PT1667708E - Conjugados de interferão-beta-1b e polietileno glicol apresentando uma potência biológica in vitro aumentada - Google Patents

Conjugados de interferão-beta-1b e polietileno glicol apresentando uma potência biológica in vitro aumentada Download PDF

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David L Williams
Alexa L Martinez
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Description

DESCRIÇÃO
CONJUGADOS DE INTERFERÃO-BETA-1B E POLIETILENO GLICOL APRESENTANDO UMA POTÊNCIA BIOLÓGICA IN VITRO AUMENTADA ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Campo da Invenção A presente invenção está no campo da bioquímica de proteínas e das ciências médicas e farmacêuticas. Em particular, a invenção proporciona métodos para a produção de conjugados entre polímeros solúveis em água (por ex. Poli (etileno glicol) e seus derivados) e citoquinas (por exemplo, o interferão-beta), cujos conjugados têm uma potência aumentada em comparação com os conjugados de polímero da mesma citoquina sintetizados por métodos convencionais. A invenção também proporciona conjugados produzidos por tais métodos, composições compreendendo tais conjugados, kits compreendendo tais conjugados e composições e métodos de utilização dos conjugados e composições para a prevenção, diagnóstico e tratamento de uma variedade de condições médicas e veterinárias. A invenção também proporciona métodos para determinar o (s) local de ligação de polímeros por alquilação redutiva sob certas condições. Técnica Relacionada A seguinte descrição da técnica relacionada inclui interpretações dos inventores da presente invenção que estão, em si, na técnica anterior. As citoquinas são proteínas reguladoras segregadas que controlam a sobrevivência, crescimento, diferenciação e/ou função 1 efectora de células endócrinas, na forma parácrina ou autócrina (revisto em Nicola, N.A. (1994) em: Guidebook to Cytokines and their Receptores, Nicola, N.A., ed, pp 1-7, Oxford University Press, New York). Devido à sua potência, especificidade, tamanho pequeno e relativa facilidade de produção em organismos recombinantes, as citoquinas têm muitas aplicações potenciais como agentes terapêuticos.
Dois factores principais têm impedido o desenvolvimento de citoquinas, em particular, e proteínas recombinantes, em geral, como agentes terapêuticos - a sua geralmente curta meia-vida na circulação e a sua antigenicidade potencial e imunogenicidade. Tal como aqui usado e geralmente na técnica, o termo "antigenicidade" refere-se à capacidade de uma molécula para se ligar a anticorpos pré-existentes, ao passo que o termo "imunogenicidade" refere-se à capacidade da molécula para evocar uma resposta imune in vivo, quer essa resposta envolva a formação de anticorpos (uma "resposta humoral") ou a estimulação da resposta imunitária celular.
Para a administração de proteínas recombinantes terapêuticas, a administração intravenosa (i.v.) é muitas vezes desejável a fim de atingir as maiores atividades circulantes e minimizar problemas de biodisponibilidade e degradação. No entanto, as semi-vidas de pequenas proteínas seguidas à administração i.v. são geralmente muito curtas (ver exemplos em Mordenti, J., et al., (1991) Pharm Res 8:1351-1359; Kuwabara, T., et al., (1995) Pharm Res 12:1466-1469). Proteínas com raios hidrodinâmicos superiores ao da albumina do soro, que têm um raio de 2
Stokes de cerca de 36 Â e um peso molecular de cerca de 66000 Daltons (66 kDa), são geralmente retidas no sangue pelos rins saudáveis. No entanto, as proteínas mais pequenas, incluindo as citoquinas, tais como o factor estimulador de colónias de granulócitos ("G-CSF"), interleucina-2 ("IL-2"), interferão-alfa ("IFN-alfa") e interferão gama ("IFN -gama "), são rapidamente eliminadas da corrente sanguínea por meio de filtração glomerular (Brenner, B.M., et al, (1978) Am J Physiol 234: F455-F460; Venkatachalam, M.A. et al., (1978) Circ Res 43:337-347;
Wilson, G., (1979) J Gen Physiol 74:495-509; Knauf, M.J., et al., (1988) J Biol Chem 2 63:150 64-1507 0; Kita, Y., et al., (1990) Drug Des Deliv 6:157-167; Rostaing, L. et al., (1998) , J Am Soc Nephrol 9:2344-2348). Como resultado, a manutenção de concentrações terapeuticamente úteis de pequenas proteínas recombinantes na circulação a seguir à injeção é problemático. Por conseguinte, devem ser tipicamente administradas concentrações mais elevadas de tais proteínas injeções mais frequentes. Os regimes de dosagem resultantes aumentam o custo do tratamento, diminuem a probabilidade de aceitação pelo paciente e aumentam o risco de efeitos adversos, por exemplo, reações imunológicas. As respostas imunes celulares e humorais podem reduzir as concentrações circulantes de proteínas recombinantes injetadas numa extensão que pode impedir a administração de uma dose eficaz ou pode levar a eventos de limitação de tratamento, incluindo procedimento acelerado, neutralização de eficácia e anafilaxia (Ragnhammar, P., et al., (1994) Blood 84:4078-4087; Wadhwa, M., et al., (1999) , Clin Câncer Res. 5:1353-1361; Hjelm Skog, A.-L., et al., (2001), Clin Câncer Res. 7:1163-1170; Li, J., et al., (2001) Blood 98:3241-3248; Basser, R.L., et al., (2002) Blood 99:2599-2602; Schellekens, H., (2002) Clin
Ther 24:1720-1740). 3 A modificação de proteínas recombinantes por ligação covalente de poli (etileno glicol) ("PEG") tem sido
extensivamente investigada como um meio de lidar com as deficiências acima discutidas (revisto em Sherman, M.R., et al, (1997) em: Poly (ethylene glycol) : Chemistry and Biological Applications, Harris, J.M., et al, eds, pp 155-169, American Chemical Society, Washington, DC; Roberts, M.J., et al., (2002) Adv. Drug Deliv Rev 54:459-476). A ligação de PEG a proteínas tem sido mostrado para estabilizar as proteínas, melhorar a sua biodisponibilidade e/ou reduzir a sua imunogenicidade in vivo. (A ligação covalente de PEG a uma proteína ou outro substrato é agui referida, e é conhecida na técnica, como "peguilação")· Além disso, a peguilação pode aumentar significativamente o raio hidrodinâmico das proteínas. Quando uma proteína pequena, tais como uma citoquina é acoplada a uma única cadeia longa de PEG (por exemplo, tendo um peso molecular de pelo menos cerca de 18 kDa) , o conjugado resultante tem um raio hidrodinâmico superior ao da albumina do soro e a sua depuração na circulação através dos glomérulos renais é dramaticamente retardada. Os efeitos combinados da PEGuilação - proteólise reduzida, reduzem o reconhecimento imunológico e reduzem as taxas de depuração renal conferem vantagens substanciais em proteínas PEGuiladas como agentes terapêuticos.
Desde os anos 70, têm sido feitas tentativas para utilizar a ligação covalente de polímeros para melhorar a segurança e eficácia de várias proteínas para uso farmacêutico (ver, por exemplo, Davis, F.F., et al., Patente US 4179337) . Alguns exemplos incluem o acoplamento de PEG ou poli (óxido de etileno) ("PEO") a adenosina-desaminase (EC 3.5.4.4), para utilização no tratamento da doença da imunodeficiência 4 combinada grave (Davis, S., et al., (1981) Clin Exp Immunol 46:649-652; Hershfield, MS, et al., (1987) N Engl J Med 316:589-596), a superóxido-dismutase (EC 1.15.1.1), para o tratamento de estados inflamatórios (Saifer, M., et al., Patentes US 5006333 e 5080891) e a urato oxidase (EC 1.7.3.3), para a eliminação do excesso de ácido úrico no sangue e na urina (Kelly, SJ, et al., (2001) J Am Soc Nephrol 12:1001-1009; Williams, LD, et al., WO 00/07629 A3 e Patente US 6576235; Sherman, MR, et al., WO 01/59078 A2). PEOs e PEGs são polímeros compostos por unidades de óxido de etileno ligados covalentemente. Estes polímeros têm a seguinte estrutura geral: R^fOCHgCH^n-Rg onde R2 pode ser um grupo hidroxilo (ou um seu derivado reativo) e Ri pode ser hidrogénio, como no dihidroxiPEG ("PEG diol"), um grupo metilo, tal como no monometoxyPEG ("mPEG"), ou um outro grupo alquilo inferior, por exemplo, como no iso-propoxiPEG ou t-butoxiPEG. O parâmetro n na estrutura geral do PEG indica o número de unidades de óxido de etileno no polimero e é referido aqui e na técnica, como o "grau de polimerização". Polímeros com a mesma estrutura geral, em que Ri é um grupo alquilo C1-7, também têm sido referidos como derivados de oxirano (Yasukohchi, T., et ai., Patente US 6455639). PEGs e PEOs podem ser lineares, ramificados (Fuke, I., et al., (1994) J. Control Release
30:27-34) ou em forma de estrela (Merrill, E.W., (1993) J
Biomater Sei Polym Ed 5:1-11) . PEGs e PEOs são anfipáticos, ou seja, são solúveis em água e em certos solventes orgânicos e podem aderir a materiais contendo 5 lípidos, incluindo os virus com envelope e membranas das células animais e de bactérias. Certos copolimeros aleatórios ou de bloco ou alternados de óxido de etileno (OCH2CH2) e óxido de propileno, o qual tem a seguinte estrutura: CH2-CH-CH3
O têm propriedades que são suficientemente semelhantes às do PEG que estes copolimeros são pensados serem substitutos adequados para o PEG, em certas aplicações (ver, e.g., Hiratani, H., Patente US 4609546 e Saifer, M., et al., Patente US 5283317). O termo "óxido de polialquileno" e a abreviatura "PAO" é aqui utilizado para se referir a tais copolimeros, bem como a copolimeros PEG ou PEO e poli (oxietileno-oximetileno) (Pitt, CG, et al., Patente US 5476653). Tal como aqui utilizado, o termo "polialquileno glicóis" e a abreviatura "PAGs" são usados para referir genericamente polímeros adequados para utilização nos conjugados da presente invenção, particularmente PEGs, mais particularmente PEGs contendo um único grupo reativo ("PEGs monofuncionalmente ativados"). A ligação covalente de PEG ou outros óxidos de polialquileno para uma proteína requer a conversão de pelo menos um grupo terminal do polímero num grupo funcional reativo. Este processo é frequentemente referido como "ativação" e o produto é chamado de "PEG ativado" ou óxido de polialquileno ativado. MonometoxiPEGs, em que um átomo de oxigénio numa extremidade é tapado com um grupo metilo não reativo, quimicamente estável (para produzir um "grupo 6 metoxilo") e na outra extremidade com um grupo funcional que seja reativo em relação a grupos amino de uma molécula de proteina, são usados mais comummente para tais abordagens. Os chamados mPEGs "ramificados", que contêm dois ou mais grupos metoxilo distais a um único grupo funcional ativado, são utilizados com menor frequência. Um exemplo de PEG ramificado é o di-mPEG-lisina, em que o PEG é acoplado a ambos os grupos amino, e o grupo carboxilo da lisina é o mais frequentemente ativado por esterificação com N-hidroxi-succinimida (Martinez, A., et al., Patente US 5643575; Greenwald, RB, et al., Patente US 5919455; Harris, JM, et al., Patente US 5932462).
Comummente, os polímeros ativados são feitos reagir com um composto bioativo tendo grupos funcionais nucleófilos, que servem como sitios de ligação. Um grupo nucleofilico funcional que é comummente utilizado como um local de ligação é o grupo amino épsilon de resíduos de lisina. Grupos solventes alfa-amino acessíveis, grupos de ácido carboxílico, grupos guanidino, grupos imidazole, grupos carbonilo ativados adequados, porções de hidrato de carbono oxidado e grupos tiol também têm sido utilizados como sítios de ligação. 0 grupo hidroxilo do PEG foi ativado com cloreto cianúrico, antes da sua ligação às proteínas (Abuchowski, A., et al., (1977) J Biol Chem 252:3582-3586; Abuchowski, A., et al., (1981) Câncer Treat Rep 65:1077-1081). A utilização deste método apresenta desvantagens, no entanto, tal como a toxicidade do cloreto cianúrico e a sua reatividade não específica para proteínas que possuem grupos funcionais que 7 não sejam as aminas, tais como solventes acessíveis de cisteína ou resíduos de tirosina que podem ser essenciais para a função. A fim de ultrapassar estas e outras desvantagens, foram introduzidos PEGs ativados alternativos, tais como os derivados de succinato de succinimidilo de PEG ("SS-PEG") (Abuchowski, A., et al., (1984) Câncer Biochem Biophys 7:175-186), derivados de carbonato de succinimidilo de PAG ("SC-PAG") (Saifer, M., et al., Patente US 5006333) e derivados de aldeído de PEG (Royer, GP, Patente US 4002531).
Comummente , várias (por exemplo, 5 a 10) , fitas de uma ou mais PAGs , por exemplo, um ou mais PEGs com um peso molecular de cerca de 5 kDa a cerca de 10 kDa, são acoplados à proteína alvo por meio de grupos amino primários (os grupos amino épsilon de resíduos de lisina e, eventualmente, o grupo alfa-amino do terminal amino ("N-terminal") de aminoácidos). Mais recentemente, têm sido sintetizados conjugados contendo uma única fita de mPEG de peso molecular mais elevado, por exemplo, 12 kDa, 20 kDa ou 30 kDa. Foram demonstradas correlações diretas entre as semi-vidas no plasma dos conjugados e um peso molecular crescente e/ou aumento do número de cadeias de PEG acopladas (Knauf, MJ, et al, supra.; Katre, NV (1990) J Immunol 144:209-213; Clark, R., et al., (1996) J Biol Chem 271:21969-21977; Bowen, S., et al., (1999) Exp. Hematol 27:425-432; Leong, SR, et al. , (2001) 16:106-119 Cytokine) . Por outro lado, como o número de fitas de PEG acoplados a cada molécula de proteína é aumentado, então a probabilidade de um grupo amino de uma região essencial da proteína ser modificado e, consequentemente, a função biológica da proteína ser prejudicada, especialmente se for uma proteína de ligação ao receptor. Para proteínas maiores 8 que contêm muitos grupos amino, e para as enzimas com substratos de baixo peso molecular, a troca entre o aumento da duração da ação e a diminuição da atividade especifica pode ser aceitável, uma vez que produz um aumento liquido da atividade biológica dos conjugados contendo PEG in vivo. Para as proteínas mais pequenas que funcionam via interação com receptores de superfície celular, tais como as citoquinas, no entanto, um grau relativamente elevado de substituição tem sido relatado para reduzir a atividade funcional ao ponto de negar a vantagem de uma semi-vida prolongada na circulação sanguínea (Clark, R., et al., supra) .
Assim, a conjugação do polímero é uma tecnologia bem estabelecida para prolongar a bioatividade e diminuir a imunorreatividade de proteínas terapêuticas, tais como enzimas (ver, por exemplo, o Pedido US 60/436,020, apresentado em 26 dezembro de 2002, e os Pedidos US 60/479,913 e 60/479,914, ambos apresentados em 20 de junho de 2003. Uma classe de proteínas terapêuticas que beneficiariam sobretudo de uma tal imunorreatividade diminuída são os interferões-betas, particularmente o interferão-beta-lb ("IFN-β lb;SEQ ID NO: 1) (O IFNb
Multiple Sclerosis Study Group (1996) Necrology 47:889-894). No entanto, a conjugação de polímeros a proteínas reguladoras que funcionam por ligação específica a receptores de superfície celular, geralmente: (1) interferem com tal ligação; (2) diminuem acentuadamente as potências dos agonistas de transdução de sinal das citoquinas; e (3) diminuem acentuadamente as potências competitivas dos antagonistas de citoquinas. Exemplos publicados de tais conjugados com reduzida atividade de ligação ao receptor incluem conjugados de polímero de 9 factor estimulador de colónias de granulócitos ("G-CSF") (Kinstler, 0., et al., WO 96/11953; Bowen, s., et al supra); hormona do crescimento humano ("hGH" ) (Clark, R. et al, supra) ; antagonistas de hGH (Ross, RJM, et al. (2001) J Clin Endocrinol Metab 86:1716-1723 e In-alfa (Bailon, P., et al. , (2001) Bioconjug Chem 12:195-202; Wylie, DC, et al., (2001) Pharm Res 18:1354-1360; e Wang, Y.-S., et li-, (2002) Drug Deliv Rev Adv. 54:547-570), entre outros. Num caso extremo, o acoplamento de polímeros para a interleucina-15 ("IL-15") convertem este factor de crescimento IL-2 num inibidor da proliferação celular (Pettit, DK, et al., (1997) J Biol Chem 272:2312-2318). Embora não pretendendo estar limitado pela teoria, o mecanismo para tais efeitos indesejáveis de PEGuilação pode envolver o impedimento estereoquimico da interação do receptor com os grupos PEG volumosos, neutralização de carga, ou ambos. EI Tayar et al. (WO 99/55377) refere-se a PEGuilação de interferão-beta-la (SEQ ID NO: 2), com a cisteina na posição 17.
Pepinsky et al. (WO 00/23114) refere-se a muteinas de interferão beta-la e PEG conjugados destes.
Katre et al. (Patente US 4917888) refere-se a solubilização de conjugada com o imunotoxina. uma proteina biologicamente ativa que é interferão-beta, interleucina-2 ou uma 10
Lin, et al (WO 03/061577) refere-se à PEGuilação de um modo geral e descreve no Exemplo 2, a mono-PEGuilação de interferão-beta-la na extremidade N-terminal por meio de alquilação redutora.
Assim, existe uma necessidade de métodos para a produção de PAG contendo conjugados (por exemplo, contendo PEG e/ou PEO) , em particular conjugados entre tais polimeros solúveis em água e proteinas de ligação ao receptor, com a preservação da bioatividade substancial (por exemplo, pelo menos cerca de 40%), quase bioatividade completa (por exemplo, pelo menos cerca de 80%), ou bioatividade essencialmente completa (por exemplo, pelo menos cerca de 90%). Tais conjugados terão os benefícios proporcionados pelo componente de polimero de aumento de solubilidade, estabilidade e biodisponibilidade in vivo e exibem potência substancialmente aumentada ou utilidade, em comparação com os conjugados de polimeros convencionais, num animal no qual os conjugados foram introduzidos para fins profiláticos, terapêuticos ou de diagnóstico.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção resolve as necessidades acima identificadas, e proporciona métodos para a preparação de conjugados de poli (etileno glicol), e seus derivados, com interferão-beta-lb. A invenção também proporciona conjugados produzidos por tais métodos. Em comparação com os correspondentes componentes bioativos não conjugados, os conjugados da presente invenção têm uma maior estabilidade (isto é, vida útil mais longa e semi-vidas mais longas in vivo) . Além disso, em comparação com os conjugados do 11 mesmo componente bioativo preparado com cadeias de polímeros que são ligadas de forma aleatória com locais solventes acessíveis ao longo das cadeias de polipeptídeos, os conjugados da presente invenção têm uma maior atividade de ligação ao receptor, que pode ser medida in vitro e potência aumentada, que pode ser medida in vitro ou in vivo.
Especificamente, a invenção proporciona um método para aumentar a potência biológica in vitro ou de um interferão-beta não-glicosilado, que compreende o acoplamento seletivo, na presença de um tensioativo, um ou mais polímeros solúveis em água para o aminoácido amino-terminal ou o dito interferão-beta, em que o referido aminoácido amino-terminal está localizado remotamente a partir do domínio de ligação ao receptor (s) ou do referido interferão-beta e em que (i) o polímero solúvel em água tem um único grupo aldeído e o acoplamento compreende a alquilação redutiva ou a base de Schiff formada com o polímero solúvel em água e a redução ou a base de Schiff com um agente redutor suave ou (ii) o acoplamento compreende acoplar uma hidrazida, hidrazina, semicarbazida, ou outro polímero solúvel em água contendo amina a uma serina N-terminal ou um resíduo de treonina ou o interferão beta que foi oxidativamente limpo a um aldeído com periodato, e em que o polímero solúvel em água é um polialquileno glicol selecionado a partir do grupo consistindo num poli (etilenoglicol), um mono-metoxipoli (etileno glicol) e um mono-hidroxi-poli (etileno-glicol). 12
Além disso, a invenção proporciona conjugados produzidos por tais métodos, composições compreendendo tais conjugados, kits contendo tais conjugados e composições para utilização numa variedade de regimes terapêuticos e de diagnóstico.
Os polímeros adequados para utilização nestes métodos da presente invenção são um ou mais poli (etileno-glicóis), um ou mais monometooxipoli (etileno-glicóis) e um ou mais monohidroxipoli (etileno-glicóis) . Os polímeros adequados para utilização nos métodos da presente invenção tipicamente têm um peso molecular de entre cerca de 1 kDa e cerca de 100 kDa, inclusive, ou, mais particularmente, os pesos moleculares de entre cerca de 8 kDa e cerca de 14 kDa, inclusive; entre cerca de 10 kDa e cerca de 30 kDa, inclusive; entre cerca de 18 kDa e cerca de 22 kDa, inclusive; ou de cerca de 20 kDa ou cerca de 30 kDa.
Em certas formas de realização, um ou mais polímeros é/são covalentemente acoplado (particularmente através de uma ligação amina secundária), para o grupo alfa-amino do aminoácido amino-terminal de uma citoquina.
Para conjugados de polímero de agonistas da invenção, é preferível que o (s) local de ligação do polímero seja remoto de todos os domínios de ligação ao receptor. A invenção também proporciona composições, especialmente composições farmacêuticas, compreendendo um ou mais dos conjugados da presente invenção e um ou mais componentes adicionais, tais como um ou mais diluentes 13 farmaceuticamente aceitáveis, excipientes ou veículos. A invenção também proporciona kits compreendendo um ou mais dos conjugados, composições e/ou composições farmacêuticas da presente invenção. A invenção proporciona também os conjugados usados em métodos de prevenção, diagnóstico ou tratamento de um distúrbio físico num animal (por ex. um mamífero tal como um ser humano) que sofre ou está predisposto ao distúrbio físico. Tais métodos podem incluir, por exemplo, a administração ao animal de uma quantidade eficaz de um ou mais dos conjugados, composições ou composições farmacêuticas da presente invenção. Distúrbios físicos adequadamente tratados ou prevenidos de acordo com tais métodos da invenção incluem cancros (por ex. cancro da mama, cancro uterino, cancro do ovário, cancro da próstata, cancro testicular, cancro do pulmão, leucemia, linfoma, cancro do cólon, cancro gastrointestinal, cancro do pâncreas, cancro da bexiga, cancro dos rins, cancro ósseo, cancro neurológicos, cancro da cabeça e do pescoço, cancro da pele, sarcoma, carcinoma, adenoma e mieloma); doenças infecciosas (por exemplo, doenças bacterianas, doenças por fungos, doenças parasíticas e doenças virais (tais como hepatite virai, uma doença causada por um vírus cardiotrópico, HIV/SIDA) e distúrbios genéticos (por exemplo, anemia, trombocitopenia, neutropenia, hemofilia, nanismo e doença da imunodeficiência combinada grave ("SCID"); distúrbios autoimunes (por ex. psoríase, lúpus eritematoso sistémico e artrite reumatoide) e desordens neurodegenerativas (por exemplo, várias formas e fases da esclerose múltipla ("EM"), tais como EM remitente-recorrente, EM progressiva primária e EM progressiva 14 secundária; Doença de Creutzfeldt-Jakob; Doença de Alzheimer, e afins).
Em realizações adicionais, a invenção proporciona métodos para a clivagem oxidativa seletiva de um residuo de serina N-terminal de uma proteína bioativa, sem oxidar resíduos funcionalmente essenciais de aminoácidos da referida proteína bioativa. Tais métodos da presente invenção compreendem, por exemplo, (a) o ajustamento da concentração de iões de hidrogénio de uma solução da proteína bioativa para um pH de entre cerca de 5 e cerca de 10, mais preferivelmente um pH de entre cerca de 7 e cerca de 8; (b) misturar a solução de proteína bioativa com cerca de 0,1 moles a cerca de 10 moles, ou mais preferencialmente com cerca de 0,5 moles a cerca de 5 moles, de um periodato por mole de proteína bioativa; e (c) incubação da referida mistura durante pelo menos uma hora, de preferência a uma temperatura de entre cerca de 2°C e cerca de 40°C. As proteínas adequadas para utilização de acordo com os referidos métodos incluem citoquinas (incluindo o interferão-beta (em particular, o interferão-beta-lb, o qual tem preferivelmente a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 1).
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra os modelos moleculares de citoquinas criados com o software RasMol (Sayle, RA, et al., (1995) Trends Biochem Sei 20:374-376) com base em dados cristalográficos. Cada um dos modelos está representado na "fita" ou formato de "cartoon", com exceção de certos resíduos de interesse particular, que são mostrados em 15 formato de "bola-e-vara". Estes formatos são opções selecionadas usando o software RasMol. As partes escuras das fitas representam domínios das citoquinas e factores de crescimento que são relatados para serem envolvidos na ligação aos seus receptores. Para cada estrutura, o código de adesão, no Protein Data Bank ("APO") está indicado (ver Laskowski, RA, (2001) Nucleic Acids Res. 29:221-222; Peitsch, MC (2002), Bioinformatics 18:934-938; Schein, CH, (2002) Curr Pharm Des 8:2113-2129). A Figura 1 mostra um modelo molecular do interferão-beta-la humano (ver SEQ ID NO: 2), em que são indicados vários resíduos de lisina que estão dentro ou adjacentes aos domínios de ligação ao receptor (Lys 19, Lys 33, Lys 99 e Lys 134). Além disso, o local de glicosilação (Asn 80) e o resíduo de metionina N-terminal ("Met 1") estão apresentados no formato de "bola-e-vara" (com base em dados de Karpusas, M., et al., (1997) Proc Natl Acad Sei USA 94:11813-11818; Karpusas, M., et al., (1998) Cell Mol Life Sei 54:1203-1216; Runkel, L., et al., (2000) Biochemistry 39:2538-2551). Met 1 é remoto dos locais de ligação 1 e 2, ao passo que vários resíduos de lisina estão localizados dentro dos domínios de ligação ao receptor. (código PDB 1AUI) A estrutura do interferão-beta-lb (ver SEQ ID NO: 1) é diferente do interferão-beta-la em que falta o resíduo metionina N-terminal e a unidade de hidratos de carbono, bem como com um resíduo de serina substituído por um resíduo de cisteína não emparelhado (Cys 17 de SEQ ID NO: 2) . 16 A Figura 2 descreve a resolução por exclusão de tamanho de HPLC do interferão^-lb ("IFN") a partir dos seus conjugados formados por alquilação redutora com o aldeído 20 kDa mPEG em concentrações de entrada diferentes ("lx", "2x" ou "4x"), com cianoboro-hidreto de sódio (NaBH3CN) como agente redutor. Conjugados contendo uma cadeia de PEG ("PEGi-IFN") ou duas cadeias ("PEG2-IFN") são resolvidos a partir de IFN em que o PEG não foi acoplado sob estas condições ("IFN PEGuilado Mock"). A Figura 3 demonstra a clivagem oxidativa por periodato de sódio de cerca de 90% de PEGi-IFN-β sintetizado por alquilação redutora sob várias condições. HPLC de exclusão de tamanho na presença de dodecil sulfato de sódio ("SDS") resolveu o PEGi-IFN-β residual a partir dos produtos de clivagem, incluindo formaldeído e IFN em que a serina N-terminal foi clivada para um aldeído ("aldeído IFN"). A Figura 4 mostra a resolução por cromatografia de fase reversa de PEGi-IFN- β a partir de IFN-β PEGuilado Mock, PEG não acoplado, SDS não acoplado e componentes secundários da mistura reacional. A Figura 5 ilustra os resultados da cromatografia de fase inversa analítica ("RP") de uma mistura de reação de PEGuilação e as fracções a partir de uma coluna de RP preparativa que foram enriquecidas em PEGi-IFN-β (Fracção 51) ou em IFN-β PEGuilado Mock (Fracção 53) , respectivamente. 17 A Figura 6 representa os resultados de análises eletroforéticas de uma mistura de reação de PEGuilação e de fracções de uma coluna RP preparativa, que são enriquecidas tanto em PEGi-IFN-β (Fracção 51) como nos conjugados contendo mais do que uma cadeia de PEG (Fracção 4 9) . 0 gel foi corado para a proteína com um corante fluorescente e fotografado com iluminação ultravioleta. A intensidade do corante foi medida com o software de imagens Kodak 1D. A Figura 7 ilustra os resultados de análises electroforéticas das mesmas amostras como na Figura 6, com exceção de que o gel foi corado por PEG com um reagente contendo BaCl2, I2 e Kl. A intensidade do corante numa fotografia do gel foi medida como na Figura 6A e o pico residual livre de 20 kDa PEG foi detectável na mistura de reação. A Figura 8 mostra cromatogramas de fase reversa de amostras de ΙΕΝ-β-lb que foram ou não tratadas (curva de cima) ou incubadas com 0,5 mM de NalCh que clivado com os resíduos de serina N-terminais de ambos os componentes principais e secundários dos derivados de aldeído (curva média) , ou oxidados com NalC>4 e feitos reagir com 9-f luorenilmetil carbazato ("Fmoc-carbazato"). O componente secundário ("Pico A") contém um resíduo de metionina oxidada. Os aumentos semelhantes nos tempos de retenção de ambos o pico A e o componente principal após oxidação refletem a clivagem dos resíduos N-terminais da serina em cada pico a um aldeído. Nenhum aumento na percentagem de pico A foi detectado após incubação com Nal04 sob estas condições. A formação de conjugados de Fmoc das formas oxidadas de Pico 18 A e o componente principal é indicado pelos aumentos nos seus tempos de retenção e as absorbâncias após reação com Fmoc-carbazato. A Figura 9 demonstra a síntese de PEGi-IFN-β por reação de carbazato de PEG 20 kDa com o derivado aldeído de IFN-β. O aumento da proporção do conjugado detectads após a incubação da proteína com 0,125 mM de NalCh à temperatura ambiente durante 0,5 horas, 1 ou 2 horas indica que a conversão completa da serina N-terminal para um aldeído requer mais de 1 hora nestas condições. O PEGi-IFN-β foi resolvido de forma incompleta a partir de carbazato de PEG 20 kDa nesta coluna de exclusão de tamanho. A Figura 10 demonstra a maior potência anti-proliferativa em células de linfoma de Burkitt humano (células de Daudi) de diluições de PEGi-IFN-β, o qual foi purificado por cromatografia de fase reversa (Fracção 51, caracterizada nas Figuras 17-19), do que diluições da solução mãe de IFN-β. A concentração de PEGi-IFN-β purificado necessário para inibir 50% do crescimento inibido destas células foi cerca de 40 pg/mL, o qual foi cerca de um sexto da necessária para a solução mãe de IFN-β. A concentração de IFN-βΡΕ6ηίΐ30ο Mock purificado (Fracção 53 a partir do cromatograma de fase inversa mostrado na Figura 17) necessária para inibir 50% do crescimento inibido destas células era de cerca de 80 pg/mL, o que é cerca de um terço do requerido para a solução mãe de IFN-β. 19
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A menos que definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado como vulgarmente entendido por um vulgar perito na técnica à qual esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam ser utilizados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais preferidos são descritos a seguir.
De acordo com as reivindicações da presente invenção, a invenção proporciona um método para aumentar a potência biológica in vitro de um interferão-beta não-glicosilado, que compreende o acoplamento seletivo de um ou mais polímeros sintéticos solúveis em água para o aminoácido amino-terminal do referido interferão-beta, em que o referido aminoácido amino-terminal está localizado remotamente a partir do dominio de ligação ao receptor (s) do referido interferão-beta. A invenção proporciona ainda um método para a clivagem oxidativa seletiva de um residuo N-terminal de serina ou treonina de uma proteína bioativa, sem oxidar funcionalmente os resíduos de aminoácidos essenciais da referida proteína bioativa, compreendendo: a) ajustar a concentração de iões de hidrogénio de uma solução da referida proteína bioativa para um pH entre cerca de 7 e cerca de 8; 20 b) misturar a dita solução de proteína bioativa com cerca de 0,5 a cerca de 5 moles de um periodato por mole de proteína bioativa; e c) incubação da referida mistura pelo menos uma hora a uma temperatura de entre cerca de 2°C e cerca de 40°C.
Definições
Sobre: Tal como aqui usado para referir qualquer valor numérico, o termo "cerca" significa um valor de ± 10% do valor indicado (por exemplo, "cerca de 50°C" engloba uma gama de temperaturas desde 45°C a 55°C, inclusive, do mesmo modo, "cerca de 100 mM" engloba uma gama de concentrações de 90 mM a 110 mM, inclusive).
Resíduos de aminoácidos: Como aqui utilizado, o termo "resíduo de aminoácido" refere-se a um aminoácido específico, geralmente desidratado, como resultado do seu envolvimento em duas ligações peptídicas, numa espinha dorsal polipeptídica ou cadeia lateral, mas também quando o aminoácido é envolvido numa ligação peptídica, tal como ocorre em cada extremidade de uma cadeia polipeptídica linear. Os resíduos de aminoácidos são designados pelos códigos de três letras ou de única letra que são comuns na técnica.
Antagonista: Como aqui utilizado, o termo "antagonista" refere-se a um composto, molécula, porção ou complexo que reduz, reduz substancialmente ou completamente inibe os efeitos biológicos e/ou fisiológicos de uma dada citoquina 21 numa célula, tecido ou organismo que são mediados através dos receptores para a citoquina fornecida. Os antagonistas podem efetuar tais efeitos numa variedade de formas, incluindo com o agonista de sitio de ligação (s) ou receptor (es) da superficie celular; interagindo com o agonista, de tal modo para reduzir, substancialmente reduzir ou inibir a capacidade do agonista para se ligar aos receptores da superficie celular; ligar a e induzir uma alteração conformacional no receptor da superficie celular de tal forma que os receptores assumem uma estrutura em que o agonista pode já não se ligar (ou pode ligar apenas com afinidade reduzida ou substancialmente reduzida e/ou eficácia); induzir uma alteração fisiológica (por exemplo, aumento de complexos intracelulares de sinalização; aumento de inibidores da transcrição; redução na expressão do ligando do receptor de superfície das células, etc.) em células, tecidos ou organismos, tais que a ligação do agonista, ou o sinal fisiológico induzido pelo agonista sobre a ligação com a célula, é reduzido, substancialmente reduzido ou completamente inibido; e outros mecanismos pelos quais os antagonistas podem exercer as suas atividades, que serão familiares para qualquer especialista na matéria. Como o perito na técnica compreenderá, um antagonista pode ter uma estrutura semelhante para o ligando que antagoniza (por exemplo, o antagonista pode ser uma muteina, variante, fragmento ou derivado do agonista), ou pode ter uma estrutura totalmente não relacionada.
Componente bioativo: Como usado aqui, o termo "componente bioativo" refere-se a um composto, uma molécula porção ou complexo que tem uma atividade biológica específica in vivo, in vitro ou ex vivo, numa célula, tecido, órgão ou organismo e que é capaz de ser ligado a um ou mais glicóis 22 de polialquileno para formar os conjugados da presente invenção. Componentes bioativos preferidos incluem proteínas e polipeptídeos, tais como os que são aqui descritos.
Ligado: Como usado aqui, o termo "ligado" refere-se à ligação ou conexão que pode ser covalente, por exemplo, por acoplamento químico, ou não-covalente, por exemplo, interações iónicas, interações hidrofóbicas, ligações de hidrogénio, etc. As ligações covalentes podem ser, por exemplo, ligações de éter, éster, fosfoéster, tioéster, tioéter, uretano, amida, amina, péptido, imida, hidrazona, hidrazida, carbono-enxofre, carbono-fósforo e similares. 0 termo "ligado" é mais amplo do que isso, e inclui os termos tais como "acoplado", "conjugado" e "conectado".
Conjugado/conjugação: Conforme aqui utilizado, "conjugado" refere-se ao produto de ligação covalente de um polímero, por exemplo, PEG ou PEO, a um componente bioativo, por exemplo, uma proteína ou glicoproteína. "Conjugação" refere-se à formação de um conjugado tal como definido no parágrafo anterior. Qualquer método normalmente utilizado pelos peritos na técnica da conjugação de polímeros a materiais biologicamente ativos pode ser usado na presente invenção.
Acoplado: 0 termo "acoplado", tal como aqui utilizado, refere-se à conexão através de ligações covalentes ou por fortes interações não covalentes, normalmente e de preferência a conexão por ligações covalentes. Qualquer 23 método normalmente utilizado pelos peritos na técnica do acoplamento de materiais biologicamente ativos pode ser usado na presente invenção.
Citoquina: Como aqui utilizado, o termo "citoquina" é definido como uma proteina reguladora segregada que controla a sobrevivência, o crescimento, a diferenciação e/ou a função efectora de células, na forma endócrina, parácrina ou autócrina (revisto em Nicola, NA, supra; Kossiakoff, AA, et al., (1999) Adv. Protein Chem 52:67- 108) . De acordo com esta definição, as citoquinas incluem as interleucinas, factores estimulantes de colónias, factores de crescimento e factores peptídicos, produzidos por uma variedade de células, incluindo os aqui especificamente descritos ou exemplificados. Tal como os seus parentes mais próximos, as hormonas polipeptídicas e fatores de crescimento, as citoquinas iniciam as suas funções de regulação ligando-se a proteínas de receptores específicos na superfície das suas células-alvo.
Doença, distúrbio, condição: Tal como aqui utilizados, os termos "doença" ou "distúrbio" referem-se a qualquer condição adversa de um ser humano ou animal, incluindo tumores, cancro e alergias, adições, autoimunidade, infecções, envenenamento ou insuficiência de funções mentais ou corporais. "Condições" tal como aqui utilizado inclui doenças e desordens, mas também se refere a estados fisiológicos. Por exemplo, a fertilidade é um estado fisiológico, mas não uma doença ou distúrbio. As composições da invenção adequadas para prevenir a gravidez através da diminuição da fertilidade podem, por 24 conseguinte, ser descritas como um tratamento de uma condição (fertilidade), mas não o tratamento de uma desordem ou doença. Outras condições são compreendidas pelas pessoas com conhecimentos correntes na matéria.
Quantidade eficaz: Tal como aqui utilizado, o termo "quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade de um dado conjugado ou composição que é necessária ou suficiente para realizar um efeito biológico desejado. Uma quantidade eficaz de um dado conjugado ou composição da presente invenção seria a quantidade que alcança este resultado selecionado, e tal quantidade pode ser determinada por uma questão de rotina por um perito na técnica, utilizando testes que são conhecidos na técnica e/ou que são aqui descritos, sem a necessidade de experimentação indevida. Por exemplo, uma quantidade eficaz para o tratamento de uma deficiência do sistema imunitário poderia ser a quantidade necessária para causar a ativação do sistema imunitário, resultando no desenvolvimento de uma resposta imunitária antigénio-especifica após a exposição a um antigénio. 0 termo é também sinónimo de "quantidade suficiente". A quantidade eficaz para qualquer aplicação particular pode variar dependendo de factores tais como a doença ou condição a ser tratada, a composição particular a ser administrada, a via de administração, o tamanho do sujeito, e/ou a gravidade da doença ou condição. Um vulgar perito na técnica pode determinar empiricamente a quantidade eficaz de um conjugado ou composição especifica da presente invenção, sem necessidade de experimentação excessiva. 25
Um, a, ou uma: Quando os termos "um", "a" ou "uma" são usados na presente memória descritiva, significa "pelo menos um" ou "um ou mais", a não ser que seja indicado o contrário. PEG: Conforme aqui utilizado, "PEG" inclui todos os polímeros de óxido de etileno, quer lineares ou ramificados ou multi-armados e terminados em cobertura ou hidroxi. "PEG" inclui aqueles polímeros que são conhecidos na técnica, como o poli (etileno glicol), metoxipoli (etileno-gli col) ou mPEG ou poli (etileno glicol) monometil-éter, alcoxipoli (etileno glicol), poli (óxido de etileno) ou PEO, a-metil-co-hidroxi-poli (oxi-1,2-etanodiilo) e polioxirano, entre outros nomes que são usados na técnica para os polímeros de óxido de etileno. PEGuilação, PEGuilado e Mock PEGuilado: Conforme aqui utilizado, "PEGuilação" refere-se a qualquer processo para o acoplamento covalente de PEG a uma molécula bioativa alvo, especialmente uma proteina de ligação ao receptor. 0 conjugado assim produzido é referida como sendo "PEGuilado". Como usado aqui, "PEGuilado Mock" refere-se à porção da proteina numa mistura de reação de PEGuilação para a qual o PEG não foi ligado covalentemente. No entanto, o produto tratado com PEG Mock pode ter sido alterado durante a reação ou nos passos de purificação subsequente, por ex. , como consequência da exposição ao agente redutor durante a PEGuilação por alquilação redutora e/ou por um ou mais agentes inibidores, compostos, etc., serem removidos durante o processamento e/ou os passos de purificação. 26
Polipeptideo: Como aqui utilizado, o termo "polipeptídeo" refere-se a uma molécula composta por monómeros (aminoácidos) linearmente ligados por ligações amida (também conhecidas como ligações peptidicas). Isto indica uma cadeia molecular de aminoácidos e não se refere a um comprimento especifico do produto. Assim, peptideos, dipeptúdeos, tripptídeos, oligopeptídeos e proteínas estão incluídos dentro da definição de polipeptídeo. Este termo destina-se também a referir os produtos das modificações pós-expressão do polipeptídeo, por exemplo, glicosilação, hiperglicosilação, acetilação, fosforilação. Um polipeptídeo pode ser derivado de uma fonte biológica natural ou produzido por tecnologia de ADN recombinante, mas não é necessariamente traduzido a partir de uma sequência de ácido nucleico designado. Pode ser gerado em qualquer forma, incluindo por síntese química.
Proteínas e glicoproteínas: Como aqui utilizado, o termo proteína refere-se de modo geral a um polipeptídeo de tamanho superior a cerca de 10 ou mais, 20 ou mais, 25 ou mais, 50 ou mais, 75 ou mais, 100 ou mais, 200 ou mais, 500 ou mais, 1000 ou mais, ou 2000 ou mais aminoácidos. As proteínas têm, geralmente, estruturas tridimensionais definidas, embora não tenham necessariamente esta estrutura, e são muitas vezes referidas como dobradas, em oposição a péptidos e polipeptídeos, que muitas vezes não possuem uma estrutura tridimensional definida, mas podem adoptar um grande número de conformações diferentes, e são referidos como desdobrados. Os péptidos podem, no entanto, também ter uma estrutura tridimensional definida. Como aqui utilizado, o termo glicoproteína refere-se a uma proteína acoplada a pelo menos uma porção de hidrato de carbono que está ligada à proteína através de uma cadeia 27 lateral de um átomo de oxigénio ou azoto de um resíduo de aminoácido, por exemplo, um resíduo de serina ou um resíduo de asparagina.
Remota: Como aqui utilizado, o termo "controlo remoto" (como em "aminoácido de N-terminal remoto" ou "local de glicosilação remota") refere-se a uma estrutura em que a localização de um ou mais locais de ligação para um ou mais polímeros numa proteína é/são removidas distai ou espacialmente de um ou mais dos receptores de ligação de regiões ou domínios da proteína, tal como avaliado por modelação molecular. Conjugação de um polímero em tal local de ligação remota (geralmente o aminoácido N-terminal (para receptores de proteínas de ligação que são, portanto, referidos como "N-terminal remoto" ou proteínas de ligação a receptor "RN") ou um ou mais porções de hidratos de carbono ou locais de glicosilação de uma glicoproteína (para o receptor de proteínas de ligação que são, portanto, referidos como "glicosilação remota" ou proteínas de ligação a receptor "RG") não causa impedimento estérico substancial da ligação da proteína ao seu receptor (s) . Assim, um aminoácido amino-terminal ou um sítio de glicosilação numa citoquina é dito ser "localizado remotamente a partir de um ou mais domínios de ligação ao receptor" da citoquina quando a conjugação (por ex., ligação covalente) de um polímero solúvel em água para o amino-terminal do aminoácido ou local de glicosilação, respectivamente, não interfere substancialmente com a capacidade da citoquina de se ligar ao seu receptor (s) , particularmente para receptores de superfície celular. Reconhece-se, naturalmente, que uma dada citoquina pode conter mais do que um domínio de ligação ao receptor. Em tais situações, um aminoácido amino-terminal ou local de 28 glicosilação de uma citoquina pode ser localizado remotamente a partir de um domínio de tal ou de mais de um de tais domínios, e ainda assim ser considerado ser "localizado remotamente a partir de um ou mais domínios de ligação ao receptor, "contanto que a conjugação do aminoácido amino-terminal ou local de glicosilação não interfira substancialmente com a ligação da citoquina ao seu receptor (s) , através de um ou mais dos domínios de ligação ao receptor. Seja ou não que a conjugação interfira substancialmente com a capacidade de uma proteína para se ligar ao seu receptor (es) podem ser facilmente determinadas utilizando ensaios conhecidos na técnica de ligação ligando-receptor que serão familiares para qualquer especialista na matéria. PEG é um polímero altamente flexível estendido e que ocupa um grande volume de solução em relação a uma proteína de peso molecular semelhante. Embora o resíduo de aminoácido para o qual o PEG está ligado possa ser remota a partir de um ou mais sítios de ligação de receptor, porções do polímero podem, no entanto, interferir, em certa medida, com a ligação ao receptor. A probabilidade da interferência deste tipo aumenta com o peso molecular e, consequentemente, o volume ocupado pelo polímero em solução. Em qualquer caso, o alvo de fixação de PEG a um ou mais sítio (s) remotos a partir da região de ligação ao receptor (s) irá interferir menos com a função da citoquina de PEGuilação aleatória. Métodos de avaliação da ligação ligando-receptor incluem, sem limitação, ensaios de ligação competitiva, ensaios de 29 radiorecetor de ligação, ensaios baseados em células, medições de ressonância de plasma de superfície, dispersão dinâmica de luz, ultracentrifugação e ultrafiltração.
Substancial, substancialmente: Tal como aqui utilizado, a conjugação de uma proteina é dito não interferir "substancialmente", com a capacidade da proteina de se ligar ao seu receptor (s) , se a taxa e/ou a quantidade de ligação de uma proteina conjugada a um receptor não é menos do que cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 65 o o r cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85 0, ° r cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93 %, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou cerca de 100% ou mais, da taxa de ligação e/ou a quantidade da citoquina correspondente que não tenha sido conjugada.
Tratamento: Tal como aqui utilizado, os termos "tratamento", "tratar", "tratado" ou "tratamento" referem-se a profilaxia e/ou terapia. Quando utilizado em relação a uma doença infecciosa, por exemplo, o termo pode referir-se a um tratamento profilático que aumenta a resistência de um objecto à infecção por um agente patogénico, ou, em outras palavras, diminui a probabilidade de o sujeito infectado com o agente patogénico ou mostrar sinais de doença atribuível à infecção, bem como um tratamento depois do sujeito ficar infectado a fim de combater a infecção, por exemplo, para reduzir ou eliminar a infecção, ou para impedir que se torne pior. 30
Visão global A presente invenção proporciona métodos para a síntese de conjugados de polímero de receptor de ligação a proteínas que retêm inesperadamente elevada atividade de ligação aos receptores em relação aos conjugados de polímero da mesma proteína de ligação ao receptor e na qual um ou mais polímeros são ligados de forma aleatória. Através da utilização de cristalografia de raios-x e ressonância magnética nuclear com base em análises estruturais, análise mutacional e software de modelagem molecular, os presentes inventores identificaram locais-alvo para a PEGuilação de citoquinas que estão envolvidas ou não estão envolvidas na ligação aos seus receptores. Como uma classe de proteínas, tais citoquinas são aqui referidas como proteínas de ligação a receptores. Por seleção de uma estratégia sintética que tem como alvo o polímero de fixação para a região (s) de receptores de proteínas de ligação que não estão envolvidos nas interações dos receptores, certos obstáculos estéricos indesejáveis são evitados e os conjugados resultantes de polímero retêm uma potência excepcionalmente elevada. Estas proteínas de ligação ao receptor que tenham um resíduo amino-terminal que é remota a partir de uma ou mais das suas regiões de ligação ao receptor ou domínios são aqui definidos como "N-terminal remoto" ou proteínas de ligação a receptor "RN"; que incluem todas as citoquinas ou antagonistas destas, que tenham o seu aminoácido amino-terminal localizado remotamente a partir do sítio de ligação ao receptor ou locais da proteína.
Em formas de conjugados são realização adicionais da invenção, os produzidos compreendendo um ou mais poli 31 (etileno-glicóis), covalentemente acoplados a citoquinas que têm sítios de glicosilação naturais que estão distantes de uma ou mais das suas regiões de ligação ao receptor ou domínios. Este subconjunto de proteínas de receptor de ligação é aqui referido como proteínas de ligação a receptor "RG". Quando um polímero hidrofílico ou anfifático é acoplado seletivamente em ou perto de uma tal local de "glicosilação remota", especialmente quando a proteína alvo está numa forma não glicosilada de uma proteína que é glicosilada naturalmente, o polímero pode imitar os efeitos favoráveis do hidrato de carbono de ocorrência natural, por exemplo, sobre a estabilidade de agregação e/ou solubilidade. Daí a ligação do polímero na ou perto de um local de glicosilação ser aqui referida como "pseudoglicosilação". Assim, a presente invenção proporciona métodos para a síntese de conjugados em que o local de acoplamento seletivo de um polímero sintético substitui eficazmente as de porções hidrato de carbono que ocorrem naturalmente. A pseudoglicosilação resultante contribui para a solubilidade melhorada, redução da agregação e libertação retardada da corrente sanguínea, em comparação com outras formas não glicosiladas da proteína. Esta abordagem, portanto, é particularmente vantajoso para a preparação de conjugados e composições de proteínas que são produzidas por tecnologia de ADN recombinante em células hospedeiras procarióticas (por exemplo, bactérias como a Escherichia coli) , uma vez que os organismos procariotas, geralmente, não glicosilam proteínas que eles expressam.
Analogamente, a PEGuilação seletiva da fracção de hidratos de carbono de uma glicoproteína pode resultar em "pseudohiperglicosilação" da glicoproteína. Este processo 32 foi descrito, por exemplo, por C. Bona et al., na WO 96/40731. Esta abordagem, portanto, é particularmente vantajosa para a preparação de conjugados e composições de proteínas que são produzidas por tecnologia de ADN recombinante em células hospedeiras eucarióticas (por exemplo, em leveduras, células vegetais e células animais (incluindo células de mamíferos e de insectos), uma vez que os organismos eucariotas em geral glicosilam as proteínas que expressam, se essas proteínas incluem os sinais de glicosilação que ocorrem naturalmente ou sinais de glicosilação introduzidos por tecnologia de ADN recombinante. Tais proteínas de receptor de ligação RG pseudoglicosiladas estão dentro do âmbito da presente invenção.
Assim, a invenção também abrange os conjugados de polímero de receptor de ligação a proteínas "RN", que retêm substancial, quase completa ou essencialmente completa atividade de ligação ao receptor, e receptor de ligação a proteínas "RG" pseudoglicosiladas, que retêm substancial, quase completa ou essencialmente completa atividade de ligação ao receptor. Tal como aqui utilizado, uma citoquina é dita "reter substancial, quase completa ou essencialmente completa atividade de ligação ao receptor", quando conjugada com um ou mais polímeros solúveis em água de acordo com a presente invenção, se a conjugação da citoquina não interfere substancialmente com a capacidade da proteína de se ligar ao seu receptor (s) , ou seja, se a taxa e/ou a quantidade de ligação da proteína conjugada ao seu receptor correspondente (s) não é inferior a cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60 %, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 33 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou cerca de 100% ou mais, da taxa de ligação e/ou a quantidade de uma forma não conjugada da proteina correspondente. Também estão incluidos dentro do âmbito da presente invenção os conjugados de polímero de tais proteínas de ligação ao receptor, que são classificados tanto como proteínas de ligação a receptor "RN" e "RG". Um exemplo das proteínas do último é o interferão beta (em particular o interferão-beta-lb).
Em realizações adicionais, a invenção proporciona métodos para a síntese de conjugados de polímero de receptor de proteínas de ligação que mantêm inesperadamente elevada atividade de ligação aos receptores em relação à de conjugados de polímero de a proteína de ligação ao receptor e na qual um ou mais polímeros são ligados de forma aleatória. A invenção também proporciona conjugados produzidos por tais métodos e composições compreendendo um ou mais destes conjugados da presente invenção, que pode compreender ainda um ou mais componentes adicionais ou reagentes, tais como um ou mais sais tampão, um ou mais excipientes de hidratos de carbono, um ou mais proteínas de transporte, uma ou mais enzimas, um ou mais detergentes, uma ou mais moléculas de ácido nucleico, um ou mais polímeros, tais como PEG não conjugado ou polialquileno glicol. A invenção também fornece kits que compreendem os conjugados e/ou composições da presente invenção. A invenção também fornece composições farmacêuticas ou veterinárias que compreendem os conjugados da presente invenção e pelo menos um excipiente ou veículo que é 34 aceitável para uso farmacêutico ou veterinário. A invenção também proporciona conjugados para utilização no tratamento ou prevenção de uma variedade de distúrbios físicos usando tais composições, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de um ou mais dos conjugados ou composições da presente invenção a um animal que sofre de, ou predisposição para uma doença ou condição física.
Além disso, a invenção proporciona receptores de ligação a proteínas estabilizados e métodos para a sua produção para o uso industrial, em cultura de células, por meio dos quais potências inesperadamente elevadas são obtidas como resultado dos efeitos combinados de retenção substancial de bioatividade e aumentou da duração da ação em uso industrial. As potências anormalmente elevadas de conjugados da presente invenção podem ser reflectidas na produção de biomassa invulgarmente elevada, níveis anormalmente elevados de expressão de proteínas recombinantes e outros melhoramentos na eficiência de bioprocessamento.
Em realizações adicionais, a invenção proporciona métodos alternativos para aumentar a potência biológica de uma preparação de interferão-beta, particularmente uma preparação de interferão-beta-lb. Métodos de acordo com este aspecto da invenção podem compreender, por exemplo, a remoção de um ou mais componentes de inibição de uma preparação de interferão-beta (ou do interferão-beta-lb). De acordo com este aspecto da invenção, um ou mais componentes de inibição pode ser removido a partir das preparações por uma variedade de métodos conhecidos na 35 técnica de processamento de proteínas e peptídeos, de purificação e/ou análise, incluindo um ou mais métodos cromatográficos tais como cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de fase invertida, cromatografia de interação hidrófoba e cromatografia de afinidade. Como uma questão prática, a determinação da potência biológica de uma dada preparação de interferão-beta (isto é, se a potência biológica é aumentada, diminuída ou não afectada, em relação a uma solução de reserva de uma citoquina, tais como o interferão-beta) pode ser realizada por qualquer número de ensaios in vitro ou em ensaios in vivo, que serão familiares para qualquer especialista na matéria. Por exemplo, pode ser utilizado um ensaio de cultura de células que respondem ao interferão-beta para determinar a potência biológica de preparações de interferão-beta. Exemplos de tais ensaios de cultura de células adequados incluem ensaios antiproliferativos, ensaios antivirais, ensaios de transdução de sinal de ativação de genes, exemplos dos quais são bem conhecidos dos vulgares peritos na técnica.
Em formas de realização relacionadas, a presente invenção proporciona também métodos para determinar a quantidade de um polímero que é ligado ao terminal amino de uma proteína com um resíduo serina N-terminal, de um conjugado de polímero-proteína sintetizada por alquilação redutiva. Métodos de acordo com este aspecto da invenção compreendem, por exemplo, (a) a reação do conjugado com uma quantidade suficiente de um agente oxidante durante um tempo suficiente para clivar o polímero a partir do resíduo de serina da proteína; e (b) medição do aumento na porção de proteína não conjugada na preparação. As proteínas adequadas para utilização de acordo com os referidos métodos incluem citoquinas (incluindo o interferão-beta (em 36 particular, o interferão-beta-lb, o qual tem preferivelmente a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 1) e o crescimento de megacariócitos e factor de desenvolvimento (Guerra, PI, et al., (1998) Pharm Res 15:1822-1827). 0 agente oxidante utilizado em tais métodos da presente invenção podem ser um periodato incluindo o metaperiodato de sódio, meta-periodato de potássio, meta-periodato de litio, periodato de cálcio, bário e periodato de ácido periódico. Os métodos adequados para a medição do aumento da porção de proteína não conjugada na preparação incluem qualquer variedade de métodos conhecidos na técnica de análise de proteínas e péptidos, incluindo, por exemplo, cromatografia de exclusão por tamanho, cromatografia de fase reversa, electroforese em gel, electroforese capilar, ultracentrifugação, dispersão de ultrafiltração, luz e espectroscopia de massa.
Em outras concretizações relacionadas, a invenção fornece métodos para a clivagem oxidativa seletiva de um resíduo de serina N-terminal de uma proteína bioativa, sem oxidar funcionalmente resíduos de aminoácidos essenciais da referida proteína bioativa. Tais métodos da presente invenção compreendem, por exemplo, (a) o ajustamento da concentração de iões de hidrogénio de uma solução da proteína bioativa para um pH de entre cerca de 5 e cerca de 10, mais preferivelmente um pH de entre cerca de 7 e cerca de 8; (b) misturar a solução da proteína bioativa com cerca de 0,1 moles a cerca de 10 moles, ou mais preferencialmente com cerca de 0,5 moles a cerca de 5 moles, de um periodato por mole de proteína bioativa; e (c) incubar a referida mistura pelo menos uma hora, de preferência a uma temperatura de entre cerca de 2°C e cerca de 40°C. As proteínas adequadas para utilização de acordo com os 37 referidos métodos incluem citoquinas (incluindo o interferão-beta (em particular, o interferão-beta-lb, o qual tem preferivelmente a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 1). Métodos
Os presentes inventores descobriram que a segmentação de polímeros para o aminoácido amino-terminal de uma proteína de ligação ao receptor "RN" ou para a vizinhança do local de glicosilação de uma proteína de ligação ao receptor "RG" garante que o polímero está ligado a um local que é remoto de uma ou mais das regiões de ligação ao receptor ou domínios da proteína, desse modo minimizando o impedimento estereoquímico da interação do receptor com as moléculas de polímero anexadas. Consequentemente, uma percentagem mais elevada da atividade de ligação ao receptor pode ser preservada por conjugação de proteínas de acordo com os métodos da presente invenção, do que ocorreria se o polímero fosse ligado dentro ou proximal a uma porção da molécula que estivesse envolvida na ligação ao seu receptor (s) . Este princípio, o que pode resultar na retenção inesperadamente elevada da atividade de ligação ao receptor, pode ser demonstrada por proteínas de receptor de ligação que são selecionadas de entre factor de crescimento de fibroblastos básico ("bFGF" ou "FGF-2"), factor de crescimento da epiderme ("EGF"), factor-1 de crescimento da insulina ("IGF-1"), interferão-alfa ( "IFN-alfa"), interferão-beta ("IFN-beta", incluindo o IFN-beta-lb), factor de estimulação de colónias de granulócitos- macrófagos ("GM-CSF"), factor estimulante de colónias de monócitos ("M-CSF"), factor de células estaminais ligando de Flt3 ("SCF") , interleucinas 2, 3, 4, 6, 10, 12, 13 e 15, factor de crescimento transformante beta ("TGF-beta"), 38 hormona de crescimento humana ("hGH"), prolactina, hormona lactogénica placentária, factor neurotrófico ciliar ("CNTF"), leptina e análogos estruturais destas proteínas de ligação ao receptor que imitam as ações destas proteínas ou que são antagonistas de receptores de ligação das mesmas. Em contraste, a ligação seletiva de um polimero grande para o terminal amino de IFN-gama não está previsto para preservar a maior parte da atividade desta citoquina, uma vez que tal acoplamento se espera que interfira com a ligação do dimero ativo aos seus receptores (com base em dados de Walter, MR, et al., (1995) Nature 376:230-235). A modificação amino-terminal de determinadas proteínas tem sido descrita previamente (ver, por exemplo, Dixon, HBF, (1984) J Protein Chem 3:99-108). Por exemplo, a modificação do N-terminal das proteínas tem sido relatado para estabilizar certas proteínas contra a ação de aminopeptidases (Guerra, PI, et al., supra), para melhorar a solubilidade da proteína (Hinds, K. et al., (2000)
Bioconjug Chem 11:195-201), para diminuir a carga sobre o grupo amino N-terminal, ou para melhorar a homogeneidade dos conjugados resultantes (Kinstler, O., et al. EP 822 199 A2; Kinstler, O., et al., (2002) Drug Deliv Rev Adv. 54:477-485), entre outros. Tem sido divulgado um método alternativo para o acoplamento de polímeros com o grupo alfa-amino de uma cisteína N-terminal ou um resíduo de histidina, por uma adaptação de um procedimento conhecido na técnica como "ligação química nativa", (Roberts, MJ, et al., WO 03/031581 A2 Pedido de Patente US 2003/0105224 Al) . No entanto, a existência de subclasses de proteínas de ligação ao receptor "RN" e "RG", os métodos geralmente aplicáveis para a seleção dos membros dessas classes, bem como a preparação e utilização de polímeros conjugados de 39 tais proteínas de ligação a receptores como uma maneira de preservar inesperadamente a atividade funcional elevada de receptor de proteínas de ligação "RN", não foi reconhecida ou descrita anteriormente.
Deste modo, existe uma vantagem para determinar se ou não de uma dada citoquina tem um local de N-terminal e/ou de glicosilação (s) que está afastado do local de ligação do receptor (s) do ligando. A capacidade de prever se uma dada citoquina é um ligando "RN" ou um "RG", antes da conjugação do ligante com um polímero, diminui substancialmente a experimentação necessária para produzir polímeros conjugados com um ligando (por exemplo, citoquinas ou antagonistas destes conjugados com polímeros, por exemplo, PEG), em que a antigenicidade e imunogenicidade do conjugado é reduzida em relação à antigenicidade e imunogenicidade do ligando não conjugado, apesar de não reduzir substancialmente as atividades de ligação ao receptor e fisiológicas do ligante conjugado.
Por conseguinte, em formas de realização adicionais, a presente invenção proporciona métodos para a identificação e seleção de ligandos do receptor da proteína de ligação (por exemplo, citoquinas e antagonistas das mesmas) que possuem um N-terminal e/ou local de glicosilação (s) que estão longe dos sítios de ligação do receptor dos ligandos de proteína (isto é, os métodos para identificação e seleção de proteínas "RN" ou "RG") . Em certas formas de realização da invenção, a localização óptima para a conjugação de um ou mais polímeros (por exemplo, um ou mais PEGs) pode ser determinada usando a modelagem molecular, 40 por exemplo, através da visualização da estrutura tridimensional da proteina (a citoquina ou um seu antagonista) utilizando o software de modelagem molecular para prever a localização em que um ou mais polímeros podem ser ligados à proteina sem uma perda substancial da atividade biológica ou de ligação ao receptor da proteina (ver também Schein, CH, supra). Uma abordagem semelhante tem sido demonstrada, por exemplo, para a conjugação de PEG a G-CSF, numa tentativa de melhorar a sua resistência à digestão proteolítica (ver publicação US 2001/0016191 AI de TD Osslund). Um software de modelagem molecular apropriado para o uso na presente invenção como o RASMOL (Sayle et al, supra) e outros programas utilizados para criar o banco de dados de estruturas macromoleculares depositado no Protein Data Bank (PDB; ver Laskowski, RA, supra), são bem conhecidos na técnica e serão familiares para os vulgares peritos na técnica. Utilizando um tal software de modelagem molecular, a estrutura tridimensional de um polipeptideo, por exemplo, uma citoquina ou um seu antagonista, pode ser prevista ou determinada com um elevado grau de confiança, com base em análises cristalográficas dos ligandos e seus receptores. Deste modo, um especialista pode facilmente determinar quais os ligandos que são ligandos "RN" ou "RG" apropriados para utilização de acordo com a presente invenção.
Para praticar a presente invenção, uma via conveniente para o acoplamento covalente de um polimero solúvel em água com o grupo alfa-amino do resíduo de aminoácido N-terminal amino de uma proteína é por alquilação redutora de bases de Schiff formada com polímeros tendo um único grupo aldeído, por exemplo, como alegado por G.P. Royer (Patente US 4002531), mas não como reivindicado por J.M. Harris, et 41 al., (Patente US 5252714), uma vez que os inventores afirmam que apenas polímeros derivatizados em ambas as extremidades com grupos aldeído, que são agentes de reticulação e, portanto, são inadequados para a síntese de longa ação dos receptores de ligação a proteínas, que retêm a atividade substancial de ligação ao receptor. A alquilação redutora de bases de Schiff de monoaldeídos de PEG em direção ao grupo alfa-amino do aminoácido N-terminal amino de uma proteína de ligação ao receptor e para longe dos grupos épsilon amino dos seus resíduos de lisina pode ser realizada por uma variedade de métodos, com base nas divulgações de J.T. Edsall nos capítulos 4 e 5 de Proteins Amino Acids and Peptides as Ions and Dipolar Ions ((1943), Reinhold Publishing Corporation, New York). A constante de dissociação ácida ("pKa") de um grupo alfa amino de um aminoácido N-terminal amino de um polipéptido deverá ser inferior a 7,6, enquanto os valores de pKa dos grupos épsilon amino dos resíduos de lisina em polipeptídeos devem ser de aproximadamente 9,5. Edsall ((1943, supra) indicou claramente que os aldeídos se combinam com o grupo amino de um aminoácido "apenas no lado alcalino do seu ponto isoeléctrico."
Por isso, com base na presente descrição e informação que está facilmente disponível na técnica, o perito na técnica irá reconhecer que (1) a reação seletiva dos aldeídos com o grupo alfa-amino de uma proteína será favorecida por uma gama de pH que é abaixo de 9,5 (aproximadamente o pKa dos grupos amino épsilon da proteína); (2) a taxa de reação dos aldeídos com os grupos amino épsilon diminuirá se o pH da 42 reação for reduzido para 7, 6 (aproximadamente o pKa do grupo alfa amino da proteína); (3) a velocidade de reação dos aldeidos com o grupo alfa-amino diminui menos do que a dos grupos épsilon amino quando o pH da reação é reduzido para 7,6; e (4) a seletividade para a reação de um aldeído com o grupo alfa-amino será um pouco melhorada por abaixamento do pH para 6,6. Uma vez que este valor é de cerca de uma unidade de pH abaixo do pKa do grupo amino alfa e três unidades de pH abaixo do pKa dos grupos amino épsilon, cerca de 10% dos grupos amino alfa e cerca de 0,1% dos grupos amino épsilon estarão no estado reativo, não protonado. Assim, a um pH 6,6, a fracção dos grupos amino alfa não protonada é 100 vezes maior do que a fracção dos grupos épsilon amino não protonados. Assim, será obtido muito pouco aumento na seletividade através da redução do pH da reação ulterior, por exemplo, para 5, 6, em que, teoricamente, a 1% dos grupos amino alfa e 0,01% dos grupos amino épsilon estariam no seu estado reativo, não protonado. Assim, em certas formas de realização da invenção, os ligandos de proteína (especialmente os ligandos "RN" ou "RG", incluindo citoquinas e antagonistas das mesmas) são conjugados com um ou mais polímeros para formar uma mistura entre o ligante (s) e um ou mais polímeros reativos a um pH de cerca de 5,6 a cerca de 7,6; a um pH de cerca de 5,6 a cerca de 7,0; a um pH de cerca de 6,0 a cerca de 7,0; a um pH de cerca de 6,5 a cerca de 7,0; a um pH de cerca de 6,6 a cerca 7,6; a um pH de cerca de 6,6 a cerca de 7,0, ou a um pH de cerca de 6,6. Os métodos da presente invenção, portanto, diferem significativamente daqueles conhecidos na técnica, em que o acoplamento de polímeros com grupos alfa amino no N-terminal de resíduos de aminoácidos de ligandos é levada a cabo a um pH de cerca de 5 (Kinstler, O., et al. , (2002) supra; EP 0 822 199 A2; 43
Patentes US 5824784 e 5985265; Roberts, MJ, et al, (2002), supra; Delgado, C., et al., Pedido US 2002/0127244 Al), enquanto o acoplamento de polímeros para os grupos amino épsilon de resíduos de lisina na cadeia principal do ligando polipeptídeo é realizada a um pH de 8,0 (Kinstler, O., et al., EP 0 822 199 A2; Patentes US 5824784 e 5985265). Da mesma forma, os métodos da presente invenção também são significativamente diferentes dos métodos enzimáticos que têm sido utilizados para o acoplamento de derivados de alquilamina de poli (etileno glicol) para certas proteínas utilizando transglutaminase, que é levada a cabo a um pH de 7,5 (Sato, H., (2002) Drug Deliv Rev Adv. 54:487) .
Redução das bases de Schiff resultantes com agentes redutores suaves, tais como cianoboro-hidreto de sódio ou complexo borano-piridina (Cabacungan, JC, et ai., (1982) Anal Biochem 124:272-278), forma ligações de amina secundária que preservam a carga positiva do grupo alfa amino N-terminal da proteína a um pH fisiológico. Tais ligações que retêm a mesma carga que a proteína nativa, são mais susceptíveis de conservar a sua atividade biológica que os produtos químicos de ligação alternativos que neutralizam a carga, por exemplo, através da formação de ligações amida (Burg, J., et al., WO 02/49673 A2; Kinstler, O., et al, Pedido EP 0 822 199 A2; Kinstler, O., et al., (1996) Pharm Res, 13:996-1002; Kita, Y., et al, supra) ou ligações de uretano (Gilbert, CW et al., Patente US 6042822; Grace, M., et al., (2001) J Cytokine Interferon
Res. 21:1103-1115; Youngster, S., et al., (2002) Curr
Pharm Des 8:2139-2157). 44
Abordagens alternativas para o acoplamento seletivo de polímeros para N-terminais de resíduos de aminoácidos são conhecidas dos peritos na técnica. Incluídos estão os métodos para o acoplamento de hidrazida, hidrazina semicarbazida, amina ou outros polímeros contendo a extremidade N-terminal de serina ou treonina, que tenham sido clivados oxidativamente para aldeídos com periodato (Dixon, HBF, supra; Geoghegan, KF, Patente US 5362852; Gaertner, HF, et al., (1996) Bioconjug Chem 7:38-44;
Drummond, RJ, et al., Patente US 6423685).
Polímeros adequados
Em certas formas de realização da invenção, é desejável minimizar a formação de ligações cruzadas intramoleculares e intermoleculares por polímeros tais como PEG, durante a reação em que o polímero é acoplado ao componente bioativo para produzir os conjugados da presente invenção. Isto pode ser conseguido pela utilização de polímeros que são ativados em apenas uma extremidade (aqui referidos como "PEGs monofuncionalmente ativados" ou "PAGs monofuncionalmente ativados") ou preparações de polímeros em que a percentagem de bifuncionalmente ativados (referidos, no caso de PEGs lineares como "dióis de PEG bis-ativados") ou polímeros multi-funcionalmente ativados é inferior a cerca de 30%, ou mais preferivelmente menor do que cerca de 10% ou mais preferivelmente menos do que cerca de 2% (p/p) . A utilização de polímeros ativados que são totalmente ou quase totalmente monofuncionais pode minimizar a formação de todos os seguintes: ligações cruzadas intramoleculares no interior de moléculas individuais de proteínas, estruturas "haltere", em que uma cadeia do polímero se liga a duas moléculas de proteína, e os agregados maiores ou géis. 45
As formas ativadas de polímeros que são adequadas para utilização nos métodos e composições da presente invenção podem incluir quaisquer formas lineares ou ramificadas, mono funcionalmente ativado de polímeros, que são conhecidos na técnica. Por exemplo, estão incluídos aqueles com pesos moleculares (excluindo a massa do qrupo de ativação) na gama de cerca de 1 kDa a cerca de 100 kDa. Intervalos adequados de pesos moleculares incluem cerca de 5 kDa a cerca de 30 kDa, cerca de 8 kDa e cerca de 14 kDa, cerca de 10 kDa a cerca de 20 kDa, cerca de 18 kDa a cerca de 60 kDa, cerca de 18 kDa a cerca de 22 kDa; cerca de 12 kDa a cerca de 30 kDa, cerca de 5 kDa, cerca de 10 kDa, cerca de 20 kDa ou cerca de 30 kDa. No caso dos PEGs lineares, pesos moleculares de cerca de 10 kDa, cerca de 20 kDa ou cerca de 30 kDa correspondentes a graus de polimerização (n) de cerca de 230, cerca de 450 ou cerca de 680 unidades monoméricas de óxido de etileno, respectivamente. Deve notar-se que, muito antes da existência das classes de receptores de proteínas de ligação "RN" e "RG" serem reconhecidas, as vantagens do acoplamento de proteínas terapêuticas para polímeros com pesos moleculares relativamente elevados (isto é,> 20-30 kDa) foram divulgadas pela primeira vez (Saifer, M. , et al., WO 89/01033 Al, publicado 9 de fevereiro de 1989) .
Em outras formas de realização da invenção, os conjugados de proteínas de ligação a receptores com percentagens anormalmente elevadas de bioatividade retidas podem ser preparados para utilização in vitro, por exemplo, em cultura de células, por acoplamento de polímeros monofuncionalmente ativados de cerca de 1 kDa, cerca de 2 kDa e cerca de 5 kDa, de acordo com os métodos da presente 46 invenção. Para tais aplicações in vitro, esta baixa gama de pesos moleculares podem ser preferidos.
Opcionalmente, um polímero linear pode ter um grupo reativo numa extremidade ou em ambas as extremidades, criando assim um "polímero reativo". Em certas formas de realização da presente invenção, pode ser desejável usar o éster de N-hidroxi-succinimidilo do derivado de ácido monopropiónico de PEG, como divulgado em JM Harris, et al., Patente US 5672662 ou outros PEG de ácidos monocarboxílicos ativados de N-hidroxi-succinimida. Em outras formas de realização, pode ser desejável a utilização tanto dos derivados de carbonato de monosuccinimidil de PEG ("SC-PEG"), como descrito em Saifer M., et al., Patentes US 5006333; 5080891; 5283317 e 5468478, ou o derivado de carbonato de mono-p-nitrofenil de PEG, como divulgado em SJ Kelly, et al, supra, em LD Williams, et al., WO 00/07629 A2, LD Williams, et al. , Patente US 6576235 e em MR Sherman, et al., WO 01/59078 A2. Além disso, outros tipos de grupos reativos podem ser utilizados para sintetizar conjugados de polímeros de proteínas. Estes derivados incluem derivados de PEGs monoaldeídos (Royer, GP, Patente US 4002531; Harris, JM, et al., Patente US 5252714), monoamina, carbonato de mono-tribromofenil, monocarbonilimidazole, mono-triclorofenil carbonato, carbonato de mono-trifluorofenilo, monohidrazida, monohidrazina, monosemicarbazida, monocarbazate, monotiosemicarbazida, monoiodoacetamida, monomateimida, mono-ortopiridil dissulfureto, mono-oxima, mono-fenilglioxal, mono-tiazolidina-2-tiona, monotioester, monotiol, monotriazina monovinilsulfona e derivados de PEG. Em formas de realização adicionais, citoquinas, quimiocinas, factores de crescimento, hormonas polipeptídicas e antagonistas das 47 mesmas podem ser acopladas a um ou mais polímeros, tal como descrito em propriedade comum, no Pedido US co-pendente 10/669, 597.
Componentes bioativos
Como notado acima, os conjugados da presente invenção compreendem um PAG ou PAO, e particularmente uma cadeia de PEG, covalentemente ligado a um ou mais componentes bioativos. Componentes bioativos aos quais um ou mais polímeros (ou cadeias dos mesmos) têm sido ligados de forma covalente são aqui referidos variadamente e equivalentemente, como "componentes bioativos conjugados" ou "componentes bioativos modificados". Estes termos devem ser distinguidos aqui de " componentes bioativos não conjugados", "componentes bioativos iniciais" ou "componentes bioativos não-modificados", todos os termos se referem a componentes bioativos que não tiveram polímeros ligados de forma covalente a estes. É para ser entendido, contudo, que um componente bioativo "não conjugado", "não modificado" ou "inicial" pode conter outras conjugações ou modificações não poliméricas em relação a uma molécula de tipo selvagem ou nativa, mas que ainda assim ser considerado "não conjugado", "não modificado" ou "inicial" de acordo com a presente invenção, uma vez que o componente bioativo seria "não conjugado", "não modificado" ou "inicial" no que diz respeito à ligação de polímeros, como é o caso de componentes bioativos que são aqui referidos como "PEGuilado Mock". O termo "estabilizante" de um componente bioativo (ou "métodos de estabilização" ou "componente bioativa 48 estabilizada") indica que um componente bioativo foi estabilizado de acordo com os métodos da presente invenção (isto é, um componente bioativo ao qual um polímero foi covalentemente liqado de acordo com os métodos da invenção). Tais componentes bioativos estabilizados irão exibir certas características bioquímicas e biofísicas alteradas quando comparado com um componente bioativo que não tenha sido estabilizado (isto é, um componente bioativo ao qual um polímero não tenha sido ligado de forma covalente). Incluídos entre tais parâmetros bioquímicos e biofísicos alterados, em especial para as proteínas de ligação ao receptor, em que pode ser reduzida a susceptibilidade à degradação proteolítica e, em particular a manutenção da atividade de uma proteína de ligação ao receptor durante a incubação, sob certas condições ambientais ou experimentais adversas. Em certas formas de realização da invenção, os parâmetros bioquímicos e biofísicos alterados podem incluir, por exemplo, um aumento da semi-vida na circulação in vivo, biodisponibilidade aumentada, aumento da duração da ação in vitro.
Qualquer proteína de ligação ao receptor (normalmente, uma citoquina) possuindo atividade (isto é, fisiológica, bioquímica ou farmacêutic) biológica associada com porções da molécula que estão distantes da sua extremidade amino ou a partir de um local de glicosilação de ocorrência natural ou mutacionalmente introduzida pode ser adequadamente usado como componente inicial na presente invenção. Tais componentes bioativos incluem péptidos, polipeptídeos, proteínas. Componentes bioativos também incluem fragmentos, muteinas e derivados de tais péptidos, polipeptídeos, proteínas, particularmente tais fragmentos, 49 fisiológica muteínas e derivados com atividade (isto é bioquímica ou farmacêutica) biológica.
Peptídeos adequados, polipeptídeos e proteínas, glicoproteínas, que são úteis como componentes bioativos na presente invenção incluem qualquer péptido, polipeptídeo ou proteína, etc., tendo um ou mais de um grupo amino disponível, o grupo tiol ou outro grupo que é afastado do receptor região de ligação ou regiões do componente bioativo e em que os polímeros podem ser seletivamente ligados. Tais péptidos, polipeptídeos, proteínas, glicoproteínas incluem citoquinas, que podem ter qualquer uma de uma variedade de estruturas (Nicola, NA, supra; Schein, CH, supra).
Por exemplo, péptidos adequados, polipeptídeos e proteínas de interesse incluem a classe de citoquinas que possuem estruturas que compreendem quatro feixes helicoidais cx (subclasses tanto de cadeia longa e de cadeia curta) (para revisão, ver Schein, CH, supra) . Uma variedade de tais proteínas de quatro feixes helicoidais é adequada para utilização na presente invenção, incluindo as interleucinas, por exemplo, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 (subunidade p35), IL-13, IL-15 e IL-17; fatores estimuladores de colónias, por exemplo, do factor de estimulação de colónias de macrófagos (M-CSF) e de factor de estimulação de colónias macrófagos granulócitos (GM-CSF); Rozwarski, DA, et al., (1996) Proteins 26:304-313); interferões, por exemplo, IFN-α, IFN-β (incluindo IFN-β lb) e IFN de consenso; factor de inibição de leucemia (LIF); eritropoietina (Epo); 50 trombopoietina (ΤΡΟ); crescimento de megacariócitos e factor de desenvolvimento (MGDF); factor de células estaminais (SCF), também conhecida na arte como factor de Steel (Morrissey, PJ, et al., (1994) Cell Immunol 157:118-131; McNiece, IK, et al., (1995) J Leukoc Biol 58:14-22); oncostatina M (OSM); activador de proteina fosfolipase (PLAP); factores neurotróficos; e peptideos miméticos destes. Embora a prolactina e a hormona de crescimento sejam hormonas clássicas, que circulam amplamente no corpo, ao contrário das citoquinas, que são geralmente produzidas perto das suas células alvo, a prolactina e a hormona de crescimento pertence à mesma classe estrutural tal como as citocinas com quatro feixes helicoidais α (Nicola, NA, supra, Goffin, V., et al, supra) e que são alvos semelhantes adequados para o acoplamento do polímero e para a produção dos conjugados em consideração, de acordo com a presente invenção.
Finalmente, apesar de alguns anticorpos funcionarem como receptor de ligação de agonistas ou antagonistas (ver, por exemplo, Morris, JC, et al, (2000) Ann Rheum Dis 59 (Suppl I) : I109-H14), tais imunoglobulinas não são candidatos adequados para o acoplamento do polímero N-terminal dentro do âmbito da presente invenção, isto é, não são proteínas de ligação ao receptor RN, uma vez que as regiões amino-terminal tanto de cadeias leves e pesadas participam no reconhecimento do antigénio.
De particular utilidade como componentes bioativos para utilização na preparação dos conjugados de polímeros da presente invenção é o interferão-beta. Também de uso 51 particular são muteínas e fragmentos de tais componentes bioativos, particularmente aquelas capazes de se ligar aos receptores para o polipeptídeo de tipo selvagem ou intacto correspondente, quer ou não esta ligação induza um efeito biológico ou fisiológico. Em certas formas de realização, as muteinas e fragmentos, dos componentes bioativos podem atuar como antagonistas dos receptores para os ligandos correspondentes, o que reduz, substancialmente reduz ou inibe a ligação dos ligandos aos seus receptores e/ou a atividade dos ligandos sobre as células-alvo, tecidos e/ou organismos. Outros antagonistas, os quais podem ou não podem ser análogos estruturais, muteinas, variantes ou derivados de ligandos de interesse, são também adequados para a preparação dos conjugados de acordo com a presente invenção. Como um assunto prático, pode ser determinada com ou sem uma dada muteina, fragmento, variante, derivado ou antagonista antagoniza os efeitos biológicos e/ou fisiológicos de um dado ligando, sem experimentação indevida, utilizando ensaios para os efeitos biológicos/fisiológicos do ligando, uma grande variedade dos quais são bem conhecidos na técnica e/ou descritas aqui.
As estruturas (primária, secundária, terciária e, quando aplicável, quaternária) para estes e outros polipeptídeos de interesse que são vantajosamente utilizadas de acordo com a presente invenção são bem conhecidos na técnica e serão familiares para um perito, particularmente tendo em vista as estruturas aqui proporcionadas e nas referências aqui citadas. 52
Conjugados A presente invenção proporciona conjugados estáveis de componentes bioativos, particularmente de citoquinas, para utilização numa variedade de aplicações. Tais conjugados da invenção têm um número de vantagens em relação aos anteriormente conhecidos na técnica, tal como mostrado pelas seguintes comparações exemplares de conjugados conhecidos. H. Hiratani (Patente Europeia EP 0 098 110 BI e Patente US 4609546) descreve conjugados de copolímeros de óxido de etileno e óxido de propileno ("PEG-PPG", um membro de uma classe genérica de PAGs) com proteínas, incluindo os interferões e interleucinas, em que é divulgado que não há preferência para evitar regiões das proteínas envolvidas na ligação ao receptor. Nestas referências, os interferões alfa, beta e gama foram considerados equivalentes para os objectivos de acoplamento de PAG, ao contrário da presente invenção em que o interferão-gama não é considerado para ser um alvo adequado para o acoplamento N-terminal, pois o terminal amino encontra-se dentro da região de ligação ao receptor desta citoquina. Além disso, Hiratani revela conjugados sintetizados apenas com PAGs de 1 kDa a 10 kDa, enquanto os métodos da presente invenção preferem o acoplamento de polímeros sintéticos solúveis em água, com peso molecular superior a 10 kDa para aplicações terapêuticas. Analogamente, NV Katre ((1990) supra) revela que o acoplamento de um número maior de cadeias de mPEG de 5 kDa para a interleucina-2 recombinante humana aumenta os tempos de vida dos conjugados resultantes nas correntes sanguíneas de ratos e coelhos. No entanto, esta referência não divulga ou reconhece a vantagem do acoplamento de um 53 número menor de cadeias mais longas de PEG ou de acoplamento de uma cadeia simples de PEG de elevado peso molecular para o terminal amino de IL-2. G. Shaw (Patente US 4904584 e WO 89/05824 A2) revela métodos para a indução seletiva no local de fixação de polímeros amina reativos através da introdução, substituição ou eliminação de resíduos de lisina na proteína alvo, especialmente Epo, G-CSF e IL-2. No entanto, ao contrário da divulgação da presente invenção, estas referências não revelam que os polímeros de amina reativos podem reagir com qualquer amina na proteína alvo que não sejam os grupos épsilon amino de resíduos de lisina, distinguindo claramente estas revelações da presente invenção. D.E. Nitecki et al., (Patente US 4902502) divulga múltiplos conjugados de IL-2 PEGuilado que foram preparados a partir de derivados de cloroformato de PEG diferentes que foram destinados a reagir com os grupos épsilon amino de resíduos de lisina. Em contraste com os métodos da presente invenção, no entanto, esta referência não revela nenhum método para evitar a PEGuilação de resíduos de lisina em regiões da proteína IL-2, que estão envolvidos na ligação ao receptor, nem qualquer percepção que o evitamento de tais locais é vantajoso.
Katre N., et al., (Patente US 5206344) descrevem conjugados de PEG-IL-2 em que o PEG é acoplado aos grupos épsilon amino de resíduos de lisina, ao grupo sulfidrilo 54 desemparelhado do resíduo de cisteína de ocorrência natural na posição 125 (a contar a partir do terminal amino), ou com o grupo sulfidrilo de um resíduo de cisteína que tenha sido mutacionalmente introduzido entre o primeiro e o vigésimo resíduo a partir do terminal amino de IL-2. Incluída entre as muteínas que são divulgadas na patente '344 é "des-ala-1" IL-2, ou seja, uma muteína em que a alanina amino-terminal é eliminada e não PEGuilada. Em contraste com a presente divulgação, no entanto, a patente '344 não descreve qualquer método para evitar o acoplamento de PEG a resíduos de aminoácidos que estão envolvidos na ligação aos receptores, ou qualquer reconhecimento de que uma tal abordagem seria vantajosa. Consistente com esta noção, e em contraste com a presente invenção, uma vasta gama de pontos de fixação propostos na patente '344 não sugere que o acoplamento de PEG com o terminal amino de IL-2 seja especialmente vantajoso. S.P. Monkarsh et al., (1997) Anal Biochem 247:434-440 e S.P. Monkarsh, et al, (1997) em Harris, JM, et al, eds, poly (ethylene glycol): Chemistry and Biological Applications, pp.207-216, American Chemical Society, Washington, DC, revelam que a reação do interferão alfa-2a com um excesso de três vezes molar de um PEG ativado com um peso molecular de 5300 Daltons produz 11 isómeros posicionais de interferão monoPEG, que correspondem aos 11 resíduos de lisina no interferão-alfa-2a. Foi relatado que o interferão PEG, em que o PEG é acoplado ao grupo alfa-amino no terminal amino do interferão. Os isómeros de posição 11 relataram nestas referências indicadas as atividades antivirais em culturas de células que variaram de 6% a 40% do que a do interferão não modificado e antiproliferativa em culturas de células, que variavam 55 entre 9% e 29% do que a do interferão não modificado. Estes resultados demonstram claramente que a peguilação aleatória de residuos de lisina praticada por estes investigadores interfere com as funções do interferão alfa-2a mediada pelos seus receptores, em contraste com os conjugados preparados pelos métodos da presente invenção. Além disso, ao contrário, dos conjugados da presente invenção, não existia o interferão peguilado no terminal-N nos conjugados relatados nestas referências. 0. Nishimura et al. , (Patente US H1662) revela conjugados de interferão-alfa, interferon-gama e IL-2, que são preparados por alquilação redutiva de "aldeidos de polietileno glicol metil éter" ativados, com cianoboro-hidreto de sódio a pH 7,0 (para os conjugados de interferão) ou pH 7,15 (para os conjugados de IL- 2). Os conjugados preparados por tais métodos, no entanto, foram reportados como tendo perdido até 95% da bioatividade das proteínas não modificadas, aparentemente devido à presença de múltiplos locais de ligação de polímero, os quais foram referidos como os grupos amino épsilon de resíduos de lisina. DK Pettit et al., (1997) J Biol Chem 272:2312-2318, divulga conjugados de polímeros de interleucina-15 ("IL-15"). 0 conjugado IL-15 relatado nesta referência, contudo, não só perde a sua capacidade de promoção do crescimento de IL-2 como resultado do acoplamento a polímeros de resíduos de lisina em regiões da proteína que estão envolvidas na ligação ao receptor, mas também mostrou antagonismo em vez de agonismo. Estes autores concluem que a inibição 56 seletiva da ligação da IL-15 a um dos vários receptores de superfície de células pode ser uma consequência da conjugação do polímero e que tal inibição pode não apenas diminuir a ligação ao receptor, mas pode reverter o efeito biológico da proteína. Ao evitar o acoplamento de polímeros a porções da proteína de ligação aos receptores que estão envolvidos nas interações com os seus receptores, a presente invenção evita este resultado indesejável de acoplamento do polímero. J. Hakimi et al., (Patentes US 5792834 e 5834594) divulga conjugados de PEG de proteínas ligados por uretano, incluindo o interferão-alfa, IL-2, interleucina-1 ("IL-1") e um antagonista do receptor IL-1, os quais foram supostamente preparados a fim de diminuir a imunogenicidade, aumentar a solubilidade e aumentar a semi-vida biológica das proteínas respectivas. Nestas referências, o PEG foi acoplado a "vários grupos amino livres", sem nenhuma referência a N-terminal e PEGuilação e nenhuma divulgação de que os grupos N-terminais alfa amino possam ou devam ser ligados a PEG. Estas patentes também afirmam que o conjugado aí revelado "tem pelo menos uma parte" da atividade biológica original da proteína de partida, indicando a possível perda de bioatividade substancial. Este resultado seria consistente com a utilização dos métodos de ligação a PEG não-alvo divulgadas no mesmo. Em contraste com a presente invenção, estas patentes não revelam qualquer tentativa para melhorar a retenção da bioatividade dos seus conjugados, alterando a seletividade dos processos de peguilação aqui revelados. 57 OB Kinstler et al., (Pedido de Patente Europeia EP 0 822 199 A2) descreve um processo para a reação de poli (etileno-glicol), com o grupo alfa-amino do aminoácido no terminal amino de um polipeptideo, especialmente o interferão de consenso e G-CSF, que são as duas proteínas fabricadas por Amgen, Inc., o cessionário do presente pedido de patente. Esta publicação indica que "um pH suficientemente ácido para ativar seletivamente o grupo alfa-amino" é uma característica necessária do processo divulgado. Em contraste, na presente invenção descobriu-se que a diminuição do pH reduz a reatividade dos grupos amino com aldeídos de PEG e que o grupo alfa-amino é mais reativo quando não está protonado, isto é, a um pH acima do seu pKa. Assim, os presentes inventores descobrir que nenhum pH é "suficientemente ácido para ativar seletivamente o grupo alfa-amino" de qualquer dos conjugados de citoquinas RN da presente invenção. As explicações sobre a dependência do pH da reatividade dos grupos N-terminais alfa amino com aldeídos dados por JT Edsall (supra) e por RS Larsen et al., ((2001) Bioconjug Chem 12 :861-869), são mais compatíveis com o experiência dos inventores da presente invenção. Além disso, Kinstler et al. relata o uso de N-terminal para a peguilação de polipéptidos para aumentar a homogeneidade dos conjugados resultantes e de proteção do grupo amino terminal a partir da degradação por proteases, mas não divulga que a PEGuilação do N-terminal pode preservar uma maior fracção da ligação ao receptor de atividade de ligação a proteínas de receptores específicos (ver, por exemplo, WO 96/11953; Patente Europeia EP 0 733 067 Bl, e Patentes US 5770577, 5824784 e 5985265, todos de Kinstler, OB, et al.). 58 0 pedido europeu de Kinstler et al. (EP 0 822 199 A2) também generaliza os benefícios da PEGuilação do N-terminal de todos os polipeptideos, o que não tem sido a experiência dos inventores da presente invenção. Especificamente, uma vez que os terminais amino de moléculas de anticorpos ocorrem com a combinação da região proximal com antigénio de proteínas de anticorpos (Chapman, AP (2002) Adv Drug Deliv Rev 54:531-545), a PEGuilação de N-terminais de anticorpos é inesperadamente deletério para a bioatividade, comparativamente à PEGuilação aleatória de residuos de lisina, tal como divulgado por Larsen, RS, et al. , supra. Do mesmo modo a PEGuilação N-terminal do receptor de proteínas de ligação que não são receptor de proteínas de ligação "RN", por exemplo, o interferão-gama, espera-se que seja mais inibidora das interações com os receptores que a PEGuilação aleatória dos residuos de lisina de tais proteínas de ligação a receptor.
Assim, como referido acima, os métodos da presente invenção distinguem-se daqueles descritos por Kinstler et al. Nas publicações aqui citadas, em que os conjugados da presente invenção são preparados por conjugação de uma ou mais citoquinas ou seus antagonistas que são selecionados como receptor de ligação de proteínas RN com um ou mais polímeros de formação de uma mistura entre o ligante (s) e um ou mais polímeros com um pH de cerca de 5,6 a cerca de 7,6; a um pH de cerca de 5,6 a cerca de 7,0 a um pH; de cerca de 6,0 a cerca de 7,0; com um pH de cerca de 6,5 a cerca de 7,0; com um pH de cerca de 6,6 a cerca de 7,6; com um pH de cerca de 6,6 a cerca de 7,0, ou a um pH de cerca de 6,6. Em contraste, os métodos de Kinstler et al. dependem de conjugação de ligandos a um pH abaixo de 5,5, variação de pH que os presentes inventores verificaram ser 59 sub-ótima ou inferior para a preparação de preparações de ligandos conjugados com polímeros seletivamente a distância N-terminal de aminoácidos e/ou nos locais de glicosilaçao remotos.
Pepinsky, B., et al., (WO 00/23114 e Pedido de Patente US 2003/0021765 Al) revelam conjugados de polímero de interferão-beta-la glicosilado, que são mais ativos do que o interferão-beta-lb não glicosilado, num ensaio antiviral. Quando Pepinsky et al. acopla mPEG de 5 kDa ou de 20 kDa do terminal amino de IFN-β-Ι por alquilação redutora, nenhum efeito de PEGuilação sobre a potência antiviral foi observada, ao passo que o acoplamento de PEG de peso molecular mais elevado reduziu ou eliminou a potência. Esta referência também divulga que o polialquileno-glicol pode ser acoplado ao interferão-beta-la por meio de uma variedade de grupos de acoplamento em vários locais, incluindo o terminal amino, o terminal carboxilo e a porção hidrato de carbono da proteína glicosilada. Os métodos descritos nesta publicação, no entanto, são demonstrados não ser generalizados: "estes estudos indicam que, apesar da conservação na sequência entre o interferão-beta-la e o interferão-beta-lb, eles são entidades bioquímicas distintas e, portanto, muito do que se sabe acerca do interferão-beta-lb pode não ser aplicado ao interferão-beta-la, e vice-versa Em contraste, a presente invenção descreve as características comuns incorporadas em proteínas de ligação de receptor "RN" e "RG", como aqui definido. De acordo com a presente invenção, tanto o interferão-beta-la e o interferão-beta-lb são proteínas de ligação a receptor "RN". Além disso, o interferão-beta-lb é uma proteína de ligação ao receptor "RG". Por conseguinte, em contraste com os métodos da WO 00/23114, os 60 métodos da presente invenção são úteis para a preparação de conjugados bioativos estáveis, tanto de interferão-beta-lb como de interferão-beta-la.
Wei Z., et al., (Patente US 6077939), descreve métodos para acoplar polímeros solúveis em água (especialmente PEG) para o átomo de carbono alfa N-terminal de um polipeptideo (especialmente eritropoietina), em que a amina no carbono alfa do ácido N-terminal amino é primeiro transaminado a um grupo alfa carbonilo que é depois feito reagir com um derivado de PEG para formar uma oxima ou uma ponte de hidrazona. Dado que o objectivo da divulgação da presente referência foi o de desenvolver um método que seja aplicável a proteínas em geral, não foram consideradas para a preservação da atividade de ligação ao receptor, que pode resultar da escolha do terminal amino como o local de ligação a PEG de certas proteínas de ligação do receptor. Assim, em contraste com a divulgação de Wei et al., a presente invenção não requer a remoção do grupo alfa amino N-terminal, mas, em contraste, pode preservar a carga do grupo alfa amino N-terminal de pH menos neutro, através da formação de uma ligação amina secundária entre a proteina e o polímero. CW Gilbert et al., (Patente US 6042822; Patente Europeia EP 1 039 922 Bl) descrevem a conveniência de uma mistura de isómeros posicionais de interferão alfa-2b de PEG em que um especialmente desejável isómero é de PEG ligado a um resíduo de histidina do interferão alfa-2b, especialmente histidina-34, e demonstra que a ligação de PEG à histidina -34 é instável. Uma vez que a histidina-34 está na 61 superfície do interferão-alfa-2b, numa região que pode entrar em contacto íntimo com um receptor do interferão, a fim de desencadear a transdução de sinal, a instabilidade da ligação entre o PEG e a histidina-34 divulgada nestas referências parece ser essencial para a função do conjugado de PEG-interferão aí revelada. Proteínas substancialmente puras de histidina ligadas aos conjugados de polímero foram descritas por S. Lee et al., Patente US 5985263. Em contraste, a presente invenção demonstra que um conjugado preferido é um conjugado de PEG-interferão, em que o PEG está ligado de forma estável a um local que se encontra afastado dos domínios de ligação ao receptor do interferão componente. P. Bailon et al., ((2001) Bioconjug Chem 12:195-202), revela que o interferão-alfa-2a, que é ligada a PEG com uma molécula de 40-kDa de di-mPEG-lisina por molécula de interferão é composta de quatro isómeros posicionais principais. Esta referência revela que quase todo o PEG foi ligado por ligações amida de lisinas 31, 121, 131 ou 134, cada um dos quais está dentro ou adjacente aos domínios de ligação ao receptor do interferão alfa-2a (resíduos 29-35 e 123 -140, de acordo com Bailon et al.). A PEGuilação do N-terminal não foi relatada por Bailon et al. A atividade antiviral isolada da mistura de isómeros posicionais de PEG-interferão contra a infecção por Vírus da Estomatite Vesicular de Madin-Darby de células de rim de bovino in vitro foi relatado como sendo de 7% da do interferão alfa-2a não conjugado, que foi testado. A perda substancial de bioatividade, que foi observada para estes conjugados de PEG-interferão que não inclui a PEGuilação do N-terminal do interferão distingue, assim, claramente os conjugados da Bailon et al. dos da presente invenção. 62 RB Pepinsky et al., ((2001) J Pharmacol Exp Ther 297:1059-1066), descrevem a síntese de um conjugado de (1) interferão-beta-la glicosilado tendo um resíduo de metionina N-terminal e (2) um aldeído PEG de 20-kDa. O conjugado, que é referido na referência como sendo mono-peguilado no terminal-N de metionina, é dito reter a bioatividade completa num ensaio antiviral. Embora estes autores descrevam que a escolha do local de N-terminal para a peguilação do interferão-beta-la glicosilado foi ditada pela disponibilidade de reagentes de peguilação seletiva local e de modelação molecular, que reconhece que "alguns efeitos são específicos ao produto". Além disso, e em contraste com a presente invenção, as observações descritas aí não foram generalizadas de modo a incluir a classe de proteínas de ligação do receptor que são aqui definidas como proteínas de ligação a receptor "RN". J. Burg, et al., (WO 01/02017 A2) descreve a produção de conjugados de alcoxiPEG glicoproteína eritropoietina, em que uma a três cadeias de um metoxiPEG foi/foram feitos reagir com os grupos sulfidrilo, que foram introduzidos através da modificação química dos grupos épsilon amino de resíduos de lisina na superfície da glicoproteína. Em contraste com a presente invenção, no entanto, esta referência não descreve qualquer tentativa de acoplar o PEG ao grupo alfa amino livre do aminoácido N-terminal amino da eritropoietina ou para evitar a modificação de resíduos de lisina em regiões da glicoproteína eritropoietina que são essenciais para interações com receptores de eritropoietina. 63 J. Burg, et al., (WO 02/49673 A2) descreve a síntese de conjugados de PEG ligados ao N-terminal amida da glicoproteína eritropoietina naturais e muteína por um processo que emprega seletivamente clivagens de extensões de terminal-N de peptídeos que são clivados, antes da PEGuilação e depois da citraconilação reversível de todos os grupos épsilon amino de resíduos de lisina da glicoproteína. A lógica divulgada para o processo de vários passos nesta referência era tornar o processo de PEGuilação seletiva para o grupo alfa amino livre do aminoácido N-terminal amino, a fim de produzir conjugados mono-pegilados homogéneos, evitando assim a necessidade de separar os conjugados mono-peguilados dos derivados peguilhados múltiplos. Este método difere da presente invenção em vários aspectos importantes, incluindo: (1) a abordagem de Burg et al. limita-se a glicoproteínas de eritropoietina às quais o alcoxiPEG está ligado através de ligações de amida, enquanto a presente invenção é aplicável a um variedade de componentes bioativos conjugados usando uma variedade de polímeros sintéticos; (2) a presente invenção aplica-se tanto a receptor de proteínas de ligação "RN" e "RG" glicosilado como não glicosilado, enquanto Burg et al. divulga apenas a conjugação de glicoproteínas; (3) a presente invenção engloba ambos os alcoxiPEGs, tais como mPEG, e hidroxiPEGs monofuncionalmente ativados, enquanto Burg et al. divulga apenas o uso de alkoxiPEGs; e (4) na presente invenção, as ligações de amina secundária entre o polímero e a proteína são preferidos sobre as ligações amida, usadas por Burg et al., uma vez que as primeiras são mais estáveis e conservam a carga positiva no grupo amino. No trabalho análogo do mesmo grupo, J. Burg, et al., (Patente US 6340742) descreve a produção de conjugados de amida ligadas a glicoproteínas de eritropoietina, em que uma a três cadeias de alcoxiPEG está/estão ligadas a um a 64 três grupos amino da proteína. Em contraste com a presente invenção, no entanto, esta referência não relata qualquer preferência para o grupo alfa-amino do aminoácido N-terminal amino ou grupos amino que não se encontram em regiões que estão envolvidos nas interações com os receptores. C. Delgado et al., (Patente US 6384195) revela conjugados de colónias de fator estimulante de granulócitos-macrófagos que são preparadas usando um polímero reativo que é representado como monometoxiPEG tresilo e é aí referido como "TMPEG". Esta referência indica que, quando o TMPEG é posto em contacto com GM-CSF recombinante humano, o material modificado contém espécies sem atividade e com atividade maior do que o material não modificado. Como um vulgar perito reconhecerá facilmente, as espécies sem atividade são indesejáveis numa mistura de componentes conjugados de polímeros bioativos, particularmente em composições para uso terapêutico, que compreendem tais conjugados, uma vez que podem contribuir para os riscos de administrar o conjugado a um paciente em necessidade de tal administração, sem contribuir para os efeitos benéficos. Como notado aqui, a presente invenção ultrapassa esta limitação na técnica, pelo menos, em parte, ao evitar a modificação de GM-CSF e outras proteínas de ligação a receptores em locais sobre as proteínas que estão envolvidas na sua atividade de ligação ao receptor, desse modo reduzindo ou eliminando a síntese de espécies sem atividade. A presente invenção também fornece métodos para o fraccionamento e purificação de conjugados que têm tamanhos diferentes, cargas diferentes e/ou diferentes graus de blindagem de cargas na proteína pelo polímero. 65 É digno de nota que a Patente US 6384195 não menciona a PEGuilação N-terminal de GM-CSF e, por conseguinte, não reconhece as vantagens dos métodos da presente invenção. Finalmente, a Patente US 6384195 indica uma preferência por conjugados em que mais do que um PEG é acoplado a cada molécula de GM-CSF, sem qualquer consideração sobre onde na molécula de GM-CSF as moléculas de PEG são ligadas (não sendo acopladas a residuos de lisina) . Ao afirmar uma preferência pelos conjugados com até seis moléculas de PEG por GM-CSF, a referência indica, assim, uma preferência pelos conjugados em que o PEG pode ser conectado a todos os possíveis residuos de lisina, assegurando assim que o PEG será ligado em posições que impedem estereoquimicamente uma abordagem próxima da proteina para os seus receptores de superfície celular. Em contraste, a presente invenção indica a inconveniência do acoplamento de PEG a residuos de lisina, excepto quando os residuos de lisina são afastados dos dominios da proteina de ligação ao receptor, que são essenciais para a interação com os receptores e, portanto, para a transdução de sinal (no caso de agonistas) ou com o fim de inibir competitivamente a transdução de sinal (no caso dos antagonistas). T. Nakamura et al., (WO 02/32957 Al) revela que o aumento do peso molecular de PEG, que é acoplado ao grupo amino épsilon do residuo de lisina na posição 52 da glicoproteína eritropoietina aumenta o efeito eritropoiético do conjugado in vivo, enquanto diminui a afinidade do conjugado para os receptores de eritropoietina. Em contraste com a presente invenção, no entanto, esta referência não descreve o acoplamento de PEG no terminal amino, nem reconhece qualquer vantagem em fazê-lo. 66
Assim, a presente invenção proporciona conjugados de componentes bioativos acoplados a polímeros sintéticos que têm distintas vantagens estruturais e funcionais em relação aos que foram previamente divulgado.
Composições A presente invenção proporciona conjugados ou complexos que compreendem um ou mais componentes bioativos, adequadamente uma ou mais citoquinas, acopladas a um ou mais polímeros estabilizadores, tais como um ou mais PEGs. Tipicamente, tais conjugados são produzidos pelos métodos da presente invenção aqui descritos, no entanto, os conjugados possuindo as estruturas e as atividades aqui descritas, independentemente dos métodos utilizados para a produção de tais conjugados, são considerados como equivalentes aos produzidos pelos métodos da presente invenção e são, por conseguinte, abrangidos pela presente invenção. Em aspectos relacionados, a invenção também proporciona composições que compreendem um ou mais de tais conjugados ou complexos. Composições de acordo com este aspecto da presente invenção compreenderão uma ou mais (por exemplo, um, dois, três, quatro, cinco, dez, etc.) dos conjugados ou complexos acima descritos da presente invenção. Em certos aspectos, as composições podem compreender um ou mais componentes adicionais, tais como um ou mais sais tampão, um ou mais agentes caotrópicos, um ou mais detergentes, uma ou mais proteínas (por exemplo, albumina ou um ou mais enzimas), uma ou mais polímeros não ligados, um ou mais agentes osmoticamente ativos. As composições deste aspecto da invenção podem estar em qualquer forma, incluindo sólida (em pó, por exemplo, seco) ou solução (em particular sob a forma de uma solução salina tamponada fisiologicamente 67 compatível, compreendendo um ou mais dos conjugados da presente invenção). A. Composições farmacêuticas
Certas composições da presente invenção são particularmente formuladas para utilização como composições farmacêuticas para utilização em aplicações de profilaxia, diagnóstico ou terapêutica. Tais composições compreendem tipicamente um ou mais dos conjugados, complexos ou composições da invenção e um ou mais veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. 0 termo "veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável", tal como aqui utilizado, refere-se a um agente de enchimento não-tóxico sólido, semi-sólido ou líquido, diluente, material de encapsulamento ou formulação auxiliar de qualquer tipo que é capaz de ser tolerado por um animal receptor, incluindo um ser humano ou outro mamífero, em que a composição farmacêutica é introduzida, sem efeitos adversos resultantes da sua adição.
As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas a um receptor através de qualquer modo adequado de administração, como por exemplo por via oral, rectal, parentérica, intrasistémica, vaginal, intraperitoneal, tópica (como através de pós, pomadas, gotas ou do sistema transdérmico), bucalmente, como uma pulverização oral ou nasal ou por inalação. 0 termo "parentérica" conforme aqui utilizado refere-se a modos de administração que incluem injeção intravenosa, intra-arterial, intramuscular, intraperitoneal, intracistérnica, subcutânea e intra-articular e infusão. 68
As composições farmacêuticas proporcionadas pela presente invenção para injeção parentérica podem compreender soluções estéreis farmaceuticamente aceitáveis aquosas ou não aquosas, dispersões, suspensões ou emulsões, assim como pós estéreis para reconstituição em soluções injetáveis estéreis ou dispersões antes da utilização. Exemplos de transportadores aquosos e não aquosos, diluentes, solventes ou veículos adequados incluem áqua, etanol, polióis (tais como glicerol, propilenoglicol, poli (etilenoglicol)), carboximetilcelulose e suas misturas adequadas, óleos vegetais (tais como azeite), e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etilo. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento tais como a lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso das dispersões, e pelo uso de tensioativos.
Tais composições farmacêuticas da presente invenção podem também conter adjuvantes tais como conservantes, agentes molhantes, agentes emulsionantes e agentes dispersantes. A prevenção da ação de microorganismos pode ser assegurada pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, álcool benzílico, clorobutanol, fenol, ácido sórbico. Pode também ser desejável incluir agentes osmóticos, tais como açúcares, cloreto de sódio. A absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser provocada pela inclusão de agentes que atrasam a absorção, tal como o alumínio, monoestearato, hidrogéis e gelatina. 69
Em alguns casos, a fim de prolongar o efeito do fármaco, é desejável retardar a absorção da injeção subcutânea ou intramuscular. Isto pode ser conseguido pela utilização de uma suspensão líquida de material cristalino ou amorfo com fraca solubilidade em fluidos corporais aquosos. A velocidade de absorção do fármaco depende então da sua velocidade de dissolução, a qual, por sua vez, pode depender da sua forma fisica. Alternativamente, a absorção retardada de uma forma de fármaco administrado parentericamente pode ser conseguida por dissolução ou suspensão do fármaco num veículo oleoso.
As formas de depósito injetáveis são feitas formando matrizes microencapsuladas do fármaco em polímeros biodegradáveis tais como polilactido-poliglicólido. Dependendo da razão do fármaco para o polímero veicular e da natureza do polímero portador particular empregue, a velocidade de libertação do fármaco pode ser controlada. Exemplos de outros polímeros biodegradáveis incluem poli (ortoésteres) e poli (anidridos) biocompatíveis. As formulações de depósito injetáveis são também preparadas por aprisionamento do fármaco em lipossomas ou microemulsões que são compatíveis com os tecidos corporais.
As formulações injetáveis podem ser esterilizadas, por exemplo, por filtração através de um filtro de retenção de bactérias, ou por incorporação de agentes de esterilização na forma de composições sólidas estéreis que podem ser dissolvidas ou dispersas em água estéril ou outro meio injetável estéril antes do uso. 70
As formas de dosagem sólidas para administração oral incluem cápsulas, comprimidos, pílulas, pós e grânulos. Em tais formas de dosagem sólidas, os compostos ativos são misturados com pelo menos um excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável, tal como citrato de sódio ou fosfato de dicálcio e/ou um enchimento) ou extensores, tais como amidos, lactose, sacarose, glicose, manitol e ácido silícico, b) ligantes tais como, por exemplo, carboximetilcelulose, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarose e goma de acácia, c) humectantes tais como glicerol, d) agentes de desintegração, tais como agar-agar, carbonato de cálcio, amido de batata ou de tapioca, ácido algínico, certos silicatos, e carbonato de sódio, e) solução de agentes retardantes tais como a parafina, f) aceleradores de absorção, tais como compostos de amónio quaternário, g) agentes humectantes tais como, por exemplo, álcool cetílico e monoestearato de glicerol, h) adsorventes, tais como caulino e argila de bentonite, e i) lubrificantes tais como talco, estearato de cálcio, estearato de magnésio, PEGs sólidos, lauril sulfato de sódio e suas misturas. No caso de cápsulas, comprimidos e pílulas, a forma de dosagem pode também compreender agentes tamponantes.
As composições sólidas de um tipo semelhante podem também ser empregues como agentes de enchimento em cápsulas de gelatina moles e duras, usando excipientes tais como lactose (açúcar de leite) , bem como PEGs de elevado peso molecular. 71
As formas de dosagem sólidas de comprimidos, drageias, cápsulas, pílulas e grânulos podem ser preparadas com revestimentos e invólucros tais como revestimentos entéricos ou cronomodulados e outros revestimentos bem conhecidos na técnica da formulação farmacêutica. Poderão conter opcionalmente agentes opacificantes e podem também ser de uma tal composição que libertem o ingrediente ativo (s) apenas, ou preferencialmente, numa certa parte do trato gastrointestinal, opcionalmente, de uma forma retardada. Os exemplos de incorporação de composições que podem ser usadas incluem substâncias poliméricas e ceras. Os compostos ativos podem também estar na forma microencapsulada, se apropriado, com um ou mais dos excipientes acima mencionados.
As formas de dosagem líquidas para administração oral podem incluir emulsões farmaceuticamente aceitáveis, soluções, suspensões, xaropes e elixires. Em adição aos compostos ativos, as formas de dosagem líquidas podem conter diluentes inertes vulgarmente utilizados na técnica tais como, por exemplo, água ou outros solventes, agentes solubilizantes e emulsionantes tais como álcool etílico, álcool isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, álcool benzílico, benzoato de benzilo, propilenoglicol, 1,3-butilenoglicol, dimetilformamida, óleos (em particular, óleos de algodão, amendoim, milho, gérmen, azeitona, rícino, e sésamo), glicerol, álcool tetra-hidrofurfurílico, PEGs e ésteres de ácidos gordos de sorbitano e suas misturas. 72
Além de diluentes inertes, as composições orais podem também incluir adjuvantes tais como agentes humectantes, agentes emulsionantes e de suspensão, agentes edulcorantes, aromatizantes e perfumantes.
As suspensões, em adição aos compostos ativos, podem conter agentes de suspensão como, por exemplo, álcoois isoestearilicos etoxilados, polioxietileno-sorbitol e ésteres de sorbitano, celulose microcristalina, meta-hidróxido de alumínio, bentonite, ágar-ágar, goma adragante e suas misturas. A administração tópica inclui a administração à pele ou mucosa, incluindo superfícies do pulmão e do olho. As composições para administração tópica, incluindo aquelas para inalação, podendo ser preparadas como um pó seco que pode ser pressurizado ou não pressurizado. Em composições em pó não-pressurizadas, os ingredientes ativos na forma finamente dividida podem ser utilizados em mistura com um veículo inerte de maior tamanho farmaceuticamente aceitável compreendendo partículas possuindo um tamanho, por exemplo, de até 100 micrómetros de diâmetro. Veículos inertes adequados incluem açúcares tais como lactose e sacarose. Desejavelmente, pelo menos 95% em peso das partículas do ingrediente ativo têm um tamanho de partícula eficaz na gama de 0,01 a 10 micrómetros.
Alternativamente, a composição farmacêutica pode ser pressurizada e conter um gás comprimido, tal como azoto ou um propulsor de gás liquefeito. O meio propulsor liquefeito 73 e de facto a composição total pode ser de preferência de tal modo que os ingredientes ativos não se dissolvem nele em nenhuma extensão substancial. A composição pressurizada pode também conter um agente tensioativo. 0 agente tensioativo pode ser um agente tensioativo sólido ou liquido não-iónico ou pode ser um agente tensioativo sólido aniónico. É preferível utilizar-se o agente tensioativo sólido aniónico na forma de um sal de sódio.
Uma outra forma de administração tópica é no olho. Neste modo de administração, os conjugados ou composições da presente invenção são entregues num veículo oftálmico farmaceuticamente aceitável, de tal modo que os compostos ativos são mantidos em contacto com a superfície ocular durante um período de tempo suficiente para permitir que os compostos penetrem a conjuntiva ou regiões da córnea e internas do olho, como por exemplo a câmara anterior, a câmara posterior, o corpo vítreo, o humor aquoso, o humor vítreo, a córnea, a íris/ciliar, o cristalino, o coróide/retina e a esclera. 0 veículo oftálmico farmaceuticamente aceitável pode, por exemplo, ser uma pomada, óleo vegetal ou um material encapsulante.
As composições para administração rectal ou vaginal são preferivelmente supositórios que podem ser preparados por mistura dos conjugados ou composições da presente invenção, com excipientes ou veículos não irritantes adequados, tais como manteiga de cacau, PEG ou uma cera de supositório, que são sólidos à temperatura ambiente mas líquidos à temperatura do corpo e, portanto, derretem no recto ou na cavidade vaginal e libertam o fármaco. 74 nos métodos
As composições farmacêuticas utilizadas terapêuticos da presente invenção podem também ser administradas na forma de lipossomas. Como é conhecido na técnica, os lipossomas são geralmente derivados de fosfolipidos ou outras substâncias lipidicas. Os lipossomas são formados por cristais hidratados mono ou multi-lamelares de líquidos que são dispersos num meio aquoso. Qualquer lípido não tóxico, fisiologicamente aceitável e metabolizável capaz de formar lipossomas pode ser usado. Além de um ou mais dos conjugados ou composição da invenção, as composições farmacêuticas presentes na forma de lipossomas podem também conter um ou mais agentes estabilizadores, conservantes, excipientes. Os lípidos preferidos são os fosfolipidos e as fosfatidilcolinas (lecitinas), tanto naturais como sintéticas. Métodos para formar lipossomas são conhecidos na técnica (ver, e.g., Zalipsky, S., et al., Patente US 5395619). Os lipossomas que compreendem fosfolipidos que são conjugados a PEG, mais comummente fosfatidiletanolamina acoplada a monometoxiPEG, têm propriedades vantajosas, incluindo tempos de vida prolongados na circulação sanguínea dos mamíferos (Fisher, D., Patente US 6132763). B. Utilizações
Como se observa noutras partes deste documento, os métodos, conjugados e composições da presente invenção são vantajosamente usados em métodos para manter ou aumentar a bioatividade dos componentes biológicos, sem interferir com a capacidade dos componentes biológicos de se ligar aos seus receptores. Tais métodos da presente invenção podem implicar entregar um ou mais dos conjugados e composições para células, tecidos, órgãos ou organismos. Em particular, a invenção proporciona a libertação controlada de um ou 75 mais componentes dos conjugados, complexos ou composições para células, tecidos, órgãos ou organismos, proporcionando assim ao utilizador a capacidade de regular, temporal e espacialmente, a quantidade de um determinado componente que é liberado para a atividade nas células, tecidos, órgãos ou organismos.
Em geral, estes métodos da invenção envolvem uma ou mais atividades. Por exemplo, um tal método da presente invenção compreende: (a) a preparação de um ou mais conjugados ou composições da presente invenção, tal como aqui detalhado; e (b) contactar uma ou mais células, tecidos, órgãos ou organismos com um ou mais conjugados ou composições, em condições que favorecem a ligação de um ou mais dos conjugados ou composições da presente invenção para as células, tecidos, órgãos ou organismos. Uma vez que os componentes bioativos dos conjugados e/ou composições da presente invenção tenham sido ligados (ou, em alguns casos, internalizados) através das células, tecidos, órgãos ou organismos, os componentes realizam as suas funções biológicas pretendidas. Por exemplo, os componentes de péptidos podem ligar-se a receptores ou outros componentes sobre ou no interior das células, tecidos, órgãos ou organismos; para participar em reações metabólicas no interior das células, tecidos, órgãos ou organismos, para levar a cabo, sobrerregular ou ativar ou regular negativamente ou inibir, uma ou mais atividades enzimáticas no interior das células, tecidos, órgãos ou organismos; para proporcionar um componente estrutural em falta às células, tecidos, órgãos ou organismos; para fornecer uma ou mais das necessidades nutricionais para as células, tecidos, órgãos ou organismos; para inibir, 76 tratar, reverter ou melhorar de outro modo um ou mais processos ou sintomas de uma doença ou distúrbio fisico.
Em concretizações adicionais, os conjugados e as composições da invenção podem ser utilizados em cultura industrial de células, devido às potências inesperadamente elevadas dos componentes bioativos dos conjugados, que são obtidos como um resultado dos efeitos combinados de retenção substancial da sua bioatividade e aumento da duração da ação, mesmo sob as condições de utilização industrial. Estas potências inesperadamente elevadas dos conjugados da presente invenção podem levar à produção de biomassa invulgarmente elevada, niveis anormalmente elevados de expressão de proteínas recombinantes, e outros melhoramentos na eficiência de bioprocessamento. C. Esquemas de dosagem
Os conjugados, complexos ou composições da invenção podem ser administrados in vitro, ex vivo ou in vivo a células, tecidos, órgãos ou organismos para proporcionar aos mesmos um ou mais componentes bioativos (isto é, uma ou mais citoquinas ou antagonistas das mesmas) . Um perito compreenderá que as quantidades eficazes de um determinado composto ativo, conjugado, complexo ou composição podem ser determinadas empiricamente e podem ser empregues na forma pura ou, quando tais formas existem, na formulação farmaceuticamente aceitável ou na forma de pró-fármaco. Os compostos, conjugados, complexos ou composições da invenção podem ser administrados a um paciente animal (incluindo um mamífero, tal como um ser humano) com necessidade do mesmo na forma de composições veterinárias ou farmacêuticas, em 77 combinação com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. 0 nivel de dose terapeuticamente eficaz para qualquer paciente em particular dependerá de uma variedade de factores, incluindo o tipo e grau da resposta celular a ser alcançada, a identidade e/ou atividade do composto especifico (s) , conjugado (s) , complexo (s) ou composição (ões) empregue, a idade, o peso corporal ou área de superfície, a saúde geral, sexo e dieta do paciente, o tempo de administração, via de administração e taxa de excreção do composto ativo (s), a duração do tratamento, os fármacos utilizadas em combinação ou coincidentes com o composto especifico (s) , conjugado (s) , complexo (s) ou composição (ões), e factores semelhantes, que são bem conhecidos dos vulgares peritos na farmacêutica e artes médicas. Por exemplo, está bem dentro da habilidade ordinária da técnica começar com doses de um dado composto, conjugado, complexo ou composição da presente invenção em niveis mais baixos do que aqueles requeridos para alcançar o efeito terapêutico desejado e aumentar gradualmente a dosagem até que o efeito desejado é conseguido.
Regimes de dosagem também podem ser dispostos de uma maneira especifica no paciente para proporcionar uma concentração pré-determinada de um dado composto ativo no sangue, tal como determinado por técnicas de rotina e aceites na técnica, por exemplo, exclusão de tamanho, de permuta iónica ou de cromatografia liquida de fase inversa de alto desempenho ("HPLC"), bioensaios ou imunoensaios. Deste modo, os regimes de dosagem do paciente podem ser ajustados para atingir niveis sanguíneos relativamente constantes, como medido por HPLC, ou imunoensaio, de acordo com métodos que são de rotina e familiar para os vulgares 78 peritos nas farmacológicas. artes médicas farmacêuticas e/ou D. Diagnóstico e Usos Terapêuticos A utilização em diagnóstico de um conjugado da invenção pode ser para a localização de células ou tecidos que tenham capacidade de ligação invulgarmente elevada para a citoquina, por exemplo, um cancro, dentro do corpo de um animal, especialmente um ser humano, por administração de um conjugado ou composição da invenção, em que o conjugado (ou um ou mais componentes, ou seja, o componente bioativo e/ou o polímero sintético) é marcado ou compreende um ou mais marcadores detectáveis, de modo a permitir a detecção, por exemplo, por meios ópticos, radiométricos, fluorescentes ou de detecção de ressonância de acordo com métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a maioria dos cancros do pulmão de células não-pequenas exprimem a concentração anormalmente elevada de receptores para o factor de crescimento epidérmico (Bunn, PA, et al., (2002)
Semin Oncol 29 (Suppl 14):38-44). Assim, num outro aspecto da invenção, os conjugados e as composições da presente invenção podem ser utilizados em métodos de diagnóstico ou terapêuticos, por exemplo, para o diagnóstico, tratamento ou prevenção de uma variedade de distúrbios físicos num animal, particularmente um mamífero tal como um ser humano, ou predisposto a sofrer de tal desordem. Em tais abordagens, o objectivo da terapia é a de retardar ou prevenir o desenvolvimento da doença e/ou curar, induzir uma remissão ou manter a remissão da doença, e/ou para diminuir ou minimizar os efeitos secundários de outros regimes terapêuticos. 79
Assim, os conjugados, os complexos e as composições da presente invenção podem ser utilizados para a proteção, supressão ou tratamento de distúrbios físicos, tais como infecções ou doenças. 0 termo "proteção" de uma doença física, como aqui utilizado, abrange "a prevenção", "a supressão" e o "tratamento". A "prevenção" envolve a administração de um complexo ou composição da presente invenção, antes da indução da doença ou distúrbio físico, enquanto a "supressão" envolve a administração do conjugado ou composição antes do aparecimento clínico da doença, daí, a "prevenção" e a "supressão" de uma desordem física serem tipicamente realizadas num animal que está predisposto a, ou susceptível à doença, mas que ainda não sofre da mesma. 0 "tratamento" de um distúrbio físico, contudo, envolve a administração do conjugado terapêutico ou composição da presente invenção, após o aparecimento da doença. Deve ser entendido que, em medicina humana e veterinária, que nem sempre é possível distinguir entre "prevenção" e "supressão" de uma desordem física. Em muitos casos, o evento ou eventos finais indutivos podem ser desconhecidos ou latentes, e nem o paciente nem o médico podem estar cientes do evento indutivo até bem depois da sua ocorrência. Portanto, é comum a utilização do termo "profilaxia", distinto do termo "tratamento", para abranger tanto a "prevenção" e a "supressão", tal como definido no presente documento. 0 termo "proteção", utilizado de acordo com os métodos da presente invenção, por conseguinte, pretende incluir a "profilaxia". Métodos de acordo com este aspecto da invenção pode compreender uma ou mais etapas que permitem que o clínico atinja os objectivos terapêuticos acima descritos. Um tal método da presente invenção pode compreender, por exemplo: (a) identificação de um animal (de preferência um mamífero, tal como um ser humano) que sofre ou está predisposto a uma perturbação 80 física; e (b) administração ao animal de uma quantidade eficaz de um ou mais dos conjugados, complexos ou composições da presente invenção tal como aqui descritos, de tal forma que a administração do conjugado, complexo ou composição impeça, atrase ou diagnostique o desenvolvimento, ou cure ou induza a remissão do distúrbio físico no animal.
Tal como aqui utilizado, um animal que é "predisposto para" um distúrbio físico é definido como um animal que não apresenta uma pluralidade de sintomas físicos evidentes da doença, mas que está geneticamente, fisiologicamente ou de outra forma em risco de desenvolver a doença. Nos métodos da presente invenção, a identificação de um animal (tal como um mamífero, incluindo um ser humano) que está predisposto a, em risco de, ou sofrendo de uma dada desordem físico pode ser realizada de acordo com o padrão de métodos conhecidos na técnica, que serão familiares para o médico ordinariamente qualificado, incluindo, por exemplo, os ensaios radiológicos, os ensaios bioquímicos (por exemplo, ensaios dos níveis relativos de péptidos particulares, proteínas, electrólitos, etc., numa amostra obtida a partir de um animal), os métodos cirúrgicos, o rastreio genético, a história da família, a palpação física, exames patológicos e histológicos (por exemplo, a avaliação microscópica do tecido ou amostras de fluidos corporais ou manchas, ensaios imunológicos, etc.), o teste de fluidos corporais (por exemplo, sangue, soro, plasma, fluido cerebrospinal, urina, saliva, sémen), imagiologia (por exemplo, radiológico, fluorescente, óptico, ressonante (por exemplo, utilizando-se a ressonância magnética nuclear ("RMN") ou ressonância de spin de electrões ("ESR")), etc. Uma vez que um animal foi identificado por um ou mais de 81 tais métodos, o animal pode ser agressiva e/ou ativamente tratado para prevenir, suprimir, retardar ou curar a doença fisica.
Distúrbios fisicos que possam ser evitados, diagnosticados ou tratados com os conjugados, complexos, composições da presente invenção incluem quaisquer distúrbios fisicos para o qual o componente bioativo (tipicamente, a citoquina ou antagonista da mesma) dos conjugados ou composições podem ser utilizados na prevenção, diagnóstico ou tratamento. Tais desordens incluem uma variedade de cancros (por exemplo, cancros da mama, cancros uterinos, cancros do ovário, cancros da próstata, cancros testiculares, leucemias, linfomas, cancros do pulmão, cancros neurológicos, cancros da pele, cabeça e pescoço, cancros ósseos, do cólon e outros cancros gastrointestinais, cancro do pâncreas, cancro da bexiga, cancro dos rins e outros carcinomas, sarcomas, adenomas e mielomas), doenças iatrogênicas; doenças infecciosas (por exemplo, doenças bacterianas, doenças fúngicas, infecções virais (incluindo hepatite, doenças causadas por virus cardiotrópicos, HIV/ SIDA), doenças parasitárias); doenças genéticas (por exemplo, fibrose cística, esclerose lateral amiotrófica, distrofia muscular, doença de Gaucher, doença de Pompe, doença da imunodeficiência combinada grave, nanismo), anemia, neutropenia, trombocitopenia, hemofilia e outras doenças do sangue, perturbações neurodegenerativas (por exemplo, esclerose múltipla ("MS", incluindo a MS remitente-recorrente, progressiva primária, progressiva secundária), doença de Creutzfeldt-Jakob, doença de Alzheimer), distúrbios enzimáticos (por exemplo, gota, uremia, hipercolesterolemia) , transtornos de etiologia incerta ou multifocal (e.g., doença cardiovascular, 82 hipertensão, doença inflamatória do intestino); doenças autoimunes (por exemplo, lúpus eritematoso sistémico, artrite reumatóide, psoríase) e outras desordens de importância médica, que serão prontamente familiares para os especialistas na matéria. Os conjugados, complexos, composições e métodos da presente invenção podem também ser utilizados na prevenção da progressão da doença, tal como na quimioprevenção da progressão de uma lesão pré-maligna para uma lesão maligna.
Um ou mais conjugados, complexos ou composições da presente invenção, ou uma ou mais das composições farmacêuticas da presente invenção, podem ser administrados a um animal em necessidade do mesmo por uma variedade de vias de administração, incluindo por via oral, rectal, parentérica (incluindo injeção intravenosa, intra-arterial, intramuscular, intraperitoneal, intracisternal, subcutânea e intra-articular e infusão), intrasistémica, vaginal, intraperitoneal, tópica (como através de pós, pomadas, gotas ou do sistema transdérmico), bucalmente, como uma pulverização oral ou nasal ou por inalação. Pela invenção, uma quantidade eficaz dos conjugados, complexos ou composições podem ser administradas in vitro, ex vivo ou in vivo em células ou em animais que sofrem de, ou predisposição para uma doença particular, impedindo, atrasando, diagnosticando ou tratando a desordem em o animal. Como usado aqui, "uma quantidade eficaz de um conjugado (ou complexo ou composição) refere-se a uma quantidade de tal modo que o conjugado (ou complexo ou composição) exerça a atividade biológica do componente bioativo (isto é, a citoquina ou um seu antagonista) do complexo, conjugado ou composição, impedindo, retardando, diagnosticando, tratando ou curando a desordem fisica no 83 animal ao qual o complexo, conjugado ou composição da invenção foi administrado. Um perito compreenderá que as quantidades eficazes dos conjugados, complexos ou composições da invenção pode ser determinada empiricamente, em conformidade com métodos convencionais bem conhecidos dos vulgares peritos nas artes médicas e farmacêuticas, ver, por exemplo, Beers, MH, et al., Eds. (1999) Merck Manual of Diagnosis & Therapy, 17a edição, Merck e Co., Rahway, NJ; Hardman, JG, et al., Eds. (2001) Goodman e Gilman The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10a edição, McGraw-Hill Medicai Publishing Division, New York; Speight, TM et al., Eds. (1997) Avery's Drug Treatment, 4a edição, Adis International, Auckland, Nova Zelândia; Katzung, BG (2000) Basic & Clinicai Pharmacology, 8a edição, Lange Medicai Books/McGraw-Hill, New York.
Deve entender-se que, quando administrada a um paciente humano, a dosagem total diária, semanal ou mensal dos conjugados, complexos e composições da presente invenção será decidida pelo médico assistente dentro do âmbito do correto julgamento médico. Por exemplo, os resultados satisfatórios são obtidos por administração de certos conjugados, complexos ou composições da presente invenção em doses apropriadas, dependendo do composto bioativo especifico utilizado, cujas dosagens serão prontamente familiares para o perito na técnica ou que podem ser facilmente determinadas empiricamente utilizando apenas experimentação de rotina. De acordo com este aspecto da invenção, os conjugados, complexos ou composições podem ser administrados uma vez ou, em doses divididas, por exemplo, uma ou duas vezes por dia, ou uma vez ou duas vezes por semana, ou uma vez ou duas vezes por mês, etc. A dose apropriada para diferentes modos de administração (por 84 exemplo, parentérica, subcutânea, intramuscular, intra-ocular, intranasal, etc.) também pode ser facilmente determinada empiricamente, utilizando apenas a experimentação de rotina, ou serão evidentes para o perito na técnica, dependendo da identidade do componente bioativo (isto é, a citoquina ou um seu antagonista) do conjugado, complexo ou composição.
Em outras aplicações, os conjugados, complexos e composições da presente invenção podem ser utilizados para visar especificamente um agente de diagnóstico ou terapêutico para uma célula, tecido, órgão ou organismo que expressa um receptor para, ligar, incorporar ou de outra forma assumir, o componente bioativo (isto é, a citoquina ou um seu antagonista) do conjugado, complexo ou composição. Métodos de acordo com este aspecto podem compreender, por exemplo, o contacto da célula, tecido, órgão ou organismo com um ou mais conjugados, complexos ou composições da presente invenção que, adicionalmente, compreende um ou mais agentes de diagnóstico ou terapêuticos, de tal modo que o conjugado, complexo ou composição é ligada ou absorvido pela célula, tecido, órgão ou organismo, libertando desta forma o agente de diagnóstico ou terapêutico para a célula, tecido, órgão ou organismo. 0 agente de diagnóstico ou terapêutico pode utilizar pelo menos um agente selecionado a partir de um ácido nucleico, um composto orgânico, uma proteína ou péptido, um anticorpo, uma enzima, uma glicoproteína, uma lipoproteína, um elemento, um lípido, um sacárido, um isótopo, um hidrato de carbono, um agente de imagiologia, uma sonda detectável, ou qualquer combinação dos mesmos, o que pode ser marcado de forma detectável, tal como descrito no presente documento. Um agente terapêutico da presente 85 invenção pode ter um efeito terapêutico na célula alvo (ou órgão, tecido ou organismo), sendo o efeito selecionado para corrigir um defeito no gene ou proteína, uma ação de um fármaco, um efeito tóxico, um efeito de estímulo do crescimento, um efeito inibidor do crescimento, um efeito metabólico, um efeito catabólico, um efeito anabólico, um efeito antiviral, um efeito antifúngico, um efeito antibacteriano, um efeito hormonal, um efeito neuro-humoral, um efeito estimulador das células de diferenciação, um efeito inibitório de diferenciação celular, uma efeito neuromodulador, um efeito anti-neoplásico, um efeito anti-tumoral, um efeito de estimular ou inibir a insulina, um efeito de estímulo da medula óssea, efeito estimulante das células-tronco pluripotentes, um efeito estimulador do sistema imunológico, bem como qualquer outro efeito terapêutico conhecido que pode ser fornecido por um agente terapêutico entregue a uma célula (ou tecido, órgão ou organismo) por meio de um sistema de entrega de acordo com este aspecto da presente invenção.
Tais agentes terapêuticos adicionais podem ser selecionados a partir de compostos conhecidos e novos e composições, incluindo antibióticos, esteróides, agentes citotóxicos, fármacos vasoativos, anticorpos e outros agentes terapêuticos. Exemplos de tais agentes incluem antibióticos e outros medicamentos usados no tratamento do choque bacteriano, tais como a gentamicina, tobramicina, nafcilina, cefalosporinas parentéricas, etc.; corticosteróides supra-renais e seus análogos, tais como a dexametasona, de forma a atenuar a lesão celular causada por endotoxinas; fármacos vasoativos, tais como um agente de receptor alfa adrenérgico de bloqueio (por exemplo, 86 fenoxibenzamina) , um agonista do receptor adrenérgico beta (por exemplo, isoproterenol) e dopamina.
Os conjugados, complexos e composições da invenção podem também ser utilizados para o diagnóstico da doença e para monitorizar a resposta terapêutica. Em certos de tais métodos, os conjugados, complexos ou composições da invenção podem compreender um ou mais marcadores detectáveis (tais como os descritos noutras partes deste documento). Em tais métodos específicos, estes conjugados complexos ou composições marcados de forma detectável da invenção podem ser usados para detectar células, tecidos, órgãos ou organismos que expressam receptores para, ou de outro modo assumir, o componente bioativo (isto é, a citoquina ou antagonista da mesma) dos conjugados, complexos ou composições. Num exemplo de um tal método, a célula, tecido, órgão ou organismo é contactada com um ou mais dos conjugados, complexos ou composições da presente invenção, sob condições que favorecem a ligação ou absorção do conjugado pela célula, tecido ou organismo (por exemplo, por ligação do conjugado a um receptor da superfície da célula ou por pinocitose ou por difusão do conjugado na célula), e em seguida detectar o conjugado ligado ou incorporado na célula utilizando meios de detecção específico para o marcador utilizado (por exemplo, detecção por fluorescência para conjugados de etiquetas fluorescentes; ressonância magnética para conjugados magneticamente marcados; imagens radiológicas para conjugados marcados radioactivamente, etc.). Outras utilizações de tais conjugados marcados de forma detectável pode incluir, por exemplo, imagiologia de uma célula, tecido, órgão ou organismo, ou a estrutura interna de um animal (incluindo um ser humano), por administração de uma 87 quantidade eficaz de uma forma marcada de um ou mais dos conjugados da presente invenção e da radiação detectável de medição associado à célula, tecido, órgão ou organismo (ou animal). Métodos de detecção de diferentes tipos de etiquetas e as suas utilizações em imagiologia de diagnóstico e terapêuticos são bem conhecidos dos peritos na técnica e estão descritos noutras partes deste documento.
Num outro aspecto, os conjugados e as composições da presente invenção podem ser usadas em métodos para modular a concentração ou atividade de um receptor especifico para o componente do conjugado bioativo na superfície de uma célula que expressa esse receptor. Por "modular" a atividade de um dado receptor entende-se que o conjugado, por ligação ao receptor, seja ativada ou iniba a atividade fisiológica (por exemplo, a cascata de sinalização intracelular) mediada por esse receptor. Embora não pretendendo estar ligado a qualquer explicação particular mecanicista para a atividade regulatória dos conjugados da presente invenção, tais conjugados podem antagonizar a atividade fisiológica de um receptor celular pela ligação ao receptor através do componente bioativo do conjugado, bloqueando assim a ligação do agonista natural (por exemplo, o componente bioativo não conjugado) e prevenindo a ativação do receptor pelo agonista natural, apesar de não induzir uma ativação significativa da atividade fisiológica do próprio receptor. Métodos de acordo com este aspecto da invenção podem compreender um ou mais passos, por exemplo, o contacto da célula (que pode ser feito in vitro ou in vivo) com um ou mais dos conjugados da presente invenção, sob condições tais que o conjugado (i.e., a parte componente bioativo do conjugado) se liga a um receptor 88 para o componente bioativo na superfície da célula, mas não ativa substancialmente o receptor. Estes métodos irão ser úteis para uma variedade de aplicações de diagnóstico e terapêutica, como o perito na técnica compreenderá imediatamente.
Kits A invenção também fornece kits que compreendem os conjugados e/ou composições da presente invenção. Tais estojos tipicamente compreendem um transportador, tal como uma caixa, caixa de cartão, tubo ou semelhante, tendo um confinamento rigoroso de um ou mais recipientes, tais como frascos, tubos, ampolas, frascos, seringas e outros semelhantes, em que um primeiro recipiente contém um ou mais dos conjugados e/ou composições da presente invenção. Os kits englobados por este aspecto da presente invenção podem ainda compreender um ou mais componentes adicionais (por exemplo, reagentes e compostos) necessários para a realização de uma ou mais aplicações particulares dos conjugados e composições da presente invenção, tais como um ou mais componentes úteis para o diagnóstico, tratamento ou prevenção de uma determinada doença ou distúrbio físico (por exemplo, um ou mais outros compostos ou composições terapêuticas, um ou mais reagentes de diagnóstico, um ou mais transportadores ou excipientes, e outros semelhantes), um ou mais conjugados adicionais ou composições da invenção, e outros semelhantes.
Será facilmente evidente para um perito nas técnicas relevantes que outras modificações e adaptações apropriadas dos métodos e aplicações aqui descritas podem ser feitas 89 sem se sair do âmbito da invenção ou qualquer concretização da mesma. Tendo agora descrito a presente invenção em detalhe, o mesmo será mais claramente compreendido por referência aos exemplos que se seguem, os quais são aqui incluídos apenas para fins de ilustração.
EXEMPLOS A Figura 1 mostra os resíduos de lisina, distribuídos ao longo das regiões do Sítio de Ligação 1 e Sítio de Ligação 2 do interferão-beta, enquanto o terminal amino da cadeia polipeptídica é remota das regiões de ligação ao receptor da proteína, o que demonstra que o IFN-beta é uma citoquina RN.
Estes exemplos, em especial, como ilustrado graficamente na Figura 1, fornecem uma base facilmente visualizada para compreender o papel potencial do impedimento esteárico da proteína do receptor de interações por PEGuilação de proteínas de ligação ao receptor dentro ou adjacentes aos domínios do receptor de ligação destes componentes bioativos. 0 grande volume que é ocupado pelas cadeias de PEG altamente prolongadas e flexíveis também iria impedir estericamente a associação de monómeros de certas proteínas de ligação de receptor em homodímeros funcionais ou homotrímeros, se o PEG fosse acoplado em regiões que são relatadas para serem requeridas para interações entre os monómeros. Assim, a segmentação da PEGuilação para locais distantes do receptor de ligação a regiões de receptores de proteínas de ligação diminui a probabilidade de ligação a PEG irá interferir com as interações intermoleculares que são necessários para a sua função. Procedendo de acordo 90 com o método da presente invenção, podem ser realizados mais do que os benefícios esperados da PEGuilação de proteínas de ligação ao receptor. Os conjugados resultantes combinam os benefícios esperados da melhor solubilidade, biodisponibilidade aumentada, maior estabilidade e diminuição da imunogenicidade com uma retenção inesperadamente elevada da bioatividade.
Exemplo 1: PEGuilação do interferão-p-lb por alquilação redutora
Numa série de formas de realização, os conjugados de interferão^-lb ("IFN-p-lb"; SEQ ID NO: 1) com monometoxiPEG ("mPEG") foram sintetizados por alquilação redutiva com um aldeído mPEG de 20 kDa ou 30 kDa, utilizando-se um complexo de borano-piridina como agente de redução (Cabacungan, JC, et al., supra), interferão^-lb, livre de proteínas de transporte e a uma concentração de cerca de 1,9 mg/mL numa solução contendo cerca de 3 mg/mL de SDS foi obtido a partir de Chiron Corporation (Emeryville, CA) . Esta proteína é designada por "Betaseron®" na formulação que é comercializada por Berlex Laboratories, uma subsidiária nos EUA da Schering AG, e como "BETAFERON®", em que a formulação é comercializada diretamente pela Schering. O complexo de borano-piridina (Aldrich 17,975-2, Milwaukee, WI) foi diluído para 450 mM de borano em 60% (v/v) de acetonitrilo aquoso. 20 kDa de mPEG-n-propionaldeído ("PEG-aldeído;" NOF Corporation, Tóquio) foi dissolvido em 1 mM de HC1 a uma concentração de 30 mg/mL. Após a dissolução, 0,1 ml da solução de PEG-aldeído foi adicionada a 0,7 mL de solução de IFN-p-lb e misturado. A adição de 0,05 ml de 100 mM de tampão acetato, pH 4,6, deu à mistura de reação um pH final de 5. A outra mistura de reação que contém 0,1 ml de solução de 91 PEG-aldeído e 0,7 mL de solução de IFN-p-lb, foi adicionado 0,05 ml de uma mistura de 200 mM de ácido acético, 200 mM de Na2HP04 e 68 mM de NaOH para dar um pH final de 6,4. Para três alíquotas de 0,85 mL de cada uma destas misturas, foi adicionado 0,1 ml de água, 1,5 M de NaCl ou 10 mg/mL SDS. O complexo de borano-piridina diluído foi então adicionado a cada mistura de reação para se obter uma concentração final de 23 mM de borano. Cada uma das misturas de reação resultante foi dividida em dois tubos que foram incubados durante 2 dias a 4°C ou à temperatura ambiente. Alíquotas das misturas de reação foram analisadas por HPLC de exclusão por tamanho em 10 mM de Tris, 150 mM de NaCl, pH 8,3, contendo 0,3 mg/ml de SDS, a uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min numa coluna Superose™ 12 (Amersham Biosciences HR 10/30; Piscataway, NJ) . A absorvância do eluato foi monitorizada a 214 nm. Com uma relação de entrada de cerca de 2 moles de PEG por mole de proteína, a espécie predominante foi interferão-p-lb monoPEGuilado (PEGi-IFN^-lb) . O rendimento de PEGi-IFN-β lb está entre 65% e 72%, sob todas as condições de incubação testadas (a um pH de 5 ou pH 6,4; temperatura de 4°C ou à temperatura ambiente, na presença ou na ausência de NaCl ou SDS adicional) .
Noutras experiências, foi usado NaBH3CN como agente de redução e as amostras foram analisadas por HPLC de exclusão de tamanho numa coluna Superdex 200 HR 30/10 (Amersham Biosciences) em 10 mM de acetato, 150 mM de NaCl, pH 4,6, contendo 1 mg/mL de SDS, a uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min. Os resultados de uma experiência tal são mostrados na Figura 2. As concentrações de entrada de 2 0 kDa de mPEG foram de aproximadamente 0,1 mM, 0,2 mM e 0,4 mM (designado "lx", "2x" e "4x" na Figura 2, respectivamente) e as 92 misturas reacionais foram incubadas à temperatura ambiente durante 3 dias. A amostra de controlo (traçado inferior) foi incubada apenas com o agente redutor. Quando as mesmas amostras foram cromatografadas sob condições idênticas, com exceção da omissão de SDS a partir do tampão de eluição, a ΙΕΝ-β-lb não PEGuilado não foi detectado no eluato. Resultados similares foram obtidos quando o 30 kDa de mPEG n-propionaldeido foi substituído por 20 kDa n-mPEG-propionaldeído nos métodos do presente Exemplo 1. Resultados semelhantes foram também obtidos quando 10 kDa de mPEG n-propionaldeído foi substituído por 20 kDa mPEG n-propionaldeído. Alternativamente, o MPEG-acetaldeído ou butiraldeidos podem ser empregues. A peguilação seletiva do N-terminal de IFN-beta pelo método deste exemplo produz conjugados de bioatividade reforçada se o ácido N-terminal amino é a serina, como o IFN-β lb, metionina, tal como em IFN-β-Ι a, ou outro aminoácido.
Exemplo 2: Determinação da extensão de PEGuilação do N-terminal por clivagem oxidativa A fracção de PEG ligado ao grupo alfa-amino do resíduo de serina N-terminal de uma proteína, em vez dos grupos épsilon amino de resíduos de lisina acessíveis, foi avaliada por um novo método que envolve a clivagem oxidativa do resíduo de serina alquilada. A mistura de reação em que PEGi-IFN-β lb foi a espécie predominante (aproximadamente 70% da proteína total) foi dialisada contra 1 mg/mL SDS em tampão de acetato, pH 4,6. O pH foi então ajustado para 7,4 pela adição de 10 mM de Na3P04. Porções desta solução foram incubadas a 4°C até 20 horas, na ausência de periodato de sódio ou com concentrações finais de 0,1 a 10 mM de Nal04. Após a incubação, as misturas de reação foram cromatografadas sobre uma coluna 93 de Superose™ 6 em 10 mM de tampão de acetato, 150 mM de NaCl, pH 4,6, contendo 1 mg/ml de SDS. Resultados semelhantes no que diz respeito à recuperação de IFN-p-lb monoPEGuilado foram obtidos numa coluna Superose 12, com a vantagem de que a coluna Superose 12 permitir a resolução do ΙΕΝ-β-lb não modificado a partir do "pico de sal". A representação gráfica das áreas sob os picos de absorvância a 214 nm correspondente a PEGi-IFB-p-lb versus concentração de periodato mostrou uma diminuição acentuada na zona até cerca de 1 mM de periodato e um nivel quase constante de PEGi-IFN-β lb-residual entre cerca de 1 mM e 10 mM de periodato. Análises semelhantes depois do tratamento com periodato de h 3 mM por 0,2, 2 ou 7 horas indicaram que a clivagem oxidativa do PEG ligado por serina estava substancialmente completa dentro de 2 horas. O PEG residual continha apenas conjugados de PEG de lisina ligada, cuja ligação era estável a tratamento com até pelo menos 10 mM de periodato. A fracção dos conjugados que sobreviveram à oxidação com periodato foi semelhante à fracção estimada por degradação de Edman para ser PEGuilada em locais diferentes no terminal amino. Resultados semelhantes são obtidos quando a distribuição de conjugados que são estáveis ou instáveis para os processos oxidativos descritos neste exemplo é avaliada por uma variedade de métodos analíticos, incluindo, mas não se limitndo a cromatografia de fase reversa, electroforese capilar, electroforese em gel, ultracentrifugação, espectroscopia em massa, dispersão de luz ou ultra-filtração. O interferão^-lb foi acoplado a 20 kDa de PEG aldeído com complexo borano-piridina como agente redutor sob várias condições, tal como descrito no Exemplo 1. O IFN-p-lb monoPEGuilado foi purificado por cromatografia numa coluna 94
Superose 12, em 20 mM de tampão fosfato de sódio, 150 mM de NaCl, pH 7,4, contendo 0,3 mg/ml de SDS, a uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min. Porções do PEGi-IFN-p-lb purificado conjugados foram incubadas durante 2 horas à temperatura ambiente na ausência ou na presença de 3 mM de periodato de sódio. A Figura 3 mostra cromatogramas das amostras não tratadas e oxidativamente clivadas de PEGi-IFN-β lb numa coluna Superose 12, em 10 mM de Tris, 150 mM de NaCl, pH 8,3, contendo 0,3 mg/ml de SDS, até 0,5 mL/min. Estes dados indicam que aproximadamente 90% do PEG em PEGi-IFN-β-lb sintetizado a pH 6,4 foi acoplado ao N-terminal da serina. Este resultado não foi alterado de forma significativa através da realização do acoplamento, após a adição de 150 mM de NaCl (curvas inferiores) ou 1 mg/mL de SDS (curvas superiores) para as misturas de reação ou realizando as reações de acoplamento a um pH de 5 (resultados não mostrados). Resultados semelhantes são obtidos quando o monohidroxiPEG n-propionaldeido é substituído por n-mPEG propionaldeido ou quando os aldeidos de PEG que não sejam n-propionaldeido são empregues. Da mesma forma, o método deste exemplo mede o grau de proteínas do terminal-N alquilado redutivamente com excepção do ΙΕΝ-β-lb, em que tais proteínas têm uma serina N-terminal ou um residuo de treonina. Da mesma forma, a clivagem oxidativa de polímeros ligados por alquilação redutora de N-terminal de serina ou treonina é conseguido usando periodatos diferentes do periodato de sódio, incluindo: metaperiodato de sódio (referido aqui noutro sitio e conhecido na técnica como periodato de sódio), metaperiodato de potássio, metaperiodato de litio, periodato de cálcio, periodato de bário e ácido periódico. 95
Os conjugados de polímero sintetizado por alquilação redutora de outras citoquinas a que o método do presente Exemplo 2 é aplicável inclui a interleucina-l-alfa (Geoghegan, KF, et al., supra) e o factor de crescimento e desenvolvimento de megacariócitos (Guerra, PI, et al., supra).
Exemplo 3: Purificação de conjugados e remoção do PEG livre e SDS por cromatografia de fase reversa A cromatografia de fase reversa ("RP") foi usada por Hershenson S. et al. (Patente US 4894330), para purificar o ΙΕΝ-β-lb após a sua expressão em cultura de células bacterianas. Os inventores da presente invenção adaptaram aos métodos de Hershenson et al. para separar as espécies individuais PEGuiladas sintetizadas como descrito no Exemplo 1, a partir da proteína não modificada. Este procedimento também resolve o PEG livre e a maior parte do SDS dos picos de proteína. A Figura 4 mostra um cromatograma analítico numa coluna Júpiter™ C4 300A (15 cm x 4,6 mm; Phenomenex; Torrance, CA) com um gradiente de acetonitrilo a 20% mais 0,04% de ácido trifluoroacético a 80% de acetonitrilo e 0,1% de ácido trifluoroacético. Um décimo de mililitro da mistura reacional foi carregado e fracções de 0,5 ml foram recolhidas a uma velocidade de fluxo de 1 mL/min. Um pico de ΙΕΝ-β-lb que se manteve inalterado, excepto em caso de exposição aos reagentes de PEGuilação ("PEGuilado Mock") e picos de PEG conjugados contendo uma ou mais cadeias de PEG por molécula de proteína foram detectados por monitorização da absorvância a 280 nm (curva a cheio). Nesta experiência, a coluna foi mantida a 40°C. Resultados qualitativamente semelhantes, mas com tempos de retenção diferentes, foram obtidos por meio de cromatografia à temperatura ambiente. 96
Os resultados dos ensaios de SDS nas fracções recolhidas são mostrados pelos triângulos abertos. Uma solução de stock do reagente de ensaio de SDS continha 1 mg/mL de um corante de carbocianina, Stains-All (Sigma, # E-9379; 3,3' -dietil-9-metil-4,5,4',5'-dibenzotiacarbocianina) , em 50% (v/v) de isopropanol aquoso (Rusconi, F., et al., (2001) Anal Biochem 295:31-37). O reagente de trabalho foi preparado imediatamente antes da utilização por mistura de 2 mL da solução-mãe, mais 2 mL de N,N-dimetilformamida e 41 ml de água. A adição de SDS para este reagente causou alterações espectrais que são especificas para SDS e resultam numa diminuição no pico de absorvância a 510-515 nm, e o aparecimento de um pico de absorvância a 439 nm. As alterações na absorvância a 439 nm mediante adição de 2 mcL de cada fracção a partir da coluna de cromatografia RP a 250 mcL do reagente de trabalho numa placa de 96 poços foram monitorizadas num leitor de placas SpectraMax 250 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
Os resultados de um ensaio para PEG nas fracções recolhidas são mostrados pelos círculos a cheio na Figura 4. 0 reagente de ensaio de PEG foi preparado imediatamente antes da utilização por mistura de 1 volume de 20% (p/v) de cloreto de bário em 1 N de HC1, com 4 volumes de 4 mg/ml de iodo em 1% (p/v) de iodeto de potássio. A partir de cada fracção da coluna de cromatografia RP (e as normas PEG) , uma alíquota de 10 mcL foi adicionada a 90 mcL de água nos poços de uma placa de 96 poços, seguido de 100 mcL de reagente de ensaio de PEG. Após as amostras e os reagentes terem sido misturados e incubados à temperatura ambiente durante 15 minutos, a absorvância a 508 nm foi medida num leitor de placas SpectraMax. Os gráficos na Figura 4 demonstram que a cromatografia RP sob essas condições da 97 proteína PEGuilada Mock separada dos conjugados contendo uma ou mais cadeias de 2 0 kDa de PEG, enquanto resolve o PEG não ligado e SDS a partir dos conjugados. Foram obtidos resultados semelhantes com os conjugados contendo PEGs de outros pesos moleculares (p. ex., 10 kDa ou 30 kDa de PEG) e outras ligações estáveis ácidos entre PEG e o IFN-p-lb.
Exemplo 4: Análises cromatográficas e de eletroforese de fracções purificadas a partir da fase reversa preparativa de HPLC A cromatografia de fase reversa em condições semelhantes às descritas no Exemplo 3 foi realizada em amostras maiores (0,3 ou 0,5 ml) da mistura de reação de PEGuilação na mesma coluna Júpiter C4 com um gradiente modificado. Quando as amostras de maior dimensão foram carregadas, a resolução, entre as várias formas de interferão (Mock PEGuilado, PEGi-IFN-p-lb ou conjugados com mais de uma cadeia de PEG), não era tão clara como a mostrada na Figura 4. No entanto, foram obtidas as fracções que foram altamente enriquecidas quer no PEGuilado Mock ou em proteínas mono-PEGuiladas, como mostrado por recromatografia de pequenas alíquotas das fracções parcialmente purificadas na mesma coluna de RP (Figura 5) . Os cromatogramas foram analisados usando o software EZChrom Elite (Scientific Software, Inc., Pleasanton, CA) . A partir desta análise, a preparação mostrada na curva superior (Fracção 53 a partir da coluna de RP preparativa) continha cerca de 70-80% de IFN-p-lb PEGuilado Mock, ao passo que a preparação mostrada na curva média (Fracção 51) continha cerca de 99% de PEGi-IFN-p-lb. A curva inferior da Figura 5 mostra um cromatograma da mistura de reação a partir do qual as fracções foram derivadas, em que cerca de 19% da absorvância foi associada 98 com a proteína PEGuilada Mock, cerca de 61% com o pico do PEGi-IFN, cerca de 12 % com o pico rotulado PEG2-IFN, e 5-6%, com formas que eluiram mais cedo do que o PEG2-IFN. Resultados qualitativamente semelhantes são obtidos quando são usadas as colunas de fase reversa de outros fabricantes. A mesma mistura de reação (analisada por cromatoqrafia RP na Figura 5) , e duas fracções de interferão-PEG purificado por cromatografia em RP foram analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS ("SDS-PAGE") . Os resultados são mostrados nas Figuras 6 e 7. Amostras idênticas foram incubadas com um agente redutor (Invitrogen, # NP0004; Carlsbad, CA) ou sem agente redutor, durante 10 minutos, quer à temperatura ambiente ou a 102°C e sujeitas a electroforese durante 140 minutos a 120 V, através de 4-12% de gel Bis-Tris (Invitrogen, # NP0321B). Os traçados mostrados nas Figuras 6 e 7 eram de amostras que não foram nem reduzidas nem aquecidas. As proteínas no gel foram coradas com Stain Sypro® rubi (Molecular Probes # S-12000, Eugene, OR) , iluminado a 302 nm e fotografadas usando um filtro de luz laranja/vermelha visível (Molecular Probes, # S-6655) (Figura 6. As imagens digitais foram analisadas utilizando o software de análise de imagem ID da Kodak (Rochester, NY) . O eixo horizontal representa a distância de migração em relação à frente de corante (100 unidades) e o eixo vertical representa a intensidade relativa da mancha da proteína fluorescente. Os valores de linha de base para as diferentes faixas têm sido deslocados verticalmente para clarificar a apresentação dos resultados. O traçado inferior representa uma mistura de proteínas padrão (Markl2™, # LC5677 da Invitrogen) , em que os picos numerados de 1 a 9 são identificados como 99 proteínas possuindo os seguintes pesos moleculares (todos em kDa) : 200, 116, 97,1, 66, 3, 55, 4, 36, 5, 31,0, 21,5 e 14,4. O segundo traçado da parte inferior mostra a análise por electroforese da mistura de reação Nesta mistura, as percentagens da mancha de proteína associada com cada forma de IFN-p-lb foram: 14% Mock PEGuilado; 64% de PEGi-IFN; 20% de PEG2-IFN e cerca de 2% de formas maiores do que o PEG2-IFN. O terceiro traçado da parte inferior mostra uma fracção a partir da coluna cromatográfica RP que continha 33 ± 1% de PEGi-IFN;. 64 ± 1% de PEG2-IFN e cerca de 6% de formas maiores de PEG2-IFN. A curva superior mostra a fracção que contém 95 ± 1% de PEGi-IFN, cerca de 2% de IFN PEGuilado Mock e cerca de 2% de formas maiores de PEG2-IFN. As percentagens indicadas acima são a média e o desvio padrão dos resultados de quatro análises replicadas de cada amostra. Resultados qualitativamente similares foram obtidos com 10 kDa e 30 kDa de PEG. A Figura 7 mostra os resultados de análises de SDS-PAGE, tal como descrito para a Figura 6, excepto que o gel foi corado por PEG utilizando-se 20% (p/v) de BaCl2 em 1 N de HC1 combinado com 4 volumes de 4 mg/mL de I2 em 1% (p/v) de Kl. O traçado inferior representa uma mistura de proteínas padrão pré-coradas (SeeBlue Plus2™, Invitrogen # LC5625), na qual os picos numerados de 1 a 9 identificam as proteínas com os seguintes pesos moleculares aparentes (em kDa): 204, 111, 68,8, 51,5, 40,2, 28,9, 20,7, 14,9 e c. 6. A análise quantitativa do gel corado PEG indica que cerca de 99% do PEG na Fracção 51 a partir da coluna de RP (curva superior) é associado com PEGi-IFN, enquanto a fracção enriquecida com o conjugado de diPEG (segunda curva de cima) continha 25 ± 1% do PEGi-IFN e cerca de 3% de formas maiores de PEG2-IFN, para além de cerca de 71% de PEG2-IFN. 100
Ao estimar as quantidades relativas das diferentes formas de ΙΕΝ-β-lb manchado por PEG, a área sob o pico de PEG2-IFN foi dividido por 2. Na mistura de reação (segunda curva de baixo) , cerca de 50% da mancha de PEG foi associada com PEG não ligado, cerca de 35% de PEGi-IFN, cerca de 14% de PEG2 -IFN e cerca de 1% de formas maiores do que PEG2-IFN.
Exemplo 5: Oxidação seletiva do N-terminal do interferão-β lb e acoplamento com um carbazato de baixo peso molecular
Um método alternativo de acoplamento mPEG ao terminal amino de IFN-p-lb foi usado para aumentar a seletividade aparente para este local de ligação em cerca de 100% em relação ao valor de cerca de 90% obtido por meio de alquilação redutora, tal como descrito nos Exemplos 1 e 2. 0 primeiro passo deste método de peguilação é baseado num principio semelhante à clivagem oxidativa do PEG-IFN-^-lb redutivamente alquilado descrito no Exemplo 2. Esta abordagem tira vantagem da sensibilidade única de um N-terminal de serina ou treonina a ser clivado num aldeído por periodato, como relatado por HBF Dixon (supra) e por KF Geoghegan et al., ((1992) Bioconjug Chem 3:138-146; Geoghegan, KF, Patente US 5362852; Drummond, RJ, et al.,
Patente US 6423685) . Quando o N-terminal do resíduo de serina IFN-β lb foi maximamente o xidado, por exemplo, após o tratamento com 3 mM de NalCh durante 2 horas à temperatura ambiente, o pico de absorvância da proteína resultante apareceu largo na cromatografia de exclusão de tamanho preliminar numa coluna Superose 6. A análise subsequente numa coluna Superose 12 em 10 mM de acetato, 150 mM de NaCl, pH 4,6, contendo 0,3 mg/ml de SDS, claramente resolveu a proteína oxidada em duas formas que foram inferidas ser monómeros e dímeros da proteína. As 101 identidades destes dois picos foram confirmadas por SDS-PAGE, realizada como descrito no Exemplo.
As análises por cromatografia em fase reversa documentam, ainda, a descoberta de que a oxidação preferencial do N-terminal da serina foi realizada com o mínimo de oxidação de pelo menos um resíduo essencial de metionina. LS Lin et al., ((1996) Pharm Biotechnol 9:275-301) e L. Lin ((1998) Dev. Biol Stand 96:97-104) mostraram que a cromatografia RP resolve as preparações de IFN-p-lb num componente principal ("Pico B") e num componente menor que eluiu mais cedo ("Pico A"). Lin ((1998) supra) demonstrou ainda que o pico A contendo IFN-(3-lb no qual uma metionina funcionalmente ativa (Met 61 de BETASERON) foi oxidada a um sulfóxido. Os presentes inventores descobriram as condições sob as quais a quase completa oxidação do N-terminal da serina pode ser conseguida com um mínimo de oxidação do Met 61, tal como reflectido na percentagem do Pico A em cromatogramas RP. A oxidação de Met 61, como medida por cromatograf ia RP, foi utilizada como um marcador substituto para a oxidação dos outros resíduos de metionina de IFN-p-lb (Met 35 e Met 116 de BETASERON).
Estudos sobre a extensão da oxidação de Met 61 como uma função do pH e do tempo de incubação com 0,25 mM de Nal04 a 4°C são resumidos na Tabela 1. 102
Tabela 1: Efeitos do pH e do tempo de exposição ao periodato sobre a extensão da oxidação da metionina, tal como medido pela área do pico A, após cromatografia de fase reversa
Tempo de exposição para 0,25 mM de NalC>4 Percentagem de Pico A a pH 6, 9 Percentagem de Pico A a pH 7,7 0 4, 9 4,8 2 horas 5,1 5,2 6 horas 5, 6 5, 0 18 horas 7,3 5,4 9 dias 21,2 15, 7 A demonstração da formação de aldeído por oxidação N-terminal de ΙΕΝ-β-lb foi facilitada pela sua conjugação a 9-fluorenilmetil carbazato ("Fmoc-carbazato", também conhecido na técnica como "Fmoc-hidrazida") (Fluka 46917; Zhang, R.-E., et al., (1991) Anal Biochem 195:160-167). Os espectros de absorvância distintiva dos aductos de Fmoc-carbazato de IFN-p-lb possibilitam a discriminação entre as formas não conjugadas correspondentes da proteína, sem a utilização de um detector de fluorescência. O interferão-β-lb foi oxidado por meio de tratamento com várias concentrações de Nal04 a pH 7,8 durante vários períodos de tempo (0,5 a 2 horas à temperatura ambiente ou até vários dias no frio). Nas experiências apresentadas na Figura 8, a proteína foi incubada durante 1 hora à temperatura ambiente com 0,5 mM de Nal04. A reação foi terminada através da adição de glicerol. Após 30 minutos à temperatura ambiente, o pH foi reduzido pela adição de ácido acético até uma concentração final de 19 mM. Para cada ml de mistura resultante, 182 mcL de 15 mM Fmoc-carbazato em metanol foi adicionado para dar uma concentração final de 2,3 mM de Fmoc-carbazato. Esta 103 mistura de reação foi incubada durante a noite a 4-8°C antes da análise por cromatografia em fase reversa. A Figura 8 ilustra os efeitos sobre o comportamento cromatográfico RP da incubação de IFN-p-lb com 0,5 mM de NalC>4 durante 1 hora à temperatura ambiente e de acoplamento dos produtos de oxidação de Fmoc-carbazato. Uma comparação dos resultados para a amostra de controlo (curva superior) com aqueles para a amostra oxidada (curva do meio com circulos abertos) , mostra que os tempos de retenção de ambos os componentes principal e de Pico A (refletindo a presença de cerca de 5% do IFN-p-lb com um resíduo de metionina oxidada) são aumentados de 0,2 para 0,3 minutos por oxidação. Tal como medido pela percentagem de pico A, em comparação com pico A', menos de 1% da oxidação da metionina foi detectada após incubação com NalCh sob estas condições.
Os resultados dos bioensaios que são descritos no Exemplo 8 fornecem evidências adicionais de que a oxidação controlada (por ex. até 2 horas no frio) com 0,1 a 0,3 mM de periodato preservada a integridade dos resíduos de aminoácidos da proteína que são essenciais para bioatividade.
Tal como mostrado na curva inferior com triângulos a cheio na Figura 8, a evidência para a formação de aductos de Fmoc foi fornecida pela mudança para tempos de retenção mais longos, tanto para o componente principal como para o Pico A' (o derivado de aldeído N-terminal do pico A). Por outro lado, houve um aumento de 50% na razão de absorvância a 278 104 nm para 214 nm em que os picos deslocados. Para ambas as formas da proteína, os aumentos nos tempos de retenção, devido à formação dos correspondentes aldeídos N-terminais (0,2-0,3 minutos) foram muito menores do que os aumentos resultantes da formação dos correspondentes derivados de Fmoc (1,0-1,2 minutos).
Exemplo 6: Sintese de aductos PEG-carbazato do N-Termlnal do interferão-p-lb oxidado 0 interferão-p-lb, seletivamente oxidado no terminal amino, tal como descrito no Exemplo 5, foi também acoplado a um derivado de carbazato de PEG, por uma adaptação dos métodos descritos por RJ Drummond et al. (WO 99/45026; Patente US 6423685) e por S. Zalipsky et al., (WO 92/16555 Al e em Harris, JM, et al., Eds., (1997) Chemistry and Biological
Apllications of Poly (ethylene glycol), pp 318-341, Washington, DC, American Chemical Society). O PEG-carbazato foi sintetizado pela reação de um derivado de hidrazina, com o carbonato de p-nitrofenilo de PEG de 20 kDa ("NPC-PEG" de NOF Corporation). Após a incubação da proteína à temperatura ambiente na ausência de periodato ou na presença de 0,125 mM de Nal04 por 0,5, 1 ou 2 horas, as amostras foram diluídas com 4 volumes de 20 kDa de PEG-carbazato em 10 mM de tampão de acetato, 150 mM de NaCl, pH 4,6, contendo 1 mg/mL de SDS, e incubadas durante 1 dia à temperatura ambiente. As amostras foram analisadas por cromatografia de exclusão de tamanho numa coluna Superose 12, em 10 mM de Tris, 150 mM de NaCl, pH 8,3, contendo 0,3 mg/ml de SDS. Como mostrado na Figura 9, a oxidação da proteína até 2 horas antes da reação com o PEG-carbazato resultou num decréscimo progressivo da concentração da proteína não modificada (eluída no tempo de retenção de cerca de 25 minutos) e um aumento progressivo na proporção 105 de absorção associado a PEGi-IFN-β lb-conjugado (eluído no tempo de retenção de cerca de 20 minutos). Os rendimentos de PEGi-IFN-p-lb superiores a 80% foram obtidos por este método. Resultados similares foram obtidos usando derivados monocarbazate de PEG de 10 kDa ou 30 kDa.
Exemplo 7: Bioensaio de interferão-p-lb monoPEGuilado, purificado por HPLC de fase reversa A utilização de células de Daudi humanas de linfoma de Burkitt (ATCC # CCL-231, Manassas, VA) para os ensaios anti-proliferativos de interferão^-la e várias muteinas foi descrita por L. Runkel et ali. ((2000) Biochemistry 39:2538-2551) . A Figura 10 representa os resultados de ensaios das atividades antiproliferativos sobre as células de Daudi não tratadas de IFN-p-lb e um conjugado monoPEGuilado no terminal-N, que foi parcialmente purificada por cromatografia de RP. As células foram cultivadas em meio RPMI1640 suplementado (Gibco # 11875-093, Grand
Island, NY) com 10% (v/v) de soro fetal de vitelo (Irvine
Scientific # 3000, Santa Ana, CA) . Cem mil células foram inoculadas em 250 mcL de meio em cada poço de uma placa de 48 poços e deixou-se crescer a 37°C com C02 a 5% durante 4 horas antes de serem misturadas com um volume igual de meio pré-aquecido ou diluições de IFN-p-lb ou um conjugado de PEG em meio. Durante 3 dias, o número de células diluído apenas com meio aumentaram 590 +/- 24% (sd) do número no tempo zero, com base na contagem de células com um contador Coulter (Modelo Zl, Miami, FL) . Sob condições de inibição do crescimento máximo por IFN-p-lb ou seus conjugados de PEG, o número de células aumentou 283 +/- 8% do número no tempo zero. Assim, a percentagem máxima de inibição do crescimento observada nesta experiência foi de 48%. Os dados na Figura 10, para várias concentrações de duas 106 preparações de Ι/ίοη-β-lb são expressos como uma percentagem do crescimento celular inibido. A Figura 10 mostra os resultados de um estudo utilizando diluições da solução-mãe de ΙΕΝ-β-lb e das fracções a partir da experiência da fase inversa cromatográfica preparativa descrita no Exemplo 4, que continha o conjugado monoPEG quase puro, como se mostra nas Figuras 5-7 (fracção 51), ou ΙΕΝ-β-lb Mock PEGuilado quase puro (Fracção 53 da coluna apresentada na Figura 5) . As amostras foram diluídas, em triplicado, a 1 mcg/mL em meio de cultura suplementado com soro de vitela fetal e esterilizadas por filtração através de um filtro de 0,2 micrómetros. De cada uma das diluições iniciais, foram feitas uma diluição de 32 ng/mL e posteriores diluições seriadas. A partir dos dados da Figura 10, foi calculada a concentração de cada preparação necessária para uma inibição de 50% do crescimento celular inibido ("IC50"). Os resultados mostraram que o ΙΕΝ-β-lb mono-PEGuilado (IC50 = c. 40 pg/ml) foi cerca de 6 vezes mais potente que o IFN-β lb não modificado (IC50 = c. 250 pg/mL) . Os aumentos médios de potências antiproliferativas dos conjugados com PEG de vários tamanhos, testadas numa série de experiências semelhantes às mostradas na Figura 22, tinham um intervalo de cerca de 2,5 vezes (para 10 kDa de PEG) a cerca de 5 vezes (para 30 kDa de PEG).
Surpreendentemente, a preparação Mock PEGuilado mostrado na Figura 10 tinha um IC50 de cerca de 80 pg/mL, o que é intermediário entre os da solução-mãe de ΙΕΝ-β-lb e a preparação monoPEGuilada. Embora não pretendendo estar 107 limitado pela teoria ou qualquer explicação mecanicista particular, é plausível que a potência antiproliferativa reforçada da preparação ligada a PEG Mock reflita a remoção durante a cromatografia de fase reversa de um material inibidor, que está presente na solução de stock de IFN-β-lb. Esta interpretação é consistente com os resultados de cromatografia de exclusão de tamanho numa coluna Superose 6 de uma solução tampão contendo SDS (como descrito no Exemplo 1) , que revelou um pico de absorvância em ambos 214 nm e 280 mm, que eluiu entre as posições de eluição do IFN-p-lb e do "pico" de sal. Experiências de bioensaios similares aos mostrados na Figura 10 foram realizadas na Fracção 49 da coluna RP, que continha uma mistura de PEG2 -e PEGi-IFN-p-lb (ver Figuras 6 e 7) . Tal como no caso da amostra Mock PEGuilada, a amostra PEGuilada múltipla tinha uma potência antiproliferativa que era maior do que a da solução de stock de IFN-p-lb, mas menor do que a do conjugado mono-PEGuilado. Noutras experiências, o aumento da potência observada com IFN-p-lb monoPEGuilado variou de seis vezes a dez vezes. Aumentos semelhantes na potência foram observados com os aductos de carbazato descritos no Exemplo 6, utilizando PEG de 10, 20 e 30 kDa.
As potências antiproliferativa das células Daudi obtidas com os conjugados da presente invenção podem ser comparadas com as atividades específicas mencionadas das três formas farmacêuticas de interferão-β medidos num ensaio antiviral. De acordo com as bulas respectivas, as atividades são 0,32 x 106 IU/mg para o BETASERON® Berlex flan-β-ΐδ), 200 x 106 IU/mg para o AVONEX® (formulação de ΙΕΝ-β-la da Biogen) e 270 x 106 IU/mg para o REBIF ® (formulação de ΙΕΝ-β-la da Serono) . Deste modo, o aumento de, pelo menos, seis vezes na potência do BETASERON monoPEGuilado no ensaio 108 antiproliferativo ilustrado na Figura 10 indica que a ligação a PEG no terminal-N do BETASERON pelos métodos da presente invenção aumentou a sua potência para a gama esperada para as preparações glicosiladas comercialmente disponível, AVONEX e REBIF.
Anteriormente, a solubilidade do interferão-β não glicosilado (expressa em Escherichia coli), tem sido melhorada pela utilização de soluções ácidas (Hanisch, WH et al., Patente US 4462940) ou através da adição de SDS (Thomson, JW, Patente US 4816440) . Sem se pretender ficar limitado pela teoria, um mecanismo através do qual a PEGuilação pode aumentar a eficácia antiproliferativa de IFN-p-lb é medido in vitro, diminuindo a sua tendência para se auto-associar no meio de cultura. Por conseguinte, a observação de que a amostra enriquecida em PEG2-IFN^-lb foi menos eficaz do que em PEGi-IFN-β lb indica que os efeitos positivos da agregação diminuída podem ser superados pelo efeito negativo da PEGuilação excessiva sobre a capacidade desta citoquina para se ligar aos seus receptores e/ou para iniciar a transdução de sinal responsável pela sua atividade anti-proliferativa.
Exemplo 8: Bioensaios de Interferão-p-lb seletivamente oxidado
Ensaios da atividade anti-proliferativa em células de Daudi de ΙΕΝ-β-lb oxidado para graus diferentes foram realizados como descrito no Exemplo 7. As amostras testadas incluíram a solução-mãe de ΙΕΝ-β-lb e as amostras que tinham sido tratadas durante vários dias a 4°C com 0,1, 0,3 ou 3 mM de periodato. As amostras foram diluídas conforme descrito no 109
Exemplo 7, e misturadas com um volume igual de suspensão de células de Daudi, 4 horas após a inoculação das células. As células foram cultivadas durante 2 dias a 37°C com 5% de CO2 e depois contadas com um contador Coulter. A atividade antiproliferativa de IFN-p-lb não foi afectada ou aumentada por tratamento com 0,075-0,5 mM de NalC>4 sob as condições testadas. Resultados semelhantes foram obtidos em três dias de ensaios antiproliferativos, tal como descrito no Exemplo 7. A potência antiproliferativa foi reforçada pela conjugação do lFN-p-lb seletivamente oxidado com PEG-carbazato, tal como descrito no Exemplo 6. Resultados semelhantes aos obtidos com o PEG-carbazato são obtidos com produtos de conjugação de ΙΕΝ-β-lb seletivamente oxidado com PEG-hidrazida. Em contraste, o efeito antiproliferativo em células de Daudi foi suprimido ou completamente abolido por meio de tratamento de IFN-β lb com concentrações mais elevadas de periodato, por exemplo, 1-3 mm. Estas altas concentrações de NalCq induzem a dimerização da proteína, a qual foi detectada por HPLC de exclusão de tamanho numa coluna Superose 12, tal como descrito no Exemplo 2, e a oxidação da metionina, tal como detectado por meio de cromatografia de fase reversa, tal como descrito no Exemplo 3 (resultados não apresentados).
As bioatividades dos conjugados da presente invenção podem ser medidas por ensaios antiproliferativos e antivirais conhecidos na técnica, com base em várias linhas celulares e culturas primárias, em que as células suportam receptores de superfície celular para o IFN-beta. Alternativamente, pode-se monitorizar as respostas de IFN-beta que incluem a indução de neopterina (Pepinsky, RB, et al., supra), β2~ microglobulina (Pepinsky, RB, et al., supra), ou 2' — 5' — oligoadenilato-sintetase (Bruchelt, G., et al., (1992) Eur. 110 J. Clin Chem Clin Biochem 30:521-528) ou proteínas repórter operacionalmente ligadas a promotores de proteínas que são induzíveis por IFN-beta. Métodos adicionais para ensaiar a bioatividade de conjugados de polímero de IFN-beta incluem ensaios de transdução de sinal e os ensaios de ativação de genes (por exemplo, Pungor, E., et al., (1998) J Cytokine Interferon Res. 18:1025-1030).
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[0178] <11Q> Mountaln Vlew PharmaceuEícals, Inc. 3475-S Edison Way Menlo Park, Califórnia 94025 United States of America
<12Q> POLYMER CONJUGATESOF INTERFERON-BETA WITH ENHANCED BiOLOGICAL POTENCY
<13Q> 2Q57.012PCQ1/JAG/BJD <H0> (To be assigned) <Ί4·1> (herewith) <150> US 60/479,914 <151> 2003-06-20 <150> US 60/479,913 <151> 2003-06-20 < 150> US 60/436,020 <151 >2002-12-26 111 <160>2 <170> FastSEQ for Windows Verston 4.0 <21 Ô> 1 <211» 165
<212>PRT <213> Momo sapiens <400> 1
Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gin Arg Ser ser Asn Phe Gin Ser 1 5 . Iff 15 Gin Lys Leu- Leu Trp Gin Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu Lys 20 25 30 Asp Arg Mèt Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gin Leu Gin Gin 35 40 45 Phe Gin Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gin Asn 50 55 60 He Phe Ala Ile Phe Arg Gin Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu 65 70 75 80 Thr Xle Vai Glu Asn Leu Leu Ala Asn Vai Tyr His Gin Ile Asn His 85 90 95 Leu Lys Thr Vai Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg 100 105 110 Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile 115 120 125 Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser Cya Ala Trp Thr lie 130 135 140 Vai Arg Vai Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr 145 150 155 160 Gly Tyr Leu Arg Asn 165 <210>2 <211* 166
<212> PRT <213> Homo sapiens <400>2 112
Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gin Arg Ser Ser Asn Phe Gin 1 5 10 15 Cys Gin Lys Leu Leu Trp Gin Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu 20 25 30 Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gin Leu Gin 35 40 45 Gin Phe Gin Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gin SO 55 60 Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gin Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn 65 70 75 80 Glu Thr Ile Vai Glu Asn Leu Leu Ala Asn Vai Tyr His Gin Ile Asn 85 90 95 HiS Leu Lys Thr Vai Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr 100 105 110 Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg 115 120 125 lie Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr 130 135 140 Ile Vai Arg Vai Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu 145 ISO 155 160 Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 165
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <11 tb» Mõunt&ln View PhamiâceutscaSs, Inc, 3475-S Edison Way Mento Park:, Califórnia 94025 United States of America
<120> POLYMER CONJUGATES OF INTERFERQN-BETA WITH ENHANCED BIOLOGiCAL POTENCY
<130> 2057.012PC01/JAG/BJD <140> (To be assigned) <141 > (herewith) t.150> US 60/479,914 <151 >2003-06-20 <150> US 60/479,913 <151 >2003-06-20 <150> US 60/436,020 <151 >2002-12-26 113 <1δΟ> 2 <170» FasiSEG for Windows Version 4.0 <210> 1 <211» 165 <212» PRT <213» Homo sapíens <400» 1
Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gin Arg Ser Ser Asn Phe Gin Ser 1 5 10' 15 Gin Lys Leu Leu Trp Gin Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu Lys 20 25 30 Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gin Leu Gin Gin 35 40 45 Phe Gin Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gin Asn 50 55 60 Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gin Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu 65 70 75 80 Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gin Ile Asn His 85 90 95 Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg 100 105 110 Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile 115 120 125 Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile 130 135 140 Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr 145 ISO 155 160
Gly Tyr Leu Arg Asn 165 <210»2 <211»166 <212» PRT <213» Homo sapseos <400» 2 114
Met ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gin Arg Ser Ser Asn Phe Gin. 1 5 10 15 Cys Gin Lys Leu Leu Trp Gin Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu 20 25 30 Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gin Leu Gin 35 40 45 Gin Phe Gin Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gin 50 55 60 Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gin Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn, 65 70 75 80 Glu Thr Ile Vai Glu Asn Leu Leu Ala Asn Vai Tyr His Gin Ile Asn 85 90 95 Mis Leu Lys Thr Vai Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr 100 105 110 Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg 115 120 125 Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr 130 135 140 Ile Vál Arg Vai Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu 145 150 155 160 Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 165 115

Claims (46)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Método para aumentar a potência biológica in vitro de um interferão-beta não-glicosilado, que compreende seletivamente o acoplamento, na presença de um agente tensioativo, um ou mais polímeros sintéticos solúveis em água para o amino terminal do aminoácido do referido interferão-beta, em que o referido amino-terminal do aminoácido está localizado remotamente a partir do dominio de ligação ao receptor (s) do referido interferão-beta, e em que o polimero solúvel em água é um polialquileno-glicol selecionado a partir do grupo consistindo num poli (etileno glicol), uma monometoxipoli (etileno glicol) e um monohidroxipoli (etileno glicol) (i) o polimero solúvel em água tem um único grupo aldeído e o acoplamento compreende a alquilação redutiva de uma base de Schiff formada com o polímero solúvel em água e uma redução da base de Schiff com um agente redutor suave, ou (ii) o acoplamento compreende o acoplamento de uma hidrazida, hidrazina, semicarbazida, ou outras aminas contendo um polímero solúvel em água para uma serina N-terminal ou um resíduo de treonina do interferão beta que foi clivado oxidativamente para um aldeído com o periodato, e em que - o polímero solúvel em água é um polialquileno glicol selecionado do grupo constituído por um poli (etileno glicol), um monometoxipoli (etileno glicol) e um monohidroxipoli (etileno glicol). 1
  2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, que (i) compreende a formação de uma mistura do interferão-beta e o polímero solúvel em água a um pH de 5,6-7,6.
  3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que (i) o agente redutor suave compreende cianoborohidreto de sódio.
  4. 4. Método de acordo com a reivindicação 1 ou, em que (i) o agente redutor suave compreende piridina-borano.
  5. 5. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 4, realizada de forma a minimizar a oxidação de pelo menos um resíduo de uma essencial metionina no interferão-beta .
  6. 6. Método da reivindicação 1, em que a dita potência biológica é medida num ensaio de cultura de células que respondem ao interferão-beta.
  7. 7. Método da reivindicação 1, em que o referido interferão-beta tem a sequência de aminoácidos do interferão^-lb especificado na SEQ ID NO: 1.
  8. 8. Método da reivindicação 1, em que o referido interferão-beta tem substancialmente a sequência de aminoácidos em SEQ ID NO: 1.
  9. 9. Método da reivindicação 1, em que o referido polimero está covalentemente acoplado ao grupo alfa-amino do referido amino-terminal do aminoácido.
  10. 10. Método da reivindicação 9, em que a referida ligação covalente do referido polímero para o referido grupo 2 alfa amino secundária. é através de uma ligação de amina
  11. 11. Método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o dito polialquileno glicol é um monometoxipoli (etileno glicol).
  12. 12. Método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o referido polialquilenoglicol é um monohidroxipoli (etileno glicol).
  13. 13. Método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o dito polialquileno-glicol tem um peso molecular de entre cerca de 1 kDa a cerca de 100 kDa, inclusive.
  14. 14. Método da reivindicação 13, em que o referido polialquilenoglicol possui um peso molecular de entre cerca de 8 kDa a cerca de 14 kDa, inclusive.
  15. 15. Método da reivindicação polialquilenoglicol possui cerca de 10 kDa e cerca de
  16. 16. Método da reivindicação polialquilenoglicol possui cerca de 18 kDa e cerca de 13, em que o referido um peso molecular de entre 30 kDa, inclusive. 15, em que o referido um peso molecular de entre 22 kDa, inclusive.
  17. 17. Método da reivindicação 16, em que o referido polialquilenoglicol possui um peso molecular de aproximadamente 20 kDa. 3
  18. 18. Método da reivindicação 13, em que o referido polialquilenoglicol possui um peso molecular de aproximadamente 30 kDa.
  19. 19. Método da reivindicação 1, em que o acoplamento do referido polímero para o referido interferão-beta no referido amino-terminal do aminoácido imita os efeitos benéficos da glicosilação ou hiperglicosilação do referido interferão-beta.
  20. 20. Conjugado obtenível pelo método de qualquer uma das reivindicações precedentes.
  21. 21. Conjugado de acordo com a reivindicação 20, compreendendo um interferão beta não-glicosilado covalentemente acoplado no seu amino-terminal do aminoácido de um ou mais polímeros sintéticos solúveis em água, em que a potência biológica in vitro do referido conjugado de interferão-beta é aumentada em comparação ao mesmo interferão beta cujos um ou mais dos mesmos polímeros sintéticos solúveis em água, foram acoplados de forma aleatória para resíduos de lisina solventes acessíveis, e em que o polímero solúvel em água é um polialquileno-glicol selecionado a partir do grupo que consiste num etileno (poli glicol), um monometooxipoli (etileno glicol) e um monohidroxipoli (etileno glicol).
  22. 22. Conjugado da reivindicação 21, em que a potência biológica do referido conjugado é medida num ensaio de cultura de células que respondem ao interferão-beta. 4
  23. 23. Conjugado da reivindicação 21, em que o referido interferão-beta tem a sequência de aminoácidos do interferão-p-lb especificado na SEQ ID NO: 1.
  24. 24. Conjugado da reivindicação 23, em que a potência biológica in vitro do referido interferão-p-lb é aumentada para aproximadamente a potência de interferon-p-la, o qual tem a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 2 e que está glicosilado no resíduo de asparagina 80.
  25. 25. Conjugado da reivindicação 22, em que o referido ensaio de cultura de células de interferão-beta é selecionado a partir do grupo que consiste num ensaio antiproliferativo, um ensaio antiviral, um ensaio de transdução de sinal e um ensaio de ativação de genes.
  26. 26. Composição farmacêutica que compreende o conjugado de qualquer das reivindicações 20 a 25 e um transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
  27. 27. Kit que compreende o conjugado de qualquer uma das reivindicações 20 a 25.
  28. 28. Kit que compreende a composição farmacêutica da reivindicação 26.
  29. 29. Conjugado de qualquer uma das reivindicações 20 a 25, para utilização na prevenção, diagnóstico ou tratamento de uma desordem física responsiva do interferão-beta num animal que sofra ou tenha predisposição para a referida desordem física. 5
  30. 30. Composição farmacêutica da reivindicação 26, para utilização na prevenção, diagnóstico ou tratamento de uma desordem fisica responsiva do interferão-beta num animal que sofra ou tenha predisposição para a referida desordem fisica.
  31. 31. Conjugado da reivindicação 29, em que o referido animal é um mamífero.
  32. 32. Composição farmacêutica da reivindicação 30, em que o referido animal é um mamífero.
  33. 33. Conjugado da reivindicação 31 ou da composição farmacêutica da reivindicação 32, em que o referido mamífero é um ser humano.
  34. 34. Conjugado da reivindicação 29, em que o referido interferão-beta responsivo a uma desordem física é selecionado de entre o grupo consistindo num cancro, numa doença infecciosa, numa doença neurodegenerativa, numa doença autoimune e numa desordem genética.
  35. 35. Conjugado da reivindicação 34, em que o referido cancro é selecionado de entre o grupo consistindo em cancro da mama, cancro uterino, cancro do ovário, cancro da próstata, cancro testicular, cancro do pulmão, leucemia, linfoma, cancro do cólon, cancro gastrointestinal, cancro do pâncreas, cancro da bexiga, cancro dos rins, cancro ósseo, cancro neurológicos, cancro da cabeça e do pescoço, cancro de pele, carcinoma, sarcoma, adenoma e mieloma.
  36. 36. Conjugado da reivindicação 34, em que o referido interferão-beta responsivo a uma doença infecciosa é 6 selecionado a partir do grupo consistindo em hepatite virai, doença causada por um virus cardiotrópicos e VIH/SIDA.
  37. 37. Conjugado da reivindicação 34, em que o referido interferão-beta responsivo a um distúrbio neurodegenerativo é a esclerose múltipla.
  38. 38. Conjugado da reivindicação 37, em que a referida esclerose múltipla é selecionado a partir do grupo consistindo em esclerose múltipla recorrente-remitente, progressiva primária e progressiva secundária.
  39. 39. Composição farmacêutica da reivindicação 30, em que o referido interferão-beta responsivo a uma desordem fisica é selecionado de entre o grupo consistindo em cancro, doença infecciosa, doença neurodegenerativa, doença autoimune e desordem genética.
  40. 40. Composição farmacêutica da reivindicação 39, em que o referido cancro é selecionado de entre o grupo consistindo em cancro da mama, cancro uterino, cancro do ovário, cancro da próstata, cancro testicular, cancro do pulmão, leucemia, linfoma, cancro do cólon, cancro gastrointestinal, cancro do pâncreas, cancro da bexiga, cancro dos rins, cancro ósseo, cancro neurológico, cancro da cabeça e do pescoço, cancro de pele, carcinoma, sarcoma, adenoma e mieloma
  41. 41. Composição farmacêutica da reivindicação 39, em que o referido interferão-beta responsivo a uma doença infecciosa é selecionado a partir do grupo consistindo em hepatite virai, doença causada por um virus cardiotrópicos e VIH/SIDA. 7
  42. 42. Composição farmacêutica da reivindicação 39, em que o referido interferão-beta responsivo a um distúrbio neurodegenerativo é a esclerose múltipla.
  43. 43. Composição farmacêutica da reivindicação 42, em que a referida esclerose múltipla é selecionada a partir do grupo consistindo em esclerose múltipla recorrente-remitente, progressiva primária e progressiva secundária.
  44. 44. Método para a clivagem selectiva oxidativa de um N-terminal de serina ou treonina de uma proteína bioativa, sem oxidar funcionalmente os resíduos de aminoácidos essenciais da referida proteína bioativa, que compreende: a) ajustar a concentração de iões de hidrogénio de uma solução da referida proteína bioativa a uma pH entre cerca de 7 e cerca de 8; b) misturar a dita solução de proteína bioativa com cerca de 0,5 a cerca de 5 moles de um periodato por mole de proteína bioativa; e c) incubar a referida mistura pelo menos uma hora a uma temperatura de entre cerca de 2°C e cerca de 40°C.
  45. 45. Método da reivindicação 44, em que a referida proteína bioativa é um interferão-beta.
  46. 46. Método da reivindicação 45, em que o referido interferão-beta é o interferão-3~lb que tem a sequência de aminoácidos especificada na SEQ ID NO: 1. 8
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