где Е имеет структуру согласно формуле III
    К---НС—(СН^---(У)т ς> Х—СК2СП2-Ζ >
    где X и Υ независимо означают О, 8, СО, СО2, СО8, 8О, 8О2, СОКК', 8О2НК или №';
    9 означает С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил, замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил означает С1-С20 насыщенный или ненасыщенный алкил, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксила, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтиогруппы;
    К' и каждый Ζ независимо имеют значения, которые определены выше;
    т равно 0 или 1;
    каждый А независимо означает водород или С1-С7 алкил;
    каждый η независимо равен 0 или является целым числом от 1 до 5 и
    К'' является остатком, подходящим для образования связи между соединением формулы III и биологически активным соединением или его предшественником.
    - 65 009783
    Ιν
  8. 8. Активированный полимер полиалкиленгликоля по п.5, где Е имеет структуру согласно формуле
    К”---нс где каждый X, Ζ и п независимо имеют значения, которые определены;
    каждый А независимо означает водород или С1-С7 алкил и
    К''' является остатком, подходящим для образования связи между соединением формулы Ιν и биологически активным соединением или его предшественником.
  9. 9. Активированный полимер полиалкиленгликоля по п.7, где К'' выбран из группы, состоящей из карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида, ацеталя, гидроксильной группы, защищенной гидроксильной группы, карбоната, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, замещенного или незамещенного тиола, галогена, замещенного или незамещенного амина, защищенного амина, гидразида, защищенного гидразида, сукцинимидила, изоцианата, изотиоцианата, дитиопиридина, винилпиридина, йодацетамида, эпоксида, гидроксисукцинимидила, азола, малеимида, сульфона, аллила, винилсульфона, трезила, сульфо-^сукцинимидила, диона, мезила, тозила и глиоксаля.
  10. 10. Активированный полимер полиалкиленгликоля по п.8, где К''' выбран из группы, состоящей из карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида, ацеталя, гидроксильной группы, защищенной гидроксильной группы, карбоната, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, замещенного или незамещенного тиола, галогена, замещенного или незамещенного амина, защищенного амина, гидразида, защищенного гидразида, сукцинимидила, изоцианата, изотиоцианата, дитиопиридина, винилпиридина, йодацетамида, эпоксида, гидроксисукцинимидила, азола, малеимида, сульфона, аллила, винилсульфона, трезила, сульфо-^сукцинимидила, диона, мезила, тозила и глиоксаля.
  11. 11. Активированный полимер полиалкиленгликоля по п.3, где Е является регистрируемой меткой.
  12. 12. Активированный полимер полиалкиленгликоля по п.10, где Е выбран из группы, состоящей из радиоактивных изотопов, флуоресцентных остатков, фосфоресцентных остатков, хемилюминесцентных остатков и квантовых меток.
  13. 13. Активированный полимер полиалкиленгликоля, имеющий структуру согласно формуле Xа
    Р---X---(СНа).---СН—К где Р означает полимер полиалкиленгликоля;
    X означает О, 8, СО, СО2, СО8, 8О, 8О2, СОЫК', 8О2\К или МК';
    К' означает водород, насыщенную или ненасыщенную С|-С20 алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью, С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил, замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил является С1-С2,) насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксила, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтиогруппы;
    Ζ означает насыщенную или ненасыщенную С1-С2,) алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью, С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил, замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил является С1-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксила, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтиогруппы;
    К выбран из группы, состоящей из карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида, ацеталя, гидроксильной группы, защищенной гидроксильной группы, карбоната, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, замещенного или незамещенного тиола, галогена, замещенного или незамещенного амина, защищенного амина, гидразида, защищенного гидразида, сукцинимидила, изоцианата, изотиоцианата, дитиопиридина, винилпиридина, йодацетамида, эпоксида, гидроксисукцинимидила, азола, малеимида, сульфона, аллила, винилсульфона, трезила, сулы|)о-\-сукцинимидила, диона, мезила, тозила и глиоксаля; и п равно 0 или является целым числом от 1 до 5.
    - 66 009783
  14. 14. Активированный полимер полиалкиленгликоля по п.13, где К означает остаток карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида или ацеталя.
  15. 15. Активированный полимер полиалкиленгликоля по п.13, где Р означает полиэтиленгликоль, имеющий структуру формулы II
    Е- (О-СН2СН2) а-, где Е означает водород, СГС20 алкильную группу с прямой или разветвленной цепью или регистрируемую метку и а является целым числом от 4 до 10000.
  16. 16. Активированный полимер полиалкиленгликоля по п.15, где Е является метилом.
  17. 17. Активированный полимер полиалкиленгликоля по п.13, где Р является полиэтиленгликолем, имеющим структуру формулы II
    Е- (О-СН2СН2)а-, где Е является остатком, подходящим для образования связи между соединением формулы X и биологически активным соединением или его предшественником, и а является целым числом от 4 до 10000.
  18. 18. Активированный полимер полиалкиленгликоля по п.17, где Е выбран из группы, состоящей из карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида, ацеталя, гидроксильной группы, защищенной гидроксильной группы, карбоната, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, замещенного или незамещенного тиола, галогена, замещенного или незамещенного амина, защищенного амина, гидразида, защищенного гидразида, сукцинимидила, изоцианата, изотиоцианата, дитиопиридина, винилпиридина, йодацетамида, эпоксида, гидроксисукцинимидила, азола, малеимида, сульфона, аллила, винилсульфона, трезила, сульфо-№-сукцинимидила, диона, мезила, тозила и глиоксаля.
  19. 19. Активированный полимер полиалкиленгликоля по п.17, где Е имеет структуру согласно формуле III
    К--НС—(СН^--00т—р—X—С\У2С\¥2—
    Ζ г где X и Υ независимо означают О, 8, СО, СО2, С08, 80, 8О2, СОНК', 8О;\« или НК';
    О означает С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил, замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил является С1-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксила, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтиогруппы;
    К' и каждый Ζ независимо имеют значения, описанные выше;
    т равно 0 или 1;
    каждый независимо является водородом или С1-С7 алкилом;
    каждый п независимо равен 0 или является целым числом от 1 до 5 и
    К'' является остатком, подходящим для образования связи между соединением формулы III и биологически активным соединением или его предшественником.
  20. 20. Активированный полимер полиалкиленгликоля по п.17, где Е имеет структуру согласно формуле IV
    К---НС--(СН^--X---СУУ2С\¥2--Ζ , где каждый X, Ζ и η независимо имеют значения, определенные выше;
    каждый независимо является водородом или С1-С7 алкилом и
    К''' является остатком, подходящим для образования связи между соединением формулы IV и биологически активным соединением или его предшественником.
  21. 21. Активированный полимер полиалкиленгликоля по п.19, где К'' выбран из группы, состоящей из карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида, ацеталя, гидроксильной группы, защищенной гидроксильной группы, карбоната, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, замещенного или незамещенного тиола, галогена, замещенного или незамещенного амина, защищенного амина, гидразида, защищенного гидразида, сукцинимидила, изоцианата, изотиоцианата, дитиопиридина, винилпиридина, йодацетамида, эпоксида, гидроксисукцинимидила, азола, малеимида, сульфона, аллила, винилсульфона, трезила, сульфо^-сукцинимидила, диона, мезила, тозила и глиоксаля.
  22. 22. Активированный полимер полиалкиленгликоля по п.20, где К''' выбран из группы, состоящей из карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида, ацеталя, гидроксильной группы, защищенной гидроксильной группы, карбоната, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, замещен
    - 67 009783 ного или незамещенного тиола, галогена, замещенного или незамещенного амина, защищенного амина, гидразида, защищенного гидразида, сукцинимидила, изоцианата, изотиоцианата, дитиопиридина, винилпиридина, йодацетамида, эпоксида, гидроксисукцинимидила, азола, малеимида, сульфона, аллила, винилсульфона, трезила, сульфо-№сукцинимидила, диона, мезила, тозила и глиоксаля.
  23. 23. Активированный полимер полиалкиленгликоля по п.15, где Е является регистрируемой меткой.
  24. 24. Активированный полимер полиалкиленгликоля по п.22, где Е выбран из группы, состоящей из радиоактивных изотопов, флуоресцентных остатков, фосфоресцентных остатков, хемилюминесцентных остатков и квантовых меток.
  25. 25. Активированный полимер полиалкиленгликоля по п.13, имеющий структуру согласно формуле XI где Р означает полимер полиалкиленгликоля и η и Ζ имеют значения, которые определены.
  26. 26. Активированный полиалкиленгликоль по п.15, имеющий структуру согласно формуле XII где η, а и Ζ имеют значения, которые определены.
  27. 27. Активированный полимер полиалкиленгликоля по п.26, где Ζ является метилом.
  28. 28. Активированный полимер полиалкиленгликоля по п.26, где η равно единице.
  29. 29. Активированный полимер полиалкиленгликоля, имеющий структуру согласно формуле XШ где а является целым числом от 4 до 10000.
  30. 30. Композиция, содержащая активированный полимер полиалкиленгликоля по п.1 и биологически активное соединение или его предшественник.
  31. 31. Композиция по п.30, где биологически активное соединение или его предшественник выбраны из группы, состоящей из пептида, аналога пептида, белка, фермента, малой молекулы, красителя, липида, нуклеозида, олигонуклеотида, аналога олигонуклеотида, сахара, олигосахарида, клетки, вируса, липосо мы, микрочастицы, поверхности и мицеллы.
  32. 32. Полимерный конъюгат, имеющий структуру согласно формуле XXII где Р означает полимер полиалкиленгликоля;
    X означает О, 8, СО, СО2, СО8, 8О, 8О2, СОт', 8Ода' или ΝΕ.';
    К' означает водород, насыщенную или ненасыщенную С^С20 алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью, С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил, замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил является С1-С2о насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксила, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтиогруппы;
    каждый Ζ и Ζ' независимо означает водород, насыщенную или ненасыщенную С1-С20 алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью, С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил, замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил является С1-С20 насыщен
    - 68 009783 ным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксила, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтиогруппы, при условии, что по меньшей мере один Ζ или Ζ' не является водородом;
    К* образован в результате взаимодействия В с остатком, выбранным из группы, состоящей из карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида, ацеталя, гидроксильной группы, защищенной гидроксильной группы, карбоната, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, замещенного или незамещенного тиола, галогена, замещенного или незамещенного амина, защищенного амина, гидразида, защищенного гидразида, сукцинимидила, изоцианата, изотиоцианата, дитиопиридина, винилпиридина, йодацетамида, эпоксида, гидроксисукцинимидила, азола, малеимида, сульфона, аллила, винилсульфона, трезила, сульфо-К-сукцинимидила, диона, мезила, тозила и глиоксаля;
    В является интерфероном-бета;
    каждый п равен 0 или является целым числом от 1 до 5 и р равно 1, 2 или 3.
  33. 33. Полимерный конъюгат по п.32, где К* означает остаток карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида или ацеталя.
  34. 34. Полимерный конъюгат по п.32, где Р является полиэтиленгликолем, имеющим структуру формулы ΙΙ
    Е- (О~СН2СН2) а-, где Е означает водород, СГС20 алкильную группу с прямой или разветвленной цепью или регистрируемую метку и а является целым числом от 4 до 10000.
  35. 35. Полимерный конъюгат по п.34, где Е является метилом.
  36. 36. Полимерный конъюгат по п.32, где Р является полиэтиленгликолем, имеющим структуру формулы ΙΙ
    Е- (О-СН2СН2)а-, где Е является остатком, подходящим для образования связи между соединением формулы ΙΙ и биологически активным соединением или его предшественником, и а является целым числом от 4 до 10000.
  37. 37. Полимерный конъюгат по п.36, где Е связывается с биологически активным соединением или его предшественником, отличным от В.
  38. 38. Полимерный конъюгат по п.36, где Е образует дополнительную связь с биологически активным соединением В.
  39. 39. Полимерный конъюгат по п.36, где Е выбран из группы, состоящей из карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида, ацеталя, гидроксильной группы, защищенной гидроксильной группы, карбоната, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, замещенного или незамещенного тиола, галогена, замещенного или незамещенного амина, защищенного амина, гидразида, защищенного гидразида, сукцинимидила, изоцианата, изотиоцианата, дитиопиридина, винилпиридина, йодацетамида, эпоксида, гидроксисукцинимидила, азола, малеимида, сульфона, аллила, винилсульфона, трезила, сульфо-Х-сукцинимидила, диона, мезила, тозила и глиоксаля.
  40. 40. Полимерный конъюгат по п.36, где Е имеет структуру согласно формуле ΙΙΙ к--нс—(сн^--(¥)го—ς—х— с^2с^2— ζ
    где каждый X и Υ независимо означает О, δ, СО, СО2, СОБ, БО, БО2, СОХК', δΘ2ΝΚ' или ΝΚ';
    С) означает С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил, замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил означает С1-С20 насыщенный или ненасыщенный алкил, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксила, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтиогруппы;
    К' и каждый Ζ независимо имеют значения, которые определены выше;
    т равно 0 или 1;
    каждый п независимо равен 0 или является целым числом от 1 до 5;
    К'' является остатком, подходящим для образования связи между соединением формулы ΙΙΙ и биологически активным соединением или его предшественником; и
    - 69 009783 каждый независимо означает водород или С1-С7 алкил.
  41. 41. Полимерный конъюгат по п.36, где Е имеет структуру согласно формуле IV
    К”---НС—(СН^--X--СА¥2СА¥2--Ζ , где каждый X, Ζ и η независимо имеют значения, которые определены;
    каждый независимо означает водород или С1-С7 алкил и
    К''' является остатком, подходящим для образования связи между соединением формулы IV и биологически активным соединением или его предшественником.
  42. 42. Полимерный конъюгат по п.40, где К' выбран из группы, состоящей из карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида, ацеталя, гидроксильной группы, защищенной гидроксильной группы, карбоната, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, замещенного или незамещенного тиола, галогена, замещенного или незамещенного амина, защищенного амина, гидразида, защищенного гидразида, сукцинимидила, изоцианата, изотиоцианата, дитиопиридина, винилпиридина, йодацетамида, эпоксида, гидроксисукцинимидила, азола, малеимида, сульфона, аллила, винилсульфона, трезила, сульфо-№сукцинимидила, диона, мезила, тозила и глиоксаля.
  43. 43. Полимерный конъюгат по п.41, где К''' выбран из группы, состоящей из карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида, ацеталя, гидроксильной группы, защищенной гидроксильной группы, карбоната, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, замещенного или незамещенного тиола, галогена, замещенного или незамещенного амина, защищенного амина, гидразида, защищенного гидразида, сукцинимидила, изоцианата, изотиоцианата, дитиопиридина, винилпиридина, йодацетамида, эпоксида, гидроксисукцинимидила, азола, малеимида, сульфона, аллила, винилсульфона, трезила, сульфо-№сукцинимидила, диона, мезила, тозила и глиоксаля.
  44. 44. Полимерный конъюгат по п.34, где Е является регистрируемой меткой.
  45. 45. Полимерный конъюгат по п.44, где Е выбран из группы, состоящей из радиоактивных изотопов, флуоресцентных остатков, фосфоресцентных остатков, хемилюминесцентных остатков и квантовых меток.
  46. 46. Полимерный конъюгат по п.32, где К* является метиленом и В является биологически активной молекулой, связанной посредством амина.
  47. 47. Полимерный конъюгат по п.46, где амин является аминоконцом пептида.
  48. 48. Полимерный конъюгат по п.47, где пептид является интерфероном.
  49. 49. Полимерный конъюгат по п.48, где пептид является интерфероном-бета.
  50. 50. Полимерный конъюгат по п.49, где интерферон-бета является интерфероном-бета-1а.
  51. 51. Полимерный конъюгат, имеющий структуру согласно формуле XXIIа р--х--(СНД, СН—К*--В где Р означает полимер полиалкиленгликоля;
    X означает О, 8, СО, СО2, СО8, 8О, 8О2, СОт', 8О2^' или ΝΚ;
    К' означает водород, насыщенную или ненасыщенную С1-С20 алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью, С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил, замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил является С1-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксила, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтиогруппы;
    Ζ означает насыщенную или ненасыщенную С1-С20 алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью, С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил, замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил является С1-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксила, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтиогруппы;
    К* образован в результате взаимодействия остатка, выбранного из группы, состоящей из карбоно
    - 70 009783 вой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида, ацеталя, гидроксильной группы, защищенной гидроксильной группы, карбоната, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, замещенного или незамещенного тиола, галогена, замещенного или незамещенного амина, защищенного амина, гидразида, защищенного гидразида, сукцинимидила, изоцианата, изотиоцианата, дитиопиридина, винилпиридина, йодацетамида, эпоксида, гидроксисукцинимидила, азола, малеимида, сульфона, аллила, винилсульфона, трезила, сульфо-№сукцинимидила, диона, мезила, тозила и глиоксаля, с биологически активным соединением или его предшественником;
    В означает биологически активную молекулу и η равно 0 или является целым числом от 1 до 5.
  52. 52. Полимерный конъюгат по п.51, где К* означает остаток карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида или ацеталя.
  53. 53. Полимерный конъюгат по п.51, где Р является полиэтиленгликолем, имеющим структуру формулы II
    Е- (О-СН2СН2) а-, где Е означает водород, С1-С20 алкильную группу с прямой или разветвленной цепью или регистрируемую метку и а является целым числом от 4 до 10000.
  54. 54. Полимерный конъюгат по п.53, где Е является метилом.
  55. 55. Полимерный конъюгат по п.51, где Р является полиэтиленгликолем, имеющим структуру формулы II
    Е- (О-СН2СН2) а-, где Е является остатком, подходящим для образования связи между соединением формулы II и биологически активным соединением или его предшественником, и а является целым числом от 4 до 10000.
  56. 56. Полимерный конъюгат по п.55, где Е образует связь с биологически активным соединением или его предшественником, отличным от В.
  57. 57. Полимерный конъюгат по п.55, где Е образует дополнительную связь с биологически активным соединением В.
  58. 58. Полимерный конъюгат по п.55, где Е выбран из группы, состоящей из карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида, ацеталя, гидроксильной группы, защищенной гидроксильной группы, карбоната, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, замещенного или незамещенного тиола, галогена, замещенного или незамещенного амина, защищенного амина, гидразида, защищенного гидразида, сукцинимидила, изоцианата, изотиоцианата, дитиопиридина, винилпиридина, йодацетамида, эпоксида, гидроксисукцинимидила, азола, малеимида, сульфона, аллила, винилсульфона, трезила, сульфо-№сукцинимидила, диона, мезила, тозила и глиоксаля.
  59. 59. Полимерный конъюгат по п.55, где Е имеет структуру согласно формуле III
    К---нс—(СН^---(¥)т <5 х—С^2С\У2
    Ζ г где каждый X и Υ независимо означает О, З, СО, СО2, СОЗ, ЗО, ЗО2, СОNК', 3Ο2ΝΚ' или ΝΚ';
    С означает С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил, замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил означает С1-С20 насыщенный или ненасыщенный алкил, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксила, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтиогруппы;
    К' и каждый Ζ независимо имеют значения, которые определены выше;
    т равно 0 или 1;
    каждый п независимо равен 0 или является целым числом от 1 до 5;
    К'' является остатком, подходящим для образования связи между соединением формулы III и биологически активным соединением или его предшественником; и каждый независимо означает водород или С1-С7 алкил.
  60. 60. Полимерный конъюгат по п.55, где Е имеет структуру согласно формуле IV
    К’---нс (СН2)^—х—слу2слу2--Ζ , где каждый X, Ζ и η независимо имеют значения, которые определены;
    каждый независимо означает водород или С1-С7 алкил и
    К''' является остатком, подходящим для образования связи между соединением формулы IV и био
    - 71 009783 логически активным соединением или его предшественником.
  61. 61. Полимерный конъюгат по п.59, где Я'' выбран из группы, состоящей из карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида, ацеталя, гидроксильной группы, защищенной гидроксильной группы, карбоната, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, замещенного или незамещенного тиола, галогена, замещенного или незамещенного амина, защищенного амина, гидразида, защищенного гидразида, сукцинимидила, изоцианата, изотиоцианата, дитиопиридина, винилпиридина, йодацетамида, эпоксида, гидроксисукцинимидила, азола, малеимида, сульфона, аллила, винилсульфона, трезила, сульфо-Х-сукцинимидила, диона, мезила, тозила и глиоксаля.
  62. 62. Полимерный конъюгат по п.60, где Я''' выбран из группы, состоящей из карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида, ацеталя, гидроксильной группы, защищенной гидроксильной группы, карбоната, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, замещенного или незамещенного тиола, галогена, замещенного или незамещенного амина, защищенного амина, гидразида, защищенного гидразида, сукцинимидила, изоцианата, изотиоцианата, дитиопиридина, винилпиридина, йодацетамида, эпоксида, гидроксисукцинимидила, азола, малеимида, сульфона, аллила, винилсульфона, трезила, сульфо-Х-сукцинимидила, диона, мезила, тозила и глиоксаля.
  63. 63. Полимерный конъюгат по п.53, где Е является регистрируемой меткой.
  64. 64. Полимерный конъюгат по п.63, где Е выбран из группы, состоящей из радиоактивных изотопов, флуоресцентных остатков, фосфоресцентных остатков, хемилюминесцентных остатков и квантовых меток.
  65. 65. Полимерный конъюгат по п.51, где Я* является метиленом и В является биологически активной молекулой, связанной посредством амина.
  66. 66. Полимерный конъюгат по п.65, где амин является аминоконцом пептида.
  67. 67. Полимерный конъюгат по п.66, где пептид является интерфероном.
  68. 68. Полимерный конъюгат по п.67, где пептид является интерфероном-бета.
  69. 69. Полимерный конъюгат по п.68, где интерферон-бета является интерфероном-бета-1а.
  70. 70. Полимерный конъюгат по п.51, имеющий структуру согласно формуле XXШ где п, а, Я*, В и Ζ имеют значения, которые определены выше.
  71. 71. Полимерный конъюгат по п.70, где Ζ является метилом и η равно единице.
  72. 72. Полимерный конъюгат по п.71, где Я* является метиленом и В является биологически активной молекулой, связанной посредством амина.
  73. 73. Полимерный конъюгат по п.72, где амин является аминоконцом интерферона-бета-1а.
  74. 74. Полимерный конъюгат согласно формуле XXIV в·—к—ср—(сНгХ,—(Υλη—о—χ— αν2αν2—(О-СН2СН2)—X— (сн2)' ζ где каждый X и Υ независимо означает О, 8, СО, СО2, СО8, 8О, 8О2, СОХЯ', 8О2ХК' или ΝΚ';
    каждый Я' и Ζ независимо означает водород, насыщенную или ненасыщенную С1-С20 алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью;
    С) означает С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил, замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил означает С1-С20 насыщенный или ненасыщенный алкил, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксила, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтиогруппы;
    каждый независимо означает водород или С1-С7 алкил;
    Я* и Я** независимо являются связывающими остатками;
    В и В' независимо являются биологически активными молекулами;
    т равно 0 или 1;
    а является целым числом от 4 до 10000;
    каждый п независимо равен 0 или является целым числом от 1 до 5.
  75. 75. Полимерный конъюгат по п.74, где В и В' представляют собой одну и ту же биологически активную молекулу.
  76. 76. Полимерный конъюгат по п.74, где В и В' являются разными биологически активными молеку- 72 009783 лами.
  77. 77. Полимерный конъюгат согласно формуле XXV
    В*—(СН2)5—х—С\У2С^2----(О-СНгСНД—X—(СН2).
    где X означает О, 8, СО, СО2, СО8, 8О, 8О2, СОЖ', 8О2КК' или ЫК';
    каждый Ζ независимо означает водород, насыщенную или ненасыщенную СГС20 алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью;
    каждый Ш независимо является водородом или С1-С7 алкилом;
    К* и К** независимо являются связывающими остатками;
    В и В' независимо являются биологически активной молекулой;
    а является целым числом от 4 до 10000 и каждый η независимо равен 0 или является целым числом от 1 до 5.
  78. 78. Полимерный конъюгат по п.77, где В и В' представляют собой одну и ту же биологически активную молекулу.
  79. 79. Полимерный конъюгат по п.77, где В и В' являются разными биологически активными молеку лами.
  80. 80. Фармацевтическая композиция, содержащая композицию по п.30 и фармацевтически приемлемый носитель.
  81. 81. Фармацевтическая композиция, содержащая полимерный конъюгат по п.32 и фармацевтически приемлемый носитель.
  82. 82. Фармацевтическая композиция, содержащая полимерный конъюгат по п.70 и фармацевтически приемлемый носитель.
  83. 83. Фармацевтическая композиция, содержащая полимерный конъюгат по п.74 и фармацевтически приемлемый носитель.
  84. 84. Фармацевтическая композиция, содержащая полимерный конъюгат по п.77 и фармацевтически приемлемый носитель.
  85. 85. Фармацевтическая композиция по любому из пп.80-84, дополнительно содержащая биологически активное средство.
  86. 86. Фармацевтическая композиция по п.83, где биологически активное средство выбрано из группы, состоящей из пептида, аналога пептида, белка, фермента, малой молекулы, красителя, липида, нуклеозида, олигонуклеотида, аналога олигонуклеотида, сахара, олигосахарида, клетки, вируса, липосомы, микрочастицы, поверхности и мицеллы.
  87. 87. Фармацевтическая композиция по п.86, где биологически активным средством является противовирусное средство.
  88. 88. Композиция, содержащая продукт взаимодействия соединения по п.1 и биологически активного соединения или его предшественника.
  89. 89. Композиция по п.88, имеющая структуру согласно формуле XXII
    Р—X--(СНА--СН—к*—в где все переменные имеют значения, определенные выше, и где К* является связывающим остатком, образованным в результате взаимодействия К с химически активным остатком на биологически активном соединении или его предшественнике; и
    В является биологически активным соединением или его предшественником.
  90. 90. Композиция по п.88, имеющая структуру согласно формуле XXIV
    В1—К~~ ^-(СНг)»—СО;—О—Х-О¥2С\У2— (О-СН2СН2)~X— (СНД^ Ζ где все переменные имеют значения, определенные выше, и где каждый Ш независимо означает водород или С1-С7 алкил;
    К* является связывающим остатком, образованным в результате взаимодействия К с химически активным остатком на биологически активном соединении В или его предшественнике;
    К** является связывающим остатком, образованным в результате взаимодействия К'' с химически активным остатком на биологически активном соединении В' или его предшественнике; и
    В и В' независимо являются биологически активным соединением или его предшественником.
  91. 91. Композиция по п.88, имеющая структуру согласно формуле XXV
    - 73 009783 где все переменные имеют значения, определенные выше, и где каждый Ш независимо означает водород или С1-С7 алкил;
    К* является связывающим остатком, образованным в результате взаимодействия К с химически активным остатком на биологически активном соединении В или его предшественнике;
    К** является связывающим остатком, образованным в результате взаимодействия К''' с химически активным остатком на биологически активном соединении В' или его предшественнике; и
    В и В' независимо являются биологически активным соединением или его предшественником.
  92. 92. Способ лечения пациента с поддающейся лечению вирусной инфекцией, включающий введение пациенту эффективного количества композиции, имеющей структуру согласно формуле XXII где Р означает полимер полиалкиленгликоля;
    X означает О, 8, СО, СО2, СО8, 8О, 8О2, СОт', 8О:\К или ΝΕ';
    К' означает водород, насыщенную или ненасыщенную С1-С20 алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью, С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил, замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил является С1-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксила, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтиогруппы;
    каждый Ζ и Ζ' независимо означает водород, насыщенную или ненасыщенную С1-С20 алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью, С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил, замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил является С1-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксила, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтиогруппы, при условии, что по меньшей мере один Ζ или Ζ' не является водородом;
    К* образован в результате взаимодействия остатка, выбранного из группы, состоящей из карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида, ацеталя, гидроксильной группы, защищенной гидроксильной группы, карбоната, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, замещенного или незамещенного тиола, галогена, замещенного или незамещенного амина, защищенного амина, гидразида, защищенного гидразида, сукцинимидила, изоцианата, изотиоцианата, дитиопиридина, винилпиридина, йодацетамида, эпоксида, гидроксисукцинимидила, азола, малеимида, сульфона, аллила, винилсульфона, трезила, сульфо-N-сукцинимидила, диона, мезила, тозила и глиоксаля, с биологически активным соединением или его предшественником.
    В означает интерферон;
    каждый п равен 0 или является целым числом от 1 до 5 и р равно 1, 2 или 3.
  93. 93. Способ по п.92, где композиция дополнительно содержит биологически активное средство, выбранное из группы, состоящей из противовирусной малой молекулы, противовирусной нуклеиновой кислоты и пептидного противовирусного средства.
  94. 94. Способ по п.93, где противовирусное средство выбрано из группы, состоящей из рибавирина, левовирина, 3ТС, РТС, МВ686, зидовудина, ацикловира, ганцикловира, вирамида, VX-497, VX-950 и ^8-14803.
  95. 95. Способ по п.92, где вирусной инфекцией является хронический гепатит С.
  96. 96. Способ лечения пациента с поддающейся лечению вирусной инфекцией, включающий введение
    - 74 009783 пациенту эффективного количества композиции, имеющей структуру согласно формуле XXIIа где Р означает полимер полиалкиленгликоля;
    X означает О, 8, СО, СО2, СО8, 8О, 8О2, СОМК', 8О-\К' или ΝΕ';
    К' означает водород, насыщенную или ненасыщенную С1-С20 алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью, С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил, замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил является С1-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксила, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтиогруппы;
    Ζ означает насыщенную или ненасыщенную С1-С20 алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью, С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил, замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил является С1-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксила, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтиогруппы;
    К* образован в результате взаимодействия остатка, выбранного из группы, состоящей из карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида, ацеталя, гидроксильной группы, защищенной гидроксильной группы, карбоната, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, замещенного или незамещенного тиола, галогена, замещенного или незамещенного амина, защищенного амина, гидразида, защищенного гидразида, сукцинимидила, изоцианата, изотиоцианата, дитиопиридина, винилпиридина, йодацетамида, эпоксида, гидроксисукцинимидила, азола, малеимида, сульфона, аллила, винилсульфона, трезила, сульфо^-сукцинимидила, диона, мезила, тозила и глиоксаля, с биологически активным соединением или его предшественником,
    В означает интерферон, и п равно 0 или является целым числом от 1 до 5.
  97. 97. Способ по п.96, где композиция дополнительно содержит биологически активное средство, выбранное из группы, состоящей из противовирусной малой молекулы, противовирусной нуклеиновой кислоты и пептидного противовирусного средства.
  98. 98. Способ по п.97, где противовирусное средство выбрано из группы, состоящей из рибавирина, левовирина, 3ТС, Ε^, МВ686, зидовудина, ацикловира, ганцикловира, вирамида, VX-497, VX-950 и Т8Т8-14803.
  99. 99. Способ по п.96, где вирусной инфекцией является хронический гепатит С.
  100. 100. Способ лечения пациента с поддающейся лечению вирусной инфекцией, включающий введение пациенту эффективного количества композиции, имеющей структуру согласно формуле XXIV в·—п—ср-(СНа),,—(У)т— о—X— са2са2— (О-сн2сн2),—X—(СНА
    Ζ где каждый X и Υ независимо означает О, 8, СО, СО2, СО8, 8О, 8О2, СОНК.', 8О2КК' или Ν£';
    каждый К' и Ζ независимо означает водород, насыщенную или ненасыщенную С1-С20 алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью;
    каждый независимо означает водород или СГС7 алкил;
    С) означает С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил, замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил означает С1-С20 насыщенный или ненасыщенный алкил, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксила, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, циа
    - 75 009783 ногруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтиогруппы;
    К* образован в результате взаимодействия остатка, выбранного из группы, состоящей из карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида, ацеталя, гидроксильной группы, защищенной гидроксильной группы, карбоната, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, замещенного или незамещенного тиола, галогена, замещенного или незамещенного амина, защищенного амина, гидразида, защищенного гидразида, сукцинимидила, изоцианата, изотиоцианата, дитиопиридина, винилпиридина, йодацетамида, эпоксида, гидроксисукцинимидила, азола, малеимида, сульфона, аллила, винилсульфона, трезила, сульфо-N-сукцинимидила, диона, мезила, тозила и глиоксаля, с биологически активным соединением или его предшественником,
    К* * независимо является связывающим остатком,
    В является интерфероном и В' - биологически активной молекулой;
    т равно 0 или 1;
    а является целым числом от 4 до 10000 и каждый η независимо равен 0 или является целым числом от 1 до 5.
  101. 101. Способ по п.100, где композиция дополнительно содержит биологически активное средство, выбранное из группы, состоящей из противовирусной малой молекулы, противовирусной нуклеиновой кислоты и пептидного противовирусного средства.
  102. 102. Способ по п.101, где противовирусное средство выбрано из группы, состоящей из рибавирина, левовирина, 3ТС, РТС, МВ686, зидовудина, ацикловира, ганцикловира, вирамида, VX-497, VX-950 и Х8Х8-14803.
  103. 103. Способ по п.100, где вирусной инфекцией является хронический гепатит С.
  104. 104. Способ лечения пациента с поддающейся лечению вирусной инфекций, включающий введение пациенту эффективного количества композиции, имеющей структуру согласно формуле XXV где X означает О, 8, СО, СО2, СО8, 8О, 8О2, СОНК', 8ОЛК' или ЦК';
    каждый Ζ независимо означает водород, насыщенную или ненасыщенную С1-С20 алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью;
    К* образован в результате взаимодействия остатка, выбранного из группы, состоящей из карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида, ацеталя, гидроксильной группы, защищенной гидроксильной группы, карбоната, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, замещенного или незамещенного тиола, галогена, замещенного или незамещенного амина, защищенного амина, гидразида, защищенного гидразида, сукцинимидила, изоцианата, изотиоцианата, дитиопиридина, винилпиридина, йодацетамида, эпоксида, гидроксисукцинимидила, азола, малеимида, сульфона, аллила, винилсульфона, трезила, сульфо-N-сукцинимидила, диона, мезила, тозила и глиоксаля, с биологически активным соединением или его предшественником,
    К** независимо является связывающим остатком;
    В является интерфероном и В' является биологически активной молекулой;
    каждый А независимо является водородом или С1-С7 алкилом;
    а является целым числом от 4 до 10000 и каждый η независимо равен 0 или является целым числом от 1 до 5.
  105. 105. Способ по п.104, где композиция дополнительно содержит биологически активное средство, выбранное из группы, состоящей из противовирусной малой молекулы, противовирусной нуклеиновой кислоты и пептидного противовирусного средства.
  106. 106. Способ по п.105, где противовирусное средство выбрано из группы, состоящей из рибавирина, левовирина, 3ТС, РТС, МВ686, зидовудина, ацикловира, ганцикловира, вирамида, VX-497, VX-950 и Х8Х8-14803.
  107. 107. Способ по п.104, где вирусной инфекцией является хронический гепатит С.
  108. 108. Способ лечения пациента, у которого предполагается инфекция гепатита С, включающий введение пациенту комбинации композиции по любому из пп.80-84 и противовирусного средства.
  109. 109. Способ по п.108, где композицию и противовирусное средство вводят одновременно.
  110. 110. Способ по п.108, где композицию и противовирусное средство вводят последовательно.
  111. 111. Способ по п.108, где композицию и противовирусное средство вводят поочередно.
  112. 112. Способ по п.108, где противовирусным средством является рибавирин.
  113. 113. Способ лечения множественного склероза у пациента, включающий введение указанному пациенту эффективного количества полимерного конъюгата согласно формуле XXХХ, где формула XXХХ
    - 76 009783 представляет собой где Р означает полимер полиалкиленгликоля;
    X означает О, 8, СО, СО2, СО8, 8О, 8О2, СОт', 8ОАК' или ΝΒ.';
    К' означает водород, насыщенную или ненасыщенную С1-С2о алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью, С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил, замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил является С1-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксила, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтиогруппы;
    каждый Ζ и Ζ' независимо означает водород, насыщенную или ненасыщенную С1-С20 алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью, С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил, замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил является С1-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксила, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтиогруппы, при условии, что по меньшей мере один Ζ или Ζ' не является водородом;
    К* образован в результате взаимодействия В с остатком, выбранным из группы, состоящей из карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида, ацеталя, гидроксильной группы, защищенной гидроксильной группы, карбоната, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, замещенного или незамещенного тиола, галогена, замещенного или незамещенного амина, защищенного амина, гидра зида, защищенного гидразида, сукцинимидила, изоцианата, изотиоцианата, дитиопиридина, винилпиридина, йодацетамида, эпоксида, гидроксисукцинимидила, азола, малеимида, сульфона, аллила, винилсульфона, трезила, сульфо^-сукцинимидила, диона, мезила, тозила и глиоксаля, с биологически актив ным соединением или его предшественником;
    В является интерфероном-бета;
    каждый п равен 0 или является целым числом от 1 до 5 и р равно 1, 2 или 3.
  114. 114. Способ по п.113, где К* образован в результате взаимодействия В с остатком, выбранным из группы, состоящей из карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида и ацеталя.
  115. 115. Способ по п.113 или 114, где К* является метиленом и В присоединен посредством амина.
  116. 116. Способ по любому из пп.113-115, где X означает О, 8 или ИК.'.
  117. 117. Способ по любому из пп.113-116, где Ζ и Ζ' независимо означает водород или насыщенную или ненасыщенную С1-С20 алкильную группу с прямой или разветвленной цепью.
  118. 118. Способ по любому из пп.113-117, где В является интерфероном-бета-1а.
  119. 119. Способ лечения множественного склероза у пациента, включающий введение указанному пациенту эффективного количества полимерного конъюгата согласно формуле XXIII, где формула XXIII представляет собой где Ζ означает насыщенную или ненасыщенную С1-С20 алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью, С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил, замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил является С1-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксила, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина,
    - 77 009783 имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтиогруппы;
    К* образован в результате взаимодействия В с остатком, выбранным из группы, состоящей из карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида, ацеталя, гидроксильной группы, защищенной гидроксильной группы, карбоната, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, замещенного или незамещенного тиола, галогена, замещенного или незамещенного амина, защищенного амина, гидра зида, защищенного гидразида, сукцинимидила, изоцианата, изотиоцианата, дитиопиридина, винилпиридина, йодацетамида, эпоксида, гидроксисукцинимидила, азола, малеимида, сульфона, аллила, винилсульфона, трезила, сульфо-И-сукцинимидила, диона, мезила, тозила и глиоксаля;
    В является интерфероном-бета;
    η равен 0 или является целым числом от 1 до 5 и а является целым числом от 4 до 10000.
  120. 120. Способ по п.119, где К* образован в результате взаимодействия В с остатком, выбранным из группы, состоящей из карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида и ацеталя.
  121. 121. Способ по п.119 или 120, где Ζ означает насыщенную или ненасыщенную С1-С2о алкильную группу с прямой или разветвленной цепью.
  122. 122. Способ по п.119 или 120, где η равен 1 и Ζ означает метил.
  123. 123. Способ по п.119, 121 или 122, где К* является метиленом и В присоединен посредством амина.
  124. 124. Способ по любому из пп.119-123, где В является интерфероном-бета-1а.
  125. 125. Способ лечения рака у пациента, включающий введение указанному пациенту эффективного количества полимерного конъюгата согласно формуле XXII, где формула XXII представляет собой где Р означает полимер полиалкиленгликоля;
    X означает О, 8, СО, СО2, СО8, 8О, 8О2, СОИК', 8О2ИК' или ИК';
    К' означает водород, насыщенную или ненасыщенную С1-С20 алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью, С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил, замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил является С1-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксила, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтиогруппы;
    каждый Ζ и Ζ' независимо означает водород, насыщенную или ненасыщенную С1-С20 алкильную или гетероалкильную группу с прямой или разветвленной цепью, С3-С8 насыщенный или ненасыщенный циклический алкил или циклический гетероалкил, замещенную или незамещенную арильную или гетероарильную группу или замещенный или незамещенный алкарил, где алкил является С1-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом, или гетероалкарильную группу, где заместители выбраны из группы, состоящей из галогена, гидроксила, карбонила, карбоксилата, сложного эфира, формила, ацила, тиокарбонила, сложного тиоэфира, тиоацетата, тиоформиата, алкоксила, фосфорила, фосфоната, фосфината, аминогруппы, амидогруппы, амидина, имина, цианогруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфгидрила, сульфата, сульфоната, сульфамоила, сульфонамидогруппы, сульфонила, гетероциклила, аралкила, ароматического остатка, гетероароматического остатка, иминогруппы, силила, простого эфира и алкилтиогруппы, при условии, что по меньшей мере один Ζ или Ζ' не является водородом;
    К* образован в результате взаимодействия В с остатком, выбранным из группы, состоящей из карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида, ацеталя, гидроксильной группы, защищенной гидроксильной группы, карбоната, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, замещенного или незамещенного тиола, галогена, замещенного или незамещенного амина, защищенного амина, гидразида, защищенного гидразида, сукцинимидила, изоцианата, изотиоцианата, дитиопиридина, винилпиридина, йодацетамида, эпоксида, гидроксисукцинимидила, азола, малеимида, сульфона, аллила, винилсульфона, трезила, сульфо-И-сукцинимидила, диона, мезила, тозила и глиоксаля;
    В является интерфероном-бета;
    каждый η равен 0 или является целым числом от 1 до 5 и р равно 1, 2 или 3.
  126. 126. Способ по п.125, где К* образован в результате взаимодействия В с остатком, выбранным из группы, состоящей из карбоновой кислоты, сложного эфира, альдегида, гидрата альдегида и ацеталя.
    - 78 009783
  127. 127. Способ по п.125 или 126, где К* является метиленом и В присоединен посредством амина.
  128. 128. Способ по любому из пп.125-127, где X означает О, δ или ΝΚ'.
  129. 129. Способ по любому из пп.125-128, где Ζ И Ζ' независимо означает водород или насыщенную или ненасыщенную С4-С20 алкильную группу с прямой или разветвленной цепью.
  130. 130. Способ по любому из пп.125-129, где В является интерфероном-бета-1а.
  131. 131. Способ по любому из пп.113-130, где указанным пациентом является человек.
EA200400962A 2002-01-18 2003-01-17 Полиалкиленгликоль с остатком для конъюгации биологически активного соединения EA009783B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US34991702P 2002-01-18 2002-01-18
PCT/US2003/001559 WO2003061577A2 (en) 2002-01-18 2003-01-17 Polyalkylene glycol with moiety for conjugating biologically active compound

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200400962A1 EA200400962A1 (ru) 2005-06-30
EA009783B1 true EA009783B1 (ru) 2008-04-28

Family

ID=27613339

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200701386A EA011829B1 (ru) 2002-01-18 2003-01-17 Полиалкиленгликоль с остатком для конъюгации биологически активного соединения
EA200400962A EA009783B1 (ru) 2002-01-18 2003-01-17 Полиалкиленгликоль с остатком для конъюгации биологически активного соединения

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200701386A EA011829B1 (ru) 2002-01-18 2003-01-17 Полиалкиленгликоль с остатком для конъюгации биологически активного соединения

Country Status (35)

Country Link
US (2) US8017733B2 (ru)
EP (3) EP1476181B1 (ru)
JP (5) JP2005526151A (ru)
KR (1) KR100964411B1 (ru)
CN (2) CN101700401B (ru)
AU (1) AU2003210564B2 (ru)
BE (1) BE2016C040I2 (ru)
BG (1) BG66525B1 (ru)
BR (1) BRPI0306993B8 (ru)
CA (4) CA2473526C (ru)
CY (2) CY2016027I2 (ru)
CZ (1) CZ2004877A3 (ru)
DK (2) DK3025726T3 (ru)
EA (2) EA011829B1 (ru)
EE (1) EE05509B1 (ru)
ES (2) ES2566797T3 (ru)
GE (2) GEP20064024B (ru)
HK (3) HK1072721A1 (ru)
HU (4) HUE047557T2 (ru)
IL (1) IL163006A (ru)
IS (1) IS2989B (ru)
LU (1) LU93162I2 (ru)
ME (2) MEP35608A (ru)
MX (1) MXPA04006855A (ru)
NL (1) NL300826I2 (ru)
NO (3) NO339857B1 (ru)
NZ (1) NZ534708A (ru)
PL (2) PL213322B1 (ru)
PT (1) PT3025726T (ru)
RS (1) RS55578B1 (ru)
SI (2) SI3025726T1 (ru)
SK (1) SK3102004A3 (ru)
UA (1) UA82184C2 (ru)
WO (1) WO2003061577A2 (ru)
ZA (1) ZA200406555B (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2496514C2 (ru) * 2008-06-05 2013-10-27 Займоджинетикс, Инк. Применение пэгилированных интерферонов типа iii для лечения гепатита с

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101700401B (zh) 2002-01-18 2013-08-14 比奥根艾迪克Ma公司 具有用于共轭生物活性化合物的部分的聚亚烷基二醇
US20150246097A9 (en) * 2002-01-18 2015-09-03 Biogen Idec Ma Inc. Polyalkylene Polymer Compounds and Uses Thereof
NZ538624A (en) 2002-09-09 2007-01-26 Nektar Therapeutics Al Corp Water-soluble polymer alkanals
US8129330B2 (en) 2002-09-30 2012-03-06 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
RS20050501A (en) * 2002-12-26 2007-08-03 Mountain View Pharmaceuticals Inc., Polymer conjugates of cytokines,chemokines,growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity
PT1667708E (pt) * 2002-12-26 2012-09-14 Mountain View Pharmaceuticals Conjugados de interferão-beta-1b e polietileno glicol apresentando uma potência biológica in vitro aumentada
US7432331B2 (en) 2002-12-31 2008-10-07 Nektar Therapeutics Al, Corporation Hydrolytically stable maleimide-terminated polymers
AR044926A1 (es) 2003-06-26 2005-10-12 Control Delivery Sys Inc Sistema de suministro de farmacos gelificante in situ
TWI367103B (en) 2003-06-26 2012-07-01 Psivida Inc Bioerodible sustained release drug delivery systems
US20090312344A1 (en) * 2004-05-31 2009-12-17 Mohammad Salman Arylpiperazine derivatives as adrenergic receptor antagonists
KR101320936B1 (ko) 2004-12-21 2013-10-23 넥타르 테라퓨틱스 안정화된 중합체성 티올 시약
US20070004635A1 (en) * 2005-06-02 2007-01-04 Schering Corporation Method of treating interferon non-responders using HCV protease inhibitor
CA2614200A1 (en) * 2005-07-08 2007-01-18 Elan Pharmaceuticals, Inc. Preparation of polymer conjugates of therapeutic, agricultural, and food additive compounds
EP2019690A2 (en) * 2006-05-22 2009-02-04 Elan Pharmaceuticals Inc. Preparation of polymer conjugates of vla-4 antagonists via a mitsunobu's reaction
US20100222546A1 (en) * 2006-11-28 2010-09-02 David Crich Methods for the preparation of functionalized peptides, proteins and carbohydrates and their conjugates
EP2175878A4 (en) * 2007-07-11 2014-12-03 Belrose Pharma Inc POLYMER DRUG DISPENSING SYSTEM WITH A MULTIPLE SUBSTITUTED AROMATIC PART
JP2010533233A (ja) * 2007-07-11 2010-10-21 エンゾン ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド 芳香族アリル酸を含むポリマー性薬剤送達システム
CL2008002399A1 (es) * 2007-08-16 2009-01-02 Pharmaessentia Corp Conjugado sustancialmente puro que posee una porcion polimerica, una porcion proteica (interferon alfa 2b) y un ligante alifatico de 1 a 10 atomos de carbono, util en el tratamiento de las hepatitis b o c.
UA104146C2 (ru) * 2008-07-31 2014-01-10 Фармаиссеншиа Корп. ПОЛИМЕРНЫЕ КОНЪЮГАТЫ ФРАГМЕНТОВ ИНТЕРФЕРОНА-β, ЭРИТРОПОЭТИНА И ГОРМОНА РОСТА
GB0823309D0 (en) 2008-12-19 2009-01-28 Univ Bath Functionalising reagents and their uses
EP2439736A1 (en) 2009-06-02 2012-04-11 Panasonic Corporation Down-mixing device, encoder, and method therefor
UA109646C2 (uk) * 2009-12-10 2015-09-25 Терапевтичне застосування кон'югатів білка з полімером
US20130225789A1 (en) * 2012-02-29 2013-08-29 Yi Sun Polyethylene Glycol Having Hetero Multiple Functional Groups
US8993614B2 (en) 2012-03-15 2015-03-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Substituted pyrrolidine-2-carboxamides
KR101475630B1 (ko) * 2013-05-31 2014-12-22 동국대학교 산학협력단 포도근 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 c형 간염의 예방 또는 치료용 조성물
KR101671501B1 (ko) * 2014-07-24 2016-11-03 에이비온 주식회사 페길화된 인터페론-베타 변이체
DK3183264T3 (da) 2014-08-19 2020-11-02 Biogen Ma Inc Pegyleringsfremgangsmåde
GB201419108D0 (en) 2014-10-27 2014-12-10 Glythera Ltd Materials and methods relating to linkers for use in antibody drug conjugates
ES2966888T3 (es) 2014-11-06 2024-04-24 Pharmaessentia Corp Régimen de dosificación para el interferón pegilado
ES2831079T3 (es) * 2017-06-28 2021-06-07 Construction Research & Technology Gmbh Dispersante para partículas inorgánicas
US11472894B2 (en) 2018-07-23 2022-10-18 Carnegie Mellon University Enzyme-assisted ATRP procedures
CN109232898A (zh) * 2018-08-02 2019-01-18 张玲 一种具有抗凝血功能的聚酰亚胺新材料的制备方法
CN111534458B (zh) * 2020-04-13 2022-01-14 浙江工业大学 无色杆菌tbc-1及其在降解1,3,6,8-四溴咔唑中的应用
CN113716982B (zh) * 2021-08-24 2022-05-06 重庆云瑞肥业有限公司 一种食品垃圾回收用发酵制肥装置

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5252714A (en) * 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
US5990237A (en) * 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
WO2000023114A2 (en) * 1998-10-16 2000-04-27 Biogen, Inc. Polymer conjugates of interferon beta- 1a and their uses
US20010046481A1 (en) * 1999-12-23 2001-11-29 Shearwater Corporation Hydrolytically degradable carbamate derivatives of poly(ethylene glycol)
US20020044921A1 (en) * 2000-09-29 2002-04-18 Seoju Lee Pegylated interleukin-10
US20020091288A1 (en) * 1995-10-19 2002-07-11 The University Of Washington Discrete-length polyethylene glycols
WO2002060929A2 (en) * 2001-02-01 2002-08-08 Biogen, Inc. Polymer conjugates of neublastin and methods of using same
WO2003049699A2 (en) * 2001-12-11 2003-06-19 Sun Bio, Inc. Novel monofunctional polyethylene glycol aldehydes

Family Cites Families (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3710795A (en) 1970-09-29 1973-01-16 Alza Corp Drug-delivery device with stretched, rate-controlling membrane
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4002531A (en) 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
DE3262575D1 (en) 1981-12-23 1985-04-18 Schering Corp Stabilised interferon formulations and their preparation
WO1985003934A1 (en) * 1984-03-06 1985-09-12 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein and process for its preparation
GB8334102D0 (en) 1983-12-21 1984-02-01 Searle & Co Interferons with cysteine pattern
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
EP0206448B1 (en) 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
WO1987000056A1 (en) 1985-06-26 1987-01-15 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4917888A (en) 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
JP2514950B2 (ja) 1986-03-10 1996-07-10 エフ・ホフマン―ラ ロシユ アーゲー 化学修飾蛋白質，その製造法および中間体
US4894226A (en) 1986-11-14 1990-01-16 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polyproline conjugation
US5080891A (en) 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5135919A (en) 1988-01-19 1992-08-04 Children's Medical Center Corporation Method and a pharmaceutical composition for the inhibition of angiogenesis
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5286637A (en) * 1989-08-07 1994-02-15 Debiopharm, S.A. Biologically active drug polymer derivatives and method for preparing same
US5595732A (en) 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US5281698A (en) 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
WO1993012145A1 (en) 1991-12-19 1993-06-24 Baylor College Of Medicine Pva or peg conjugates of peptides for epitope-specific immunosuppression
ZA933926B (en) 1992-06-17 1994-01-03 Amgen Inc Polyoxymethylene-oxyethylene copolymers in conjuction with blomolecules
US5382657A (en) * 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
US5262564A (en) 1992-10-30 1993-11-16 Octamer, Inc. Sulfinic acid adducts of organo nitroso compounds useful as retroviral inactivating agents anti-retroviral agents and anti-tumor agents
US5298410A (en) 1993-02-25 1994-03-29 Sterling Winthrop Inc. Lyophilized formulation of polyethylene oxide modified proteins with increased shelf-life
US5681811A (en) 1993-05-10 1997-10-28 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized therapeutic agent compositions, delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5359030A (en) 1993-05-10 1994-10-25 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5874075A (en) 1993-10-06 1999-02-23 Amgen Inc. Stable protein: phospholipid compositions and methods
US5951974A (en) 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
HUT75533A (en) 1993-11-10 1997-05-28 Schering Corp Improved interferon polymer conjugates
US5446090A (en) 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
US5639725A (en) 1994-04-26 1997-06-17 Children's Hospital Medical Center Corp. Angiostatin protein
US5730990A (en) * 1994-06-24 1998-03-24 Enzon, Inc. Non-antigenic amine derived polymers and polymer conjugates
US5650234A (en) 1994-09-09 1997-07-22 Surface Engineering Technologies, Division Of Innerdyne, Inc. Electrophilic polyethylene oxides for the modification of polysaccharides, polypeptides (proteins) and surfaces
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5738846A (en) 1994-11-10 1998-04-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates and process for preparing the same
CN1168694A (zh) 1994-12-07 1997-12-24 诺沃挪第克公司 具有减弱的变应原性的多肽
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
SE9503380D0 (sv) * 1995-09-29 1995-09-29 Pharmacia Ab Protein derivatives
US5702717A (en) 1995-10-25 1997-12-30 Macromed, Inc. Thermosensitive biodegradable polymers based on poly(ether-ester)block copolymers
US5908621A (en) 1995-11-02 1999-06-01 Schering Corporation Polyethylene glycol modified interferon therapy
US5747639A (en) 1996-03-06 1998-05-05 Amgen Boulder Inc. Use of hydrophobic interaction chromatography to purify polyethylene glycols
JP2001508783A (ja) 1997-01-29 2001-07-03 ポリマスク・ファーマシューティカルズ・パブリック・リミテッド・カンパニー Ｐｅｇ化法
AU726374B2 (en) 1997-03-05 2000-11-02 University Of Washington Novel screening methods to identify agents that selectively inhibit hepatitis C virus replication
US6448369B1 (en) 1997-11-06 2002-09-10 Shearwater Corporation Heterobifunctional poly(ethylene glycol) derivatives and methods for their preparation
US7642323B2 (en) 1997-11-06 2010-01-05 Nektar Therapeutics Heterobifunctional poly(ethylene glycol) derivatives and methods for their preparation
US6180095B1 (en) 1997-12-17 2001-01-30 Enzon, Inc. Polymeric prodrugs of amino- and hydroxyl-containing bioactive agents
WO1999030727A1 (en) * 1997-12-17 1999-06-24 Enzon, Inc. Polymeric prodrugs of amino- and hydroxyl-containing bioactive agents
US5985263A (en) 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
US5981709A (en) 1997-12-19 1999-11-09 Enzon, Inc. α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same
US5965119A (en) 1997-12-30 1999-10-12 Enzon, Inc. Trialkyl-lock-facilitated polymeric prodrugs of amino-containing bioactive agents
WO1999045964A1 (en) 1998-03-12 1999-09-16 Shearwater Polymers, Incorporated Poly(ethylene glycol) derivatives with proximal reactive groups
SI1421956T1 (sl) 1998-04-28 2007-10-31 Serono Lab Postopek za stopenjsko vezavo polietilenglikola (peg) na polipeptid
US6703381B1 (en) 1998-08-14 2004-03-09 Nobex Corporation Methods for delivery therapeutic compounds across the blood-brain barrier
JP2003503367A (ja) * 1999-06-11 2003-01-28 シアウォーター・コーポレイション キトサンとポリ（エチレングリコール）または関連ポリマーから得られるヒドロゲル
US6531122B1 (en) * 1999-08-27 2003-03-11 Maxygen Aps Interferon-β variants and conjugates
KR20020034181A (ko) 1999-08-27 2002-05-08 맥시겐 에이피에스 새로운 인터페론 베타-유사 분자
US7144574B2 (en) 1999-08-27 2006-12-05 Maxygen Aps Interferon β variants and conjugates
DE60026073T2 (de) 1999-12-22 2006-09-28 Nektar Therapeutics Al, Corp., Huntsville Sterisch gehinderte derivate von wasserlöslichen polymeren
US7053150B2 (en) 2000-12-18 2006-05-30 Nektar Therapeutics Al, Corporation Segmented polymers and their conjugates
TW593427B (en) 2000-12-18 2004-06-21 Nektar Therapeutics Al Corp Synthesis of high molecular weight non-peptidic polymer derivatives
IL156059A0 (en) 2001-02-27 2003-12-23 Maxygen Aps NEW INTERFERON beta-LIKE MOLECULES
US7009033B2 (en) 2001-07-02 2006-03-07 Polymer Source Inc. Heterofunctional polyethylene glycol and polyethylene oxide, process for their manufacture
KR100974842B1 (ko) * 2001-10-18 2010-08-11 넥타르 테라퓨틱스 아편양 길항제의 중합체 공액
CN1608079A (zh) * 2001-11-20 2005-04-20 法玛西雅公司 化学修饰的人生长激素缀合物
US7041855B2 (en) 2001-12-11 2006-05-09 Sun Bio, Inc. Monofunctional polyethylene glycol aldehydes
US6916962B2 (en) 2001-12-11 2005-07-12 Sun Bio, Inc. Monofunctional polyethylene glycol aldehydes
KR100488351B1 (ko) 2001-12-11 2005-05-11 선바이오(주) 신규한 폴리에틸렌글리콜-프로피온알데히드 유도체
US6956135B2 (en) 2001-12-11 2005-10-18 Sun Bio, Inc. Monofunctional polyethylene glycol aldehydes
CN101700401B (zh) * 2002-01-18 2013-08-14 比奥根艾迪克Ma公司 具有用于共轭生物活性化合物的部分的聚亚烷基二醇
NZ538624A (en) 2002-09-09 2007-01-26 Nektar Therapeutics Al Corp Water-soluble polymer alkanals
PT1667708E (pt) 2002-12-26 2012-09-14 Mountain View Pharmaceuticals Conjugados de interferão-beta-1b e polietileno glicol apresentando uma potência biológica in vitro aumentada
US20110165122A1 (en) * 2009-11-10 2011-07-07 The Regents Of The University Of California Method for targeted and sustained antiviral therapy

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5252714A (en) * 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
US20020091288A1 (en) * 1995-10-19 2002-07-11 The University Of Washington Discrete-length polyethylene glycols
US5990237A (en) * 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
WO2000023114A2 (en) * 1998-10-16 2000-04-27 Biogen, Inc. Polymer conjugates of interferon beta- 1a and their uses
US20010046481A1 (en) * 1999-12-23 2001-11-29 Shearwater Corporation Hydrolytically degradable carbamate derivatives of poly(ethylene glycol)
US20020044921A1 (en) * 2000-09-29 2002-04-18 Seoju Lee Pegylated interleukin-10
WO2002060929A2 (en) * 2001-02-01 2002-08-08 Biogen, Inc. Polymer conjugates of neublastin and methods of using same
WO2003049699A2 (en) * 2001-12-11 2003-06-19 Sun Bio, Inc. Novel monofunctional polyethylene glycol aldehydes

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Database CAPLUS on CAS, AN 1997:758014, SHERMAN et al.: ''Conjugation of high-molecular weight poly(ethylene glycol) to cytokines'', ACS Symposium Series, 1997. *
Database CAPLUS on CAS, AN 2002:235344, ZACCHIGNA et al.: ''Syntheses, chemical and enzymatic stability of new poly(ethylene glycol)-acyclovir prodrugs'', Farmaco, v. 57, no. 3, 2002 *
Database CAPLUS on CAS, AN 2002:594875 for PCT WO 02060929 A2, BIOGEN, 08 August 2002 (08.08.02) *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2496514C2 (ru) * 2008-06-05 2013-10-27 Займоджинетикс, Инк. Применение пэгилированных интерферонов типа iii для лечения гепатита с

Also Published As

Publication number Publication date
CA2473526C (en) 2013-10-22
CA2753899C (en) 2014-03-25
AU2003210564B2 (en) 2008-10-23
CA2840490C (en) 2017-02-28
NL300826I2 (ru) 2017-03-16
HUE028163T2 (en) 2016-11-28
RS55578B1 (sr) 2017-06-30
SI1476181T1 (sl) 2016-10-28
US20050107277A1 (en) 2005-05-19
UA82184C2 (ru) 2008-03-25
HUS1600035I1 (hu) 2016-10-28
JP2016014022A (ja) 2016-01-28
CZ2004877A3 (cs) 2004-12-15
US8017733B2 (en) 2011-09-13
BRPI0306993B1 (pt) 2020-03-10
JP2009235409A (ja) 2009-10-15
EA011829B1 (ru) 2009-06-30
EP1476181A4 (en) 2008-11-19
WO2003061577A3 (en) 2003-10-02
PL397261A1 (pl) 2012-03-26
NO2017013I1 (no) 2017-04-10
EP3025726B1 (en) 2019-11-20
NO20043422L (no) 2004-10-11
NO20151082A1 (no) 2015-08-26
CY1122841T1 (el) 2021-10-29
JP2012255156A (ja) 2012-12-27
HK1143553A1 (en) 2011-01-07
EE200400105A (et) 2004-12-15
BRPI0306993B8 (pt) 2021-05-25
HUP0500457A2 (hu) 2005-08-29
ES2566797T3 (es) 2016-04-15
EP1476181B1 (en) 2016-03-23
CY2016027I1 (el) 2017-06-28
US20120014916A1 (en) 2012-01-19
PT3025726T (pt) 2020-01-09
HUP0500457A3 (en) 2012-09-28
EP3025726A1 (en) 2016-06-01
EA200400962A1 (ru) 2005-06-30
EE05509B1 (et) 2012-02-15
CA2753899A1 (en) 2003-07-31
HK1072721A1 (zh) 2005-09-09
ES2774801T3 (es) 2020-07-22
EP3669887A1 (en) 2020-06-24
PL372728A1 (en) 2005-08-08
IL163006A (en) 2011-01-31
CA2840490A1 (en) 2003-07-31
CA2952488C (en) 2019-05-07
DK3025726T3 (da) 2019-12-09
HK1224185A1 (zh) 2017-08-18
MEP35608A (en) 2011-02-10
WO2003061577A8 (en) 2008-11-20
IS2989B (is) 2017-11-15
GEP20074024B (en) 2007-01-10
HUE047557T2 (hu) 2020-04-28
EA200701386A1 (ru) 2007-10-26
CN101700401B (zh) 2013-08-14
CA2952488A1 (en) 2003-07-31
KR20040081463A (ko) 2004-09-21
CY2016027I2 (el) 2017-06-28
HU230473B1 (hu) 2016-07-28
IS7353A (is) 2004-07-15
MXPA04006855A (es) 2005-04-19
CN101700401A (zh) 2010-05-05
ME00239B (me) 2011-05-10
PL213322B1 (pl) 2013-02-28
BR0306993A (pt) 2005-09-06
GEP20064024B (en) 2007-01-10
JP2013136756A (ja) 2013-07-11
DK1476181T3 (en) 2016-05-23
WO2003061577A2 (en) 2003-07-31
JP2005526151A (ja) 2005-09-02
EP1476181A2 (en) 2004-11-17
JP6030717B2 (ja) 2016-11-24
JP5275125B2 (ja) 2013-08-28
CN1630530A (zh) 2005-06-22
SI3025726T1 (sl) 2020-03-31
BE2016C040I2 (ru) 2022-05-17
KR100964411B1 (ko) 2010-06-15
NO339857B1 (no) 2017-02-06
SK3102004A3 (sk) 2005-01-03
BG108839A (bg) 2005-04-30
NO344612B1 (no) 2020-02-10
BG66525B1 (bg) 2016-04-28
NZ534708A (en) 2007-05-31
CA2473526A1 (en) 2003-07-31
RS63504A (en) 2007-02-05
LU93162I2 (fr) 2016-10-03
NO2017013I2 (no) 2018-08-20
US8524660B2 (en) 2013-09-03
ZA200406555B (en) 2005-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA009783B1 (ru) Полиалкиленгликоль с остатком для конъюгации биологически активного соединения
JP2005526151A5 (ru)
AU2003210564A1 (en) Polyalkylene glycol with moiety for conjugating biologically active compound
US20170049904A1 (en) Polyalkylene polymer compounds and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

ND4A Extension of term of a eurasian patent
TC4A Change in name of a patent proprietor in a eurasian patent