CN102319437B - 具有增强的生物学效用的干扰素‑β的聚合物缀合物 - Google Patents

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Abstract

提供了合成细胞因子和其受体结合拮抗剂，特别是非糖基化的干扰素β，的聚合物缀合物的方法，该缀合物保留了非常高的生物学效能。根据本发明方法制备聚合物缀合物消除或避免了受体‑配体相互作用的空间抑制，该空间抑制通常产生于聚合物向细胞因子的受体结合区域及其激动性和拮抗性类似物的附着。本发明也提供了由这些方法生产的缀合物和组合物。本发明也提供了含有此类缀合物和/或组合物的试剂盒，以及这些缀合物和组合物在各种诊断、预防、治疗和生物处理应用中的使用方法，包括治疗多发性硬化。

Description

具有增强的生物学效用的干扰素-β的聚合物缀合物
本申请是申请日为2003年12月23日、申请号为200380109034.4、发明名称为“具有增强的生物学效用的干扰素-β的聚合物缀合物”的发明专利申请的分案申请。
发明背景
技术领域
本发明属于蛋白质生物化学及药学和医学领域。具体而言，本发明提供一种由水溶性聚合物(例如聚(乙二醇)及其衍生物)联结细胞因子(例如β干扰素)产生缀合物的方法，相较于以标准合成方法合成的相同细胞因子的聚合物缀合物，该缀合物的效能增加。本发明也提供依该方法制作的缀合物，包含该缀合物的组合物，包含该缀合物以及组合物的试剂盒以及使用该缀合物和组合物预防、诊断以及治疗各种医学和兽医病症的方法。本发明也提供在某些条件下还原烷化以确定聚合物附着位点的方法。
相关技术
下列相关技术的描述包括解释本案不属于现有技术的部份。细胞因子是一种分泌的调控蛋白，其以内分泌、旁分泌或自分泌的方式控制细胞的生存、生长、分化、和/或效应物功能(参见Nicola，N.A.(1994)in：Guidebook to Cytokines and Their Receptors，Nicola，N.A.，ed.，pp.1-7，Oxford University Press，New York)。由于细胞因子的效能、特异性、分子小以及较易在重组生物体中产生，因此具有许多潜在的治疗剂用途。
细胞因子及重组蛋白质作为治疗剂在发展上有二个重大阻碍：其在循环系统中的半衰期短及潜在的抗原性和免疫原性。在本文及在本 领域中，术语″抗原性″意指分子结合于已存在的抗体的能力，而术语″免疫原性″意指分子在活体内唤起免疫反应的能力，不论该反应是否涉及形成抗体(″体液反应″)或刺激细胞免疫反应。
施用重组型治疗性蛋白质时，为了达到最高循环活性及减少生物利用度和降解方面的问题，经常采取静脉内(i.v.)施用。然而，以i.v.施用后，小蛋白质的半衰期通常极短(参阅例如Mordenti，J.，等人，(1991)Pharm Res 8：1351-1359；Kuwabara，T.，等人，(1995)Pharm Res 12：1466-1469)。一般而言，健康的肾脏可保留血液中水动力半径大于血清白蛋白(即Stokes半径约 以及分子量约66,000道尔顿，66kDa)的蛋白质。然而，较小型的蛋白质，包括细胞因子，例如：粒细胞集落刺激因子(″G-CSF″)、白细胞介素-2(″白细胞介素2″)、干扰素-α(″干扰素-α″)以及干扰素-γ(″干扰素-γ″)，则经肾小球的过滤快速地从血流中消除(Brenner，B.M.，等人，(1978)Am J Physiol 234：F455-F460；Venkatachalam，M.A.等人，(1978)Circ Res 43：337-347；Wilson，G.，(1979)J Gen Physiol74：495-509；Knauf，M.J.，等人，(1988)J Biol Chem263：15064-15070；Kita，Y.，等人，(1990)Drug DesDeliv6：157-167；Rostaing，L.，等人，(1998)，J Am Soc Nephrol9：2344-2348)。结果，不易在施用后使循环中保有适当治疗浓度的重组型小蛋白质。因此，一般必须施用较高浓度的蛋白质且注射次数更频繁。该方式产生的疗程使治疗成本提高，降低病人的顺服性并增加副作用的风险，例如免疫反应。细胞以及体液免疫反应会使在循环系统中重组蛋白质的注射浓度减低，以致于抵消施用有效剂量，或导致影响治疗成效的情形，包括清除加速、中和功效及过敏性反应(Ragnhammar，P.，等人，(1994)Blood 84：4078-4087；Wadhwa，M.，等人，(1999)Clin Cancer Res 5：1353-1361；Hjelm Skog，A.-L.，等人，(2001)Clin Cancer Res7：1163-1170；Li，J.，等人，(2001)Blood 98：3241-3248；Basser，R.L.，等人，(2002)Blood99：2599-2602；Schellekens，H.，(2002)Clin Ther 24：1720-1740)。
目前已有许多研究着力于通过聚(乙二醇)(″PEG″)的共价附着来修饰重组蛋白质以改善上述缺点(评估于Sherman，M.R.，等人，(1997)in：Poly(ethylene glycol)：Chemistry and Biological Applications，Harris，J.M.，等人，eds.，pp.155-169，American Chemical Society，Washington，D.C.；Roberts，M.J.，等人，(2002)Adv DrugDeliv Rev 54：459-476)。将PEG附着在蛋白质上已显示能在活体内稳定蛋白质，改良其生物利用度和/或减低其免疫原性。(PEG共价附着至蛋白质或其它底物，在本文中以及本领域中称为″PEG化作用″。)此外，PEG化作用可显著的增加蛋白质的水动力半径。当小蛋白质，例如细胞因子，偶联至单一长链的PEG(例如，其分子量至少约18kDa)，所产生的缀合物的水动力半径大于血清白蛋白，其经由肾小球自循环系统中清除会显著减缓。PEG化的组合效应：蛋白质水解降低、免疫识别降低以及肾清除速率降低，均赋予PEG化蛋白质作为治疗剂的实质优点。
自1970年代以来即已尝试使用共价附着聚合物来改良各种医药用蛋白质的安全性和功效(参阅，例如Davis，F.F.，等人，U.S.Patent No.4,179,337)。一些实例包括：将PEG或聚(环氧乙烷)(″PEO″)偶联至腺苷脱氨酶(EC 3.5.4.4)以治疗重症联合免疫缺陷疾病(Davis，S.，等人，(1981)Clin Exp Immunol 46：649-652；Hershfield，M.S.，等人，(1987)NEngl J Med 316：589-596)；偶联至超氧化物岐化酶(EC 1.15.1.1)以治疗炎性病症(Saifer，M.，等人，美国专利第5,006,333以及5,080,891号)以及偶联至尿酸氧化酶(EC1.7.3.3)以从血液和尿液中去除过量的尿酸(Kelly，S.J.，等人，(2001)J Am Soc Nephrol12：1001-1009；Williams，L.D.，等人，PCT公告第WO 00/07629A 3号以及美国专利第6,576,235号；Sherman，M.R.，等人，PCT公告第WO 01/59078 A2号)。
PEOs以及PEGs是一种由共价联结的环氧乙烷单位所组成的聚合物。此类聚合物有下列的一般结构：
R1-(OCH2CH2)n-R2
其中R2可为羟基(或其反应性的衍生物)，而R1可为氢(如二羟基PEG(″PEG diol″)中的)、甲基(如单甲氧基PEG(″mPEG″)中的)、或其它低级烷基，例如异丙氧基PEG或叔丁氧基PEG中的。PEG通式的参数n为聚合物中环氧乙烷单位的数目，在本文及在本领域中是指″聚合度″。相同通式的聚合物(其中R1为C1-7烷基团)，也称为环氧乙烷衍生物(Ya sukohchi，T.，等人，美国专利第6,455,639号)。PEGs以及PEOs可为线性、分支(Fuke，I.，等人(1994)JControl Release30：27-34)或星形状(Merrill，E.W.(1993)J Biomater Sci Polym Ed 5：1-11)。PEGs以及PEOs是两性化合物，即其可溶解于水和某些有机溶剂中，且其可黏附至内含脂质的材料，包括有包膜病毒及动物和细菌细胞的细胞膜。某些环氧乙烷(OCH2CH2)以及具有下列结构的环氧丙烷的随机或嵌段或交替共聚物：
其性质与PEG很相似，此类共聚物在某些用途上可作为PEG适当的代替物(参阅例如，Hiratani，H.，美国专利第4,609,546号以及Saifer，M.，等人，美国专利第5,283,317号)。本文术语″聚环氧烷″及缩写″PAOs″意指此类共聚物、PEG或PEO及聚(氧亚乙基-氧亚甲基)共聚物(Pitt，C.G.，等人，美国专利第5,476,653号)。本文术语″聚亚烷基二醇″及缩写″PAGs″一般是指适用于本发明缀合物的聚合物，尤其是指PEGs，更明确的说是指内含单一的反应性基团的PEGs(″单官能性活化的PEGs″)。
PEG或其它聚环氧烷共价附着至蛋白质，需要转化聚合物中至少一个末端基团成具反应性的官能团。此方法通常称为″活化″，此产物则被称为″活化的PEG″或活化的聚环氧烷。在该方法中最常用的单甲氧基PEGs是在其中一个末端上的氧被不具反应性的、化学稳定的甲基加帽(产生″甲氧基″)，且在另一末端则有对蛋白质分子上的氨基具反应性的官能团。较少使用所谓的″分支″mPEGs，其在单一活化的官能团的远端含有两个或多个甲氧基。分支PEG的实例是二-mPEG-赖氨酸， 其中PEG偶联至两个氨基，而赖氨酸的羧基团大部份则是用N-羟基琥珀酰亚胺的酯化作用活化(Martinez，A.，等人，美国专利第5,643,575号；Greenwald，R.B.，等人，美国专利第5,919,455号；Harris，J.M.，等人，美国专利第5,932,462号)。
通常活化的聚合物可和具有亲核官能团(作为附着位点)的生物活性化合物反应。通常作为附着位点的一个亲核官能团是赖氨酸残基的ε氨基。溶剂易接近的α-氨基、羧酸基团、胍基团、咪唑基团、适当活化的羰基、氧化的糖类部份和硫醇基也可作为附着位点。
在附着至蛋白质之前，PEG的羟基已用三聚氰酸氯化物活化(Abuchowski，A.，等人，(1977)J Biol Chem 252：3582-3586；Abuchowski，A.，等人，(1981)Cancer Treat Rep65：1077-1081)。不过，使用此方法却有缺点，例如三聚氰酸氯化物的毒性以及它对于具有非氨类官能团的蛋白质(例如对其功能很重要的一些溶剂易接近的半胱氨酸或酪氨酸残基)的非专一反应性。为了克服此类以及其它缺点，可引入另外活化的PEGs，例如PEG的琥珀酰亚氨基琥珀酸衍生物(″SS-PEG″)(Abuchowski，A.，等人，(1984)Cancer BiochemBiophys 7：175-186)、PAG的琥珀酰亚氨基碳酸衍生物(″SC-PAG″)(Saifer，M.，等人，美国专利第5,006,333号)以及PEG的醛衍生物(Royer，G.P.，美国专利第4,002,531号)。
通常，数链(例如5至10)的一个或多个PAGs，例如一个或多个PEG(分子量约5kDa至约10kDa)可经由伯氨基(赖氨酸残基的ε氨基以及N-端氨基酸的α氨基)偶联至目标蛋白质。最近，已合成内含较高分子量(例如，12kDa，20kDa或30kDa)的单链mPEG的缀合物。缀合物血浆的半衰期与增加的分子量和/或增加的偶联PEG的链数之间有直接的相关(Knauf，M.J.，等人，supra；Katre，N.V.(1990)J lmmunol 144：209-213；Clark，R.，等人，(1996)JBiolChem 271：21969-21977；Bowen，S.，等人，(1999)Exp Hematol27：425-432；Leong，S.R.，等人，(2001)Cytokine 16：106-119)。另一方面，增加PEG偶联至各蛋白质分子的链数目，则修饰蛋白质(尤 其是受体-结合蛋白质)必需区域的氨基以及因此损害蛋白质的生物学功能的几率将会增加。对于含有许多氨基的较大型蛋白质，以及对低分子量底物的酶而言，增加反应时间而减低比活性是可接受的，因为其可使内含PEG的缀合物在活体内的生物活性净增加。然而对于一些通过与细胞表面受体相互作用形使功能的较小型蛋白质(例如细胞因子)而言，则已有研究报导指出，较高取代程度会减少功能活性，甚至于其使血液半衰期加长的优点也不足以补偿(Clark，R.，等人，同上)。
因此，为了延长治疗性蛋白质(例如酶)的生物活性及降低免疫原性，聚合物缀合技术已为大家接受(参阅例如，美国临时申请案第60/436,020号，申请日期2002年12月26日，以及美国临时申请案第60/479,913以及60/479,914号，两者的申请日期为2003年6月20日，其全文在此并入参考文献)。特别能从降低的免疫原性获益的一类治疗性蛋白质是干扰素β，尤其是干扰素-β-1b(″IFN-β-1b；SEQ ID NO：1)(The IFNB Multiple SclerosisStudy Group(1996)Neurology 47：889-894)。然而，聚合物与通过细胞表面受体的专一性结合而作用的调控蛋白质进行缀合通常会：(1)干扰该结合作用；(2)显著地缩小细胞因子激动剂的信号传导功效；以及(3)显著地缩小细胞因子拮抗剂的竞争性功效。该受体-结合活性降低的缀合物已发表的实例包含粒细胞集落刺激因子(″G-CSF″)(Kinstler，0.，等人，PCT公告第WO 96/11953号；Bowen，S.，等人，同上)；人类生长激素(″hGH″)(Clark，R.，等人，同上)；hGH拮抗剂(Ross，R.J.M.，等人，(2001)J Clin Endocrinol Metab 86：1716-1723；以及干扰素-α(Bailon，P.，等人，(2001)Bioconjug Chem 12：195-202；Wylie，D.C.，等人，(2001)Pharm Res 18：1354-1360；和Wang，Y.-S.，等人，(2002)Adv Drug Deliv Rev 54：547-570)等的聚合物缀合物。极端的例子中，聚合物与白细胞介素-15(″IL-15″)偶联可将该IL-2类生长因子转换成细胞增殖抑制剂(Pettit，D.K.，等人，(1997)J Biol Chem 272：2312-2318)。不受限于理论，此PEG 化的不佳效应的机制可能涉及在受体相互作用中因大体积的PEG基团造成的空间障碍、电荷中和，或以上两者。
因此，需要产生内含PAG(例如内含PEG和/或PEO)的缀合物的方法，尤其是水溶性聚合物以及受体结合蛋白质之间的缀合物，并保存实质上的生物活性(例如至少约40％)，几乎完全的生物活性(例如至少约80％)或基本上完全的生物活性(例如至少约90％)。相较于传统的聚合物缀合物，在预防性、治疗性或诊断目的下对动物引入缀合物，该缀合物将可在活体内提供有聚合物成分导致的增加的溶解度、稳定性以及生物利用度，并大大地提高效能或功用。
发明概述
本发明能满足以上的需要，并提供方法制备水溶性聚合物，例如聚(乙二醇)及其衍生物，与生物活性成分，尤其是受体-结合蛋白质，尤其是治疗的或诊断的生物活性成分，例如细胞因子(包括干扰素β，最明确的说是干扰素-β-1b)的缀合物。本发明也提供由该方法产生的缀合物。相较于对应的非缀合的生物活性成分，本发明缀合物可增加稳定性(即较长的储存期限以及在活体内较长的半衰期)。此外，相较于具相同生物活性成分且聚合物随机附着在多肽键主链上溶剂易接近的位点所制备的缀合物，本发明缀合物可增加受体-结合活性，其可在体外测量或使用，并增加效能，其可在体外或在活体内测量。此外，本发明也提供包含该缀合物的组合物、内含该缀合物及组合物的试剂盒以及在各种治疗的以及诊断方案中使用此缀合物及组合物的方法。
在一个实施方案中，本发明提供提高细胞因子效能的方法。依据本发明此方面的某些方法包含，例如：选择性地偶联一个或多个合成的水溶性聚合物至细胞因子的氨基端氨基酸，其中氨基端氨基酸位于细胞因子的一个或多个受体-结合功能域的远端。本发明提供用以提高细胞因子的效能的相关方法包含：例如在位于或接近一个或多个细胞因子糖基化作用位点上选择性地偶联一个或多个合成的水溶性聚合 物，其中一个或多个糖基化作用位点位于细胞因子的一个或多个受体-结合功能域的远端。
应用于本发明此类方法的适当聚合物包括(但非限于)：一种或多种聚亚烷基二醇(包括，但非限于：一种或多种聚(乙二醇)、一种或多种单甲氧基-聚(乙二醇)以及一种或多种单羟基聚(乙二醇))、一种或多种聚环氧烷、一种或多种聚环氧乙烷、一种或多种聚烯醇类例如聚乙烯醇、一种或多种聚羧酸酯、一种或多种聚(乙烯基吡咯烷酮)、一种或多种聚(氧亚乙基-氧亚甲基)、一种或多种聚(氨基酸)、一种或多种聚丙烯酰基-吗啉、一种或多种由一种或多种酰胺以及一种或多种烯化氧组成的共聚物、一种或多种葡聚糖以及一种或多种透明质酸。适于应用于本发明方法的聚合物典型地分子量介于约1kDa至约100kDa之间(包含端值)，或更明确的说是分子量介于约8kDa至约14kDa之间(包含端值)；分子量介于约10kDa至约30kDa之间(包含端值)；分子量介于约18kDa至约22kDa之间(包含端值)；或约20kDa或约30kDa。
各种细胞因子以及模仿或对抗经专一性细胞-表面受体介导的对应的细胞因子生物学效应的类似物均适用于制备本缀合物。此类化合物包含具有四个螺旋束结构的细胞因子(包括，但非限于：粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落-刺激因子(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落-刺激因子(GM-CSF)、白血病抑制性因子(LIF)、红细胞生成素(Epo)、促血小板生成素(Tpo)、干细胞因子(SCF)、Flt3配体、制癌蛋白M(OSM)、白细胞介素-2(IL-2)、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12(p35亚基)、IL-13、IL-15、IL-17、干扰素-α(IFN-α)、干扰素β(IFN-β)(尤其是IFN-β-1b)、干扰素共有序列以及其突变蛋白、变异体、类似物以及衍生物)以及具有β-片层或β-桶状结构的细胞因子(包括，但非限于：肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-1α、IL-1β、IL-12(p40亚基)、IL-16、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性FGF、FGF-4以及角质细胞生长因 子(KGF；FGF-7)、以及其突变蛋白、变异体、类似物以及衍生物)。
适用于本发明的尤佳的细胞因子包含白细胞介素2；干扰素-α；干扰素-β；IGF-1；EGF以及bFGF。也尤其适合使用的是前述的细胞因子与此类细胞因子的突变蛋白、变异体以及衍生物的竞争性拮抗剂。
在某些实施方案中，此一个或多个聚合物是共价偶联(尤其是经由仲胺联结)至细胞因子氨基端氨基酸的α氨基。在其它实施方案中，一个或多个聚合物是共价偶联至细胞因子上氨基端氨基酸的化学反应性侧链基团(例如：羟基、硫氢基、胍基、咪唑基、氨基、羧基或醛衍生物)。在其它实施方案中，聚合物在细胞因子的氨基端氨基酸或位于或接近一个或多个糖基化作用位点上偶联至细胞因子可以模仿糖基化作用的有利效应。在相关的实施方案中，聚合物在细胞因子的一个或多个糖基化作用位点或接近一个或多个糖基化作用位点上偶联至细胞因子可以模仿过糖基化作用的有利效应，其中″过糖基化作用″意指共价附着上除了那些天然存在的结构以外的简单或复合的糖类部份。
本发明也提供本发明方法产生的缀合物。本发明缀合物包含选择的细胞因子或其选择的拮抗剂(例如如上所述)，其偶联至一个或多个合成的水溶性聚合物(例如如上所述)，其中一个或多个聚合物偶联至细胞因子的氨基端氨基酸以及其中氨基端氨基酸位于选择的细胞因子的一个或多个受体-结合功能域的远端。此外，本发明缀合物包含选择的细胞因子或其选择的拮抗剂(例如如上所述)，其偶联至一个或多个合成的水溶性聚合物(例如如上所述)，其中一个或多个聚合物偶联至选择的细胞因子的一个或多个糖基化作用位点以及其中一个或多个糖基化作用位点位于细胞因子的一个或多个受体-结合功能域的远端。聚合物缀合至本发明激动剂时，宜使聚合物附着位点位于所有受体-结合功能域的远端。聚合物缀合至本发明的某些拮抗剂时，优选地，聚合物附着位点位于某些结合所必需的受体结合功能域的远端，但不一定远离激动剂的信号传导所必需的所有受体-结合功能域。本发明也提供组合物，尤其是药物组合物，包含一种或多种本发明缀合物 以及一种或多种其它成分，例如一种或多种医药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。本发明也提供包含一种或多种本发明的缀合物、组合物、和/或药物组合物的试剂盒。
本发明也提供预防、诊断、或治疗患有或易患有身体病症的动物(例如哺乳动物，例如人类)中身体病症的方法。该方法包含，例如：对动物施用有效量的一种或多种本发明缀合物、组合物或药物组合物。依据本发明方法可适当地治疗或预防的身体病症包括，但非限于：癌症(例如：乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、肺癌、白血病、淋巴瘤、结肠癌、胃肠的癌症、胰腺癌、膀胱癌、肾癌、骨癌、神经癌症、头部以及颈癌症、皮肤癌、肉瘤、癌、腺癌以及骨髓癌)；传染性疾病(例如：细菌疾病、真菌疾病、寄生虫病以及病毒疾病(例如：病毒性肝炎、亲心性病毒(cardiotropic virus)引起的疾病、HIV/AIDS、及其类似者)；以及遗传疾病(例如：贫血、中性血细胞减少症、血小板减少症、血友病、侏儒症以及重症联合免疫缺陷(″SCID″)；自体免疫病症(例如：牛皮癣、全身性红斑狼疮以及类风湿性关节炎)以及神经变性疾病(例如：各式各样不同形式以及阶段的多发性硬化(″MS″)，例如：复发性-缓解型MS、原发性进行性MS以及继发性进行性MS；克雅二氏病(Creutzfeldt-Jakob Disease)；阿尔茨海默病；及其类似者)。
相关的实施方案中，本发明也提供确定经还原烷化合成的聚合物-蛋白质缀合物中聚合物数量的方法，所述聚合物附着至具有N-端丝氨酸残基蛋白质的氨基末端。依据本发明此方面的方法包含，例如：(a)将缀合物与充分量的氧化剂反应充分的时间以将聚合物从蛋白质的丝氨酸残基裂解；以及(b)测量制备物中非缀合蛋白质比例的增加。依据该方法适用的蛋白质包括，但非限于：细胞因子(包括干扰素β(尤其是干扰素-β-1b，其优选地具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列)以及巨核细胞生长和发生因子(megakaryocyte growth anddevelopment factor))。用于某些本发明方法的氧化剂为高碘酸盐，包括但非限于：偏高碘酸钠、偏高碘酸钾、偏高碘酸锂、高碘酸钙、高碘酸钡以 及高碘酸。测量制备物中非缀合合蛋白质比例增加的适当方法包含本领域已知的任何蛋白质和肽分析方法，包括例如：大小排阻层析、反相色谱法、胶体电泳、毛细管电泳、超高速离心、超滤法、光散射以及质谱法。
其它相关的实施方案中，本发明提供方法选择性的氧化裂解生物活性的蛋白质N-端丝氨酸残基而不氧化该生物活性的蛋白质功能必需的氨基酸残基。某些本发明方法包含，例如：(a)调整生物活性的蛋白质溶液的氢离子浓度至pH约5至约10，更佳者调整pH至约7至约8；(b)将生物活性的蛋白质溶液与高碘酸盐(每摩尔生物活性蛋白质约0.1摩尔至约10摩尔高碘酸盐，或更佳者约0.5摩尔至约5摩尔高碘酸盐)混合；以及(c)反应该混合物至少一个小时，较佳者反应温度介于约2℃至约40℃之间。依据该方法适用的蛋白质包括，但非限于：细胞因子(包括干扰素β(尤其是干扰素-β-1b，其优选具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列)。
其它实施方案中，本发明提供增加制备的干扰素β，尤其是制备的干扰素-β-1b的生物效力的方法，该方法包含去除干扰素β(或干扰素-β-1b)制剂的一种或多种抑制性成分。依据本发明此方面，可从制剂经各种本领域已知的蛋白质和肽加工、纯化和/或分析方法移除一种或多种抑制性成分，该方法包括(但非限于)一种或多种层析法，例如大小-排阻层析、反相色谱法、疏水性相互作用色谱法以及亲和层析法。测定给定的干扰素β制备物其生物效力(即相对于干扰素β储备溶液，效能是否增加、减低或不受影响)，可用本领域技术人员熟知的任何在体外或在活体内的方法测定加以完成。例如，响应于干扰素β的细胞培养分析可用于测定干扰素β制剂的生物效力。适当的该细胞培养测定的非限制性实例包含抗增殖测定、抗病毒测定、信号传导测定以及基因活化测定，该实例为本领域普通技术人员熟知的方法。
本领域普通技术人员在参见下列图示以及本发明的描述以及权利要求后，即能了解本发明其它的较佳实施方案。
附图简述
图1至8显示基于晶体学数据以RasMol软件创造的各式不同的细胞因子及生长因子的分子模式(Sayle，R.A.，等人，(1995)Trends Biochem Sci 20：374-376)。除某些特定的残基(用″球-和-棒″版式表示)外，各模式是以″带″或″卡通(cartoon)″版式表示。此类版式是用RasMol软件选择。黑的条带部分代表细胞因子以及生长因子的功能域，据报导该功能域与其受体的结合相关。于各结构中，指出蛋白质数据库(″PDB″)的编码(参阅Laskowski，R.A.，(2001)Nucleic Acids Res 29：221-222；Peitsch，M.C.，(2002)Bioinformatics18：934-938；Schein，C.H.，(2002)Curr Pharm Des 8：2113-2129)。
图1a显示干扰素-α-2a的模型，其中四个赖氨酸残基(Lys 31、Lys 121、Lys 131以及Lys 134)报导为Roche′s PEG-干扰素产物 的PEG化主要位点，以″球-和-棒″的版式显示(基于Bailon，P.，等人的数据，同上)。涉及结合至受体的区域(″结合部位1以及2″)也经确认。Pegasys中聚乙二醇化的所有四个赖氨酸残基均位于结合部位1的区域。(PDB编码1ITF)
图1b显示干扰素-α-2b的模型，其中Schering-Plough′s 的PEG化主要位点的残基(His 34、Lys 31、Lys 121、Tyr 129以及Lys 131)，以″球-和-棒″的版式显示(基于Wylie，D.C.，等人的数据，同上)。此类氨基酸残基位于结合部位1的区域。
图1c显示干扰素-α-2b的模型，其中氨基端的半胱氨酸残基(“Cys 1”)，依据本发明是PEG化的目标，以″球-和-棒″的版式显示。Cys 1距离结合部位1以及2很遥远。
图1d显示相同于图1c的干扰素-α-2b的模型，其中单链的20-kDa PEG附着至N-端半胱氨酸残基(″Cys 1″)。PEG结构是使用Lee，L.S.，等人，(1999)Bioconjug Chem 10：973-981中描述的程序经修改后产生并且与蛋白质有相同的比例。
图2显示人类干扰素β-1a(参阅SEQ ID NO：2)的分子模型，其中也指出数个赖氨酸残基(Lys 19、Lys 33、Lys 99以及Lys 134) 是位于受体-结合功能域之内或与受体-结合功能域毗连。此外，糖基化作用位点(Asn 80)以及N-端甲硫氨酸残基(″Met I″)以″球-和-棒″的版式显示(基于Karpusas，M.，等人，(1997)Proc Natl Acad Sci USA 94：11813-11818；Karpusas，M.，等人，(1998)Cell Mol Life Sci 54：1203-1216；Runkel，L.，等人，(2000)Biochemistry39：2538-2551的数据)。Met 1距离结合部位1以及2遥远，而数个赖氨酸残基位于受体-结合功能域之内。(PDB的编号为1AUI)干扰素-β-1b(参阅SEQ ID NO：1)的结构与干扰素-β-1a不同，其缺少N-端甲硫氨酸残基以及糖类部分，但其具有取代不成对的半胱氨酸残基的丝氨酸残基(SEQ ID NO：2的Cys 17)。
图3显示人类粒细胞-巨噬细胞集落-刺激因子(″GM-CSF″)的分子模型，其中位于受体-结合功能域内的三个赖氨酸残基(Lys 72、Lys107以及Lys 111)，以及晶体结构中可目视的接近氨基末端的第一个氨基酸残基(″Arg 4″)，以″球-和-棒″的版式显示(基于Rozwarski，D.A.，等人，(1996)Proteins 26：304-313的数据)。GM-CSF的氨基端区域位于结合部位1以及2的远方。(PDB编码2GMF)
图4显示人类白细胞介素-2的分子模型，其中涉及各三个受体(α、β以及γ)的氨基酸残基用″球-和-棒″的版式表示，受体-结合功能域内或接近受体-结合功能域的数个赖氨酸残基也用″球-和-棒″的版式表示。晶体结构中可目视的氨基末端最接近的氨基酸残基是丝氨酸6(″Ser 6″)，其位于受体-结合功能域远方(基于Bamborough，P.，等人的数据，(1994)Structure 2：839-851；Pettit，D.K.，等人，同上)。(PDB编号3I NK)
图5显示人类表皮生长因子(″EGF″)分子模型的″卡通″版式，除了参与受体结合的残基以及受体-结合区域毗连的二个赖氨酸残基(Lys 28以及Lys 48)。链内的二硫键用虚线展示。基于晶体结构建立了该模型，晶体结构内可目视的最接近氨基末端的氨基酸残基是半胱氨酸6(″Cys 6″)(基于Carpenter，G.，等人，(1990)J Biol Chem 265：7709-7712；Lu，H.-S.，等人，(2001)JBiol Chem 276：34913-34917的数据)。晶体结构内不可目视的EGF氨基末端的柔软部分(残基1-5)似乎不位于受体-结合区域。(PDB编号1JL9)
图6显示碱性成纤维细胞生长因子(″bFGF″)分子模型的″卡通″版式，其中涉及结合至受体以及肝素的残基是以″球-和-棒″的版式呈现(基于Schlessinger，J.，等人，(2000)Mol Cell 6：743-750的数据)。从氨基末端起算前12个氨基酸残基不涉及受体结合。(PDB编号1FQ9)
图7显示胰岛素样生长因子-1(″IGF-1″)分子模型的″卡通″版式，除了参与受体结合的残基(23-25以及28-37)，以及谷氨酸残基3(″Glu3″)，其为晶体结构中可目视的最接近氨基末端的氨基酸残基。二个赖氨酸残基已被确认，其一毗连受体-结合功能域(Lys 27)，另一则远离受体-结合功能域(基于Brzozowski，A.M.，等人，(2002)Biochemistry 41：9389-939的数据)。IGF-1氨基末端位于受体-结合功能域远端。(PDB编号1GZR)
图8显示干扰素-γ(″干扰素-γ″)的分子模型，其为同二聚体。为了阐明二多肽键的相互作用，一个单体(″链A″)用″条带″的版式展示以及另一个用(″链B″)″骨架″的版式展示。赖氨酸残基沿着多肽键存在(展示于浅色的″球以及棒″的版式)，包括涉及单体之间界面区域或毗连参与受体结合的氨基酸残基的区域。干扰素-γ的氨基端区域则远离二聚作用的界面，但谷氨酰胺1(Gln 1)则参与受体结合。(Thiel，D.J.，等人，(2000)Structure 8：927-936；PDB编码IFG9)
图9为内含干扰素、20-kDa mPEG-醛以及还原剂的反应混合物经阳离子交换层析法显示的未聚乙二醇化的干扰素-α-2b(″IFN″)、单聚乙二醇化的干扰素-α-2b(″PEG1-IFN″)以及二聚乙二醇化的干扰素α-2b(″PEG2-IFN″)级分。
图10为展示于图9分离的反应混合物以及收集自其结果展示于图9的离子-交换柱的选择级分的大小排阻色谱分析。
图11显示内含人类白细胞介素2、20-kDa mPEG-醛以及还原剂的反应混合物的阳离子交换层析分级。在指定的洗脱条件下，未聚乙二 醇化的白细胞介素2残留物不会自管柱洗脱出，此结果与展示于图9的干扰素-α-2b不同。
图12显示如展示于图11分离的反应混合物以及经该管柱洗脱的选择级分的大小排阻色谱分析。
图13显示聚乙二醇化的白细胞介素-2(″PEG-I L-2″)反应混合物以及其色谱展示于图11的阳离子-交换柱层析级分的电泳分析。
图14描述以各式各样浓度(″1x″、″2x″或″4x″)的20kDa mPEG醛以氰基硼氢化钠(NaBH3CN)作为还原剂还原烷化形成的缀合物经大小排阻HPLC解析的干扰素-β-1b(″IFN″)。在此类条件下，缀合物中内含一链PEG(″PEG1-IFN″)或二链(″PEG2-IFN″)可解析自未偶联PEG的干扰素(″Mock聚乙二醇化的IFN″)。
图15显示过碘酸钠氧化分裂约90％的在各种不同条件下还原烷化合成的PEG1-干扰素-β。十二烷基硫酸钠(″SDS″)存在下以大小排阻HPLC从切割产物(包括甲醛以及N-端丝氨酸分解成醛的干扰素(″IFN Aldehyde″))解析残留的PEG1-干扰素-β。
图16描述从Mock聚乙二醇化的干扰素-β、未结合的PEG、未结合的SDS以及反应混合物次要成分以反相色谱法解析PEG1-干扰素-β。
图17描述PEG化反应混合物分析性反相(″RP″)色谱法以及制备型RP管柱的富含PEG1-干扰素-β(级分51)或对照组聚乙二醇化的干扰素-β(级分53)级分的结果。
图18描述PEG化反应混合物以及制备型RP管柱级分的富含PEG1-干扰素-β(级分51)或内含一链以上PEG缀合物(级分49)的电泳分析的结果。凝胶用荧光染料对蛋白质染色以及在紫外线照明下拍照。染色强度用柯达1D影像软件测量。
图19描述图18样品电泳分析的结果，所不同的是，凝胶用内含BaCl2、I2以及KI的试剂对PEG进行染色。如图18测量凝胶照片的染色强度。反应混合物中可侦测到残留的游离20-kDa PEG的吸收峰。
图20描述干扰素-β-1b样品的反相色谱，样品为未经处理(顶 端曲线)或经0.5mM浓度NaIO4反应，其是分解主要以及次要成分的N-端丝氨酸残基产生醛衍生物(中间的曲线)、或被NaIO4氧化并和9-芴基甲基肼基甲酸酯(″Fmoc-肼基甲酸酯″)反应。次要成分(″吸收峰A″)含有氧化的甲硫氨酸残基。氧化后吸收峰A以及主要的成分的滞留时间的相似增加反映了各吸收峰N-端丝氨酸残基被裂解为醛。在此类条件下与NaIO4反应之后没有侦测到吸收峰A百分比的增加。和Fmoc-肼基甲酸酯反应之后增加滞留时间及吸光度，指出从氧化形式的吸收峰A以及主要的成分形成Fmoc缀合物。
图21显示20-kDa PEG-肼基甲酸酯和干扰素-β醛衍生物反应合成的PEG1-干扰素-β。蛋白质和0.125mM浓度NaIO4在室温下反应0.5、1或2小时之后检测缀合物的增加比例，显示在此类条件下需要1小时以上将N-端丝氨酸完全转变成醛。PEG1-干扰素-β无法在大小-排阻柱中完全与20-kDa PEG-肼基甲酸酯解析。
图22显示稀释的PEG1-干扰素-β(反相色谱法纯化的级分51，其特征示于图17-19)比稀释的干扰素-β储备溶液对人类Burkitt′s淋巴瘤细胞(Daudi细胞)有较大的抗增殖能力。纯化的PEG1-干扰素-β抑制50％此类细胞的生长须要的浓度是约40皮克/毫升，约是干扰素-β储备溶液的六分之一。纯化的Mock聚乙二醇化的干扰素-β(展示于图17的反相色谱的级分53)抑制50％此类细胞的生长须要的浓度是约80皮克/毫升，约是干扰素-β储备溶液的三分之一。
发明详述
除非另行定义，本文中所有技术的及科学的术语与本领域技术人员常用的术语有相同的意义。虽然与本发明相似或等同的任何方法及材料均可用于本发明的实施或测试，较佳的方法以及材料将描述如下。
定义
约：用于在本文中的任何数值时，本文术语″约″意指陈述的数值的±10％(例如，″约50℃″则包含45℃至55℃的温度范围(包括端值)； 同样地″约100mM″则包含90mM至110mM的浓度范围(包括端值))。
氨基酸残基：本文术语″氨基酸残基″意指特定氨基酸，通常是参与二个肽键的脱水的氨基酸，位于多肽主链或侧链的氨基酸，也指当此氨基酸只涉及一个肽键，例如位于直线的多肽键端点。在本领域中氨基酸残基是使用三字码或单字码表示。
拮抗剂：本文术语″拮抗剂″意指一种化合物、分子、部分或复合物，其可降低、实质上降低或完全地抑制给定的细胞因子经由该细胞因子的受体调节的对细胞、组织或生物体的生物和/或生理的效应。拮抗剂可用各种方法实现该效应，包括(但非限于)：和激动剂竞争细胞表面上的结合部位或受体；和激动剂相互作用以减低、实质上减低或完全地抑制激动剂结合至细胞表面受体的能力；结合并诱导细胞表面受体构像改变，使该受体改变结构而不再结合激动剂(或仅可以降低的或实质上降低的亲和力和/或效率结合)；诱导细胞、组织或生物体的生理改变(例如增加细胞内信号传导复合物；增加转录的抑制剂；减少细胞表面配体受体表达；等)，使激动剂结合或激动剂结合至细胞后诱发的生理信号降低、实质上降低或完全地抑制；以及本领域技术人员熟知的拮抗剂实现其活性的其它机制。本领域技术人员将了解，拮抗剂可带有与其拮抗的配体相似的结构(例如：拮抗剂可为激动剂的突变蛋白、变异体、片段或衍生物)，或可带有完全不相关的结构。
生物活性成分：本文术语″生物活性成分″意指一种化合物、分子、部分或复合物，其在活体内、在体外或对离体的细胞、组织、器官或生物体具有特定的生物活性，且能结合一个或多个聚亚烷基二醇以形成本发明缀合物。较佳的生物活性成分包括(但非限于)：蛋白质以及多肽，例如在此描述者。
结合：本文术语″结合″意指共价结合或附着，例如化学偶联，或非共价结合，例如：离子相互作用、疏水性相互作用、氢键等。共价键可为，例如：酯、醚、磷酸酯、硫酯、硫醚、氨基甲酸酯、酰胺、胺、肽、亚胺、腙、酰肼、碳-硫键、碳-磷键等。本文术语″结合″是广义的，以及包括例如″偶联″、″缀合″以及″附着″。
缀合物/缀合作用：本文的″缀合物″意指共价附着聚合物例如PEG或PEO至生物活性成分例如蛋白质或糖蛋白质得到的产物。″缀合作用″意指形成上一句子定义的缀合物。任何本领域技术人员常用的聚合物与生物活性材料偶联的方法均可用于本发明。
偶联：本文术语″偶联″意指经共价键或强的非共价键的相互作用加以附着，典型且较佳者是经共价键附着。任何本领域技术人员常用的偶联生物活性材料的方法均可用于本发明。
细胞因子：本文术语″细胞因子″定义为分泌的调控蛋白质，其可以内分泌、旁分泌或自分泌的方式控制细胞的生存、生长、分化、和/或效应物功能(参见Nicola，N.A.，同上；Kossiakoff，A.A.，等人，(1999)Adv Protein Chem 52：67-108)。依据此定义，细胞因子包含：白介素、集落-刺激因子、生长因子、以及各种细胞制作的其它肽因子，包括(但非限于)本文特别揭示或举例者。与其细胞因子近亲相似，多肽激素以及生长因子可经结合至目标细胞表面的专一性受体蛋白启动其调控的功能。
疾病、障碍、病症：本文术语″疾病″或″病症″意指任何人类或动物的不良病症，包括：肿瘤、癌症、过敏、成瘾、自体免疫、感染、中毒或最佳的精神或生体功能受损。″病症″用于此包括疾病以及障碍，且也指生理的状态。例如，能育性是生理的状态但不是疾病或病症。本发明组合物经降低能育性适用于预防怀孕，因此描述为治疗病症(能育性)，但不是治疗障碍或疾病。其它病症为平常的本领域技术人员所了解。
有效量：本文术语″有效量″意指给定的缀合物或组合物的量，其为必需的或足以产生所要求的生物效应的量。有效量的给定的本发明缀合物或组合物应该是可达成所选的结果的量，以及该量可用本领域技术人员熟知的常规方法测定，可使用技术上已知的和/或在此描述的方法测定，而不须要过度的实验。例如，治疗免疫系统缺限的有效量必需可导致免疫系统活化，造成抗原暴露下发生抗原-专一性免疫反应。此术语也和″充分的量″同义。任何特定用途的有效量可取决于其 处理的疾病或病症、施用的特定组合物、施用的路线、对象大小、和/或疾病或病症严重性等因子变化。平常的本领域技术人员可经实验测定本发明特定的缀合物或组合物的有效量，而不必过度的实验。
一、a、或an：本文术语″一″、″a″或″an″，除非特别说明意指″至少一个″或″一个或多个″。
PEG：用于此的″PEG″包括所有环氧乙烷聚合物，包括直线的或分支的或多臂的以及末端加帽或以羟基结尾的聚合物。″PEG″包括本领域已知的聚合物：聚(乙二醇)、甲氧基聚(乙二醇)或mPEG或聚(乙二醇)-单甲醚、烷氧基聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)或PEO、α-甲基-ω-羟基-聚(氧基-1，2-乙烷二基)以及聚环氧乙烷，以及其它用于在此领域中的环氧乙烷聚合物的名称。
PEG化、聚乙二醇化以及Mock聚乙二醇化：用于此″PEG化″意指任何共价偶联PEG与生物活性目标分子(尤其是受体-结合蛋白质)的方法。缀合产物是称为″聚乙二醇化的″产物。用于此″Mock聚乙二醇化″意指，PEG化反应混合物中未经共价附着PEG的蛋白质部分。然而，Mock聚乙二醇化的产物可于反应期间或以后的纯化步骤发生改变，例如PEG化期间由于暴露至还原剂的缘故被还原烷化和/或于加工和/或纯化步骤期间移除一个或多个抑制剂、化合物等。
多肽：本文术语″多肽″意指单体(氨基酸)经酰胺键(也为熟知的肽键)线性联结组成的分子。意指氨基酸的分子链以及不是指产物特定的长度。因此，在此定义内的多肽包含肽类、二肽、三肽、寡肽以及蛋白质。此术语也意指此多肽翻译后修饰的产物，例如糖化作用、过糖基化作用、乙酰化、磷酸化等。多肽可源自天然的生物来源或经重组DNA技术制作，但不一定是翻译自指定的核酸序列。其可以任何方式包括化学合成产生。
蛋白质和糖蛋白质：本文术语蛋白质意指多肽，一般而言其大小约10个或更多、20个或更多、25个或更多、50个或更多、75个或更多、100个或更多、200个或更多、500个或更多、1,000个或更多、或2,000个或更多氨基酸。一般而言蛋白质有明确的三维结构，尽管 它们不一定非要具有此种结构，并被认为有折叠结构，肽类以及多肽则相反，通常不拥有明确的三维结构，但却具有大量不同构像，称为未折叠结构。然而肽类也可有明确的三维结构。本文术语糖蛋白质意指经由含氧或含氮氨基酸残基(例如丝氨酸残基或天冬氨酸残基)的侧链偶联至至少一个糖类部分的蛋白质。
远端：本文术语″远端″(如″远端的N-末端氨基酸″或″远端的糖基化作用位点″)意指一种结构，其中蛋白质中一个或多个聚合物的一个或多个附着位点位于蛋白质一个或多个受体-结合区域或功能域(以分子模型评估)的远端，或在空间上位于所述区域或功能域的外面。聚合物在远端的附着位点偶合(通常为N-末端氨基酸，对于受体-结合蛋白质称为″远端的N-端″或″RN″受体-结合蛋白质)或糖蛋白质的一个或多个糖类部份或糖基化作用位点(因此受体-结合蛋白质称为″远端的糖基化作用″或″RG″受体-结合蛋白质)偶合不会导致实质上蛋白质与它的受体结合的位阻。因此，细胞因子的氨基-末端氨基酸或糖基化作用位点为″位于一个或多个受体-结合功能域的远端″，当细胞因子分别偶合(例如共价附着)水溶性聚合物至氨基-末端氨基酸或糖基化作用位点，而不实质上干扰细胞因子结合至它的受体，尤其是细胞-表面受体的能力。经确认给定的细胞因子可含有一个以上的受体-结合功能域。此情况下细胞因子的氨基-末端氨基酸或糖基化作用位点可位于一个所述功能域或一个以上的该功能域的远端，只要偶合氨基-末端氨基酸或糖基化作用位点不实质上干扰细胞因子一个或多个受体-结合功能域与它的受体的结合，仍考虑为″位于一个或多个受体-结合功能域的远端″。偶合是否实质上干扰蛋白质结合至它的受体的能力，其可使用本领域技术人员熟知的测定配体-受体结合的技术容易地测定。
如展示于本文的图1d，PEG为高度延伸且有弹性的聚合物，相对于分子量相似的蛋白质，其在溶液中占有较大体积。虽然PEG附着的氨基酸残基可距离一个或多个受体-结合部位非常遥远，然而聚合物部份在某种程度上可干扰受体结合。该干扰的几率随分子量以及溶液中聚合物占有的体积而增加。任何情况下，PEG定向地附着至一个或多 个距离受体-结合区域遥远的位点，将比随机PEG化较少地干扰细胞因子功能。
评估配体-受体结合的方法包括(但不限于)：竞争性结合测定、放射性受体结合测定、以细胞为基础的测定、表面等离子共振测定、动态的光散射、超高速离心以及超滤法。
实质上、实质上地：用于此处，若缀合的蛋白质结合至受体之速率和/或结合量不少于约40％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％或更多的其对应的未缀合细胞因子的结合速率和/或结合量，则蛋白质的联结″实质上″不干扰蛋白质结合至它的受体的能力。
治疗：本文术语″治疗″或″治疗的″意指预防和/或治疗。当例如关于传染病时，本文术语可意指预防性的治疗以增加宿主对病原体感染的抗性，换言之减低宿主将来感染该病原体以及显示该病原体感染疾病的症候的可能性，也指宿主感染之后的治疗以使宿主可对抗感染，例如：减低或消除感染或预防恶化。
概述
本发明提供合成受体结合蛋白质的聚合物缀合物的方法，相对于其中一个或多个聚合物是随机附着的相同的受体-结合蛋白质聚合物缀合物，其可出乎意料地保持高受体-结合活性。经由使用X-光结晶学以及核磁共振的结构分析、突变的分析以及分子建模软件，本案发明人确认了涉及或是不涉及结合至其受体的细胞因子PEG化目标位点。依蛋白质分类，此类细胞因子是受体结合蛋白质。选择目标聚合物附着至受体结合蛋白质不参与受体相互作用的区域的合成策略，可避免某些讨人讨厌的位阻，并且产生的聚合物缀合物可保持非常高的效能。受体结合蛋白质的氨基端残基距离一个或多个受体-结合区域或功能域非常遥远者，在此定义成″远端的N-端″或″RN″受体结合蛋白质；其包含氨基端氨基酸位于蛋白质受体-结合部位或位点远端的所有 细胞因子或其拮抗剂。
本发明其它实施方案中，制作缀合物，其包含将一个或多个合成聚合物(例如一个或多个聚乙二醇)共价偶联至天然的糖基化作用位点远离一个或多个受体-结合区域或功能域的细胞因子。依据本发明此方面，当合成聚合物偶联至糖基化作用位点区域，缀合物的生物活性成分(例如细胞因子)将显示保存良好的受体-结合活性。此受体结合蛋白质亚类称为″RG″受体结合蛋白质。当亲水性的或两性的聚合物选择性地偶联于或接近该″远端的糖基化作用″位点，尤其是当目标蛋白质是天然地糖基化的蛋白质的非糖基化形式时，则聚合物可模仿天然碳水化合物优良的效应，例如凝集、稳定性和/或溶解度。因此在或接近糖基化作用位点附着聚合物在此称为″假糖基化作用″。因此，本发明提供合成缀合物的方法，其中位点-选择性偶联的合成聚合物有效地代替天然糖类部份。相较于其它未糖基化的蛋白质形式，假糖基化作用的结果可改良溶解度、减低凝集以及延缓从血流的清除。由于原核的生物体一般而言不糖基化其表达的蛋白质，此解决方式因此尤其是可有利的制备缀合物以及蛋白质组合物，该蛋白质是用重组脱氧核糖核酸技术于原核的宿主细胞(例如细菌，例如大肠杆菌(Escherichia coli))制作的蛋白质。
类似的，糖蛋白质糖类部分的选择性PEG化可产生″假过糖基化作用″的糖蛋白质。此方法描述于例如C.Bona等人的PCT公告第WO96/40731号，其全文在此并入参考文献。若蛋白质包含天然糖基化作用信号或由重组脱氧核糖核酸技术引入的糖基化作用信号，则该方法可尤其有利的制备缀合物以及蛋白质组合物，该蛋白质为重组脱氧核糖核酸技术于真核的宿主细胞(例如酵母菌、植物细胞以及动物细胞，包括哺乳动物的以及昆虫细胞)制作的蛋白质，因为真核的生物体一般而言会糖基化其表达的蛋白质。该假糖基化的以及假过糖基化的RG受体结合蛋白质属于本发明范围之内。
如此本发明也包含保持实质上的、几乎完全的或本质上完全的受体-结合活性的″RN″受体结合蛋白质聚合物缀合物以及保持实质上的、 几乎完全的或本质上完全的受体-结合活性的假糖基化的或假过糖基化的″RG″受体结合蛋白质聚合物缀合物。本文中当细胞因子根据本发明方法缀合于一个或多个水溶性聚合物时认为其″保持实质上的、几乎完全的或本质上完全的受体-结合活性″，条件是缀合的细胞因子实质上不干扰该蛋白质结合至它的受体的能力，即缀合的蛋白质结合至它的对应受体的速率和/或结合量不少于对应蛋白质的非缀合形式的约40％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％或更多。本发明范围也包括分类成″RN″以及″RG″受体结合蛋白质的受体结合蛋白质聚合物缀合物。后者的二个实例是干扰素β(尤其是干扰素-β-Ib)以及白细胞介素2。
其它实施方案中，本发明提供合成受体结合蛋白质聚合物缀合物的方法，相对于其中一个或多个聚合物是随机附着的相同的受体-结合蛋白质聚合物缀合物，其可出乎意料地保持高受体-结合活性。本发明也提供该方法制作的缀合物，以及包含一个或多个本发明此类缀合物的组合物，其可进一步的包含一个或多个附加的成分或试剂，例如一种或多种缓冲盐，一种或多种糖类赋形剂，一种或多种载体蛋白，一种或多种酶，一种或多种去污剂，一种或多种核酸分子，一种或多种聚合物例如非缀合的PEG或聚亚烷基二醇等。本发明也提供包含本发明的缀合物和/或组合物的试剂盒。
本发明也提供医药学的或兽医组合物，其包含本发明缀合物以及至少一种医药学的或兽医学可接受的赋形剂或载体。本发明也提供使用该组合物治疗或预防各种身体病症的方法，该方法包含对患有或易患有身体疾病或病症的动物施用有效量的一种或多种本发明缀合物或组合物。
此外，本发明提供稳定的受体结合蛋白质以及于工业的细胞培养产生其的方法，因此未料到地获得实质上既保留生物活性以及在工业用途上增加持续作用期间的组合效应的高效率产品。本发明的缀合物的如此高的效能可反映于非常高的生物生产量、非常高的重组蛋白质 表达量以及增进其它生物工艺的效率。
于其它实施方案中，本发明提供增加干扰素β(尤其是干扰素-β-1b)制剂生物效力的备用方法。依据本发明此方面的方法可包含，例如从制备的干扰素β(或干扰素-β-1b)去除一个或多个抑制性成分。依据本发明此方面，可从制剂经各种本领域已知的蛋白质和肽加工、纯化和/或分析方法移除一种或多种抑制性成分，该方法包括(但非限于)一种或多种层析法，例如大小-排阻层析、反相色谱法、疏水性相互作用色谱法以及亲和层析法。实际上，测定给定的干扰素β制备物其生物效力(即相对于细胞因子干扰素β储备溶液，其效能是否增加、减低或不受影响)，可用本领域技术人员熟知的任何在体外或在活体内的方法测定加以完成。例如，响应于干扰素β的细胞培养分析可用于测定干扰素β制剂的生物效力。适当的该细胞培养测定法的非限制性实例包含抗增殖测定、抗病毒测定、信号传导测定以及基因活化测定，该实例为平常的本领域技术人员熟知的方法。
相关的实施方案中，本发明也提供确定经还原烷化合成的聚合物-蛋白质缀合物中附着至具有N-端丝氨酸残基蛋白质的氨基末端的聚合物数量的方法。依据本发明此方面的方法包含，例如：(a)将缀合物与充分量的氧化剂反应充分的时间以将聚合物从蛋白质的丝氨酸残基裂解；以及(b)测量制剂中非缀合蛋白质比例的增加。依据该方法适用的蛋白质包括，但非限于：细胞因子(包括干扰素β(尤其是干扰素-β-1b，优选具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列)以及巨核细胞生长和发生因子(Guerra，P.I.，等人，(1998)Pharm Res15：1822-1827，全文在此并入参考文献)。用于某些本发明方法的氧化剂为高碘酸盐，包括，但非限于：偏高碘酸钠、偏高碘酸钾、偏高碘酸锂、高碘酸钙、高碘酸钡以及高碘酸。测量制剂中非缀合蛋白质比例增加的适当方法包含任何本领域已知的蛋白质和肽分析方法，包括例如：大小排阻层析、反相色谱法、凝胶电泳、毛细管电泳、超高速离心、超滤法、光散射以及质谱法。
相关的其它实施方案中，本发明提供方法选择性氧化裂解生物活 性蛋白质的N-端丝氨酸残基而未氧化该生物活性的蛋白质功能必需的氨基酸残基。某些本发明方法包含，例如：(a)调整生物活性的蛋白质溶液的氢离子浓度至pH约5至约10，更佳者调整pH至约7至约8；(b)生物活性的蛋白质溶液与高碘酸盐混合(每摩尔生物活性蛋白质约0.1摩尔至约10摩尔，或更佳者约0.5摩尔至约5摩尔的高碘酸盐；以及(c)反应该混合物至少一个小时，较佳者反应温度介于约2℃至约40℃之间。依据该方法适用的蛋白质包括，但非限于：细胞因子(包括干扰素β(尤其是干扰素-β-1b，优选具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列)。
方法
本案发明人发现聚合物定向附着至″RN″受体-结合蛋白质氨基端氨基酸或″RG″受体-结合蛋白质糖基化作用位点邻近范围，可确保聚合物附着至一个或多个蛋白质受体-结合区域或功能域的远端位点，从而最小化附着的聚合物分子对受体相互作用的位阻。因此，依据本发明方法联接蛋白质比起聚合物附着在参与结合至它受体的部分或邻近的部分，可保存较高百分比的受体-结合活性。此原理可导致出乎意料地高度保留受体结合活性，可用选自下列的受体结合蛋白质说明：碱性成纤维细胞生长因子(″bFGF″或″FGF-2″)、表皮生长因子(″EGF″)、胰岛素样生长因子-1(″IGF-1″)、干扰素-α(″IFN-α″)、干扰素β(″IFN β″，包括但非限于IFN-β-1b)、粒细胞-巨噬细胞-集落刺激因子(″GM-CSF″)、单核细胞集落刺激因子(″M-CSF″)、Flt3配体、干细胞因子(″SCF″)、介白素2、3、4、6、10、12、13以及15、转化生长因子-β(″TGF-β″)、人类生长激素(″hGH″)、催乳素、胎盘催乳素激素、睫状神经营养因子(″CNTF″)、瘦素以及摹拟此类蛋白质的作用或为其受体-结合拮抗剂的这些受体-结合-蛋白质结构的类似物。相反的，大的聚合物选择性附着至干扰素-γ氨基末端则不预期可保存大部份的细胞因子活性，由于该偶联预期可干涉活性二聚物与它的受体的结合(基于Walter，M.R.，等人，(1995)Nature 376：230-235的数据)。
本发明相关的实施方案中，聚合物偶联至受体结合蛋白质的突变蛋白(其功能是结合至一个或多个相同受体而未引发信号传导的天然的蛋白质竞争性拮抗剂)的氨基端残基。实例是含有点突变G120R(Sundstrom，M.，等人，(1996)JBiol Chem 271：32197-32203)的hGH拮抗剂的聚合物缀合物以及含有点突变G129R(Goffin，V.，等人，(1997)JMammaryGland Biol Neoplasia 2：7-17；Chen，W.Y.，等人，(1999)Clin Cancer Res 5：3583-3593；Chen，W.Y.，PCT Publication No.WO 99/58142 A1)的催乳素拮抗剂的聚合物缀合物。选择性点突变、截短或删除可制作其它受体结合蛋白质的拮抗剂(参阅例如Tchelet，A.，等人，(1997)Mol Cell Endocrinol130：141-152；Peterson，F.C.，(1998)Identification ofMotifs Associated with the Lactogenic and Somatotropic Actions of HumanGrowth Hormone，Ph.D.Dissertation，Ohio State University，UMI # 9822357)。
本发明″RG″受体结合蛋白质的其它实施方案中，本发明方法使一个或多个合成聚合物附着至受体结合型糖蛋白附着糖类部份的天然位点的近端。导致此类受体结合蛋白质″假糖基化作用″(例如当其经重组脱氧核糖核酸技术于大肠杆菌或其它不进行翻译后糖基化作用的原核细胞中表达)或导致其糖蛋白质形式的″假过糖基化作用″(例如天然制作的糖蛋白或真核的宿主细胞(例如酵母菌、植物细胞以及动物细胞包括哺乳动物的以及昆虫细胞)制作的进行翻译后糖基化作用的糖蛋白)。实例是干扰素α以及β、红细胞生成素(″Epo″)以及白细胞介素-2的聚合物缀合物。合成聚合物附着于或接近天然的糖基化作用位点可用本领域已知的任何方法进行，包括R.J.Goodson，等人((1990)Biotechnology 8：343-346)的突变方法以及R.S.Larson，等人((2001)Bioconjug Chem 12：861-869)的方法，其涉及先氧化糖类；此类参考文献的全文在此并入参考文献。
某些蛋白质氨基端的修饰已揭示于先前的文献(参阅例如Dixon， H.B.F.，(1984)J Protein Chem 3：99-108)。例如N-端修饰的蛋白质已报导可稳定某些蛋白质对抗氨肽酶的作用(Guerra，P.I.，等人，同上)，可改良蛋白质的溶解度(Hinds，K.，等人，(2000)Bioconjug Chem 11：195-201)，可减少N-末端氨基电价，或改良产生的缀合物的均一性(Kinstler，0.，等人European Patent Application No.EP 0 822 199 A2；Kinstler，0.，等人，(2002)Adv Drug Deliv Rev 54：477-485)等。偶联聚合物与N-端半胱氨酸或组氨酸残基的α氨基的备用方法(本领域已知的″天然化学连接″的改良步骤)已揭示于(Roberts，M.J.，等人，PCT公告第WO 03/031581A2号以及美国专利申请案公布号码第2003/0105224A1号，全文在此并入参考文献)。然而，本领域并没有认识到或描述过存在受体结合蛋白质″RN″以及″RG″亚类，选择这些类的成员的一般可采用的方法，以及制备和使用该受体结合蛋白质聚合物缀合物作为方法以保存出乎意料地高功能活性的″RN″受体结合蛋白质。
因此，确定给定的细胞因子是否有距离配体的受体-结合部位遥远的N-端和/或糖基化作用位点是有其优点。在配体和聚合物偶合之前，预测给定的细胞因子是″RN″或″RG″配体的能力，实质上可减低产生聚合物-配体缀合物所需的实验(例如细胞因子或其拮抗剂缀合至聚合物例如PEGs)，其中相对于非缀合的配体，该缀合物的抗原性和免疫原性降低，而不实质上降低缀合的配体的受体-结合以及生理活性。
据此，其它的实施方案中，本发明提供方法确认以及选择受体-结合蛋白质配体(例如细胞因子以及其拮抗剂)，其具有远离蛋白质配体的受体-结合部位的N-端和/或糖基化作用位点(即确认以及选择″RN″或″RG″蛋白质的方法)。某些本发明实施方案中，偶合一个或多个聚合物(例如一个或多个PEGs)的最适位置可使用分子建模法测定，例如使用分子建模软件观看蛋白质(细胞因子或其拮抗剂)的三维结构，预测一个或多个聚合物可附着至蛋白质而不实质上流失蛋白质生物的或受体-结合活性的位置(也可参阅Schein，C.H.，同上)。类似的方法已被说明，例如偶合PEG与G-CSF以试图改良它对蛋白质水 解的抗性(参阅发表的美国申请案第2001/0016191 A1号，颁给T.D.Osslund，全文在此并入参考文献)。应用于本发明的适当分子建模软件，例如RASMOL软件(Sayle等人，同上)以及其它用于产生寄存于蛋白质数据库大分子结构数据库的程序(PDB；参阅Laskowski，R.A.，同上)，为本领域已知的软件以及为平常的本领域技术人员所熟知。使用此类分子建模软件，可基于配体及其受体的结晶学以高可信度分析或预测多肽例如细胞因子或其拮抗剂的三维结构。以此方法，平常的本领域技术人员可容易测定哪些配体是适用于本发明的″RN″或″RG″配体。
施行本发明时，共价偶联水溶性聚合物与蛋白质N-端氨基酸残基的α氨基的一个合宜路线是还原烷化带有单一醛基团的聚合物形成的席夫碱，例如参见G.P.Royer(美国专利第4,002,531号)，但不是J.M.Harris，等人(美国专利第5,252,714号)，由于后一发明者仅申请两端用醛基团衍生的聚合物，其为交联剂，因此不适于合成保持实质上受体-结合活性的长效性受体结合蛋白质。
介导PEG-单醛类的席夫碱与受体-结合蛋白质N-端氨基酸α氨基的还原烷化但远离它的赖氨酸残基的ε氨基，可用各种方法完成，基于揭示于J.T.Edsall的第4以及5章Proteins Amino Acids and Peptides as Ions and Dipolar Ions((1943)，ReinholdPublishing Corporation，New York)，全文在此并入参考文献。多肽N-端氨基酸α氨基的酸性解离常数(″pKa″)预期低于7.6；而多肽赖氨酸残基的ε氨基的pKa值预期为大约9.5。Edsall(1943，同上)明确地说明仅在它的等电点为碱性时醛类才会与氨基酸的氨基结合。
因此，基于本公开内容以及在本领域中可容易提供的数据，本领域技术人员将认知(1)醛类和蛋白质α氨基的选择性反应偏爱的pH范围低于9.5(大约是蛋白质ε氨基的pKa)；(2)若反应pH比7.6(大约蛋白质α氨基的pKa)少则醛类和ε氨基的反应速率将降低；(3)若反应pH比7.6小，则醛类和α氨基的反应速率将比ε氨基慢，以及(4)pH6.6以下醛和α氨基反应的选择性将可改良。由于后者数 值大约比α氨基的pKa低一个pH单位以及比ε氨基pKa低三个pH单位，α氨基的约10％以及ε氨基的约0.1％将处于反应性的、未质子化状态。如此于pH6.6时，未质子化的α氨基部分是未质子化的ε氨基的100倍。因此，进一步降低pH，例如降低至5.6，得到的选择性增加非常小，在此pH值，理论上1％的α氨基以及0.01％的ε氨基将处于反应性的、未质子化的状态。因此，在本发明某些实施方案中，蛋白质配体(尤其是″RN″或″RG″配体，包括细胞因子以及其拮抗剂)是于pH约5.6至约7.6；pH约5.6至约7.0；pH约6.0至约7.0；pH约6.5至约7.0；pH约6.6至约7.6；pH约6.6至约7.0；或pH约6.6下经形成配体以及一个或多个反应性的聚合物的混合物而缀合至一个或多个聚合物。如此本发明方法与已知的技术显著不同，在已知技术中配体N-末端氨基酸残基上α氨基偶合聚合物的pH约5(Kinstler，O.，等人，(2002)同上；EP 0 822 199 A2；美国专利第5,824,784以及5,985,265号；Roberts，M.J.，等人，(2002)，spura；Delgado，C.，等人，美国申请第公布号码2002/0127244 A1号)，而聚合物偶联至配体多肽主链赖氨酸残基ε氨基的pH为8.0(Kinstler.O.，等人，EP0 822 199 A2；美国专利第5,824,784及5,985,265号)。同样地，本发明方法也与pH7.5下使用转谷氨酰胺酶将聚(乙二醇)烷基胺衍生物偶联至某些蛋白质的酶方法有显著的不同(Sato，H.，(2002)Adv Drug Deliv Rev 54：487-504)。
用温和的还原剂，例如氰基硼氢化钠或吡啶硼烷(Cabacungan，J.C.，等人，(1982)Anal Biochem 124：272-278)还原形成的席夫碱可形成在生理的pH下保存蛋白质N-端α氨基正电荷的仲胺键。保持与天然的蛋白质相同电荷的该键结，更能比其它的化学连接联结化学保存它的生物活性，所述其它化学连接中和了电荷，例如通过形成酰胺键(Burg，J.，等人，PCT公告第WO 02/49673 A2号；Kinstler，0.，等人，欧洲专利申请案第EP 0 822 199 A2号；Kinstler，0.，等人，(1996)Pharm Res，13：996-1002；Kita，Y.，等人，同上)或氨基甲酸酯键(Gilbert，C.W.，等人，美国专利第6,042,822号； Grace，M.，等人，(2001)Jlnterferon Cytokine Res 21：1103-1115；Youngster，S.，等人，(2002)Curr Pharm Des8：2139-2157)。
选择性将聚合物偶联至N-末氨基酸残基的备用方法是本领域技术人员所熟知。包括偶联酰肼、肼、半卡肼或其它内含胺的聚合物至用高碘酸盐氧化分解成醛类的N-端丝氨酸或苏氨酸残基的方法(Dixon，H.B.F.，同上；Geoghegan，K.F.，U.S.Patent No.5,362,852；Gaertner，H.F.，等人，(1996)Bioconjug Chem 7：38-44；Drummond，R.J.，等人，U.S.Patent No.6,423,685)。
适当的聚合物
在本发明某些实施方案中，在聚合物偶联至生物活性成分以产生本发明缀合物的反应期间，须要极小化聚合物例如PEG形成的分子内以及分子间的交联。此可使用仅一末端(″单官能团活化的PEGs″或″单官能团活化的PAGs″)活化的聚合物或双官能团活化(在线性PEGs的情况下，称为″双活化的PEG二醇″)或多官能团活化的聚合物的百分比少于约30％或更佳者少于约10％或最佳者少于约2％(w/w)的聚合物制剂加以完成。使用完全地或几乎完全地单官能团活化的聚合物可极小化下列的形成：单个蛋白质分子内的分子内交联、一链聚合物连接二蛋白质分子的″哑铃″结构，以及较大的聚集物或凝胶。
适于应用于本发明方法以及组合物的聚合物活化形式可包含本领域已知的任何直线的或分支的、单官能团活化形式的聚合体。例如具有分子量(排除活化基团质量)介于约1kDa至约100kDa的那些。适当的分子量范围包含但非限于约5kDa至约30kDa；约8kDa至约14kDa；约10kDa至约20kDa；约18kDa至约60kDa；约18kDa至约22kDa；约12kDa至约30kDa，约5kDa，约10kDa，约20kDa或约30kDa。以直线的PEGs为例，分子量约10kDa、约20kDa或约30kDa分别地相当于聚合度(n)约230、约450或约680个环氧乙烷单体单位。值得一提的是在确认受体结合蛋白质″RN″以及″RG″分类存在之前，先揭示了偶联治疗性蛋白质与相对高分子量(即＞20-30kDa) 聚合物的优点(Saifer，M.，等人，PCT公告第WO 89/01033 A1号发表于Feb.9，1989，全文在此并入参考文献)。
本发明其它实施方案中，保持非常高生物活性百分比的受体结合蛋白质缀合物可依据本发明方法经偶联约1kDa、约2kDa或约5kDa的单官能团活化的聚合物在体外制备，例如细胞培养。对于这种体外应用，较低的分子量范围为较佳。
视需要，线性聚合物可于一末端或两端具有反应性基团，从而创造″反应性聚合物″。在某些本发明实施方案中，可令人满意的使用PEG的单丙酸衍生物的N-羟基琥珀酰亚氨基酯，其揭示于J.M.Harris，等人，美国专利第5,672,662号，全文在此并入参考文献，或其它N-羟基琥珀酰亚胺-活化的PEG-单羧酸。某些其它实施方案中，可令人满意的使用PEG的单琥珀酰亚氨基碳酸酯衍生物(″SC-PEG″)，其描述于M.Saifer，等人美国专利第5,006,333；5,080,891；5,283,317以及5,468,478号，或PEG的单-对硝基苯碳酸酯衍生物，其揭示于S.J.Kelly，等人，同上；L.D.Williams，等人PCT公告第WO00/07629 A2号、L.D.Williams，等人，美国专利第6,576,235号以及M.R.Sherman，等人，PCT公告第WO 01/59078 A2号。此外，其它类型的反应性基团可用以合成蛋白质聚合物缀合物。此类衍生物包括(但非限于)：PEG的单醛衍生物(Royer，G.P.，美国专利第4,002,531号；Harris，J.M.，等人，美国专利第5,252,714号)，PEG的单胺、单-三溴苯基碳酸酯、单羰基-咪唑、单-三氯苯基碳酸酯、单-三氟苯基碳酸酯、单酰肼、单肼、单半卡肼、单肼基甲酸酯、单硫半卡肼、单碘乙酰胺、单马来酰亚胺、单-正吡啶基二硫化物、单-肟、单-苯基乙二醛、单-噻唑烷-2-甘肽、单硫酯、单硫醇、单三嗪以及单乙烯基砜衍生物。其它实施方案中，细胞因子、趋化因子、生长因子、多肽激素以及其拮抗剂可偶联至一个或多个聚合物，描述于共同未决申请美国专利申请案第10/669,597号，全文在此并入参考文献。
生物活性成分
如上述，本发明缀合物包含一个PAG或PAO，以及尤其是一链PEG共价附着至一个或多个生物活性成分。一个或多个聚合物(或其链)共价附着的生物活性成分在此称为″缀合的生物活性成分″或″经修饰的生物活性成分″。此类术语与″非缀合的生物活性成分″、″起始生物活性成分″或″未经修饰的生物活性成分″不同，其是意指未共价附着聚合物的生物活性成分。然而应了解，″非缀合的″、″未经修饰的″或″起始″生物活性成分当相较于野生型或天然的分子时可含有其它的非聚合物缀合作用或修饰，由于此生物活性成分在附着缀合物方面是″非缀合的″、″未经修饰的″或″起始的″，所以依据本发明仍将其认为″非缀合的″、″未经修饰的″或″起始″，该生物活性成分称为″Mock聚乙二醇化的″生物活性成分。
本文术语″稳定″生物活性成分(或″稳定方法″或″稳定的生物活性成分″)显示生物活性成分已依据本发明方法加以稳定(即生物活性成分已依据本发明方法共价附着至聚合物)。当相较于未经稳定的生物活性成分(即非共价附着聚合物的生物活性成分)，该稳定的生物活性成分将展示某些改变的生化以及生物物理特性。该改变的生化以及生物物理的参数，尤其对于受体结合蛋白质，包括减低蛋白质水解降解的敏感性以及尤其是在某些严厉的环境或实验的条件下保存受体-结合蛋白质的活性。在本发明某些实施方案中，改变的生化以及生物物理的参数可包括，例如，增加在活体循环内的半衰期，增加生物利用度，增加在体外作用的持续时间等。
任何具有生物(即生理的、生化的或医药学的)活性的受体-结合蛋白质(典型地为细胞因子)可适当地作为本发明的起始成分，其中所述生物活性与该分子的氨基末端或天然或突变引入的糖基化作用位点的远端部份相关。该生物活性成分包括(但非限于)：肽类、多肽、蛋白质等。生物活性成分也包含该肽类、多肽、蛋白质及其类似者的片段、突变蛋白以及衍生物，尤其是具有生物(即生理的、生化的或医药学的)活性的片段、突变蛋白以及其衍生物。
适用作本发明生物活性成分的适当的肽类、多肽以及蛋白质、糖 蛋白及其类似者包含任何肽、多肽或蛋白质等，其具有一个或多个可供利用的氨基、硫醇基或其它基团，它们位于受体-结合区域或生物活性成分区域的远端并可选择性地附着聚合物。该肽类、多肽、蛋白质、糖蛋白及其类似者包含细胞因子，其可带有任何的各种结构(Nicola，N.A.，同上；Schein，C.H.，同上)。
例如，适当的目的肽类、多肽以及蛋白质包括(但非限于)包含具有四个α-螺旋束结构的细胞因子类别(长链以及短链亚类)(参阅Schein，C.H.，同上)。适于应用于本发明的各种含四个-螺旋束的蛋白质包括(但非限于)：白介素，例如IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12(p35亚基)、IL-13、IL-15及IL-17；集落-刺激因子，例如巨噬细胞集落-刺激因子(M-CSF)以及粒细胞-巨噬细胞集落-刺激因子(GM-CSF；Rozwarski，D.A.，等人，(1996)Proteins 26：304-313)；干扰素，例如干扰素-α、干扰素-β(包括但非限于干扰素-β-1b)以及干扰素共有序列(consensus IFN)；白血病抑制性因子(LIF)；红细胞生成素(Epo)；促血小板生成素(Tpo)；巨核细胞生长和发生因子(MGDF)；干细胞因子(SCF)，也为本领域称为青灰因子(Morrissey，P.J.，等人，(1994)Cell Immunol 157：118-131；McNiece，I.K.，等人，(1995)J Leukoc Biol 58：14-22)；制瘤素M(OSM)；磷脂酶-活化蛋白质(PLAP)；神经营养因子；以及其肽模拟物。虽然催乳素以及生长激素是传统的激素，广泛地循环于身体，但与细胞因子不同，细胞因子通常接近其目标细胞处产生，催乳素以及生长激素与具有四个α-螺旋束的细胞因子属于相同结构的分类(Nicola，N.A.，同上；Goffin，V.，等人，同上)以及同样地其是聚合物偶联以及产生依据本发明缀合物的适当的目标物。
长链β-片层或β-桶结构分类的受体结合蛋白质(参阅Schein，C.H.，同上)也适于应用于制备本发明缀合物以及组合物。此类包括(但非限于)：细胞因子的肿瘤坏死因子家族，例如TNF-α、TNF-β以及Fas配体，其显示β-胶状滚动结构；IL-1(包括IL-1a以及IL-1 β)以及FGF(包括碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性FGF、FGF-4以及角质细胞生长因子(KGF；FGF-7))家族，其显示β-三叶草折叠(Schein，C.H.，同上；Schlessinger，J.，等人，同上)；IL-12；IL-16；表皮生长因子(EGF；Lu，H.-S.，等人，同上)；以及血小板衍生生长因子(PDGFs)、转化生长因子(包括转化生长因子-α以及转化生长因子-β(TGF-β))以及神经生长因子，其显示胱氨酸-网结结构。
有利地用于本发明缀合物以及组合物的蛋白质的其它结构分类为富含二硫化物的混合的α/β细胞因子以及生长因子(参阅Schein，C.H.，同上)，包括但非限于：EGF家族，其带有β-蜿蜒结构；IL-8；RANTES；嗜中性白细胞活化肽-2(NAP-2)；基质细胞衍生因子-1a(SDF-1a)；单核细胞化学趋化蛋白质(MCP-1、MCP-2以及MCP-3)；嗜酸性粒细胞趋化蛋白(例如嗜酸性粒细胞趋化蛋白-1、嗜酸性粒细胞趋化蛋白-2以及嗜酸性粒细胞趋化蛋白-3)；骨髓祖细胞抑制性因子-1(MPIF-1)；神经元趋化蛋白、巨噬细胞移动抑制性因子(MIF)；生长-相关的癌基因/黑素瘤生长刺激活性(GRO-a/MGSA)；生长调节素；以及胰岛素以及胰岛素样生长因子(例如IGF-1以及IGF-2)。应用于本发明缀合物以及组合物的蛋白质的相关结构分类是具有马赛克结构的细胞因子，包括生长因子例如IL-12以及肝细胞生长因子(Nicola，N.A.，同上)。
其它目的蛋白质包括(但非限于)：生长激素(尤其是人类生长激素(hGH；参阅Tchelet，A.，等人，(1997)Mol Cell Endocrinol130：141-152)以及其拮抗剂(参阅例如Sundstrom，M.，等人，(1996)J Biol Chem 271：32197-32203)、催乳素以及其拮抗剂、绒毛膜促性腺激素、促卵泡激素、促甲状腺激素、色素激素、下丘脑释放因子、抗利尿素以及以及所有上述结构分类的细胞因子和生长因子的受体-结合拮抗剂。许多该蛋白质存在糖基化的以及非糖基化的形式。非糖基化的形式是在原核生物中使用重组脱氧核糖核酸技术或使用化学合成产生的形式。该非糖基化的产物是本发明适当的生物活性成分。最 后，虽然一些抗体功能为受体-结合激动剂或拮抗剂(参阅例如Morris，J.C.，等人，(2000)Ann RheumDis 59(Supp11)：i109-i114)，该免疫球蛋白不是本发明范围内N-端聚合物偶联的适当候选物，由于轻及重链氨基端区域参与抗原识别所以其不是RN受体结合蛋白质。
特别可用于制备本发明聚合物缀合物的生物活性成分是干扰素-α、干扰素β、白细胞介素2、IL-4、IL-10、hGH、催乳素、胰岛素、IGF-1、EGF、bFGF以及红细胞生成素(Epo)。也可特别使用的是这些生物活性成分的突变蛋白以及片段，尤其是那些能结合至相应野生型或完整多肽的受体的突变蛋白或片段，无论结合是否会诱发生物的或生理的效应。某些实施方案中，生物活性成分的突变蛋白以及片段可作为对应配体的拮抗剂，其可降低、实质上减低或完全地抑制配体结合至其受体和/或配体在目标细胞、组织和/或生物体上的活性。其它拮抗剂可为或不可为目的配体的结构类似物、突变蛋白、变异体或衍生物，也适用于制备本发明缀合物。实质上，给定的突变蛋白、片段、变异体、衍生物或拮抗剂是否拮抗给定配体的生物和/或生理效应，其可使用测定配体本身生物的/生理的效应的已知的和/或在此描述的各种技术，未经过度的实验即可加以测定。
有利地用于本发明的此类以及其它目的多肽的结构(一级、二级、三级、和四级)在本领域是已知的以及为平常熟知此技术的专业人士所熟知，尤其是考虑到在此提供的结构以及引用的参考文献，该文献全文在此并入参考文献。
缀合物
本发明提供稳定的生物活性成分缀合物，尤其是细胞因子，以应用于各种用途。本发明缀合物比起之前已知的技术有许多优点，其是通过与下列非限制的以及示例性的本领域已知的缀合物进行比较而证明。
H.Hiratani(欧洲专利第EP 0 098 110 B1号以及美国专利第4,609,546号)揭示环氧乙烷以及环氧丙烷共聚物(″PEG-PPG″，普通 PAGs的成员)和蛋白质(包括干扰素以及白介素)的缀合物，其中并不避开涉及蛋白质受体结合的区域。此类参考文献中干扰素α、β以及γ是偶联PAG的等值目标，本发明不同的是：干扰素-γ不是N-端偶联适当的目标，因为氨基末端在细胞因子受体-结合区域内。此外，Hiratani揭示仅用1kDa至10kDa PAGs合成的缀合物，而本发明方法比较喜欢偶联水溶性、分子量超过10kDa的合成聚合物用于治疗的用途。类似的，N.V.Katre((1990)同上)揭示偶联较大数目链的5-kDa mPEG至人类重组白细胞介素-2以增加缀合物在小鼠以及兔子血流中的生命期。然而该参考文献未揭示或意识到本发明提供的偶联较小数目的较长链的PEG或偶联单一链的高分子量PEG至白细胞介素2氨基末端的优点。
Shaw(美国专利第4,904,584号以及PCT公告第WO 89/05824 A2号)揭示引入、取代或删除目标蛋白质(尤其是Epo、G-CSF以及白细胞介素2)赖氨酸残基以诱导位点选择性附着氨-反应性的聚合物的方法。然而与本发明的揭示不同，此类参考文献未揭示氨-反应性的聚合物可与任何目标蛋白质中赖氨酸残基ε氨基之外的氨反应，明显地与本发明揭示有所区别。
D.E.Nitecki等人，(美国专利第4,902,502号)揭示从各式不同的PEG氯甲酸酯衍生物制备的多重聚乙二醇化的白细胞介素2缀合物，所述衍生物预期可与赖氨酸残基的ε氨基反应。然而与本发明方法相反，参考文献未揭示避免PEG化白细胞介素2蛋白质中参与受体结合的赖氨酸残基的方法，也未认知避免该位点的优点。
N.Katre，等人，(美国专利第5,206,344号)揭示PEG-IL-2缀合物，其中PEG偶联至赖氨酸残基的ε氨基，偶联至位置125(从氨基末端计数)的天然半胱氨酸残基的不成对的硫氢基，或偶联至白细胞介素2氨基末端第一至第二十残基之间突变引入的半胱氨酸残基的硫氢基。已揭示于′344专利的突变蛋白包括″des-ala-1″白细胞介素2，即删除氨基端丙氨酸以及未聚乙二醇化的突变蛋白。然而与本揭示相反，′344专利未揭示任何避免偶联PEG至涉及结合受体的氨基酸残 基的方法，也未认知该方法的任何优点。与该概念一致，以及与本发明相反，′344专利提出的附着点的宽广范围并没有建议偶联PEG至白细胞介素2的氨基末端将会尤其有利。
S.P.Monkarsh，等人，(1997)Anal Biochem 247：434-440以及Harris，J.M.，等人，eds.，Poly(ethylene glycol)：Chemistry and Biological Applications，pp.207-216，American Chemical Society，Washington，D.C.，揭示干扰素-α-2a和三倍摩尔过量的活化的PEG(分子量5,300道尔顿)反应产生十一个单PEG-干扰素的位置同分异构物，对应于干扰素-α-2a的十一个赖氨酸残基。无PEG偶联至干扰素氨基末端α氨基的PEG-干扰素产生。此类参考文献报导的十一个位置同分异构物显示培养细胞中抗病毒的活性其范围是未经修饰的干扰素的6％至40％以及培养细胞中抗增殖的活性其范围是未经修饰的干扰素的9％至29％。与本发明方法制备的缀合物相反，该结果明显地显示由此类研究者随机PEG化赖氨酸残基，干扰了干扰素-α-2a经由它的受体的调节功能。此外，与本发明缀合物不同，此类参考文献并无报导缀合物中是否含有N-端聚乙二醇化的干扰素。
O Nishimura等人，(美国专利法定发明注册专利第H1662号)揭示在pH7.0(干扰素缀合物)或pH7.15(白细胞介素2缀合物)下还原烷化活化的″聚乙二醇甲醚醛类″和氰基硼氢化钠制备的干扰素-α、干扰素-γ以及白细胞介素2缀合物。然而该方法制备的缀合物失去了多至95％的未经修饰的蛋白质的生物活性，明显是由于存在着聚合物附着至赖氨酸残基ε氨基的多个位点(参见本发明图1以及4)。
D.K.Pettit，等人，(1997)J Biol Chem 272：2312-2318揭示白细胞介素-15(″IL-15″)聚合物缀合物。然而该参考文献报导的缀合的IL-15，不仅失去它的类白细胞介素2生长-促进能力(由于偶联聚合物至蛋白质涉及受体结合的赖氨酸残基)，且也显示拮抗作用而不是促效作用。此类作者推断选择性抑制IL-15结合至许多细胞表面受体中的一个，可能是由聚合物缀合造成的，而且该抑制不仅减少受体结合，且可逆转蛋白质的生物学效应。避免偶联聚合物至受体-结合 蛋白质中涉及受体相互作用的部份，本发明可避开聚合物偶联造成的讨厌的结果。
J.Hakimi，等人，(美国专利第5,792,834以及5,834,594号)揭示蛋白质的氨基甲酸酯-联结的PEG缀合物，包括：干扰素-α、白细胞介素2、白细胞介素-1(″IL-1″)以及I L-1-受体拮抗剂，据报导其可减少免疫原性、增加溶解度以及增加蛋白质生物半衰期。此类参考文献中PEG是偶联至″各式不同的自由氨基″，参考文献未揭示N-端PEG化以及未揭示N-端α氨基可或应能聚乙二醇化。此类专利也陈述：揭示于此的缀合物，″具有至少部分″的原本起始蛋白质的生物活性，如此显示可能也丢失大量的生物活性。此结果与本发明的非定向PEG化方法一致。与本发明相反，此类专利未揭示改变PEG化方法的选择性以改进保留缀合物生物活性(揭示于本发明)的任何尝试。
O.B.Kinstler，等人，(欧洲专利申请案第EP 0 822 199 A2号)揭示聚(乙二醇)与多肽(尤其是本专利申请案受让者Amgen，Inc.制作的二种蛋白质，即干扰素共有序列以及G-CSF)氨基末端氨基酸α氨基反应的方法。该文显示″酸到足以选择性地活化α氨基的pH″为该方法必需的特色。相反的，本发明发现降低pH值，会减少氨基和PEG醛类的反应性，而且α氨基未质子化(即pH大于它的pKa)时更具反应性。因此，本案发明人发现没有pH″足够酸到可选择性地活化本发明的任何RN细胞因子缀合物的α氨基″。J.T.Edsal1(同上)以及R.S.Larsen等人，((2001)Bioconjug Chem 12：861-869)中说明依赖pH的N-端α氨基和醛类的反应性，与本案发明人的经历更相容。此外，Kinstler等人报告使用N-端PEG化的多肽以增加产生的缀合物的均一性以及保护氨基末端免于蛋白酶降解，但未揭示N-端PEG化可保存某些受体结合蛋白质的大部分受体-结合活性(参阅例如PCT公告第WO 96/11953号；欧洲专利第EP 0 733 067 BI号，以及美国专利第5,770,577，5,824,784以及5,985,265号，以上专利均属于Kinstler，O.B.，等人)。
Kinstler等人的欧洲申请案(EP 0 822 199 A2)也归纳所有多 肽N-端PEG化的优点，但与本案发明人的经历不同。特别地，由于抗体分子氨基端邻近抗体蛋白的抗原结合区域(Chapman，A.P.(2002)Adv Drug Deliv Rev 54：531-545)，相较于随机PEG化的赖氨酸残基，N-端PEG化的抗体出乎意料地对生物活性有害，如揭示于Larsen，R.S.，等人，同上。同样地，非″RN″受体结合蛋白质的N-端PEG化的受体结合蛋白质，例如干扰素-γ(参阅图8)，预期比随机PEG化赖氨酸残基的受体结合蛋白质更具受体相互作用抑制性。
因此，如以上所述，本发明方法与揭示于Kinstler等人者不同，本发明缀合物的制备是在pH约5.6至约7.6；pH约5.6至约7.0；pH约6.0至约7.0；pH约6.5至约7.0；pH约6.6至约7.6；pH约6.6至约7.0；或pH约6.6的下联接一个或多个细胞因子或其拮抗剂(选作RN受体结合蛋白质)和一个或多个聚合物(形成配体以及一个或多个聚合物间的混合物)。相反的，Kinstler等人方法是在pH5.5以下联结配体，本案发明人发现该pH范围对于在N-末端氨基酸和/或糖基化作用位点的远端使聚合物和配体缀合从而制备制剂来说是次佳的或较差的pH。
Pepinsky，B.，等人(PCT公告第WO 00/23114号以及美国专利申请案公布号码第2003/0021765 A1号)揭示在抗病毒分析中比非糖基化的干扰素β-1b更具活性的糖基化的干扰素β-1a聚合物缀合物。当Pepinsky等人经还原烷化偶联5-kDa或20-kDa mPEG至干扰素-β-1氨基末端时，观察到PEG化在抗病毒的效能上并无效应，而偶联较高的分子量的PEGs可减低或消除此效能。此参考文献也揭示聚亚烷基二醇可经由各式不同的位点(包括氨基末端、羧基末端以及糖基化的蛋白质糖类部分)偶联基团偶联至干扰素β-1a。然而此方法不具一般性：″此类研究指出，尽管干扰素β-1a以及干扰素β-1b序列之间具有保守性，但是其是不同的生化实体，因此干扰素β-1b的知识不能施用至干扰素β-1a，反之也然″。相反的，本发明揭示定义在此的″RN″以及″RG″受体结合蛋白质之间的共同特色。依据本发明，干扰素β-1a以及干扰素β-1b是″RN″受体结合蛋白质。此外，干扰素β-1b 是″RG″受体-结合蛋白质。据此，与WO 00/23114的方法相反，本发明方法是用于制备稳定的、具生物活性的干扰素β-1b以及干扰素β-1a缀合物。
Z.Wei，等人，(美国专利第6,077,939号)揭示偶联水溶性聚合物(尤其是PEG)至多肽(尤其是红细胞生成素)N-端α-碳原子的方法，其中N-末端氨基酸α碳的胺先转胺化成α羰基，然后和PEG衍生物反应形成肟或腙键。由于该参考文献揭示的目标是关于发展用于蛋白质的一般方法，并未考虑到保存受体-结合活性(可以通过选择一些氨基末端作为某些受体结合蛋白质PEG化的位点来实现)。因此，与Wei，等人的揭示相反，本发明不需要去除N-端α氨基，相反的经由形成蛋白质和聚合物间的仲氨键可在中性的pH下保存N-端α氨基电荷。
C.W.Gilbert等人，(美国专利第6,042,822号；欧洲专利第EP1 039 922 131号)揭示PEG-干扰素-α-2b位置同分异构物混合物的必要性，其中尤其令人满意的异构体具有偶联至干扰素-α-2b组氨酸残基(尤其是组氨酸-34)的PEG，以及显示PEG联结至组氨酸-34不稳定。由于组氨酸-34位于干扰素-α-2b某区域的表面，该区域必须和干扰素受体紧密接触以启动信号传导(参阅本说明书的图1b)，因此揭示于此类参考文献中PEG以及组氨酸-34之间不稳定的联结似乎是揭示于此的PEG-干扰素缀合物其功能的关键。相当纯的组氨酸-联结的蛋白质聚合物缀合物描述于S.Lee等人，美国专利第5,985,263号。相反的，本发明显示一个较佳的缀合物是PEG-干扰素缀合物，其中PEG稳定联结在干扰素成分受体-结合功能域远端的位点。
P.Bailon，等人，((2001)Bioconjug Chem 12：195-202)揭示：其中每分子干扰素用一分子40-kDa的二-mPEG-赖氨酸聚乙二醇化的干扰素-α-2a包含四种主要的位置同分异构物。此参考文献揭示几乎所有的PEG是经酰胺键附着至赖氨酸31、121、131或134，各赖氨酸在干扰素-α-2a受体-结合功能域之内或邻近(残基29-35以及 123-140，依据Bailon等人；参阅本文的图1a)。Bailon等人并未报导N-端PEG化。经测试，PEG-干扰素位置同分异构物的分离的混合物在体外对抗水泡性口炎病毒感染Madin-Darby牛肾细胞的抗病毒活性是非缀合的干扰素-α-2a的7％。包含N-端未聚乙二醇化的干扰素的PEG-干扰素缀合物其生物活性大量丢失，这可明显地区别Bailon等人缀合物与本发明缀合物。
R.B.Pepinsky等人，((2001)J Pharinacol Exp Ther297：1059-1066)揭示以(1)具有N-端甲硫氨酸残基的糖基化干扰素β-1a以及(2)20-kDa PEG-醛合成缀合物。此缀合物于N-端甲硫氨酸被单聚乙二醇化，在抗病毒试验中仍保持完整的生物活性。而该作者揭示他们选择N-端位点来使糖基化的干扰素β-1a进行PEG化是取决于位点-选择性PEG化试剂的可获得性以及分子的建模，其承认″一些效应是产物特有的″。此外，与本发明相反，其观察报导没有进行概括以包含在此定义为″RN″受体结合蛋白质的受体结合蛋白质类别。
J.Burg，等人，(PCT公告第WO 01/02017 A2号)揭示红细胞生成素糖蛋白的烷氧基PEG缀合物的生产，其中一至三链的甲氧基PEG和经修饰糖蛋白质表面的赖氨酸残基ε氨基而化学引入的硫氢基反应。然而与本发明相反，该参考文献未揭示任何试图连接PEG与红细胞生成素N-末端氨基酸游离α氨基的尝试或避免修饰红细胞生成素糖蛋白质和红细胞生成素受体相互作用的重要区域中的赖氨酸残基。
J.Burg，等人，(PCT公告第WO 02/49673 A2号)揭示天然和突变红细胞生成素糖蛋白的N末端酰胺连接的PEG缀合物的合成，其方法为：使用选择性可分解的N-端肽延伸物，该N-端肽延伸物在PEG化之前以及可逆地柠康酰化(citraconylation)糖蛋白质所有赖氨酸残基ε氨基之后分解。在该文献中，所述多步骤方法地理念是选择N-末端氨基酸的游离α氨基进行PEG化，以产生均匀的单聚乙二醇化的缀合物，从而避免从多处聚乙二醇化的衍生物分离单聚乙二醇化的缀合物。此方法与本发明有许多重要的不同，包括但非限于：(1)Burg等人方法只限于红细胞生成素糖蛋白，其烷氧基PEG是经由酰胺键联 结，而本发明可采用各种合成聚合物来缀合各种生物活性成分；(2)本发明可应用于糖基化的以及非糖基化的″RN″以及″RG″受体结合蛋白质，而Burg等人仅揭示糖蛋白的缀合；(3)本发明包含烷氧基PEGs(例如mPEG)以及单官能活化的羟基PEG，而Burg等人仅揭示使用烷氧基PEGs；以及(4)本发明聚合物和蛋白质之间使用仲胺联结比Burg等人的酰胺键好，这是因为前者更稳定并保留氨基的正电荷。相同小组J.Burg，等人，(美国专利第6,340,742号)类似的成果揭示生产红细胞生成素糖蛋白的酰胺键连接的缀合物，其中一至三链的烷氧基PEG联结至蛋白质的一至三个氨基。然而与本发明相反，此文献并不优先选择N-端氨基酸的α氨基或不参与受体相互作用区域的氨基。
C.Delgado等人，(美国专利第6,384,195号)揭示使用反应性聚合物tresyl单甲氧基PEG(″TMPEG″)制备的粒细胞-巨噬细胞集落-刺激因子缀合物。此文献显示当TMPEG和重组人类GM-CSF接触，“经修饰的材料含有比未经修饰的材料无活性以及较高活性的物质”。一般本领域技术人员将立即认知聚合物-生物活性成分缀合物(尤其是包含该缀合物的治疗组合物)的混合物中无活性的物质是讨人厌的，因为对须要的病人施用这些治疗物无有利的效应，反而可促成危险性。本发明克服(至少部份地)此技术中的限制，避免修饰GM-CSF以及其它受体结合蛋白质在蛋白质上涉及受体-结合活性的位点，从而降低或排除无活性物质的合成。本发明也提供分离以及纯化有不同大小、不同电价和/或聚合物对蛋白质造成不同程度电屏蔽的缀合物的方法(参阅图9-12)。
值得注意的是美国专利第6,384,195号未描述N-端PEG化的GM-CSF，因此未显出本发明方法的优点。最后美国专利第6,384,195号优先考虑大于一个以上的PEG偶联至各GM-CSF分子的缀合物，而未考虑附着PEG分子的GM-CSF分子(除了偶联至赖氨酸残基以外)。由于认为每个GM-CSF上缀合多至六个PEG分子，该文献陈述PEG可能附着至所有可能的赖氨酸残基，从而确保PEG将附着于空间上阻碍蛋白 质与它的细胞-表面受体接近作用的位置(参阅本说明书的图3)。相反的，本发明指出偶合PEG至赖氨酸残基是不必要的，除非当赖氨酸残基距离和受体的相互作用以及因此传递信号的受体-结合蛋白质功能域非常遥远(激动剂)或为了竞争性地抑制信号传导(拮抗剂)。
T.Nakamura，等人(PCT公告第WO 02/32957 A1号)揭示增加偶联至红细胞生成素糖蛋白质位置52赖氨酸残基ε氨基的PEG分子量可在生物体内增加缀合物的促红细胞生成的效应而降低缀合物对红细胞生成素受体的亲和力。然而与本发明相反该参考文献未揭示于氨基末端或接近糖基化作用位点偶合PEG，也未认识到其任何优点。
因此，本发明提供生物活性成分偶联至合成聚合物的缀合物，其比之前描述的具有显著的结构以及功能优点。
组合物
本发明提供缀合物或复合物，包含一个或多个生物活性成分(适当地为一个或多个细胞因子)偶联至一个或多个稳定聚合物例如一个或多个PEGs。典型地，该缀合物是以本发明在此描述的方法制作；然而具有在此描述的结构以及活性的缀合物，不论用于产生该缀合物的方法如何，均考虑等同于本发明方法的产品并因此包含于本发明之内。相关的方面中，本发明也提供包含一个或多个缀合物或复合物的组合物。依据本发明此方面的组合物将包含一个或多个(例如：一、二、三、四、五、十个等)上述的本发明缀合物或复合物。于某些方面中，组合物可包含一个或多个其它成分，例如一种或多种缓冲盐、一种或多种离液剂、一种或多种去污剂、一种或多种蛋白质(例如白蛋白或一种或多种酶)、一种或多种未结合的聚合物、一种或多种渗透活性剂等。本发明该方面的组合物可为任何形式，包括固态(例如干燥粉剂)或溶液(尤其是以包含一种或多种本发明缀合物的生理上兼容的缓冲盐溶液形式)。
A.药物组合物
某些本发明组合物，尤其是可调制成应用于预防性的、诊断或治疗的用途的药物组合物。该组合物典型地包含一种或多种本发明缀合物、复合物或组合物以及一种或多种医药学上可接受的载体或赋形剂。本文术语″医药学上可接受的载体或赋形剂″意指引入药物组合物的受体动物，包括人类或其它哺乳动物可耐受的无毒的固体、半固态或液体填料、稀释剂、包囊材料或任何类型的调配辅料，其不会产生负面效应。
本发明药物组合物可经由任何适当的模式施用至受体动物，例如：口服地、直肠地、非经肠胃地、全身地、阴道地、腹膜内地、局部地(粉末、软膏、滴液或透皮贴剂)、口颊地、作为口腔或鼻喷雾或吸入剂等施用模式。本文术语″不经肠胃的″意指包含静脉内的、动脉内的、肌肉内的、腹膜内的、脑池内的、皮下和关节内的注射以及输液等施用模式。
本发明提供的不经肠胃注射的药物组合物可包含医药学上可接受的无菌的水溶液或非水溶液、分散液、悬浮液或乳状液，以及在使用之前重新调制成无菌的注射溶液或分散液的无菌粉末。适当的水性以及非水性的载体、稀释剂、溶剂或媒介物的实例包含：水、乙醇、多元醇(例如甘油及其类似者、丙二醇、聚(乙二醇))、羧甲基纤维素以及其适当的混合物、植物油(例如橄榄油)、以及可注射的有机酯类例如乙基油酸酯。通过使用包衣材料例如卵磷脂，在分散液的情况下维持所需的粒度以及使用表面活性剂可维持适当的流动性。
本发明药物组合物也可含有佐剂，例如：防腐剂、湿化剂、乳化剂以及分散剂。预防微生物的作用可通过加入各种抗细菌剂以及抗真菌剂加以达成，例如：对氧苯甲酸、苯甲醇、氯丁醇、苯酚、山梨酸等。也可令人满意地包含渗透剂例如糖、氯化钠等。内含延迟吸收的药剂例如单硬脂酸铝；水凝胶以及明胶可使可注射药物形式的吸收延长。
在一些案例中，为了延长药物效应，可令人满意的延缓从皮下或肌内注射的吸收。此可使用体液中溶解度差的结晶或无定型材料的悬 浮液完成。然后药物的吸收速率视它的溶解速率而定，而溶解速率取决于它的物理形式。此外，药物溶解或悬浮于油类媒介物可完成非经肠施用的药物形式的延长吸收。
以生物降解性高分子例如聚丙内酯-聚糖内酯形成药物微包封的基质可制造可注射的储存形式。取决于药物与载体聚合物的比例和特定的载体聚合物的本质，可控制药物释出速率。其它生物降解性高分子的实例包含生物兼容的聚(正酯类)以及聚(酐)。以身体组织兼容的脂质体或微乳状液捕获药物也可制备可注射的储存制剂。
可注射制剂可灭菌，例如经由保留细菌的滤器过滤，或加入消毒剂以无菌的固态组合物的形式在使用之前溶解或分散于灭菌水或其它无菌的注射液。
口服的固体剂量形式包含胶囊、药片、药丸、粉末以及颗粒。该固体剂量形式中，活性化合物混合有至少一种医药学上可接受的赋形剂或载体，例如：柠檬酸钠或磷酸二钙和/或a)填充剂或补充剂，例如：淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇、以及硅酸，b)结合剂例如：羧甲基纤维素、褐藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖、以及阿拉伯胶，c)保湿剂例如甘油，d)崩解剂例如：琼脂-琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐、以及碳酸钠，e)溶液迟滞剂例如石蜡，f)吸收加速剂例如季铵化合物，g)湿化剂例如：十六烷基醇以及甘油单硬脂酸酯，h)吸附剂例如高岭土以及膨润土，以及i)润滑剂例如：滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固态PEG、十二烷基硫酸钠、及其混合物。胶囊、药片以及药丸等剂型也可包含缓冲剂。
相似类型的固态组合物也可用作软明胶胶囊以及硬明胶胶囊的填充剂，其使用了赋形剂如乳糖与高分子量PEG。
药片、糖衣药丸、胶囊、药丸以及颗粒的固体剂量形式可用包衣以及外壳制备，例如肠溶包衣或慢性调控包衣以及其它医药学调制领域熟知的包衣。其可视需要含有不透明化药剂以及仅(或优先)于胃肠道的某些部份释放出此有效成分的组合物，可视需要为缓释的方式。可用的包埋组合物的实例包含聚合的物质以及蜡。活性化合物也可为 微包封的形式，视须要具有一种或多种上述的赋形剂。
口服的液体剂量形式可包含医药学上可接受的乳状液、溶液、悬浮液、糖浆以及酏剂。除了活性化合物外，液体剂量形式可含有本领域中常用的惰性稀释剂，例如：水或其它溶剂、溶解剂以及乳化剂，例如：乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(具体而言，棉籽、落花生、玉米、胚芽、橄榄油、蓖麻、以及芝麻油)、甘油、四氢糠醇、PEGs以及山梨糖醇酐脂肪酸酯、及其混合物。
除了惰性稀释剂，口服的组合物也可包含佐剂例如：湿化剂、乳化剂以及悬浮剂、增甜剂、矫味剂以及香味剂。
除了活性化合物，悬浮液还可含有悬浮剂例如：乙氧化异十八烷基醇、聚氧乙烯山梨糖醇以及山梨糖醇酐酯类、微晶纤维素、偏氢氧化铝(aluminum metahydroxide)、膨润土、琼脂-琼脂、西黄芪胶、及其混合物。
局部施用包括施用至皮肤或粘膜，包括肺以及眼睛表面。局部施用的组合物，包括吸入剂，可使用加压的或非加压的干燥粉剂制备。非加压的粉剂组合物中，细粉形式的有效成分可混合较大的医药学上可接受的惰性载体，包含颗粒大小例如直径多至100微米。适当的惰性载体包含糖例如乳糖和蔗糖。适当者，至少95％以重量计的活性成分颗粒其有效的粒度介于0.01至10微米。
或者，药物组合物可加压并含有压缩气体，例如氮或液态气体推进剂。较佳者，有效成分不以任何实质程度溶于液化的推进剂。加压的组合物也可含有表面活性剂。表面活性剂可为液体或固态非离子表面活性剂或可为固态阴离子型表面-活性剂。宜以钠盐的形式使用固态阴离子型表面活性剂。
局部施用的其它形式是眼部施用形式。此施用形式中本发明缀合物或组合物是用医药学上可接受的眼的媒介物运送，活性化合物与眼表面维持接触充分的时间以允许化合物穿透眼睛结膜或角膜以及内部的区域，例如前室、后室、玻璃体、水样液、玻璃液、角膜、虹膜/ 纤毛、晶状体、脉络膜/视网膜以及巩膜。医药学上可接受的眼的媒介物例如为软膏、植物油或包封材料。
直肠或阴道施用的组合物较佳者为栓剂，其制备上可搅拌本发明缀合物或组合物与适当的非刺激性赋形剂或载体例如可可油、PEG或栓剂蜡，其在室温下为固态但在直肠或阴道的温度下熔化成液体并释放出药物。
本治疗方法的药物组合物也可以脂质体的形式施用。本领域已知脂质体一般而言是源自磷脂或其它脂类物质。脂质体由单-或多层的水合液态晶体分散于水介质而形成。任何无毒的、生理上可接受的以及可代谢的脂类可用于形成脂质体。除了一种或多种本发明缀合物或组合物，脂质体形式的药物组合物也可含有一种或多种稳定剂、防腐剂、赋形剂等。较佳的脂类是磷脂及磷脂酰胆碱(卵磷脂)，天然的及合成的均可。形成脂质体的方法是本领域已知的(参阅例如Zalipsky，S.，等人，U.S.Patent No.5,395,619)。包含磷脂的脂质体可联结至PEG，最常见的是磷脂酰乙醇胺偶联至单甲氧基-PEG，其有利的性质包括哺乳动物血液循环中延长的生命期(Fisher，D.，美国专利第6,132,763号)。
B.用途
本发明方法、缀合物以及组合物可有利地用于维持或提高生物成分的生物活性而不干扰生物成分结合至其受体的能力。某些本发明该方法可运送一种或多种缀合物及组合物至细胞、组织、器官或生物体。具体而言，本发明提供控制传送一种或多种缀合物、复合物或组合物成分至细胞、组织、器官或生物体，从而使使用者能在时间以及空间上，调整释出特定成分的活性量至细胞、组织、器官或生物体。
一般而言本发明方法涉及一种或多种活性。例如本发明方法之一包含：(a)制备一种或多种本发明缀合物或组合物；以及(b)在有利于使一种或多种本发明缀合物或组合物结合至细胞、组织、器官或生物体的条件下，使一种或多种细胞、组织、器官或生物体接触一种 或多种缀合物或组合物。一旦本发明缀合物和/或组合物的生物活性成分已结合(或在一些案例中内化至)细胞、组织、器官或生物体，此成分可继续进行其预期的生物学功能。例如肽成分可结合至受体或其它在细胞、组织、器官或生物体上或之内的成分；参与细胞、组织、器官或生物体内的代谢反应；执行、上调或活化，或下调或抑制细胞、组织、器官或生物体内的一种或多种酶的活性；提供细胞、组织、器官或生物体丧失的结构成分；提供一种或多种细胞、组织、器官或生物体需要的营养；抑制、治疗、逆转或改善一种或多种疾病或身体的病症的进展或症状；等。
由于缀合物的生物活性成分具有实质上保留其生物活性以及甚至在工业用途的条件下增加持续作用期间的组合效应，因此具有出奇高的效能，故于其它实施方案中本发明缀合物以及组合物可用于工业细胞培养。本缀合物此类出奇的高效能可导致高生物产量，非常高的重组蛋白质表达量，以及增进其它生物工艺的效率。
C.剂量方案
本发明缀合物、复合物或组合物可在体外、体内或离体施用至细胞、组织、器官或生物体以传送一种或多种生物活性成分(即一种或多种细胞因子或其拮抗剂)。本领域一般技术人员将能认知给定的活性化合物、缀合物、复合物或组合物的有效量可凭经验测定以及可使用纯形式或(该形式存在的话)医药学上可接受的制剂或前药形式。本发明化合物、缀合物、复合物或组合物可以兽医或药物组合物结合一种或多种医药学上可接受的赋形剂施用至须要其的动物(包括哺乳动物，例如人类)。任何特定的病人其治疗有功的剂量将取决于各种因子，包括：达成细胞反应的类型以及程度；所用特定化合物、缀合物、复合物、或组合物的特性和/或活性；患者年龄、体重或表面积、总体健康、性别以及膳食；施用时间、施用路线、以及活性化合物的排泄速率；治疗持续期间；与特定化合物、缀合物、复合物或组合物组合或同时使用的其它药品；以及熟悉医药学以及医学技术的一般专 业人士熟知的其它因子。例如本领域一般技术人员可从比达成所要求的治疗效果较低剂量的本发明给定的化合物、缀合物、复杂物或组合物开始，缓慢增加剂量直到达成所要求的效应。
剂量方案也可安排成病人专一性的方式以在血液中提供给定的活性化合物的预定浓度，其可以本领域中可接受的以及常规的技术测定，例如大小-排阻法、离子-交换或反相高效液相色谱法(″HPLC″)、生物测定法或免疫测定等。因此，病人剂量方案可依据一般熟悉医药学以及医学技术的专业人士熟知的常规的和熟悉的方法调至达成相对固定的血液水平(用HPLC或免疫测定法测量)。
D.诊断和治疗的用途
本发明缀合物的诊断用途可在动物(尤其是人类)体内经由施用本发明缀合物或组合物标定对细胞因子具有高结合能力的细胞或组织，例如癌症，其中缀合物(或一种或多种成分，即生物活性成分和/或合成聚合物)标记了或包含一种或多种可检测的标记，以便依据本领域已知的方法进行检测，例如光学、放射线检测、荧光或共振检测。例如，大部分非小细胞肺癌表达非常高浓度的表皮生长因子受体(Bunn，P.A.，等人，(2002)Semin Oncol29(Suppl 14)：38-44)。因此，在本发明另一方面中，本发明缀合物以及组合物可用于诊断或治疗的方法，例如诊断、治疗或预防易患有或患有病症的各种动物(尤其是哺乳动物例如人类)身体的该病症。该方法中，治疗的目标是延迟或防止疾病的发展，和/或治愈、诱发病症缓和、或保持缓和，和/或减少或极小化其它治疗方案的副作用。
因此，本发明缀合物、复合物以及组合物可用于保护、抑制或治疗身体的病症，例如感染或疾病。本文术语″保护″身体疾病，包含″预防″、″抑制″和″治疗″。″预防″包含于诱导疾病或身体的病症之前施用本发明复合物或组合物，而″抑制″包含于疾病临床表现出现之前施用缀合物或组合物，″预防″以及″抑制″身体的病症一般是针对具有疾病倾向或易患病症但尚未经历疾病的动物。然而″治疗″身体的病症， 包含疾病表现出现之后施用本发明的治疗性缀合物或组合物。据了解人类以及兽医医学中不是很容易的能区分″预防″以及″抑制″身体的病症。许多案例中，最后的诱导事件或事件可能是未知或潜伏的，而在它出现之前病人或医师不能注意到此诱导事件。因此，一般本文术语″预防″与″治疗″不同，其包含定义于此的″预防″以及″抑制″。依据本发明方法本文术语″保护″包含″预防″。依据本发明此方面的方法可包含一个或多个允许临床医生达成上述治疗目标的步骤。本发明该方法之一可包含，例如：(a)确认患有或易患有身体病症的动物(较佳者哺乳动物，例如人类)；以及(b)对此动物施用有效量的一种或多种本发明在此描述的缀合物、复合物或组合物，使得施用该缀合物、复合物或组合物防止、迟延或诊断动物身体病症的发展、或治愈或诱发动物身体病症的缓和。
本文中″易患有身体病症″的动物其定义是不展示多数明显的身体病症的动物，但在基因上、生理上或具有发展此病症的风险。本发明方法中辨别易患身体病症的动物、处于病症危险中的动物、或患有给定的身体病症的动物(例如哺乳动物，包括人类)可通过熟练的临床医生依据已知标准技术的方法完成，包括，例如：放射性测定、生化检定(例如，测定动物样品中特定的肽类、蛋白质、电解质等相对的含量)、外科的方法、遗传筛选、家族史、身体的触诊、病理的或组织学的测试(例如微观的评估组织或体液样品或涂片、免疫测定等)、测试体液(例如：血、血清、血浆、脑脊髓液、尿、唾液、精液及其类似者)、影像(例如无线电、荧光、光学、共振(例如使用核磁共振(″NMR″)或电子自旋共振(″ESR″))等。一旦动物经一种或多种方法确认，该动物可积极的和/或预先有效的治疗以预防、抑制、延迟或治愈此身体的病症。
可用本发明缀合物、复合物、组合物以及方法预防、诊断或治疗的身体病症包含可使用缀合物或组合物的生物活性成分(典型地是细胞因子或其拮抗剂)预防、诊断或治疗的任何身体的病症。该病症包括(但非限于)：各种癌症(例如：乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、白血病、淋巴瘤、肺癌、神经癌症、皮肤癌、头部以及颈癌症、骨癌、结肠和其它胃肠的癌症、胰腺癌、膀胱癌、肾癌以及其它癌症、肉瘤、腺癌以及骨髓癌)；医源性疾病；传染性疾病(例如：细菌疾病、真菌疾病、病毒疾病(包括肝炎、亲心性病毒、HIV/AIDS、及其类似者引起的疾病)、寄生虫病、及其类似者)；遗传疾病(例如：囊性纤维化、肌萎缩性侧索硬化症、肌肉萎缩症、高歇病、糖原贮积症II型、严重的合并的免疫缺陷病症、侏儒症及其类似者)、贫血、中性血细胞减少症、血小板减少症、血友病以及其它血液病症；神经变性疾病(例如：多发性硬化(″MS″包括，但非限于，复发性-缓解型MS、原发性进行性MS、继发性进行性MS、及其类似者)、克雅二氏病、阿尔茨海默病、及其类似者)；酶的病症(例如痛风、尿毒症、高胆固醇血症、及其类似者)；不明或多病灶的病原学病症(例如：心血管疾病、高血压、炎性肠病、及其类似者)；自体免疫病症(例如：全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎、牛皮癣、及其类似者)以及其它本领域技术人员熟知的重要医学病症。本发明缀合物、复合物、组合物以及方法也可用于预防疾病进展，例如化学地预防前恶性病症至恶性病症的进展。
本发明的治疗方法因此使用一种或多种本发明缀合物、复合物或组合物，或一种或多种本发明药物组合物，其可经各种路径施用至需要其的动物，包括：口服地、直肠地、非经肠胃地(包括：静脉内的、动脉内的、肌肉内的、腹膜内的、脑池内的、皮下的以及关节内的注射以及输注)、全身内的、阴道的、腹膜内的、局部(粉末、软膏、滴液或透皮贴剂)、口颊的、口腔或鼻喷雾或吸入剂施用。本发明中，有效量的缀合物、复合物或组合物可在体外、离体或在活体内施用至细胞或患有或易患有特定病症的动物，从而预防、延缓、诊断或治疗动物的病症。本文中″有效量的缀合物(或复合物或组合物)″意指本发明施用的缀合物(或复合物或组合物)其携带的生物活性成分(即细胞因子或其拮抗剂)的生物活性量，可预防、延缓、诊断、治疗或治愈施用该缀合物、复合物或组合物的动物的身体病症。本领域技术 人员将能认知本发明缀合物、复合物或组合物的有效量，其可依据医药学以及医学技术熟知的标准方法实验测定；参阅例如Beers，M.H.，等人，eds.(1999)Merck Manual of Diagnosis& Therapy，17th edition，Merck and Co.，Rahway，NJ；Hardman，J.G.，等人，eds.(2001)Goodman and Gilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics，10th edition，McGraw-Hill Medical Publishing Division，New York；Speight，T.M.，等人，eds.(1997)Avery′s Drug Treatment，4th edition，Adis International，Auckland，New Zealand；Katzung，B.G.(2000)Basic & Clinical Pharmacology，8th edition，Lange MedicalBooks/McGraw-Hill，New York；；该参考文献以及引用的参考文献全文在此并入参考文献。
据了解当施用至人类病人，本发明缀合物、复合物以及组合物的每日、每周或每月的总剂量将由医师在医学的合理判断范围之内确定。例如，施用某些本发明缀合物、复合物或组合物得到令人满意的结果的适当剂量取决于使用的专一性生物活性化合物，其剂量将可轻易由本领域技术人员或仅使用常规的实验容易地测定。依据本发明此方面，缀合物、复合物或组合物可一次施用，分剂量施用，例如：每天一次或两次、或每周一次或两次、或每月一次或两次等。各式各样的不同施用模式的适当剂量方案(例如不经肠胃道的、皮下的、肌肉内的、眼睛内的、鼻腔内的、等)也可仅使用常规的实验轻易测定，或由本领域技术人员取决于缀合物、复合物或组合物的生物活性成分(即细胞因子或其拮抗剂)的特性轻易确定。
其它应用中，本发明缀合物、复合物以及组合物可将诊断或治疗剂特异性靶向至表达受体的细胞、组织、器官或生物体，该受体能结合、整合或摄入缀合物、复合物以及组合物的生物活性成分(即细胞因子或其拮抗剂)。依据本发明该方面的方法可包含，例如：使细胞、组织、器官或生物体与额外包含一种或多种诊断剂或治疗剂的一种或多种本发明缀合物、复合物或组合物接触，从而该缀合物、复合物或组合物可结合至或摄入至细胞、组织、器官或生物体，从而运送诊断 剂或治疗剂至细胞、组织、器官或生物体。依据本发明此方面的诊断剂或治疗剂可为(但并非限制于)至少一种试剂，其选自核酸、有机化合物、蛋白质或肽、抗体、酶、糖蛋白质、脂蛋白、化学元素、脂质、糖、同位素、碳水化合物、影像剂、可检测的探针、或其任何组合，其可如此处所述进行可检测的标记。本发明此方面的治疗剂可对目标细胞(或组织、器官或生物体)施加治疗效果，该效果选自(但非限于)：矫正缺陷的基因或蛋白质、药物作用、毒性作用、生长刺激效应、生长抑制效应、合成代谢的效应、分解代谢的效应、同化作用的效应、抗病毒的效应、抗真菌的效应、抗细菌的效应、激素的效应、神经体液效应、细胞分化刺激效应、细胞分化抑制性效应、神经调节效应、抗癌效应、抗-肿瘤效应、胰岛素刺激或抑制效应、骨髓刺激效应、多能干细胞刺激效应、免疫系统刺激效应、以及任何其它经由依据本发明此方面的传送系统运送治疗剂至细胞(或组织、器官或生物体)所提供的熟知的治疗效果。
所述其它治疗剂可以选自(但非限于)熟知的以及新的化合物以及组合物，包括抗生素、类固醇、细胞毒性药剂、血管活性药物、抗体以及其它治疗剂。此药剂非限制性的实例包含抗生素以及其它用于治疗细菌性休克的药品，例如：庆大霉素、妥布霉素、萘夫西林、肠胃外的头孢菌素等；肾上腺皮质类固醇以及其类似物，例如：地塞米松，减轻内毒素引起的细胞的受伤；血管活性药物，例如α肾上腺素能受体阻断剂(例如酚苄明)、β肾上腺素能受体激动剂(例如异丙肾上腺素)以及多巴胺。
本发明缀合物、复合物以及组合物也可诊断疾病以及监视治疗反应。某些方法中本发明缀合物、复合物以及组合物可包含一种或多种可检测的标记(例如描述于本文别处者)。该方法中此类可检测地标记的本发明缀合物、复合物以及组合物可用以检测表达受体或摄入缀合物、复合物或组合物的生物活性成分(即细胞因子或其拮抗剂)的细胞、组织、器官或生物体。该方法的一个实例中将细胞、组织、器官或生物体在有利于细胞、组织或生物体结合或摄取缀合物的条件下 (例如缀合物与细胞-表面受体结合或缀合物通过胞饮作用或扩散至细胞)接触一种或多种本发明缀合物、复合物以及组合物，然后使用标记专一性的侦检方法检测缀合物结合至或并入细胞(例如：荧光测定法，观察荧光标记的缀合物；核磁共振影像，观察磁性标记的缀合物；放射线影像，观察放射性标记的缀合物等)。该可检测标记的缀合物的其它用途可包括，例如施用一种或多种有效量的本发明缀合物的标记形式以影像化细胞、组织、器官或生物体、或动物(包括人类)内部的结构，以及测量与细胞、组织、器官或生物体(或动物)相关的可检测的放射线。检测各式各样的标记的方法以及其于诊断和治疗影像方面的用途是本领域技术人员所熟知，以及描述本文它处。
在另一方面中，本发明缀合物以及组合物可用于调控缀合物中生物活性成分的受体的浓度或特异性活性，所述受体位于表达该受体的细胞表面。″调控″给定的受体的活性意指缀合物结合至受体时可活化或抑制经由该受体调节的生理活性(例如细胞内信号传导级联)。虽然不结合特定的机制以解释本发明缀合物调控的活性，但该缀合物经由生物活性成分结合至受体可拮抗细胞受体的生理活性，从而阻断天然的激动剂(例如非缀合的生物活性成分)的结合以及预防受体经天然的激动剂活化，而不诱导实质上受体本身生理活性的活化。依据本发明此方面的方法可包含一种或多种步骤，例如在缀合物(即缀合物的生物活性成分部分)结合至生物活性成分在细胞表面上的受体但不实质上活化受体的条件下接触细胞(在体外或在活体内)与一种或多种本发明缀合物。该方法将用于本领域技术人员将认知的各种诊断、以及治疗的用途。
试剂盒
本发明也提供包含本发明的缀合物和/或组合物的试剂盒。该试剂盒典型地包含载体，例如纸盒、纸板盒、管子等，其具有封闭的一或更多的容器，例如小瓶、管、安瓿、瓶子、注射器及其类似者，其中第一容器含有一种或多种本发明缀合物和/或组合物。本发明此方面的 试剂盒可进一步包含进行一种或多种本发明缀合物以及组合物明确的用途所需的一种或多种其它成分(例如试剂以及化合物)，例如一种或多种用于诊断、治疗或预防特定的疾病或身体病症的成分(例如一种或多种其它的治疗化合物或组合物、一种或多种诊断试剂、一种或多种载体或赋形剂、及其类似者)、一种或多种其它本发明缀合物或组合物等。
一般本领域技术人员将认知在此描述的方法以及用途可适当的修饰以及适应而不脱离本发明或其任何实施方案的范围。目前已详细地描述本发明，参考下列实施例后本发明将更明显，据此该实施例是为了说明而不是限制本发明。
实施例
实施例1：PEG-干扰素-α缀合物
干扰素-α是市售地重要的药用蛋白质，2001年世界市场超过美金二十亿，主要是治疗C型肝炎病毒(″HCV″)感染的病人。在美国有三至四百万人感染慢性丙型肝炎以及每年约发生10,000件HCV-相关的死亡(Chander，G.，等人，(2002)Hepatology 36：5135-5144)。有两个主要负责发展以及行销的公司在改良有用的干扰素-α(Schering-Plough Corp.以及F.Hoffmann-La Roche AG)，已发展以及市售干扰素-α和单甲氧基聚(乙二醇)或″mPEG.″的缀合物。各案例中，mPEG仅于一附着点联结至干扰素-α的各分子。于各案例中，相较于未经修饰的干扰素，产物含有显著降低的受体-结合活性的位置同分异构物的混合物。于各案例中，缀合物在活体内增加生物利用度以及作用持续期间可补偿PEG缀合作用所造成的体外减低的生物活性，较于未经修饰的蛋白质每周注射三次，可改良至每周一次注射的临床疗效，以治疗HCV的慢性感染(Manns，M.P.，等人，(2001)Lancet 358：958-965)。
于F.Hoffmann-La Roche的PEG-干扰素-α-2a缀合物中，两链20-kDa mPEG偶联至单个赖氨酸连接体(所谓的″分支的PEG″)，该连 接体主要联结至Lys 31、Lys 121、Lys 131或Lys 134中的一个(Bailon，P.，等人，同上)，所有以上的Lys位于干扰素-α-2a受体-结合功能域之内或与之毗连(参阅图1a的结合部位1)。
于Schering-Plough Corp.的PEG-干扰素-α-2b缀合物中，单链12-kDa mPEG主要偶联至位置34的组氨酸残基(His 34；Wylie，D.C.，等人，同上；Gilbert，C.W.，等人，U.S.Patent No.6,042,822；Wang，Y.-S.，等人，同上)，该组氨酸残基位于结合受体的重要区域(参阅图1b)。其它Schering-Plough产物的PEG附着位点(Lys 121、Tyr 129以及Lys131)也位于或接近结合部位1(图1b)。
与此二种商品产物相反，本发明缀合物具有单链的水溶性合成聚合物，较佳者为PEG或mPEG，其联结至N-末端氨基酸残基，该残基距离蛋白质的受体-结合区域遥远(参阅Cys-1以及结合部位的立体关系，图1c以及1d)，展现干扰素-α是″RN″细胞因子。图9以及10分别地显示本发明示例性PEG-干扰素-α缀合物的阳离子-交换以及大小排阻色谱。反应混合物内含的干扰素-α-2b中，氨基末端Cys-1之前有其它甲硫氨酸残基，所述Cys-1位于天然序列的第一个残基。反应性的PEG是20-kDa PEG-醛，其浓度是0.2mM。还原剂是氰基硼氢化钠，最终浓度是14mM。4℃下孵育期间，周期性地以大小-排阻层析监测反应进程。虽然在描述的条件下干扰素-α可充分溶解以聚乙二醇化，其它细胞因子例如干扰素β，则溶解度较小以及需要表面活性剂存在以聚乙二醇化，C.W.Gilbert等人，(美国专利第5,711,944号)的干扰素-α也是如此，以及R.B.Greenwald，等人，(美国专利第5,738,846号)的干扰素α以及β也是如此。
用于分级的阳离子-交换管柱(展示于图9)是ToyoPearl MD-G SP(1x6.8公分；Tosoh Biosep，Montgomery-ville，PA)，以0-0.4M NaCl的20mM乙酸钠缓冲液，pH4.6线性梯度展开，流速0.5毫升/分钟。用于获得图10数据的大小-排阻管柱是 200(HR10/30；Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)，以0.5毫升/分钟在内含150mM NaCl的20mM乙酸钠缓冲液(pH4.6)洗脱。其它适当的离子 -交换以及大小排阻色层分析介质以及分级条件是本领域技术人员所熟知。本发明纯化的单PEG-干扰素-α-2b经自动化的Edman降解法的氨基-末端氨基酸分析显示＞90％的PEG附着至N-端残基。此分析是由CommonwealthBiotechnologies，Inc.(Richmond，VA)进行。
实施例2：PEG-白细胞介素-2缀合物
白细胞介素-2(″白细胞介素2″)是具有免疫调节活性对抗某些癌症(包括肾脏细胞的癌症以及恶性黑素瘤)的细胞因子。然而，临床疗效差，仅对小部分病人局部的或完全有效(Weinreich，D.M.，等人，(2002)J lmmunother 25：185-187)。白细胞介素2于血流中半衰期短，于癌症病患中诱导缓解速率低。经随机PEG化赖氨酸残基尝试使白细胞介素2更适用并未达成最佳化(Chen，S.A.，等人，(2000)J Pharrnacol Exp Ther 293：248-259)。尝试选择性地在白细胞介素2的糖基化作用位点贴上PEG(Goodson，R.J.，等人，同上)或在非必需的半胱氨酸(Cys 125)或在白细胞介素2突变蛋白残基1至20内含的半胱氨酸贴上PEG(Katre，N.，等人，美国专利第5,206,344号)，没有产生适用的临床产物。
图4显示白细胞介素2受体-结合区域的赖氨酸残基分布，显示许多表面-易接近的赖氨酸残基位于受体结合区域。实际上Lys-35以及Lys-43已确认是α-受体与白细胞介素2相互作用所必须，暗示PEG化赖氨酸残基而去活化白细胞介素2的机制。图4也显示白细胞介素2N-端区域距离蛋白质受体-结合区域遥远，展现白细胞介素2有″RN″细胞因子结构。我们的结论即白细胞介素2是″RN″细胞因子能和H.Sato，等人，((2000)Bioconjug Chem 11：502-509)的观察结果兼容，其使用酶促转谷氨酸的反应连接一或二链10-kDa mPEG至该作者引入白细胞介素2突变蛋白的N-端突出序列AQQIVM上的一或二个谷氨酰胺残基(″Q″)。Sato等人报导经转谷氨酸的反应在氨基末端附近聚乙二醇化的突变蛋白的缀合物可比随机PEG化白细胞介素2突变蛋白的赖氨酸残基制备的缀合物保持更多的生物活性。类似的PEG 化其它蛋白质的方法可参阅Sato，H.，(2002)同上。基于白细胞介素2氨基末端与蛋白质的受体-结合区域的空间隔离，如展示于图4，可了解糖基化作用位点残基Thr-3(未显示)造成白细胞介素2是本文定义的″RG″受体-结合蛋白质。因此，白细胞介素2是RN细胞因子以及RG细胞因子。
图11以及12分别显示本发明PEG-白细胞介素2缀合物的阳离子-交换及大小排阻色谱，其选择性地于N-端聚乙二醇化(还原烷化)，如实施例1。分级作用的条件与图9以及10的描述一致。图13显示离子交换层析法纯化前后，相同缀合物在十二烷基硫酸钠(″SDS-PAGE″)存在下的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，如展示于图11。凝胶内含4-12％总丙烯酰胺的Bis-Tris缓冲液梯度(目录#NP0335，Invitrogen，Carlsbad，CA)。样品各含约1-2微克蛋白质，于分析之前在90℃下加热10分钟。凝胶于冷却下操作于固定的电压117-120约135分钟。一部分的凝胶用 Ruby蛋白质凝胶染料(Molecular Probes，Eugene，OR)染色以及其它部分用改良的C.E.Childs((1975)Microchem J 20：190-192)以及B.Skoog((1979)VoxSang37：345-349)方法对PEG染色。本发明纯化的单PEG-白细胞介素的二吸收峰(图11)经自动化的Edman降解法的氨基-末端氨基酸分析显示＞90％的PEG是附着至N-端残基。此分析是由Commonwealth Biotechnologies，Inc.(Richmond，VA)进行。
实施例3：″RN″受体结合蛋白质家族的成员以及非成员
图2、3以及5-8显示受体结合蛋白质干扰素β、粒细胞-巨噬细胞集落-刺激因子(″GM-CSF″)、表皮生长因子(″EGF″)、碱性成纤维细胞生长因子(″bFGF″，也为本领域已知的″FGF-2″)、胰岛素样生长因子-1(″IGF-1″)以及干扰素-γ(″干扰素-γ″)相对于其受体-结合区域的赖氨酸残基表面分布，并显示此类蛋白质是否为″RN″细胞因子以及生长因子。此外，图2显示干扰素β是″RG″细胞因子。
图2显示干扰素β的结合部位1以及结合部位2区域的赖氨酸残 基分布，而多肽链氨基末端距离蛋白质受体-结合区域遥远，展现干扰素β是RN细胞因子。
图3显示GM-CSF结合部位1(结合α受体)，以及结合部位2(结合β受体)区域赖氨酸残基分布，而多肽链氨基末端距离蛋白质受体-结合区域遥远，展现GM-CSF是RN细胞因子。
图5显示沿着表皮生长因子(″EGF″)多肽链的赖氨酸残基分布，包括位于或接近蛋白质受体-结合区域的赖氨酸残基，而多肽链氨基末端距离蛋白质受体-结合区域遥远。
图6显示数个碱性成纤维细胞生长因子(″bFGF″)的赖氨酸残基涉及结合至受体或肝素(两者均为bFGF信号传导所必需)(Schlessinger，J.，等人，同上)。bFGF氨基末端距离bFGF肝素-结合区域遥远以及距离受体结合部位足够远，使得bFGF成为RN生长因子。
图7显示数个胰岛素样生长因子-1(″IGF-1″)的赖氨酸残基是位于或毗连多肽的受体-结合区域内，而IGF-1氨基末端距离受体-结合功能域遥远，展现IGF-1是RN生长因子。
图8显示干扰素-γ(″干扰素-γ″)是同二聚体，其中二条多肽链有广泛的相互作用。各多肽上数个赖氨酸残基是与干扰素-γ上涉及结合至受体或是二聚作用界面的氨基酸残基毗连。氨基酸残基Gln-1的″球-和-棒″的版式反映出N-端残基功能上的重要性的证据。(此图的晶体结构基本上包括其它甲硫氨酸残基(标记成″Met 0″)，该甲硫氨酸残基不存在于天然的蛋白质。)由于干扰素-γN-端残基距离二聚作用界面遥远，N-端PEG化可避免赖氨酸PEG化对干扰素-γ同二聚作用的抑制性效应。另一方面，偶合聚合物至氨基末端可抑制二聚物和它的受体的相互作用，尤其是当附着的是长链聚合物。
干扰素-γ，IL-10以及干细胞因子是同二聚体细胞因子的实例(Walter，M.R.，等人，同上；Josephson，K.，等人，(2000)J Biol Chem 275：13552-13557；McNiece，I.K.，等人，同上)。受体结合蛋白质二聚化是鉴定N-端单聚乙二醇化的缀合物特别的主题，因为不同可能的分子结构可存在于相似或同一的大小以及形状的缀合物制剂中。例如，一个二聚乙二醇化的单体以及一个未聚乙二醇化的单体(PEG2-蛋白质1+蛋白质1)组成的二聚物将难以或不可能通过基于二聚缀合物大小的分析(例如大小-排阻层析或沉降系数、光散射或扩散系数评估)与由二N-端聚乙二醇化的单体(PEG1-蛋白质1)2组成的二聚物相区分，而此类每蛋白质单体平均内含一个PEG的二种缀合物其受体-结合能力可能相当不同。
长链β-片层受体结合蛋白质形成同三聚体时，例如肿瘤坏死因子α(″TNF-α″)，PEG3-蛋白质3三聚体的同分异构物数目甚至大于溶液中同二聚体受体结合蛋白质的同分异构物数目。由于TNF接近氨基末端的化学修饰已展示使细胞因子失活(Utsumi，T.，等人，(1992)Mol Immunol 29：77-81)，当用试剂选择性聚乙二醇化N-端残基时，TNF-α不可能保持实质上的活性。
为了表征作为寡聚体形使功能的细胞因子缀合物，需要组合的分析方法。氨基端序列分析可检测具有游离N-端α氨基的单体得存在，以及电泳分析离解的单体(例如SDS-PAGE或毛细管电泳)可透露受体结合蛋白质中未聚乙二醇化的以及多重-聚乙二醇化的单体的存在。无该证据，不能明确的说明形成同二聚体以及同三聚体的蛋白质的单聚乙二醇化的缀合物是同等合成的。
此类实施例，尤其是图1-8图式说明的，在此类生物活性成分受体-结合功能域之内或与之毗连的区域，PEG化受体结合蛋白质对蛋白质-受体相互作用的位阻提供基本了解。若PEG是偶联至单体相互作用所需的区域，则高度延伸以及有弹性的PEG链(参阅图1d)占有的大体积也将在空间上妨碍某些受体结合蛋白质单体结合功能性的同二聚体或同三聚体。因此，在距离受体结合蛋白质受体-结合区域遥远的位点进行靶向PEG化可减低PEG化对其功能所需的分子间相互作用的干扰。进行依据本发明方法，预期PEG化受体结合蛋白质更为有利。产生的缀合物同时具有改良溶解度、增加生物利用度、增大稳定性以及减低免疫原性等利益，可出乎意料地保留高生物活性。
实施例4：通过还原烷化来PEG化干扰素-β-1b
一系列的实施方案中，合成干扰素-β-1b(″干扰素-β-1b；SEQ ID NO：1)和单甲氧基PEG(″mPEG″)的缀合物是用硼烷-吡啶复合体作还原剂，还原烷化20-kDa或30-kDa mPEG-醛来实现的(Cabacungan，J.C.，等人，同上)。不含载体蛋白的干扰素-β-1b其以浓度约1.9毫克/毫升溶于溶液中，其中内含大约3毫克/毫升SDS，得自Chiron Corporat ion(Emeryville，CA)。这个蛋白质称为 以制剂的形式售自BerlexLaboratories(Schering AG的美国子公司)，也称作 以制剂的形式售自Schering。硼烷-吡啶复合体(Aldrich 17，975-2，Milwaukee，WI)是稀释成450mM硼烷的60％(v/v)乙腈水溶液。20-kDa mPEG正丙醛(″PEG-醛″；NOF Corporation，Tokyo)是溶于1mM HCl，浓度为30毫克/毫升。溶解后，将0.1毫升PEG-醛溶液加入0.7毫升干扰素-β-1b溶液中以及混合。添加0.05毫升100mM乙酸缓冲液(pH4.6)，使反应混合物的最终pH为5。向另一内含0.1毫升PEG-醛溶液以及0.7毫升干扰素-β-1b溶液的反应混合物中，加入200mM乙酸、200mM Na2HPO4以及68mM NaOH组成的0.05毫升混合物使最终pH为6.4。向这些混合物的三个0.85-毫升等量样本中各加入0.1毫升的水、1.5M NaCl或10毫克/毫升SDS。然后将稀释的硼烷-吡啶复合物加入各反应混合物中以生成最终浓度23mM的硼烷。将产生的各反应混合物分成二管于4℃或室温下反应2天。等量样本的反应混合物以10mM Tris、150mM NaCl(pH8.3)(其中内含0.3毫克/毫升SDS)，流量0.5毫升/分钟的SuperoseTM12管柱(AmershamBiosciences HR 10/30；Piscataway，NJ)用大小排阻HPLC进行分析。洗脱物的吸光度用214nm监测。输入比例大约为2摩尔PEG/摩尔的蛋白质时，主要的产物是单聚乙二醇化的干扰素-β-1b(PEG1-干扰素-β-1b)。在所有测试条件下(pH5或pH6.4；4℃或室温；NaCl或其它SDS存在或不存在)PEG1-干扰素-β-1b的产率介于65％至72％之间。
其它实验中使用NaBH3CN作为还原剂以及样品分析是用大小排阻HPLC在Superdex200HR 30/10管柱(Amersham Biosciences)中进行，使用10mM乙酸盐、150mM NaC l(pH4.6)(内含1毫克/毫升SDS)洗脱，流速0.5毫升/分钟。该实验的结果展示于图14。20-kDa mPEG输入浓度大约是0.1mM、0.2mM以及0.4mM(图14中分别地称为″1x″、″2x″以及″4x″)以及反应混合物是在室温下反应3天。对照试样(底部示踪)仅和还原剂反应。当相同样品在相同条件下(除了洗脱缓冲液中除去SDS之外)进行色谱分析，洗脱物中未检测到未聚乙二醇化的干扰素-β-1b。实施例4的方法中以30-kDa mPEG正丙醛取代20-kDa mPEG正丙醛时也得到相似的结果。以10-kDa mPEG正丙醛取代20-kDa mPEG正丙醛时也得到相似的结果。此外可使用mPEG-乙醛或丁醛。此实施例方法选择性N-端PEG化干扰素β可产生增进生物活性的缀合物，不论N-末端氨基酸是否是丝氨酸(干扰素-β-1b)、甲硫氨酸(干扰素-β-1a)或其它氨基酸。
实施例5：氧化分裂作用来测定N-端PEG化的程度
PEG偶联至蛋白质N-端丝氨酸残基α氨基，而不是易接近的赖氨酸残基ε氨基的比率，可用包括烷基化丝氨酸残基的氧化分裂作用的新颖的方法评估。PEG1-干扰素-β-1b是主要物种(大约是总蛋白质的70％)的反应混合物可用1毫克/毫升SDS的乙酸盐缓冲液(pH4.6)透析。然后添加10mM Na3PO4将pH调至7.4。此溶液的部份在4℃缺少过碘酸钠下或最终浓度0.1至10mM NaIO4下反应至多20小时。反应后反应混合物以SuperoseTM 6管柱进行色谱分析，使用10mM乙酸盐缓冲液、150mM NaCl(pH4.6)(内含1毫克/毫升SDS)洗脱。关于单聚乙二醇化的干扰素-β-1b回收率，用Superose 12管柱得到相似的结果，Superose 12管柱的优点是允许从″盐吸收峰″中解析未经修饰的干扰素-β-1b。214nm吸光度吸收峰下对应至PEG1-干扰素-β-1b的区域对高碘酸盐浓度作图，显示至约1mM高碘酸盐浓度下此区域剧烈减少以及1mM至10mM高碘酸盐浓度下残留PEG1-干扰素-β-1b几乎维 持固定的水平。以≥3mM高碘酸盐处理0.2、2或7小时之后的相似分析指出丝氨酸-联结的PEG的氧化分裂作用基本上在2小时之内完成。残留PEG缀合物仅内含赖氨酸-联结的PEG，多至10mM高碘酸盐处理下此联结仍稳定。用高碘酸盐氧化反应后存在的缀合物的比率类似于以Edman降解法估计的除氨基末端之外的聚乙二醇化位点的比率。用各种分析方法，包括(但非限于)：反相色谱法、毛细管电泳、凝胶电泳、超高速离心、质谱、光散射或超滤法评估氧化方法下稳定或不稳定的缀合物的分布时得到相似的结果。
干扰素-β-1b是用硼烷-吡啶复合物作还原剂在各种描述于实施例4的不同条件下偶联至20-kDa PEG-醛。单聚乙二醇化的干扰素-β-1b是用Superose 12管柱色谱法纯化，使用20mM磷酸钠缓冲液、150mM NaCl(pH7.4)(其中内含0.3毫克/毫升SDS)洗脱，流速为0.5毫升/分钟。纯化的PEG1-干扰素-β-1b缀合物在室温下3mM过碘酸钠不存在或存在下反应2小时。图15显示未处理的以及氧化分解的PEG1-干扰素-β-1b样品的Superose 12管柱色谱，其是以10mM Tris、150mM NaCl(pH8.3)(内含0.3毫克/毫升SDS)洗脱，流速0.5毫升/分钟。此类数据指出PEG1-干扰素-β-1b中大约90％PEG在pH6.4下合成偶联至N-端丝氨酸。反应混合物中添加150mM NaCl(下面的曲线)或1毫克/毫升SDS(上面的曲线)或在pH5下进行偶联反应(结果未显示)不会显著的改变此结果。当单羟基PEG正丙醛取代mPEG正丙醛或使用PEG醛而不是正丙醛时也得到相似的结果。同样地，本实施例方法可度量干扰素-β-1b之外其它蛋白质(其中该蛋白质有N-端丝氨酸或苏氨酸残基)N-端还原烷基化的程度。同样地，通过还原烷化连接至N-端丝氨酸或苏氨酸残基的聚合物的氧化分裂作用可使用过碘酸钠之外的高碘酸盐达成，包括(但非限于)：偏高碘酸钠(本文中以及本领域也称为过碘酸钠)、偏高碘酸钾、偏高碘酸锂、高碘酸钙、高碘酸钡以及高碘酸。
通过还原烷化实施例5的方法适用的其它细胞因子而合成的聚合物缀合物包括白细胞介素-1-α(Geoghegan，K.F.，等人，同上)以 及巨核细胞生长和发生因子(Guerra，P.I.，等人，同上)。
实施例6：反相色谱法纯化缀合物以及去除游离PEG和SDS
S.Hershenson等人(美国专利第4,894,330号)使用反相(″RP″)色谱法纯化细菌细胞培养表达的干扰素-β-1b。本案发明人使用Hershenson等人的方法从未经修饰的蛋白质分离实施例4合成的个别的聚乙二醇化物。此步骤也可从蛋白质吸收峰解析游离PEG以及大部份的SDS。图16显示JupiterTMC4300A管柱(15公分x4.6毫米；Phenomenex；Torrance，CA)分析型色谱，以20％乙腈加上0.04％三氟乙酸至80％乙腈加上0.1％三氟乙酸梯度洗脱。加载0.1毫升反应混合物，收集0.5毫升级分，流速1毫升/分钟。吸光度280nm下(实线)检测到曝露至PEG化试剂下但未经修饰的干扰素-β-1b的吸收峰(″Mock聚乙二醇化″)以及每分子蛋白质内含一链或多链PEG的PEG缀合物吸收峰。此实验中，管柱是维持于40℃。在室温下的色谱法得到不同滞留时间但相似的定性结果。
收集的级分中SDS测定的结果以空心三角形展示。SDS分析试剂的储备溶液内含1毫克/毫升的羰花青染料Stains-Al1(Sigma，#E-9379；3，3′-二乙基-9-甲基-4，5，4′，5′-二苯并硫代羰花青)，溶于50％(v/v)异丙醇水溶液(Rusconi，F.，等人，(2001)AnalBiochem295：31-37)。使用之前搅拌2毫升储备溶液加上2毫升N，N-二甲基甲酰胺以及41毫升水制备此工作反应剂。反应剂中添加SDS引起专一性SDS光谱的改变以及减少510-515nm的吸收峰以及在439nm出现吸收峰。将来自RP色谱柱的各2mcL级分添加至96孔微量滴定板中的250mcL工作反应剂，439nm吸光度的改变是用SpectraMax 250平板计读器监测(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)。
分析收集的级分中PEG的结果展示于图16的实心圆圈。在使用之前搅拌1体积20％(w/v)氯化钡(溶于1当量HC1)和4体积4毫克/毫升碘的1％(w/v)碘化钾以制备PEG分析反应剂。于内含90mcL水的96孔微量滴定板中加入10mcL各RP色谱柱级分(以及PEG标准 液)，接着加入100mcL的PEG分析试剂。样品以及反应剂混合后在室温下反应15分钟，以SpectraMax平板计读器测量508nm的吸光度。图16显示RP色谱法从内含一链或多链20-kDa PEG缀合物中分离Mock聚乙二醇化的蛋白质的图式，并从缀合物中解析未结合的PEG以及SDS。从内含其它分子量PEG(例如10-kDa或30-kDa PEG)以及PEG与干扰素-β-1b之间以其它酸-稳定的键联结的缀合物也得到相似的结果。
实施例7：从制备型反相HPLC纯化的级分进行色谱分析以及电泳分析
反相色谱法的条件与描述于实施例6者相似，将PEG化反应混合物的较大样品(0.3或0.5毫升)用相同的Jupiter C4管柱及经修改的梯度进行分析。当加载较大的样品后，各式各样的干扰素(Mock聚乙二醇化的、PEG1-干扰素-β-1b或具有多于一链PEG的缀合物)的分辨率不如图16清楚。然而，得到了高度富含Mock聚乙二醇化的或单聚乙二醇化的蛋白质的级分，是以相同RP管柱对部分纯化级分的小量样本再层析获得(图17)。色谱分析是使用EZChrom Elite软件(Scientific Software，Inc.，Pleasanton，CA)进行。从此分析，展示于上方曲线的制备物(制备型RP管柱的级分53)内含约70-80％Mock聚乙二醇化的干扰素-β-1b，而展示于中间曲线的制备物(级分51)内含约99％PEG1-干扰素-β-1b。图17的底部曲线显示所述级分所源自的反应混合物的色谱，其中约19％的吸光度是和Mock聚乙二醇化的蛋白质相关，约61％和PEG1-干扰素吸收峰相关，约12％和标记的PEG2-干扰素吸收峰相关，以及5-6％与洗脱比PEG2-干扰素快的形式相关。从其它厂商的反相管柱得到相似的定性结果。
相同反应混合物(RP色谱法分析，图17)以及二个RP色谱法纯化的PEG-干扰素级分是用聚丙烯酰胺凝胶电泳在SDS存在下分析(″SDS-PAGE″)。此结果展示于图18以及19。重复样品和还原剂(Invitrogen，#NP0004；Carlsbad，CA)或无还原剂在环境温度下 或102℃下反应10分钟以及在4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen，#NP0321B)、120V下电泳140分钟。展示于图18以及19踪迹的样品是既未还原也未加热。蛋白质凝胶用 Ruby Stain(Molecular Probes # S-12000，Eugene，OR)染色，302nm照明以及使用橙色的/红色可见光滤器(Molecular Probes，# S-6655)拍照(图18)。数字成像是使用柯达(Rochester，NY)的1D影像分析软件分析。水平轴代表相对于染料前端的位移(100单位)，垂直轴代表荧光蛋白质染色的相对强度。各行的基线值已垂直地位移以阐明呈现的结果。底部踪迹代表标准蛋白质的混合物(Mark12TM，#LC5677，Invitrogen)，其中吸收峰1至9确认为具有下列分子量的蛋白质(以kDa表示)：200、116、97.1、66.3、55.4、36.5、31.0、21.5以及14.4。底部算起第二个踪迹显示电泳分析的反应混合物。此混合物中与各干扰素-β-1b型式的蛋白质染色相关的百分比是：14％Mock聚乙二醇化物；64％PEG1-干扰素；20％PEG2-干扰素以及约2％大于PEG2-干扰素的形式。底部算起第三个踪迹显示内含33±1％PEG1-干扰素；64±1％PEG2-干扰素以及约6％大于PEG2-干扰素的形式的RP层析柱级分。顶部曲线显示内含95±1％PEG1-干扰素，约2％Mock聚乙二醇化的干扰素以及约2％大于PEG2-干扰素的形式的级分。以上百分比是各样本四次重复分析结果的平均值以及标准差。10kDa以及30kDa PEG得到相似的定性结果。
图19显示SDS-PAGE分析结果，该分析与图18的相同，但是凝胶是使用20％(w/v)BaCl2的1当量HC1合并4体积4毫克/毫升I2的1％(w/v)KI对PEG进行染色的。底部踪迹代表染色前(pre-stain)的标准蛋白质的混合物(参阅Blue P1us2TM，Invitrogen # LC5625)，其中吸收峰1至9的蛋白质的表观分子量如下(以kDa表示)：204、111、68.8、51.5、40.2、28.9、20.7、14.9以及0.6。PEG-染色凝胶的定量分析显示来自RP管柱级分51的PEG约99％和PEG1-干扰素相关(顶端曲线)，而富含diPEG缀合物的级分(从顶端算起第二个曲线)除了约71％的PEG2-干扰素之外还含25±1％的PEG1-干扰素以及 约3％大于PEG2-干扰素的形式。为了估计经PEG染色的各不同形式的干扰素-β-1b相对量，将PEG2-干扰素吸收峰以下的面积除以2。反应混合物(从底部算起第二个曲线)中，约50％的PEG染色和未结合的PEG相关，约35％和PEG1-干扰素相关，约14％和PEG2-干扰素相关以及约1％和大于PEG2-干扰素的形式相关。
实施例8：干扰素-β-1b的选择性N-端氧化以及偶联至低分子量肼基甲酸
使用备用的方法偶联mPEG至干扰素-β-1b氨基末端可明显地将附着位点的选择性从还原烷化(描述于实施例4以及5)的约90％增加至约100％。此PEG化方法的第一步骤所基于的原理与描述于实施例5的对还原烷基化的PEG-干扰素-β-1b进行氧化分裂作用相似。这个方法利用高碘酸盐可特异性地将N-端丝氨酸或苏氨酸残基分解至醛的优点，如报导于H.B.F.Dixon(同上)以及K.F.Geoghegan等人，((1992)Bioconjug Chem 3：138-146；Geoghegan，K.F.，U.S.Patent No.5,362,852；Drummond，R.J.，等人，美国专利第6,423,685号)。当干扰素-β-1b的N-端丝氨酸残基氧化程度是最大时，例如3mM NaIO4室温下处理2小时后，Superose 6管柱大小-排阻层析产生的蛋白质吸光度吸收峰变宽。Superose 12管柱后续的分析使用10mM乙酸盐、150mM NaCl(pH4.6)(内含0.3毫克/毫升SDS)洗脱，其明显将氧化的蛋白质解析成二种推论为蛋白质单体和二聚体的形式。此二吸收峰的性质是经SDS-PAGE证实，如描述于实施例7。
反相色谱法分析进一步发现：可实现对N-端丝氨酸的优先氧化，而仅对至少一个必需的甲硫氨酸残基具有最小的氧化反应。L.S.Lin等人，((1996)Pharrn Biotechnol 9：275-301)以及L.Lin((1998)Dev Biol Stand 96：97-104)显示RP色谱法可将干扰素-β-1b的制剂解析成主要成分(″吸收峰B″)以及较早洗脱的次要成分(″吸收峰A″)。Lin((1998)同上)进一步说明吸收峰A内含干扰素-β-1b，其中功能活性的甲硫氨酸(BETASERON的Met 61)被氧化成亚砜。本 案发明人发现了下面的条件，在该条件下可几乎完全氧化N-端丝氨酸而同时使Met 61的氧化反应最小化，其反映在RP色谱的吸收峰A的百分比。RP色谱法测定的Met 61氧化可作为干扰素-β-1b其它甲硫氨酸残基(BETASERON的Met 35以及Met 116)氧化的替代标记。
研究pH以及反应(0.25mM NaIO4，4℃)时间与Met 61氧化程度的关系总结于表1。
表1：pH以及高碘酸盐曝露时间对甲硫氨酸氧化程度的效应，由反相色谱法后吸收峰A的区域测定。
干扰素-β-1b的N-端氧化反应形成的醛的证实可通过将其连接至9-芴基甲基肼基甲酸酯(″Fmoc-肼基甲酸酯″，也为技术上已知的″Fmoc-酰肼″)(Fluka 46917；Zhang，R.-E.，等人，(1991)Anal Biochem 195：160-167)而得到促进。干扰素-β-1b的Fmoc-肼基甲酸酯加合物独特的吸光度光谱可区别蛋白质对应的非缀合形式而不必使用荧光检测器。用各式不同浓度的NaIO4于pH7.8处理不同的时间(在室温下0.5至2小时，或在冷却下多至数天)可使干扰素-β-1b氧化。在展示于图20的实验中，此蛋白质是在室温、0.5mM NaIO4下反应1小时。添加甘油终止反应。在室温下30分钟后，添加醋酸至最终浓度19mM以降低pH。各毫升产生的混合物中，添加入182mcL的15mM Fmoc-肼基甲酸酯的甲醇溶液，使Fmoc-肼基甲酸酯的最终浓度为2.3mM。反相色谱法分析前，将此反应混合物在4-8℃下反应过夜。
图20阐明干扰素-β-1b和0.5mM NaIO4在室温反应1小时以及将 氧化产物偶联至Fmoc-肼基甲酸酯对RP色谱分析性质的效应。比较对照样本(上端曲线)和氧化的样本(中间的曲线，空心圆)的结果显示主要的成分以及吸收峰A(反映出存在约5％干扰素-β-1b具有氧化的甲硫氨酸残基)氧化反应后的滞留时间增加0.2至0.3分钟。测定吸收峰A的百分比(相较于吸收峰A′)，检测到在此类条件下与NaIO4反应后氧化的甲硫氨酸少于1％。
描述于实施例11的生物测定法的结果提供其它证据，证明用0.1至0.3mM高碘酸盐进行受控的氧化作用(例如在冷却下至多2小时)可保存蛋白质重要的生物活性氨基酸残基的完整性。
如展示于图20较低的实心三角曲线，主要的成分以及吸收峰A′(吸收峰A的N-端醛衍生物)位移至较长滞留时间，从而提供形成Fmoc加合物的证据。此外，278nm与214nm(发生位移的吸收峰)吸光度的比例增加50％。对于这两种形式的蛋白质，由于形成对应的N-端醛类造成的滞留时间增加(0.2-0.3分钟)远小于形成对应的Fmoc衍生物所造成的滞留时间增加(1.0-1.2分钟)。
实施例9：合成N-端氧化的干扰素-β-1b的PEG-肼基甲酸酯加合物
氨基末端选择性地氧化(如实施例8)的干扰素-β-1b也可偶联至PEG的肼基甲酸酯衍生物，其是使用描述于R.J.Drummond等人(PCT公告第WO 99/45026号；美国专利第6,423,685号)以及S.Zalipsky等人，(PCT公告第WO 92/16555 A1号以及Harris，J.M，等人，eds.，(1997)Chemistry and Biological Applications of Poly(ethylene glycol)，pp.318-341，Washington，D.C.，American Chemical Society)的方法。PEG-肼基甲酸酯是肼与20-kDa PEG的对硝基苯碳酸盐衍生物(″NPC-PEG″，NOF Corporation)反应合成的产物。蛋白质在室温、缺少高碘酸盐或0.125mM NaIO4存在下反应0.5、1或2小时后，样品用4倍体积20-kDa PEG-肼基甲酸酯的10mM乙酸盐缓冲液，150mM NaCl(pH4.6)(内含1毫克/毫升SDS)稀释，以 及在室温下反应1天。样品用Superose 12管柱进行大小-排阻层析分析，10mM Tris，150mM NaCl(pH8.3)(内含0.3毫克/毫升SDS)洗脱。如展示于图21，与PEG-肼基甲酸酯反应之前蛋白质先氧化至多2小时，其结果可持续性的减少未经修饰的蛋白质(洗脱的滞留时间约25分钟)的浓度以及持续性的增加与PEG1-干扰素-β-1b缀合物(洗脱的滞留时间约20分钟)相关的吸光度的比例。此方法产生的PEG1-干扰素-β-1b超过80％。使用10-kDa或30-kDaPEG的单肼基甲酸酯衍生物可得到相似的结果。
实施例10：反相HPLC纯化的单聚乙二醇化的干扰素-β-1b的生物测定法
使用人类Daudi Burkitt′s淋巴瘤细胞(ATCC # CCL-231，Manassas，VA)进行干扰素-β-1a以及各种突变蛋白的抗增殖测定，描述于L.Runkel等人((2000)Biochemistry 39：2538-2551)。图22描述未处理的干扰素-β-1b以及RP色谱法部分纯化的N-端单聚乙二醇化的缀合物对Daudi细胞抗增殖活性测定的结果。此细胞生长于补充的RPMI 1640培养基(Gibco #11875-093，Grand Island，NY)，内含10％(v/v)胎牛血清(Irvine Scientific #3000，Santa Ana，CA)。将十万个细胞接种到48-孔板中含250mcL培养液的各孔中，以及容许在37℃和5％CO2下生长4小时，之后混合相等体积预先加热的培养液或培养液稀释的干扰素-β-1b或PEG缀合物。于3天期间，以Coul ter计数器(Model ZI，Miami，FL)计算细胞，仅用培养液稀释的细胞其数目增加至零时间的590+/-24％(s.d.)。干扰素-β-1b或它的PEG缀合物最大的生长抑制的条件下，细胞的数目增加至零时间的283+/-8％。如此本实验观察到的最大生长抑制百分比是48％。图22各种不同的浓度的二种干扰素-β-1b制剂的数据是用抑制细胞生长的百分比表达。
图22显示使用干扰素-β-1b储备溶液稀释液以及来自制备型反相色谱分析实验(描述于实施例7)并且内含几乎纯的单PEG缀合物的级分（如展示于图17-19级分51），或几乎纯的Mock聚乙二醇化的干扰素-β-1b（图17管柱展示的级分53）的结果。三重复样品用1微克/毫升补充胎牛血清以及经由0.2-微米滤器过滤灭菌的培养液稀释。从各起始稀释液，制备32ng/毫升以及后续的系列稀释液。从图22的数据，计算各制剂抑制50%细胞生长的浓度（"IC50"）。结果显示单-聚乙二醇化的干扰素-β-1b（IC50=c.40pg/毫升）的效能大约是未经修饰的干扰素-β-1b（IC50=c.250pg/毫升）的6倍。一系列与图22类似的实验测试的各种大小PEG的缀合物抗增殖的效力平均增加值，其范围约2.5-倍（10kDa PEG）至约5-倍（30kDaPEG）。
出人意外地，展示于图22的Mock聚乙二醇化的制剂其IC50约为80pg/毫升，介于干扰素-β-1b储备溶液以及单聚乙二醇化的制剂中间。不希望束缚于任何理论或特定的机制，合理的解释是：Mock聚乙二醇化制剂的抗增殖能力的增加表明反相色谱法去除了一些存在于干扰素-β-1b溶液中的抑制性材料。此解释和Superose6管柱大小-排阻层析（洗脱缓冲剂中内含SDS，描述于实施例4）的结果一致，大小-排阻层析揭露214nm以及280nm吸光度吸收峰可于干扰素-β-1b以及"盐吸收峰"洗脱位置之间洗脱出。用相似于图22展示的实验的生物测定法对RP管柱的级分49进行测定，其内含PEG2-以及PEG1-干扰素-β-1b的混合物（参阅图18以及19）。如同Mock聚乙二醇化的样本，多处聚乙二醇化的样本有抗增殖的能力，其大于干扰素-β-1b储备溶液，但少于单聚乙二醇化的缀合物。其它实验中观察到单聚乙二醇化的干扰素-β-lb增加六-倍至十倍的效能。使用10、20以及30kDa的PEG的肼基甲酸酯加合物（描述于实施例9），观察到相似的效能增加。
本发明缀合物得到的Daudi细胞抗增殖的能力和三种干扰素-β医药学的形式报导的抗病毒分析的比活性相似。依据分别的包装物， （IFN-β-1b）的活性是32x106IU/毫克、（IFN-β-1a的Biogen's制剂）的活性是200x106IU/毫克以及（IFN-β-la的Serono's制剂）的活性是270x106IU/毫克。据此，图22说明单聚乙二醇化的BETASERON抗增殖分析中的效能最少增加六倍，显示本发明方法的N-端PEG化BETASERON的效能达到市售的糖基化制剂AVONEX以及REBIF。
先前提过，使用酸性的溶液(Hanisch，W.H.等人，美国专利第4,462,940号)或添加SDS(Thomson，J.W.，美国专利第4,816,440号)可增进未糖基化的干扰素-β(表达于大肠杆菌)的溶解度。不希望束缚于理论，PEG化可增加干扰素-β-1b在体外的抗增殖功效的机制是降低它在培养液中自我结合的倾向。据此，观察到富含PEG2-干扰素-β-1b的样本的效力比PEG1-干扰素-β-1b少，表明减低凝集的正效应可被多余PEG化对细胞因子结合至它受体的能力和/或引发抗增殖活性信号传导的能力的负效应所掩盖。
实施例11：选择性地氧化的干扰素-β-1b的生物测定
如描述于实施例10，测定氧化至各种程度的干扰素-β-1b对Daudi细胞的抗增殖活性。测试样品包括干扰素-β-1b储备溶液以及4℃下0.1、0.3或3mM高碘酸盐处理数天的样品。样品如实施例10所述稀释，以及于接种细胞4小时后混合相等体积的Daudi细胞悬浮液。细胞是于37℃、5％CO2下生长2天，然后用Coulter计数器计数。在测试条件下0.075-0.5mMNaIO4处理，干扰素-β-1b抗增殖活性是不受影响或是增加。3天的抗增殖的测定(如实施例10)得到相似的结果。如描述于实施例9，选择性氧化的干扰素-β-1b和PEG-肼基甲酸酯缀合可进一步增进抗增殖的能力。选择性氧化的干扰素-β-1b与PEG-酰肼最后的产物可与PEG-肼基甲酸酯的产物得到相似的结果。相反的，干扰素-β-1b用较高浓度的高碘酸盐(例如1-3mM)处理可抑制或彻底破坏Daudi细胞抗增殖的效应。此类高浓度NaIO4诱发蛋白质的二聚作用，可用Superose 12管柱大小排阻HPLC检测(描述于实施例5)，以及诱发甲硫氨酸氧化反应，可用反相色谱法检测(描述于实施例6)(结果未显示)。
本发明缀合物的生物活性可用已知的基于各种细胞系或原代培养 物(其中细胞带有干扰素β的细胞-表面受体)的抗增殖的技术以及抗病毒技术测定。此外，可监视干扰素β反应，包扩诱导新蝶呤(Pepinsky，R.B.，等人，同上)、β2-微球蛋白(Pepinsky，R.B.，等人，同上)、或2′-5′-寡腺苷酸合成酶(Bruchelt，G.，等人，(1992)EurJ.Clin Chein ClinBiochemn 30：521-528)或有效联结于干扰素β可诱发的蛋白质启动子的报导基因蛋白质。测定干扰素β聚合物缀合物生物活性的其它方法包含信号传导测定以及基因活化测定(例如Pungor，E.，等人，(1998)J Interferon Cytokine Res 18：1025-1030)。
本发明是参照某些实施方案以及某些实施例加以描述。本发明方法同样地可用于除细胞因子或其拮抗剂之外的某些受体-结合肽类以及蛋白质以及使用其它最后试剂。因此本发明范围并非受限于描述的实施方案，但仅受限于权利要求的范围。平常的本领域技术人员可立即认知其它实施方案可实际施行，而不脱离本发明范围。所有该变异均考虑为本发明的部份。
本说明书提及的所有出版物、专利以及专利申请案是用以说明本发明所属领域技术人员的技术水平。其在此引入作为参考，如同每一单独的申请、专利或专利申请明确或单独地引入作为参考一样。

Claims (36)

1.一种增加非糖基化干扰素β的体外生物效力的方法，包含在存在十二烷基硫酸钠(SDS)下选择性地偶联一种聚(乙二醇)(PEG)至该干扰素β的氨基末端氨基酸上，以获得经修饰的干扰素β，
其中该氨基-末端氨基酸位于该干扰素β的受体-结合功能域的远端，
其中该PEG具有的分子量为10kDa－30kDa，其中所述增加的体外生物效力是在响应于干扰素β的细胞培养测定法中测量的增加的抗增殖的效力，以及
其中所述偶联包括
(a)(i)混合所述干扰素β和所述PEG的醛衍生物以形成席夫碱，和(ii)在一定条件下用温和的还原剂，还原所述席夫碱，从而形成仲胺键，其中所述经修饰的干扰素-β的体外生物效力是所述偶联前所述干扰素-β的体外生物效力的2.5倍－6倍，并且其中所述选择性偶联得到90％的所述PEG缀合于氨基-末端氨基酸；或者
(b)(i)在对所述干扰素-β的至少一个必需的甲硫氨酸残基具有最小的氧化反应的条件下，用高碘酸盐将所述干扰素-β的N-端丝氨酸或苏氨酸残基氧化分解成醛类，和(ii)将所述醛与所述PEG的肼基甲酸酯衍生物偶联，其中所述经修饰的干扰素-β的体外生物效力是所述偶联前所述干扰素-β的体外生物效力的6－10倍。
2.权利要求1的方法，其中该干扰素β具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
3.权利要求1的方法，其中在(a)中该PEG共价偶联至该氨基末端氨基酸的α氨基上。
4.权利要求3的方法，其中该PEG与该α氨基的共价偶联是经由仲胺连接的。
5.权利要求1的方法，其中该PEG具有的分子量为18kDa－22kDa。
6.权利要求5的方法，其中该PEG具有的分子量为20kDa。
7.权利要求1的方法，其中该PEG具有的分子量为30kDa。
8.包含缀合物和去污剂的组合物，所述缀合物由权利要求1的方法产生。
9.一种药物组合物，包含一种或多种由权利要求1的方法产生的缀合物及一种或多种药学上可接受的赋形剂。
10.包含去污剂和缀合物的组合物，其中所述缀合物包含在其氨基末端氨基酸处共价偶联至PEG上的非糖基化的干扰素β，
其中该PEG具有的分子量为10kDa－30kDa，
其中在所述干扰素β和所述PEG之间的偶联包括
(a)形成经修饰的干扰素β，通过：(i)混合未经修饰的非糖基化的干扰素β和所述PEG的醛衍生物以形成席夫碱，和(ii)在一定条件下用温和的还原剂，还原所述席夫碱，从而形成仲胺键，其中所述经修饰的干扰素-β的体外生物效力是所述未经修饰的非糖基化的干扰素-β的体外生物效力的2.5倍－6倍，并且其中90％的所述PEG缀合于所述经修饰的干扰素-β的氨基-末端氨基酸；或者
(b)形成经修饰的干扰素β，通过：(i)在对至少一个必需的甲硫氨酸残基具有最小的氧化反应的条件下，用高碘酸盐将未经修饰的非糖基化的干扰素-β的N-端丝氨酸或苏氨酸残基氧化分解成醛类，和(ii)将所述醛与所述PEG的肼基甲酸酯衍生物偶联，其中所述经修饰的干扰素-β的体外生物效力是所述未经修饰的非糖基化的干扰素-β的体外生物效力的6－10倍,
其中所述体外生物效力是在响应于干扰素β的细胞培养测定法中测量的抗增殖的效力。
11.权利要求10的组合物，其中该干扰素β具有SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列。
12.权利要求10的组合物，其中(a)中该PEG共价偶联至该干扰素β的氨基-末端氨基酸的α氨基上。
13.权利要求12的组合物，其中该PEG经由仲胺连接共价偶联至该α氨基上。
14.权利要求10的组合物，其中该PEG具有的分子量为18kDa－22kDa。
15.权利要求14的组合物，其中该PEG具有的分子量为20kDa。
16.权利要求10的组合物，其中该PEG具有的分子量为30kDa。
17.一种试剂盒，包含权利要求9的药物组合物。
18.权利要求8和10－13中任一项的组合物在制备用于预防、诊断、或治疗患有或易患有干扰素β响应性身体病症的动物中所述身体病症的药剂中的用途。
19.权利要求9的药物组合物在制备用于一种预防、诊断、或治疗患有或易患有干扰素β响应性身体病症的动物中所述身体病症的药剂中的用途。
20.权利要求18的用途，其中该动物是哺乳动物。
21.权利要求19的用途，其中该动物是哺乳动物。
22.权利要求20或21的用途，其中该哺乳动物是人。
23.权利要求18的用途，其中该干扰素β响应性身体病症选自：癌症、传染病、神经变性病症、自体免疫病症以及遗传疾病。
24.权利要求23的用途，其中该癌症选自：癌、肉瘤、腺瘤以及骨髓瘤。
25.权利要求23的用途，其中该癌症选自：神经癌症、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、肺癌、白血病、淋巴瘤、胃肠的癌症、胰腺癌、膀胱癌、肾癌、骨癌、头部以及颈部癌症以及皮肤癌。
26.权利要求23的用途，其中该癌症是结肠癌。
27.权利要求23的用途，其中该干扰素β响应性传染病选自：病毒性肝炎、亲心性病毒以及HIV/AIDS引起的疾病。
28.权利要求23的用途，其中该干扰素β响应性神经变性疾病是多发性硬化。
29.权利要求28的用途，其中该多发性硬化选自：复发-缓解性多发性硬化、原发性进行性多发性硬化以及继发性进行性多发性硬化。
30.权利要求19的用途，其中该干扰素β响应性身体病症选自：癌症、传染病、神经变性病症、自体免疫病症以及遗传疾病。
31.权利要求30的用途，其中该癌症选自：癌、肉瘤、腺瘤以及骨髓瘤。
32.权利要求30的用途，其中该癌症选自：神经癌症、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、肺癌、白血病、淋巴瘤、胃肠的癌症、胰腺癌、膀胱癌、肾癌、骨癌、头部以及颈部癌症以及皮肤癌。
33.权利要求30的用途，其中该癌症是结肠癌。
34.权利要求30的用途，其中该干扰素β响应性传染病选自：病毒性肝炎、亲心性病毒以及HIV/AIDS引起的疾病。
35.权利要求30的用途，其中该干扰素β反应性神经变性病症是多发性硬化。
36.权利要求35的用途，其中该多发性硬化选自：复发-缓解性多发性硬化、原发性进行性多发性硬化以及继发性进行性多发性硬化。
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