PL219741B1 - Sposób zwiększania antyproliferacyjnego potencjału nieglikozylowanego interferonu-beta-1b in vitro, koniugat wytworzony tym sposobem i jego zastosowanie oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca koniugat i jej zastosowanie - Google Patents
Sposób zwiększania antyproliferacyjnego potencjału nieglikozylowanego interferonu-beta-1b in vitro, koniugat wytworzony tym sposobem i jego zastosowanie oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca koniugat i jej zastosowanieInfo
- Publication number
- PL219741B1 PL219741B1 PL379987A PL37998703A PL219741B1 PL 219741 B1 PL219741 B1 PL 219741B1 PL 379987 A PL379987 A PL 379987A PL 37998703 A PL37998703 A PL 37998703A PL 219741 B1 PL219741 B1 PL 219741B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- interferon
- cancer
- beta
- conjugates
- peg
- Prior art date
Links
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 title claims abstract description 56
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 title claims abstract description 41
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 title claims abstract description 26
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 title abstract description 109
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 169
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 130
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims abstract description 124
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims abstract description 124
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 113
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 23
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims abstract description 20
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 20
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 15
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 claims abstract description 11
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims abstract description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 52
- 108010005714 Interferon beta-1b Proteins 0.000 claims description 42
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 41
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 37
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 37
- 229960003161 interferon beta-1b Drugs 0.000 claims description 35
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 32
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 32
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 31
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 claims description 28
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 26
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 26
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 26
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 claims description 26
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 25
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 23
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims description 22
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims description 22
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 claims description 21
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 claims description 20
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 19
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 19
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 19
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims description 17
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 17
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 17
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims description 16
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims description 16
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims description 16
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 15
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 14
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 13
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 13
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 13
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 12
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims description 12
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 claims description 10
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 10
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 9
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 claims description 9
- 208000007118 chronic progressive multiple sclerosis Diseases 0.000 claims description 8
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 8
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000002262 Schiff base Substances 0.000 claims description 6
- 150000004753 Schiff bases Chemical class 0.000 claims description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 6
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 claims description 6
- NNTOJPXOCKCMKR-UHFFFAOYSA-N boron;pyridine Chemical compound [B].C1=CC=NC=C1 NNTOJPXOCKCMKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 claims description 6
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 claims description 5
- 208000003200 Adenoma Diseases 0.000 claims description 5
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 5
- 206010005949 Bone cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 208000018084 Bone neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 206010017993 Gastrointestinal neoplasms Diseases 0.000 claims description 5
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 claims description 5
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 claims description 5
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 claims description 5
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 5
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 5
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 claims description 5
- 208000024313 Testicular Neoplasms Diseases 0.000 claims description 5
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 5
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 claims description 5
- 230000001426 cardiotropic effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 5
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 claims description 5
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 5
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 claims description 5
- 206010063401 primary progressive multiple sclerosis Diseases 0.000 claims description 5
- 201000008628 secondary progressive multiple sclerosis Diseases 0.000 claims description 5
- 206010001233 Adenoma benign Diseases 0.000 claims description 4
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 claims description 4
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 4
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000007400 Relapsing-Remitting Multiple Sclerosis Diseases 0.000 claims description 4
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 claims description 4
- 206010057644 Testis cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 4
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 201000003120 testicular cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 claims description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 abstract description 87
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 abstract description 87
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 abstract description 33
- 239000003446 ligand Substances 0.000 abstract description 30
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 26
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 15
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 11
- 230000003993 interaction Effects 0.000 abstract description 11
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 9
- 108010005716 Interferon beta-1a Proteins 0.000 abstract description 7
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract description 5
- 238000010364 biochemical engineering Methods 0.000 abstract description 3
- 229960004461 interferon beta-1a Drugs 0.000 abstract description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 abstract 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 165
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 162
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 158
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 157
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 73
- 101710146873 Receptor-binding protein Proteins 0.000 description 59
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 59
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 51
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 45
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 43
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 39
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 38
- -1 poly (oxyethylene-oxymethylene) copolymers Polymers 0.000 description 36
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 34
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 32
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 32
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 30
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 29
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 29
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 28
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 28
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 27
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 26
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 25
- 229920001427 mPEG Polymers 0.000 description 25
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 25
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 25
- 230000036515 potency Effects 0.000 description 24
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 23
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 21
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 21
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 20
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 20
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 19
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 18
- 208000024335 physical disease Diseases 0.000 description 17
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 16
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 16
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 description 16
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 16
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 15
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 15
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 15
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 14
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 14
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 14
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 13
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 13
- NBBJYMSMWIIQGU-UHFFFAOYSA-N Propionic aldehyde Chemical compound CCC=O NBBJYMSMWIIQGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 13
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 13
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 13
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 13
- 238000005932 reductive alkylation reaction Methods 0.000 description 13
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 13
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 12
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 12
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 12
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 12
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 12
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 12
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 11
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 11
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 11
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 11
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 10
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 10
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 10
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 10
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 10
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 10
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 10
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 9
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 8
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 8
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 8
- 101710098940 Pro-epidermal growth factor Proteins 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 description 8
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 8
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 8
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 8
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 8
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical group C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102100040018 Interferon alpha-2 Human genes 0.000 description 7
- 108010079944 Interferon-alpha2b Proteins 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 7
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000007248 oxidative elimination reaction Methods 0.000 description 7
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 7
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 7
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 101001124867 Homo sapiens Peroxiredoxin-1 Proteins 0.000 description 6
- 101000692259 Homo sapiens Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains 1 Proteins 0.000 description 6
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 6
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 6
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102100026066 Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains 1 Human genes 0.000 description 6
- 108010057464 Prolactin Proteins 0.000 description 6
- 102000003946 Prolactin Human genes 0.000 description 6
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000009471 action Effects 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 229940021459 betaseron Drugs 0.000 description 6
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 230000008472 epithelial growth Effects 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 6
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 6
- 229940097325 prolactin Drugs 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 description 5
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 description 5
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 5
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- 102000036693 Thrombopoietin Human genes 0.000 description 5
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 description 5
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 5
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 5
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 5
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 5
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 5
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 5
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M potassium iodide Substances [K+].[I-] NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 5
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 4
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 4
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 4
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 4
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 4
- 238000002832 anti-viral assay Methods 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 4
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 4
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 4
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 4
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 4
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 4
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 4
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 4
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000012552 review Methods 0.000 description 4
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 4
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 4
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 3
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 3
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 3
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000385 Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 3
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 3
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 3
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 3
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 3
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 3
- HBJZFCIVFIBNSV-DCAQKATOSA-N Leu-Arg-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O HBJZFCIVFIBNSV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 102000015731 Peptide Hormones Human genes 0.000 description 3
- 108010038988 Peptide Hormones Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 3
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- WDIHJSXYQDMJHN-UHFFFAOYSA-L barium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ba+2] WDIHJSXYQDMJHN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229910001626 barium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 3
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 3
- ZTQSAGDEMFDKMZ-UHFFFAOYSA-N butyric aldehyde Natural products CCCC=O ZTQSAGDEMFDKMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002301 combined effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 3
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 3
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 3
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 3
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 3
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 3
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 3
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 3
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 3
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 3
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 3
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 3
- OWIUPIRUAQMTTK-UHFFFAOYSA-M n-aminocarbamate Chemical compound NNC([O-])=O OWIUPIRUAQMTTK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 3
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 3
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 3
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 3
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-M periodate Chemical compound [O-]I(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 3
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 3
- 229920000233 poly(alkylene oxides) Polymers 0.000 description 3
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000007909 solid dosage form Substances 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 3
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 3
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N (+/-)-1,3-Butanediol Chemical compound CC(O)CCO PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GVNHLQLTPKCTOI-UHFFFAOYSA-N (2,3,4-trifluorophenyl) hydrogen carbonate Chemical compound OC(=O)OC1=CC=C(F)C(F)=C1F GVNHLQLTPKCTOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 1-monostearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YGCGPEUVGHDMLO-UHFFFAOYSA-N 9h-fluoren-9-ylmethyl n-aminocarbamate Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)NN)C3=CC=CC=C3C2=C1 YGCGPEUVGHDMLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000055025 Adenosine deaminases Human genes 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- MEFILNJXAVSUTO-JXUBOQSCSA-N Ala-Leu-Thr Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O MEFILNJXAVSUTO-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 2
- OTZMRMHZCMZOJZ-SRVKXCTJSA-N Arg-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O OTZMRMHZCMZOJZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- ULBHWNVWSCJLCO-NHCYSSNCSA-N Arg-Val-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ULBHWNVWSCJLCO-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 2
- MFFOYNGMOYFPBD-DCAQKATOSA-N Asn-Arg-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MFFOYNGMOYFPBD-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- OMSMPWHEGLNQOD-UWVGGRQHSA-N Asn-Phe Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 OMSMPWHEGLNQOD-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- LSJQOMAZIKQMTJ-SRVKXCTJSA-N Asn-Phe-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O LSJQOMAZIKQMTJ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 2
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 2
- 108010005939 Ciliary Neurotrophic Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100031614 Ciliary neurotrophic factor Human genes 0.000 description 2
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 102100023688 Eotaxin Human genes 0.000 description 2
- JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N Ethyl urethane Chemical compound CCOC(N)=O JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100028071 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 241000206672 Gelidium Species 0.000 description 2
- JPVGHHQGKPQYIL-KBPBESRZSA-N Gly-Phe-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=CC=C1 JPVGHHQGKPQYIL-KBPBESRZSA-N 0.000 description 2
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- QNILDNVBIARMRK-XVYDVKMFSA-N His-Cys-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N QNILDNVBIARMRK-XVYDVKMFSA-N 0.000 description 2
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 2
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 2
- CZCSUZMIRKFFFA-CIUDSAMLSA-N Leu-Ala-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O CZCSUZMIRKFFFA-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- OIARJGNVARWKFP-YUMQZZPRSA-N Leu-Asn-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O OIARJGNVARWKFP-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- CSFVADKICPDRRF-KKUMJFAQSA-N Leu-His-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C([O-])=O)CC1=CN=CN1 CSFVADKICPDRRF-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- HMDDEJADNKQTBR-BZSNNMDCSA-N Leu-His-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O HMDDEJADNKQTBR-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- ZRHDPZAAWLXXIR-SRVKXCTJSA-N Leu-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZRHDPZAAWLXXIR-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 102000004058 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 2
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 2
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GGAPIOORBXHMNY-ULQDDVLXSA-N Lys-Arg-Tyr Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)O GGAPIOORBXHMNY-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- AIRZWUMAHCDDHR-KKUMJFAQSA-N Lys-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O AIRZWUMAHCDDHR-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- 241000872931 Myoporum sandwicense Species 0.000 description 2
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WUGMRIBZSVSJNP-UHFFFAOYSA-N N-L-alanyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)C)C(O)=O)=CNC2=C1 WUGMRIBZSVSJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010047562 NGR peptide Proteins 0.000 description 2
- BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N Nalpha-L-Leucyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 101100068676 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) gln-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000004140 Oncostatin M Human genes 0.000 description 2
- 108090000630 Oncostatin M Proteins 0.000 description 2
- 108091006006 PEGylated Proteins Proteins 0.000 description 2
- FRMKIPSIZSFTTE-HJOGWXRNSA-N Phe-Tyr-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O FRMKIPSIZSFTTE-HJOGWXRNSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100036154 Platelet basic protein Human genes 0.000 description 2
- FRKBNXCFJBPJOL-GUBZILKMSA-N Pro-Glu-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O FRKBNXCFJBPJOL-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- 230000010799 Receptor Interactions Effects 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 2
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 2
- YSXYEJWDHBCTDJ-DVJZZOLTSA-N Thr-Gly-Trp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)N)O YSXYEJWDHBCTDJ-DVJZZOLTSA-N 0.000 description 2
- YLRLHDFMMWDYTK-KKUMJFAQSA-N Tyr-Cys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 YLRLHDFMMWDYTK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- PDSLRCZINIDLMU-QWRGUYRKSA-N Tyr-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 PDSLRCZINIDLMU-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- PMDWYLVWHRTJIW-STQMWFEESA-N Tyr-Gly-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 PMDWYLVWHRTJIW-STQMWFEESA-N 0.000 description 2
- LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N Uric Acid Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CVIXTAITYJQMPE-LAEOZQHASA-N Val-Glu-Asn Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O CVIXTAITYJQMPE-LAEOZQHASA-N 0.000 description 2
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 2
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 2
- 229940003504 avonex Drugs 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000440 bentonite Substances 0.000 description 2
- 229910000278 bentonite Inorganic materials 0.000 description 2
- SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N bentoquatam Chemical compound O.O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SESFRYSPDFLNCH-UHFFFAOYSA-N benzyl benzoate Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(=O)OCC1=CC=CC=C1 SESFRYSPDFLNCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UORVGPXVDQYIDP-UHFFFAOYSA-N borane Chemical compound B UORVGPXVDQYIDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000337 buffer salt Substances 0.000 description 2
- JOOPRXVUNTUGSV-UHFFFAOYSA-L calcium;diperiodate Chemical compound [Ca+2].[O-]I(=O)(=O)=O.[O-]I(=O)(=O)=O JOOPRXVUNTUGSV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940047120 colony stimulating factors Drugs 0.000 description 2
- 108010035886 connective tissue-activating peptide Proteins 0.000 description 2
- MGNCLNQXLYJVJD-UHFFFAOYSA-N cyanuric chloride Chemical compound ClC1=NC(Cl)=NC(Cl)=N1 MGNCLNQXLYJVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 230000003292 diminished effect Effects 0.000 description 2
- 150000002009 diols Chemical class 0.000 description 2
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 2
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 2
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 230000001983 lactogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 2
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 2
- 108010051673 leucyl-glycyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 239000008297 liquid dosage form Substances 0.000 description 2
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 2
- 108010044348 lysyl-glutamyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 2
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 229940002988 pegasys Drugs 0.000 description 2
- 108010092853 peginterferon alfa-2a Proteins 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N phenyl(114C)methanol Chemical compound O[14CH2]C1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 108700001787 polyethylene glycol-modified interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- FJVZDOGVDJCCCR-UHFFFAOYSA-M potassium periodate Chemical compound [K+].[O-]I(=O)(=O)=O FJVZDOGVDJCCCR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 2
- 229960004063 propylene glycol Drugs 0.000 description 2
- 239000011546 protein dye Substances 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 229920013730 reactive polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 229940038850 rebif Drugs 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000003567 signal transduction assay Methods 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 108010003137 tyrosyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- 230000002227 vasoactive effect Effects 0.000 description 2
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 210000004127 vitreous body Anatomy 0.000 description 2
- 229920003170 water-soluble synthetic polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 2
- JWZZKOKVBUJMES-UHFFFAOYSA-N (+-)-Isoprenaline Chemical compound CC(C)NCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 JWZZKOKVBUJMES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FKWFIIMKPRTXIY-UHFFFAOYSA-N (2,3,4-tribromophenyl) hydrogen carbonate Chemical compound OC(=O)OC1=CC=C(Br)C(Br)=C1Br FKWFIIMKPRTXIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZJIFDEVVTPEXDL-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) hydrogen carbonate Chemical compound OC(=O)ON1C(=O)CCC1=O ZJIFDEVVTPEXDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N (2r,3r,4s)-2-[(1r)-1,2-dihydroxyethyl]oxolane-3,4-diol Chemical class OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- LOVPHSMOAVXQIH-UHFFFAOYSA-N (4-nitrophenyl) hydrogen carbonate Chemical class OC(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 LOVPHSMOAVXQIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000006701 (C1-C7) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940058015 1,3-butylene glycol Drugs 0.000 description 1
- WGJCBBASTRWVJL-UHFFFAOYSA-N 1,3-thiazolidine-2-thione Chemical compound SC1=NCCS1 WGJCBBASTRWVJL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trimethyl-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]benzenesulfonamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XNWFRZJHXBZDAG-UHFFFAOYSA-N 2-METHOXYETHANOL Chemical compound COCCO XNWFRZJHXBZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QXZGLTYKKZKGLN-UHFFFAOYSA-N 4-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O QXZGLTYKKZKGLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N Acetaldehyde Chemical class CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 239000005995 Aluminium silicate Substances 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 1
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 description 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 description 1
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 description 1
- PHHRSPBBQUFULD-UWVGGRQHSA-N Arg-Gly-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N PHHRSPBBQUFULD-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- FFMIYIMKQIMDPK-BQBZGAKWSA-N Asn-His Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 FFMIYIMKQIMDPK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- XLZCLJRGGMBKLR-PCBIJLKTSA-N Asn-Ile-Phe Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XLZCLJRGGMBKLR-PCBIJLKTSA-N 0.000 description 1
- GLWFAWNYGWBMOC-SRVKXCTJSA-N Asn-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O GLWFAWNYGWBMOC-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- USNJAPJZSGTTPX-XVSYOHENSA-N Asp-Phe-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O USNJAPJZSGTTPX-XVSYOHENSA-N 0.000 description 1
- 241000416162 Astragalus gummifer Species 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 208000019838 Blood disease Diseases 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100021943 C-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710155857 C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100036850 C-C motif chemokine 23 Human genes 0.000 description 1
- 102100036849 C-C motif chemokine 24 Human genes 0.000 description 1
- 102100021935 C-C motif chemokine 26 Human genes 0.000 description 1
- 102100032367 C-C motif chemokine 5 Human genes 0.000 description 1
- 102100032366 C-C motif chemokine 7 Human genes 0.000 description 1
- 101710155834 C-C motif chemokine 7 Proteins 0.000 description 1
- 102100034871 C-C motif chemokine 8 Human genes 0.000 description 1
- 101710155833 C-C motif chemokine 8 Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 1
- 108010082548 Chemokine CCL11 Proteins 0.000 description 1
- 108010083647 Chemokine CCL24 Proteins 0.000 description 1
- 108010083698 Chemokine CCL26 Proteins 0.000 description 1
- 108010055166 Chemokine CCL5 Proteins 0.000 description 1
- 241001227713 Chiron Species 0.000 description 1
- 206010008723 Chondrodystrophy Diseases 0.000 description 1
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 1
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 1
- 208000006154 Chronic hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 101710101803 DNA-binding protein J Proteins 0.000 description 1
- 206010012335 Dependence Diseases 0.000 description 1
- 235000019739 Dicalciumphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- YTPLMLYBLZKORZ-UHFFFAOYSA-N Divinylene sulfide Natural products C=1C=CSC=1 YTPLMLYBLZKORZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100044298 Drosophila melanogaster fand gene Proteins 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710139422 Eotaxin Proteins 0.000 description 1
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 1
- 101150064015 FAS gene Proteins 0.000 description 1
- 101150021185 FGF gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000381 Fibroblast growth factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100028072 Fibroblast growth factor 4 Human genes 0.000 description 1
- 102000003972 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 description 1
- 102100020715 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Human genes 0.000 description 1
- 101710162577 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Proteins 0.000 description 1
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 1
- 208000015872 Gaucher disease Diseases 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- RDPOETHPAQEGDP-ACZMJKKPSA-N Glu-Asp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O RDPOETHPAQEGDP-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- PAQUJCSYVIBPLC-AVGNSLFASA-N Glu-Asp-Phe Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 PAQUJCSYVIBPLC-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- LGYZYFFDELZWRS-DCAQKATOSA-N Glu-Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O LGYZYFFDELZWRS-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- BCYGDJXHAGZNPQ-DCAQKATOSA-N Glu-Lys-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BCYGDJXHAGZNPQ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- ILWHFUZZCFYSKT-AVGNSLFASA-N Glu-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ILWHFUZZCFYSKT-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- JSIQVRIXMINMTA-ZDLURKLDSA-N Glu-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JSIQVRIXMINMTA-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MHXKHKWHPNETGG-QWRGUYRKSA-N Gly-Lys-Leu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MHXKHKWHPNETGG-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- RIYIFUFFFBIOEU-KBPBESRZSA-N Gly-Tyr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=C(O)C=C1 RIYIFUFFFBIOEU-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010053185 Glycogen storage disease type II Diseases 0.000 description 1
- 201000005569 Gout Diseases 0.000 description 1
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102100034221 Growth-regulated alpha protein Human genes 0.000 description 1
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 1
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- RNMNYMDTESKEAJ-KKUMJFAQSA-N His-Leu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 RNMNYMDTESKEAJ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- 101000713081 Homo sapiens C-C motif chemokine 23 Proteins 0.000 description 1
- 101001069921 Homo sapiens Growth-regulated alpha protein Proteins 0.000 description 1
- 101001054334 Homo sapiens Interferon beta Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 102000015611 Hypothalamic Hormones Human genes 0.000 description 1
- 108010024118 Hypothalamic Hormones Proteins 0.000 description 1
- 101150088952 IGF1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000019468 Iatrogenic Disease Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 206010021450 Immunodeficiency congenital Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 1
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 1
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100026018 Interleukin-1 receptor antagonist protein Human genes 0.000 description 1
- 101710144554 Interleukin-1 receptor antagonist protein Proteins 0.000 description 1
- 108090000177 Interleukin-11 Proteins 0.000 description 1
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 description 1
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 1
- 108050003558 Interleukin-17 Proteins 0.000 description 1
- 102000013691 Interleukin-17 Human genes 0.000 description 1
- 102000004125 Interleukin-1alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010082786 Interleukin-1alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 102100020880 Kit ligand Human genes 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- HQUXQAMSWFIRET-AVGNSLFASA-N Leu-Glu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN HQUXQAMSWFIRET-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- OVZLLFONXILPDZ-VOAKCMCISA-N Leu-Lys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O OVZLLFONXILPDZ-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- 240000007472 Leucaena leucocephala Species 0.000 description 1
- 235000010643 Leucaena leucocephala Nutrition 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010071324 Livagen Proteins 0.000 description 1
- 102000004083 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 1
- FLCMXEFCTLXBTL-DCAQKATOSA-N Lys-Asp-Arg Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N FLCMXEFCTLXBTL-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- ODUQLUADRKMHOZ-JYJNAYRXSA-N Lys-Glu-Tyr Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)O ODUQLUADRKMHOZ-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- 240000003183 Manihot esculenta Species 0.000 description 1
- 235000016735 Manihot esculenta subsp esculenta Nutrition 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- WEDDFMCSUNNZJR-WDSKDSINSA-N Met-Ser Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WEDDFMCSUNNZJR-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- 108010064136 Monocyte Chemoattractant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000014962 Monocyte Chemoattractant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 101800000135 N-terminal protein Proteins 0.000 description 1
- 101100498071 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cys-17 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 240000007817 Olea europaea Species 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102000016979 Other receptors Human genes 0.000 description 1
- 101800001452 P1 proteinase Proteins 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 101100335198 Pneumocystis carinii fol1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002732 Polyanhydride Polymers 0.000 description 1
- 229920001710 Polyorthoester Polymers 0.000 description 1
- GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N Propylene oxide Chemical compound CC1CO1 GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000219061 Rheum Species 0.000 description 1
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 1
- MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N S-adenosyl-L-methioninate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](C[S+](CC[C@H](N)C([O-])=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 1
- 244000000231 Sesamum indicum Species 0.000 description 1
- 235000003434 Sesamum indicum Nutrition 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- SSZBUIDZHHWXNJ-UHFFFAOYSA-N Stearinsaeure-hexadecylester Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCCCCCCCCCCCCCCCC SSZBUIDZHHWXNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010039445 Stem Cell Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100021669 Stromal cell-derived factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710088580 Stromal cell-derived factor 1 Proteins 0.000 description 1
- JQAWYCUUFIMTHE-WLTAIBSBSA-N Thr-Gly-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O JQAWYCUUFIMTHE-WLTAIBSBSA-N 0.000 description 1
- BKVICMPZWRNWOC-RHYQMDGZSA-N Thr-Val-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O BKVICMPZWRNWOC-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- 102000011923 Thyrotropin Human genes 0.000 description 1
- 108010061174 Thyrotropin Proteins 0.000 description 1
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 1
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 108060008539 Transglutaminase Proteins 0.000 description 1
- BMQYVXCPAOLZOK-UHFFFAOYSA-N Trihydroxypropylpterisin Natural products OCC(O)C(O)C1=CN=C2NC(N)=NC(=O)C2=N1 BMQYVXCPAOLZOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYHSJESDFKREAR-KKUMJFAQSA-N Tyr-Asn-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 AYHSJESDFKREAR-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- 108010092464 Urate Oxidase Proteins 0.000 description 1
- TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N Uric acid Natural products N1C(=O)NC(=O)C2NC(=O)NC21 TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LYERIXUFCYVFFX-GVXVVHGQSA-N Val-Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N LYERIXUFCYVFFX-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- JPBGMZDTPVGGMQ-ULQDDVLXSA-N Val-Tyr-His Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N JPBGMZDTPVGGMQ-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010004977 Vasopressins Proteins 0.000 description 1
- 102000002852 Vasopressins Human genes 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 239000001089 [(2R)-oxolan-2-yl]methanol Substances 0.000 description 1
- JXBAVRIYDKLCOE-UHFFFAOYSA-N [C].[P] Chemical compound [C].[P] JXBAVRIYDKLCOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 239000003655 absorption accelerator Substances 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000001919 adrenal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000048 adrenergic agonist Substances 0.000 description 1
- 229940126157 adrenergic receptor agonist Drugs 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000008484 agonism Effects 0.000 description 1
- HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N aldrithiol Chemical compound C=1C=CC=NC=1SSC1=CC=CC=N1 HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 150000003973 alkyl amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 108091005588 alkylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 239000002160 alpha blocker Substances 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012211 aluminium silicate Nutrition 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 230000001195 anabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036783 anaphylactic response Effects 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 210000002159 anterior chamber Anatomy 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000118 anti-neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 210000000436 anus Anatomy 0.000 description 1
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 1
- 210000001742 aqueous humor Anatomy 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- SSTZWBSEDRHYPU-UHFFFAOYSA-L barium(2+);diperiodate Chemical compound [Ba+2].[O-]I(=O)(=O)=O.[O-]I(=O)(=O)=O SSTZWBSEDRHYPU-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 229960002903 benzyl benzoate Drugs 0.000 description 1
- 102000012740 beta Adrenergic Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010079452 beta Adrenergic Receptors Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 239000012867 bioactive agent Substances 0.000 description 1
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 229910000085 borane Inorganic materials 0.000 description 1
- PWYPGEFOZYBWDP-UHFFFAOYSA-N boric acid;pyridine Chemical compound OB(O)O.C1=CC=NC=C1 PWYPGEFOZYBWDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 235000019437 butane-1,3-diol Nutrition 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- CJZGTCYPCWQAJB-UHFFFAOYSA-L calcium stearate Chemical compound [Ca+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O CJZGTCYPCWQAJB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000013539 calcium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000008116 calcium stearate Substances 0.000 description 1
- MPBRYMWMMKKRGC-UHFFFAOYSA-M carbocyanin DBTC Chemical compound [Br-].C1=CC=CC2=C([N+](=C(C=C(C)C=C3N(C4=C5C=CC=CC5=CC=C4S3)CC)S3)CC)C3=CC=C21 MPBRYMWMMKKRGC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000298 carbocyanine Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000001925 catabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 1
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 229960000541 cetyl alcohol Drugs 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000005591 charge neutralization Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- 229940015047 chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 1
- 210000003161 choroid Anatomy 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004240 ciliary body Anatomy 0.000 description 1
- 239000004927 clay Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 1
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 210000000795 conjunctiva Anatomy 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 1
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000012926 crystallographic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002447 crystallographic data Methods 0.000 description 1
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 239000000409 cytokine receptor agonist Substances 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- NEFBYIFKOOEVPA-UHFFFAOYSA-K dicalcium phosphate Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O NEFBYIFKOOEVPA-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038472 dicalcium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 229910000390 dicalcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K dihydroxy(stearato)aluminium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[Al](O)O UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 208000037765 diseases and disorders Diseases 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 1
- AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N divinyl sulfone Chemical class C=CS(=O)(=O)C=C AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 1
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N ethenylcyclopentane Chemical compound C=CC1CCCC1 BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940093499 ethyl acetate Drugs 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 229920005570 flexible polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000007903 gelatin capsule Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010448 genetic screening Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 230000024924 glomerular filtration Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000001727 glucose Nutrition 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 108010080575 glutamyl-aspartyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- YQEMORVAKMFKLG-UHFFFAOYSA-N glycerine monostearate Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC(CO)CO YQEMORVAKMFKLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SVUQHVRAGMNPLW-UHFFFAOYSA-N glycerol monostearate Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO SVUQHVRAGMNPLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000004502 glycogen storage disease II Diseases 0.000 description 1
- 230000009422 growth inhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 125000002795 guanidino group Chemical group C(N)(=N)N* 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000018706 hematopoietic system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 208000010710 hepatitis C virus infection Diseases 0.000 description 1
- BXWNKGSJHAJOGX-UHFFFAOYSA-N hexadecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCO BXWNKGSJHAJOGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 102000055277 human IL2 Human genes 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 229940042795 hydrazides for tuberculosis treatment Drugs 0.000 description 1
- 150000002429 hydrazines Chemical class 0.000 description 1
- 150000007857 hydrazones Chemical class 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000002303 hypothalamus releasing factor Substances 0.000 description 1
- 239000012216 imaging agent Substances 0.000 description 1
- LFKYBJLFJOOKAE-UHFFFAOYSA-N imidazol-2-ylidenemethanone Chemical compound O=C=C1N=CC=N1 LFKYBJLFJOOKAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002466 imines Chemical class 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000003701 inert diluent Substances 0.000 description 1
- 239000012442 inert solvent Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 210000000554 iris Anatomy 0.000 description 1
- 229940039009 isoproterenol Drugs 0.000 description 1
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical compound O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 239000004973 liquid crystal related substance Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- AEUKDPKXTPNBNY-XEYRWQBLSA-N mcp 2 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 AEUKDPKXTPNBNY-XEYRWQBLSA-N 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006241 metabolic reaction Methods 0.000 description 1
- YQCIWBXEVYWRCW-UHFFFAOYSA-N methane;sulfane Chemical compound C.S YQCIWBXEVYWRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 150000002763 monocarboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- CQDGTJPVBWZJAZ-UHFFFAOYSA-N monoethyl carbonate Chemical compound CCOC(O)=O CQDGTJPVBWZJAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 201000006938 muscular dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- GPXLMGHLHQJAGZ-JTDSTZFVSA-N nafcillin Chemical compound C1=CC=CC2=C(C(=O)N[C@@H]3C(N4[C@H](C(C)(C)S[C@@H]43)C(O)=O)=O)C(OCC)=CC=C21 GPXLMGHLHQJAGZ-JTDSTZFVSA-N 0.000 description 1
- 229960000515 nafcillin Drugs 0.000 description 1
- 239000007922 nasal spray Substances 0.000 description 1
- 229940097496 nasal spray Drugs 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- BMQYVXCPAOLZOK-XINAWCOVSA-N neopterin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)C1=CN=C2NC(N)=NC(=O)C2=N1 BMQYVXCPAOLZOK-XINAWCOVSA-N 0.000 description 1
- 230000002182 neurohumoral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003227 neuromodulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 208000004235 neutropenia Diseases 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000344 non-irritating Toxicity 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012457 nonaqueous media Substances 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 239000000668 oral spray Substances 0.000 description 1
- 229940041678 oral spray Drugs 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000002357 osmotic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 238000002559 palpation Methods 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 1
- 108010092851 peginterferon alfa-2b Proteins 0.000 description 1
- 229940106366 pegintron Drugs 0.000 description 1
- 239000002304 perfume Substances 0.000 description 1
- 229960003742 phenol Drugs 0.000 description 1
- OJUGVDODNPJEEC-UHFFFAOYSA-N phenylglyoxal Chemical compound O=CC(=O)C1=CC=CC=C1 OJUGVDODNPJEEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000008105 phosphatidylcholines Chemical class 0.000 description 1
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 230000008884 pinocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 1
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 208000028529 primary immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 230000007425 progressive decline Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 229940076372 protein antagonist Drugs 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 150000003856 quaternary ammonium compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000001525 receptor binding assay Methods 0.000 description 1
- 229960000160 recombinant therapeutic protein Drugs 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000009711 regulatory function Effects 0.000 description 1
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 239000010979 ruby Substances 0.000 description 1
- 229910001750 ruby Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 210000003786 sclera Anatomy 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 150000004760 silicates Chemical class 0.000 description 1
- RMAQACBXLXPBSY-UHFFFAOYSA-N silicic acid Chemical compound O[Si](O)(O)O RMAQACBXLXPBSY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000008247 solid mixture Substances 0.000 description 1
- 239000004334 sorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229940075582 sorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010199 sorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- VIDRYROWYFWGSY-UHFFFAOYSA-N sotalol hydrochloride Chemical compound Cl.CC(C)NCC(O)C1=CC=C(NS(C)(=O)=O)C=C1 VIDRYROWYFWGSY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000003206 sterilizing agent Substances 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003462 sulfoxides Chemical class 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 238000011191 terminal modification Methods 0.000 description 1
- BSYVTEYKTMYBMK-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofurfuryl alcohol Chemical compound OCC1CCCO1 BSYVTEYKTMYBMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 1
- 150000007970 thio esters Chemical class 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 1
- NLVFBUXFDBBNBW-PBSUHMDJSA-N tobramycin Chemical compound N[C@@H]1C[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N NLVFBUXFDBBNBW-PBSUHMDJSA-N 0.000 description 1
- 229960000707 tobramycin Drugs 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 235000010487 tragacanth Nutrition 0.000 description 1
- 239000000196 tragacanth Substances 0.000 description 1
- 229940116362 tragacanth Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 102000003601 transglutaminase Human genes 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910000406 trisodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019801 trisodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 229940005267 urate oxidase Drugs 0.000 description 1
- 229940116269 uric acid Drugs 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/21—Interferons [IFN]
- A61K38/215—IFN-beta
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/21—Interferons [IFN]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/565—IFN-beta
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/52—Assays involving cytokines
- G01N2333/555—Interferons [IFN]
- G01N2333/565—IFN-beta
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób zwiększania antyproliferacyjnego potencjału nieglikozylowanego interferonu-beta-1b in vitro, a także wytworzony tym sposobem koniugat i jego zastosowanie, oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca ten koniugat i zastosowanie tej kompozycji.
Wynalazek dotyczy dziedzin biochemii białka i nauk farmaceutycznych i medycznych. W szczególności, wynalazek dostarcza sposoby produkcji koniugatów między rozpuszczalnymi w wodzie polimerami (np. glikol polietylenowy i jego pochodne) i cytokinami (np. interferon-beta), które to koniugaty mają zwiększoną moc w porównaniu z koniugatami polimerowymi tej samej cytokiny syntetyzowanymi metodami standardowymi. Wynalazek dostarcza także koniugaty produkowane za pomocą tych sposobów, zestawy zawierające takie koniugaty i kompozycje i sposoby stosowania koniugatów i kompozycji w zapobieganiu, diagnozowaniu i leczeniu szeregu stanów medycznych i weterynaryjnych. Wynalazek także dostarcza sposoby oznaczania miejsca (miejsc) przyczepu polimerów za pomocą alkilacji redukcyjnej w pewnych warunkach.
Poniższy opis pokrewnego stanu wiedzy obejmuje interpretacje obecnych wynalazców, które nie są jako takie stanem techniki. Cytokiny są wydzielanymi regulacyjnymi białkami, które kontrolują przeżycie, wzrost, różnicowanie i/lub funkcje efektorowe komórek w sposób endokrynny, parakrynny lub autokrynny (przegląd w Nicola, N.A. (1994) w: Guidebook to Cytokines and Their Receptors, Nicola, N.A., red., str. 1-7, Oxford University Press, New York). Ze względu na ich specyficzność, mały rozmiar i względną łatwość produkcji w zrekombinowanych organizmach cytokiny mają wiele potencjalnych zastosowań jako czynniki terapeutyczne.
Dwa kluczowe czynniki hamowały rozwój cytokin, w szczególności, i białek zrekombinowanych w ogólności, jako czynników terapeutycznych - ich ogólnie krótkie okresy połowicznego rozpadu i ich potencjalna antygenowość i immunogenność. Jak jest to tu stosowane i na ogół stosowane w dziedzinie, określenie „antygenowość” dotyczy zdolności cząsteczki do wiązania już istniejących przeciwciał podczas gdy określenie „immunogenność” dotyczy zdolności cząsteczki do wywoływania odpowiedzi odpornościowej in vivo, niezależnie od tego czy odpowiedź ta obejmuje produkcję przeciwciał („odpowiedź humoralna”) czy stymulację odpowiedzi odpornościowych komórki.
Dla podawania zrekombinowanych białek terapeutycznych często pożądane jest podawanie dożylne (i.v.) aby uzyskać najwyższe aktywności w układzie krążenia i zminimalizować (strona poprawiona) problemy biodostępności i degradacji. Jednak okresy połowicznego rozpadu małych białek po podaniu i.v. (dożylnie) są zazwyczaj niesłychanie krótkie (patrz przykłady w Mordenti, J. i wsp., (1991) Pharm Res 8:1351-1359; Kuwabara T. i wsp. (1995) Pharm Res 12:1466-1469). Białka z promieniami hydrodynamicznymi przekraczającymi ten dla albuminy surowicy, która ma promień Stokesa około 36 A i masę cząsteczkową około 66000 daltonów (66 kDa) są na ogół zatrzymywane w krwiobiegu przez zdrowe nerki. Jednak mniejsze białka, obejmujące cytokiny takie jak czynnik stymulujący kolonie granulocytów („G-CSF”), interleukinę-2 („IL-2”), interferon-alfa („IFN-alfa”), i interferon gamma („IFN-gamma”) są szybko usuwane z krwiobiegu przez sączenie kłębuszkowe (Brenner, B.M. i wsp., (1978) Am J Physiol 234:F455-F460; Venkatachalam, M.A. i wsp., (1978) Circ Res 43:337-347; Wilson, G., (1979) J Gen Physiol 74:495-509; Knauff, M.J. i wsp., (1988) J Biol Chem 263:15064-15070; Kita, Y. i wsp., (1990) Drug Des Deliv 6:157-167; Rostaing, L. i wsp., (1998), J Am Soc Nephrol 9:234 4-2348). W efekcie utrzymanie terapeutycznie pożytecznych stężeń małych zrekombinowanych białek krwiobiegu po wstrzyknięciu jest problematyczne. Tak więc typowo muszą być podawane wyższe stężenia tych białek i częstsze zastrzyki. Wynikające z tego sposoby podawania dawki zwiększają koszt terapii, zmniejszają szanse na stosowanie się pacjenta do zaleceń lekarza i zwiększają ryzyko niekorzystnych zdarzeń np. reakcji odpornościowych. Odpowiedzi odpornościowe zarówno komórkowe i humoralne mogą obniżyć stężenie w krwiobiegu wstrzykniętych zrekombinowanych białek w stopniu, który może wykluczyć podanie skutecznej dawki lub może prowadzić do zdarzeń ograniczających terapię obejmujących przyspieszony klirans, neutralizację skuteczności i anafilaksję (Ragnhammar, P. i wsp., (1994) Blood 84:4078-4087; Wadowa, M. i wsp., (1999) Clin Cancer Res 5:1353-1361; Hjelm Skog, A.-L. i wsp., (2001) Clin Cancer Res 7:1163-1170; Li, J. i wsp., (2001) Blood 98:3241-3248; Basser, R.L. i wsp., (2002) Blood 99:2599-2602; Schellekens, H. (2002) Clin Ther 24:1720-1740).
Modyfikacja zrekombinowanych białek przez kowalencyjne przyłączenie glikolu polietylenowego („PEG”) była wyczerpująco badana jako sposób adresowania niedogodności dyskutowanych powyżej (przegląd w Herman, M.R. i wsp., (1997) w: Poly(ethylene glycol): Chemistry and Biological Applications, Harris, J.M. i wsp., red. (2002) str. 155-169, American Chemical Society, Washington, D.C.;
PL 219 741 B1
Roberts, M.J. i wsp., (2002) Adv Drug Deliv Rev 54:459-476). Wykazano, że przyłączenie PEG do białek stabilizuje białka, poprawia ich biodostępność i/lub zmniejsza ich immunogenność. (Kowalencyjne przyłączenie PEG do białka lub innego substratu jest tu określane, jak jest znane w dziedzinie, jako „PEGylacja”). Dodatkowo, PEGylacja może znacząco zwiększyć promień hydrodynamiczny białek. Gdy małe białko takie jak cytokina jest połączona z pojedynczym długim łańcuchem PEG (np. mającym masę cząsteczkową przynajmniej około 18 kDa), powstały koniugat ma promień hydrodynamiczny przekraczający ten dla albuminy surowiczej i jego klirans z krwiobiegu przez kłębuszki nerkowe jest ogromnie opóźniony. Łączne efekty PEGylacji - obniżona proteoliza, obniżone rozpoznawanie przez układ odpornościowy i obniżona szybkość kliransu przez nerki - nadają znaczące korzyści białkom PEGylowanym jako czynnikom terapeutycznym.
Od lat 1970-tych czyniono próby zastosowania kowalencyjnego przyłączania polimerów aby poprawić bezpieczeństwo i skuteczność różnych białek do zastosowań farmaceutycznych (patrz np. Davis, F.F. i wsp., Patent US Nr 4,179,337). Niektóre przykłady obejmują sprzęganie PEG (lub tlenku polietylenu) („PEO”) z deaminazą adenozyny (EC 3.5.4.4.) do stosowania w terapii zespołu złożonego wrodzonego niedoboru odporności (Davis, S. i wsp., (1981) Clin Exp Immunol 46:649-652; Hershfield, M.S. i wsp., Patenty US Nr 5,006,333 i 5,080,891) i do oksydazy moczanu (EC 1.7.3.3) dla eliminacji nadmiarowego kwasu moczowego z krwi i moczu (Kelly, S.J. i wsp., (2001) J Am Soc Nephrol 12:1001-1009; Williams, L.D. i wsp., Publikacja PCT Nr WO 00/07629 A2 i A3 i Patent US Nr 6,576,235; Herman, M.R. i wsp., Publikacja PCT Nr WO 01/59078 A2).
PEO i PEG są polimerami złożonymi z kowalencyjnie połączonych jednostek tlenku etylenu. Te polimery mają następującą budowę ogólną:
R1-(OCH2CH2)n-R2 gdzie R2 może być grupą hydroksylową (lub jej reaktywną pochodną) a R1 może być wodorem, jak w dihydroksyPEG („diol PEG”), grupą metylową, jak w monometyksyPEG („mPEG”) lub inną grupą niższego alkilu np. jak w izopropoksyPEG lub t-butoksyPEG. Parametr n w ogólnej budowie PEG wskazuje liczbę jednostek tlenku etylenu w polimerze i jest określany tu i w dziedzinie jako „stopień polimeryzacji”. Polimery o tej samej ogólnej budowie, w których R1 jest grupą C1-7 alkilową były także określane jako pochodne tlenku etylenu (Yasukohchi, T. i wsp., Patent US Nr 6,455, 639. PEG i PEO mogą być liniowe, rozgałęzione (Fuke, I. i wsp., (1994) J Control Release 30:27-34) lub o kształcie gwiazdy (Merrill, E.W., (1993) J Biomater Sci Polym Ed 5:1-11). PEG i PEO są amfipatyczne, tzn. są rozpuszczalne w wodzie i pewnych rozpuszczalnikach organicznych i mogą przylegać do materiałów zawierających lipidy, w tym do wirusów w otoczkach i do błon komórek zwierząt i bakterii. Pewne losowe lub blokowe lub naprzemienne kopolimery tlenku etylenu:
CH2-CH-CH3 \ /
O mają właściwości, które są dostatecznie podobne do właściwości PEG, że kopolimery te są uważane za odpowiednie substytuty PEG w pewnych zastosowaniach (patrz np. Hiratani, H., Patent US Nr 4,609,546 i Saifer, M. i wsp., Patent US Nr 5,476,653). Jak jest to tu stosowane, określenie „tlenki polialkilenowe” i skrót „PAO” są stosowane by odnosić się do takich kopolimerów jak i do PEG lub PEO i do kopolimerów poli(oksyetylen-oksymetylen) (Pitt, C.G., i wsp., Patent US Nr 5,476,653). Jak jest to tu stosowane, określenie „glikole polialkilenowe” i skrót „PAG” są stosowane by odnieść się generycznie do polimerów odpowiednich do stosowania w koniugatach wynalazku, szczególnie PEG, bardziej szczególnie PEG zawierające pojedynczą grupę reaktywną („monofunkcyjnie aktywowane PEG”).
Kowalencyjne przyłączenie PEG lub innych tlenków polialkilenu do białka wymaga konwersji przynajmniej jednej grupy końcowej polimeru do reakcyjnej grupy funkcjonalnej. Ten proces jest często określany jako „aktywacja” i produkt nazywa się „aktywowany PEG” lub aktywowany tlenek polialkilenu. MonometoksyPEG, w których tlen na jednym końcu jest związany z nieaktywną, chemicznie stabilną grupą metylową (aby wyprodukować „grupę metoksylową”) i na drugim końcu grupą funkcjonalną, która jest reaktywna w stosunku do grup aminowych na cząsteczce białka, są najczęściej stosowane do takich podejść. Tak zwane „rozgałęzione” mPEG, które zawierają dwie lub więcej grupy metoksylowe za pojedynczą aktywowaną grupą funkcjonalną są stosowane rzadziej. Przykładem rozgałęzionego PEG jest di-mPEG-lizyna, w której PEG jest przyłączony do obu grup aminowych i grupa
PL 219 741 B1 karboksylowa lizyny jest najczęściej aktywowana przez estryfikację N-hydroksysukcynimidem (Martinez, A. i wsp., Patent US Nr 5,643,575; Greenwald, R.B. i wsp., Patent US Nr 5,919,455; Harris, J.M. i wsp., Patent US Nr 5,932,462).
Powszechnie aktywowane polimery są reagowane ze związkiem bioaktywnym mającym nukleofilowe grupy funkcjonalne, które służą jako miejsca przyczepu. Jedną nukleofilową grupą funkcjonalną, która jest często stosowana jako miejsce przyłączenia jest grupa epsilon aminowa reszt lizyny. Dostępne dla rozpuszczalnika grupy alfa-aminowe, grupy kwasu karboksylowego, grupy guanidynowe, grupy imidazolowe, odpowiednio aktywowane grupy karbonylowe, utlenione reszty węglowodanów i grupy tiolowe też były stosowane jako miejsca przyłączenia.
Grupa hydroksylowa PEG była aktywowana chlorkiem cyjanurowym przed jego przyłączeniem do białek. (Abuchowski, A. i wsp., (1977) J Biol Chem 252:3582-3586; Abuchowski, A. i wsp., (1981) Cancer Treat Rep 65:1077-1081). Zastosowanie tej metody ma jednak wady takie jak toksyczność chlorku cyjanurowego i jego niespecyficzną reaktywność w stosunku do białek mających grupy funkcjonalne inne niż aminy, takie jak dostępne dla rozpuszczalnika reszty cysteiny lub tyrozyny, które mogą być niezbędne dla funkcji. Aby obejść te i inne wady, wprowadzono alternatywne aktywowane PEG takie jak pochodne sukcynimidylo bursztynianowe PEG („SS-PEG”) (Abuchowski, A. i wsp., (1984) Cancer Biochem Biophys 7:175-186), pochodne węglanu sukcynimidylu PAG („S.C.-PAG”) (Saifer, M. i wsp., Patent US Nr 5,006,333) i aldehydowe pochodne PEG (Royer, G.P., Patent US Nr 4,002,531).
Powszechnie, kilka (np, 5 do 10) nici jednego lub więcej PAG, np. jeden lub więcej PEG z masą cząsteczkową około 5 kDa do około 10 kDa, są łączone z białkiem docelowym poprzez pierwszorzędowe grupy aminowe (grupa epsilon aminowa reszt lizyny i być może grupa alfa aminowa aminokwasu aminokońcowego („N-końcowego”)). Bardziej niedawno, syntetyzowano koniugaty zawierające pojedynczą nić mPEG o wyższej masie cząsteczkowej, np. 12 kDa, 20 kDa lub 30 kDa. Wykazano bezpośrednie korelacje między okresami połowicznego rozpadu w osoczu koniugatów i zwiększoną masą cząsteczkową i/lub zwiększoną ilością sprzęgniętych nici PEG (Knauff, M.J. i wsp., powyżej; Katre, N.V. (1990) J. Immunol. 144:209-213; Clark, R. i wsp., (1996) J Biol Chem 271:21969-21977; Bowen, S. i wsp., (1999) Exp Hematol 27:425-432; Leong, S.R. i wsp., (2001) Cytokine 16:106-119). Z drugiej strony, w miarę wzrastania liczby nici PEG sprzęgniętych do każdej cząsteczki białka, wzrasta także prawdopodobieństwo, że będzie modyfikowana grupa aminowa w niezbędnej części białka i zostanie upośledzona funkcja biologiczna białka, szczególnie jeśli jest białkiem wiążącym receptor. Dla większych białek, które zawierają wiele grup aminowych i dla enzymów z substratami o niskiej masie cząsteczkowej, kompromis między przedłużonym okresem działania i zmniejszoną aktywnością specyficzną może być do przyjęcia, ponieważ daje wzrost netto biologicznej aktywności koniugatów zawierających PEG in vivo. Jednak dla mniejszych białek, które działają poprzez interakcje z receptorami na powierzchni komórki, takich jak cytokiny, opisano, że wysoki poziom podstawienia obniża aktywność funkcjonalną do punktu znoszenia korzyści przedłużonego okresu połowicznego rozpadu w krwi (Clark, R, i wsp., powyżej).
Tak więc koniugacja polimerów jest dobrze ustaloną technologią dla przedłużania bioaktywności i zmniejszania immunoreaktywności terapeutycznych białek takich jak enzymy (patrz np. Tymczasowe Zgłoszenie US Nr 60/436,020, zgłoszone 26 grudnia, 2002 i Tymczasowe Zgłoszenia US Nr 60/479,913 i 60/479,914, oba zgłoszone 20 czerwca, 2003, których ujawnienia są tu włączone w całości w formie odniesienia). Klasą białek terapeutycznych, które by szczególnie skorzystały z takiej zmniejszonej immunoreaktywności są interferony-heta, szczególnie interferon-heta-lb („IFN-e-1b”, SEQ ID NO: 1) (The IFNB Multiple Sclerosis Study Group (1996) Neurology 47:889-894). Jednak koniugacja polimerów do białek regulacyjnych, które działają przez specyficzne wiązanie receptorów na powierzchni komórki zazwyczaj: 1) interferuje z tym wiązaniem; 2) znacząco zmniejsza moc w transdukcji sygnału agonistów cytokin. Opublikowane przykłady takich koniugatów ze zmniejszoną zdolnością wiązania receptora obejmują koniugaty polimerów czynnika stymulującego kolonie granulocytów („G-CSF”) (Kinstler, O. i wsp. Publikacja PCT Nr WO 96/11953; Bowen, S. i wsp., powyżej), ludzkiego hormonu wzrostu („hGH”) (Clark, R. i wsp., powyżej), antagonistów hGH (Ross, R.J.M. i wsp., (2001) J Clin Endocrinol Metab 86:1716-1723; i IFN-alfa (Ballon, P. i wsp., Bioconjug Chem
12:195- 202; Wylie, D.C. i wsp., (2001) Pharm Res 18:1354-13 60; i Wang, Y.-S. i wsp, (2002) Adv Drug Deliv Rev 54:547-570), między innymi. W ekstremalnym przypadku, przyłączenie polimerów do interleukiny-15 („IL-15”) przekształcało ten podobny do IL-2 czynnik wzrostu w inhibitor proliferacji komórkowej (Petit, D.K. i wsp., (1997) J Biol Chem 272:2312-2318). Nie chcąc się wiązać żadną teoPL 219 741 B1 rią, mechanizm dla takich niepożądanych efektów PEGylacji może obejmować zawadę przestrzenną interakcji receptora przez duże grupy PEG, zobojętnienie ładunku lub jedno i drugie.
Tak więc istnieje zapotrzebowanie na sposoby produkcji koniugatów zawierających PAG (np. zawierających PEG- i/lub PEO), szczególnie koniugatów między takimi polimerami rozpuszczalnymi w wodzie i białkami wiążącymi receptor, z zachowaniem zasadniczej bioaktywności (np. przynajmniej około 40%), nieomal całkowitej bioaktywności (np. przynajmniej około 80%) lub zasadniczo całkowitej aktywności (np. przynajmniej około 90%). Takie koniugaty będą miały korzyści dostarczone przez składnik polimerowy zwiększonej rozpuszczalności, stabilności i biodostępności in vivo i będą wykazywały zasadniczo zwiększoną moc lub pożyteczność, w porównaniu z konwencjonalnymi koniugatami polimerów, u zwierzęcia, do którego koniugaty zostały wprowadzone w celach profilaktycznych, terapeutycznych lub diagnostycznych.
Obecny wynalazek odpowiada na potrzeby określone powyżej i dostarcza sposoby przygotowania koniugatów polimerowych rozpuszczalnych w wodzie, np. glikolu polietylenowego i jego pochodnych z bioaktywnym składnikiem, interferonem-beta-1b.
W jednym wykonaniu, wynalazek dostarcza sposobu zwiększenia mocy biologicznej cytokiny, a bardziej szczegółowo, zwiększania antyproliferacyjnego potencjału nieglikozylowanego interferonu-beta-1b in vitro.
Sposób zwiększania antyproliferacyjnego potencjału nieglikozylowanego interferonu-beta-1b in vitro, według wynalazku charakteryzuje się tym, że obejmuje selektywne sprzęganie, w obecności dodecylosiarczanu sodowego (SDS), przynajmniej jednego syntetycznego, rozpuszczalnego w wodzie polimeru z alfa-aminową grupą N-końcowego aminokwasu interferonu-beta-1b, w którym N-końcowy aminokwas jest położony daleko od wiążącej receptor domeny lub domen interferonu-beta-1b, przy czym rozpuszczalny w wodzie polimer posiada pojedynczą grupę aldehydową, a selektywne sprzęganie obejmuje utworzenie zasady Schiffa poprzez reakcję alfa-aminowej grupy N-końcowego aminokwasu interferonu-1b z grupą aldehydową rozpuszczalnego w wodzie polimeru, a następnie redukcję tej zasady Schiffa łagodnym środkiem redukującym wybranym z grupy obejmującej kompleks boranpirydyna i cyjanoborowodorek sodu, z utworzeniem wiązania drugorzędowej aminy, przy czym rozpuszczalny w wodzie polimer jest glikolem polialkilenowym wybranym z grupy obejmującej glikol monometoksypolietylenowy i glikol monohydroksypolietylenowy. Korzystnie, wymienione sprzęganie obejmuje utworzenie mieszaniny interferonu-beta-1b z rozpuszczalnym w wodzie polimerem przy pH w zakresie od 5,6 do 7,6.
W sposobie według wynalazku korzystne jest, gdy łagodny środek redukujący obejmuje cyjanoborowodorek sodu, a szczególnie, gdy łagodnym środkiem redukującym jest kompleks boranpirydyna. Proces według sposobu prowadzi się tak, aby zminimalizować utlenianie przynajmniej jednej egzogennej reszty metioninowej interferonu-beta-1b. W sposobie, wymieniony antyproliferacyjny potencjał oznacza się w teście hodowli komórkowej reagującej na interferon-beta-1b.
Korzystnie, gdy wymieniony interferon-beta-1b ma sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 1, albo też gdy ma zasadniczo sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 1. Korzystnie, jako glikol polialkilenowy stosuje się glikol monometoksypolietylenowy, albo też glikol monohydroksypolietylenowy. Korzystnie, stosuje się glikol polialkilenowy o masie cząsteczkowej od 1 kDa do 100 kDa włącznie, bardziej korzystnie glikol polialkilenowy o masie cząsteczkowej od 8 kDa do 14 kDa włącznie, albo glikol polialkilenowy o masie cząsteczkowej od 10 kDa do 30 kDa włącznie. Jeszcze korzystniej, gdy stosuje się glikol polialkilenowy o masie cząsteczkowej od 18 kDa do 22 kDa włącznie, a najkorzystniej, gdy stosuje się glikol polialkilenowy o masie cząsteczkowej około 20 kDa. Równie korzystnie, gdy jako glikol polialkilenowy stosuje się glikol polialkilenowy o masie cząsteczkowej około 30 kDa.
Wynalazek dostarcza także koniugatu, wytworzonego wyżej opisanym sposobem według wynalazku.
Koniugat wytworzony sposobem według wynalazku zawiera nieglikozylowany interferon-beta-1b sprzężony kowalencyjnie w miejscu jego N-końcowego aminokwasu przynajmniej z jednym lub więcej syntetycznymi, rozpuszczalnymi w wodzie polimerami, przy czym antyproliferacyjny potencjał in vitro tego koniugatu interferonu-beta-1b jest zwiększony w porównaniu do potencjału takiego samego interferonu-beta-1b, do którego został losowo przyłączony, poprzez dostępne dla rozpuszczalnika reszty lizyny, co najmniej jeden taki sam syntetyczny, rozpuszczalny w wodzie polimer. Korzystnie, gdy zawarty w koniugacie interferon-beta-1b ma sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 1, a także, gdy antyproliferacyjny potencjał interfer-beta-1b in vitro jest zwiększony w przybliżeniu do potencjału interfe6
PL 219 741 B1 ronu-e-1a, który ma sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 2 i którego reszta asparaginy 80 jest glikozylowana.
Wynalazek dostarcza także zastosowanie koniugatu wytworzonego opisanym powyżej sposobem według wynalazku.
Koniugat wytworzony sposobem według wynalazku przeznaczony jest do zastosowania w zapobieganiu, diagnozowaniu lub leczeniu reagujących na beta-interferon zaburzeń u zwierząt cierpiących lub podatnych na te zaburzenia. Korzystne jest, gdy wymienione zwierzę jest ssakiem, a jeszcze korzystniej, gdy ssakiem jest człowiek. Dla zastosowania koniugatu według wynalazku korzystne jest, gdy zaburzenie reagujące na beta-interferon jest wybrane z grupy obejmującej raka, chorobę zakaźną, zaburzenie neurodegeneracyjne, zaburzenie autoimmunologiczne i zaburzenie genetycze. Korzystnie, rak jest wybrany z grupy obejmującej raka sutka, raka macicy, raka jajnika, raka prostaty, raka jąder, raka płuc, białaczki, chłoniaka, raka jelita grubego, raka przewodu pokarmowego, raka trzustki, raka pęcherza, raka nerki, raka kości, raka neurologicznego, raka głowy i szyi, raka skóry, raka, mięsaka, gruczolaka i szpiczaka, a choroba zakaźna reagująca na beta-interferon jest wybrana z grupy obejmującej wirusowe zapalenie wątroby, chorobę spowodowaną przez wirus kardiotropowy, oraz HIV/AIDS, zaś zaburzenie neurodegeneracyjne reagujące na interferon-beta jest stwardnieniem rozsianym. Dla zastosowania koniugatu jest korzystne, gdy stwardnienie rozsiane wybrane jest z grupy obejmującej stwardnienie rozsiane w postaci remitująco-nawracającej, pierwotnie postępującej, i wtórnie postępującej.
Wynalazek dostarcza także kompozycję farmaceutyczną. Kompozycja farmaceutyczna, zawierająca substancję aktywną oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub zaróbkę, według wynalazku charakteryzuje się tym, że substancją aktywną jest koniugat wytworzony opisanym powyżej sposobem według wynalazku.
Wynalazek dostarcza także zastosowanie wymienionej kompozycji farmaceutycznej.
Zastosowanie kompozycji farmaceutycznej według wynalazku charakteryzuje się tym, że kompozycja przeznaczona jest do zastosowania w zapobieganiu, diagnozowaniu, lub leczeniu reagujących na beta-interferon zaburzeń u zwierząt cierpiących lub podatnych na te zaburzenia. Dla zastosowania jest korzystnie, gdy zwierzę jest ssakiem, a bardziej korzystnie, gdy ssakiem jest człowiek. Dla zastosowania kompozycji farmaceutycznej według wynalazku korzystne jest, gdy zaburzenie reagujące na beta-interferon jest wybrane z grupy obejmującej raka, chorobę zakaźną, zaburzenie neurodegeneracyjne, zaburzenie autoimmunologiczne i zaburzenie genetyczne. Korzystnie, rak jest wybrany z grupy obejmującej raka sutka, raka macicy, raka jajnika, raka prostaty, raka jąder, raka płuc, białaczki, chłoniaka, raka jelita grubego, raka przewodu pokarmowego, raka trzustki, raka pęcherza, raka nerki, raka kości, raka neurologicznego, raka głowy i szyi, raka skóry, raka, mięsaka, gruczolaka, i szpiczaka, zaś choroba zakaźna reagująca na beta-interferon jest wybrana z grupy obejmującej wirusowe zapalenie wątroby, chorobę spowodowaną przez wirus kardiotropowy, oraz HIV/AIDS, a zaburzenie neurodegeneracyjne reagujące na beta-interferon jest stwardnieniem rozsianym. Korzystnie, stwardnienie rozsiane wybrane jest z grupy obejmującej stwardnienie rozsiane w postaci remitująconawracającej, pierwotnie postępującej, i wtórnie postępującej.
Sposób według wynalazku, a więc sprzęganie polimeru z interferonem-beta-1b w miejscu N-końcowego aminokwasu prowadzi do równie korzystnych efektów co glikozylacja lub hiperglikozylacja interferonu-beta-1b.
Koniugaty wytwarzane sposobem według wynalazku, w porównaniu z odpowiednimi niekoniugowanymi składnikami bioaktywnymi, mają zwiększoną stabilność (np. dłuższy okres przechowywania i dłuższe okresy połowicznego rozpadu in vivo). Ponadto, koniugaty według wynalazku, w porównaniu z koniugatami tego samego bioaktywnego składnika przygotowanego z łańcuchami polimerów, które są przyczepione losowo do dostępnych dla rozpuszczalnika miejsc wzdłuż łańcuchów polipeptydowych, mają zwiększoną aktywność wiązania receptora, która może być mierzona lub stosowana in vitro i zwiększoną moc, która może być mierzona in vitro lub in vivo.
Oznaczenie mocy biologicznej danego preparatu interferonu-beta (tzn. czy moc jest zwiększona, zmniejszona lub niezmieniona względem wzorcowego roztworu interferonu-beta) można uzyskać za pomocą szeregu oznaczeń in vitro lub in vivo znanych osobie o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie. Na przykład oznaczenie w hodowli komórek, która odpowiada na interferon-beta może być stosowane do oznaczenia mocy biologicznej preparatów interferonu-beta. Nieograniczające przykłady odpowiednich oznaczeń w hodowlach komórkowych obejmują oznaczenia antyproliferacyjne,
PL 219 741 B1 oznaczenia antywirusowe, oznaczenia transdukcji sygnału i oznaczenia aktywacji genów, których przykłady są dobrze znane osobom o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie.
Inne korzystne wykonania tego wynalazku będą ewidentne dla osoby o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie w świetle następujących figur i opisu wynalazku i zastrzeżeń.
Krótki opis figur
Fig. 1 do 8 pokazują molekularne modele różnych cytokin i czynników wzrostu stworzonych z oprogramowaniem RasMol (Sayle, R.A. i wsp. (1995) Trends Biochem Sci 20:374-376) w oparciu o dane krystalograficzne. Każdy z modeli jest reprezentowany w formacie „wstążki” lub „szkicu” poza pewnymi szczególnie interesującymi resztami, które są pokazane w formie „kulek i kijków”. Te formaty są opcjami wybranymi stosując oprogramowanie RasMol. Ciemne części wstążek reprezentują domeny cytokin i czynników wzrostu, które są uważane za biorące udział w wiązaniu swoich receptorów. Dla każdej struktury wskazany jest kod dostępu w Protein Data Bank („PDB” Bank Danych Białek) (patrz Laskowski, R.A. (2001) Nucleic Acids Res 29:221-222; Peitsch, M.C. (2002) Bioinformatics 18:934-938; Schein, C.H., (2002) Curr Pharm Des 8:2113-2129.
Fig. 1a pokazuje model interferonu-alfa-2a, w którym cztery reszty lizyny (Lys 31, Lys 121, Lys 131 i Lys 134), dla których podano, że są pierwszorzędowym miejscem PEGylacji w produkcie interferonowym firmy Roche PEGASYS® są przedstawione w formacie „kulek i kijków” (w oparciu o dane Bailon, P. i wsp., powyżej). Regiony biorące udział w wiązaniu do jego receptorów („miejsca wiązania 1 i 2”) są zidentyfikowane. Wszystkie cztery reszty, które są opisane jako będące głównymi miejscami PEGylacji w PEGASYS są w regionie miejsca wiązania 1 (kod PDB 1ITF).
Fig. 1b pokazuje model interferonu-alfa-2b; w którym reszty, które są opisywane jako główne miejsca PEGylacji w produkcie interferonowym Schering-Plough PEG-Intron® (His 34, Lys 31, Lys 121, Tyr 129 i Lys 131) są przedstawione w formacie „kulek i kijków” (w oparciu o dane Wylie, D. C. i wsp., powyżej). Te reszty aminokwasów są w regionie miejsca wiązania 1.
Fig. 1c pokazuje model interferonu-alfa-2b, w którym aminokońcowa reszta cysteiny („Cys 1”), cel PEGylacji według obecnego wynalazku jest pokazana w formacie „kulek i kijków”. Cys 1 jest daleki od miejsc wiązania 1 i 2.
Fig. 1d przedstawia ten sam model interferonu-alfa-2b jak pokazano na Fig. 1c, w którym pojedyncza nić 20-kDa PEG była przyczepiona do N-końcowej reszty cysteiny („Cys 1”). Struktura PEG była wygenerowana stosując adaptację programu opisanego przez Lee, L.S. i wsp., (1999) Bioconjug Chem 10:973-981) i jest podana w tej samej skali jak białko.
Fig. 2 pokazuje model molekularny ludzkiego interferonu-beta-1a (patrz SEQ ID NO: 2), w którym pokazano kilka reszt lizyny, które są w obrębie lub przylegające do domen wiążących receptor (Lys 19, Lys 33, Lys 99 i Lys 134). Dodatkowo w formacie „kulek i kijków” pokazano miejsce glikozylacji (Asn80) i N-końcową resztę metioniny („Met 1”) (w oparciu o dane Karpusas, M. i wsp., (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94:11813-11818; Karpusas, M. i wsp., (1998) Cell Mol Life Sci 54:1203-1216; Runkel, L. i wsp. (2000) Biochemistry 39:2538-2551). Met 1 jest odległy od miejsca wiązania 1 i 2, podczas gdy kilka reszt lizyny jest umieszczonych w obrębie domen wiążących receptory. (Kod PDB 1AUI). Struktura interferonu-beta-1b (patrz SEQ ID NO: 1) różni się od interferonu-beta-1a przez nie posiadanie N-końcowej reszty metioniny i reszty węglowodanowej, jak i posiadanie reszty seryny podstawionej za niesparowaną resztę cysteiny (Cys 17 SEQ ID NO: 2).
Fig. 3 przedstawia molekularny model ludzkiego czynnika stymulującego kolonie granulocytówmakrofagów („GM-CSF”), w którym trzy reszty lizyny (Lys 72, Lys 107 i Lys 111, które są w obrębie domeny wiążącej receptora, jak i pierwsza reszta aminokwasu blisko końca aminowego, która jest wizualizowana w strukturze kryształu („Arg4”) są pokazane w modelu „kulek i kijków” (w oparciu o dane Rozwarski D.A. i wsp., (1996) Proteins 26:304-313). Region amino-końcowy GM-CSF jest odległy od miejsc wiązania 1 i 2 (kod pDB 2GMF).
Fig. 4 przedstawia model molekularny ludzkiej interleukiny-2, w którym reszty aminokwasów opisane jako zaangażowane w każdym z trzech receptorów (alfa, beta i gamma) są reprezentowane w formacie „kulek i kijków”, podobnie jak kilka reszt lizynowych, które są w obrębie lub w pobliżu domen wiążących receptor. Reszta aminokwasu najbliższa końcowi aminowemu, która jest uwidoczniona w strukturze kryształu to seryna 6 („Ser 6”), która jest odległa od domen wiążących receptor (oparte o dane Bamborough, P. i wsp., (1994) Structure 2:839-851; Petit, D.K. i wsp., powyżej) (kod PDB 3INK).
Fig. 5 przedstawia model molekularny ludzkiego nabłonkowego czynnika wzrostu („EGF”) w formie „szkicu”, poza tym, że reszty, które biorą udział we wiązaniu receptora i dwie reszty lizyny (Lys 28 i Lys 48, które przylegają do regionów wiążących receptor. Wiązania dwusiarczkowe między
PL 219 741 B1 łańcuchami są pokazane jako linie przerywane. Reszta aminokwasu najbliższa końcowi aminowemu, która jest uwidoczniona w strukturze kryształu, na której jest oparty ten model to cysteina 6 („Cys 6”) (w oparciu o dane Carpenter, G. i wsp. (1990) J Biol Chem 265:7709-7712; Lu, H.-S. i wsp., (2001) J Biol Chem 276:34 913-34 917). Elastyczna część końca aminowego EGF (reszty 1-5), która nie jest uwidoczniona w strukturze kryształu nie wydaje się być w regionie wiążącym receptor, (kod PDB 1JL9).
Fig. 6 przedstawia model molekularny zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów („bFGF”) w formie „szkicu”, w którym reszty biorące udział we wiązaniu do receptorów i heparyny są identyfikowane przez prezentację w formacie „kulek i kijków” (w oparciu o dane Schlessinger, J. i wsp., (2000) Mol Cell 6:743-750). Pierwsze 12 reszt aminokwasów z końca aminowego wydaje się być w regionie wiążącym receptor. (Kod PDB 1JL9).
Fig. 7 przedstawia model molekularny insulinopodobnego czynnika wzrostu 1 („IGF-1”) w formie „szkicu”, poza resztami biorącymi udział w wiązaniu receptora (23-25 i 28-27) i resztą kwasu glutaminowego 3 („Glu3”), która jest najbliższą resztą aminokwasu do końca aminowego, która jest uwidoczniona w strukturze kryształu. Zidentyfikowano dwie z reszt lizyny z których jedna (Lys27) przylega do domeny wiążącej receptor, a druga z nich jest odległa od domeny wiążącej (oparte o dane Brzozowski, A.M., i wsp., (2002), Biochemistry 41:9389-9397). Koniec aminowy IGF-1 jest odległy od domen wiążących receptor (kod PDB IGZR).
Fig. 8 przedstawia model molekularny interferonu gamma („IFN-gamma”), który jest homodimerem. Aby wyjaśnić interakcje między łańcuchami polipeptydowymi jeden z monomerów („łańcuch A”) jest przedstawiony w formie „wstążki” a drugi („łańcuch B”) jest przedstawiony w formie „szkieletu”. Reszty lizynowe (pokazane w lekkim formacie „kulek i kijków”) są obecne wzdłuż łańcucha polipeptydowego włącznie z regionami, które biorą udział w styku między monomerami lub przylegają do reszt aminokwasów, które biorą udział we wiązaniu receptora. Region aminokońcowy IFN-gamma jest odległy od styku dimeryzacji, ale są dane o udziale glutaminy 1 (Gln 1) we wiązaniu receptora (Thiel, D.J. i wsp., (2000) Structure 8:927-936; kod PDB 1FG9).
Fig. 9 przedstawia frakcjonowanie niePEGylowanego interferonu-alfa-2b („IFN”), monoPEGylowanego interferonu-alfa-2b („PEG1-IFN”) przez chromatografię kationowymienną mieszaniny reakcyjnej zawierającej IFN, 20-kDa mPEG-aldehyd i czynnik redukujący.
Fig. 10 przedstawia dane z chromatografii wykluczania wielkości mieszaniny reakcyjnej frakcjonowanej jak pokazano na Fig. 9 i wybranych frakcji zebranych z kolumny chromatografii jonowymiennej, dla której wyniki są przedstawione na Fig. 9.
Fig. 11 przedstawia frakcjonowanie za pomocą chromatografii kationowymiennej mieszaniny reakcyjnej zawierającej ludzką IL-2, 20-kDa mPEG-aldehyd i czynnik redukujący. We wskazanych warunkach resztkowa niePEGylowana IL-2 nie była eluowana z kolumny w odróżnieniu od wyników dla interferonu-alfa-2b przedstawionych na Fig. 9.
Fig. 12 przedstawia analizę z chromatografii wykluczania wielkości mieszaniny reakcyjnej jak przedstawiono na Fig. 11 i wybranych frakcji eluowanych z tej kolumny.
Fig. 13 przedstawia analizy elektroforetyczne mieszaniny reakcyjnej PEGylowanej interleukiny-2 („PEG-IL-2”) i frakcji z kolumny kationowymiennej, dla której chromatogram jest przedstawiony na Fig. 11.
Fig. 14 przedstawia rozdział za pomocą chromatografii wykluczania wielkości HPLC interferonuβ-1 b („IFN”) od koniugatów tworzonych za pomocą redukcyjnej alkilacji z 20 kDa aldehydem mPEG w różnych stosowanych stężeniach („1x”, „2x” lub „4x”) z cyjanoborowodorkiem sodu (NaBH3CN) jako czynnikiem redukującym. Koniugaty zawierające jedną nić PEG („PEG1-IFN”) lub dwie nici PEG („PEG2-IFN”) są oddzielone od IFN, do którego PEG nie był przyłączony w tych warunkach („pozornie PEGylowany IFN”).
Fig. 15 przedstawia oksydacyjne cięcie za pomocą nadjodanu sodu około 90% PEGi-IFN-β syntetyzowanego za pomocą alkilacji redukcyjnej w różnych warunkach. HPLC wykluczenia wielkości w obecności siarczanu dodecylu sodu („SDS”) rozdzieliła wyjściowy PEGi-IFN-β od produktów cięcia, obejmujące formaldehyd i IFN, w którym N-końcowa seryna była odcięta do aldehydu („IFN aldehyd”).
Fig. 16 przedstawia rozdział za pomocą chromatografii fazy odwróconej PEGi-IFN-β od pozornie PEGylowanego IFN-β, niezwiązanego PEG, niezwiązanego SDS i pomniejszych składników mieszaniny reakcyjnej.
Fig. 17 przedstawia wyniki analitycznej chromatografii fazy odwróconej („RP”) mieszaniny reakcyjnej PEGylacji i frakcje z kolumny preparatywnej, która była wzbogacona w PEGi-IFN-β (Frakcja 51) lub w pozornie PEGylowany IFN-β (frakcja 53), odpowiednio.
PL 219 741 B1
Fig. 18 przedstawia wyniki analizy elektroforezy mieszaniny reakcyjnej PEGylacji i frakcji z preparatywnej kolumny RP, które są wzbogacone w albo PEGi-IFN-β (Frakcja 51) albo w koniugaty zawierające więcej niż jedną nić PEG (Frakcja 49). Żel barwiono na białka barwnikiem fluorescencyjnym i fotografowano z oświetleniem ultrafioletowym. Intensywność barwienia mierzono oprogramowaniem do obrazowania Kodak.
Fig. 19 przedstawia wyniki analizy elektroforetycznej tych samych próbek jak na Fig. 18, poza tym, że żel barwiono na PEG odczynnikiem zawierającym BaCl2, I2 i KI. Intensywność barwienia na fotografii żelu mierzono jak na Fig. 18. Szczyt resztkowego wolnego 20 kDa PEG jest wykrywalny w mieszaninie reakcyjnej.
Fig. 20 przedstawia chromatografy fazy odwróconej próbek ^^β-1^ które albo nie były traktowane (górna krzywa), albo były inkubowane z 0,5 mM NaIO4, który ciął N-końcowe reszty seryny zarówno głównych i pobocznych składników do pochodnych aldehydowych (środkowa krzywa) lub utleniane NaIO4 I reagowane z karbazanem 9-fIuorenylometylu („Moc-karmazan). Pominiejszy składnik (szczyt A) zawiera utlenioną resztę metioniny. Podobne przyrosty czasu retencji zarówno szczytu A I głównego składnika po utlenieniu są odbiciem cięcia reszt N-końcowej seryny w każdym szczycie do aldehydu. Nie wykryto zwiększenia procentu szczytu A po inkubacji z NaIO4 w tych warunkach. Tworzenie koniugatów Fmoc z utlenionych form szczytu A i głównego składnika jest wskazywane przez wzrost ich czasów retencji i absorbancji po reakcji z Moc-karbazanem.
Fig. 21 przedstawia syntezę PEGi-IFN-β za pomocą reakcji 20 kDa PEG-karbazanu z pochodną aldehydową IFN-β. Zwiększająca się część koniugatu wykrywana po inkubacji białka z 0,125 MM NaIO4 w temperaturze pokojowej przez 0,5, 1 lub 2 godziny wskazuje, że całkowite przekształcenie N- końcowej seryny do aldehydu wymaga więcej niż 1 godziny w tych warunkach. PEGi-IFN-β był niecałkowicie oddzielony od 20-kDa PEG-karbazanu na tej kolumnie wykluczania wielkości.
Fig. 22 wykazuje większą moc antyproliferacyjną na ludzkich komórkach chłoniaka Burkitta (komórki Daudi) rozcieńczeń PEGi-IFN-β, który był oczyszczony za pomocą chromatografii fazy odwróconej (Frakcja 51, charakteryzowana na Fig. 17-19), niż w rozcieńczeniach wzorcowego roztworu ΙFΝ-β. Stężenie oczyszczonego PEGi-IFN-β wymagane do hamowania 50% możliwego do zahamowania wzrostu tych komórek wynosiło około 40 pg/mL, co stanowiło około jedną szóstą ilości wymaganej dla roztworu wzorcowego IFN-β. Stężenie oczyszczonego pozornie PEGylowanego IFN-β (Frakcja 53 z chromatogramu fazy odwróconej przedstawionego na Fig. 17) wymagane do hamowania 50% możliwego do zahamowania wzrostu tych komórek wynosiło około 80 pg/mL, stanowiło około jedną trzecią ilości wymaganej dla roztworu wzorcowego EF-β.
Szczegółowy opis wynalazku o ile nie jest definiowane inaczej, wszystkie terminy techniczne i naukowe tu stosowane mają te same znaczenia jak jest normalnie rozumiane przez osobę o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie, do której należy ten wynalazek. Choć dowolne metody i materiały podobne lub równoważne do tych tu opisanych mogą być stosowane w testowaniu tego wynalazku, korzystne sposoby i materiały są tu opisane dalej.
Definicje
Około: jak jest to tu stosowane, gdy dotyczy to dowolnej wartości liczbowej, określenie „około” oznacza wartość + 10% podanej wartości (np. „około 50°C” obejmuje zakres temperatur od 45°C do 55°C włącznie; podobnie „około 100 mM” obejmuje zakres stężeń od 90 mM do 100 mM, włącznie).
Reszta aminokwasu: jak jest to tu stosowane, określenie „reszta aminokwasu” dotyczy specyficznego aminokwasu, na ogół odwodnionego w wyniku jego udziału w dwóch wiązaniach peptydowych, w szkielecie polipeptydowym lub łańcuchu bocznym, ale także gdy aminokwas bierze udział w jednym wiązaniu peptydowym jak zachodzi na końcu liniowego łańcucha polipeptydowego. Reszty aminokwasów są określane przez kody trzyliterowe lub jednoliterowe, jak jest powszechne w dziedzinie.
Antagonista: jak jest to tu stosowane, określenie „antagonista” dotyczy związku, cząsteczki, reszty lub kompleksu, który zmniejsza, znacznie zmniejsza lub całkowicie hamuje efekty biologiczne i/lub fizjologiczne danej cytokiny w komórce, tkance lub organizmie, które zachodzą poprzez receptory danej cytokiny. Antagoniści mogą przeprowadzać takie efekty na szereg sposobów, obejmujących, ale nie ograniczonych do, współzawodniczenie z agonistą o miejsce (miejsca) wiążące lub receptor(y) na powierzchni komórki; oddziaływanie z agonistą w taki sposób by zmniejszyć, znacznie zmniejszyć lub całkowicie zahamować zdolność agonisty do wiązania receptorów na powierzchni komórki; wiązanie do i indukowanie zmiany konformacji w receptorach na powierzchni komórki takie, że receptory przyjmują strukturę, do której agonista nie może się już wiązać (lub może wiązać się tylko ze zmniejszonym lub znacznie zmniejszonym powinowactwem i/lub wydajnością); indukować zmianę fizjologiczną
PL 219 741 B1 (np. zwiększenie ilości wewnątrzkomórkowych kompleksów sygnalizujących; zwiększenie inhibitorów transkrypcji; zmniejszenie w ekspresji receptorów ligandu na powierzchni komórki itd.) w komórkach, tkankach lub organizmach tak, że wiązanie agonisty lub sygnał fizjologiczny indukowany przez agonistę po wiązaniu do komórki jest zmniejszony, znacznie zmniejszony lub całkowicie hamowany; i inne mechanizmy za pomocą których antagoniści mogą przeprowadzać swoje aktywności, które będą znane osobie o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie. Jak zrozumie osoba o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie, antagonista może mieć podobną strukturę do ligandu, który antagonizuje (np. antagonista może być muteiną, wariantem, fragmentem lub pochodną agonisty) lub może mieć zupełnie niespokrewnioną strukturę.
„Składnik bioaktywny”: jak jest to tu stosowane, określenie „składnik bioaktywny” dotyczy związku, cząsteczki, reszty lub kompleksu, który ma określoną aktywność biologiczną in vivo, in vitro lub ex vivo na komórkę, tkankę, narząd lub organizm, i który jest zdolny do bycia wiązanym do jednego lub więcej glikoli polialkilenowych, aby wytworzyć koniugaty według wynalazku. Korzystne związki bioaktywne obejmują ale nie są ograniczone do, białka i polipeptydy takie jak te tu opisane.
„Związany”: jak jest to tu stosowane, określenie „związany” dotyczy wiązania lub przyłączenia, które może być kowalencyjne, np. przez połączenie chemiczne, lub niekowalencyjne, np. oddziaływania jonowe, oddziaływania hydrofobowe, wiązania wodorowe itd. Wiązania kowalencyjne mogą być np. estrowe, eterowe, fosfoestrowe, tioestrowe, tioeterowe, uretanowe, amidowe, aminowe, peptydowe, iminowe, hydrazonowe, hydrazydowe, wiązania węgiel-siarka, wiązania węgiel-fosfor, i tym podobne. Określenie „związany” jest szersze i obejmuje określenia takie jak „sprzęgnięty”, „koniugowany” i „przyłączony”.
Koniugat/koniugacja: jak jest to tu stosowane, określenie „koniugat” dotyczy produktu kowalencyjnego przyłączenia polimeru np. PEG lub PEO do składnika bioaktywnego np. białka lub glikoproteiny. „Koniugacja” dotyczy wytwarzania koniugatu zdefiniowanego w poprzednim zdaniu. Dowolna metoda stosowana przez osoby biegłe w dziedzinie koniugacji polimerów do materiałów biologicznie czynnych może być stosowana w obecnym wynalazku.
Przyłączony: Określenie „przyłączony” jak jest to tu stosowane oznacza przyłączenie za pomocą wiązań kowalencyjnych lub silnych wiązań niekowalencyjnych typowo i korzystnie przez przyłączenie do wiązań kowalencyjnych. Dowolny sposób normalnie stosowany przez osoby biegłe w dziedzinie do przyłączania materiałów biologicznie czynnych może być stosowany w obecnym wynalazku.
Cytokina: jak jest to tu stosowane, określenie „cytokina” jest definiowane jako wydzielane regulacyjne białko, które kontroluje przeżycie, wzrost, różnicowanie i/lub efektorowe funkcje komórek, w sposób endokrynny, parakrynny lub autokrynny (przegląd w Nicola, N.A., powyżej; Kossiakoff, A.A. i wsp., (1999) Adv Protein Chem 52:67-108). Według tych definicji, cytokiny obejmują interleukiny, czynniki stymulujące wzrost kolonii, czynniki wzrostu i inne czynniki peptydowe produkowane przez różne komórki, obejmujące, ale nie ograniczone do te tu specyficznie ujawnione lub podane jako przykłady. Jak ich bliscy krewni, hormony polipeptydowe i czynniki wzrostu, cytokiny inicjują swoje funkcje regulatorowe przez wiązanie do specyficznych białek receptorowych na powierzchni swoich docelowych komórek.
Choroba, zaburzenie, stan: jak jest to tu stosowane, określenie „choroba” lub „zaburzenie” dotyczy dowolnego niekorzystnego stanu człowieka lub zwierzęcia obejmującego guzy nowotworowe, raka, alergie, uzależnienia, autoimmunizację, zakażenie, zatrucie lub upośledzenie optymalnego funkcjonowania umysłu lub ciała. „Stany” jak jest to tu stosowane, obejmuje choroby i zaburzenia, ale także dotyczy stanów fizjologicznych. Na przykład płodność jest stanem fizjologicznym, ale nie jest chorobą ani zaburzeniem. Kompozycje według wynalazku odpowiednie do zapobiegania ciąży przez zmniejszenie płodności by były więc opisane jako traktowanie stanu (płodności) ale nie jako traktowanie zaburzenia lub choroby. Inne warunki są rozumiane przez osoby o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie.
Skuteczna ilość: jak jest to tu stosowane, określenie „skuteczna ilość” dotyczy ilości danego koniugatu lub kompozycji, która jest konieczna lub wystarczająca do osiągnięcia pożądanego efektu biologicznego. Skuteczna ilość danego koniugatu lub kompozycji według wynalazku byłaby to ilość, która osiąga ten wybrany efekt, i taka ilość może być określona rutynowo przez osobę biegłą w dziedzinie, stosując oznaczenia, które są znane w dziedzinie i/lub które są tu opisane, bez potrzeby nadmiernego eksperymentowania. Na przykład skuteczna ilość do leczenia niedoboru układu odpornościowego mogłaby być tą ilością potrzebną do spowodowania aktywacji układu odpornościowego dając rozwój specyficznej względem antygenu odpowiedzi odpornościowej po ekspozycji na antygen.
PL 219 741 B1
Określenie to jest też synonimem „wystarczającej ilości”. Skuteczna ilość dla każdego szczególnego zastosowania może się zmieniać w zależności od takich czynników jak leczona choroba lub stan, szczególna podawana kompozycja, droga podawania, wielkość osobnika i/lub ciężkość choroby lub stanu. Osoba o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie może określić empirycznie skuteczną ilość danego koniugatu lub kompozycji według wynalazku bez konieczności nadmiernego eksperymentowania.
Jeden: Gdy stosowane jest określenie „jeden” w tym ujawnieniu oznacza „przynajmniej jeden” lub „jeden lub więcej”, o ile nie jest podane inaczej.
PEG: jak jest to tu stosowane, „PEG” obejmuje wszystkie polimery tlenku etylenu, liniowe, rozgałęzione lub wieloramienne, z kapem lub hydroksylem na końcu. „PEG” obejmuje te polimery, które są znane w dziedzinie jak glikol polietylenowy, glikol metoksypolietylenowy lub mPEG lub eter monometylowy glikolu polietylenowego, glikol alkoksypolietylenowy, tlenek polietylenu lub PEO, a-emetyloω-hydroksy-poli(oksy-1,2-etanodiil) i tlenek polietylenu, wśród innych nazw, które są stosowane w dziedzinie dla polimerów tlenku etylenu.
PEGylacja, PEGylowany i pozornie PEGylowany: jak jest to tu stosowane, „PEGylacja” dotyczy dowolnego procesu dla kowalencyjnego przyłączenia PEG do bioaktywnej cząsteczki docelowej szczególnie białka wiążącego receptor. W ten sposób wytworzony koniugat jest określany jako „PEGylowany”. Jak jest to tu stosowane, „pozornie PEGylowany” dotyczy części białka w mieszaninie reakcyjnej do PEGylacji, do którego nie przyłączył się PEG. Tym niemniej produkt pozornie PEGylowany mógł być zmieniony w czasie reakcji i kolejnych procedur oczyszczania np. w efekcie ekspozycji na czynnik redukujący w czasie PEGylacji przez alkilację redukcyjną i/lub przez usunięcie jednego lub więcej czynników hamujących, związków itd. w czasie etapów obróbki i/lub oczyszczania.
Polipeptyd: jak jest to tu stosowane, określenie „polipeptyd” dotyczy cząsteczki złożonej z monomerów (aminokwasów) połączonych liniowo przez wiązania amidowe (znane także jako wiązania peptydowe). Wskazuje to cząsteczkowy łańcuch aminokwasów i nie dotyczy specyficznej długości produktu. Tak więc peptydy, dipeptydy, tripeptydy, oligopeptydy i białka są objęte przez definicję polipeptydu. To określenie ma także na celu objęcie produktów postekspresyjnej modyfikacji polipeptydu, na przykład glikozylacji, hiperglikozylacji, acetylacji, fosforylacji i tym podobnie. Polipeptyd może pochodzić z naturalnego źródła biologicznego lub być produkowany przez technologię rekombinacji, ale niekoniecznie ulega translacji z określonej sekwencji kwasu nukleinowego. Może być wygenerowany w dowolny sposób, w tym przez syntezę chemiczną.
Białko i glikoproteina: jak jest to tu stosowane, określenie białko dotyczy polipeptydu ogólnie o wielkości powyżej około 10 lub więcej, 20 lub więcej, 25 lub więcej, 50 lub więcej, 75 lub więcej, 100 lub więcej, 200 lub więcej, 500 lub więcej, 1000 lub więcej, lub 2000 lub więcej aminokwasów. Białka na ogół mają określoną strukturę trójwymiarową choć niekoniecznie mają taką strukturę i są często określane jako zwinięte w przeciwieństwie do peptydów i polipeptydów, które często nie posiadają określonej trójwymiarowej struktury ale raczej mogą przyjmować szereg różnych konformacji i są określane jako rozwinięte. Peptydy mogą jednak także mieć określoną strukturę trójwymiarową. Jak jest to tu stosowane, określenie glikoproteina dotyczy białka połączonego z przynajmniej jedną resztą węglowodanową, która jest przyłączona do białka poprzez łańcuch boczny zawierający tlen lub zawierający azot reszty aminokwasu, np. resztę seryny lub resztę asparaginy.
Odległy: jak jest to tu stosowane, określenie „odległy” (jak w „odległy aminokwas N-końcowy” lub „odległe miejsce glikozylacji”) dotyczy struktury, w której umieszczenie jednego lub więcej miejsc przyczepu dla jednego lub więcej polimerów na białku jest/są dalekie lub przestrzennie oddzielone od jednego lub więcej regionów wiążących receptor lub domen białka, ocenione na podstawie modelowania molekularnego. Koniugacja polimeru w takim odległym miejscu przyczepienia (na ogół aminokwas N-końcowy (dla białek wiążących receptory, które są więc określane jako: odległe N-końcowe-remote N-terminal „RN” białka wiążące receptor) lub jednej lub więcej reszt węglowodanowych lub miejsc glikozylacji na glikoproteinie (dla białek wiążących receptor, które są więc określane jako białka wiążące receptor „odległa glikozylacja” - remote glycosylation lub „RG”) nie powoduje zasadniczej zawady przestrzennej we wiązaniu białka z jego receptorem (receptorami). Tak więc aminokwas aminokońcowy lub miejsce glikozylacji na cytokinie jest określane jako „położone daleko od jednej lub więcej domen” cytokiny gdy koniugacja (np. przyłączenie kowalencyjne) polimeru rozpuszczalnego w wodzie do odpowiednio aminokońcowego aminokwasu lub miejsca glikozylacji nie interferuje zasadniczo w zdolności cytokiny do wiązania swojego receptora (receptorów), szczególnie do receptorów na powierzchni komórki. Wiadomo oczywiście, że dana cytokina może zawierać więcej niż jedną
PL 219 741 B1 domenę wiążącą receptor. W takich sytuacjach, aminokońcowy aminokwas lub miejsce glikozylacji cytokiny może być położone odlegle od takiej domeny lub od więcej niż jednej domeny i nadal być uważane za „położone odlegle od jednej lub więcej domen wiążących receptor” o ile koniugacja aminokońcowego aminokwasu lub miejsca glikozylacji nie interferuje zasadniczo z wiązaniem cytokiny do jej receptora (receptorów) poprzez jedną lub więcej domen wiążących receptor. Czy koniugacja zasadniczo interferuje ze zdolnością białka do wiązania do swoich receptorów może być łatwo określone stosując znane w dziedzinie oznaczenia wiązania Iigand-receptor, które będą znane osobie o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie.
Jak przedstawiono na Fig. 1d tej specyfikacji, PEG jest polimerem wysoce rozciągniętym i elastycznym, który zajmuje w roztworze dużą objętość względem białka o podobnej masie cząsteczkowej. Choć reszta aminokwasu, do której PEG jest przyłączony może być odległa od jednego lub więcej miejsc wiążących receptor, części polimeru mogłyby w pewnym stopniu interferować we wiązaniu receptora. Prawdopodobieństwo takiej interferencji wzrasta z masą cząsteczkową i tak więc objętością zajmowaną przez polimer w roztworze. W każdym razie adresowane przyłączanie PEG do jednego lub więcej miejsc odległych od regionów wiązania receptora będzie mniej interferować z działaniem cytokiny niż PEGylacja losowa.
Sposoby oceniania wiązania ligand-receptor obejmują bez ograniczenia, kompetycyjne oznaczenie wiązania, oznaczenia wiązania radioreceptora, oznaczenia oparte na komórkach, pomiary plazmonowego rezonansu powierzchniowego, dynamiczne rozpraszanie światła i ultrawirowanie.
Znacznie, znaczny: jak jest to tu stosowane, mówi się, że koniugacja białka nie interferuje „znacznie” ze zdolnością białka do wiązania jego receptora (receptorów) jeśli tempo i/lub ilość wiązania koniugowanego białka do receptora wynosi nie mniej niż około 40%, około 50%, około 60%, około 65%, około 70%, około 75%, około 80%, około 90%, około 91%, około 92%, około 93%, około 94%, około 95%, około 96%, około 97%, około 98%, około 99% lub około 100% lub więcej tempa wiązania i/lub ilości odpowiedniej cytokiny, która nie była koniugowana.
Traktowanie: jak jest tu stosowane, określenie „traktowanie”, „traktować”, „traktowany” lub „traktujący” dotyczy profilaktyki i/lub terapii. Gdy jest stosowane względem chorób zakaźnych, na przykład, określenie może dotyczyć traktowania profilaktycznego, które zwiększa oporność osobnika na zakażenie patogenem lub innymi słowy zmniejsza prawdopodobieństwo, że osobnik zostanie zakażony przez patogen lub wykaże objawy choroby, które można przypisać zakażaniu, jak i traktowanie po tym, jak osobnik został zakażony aby zwalczyć zakażenie np. aby zmniejszyć lub wyeliminować zakażenie lub zapobiec pogorszeniu.
Ogólne omówienie
Obecny wynalazek dostarcza sposoby syntezy koniugatów polimerowych białek wiążących receptory, u których zachowana jest niezwykle wysoka aktywność wiązania receptora względem koniugatów polimerowych tego samego białka wiążącego receptor, w którym jeden lub więcej polimerów jest przyłączonych losowo. Poprzez zastosowanie danych z krystalografii promieniami X i analiz opartych na magnetycznym rezonansie jądrowym, analizę mutacyjną i oprogramowanie do modelowania molekularnego obecni wynalazcy określili docelowe miejsca do PEGylacji cytokin, które uczestniczą lub nie uczestniczą w wiązaniu tych receptorów. Jako klasa białek te cytokiny są tu określane jako białka wiążące receptor. Przez wybór syntetycznej strategii, która adresuje przyczepianie polimerów do regionu (regionów) białek wiążących receptor, które nie uczestniczą w interakcjach z receptorem, unika się pewnych niepożądanych zawad przestrzennych i uzyskane koniugaty polimerów zachowują niezwykle wysoką moc. Te białka wiążące receptor, które mają resztę aminokońcową, która jest odległa od jednego lub więcej z ich regionów lub domen wiążących receptor są tu definiowane jako białka wiążące receptor „odległe N-końcowe” lub „RN”; obejmują one wszystkie cytokiny, które mają swój aminokońcowy aminokwas umieszczony daleko od miejsca lub miejsc wiążących receptor białka.
W dodatkowych wykonaniach wynalazku, produkowane są koniugaty obejmujące jeden lub więcej syntetycznych polimerów (np. jeden lub więcej glikoli polietylenowych) kowalencyjnie połączonych z cytokinami, które mają naturalne miejsca glikozylacji, które są odległe od jednego lub więcej z ich regionów lub domen wiążących receptor. Według tego aspektu wynalazku, bioaktywne składniki (np. cytokiny) koniugatów będą wykazywały dobrze zachowane aktywności wiązania receptora, gdy syntetyczne polimery są przyłączane w regionie miejsca (miejsc) glikozylacji. Ten podzbiór białek wiążących receptor jest tu określany jako białka wiążące receptor „RG”. Gdy polimer hydrofilowy lub amfipatyczny jest selektywnie przyłączony w lub w pobliżu takiego „odległego miejsca glikozylacji” szczególnie gdy docelowe białko jest nieglikozylowaną formą białka, które jest naturalnie glikozylowane,
PL 219 741 B1 polimer może imitować korzystne efekty naturalnie występującego węglowodanu np. na agregację, stabilność i/lub rozpuszczalność. Stąd też przyłączenie polimeru w lub w pobliżu miejsca glikozylacji jest tutaj określane jako „pseudoglikozylacja”. Tak więc obecny wynalazek dostarcza sposoby syntezy koniugatów, w których specyficzne względem miejsca przyłączanie syntetycznego polimeru skutecznie zastępuje naturalnie występujące reszty węglowodanowe. Wynikająca pseudoglikozylacja ma wpływ na poprawioną rozpuszczalność, zmniejszoną agregację i opóźniony klirans z krwiobiegu w porównaniu z innymi nieglikozylowanymi formami białka. To podejście jest więc szczególnie korzystne dla przygotowania koniugatów i kompozycji białek, które są produkowane za pomocą technik rekombinowanego DNA w prokariotycznych komórkach gospodarza (np. bakterii takich jak Escherichia coli) jako że te prokariotyczne organizmy na ogół nie glikozylują białek, które wyrażają.
Analogicznie, wybiórcza PEGylacja reszty węglowodanowej glikoproteiny może dać „pseudohiperglikozylację” glikoproteiny. Ten proces opisali, na przykład, C. Bona i wsp., w publikacji PCT Nr WO 96/40731, której ujawnienie jest tu włączone w całości w formie odniesienia. To podejście jest więc szczególnie korzystne dla przygotowania koniugatów i kompozycji białek, które są produkowane za pomocą technologii rekombinowanego DNA w eukariotycznych komórkach gospodarza (np. w drożdżach, komórkach roślinnych i komórkach zwierzęcych (obejmujących komórki ssaków i komórki owadów) ponieważ te eukariotyczne organizmy na ogół glikozylują białka, które wyrażają jeśli białka te zawierają naturalnie występujące sygnały glikozylacji lub sygnały glikozylacji wprowadzone za pomocą technologii rekombinowanego DNA. Takie pseudoglikozylowane i pseudohiperg likozylowane białka RG wiążące receptor są w zakresie tego wynalazku.
Wynalazek ten także obejmuje koniugaty polimerów białek wiążących receptor „RN”, które zachowują znaczną, nieomal całkowitą lub zasadniczo całkowitą aktywność wiążącą receptor i pseudoglikozylowane lub pseudohiperglikozylowane białka wiążące receptor RG, które zachowują znaczną, nieomal całkowitą lub zasadniczo całkowitą aktywność wiążącą receptor. Jak jest to tu stosowane, mówi się, że cytokina „zachowuje znaczną, nieomal całkowitą lub zasadniczo całkowitą aktywność wiążącą receptor” gdy jest koniugowana z jednym lub więcej polimerami rozpuszczalnymi w wodzie według wynalazku jeśli koniugacja cytokiny nie interferuje znacznie ze zdolnością białka do wiązania swojego receptora (receptorów) tzn. jeśli tempo i/lub ilość wiązania koniugowanego białka do receptora wynosi nie mniej niż około 40%, około 50%, około 60%, około 65%, około 70%, około 75%, około 80%, około 90%, około 91%, około 92%, około 93%, około 94%, około 95%, około 96%, około 97%, około 98%, około 99% lub około 100% lub więcej tempa wiązania i/lub ilości odpowiedniej cytokiny, chemokiny, czynnika wzrostu lub hormonu polipeptydowego, który nie był koniugowany. Także włączone w zakres tego wynalazku są koniugaty polimerów tych białek wiążących receptor, które są klasyfikowane jako zarówno białka wiążące receptor „RN” i „RG”. Dwa przykłady tych ostatnich białek to interferon-heta (szczególnie interferon-heta-1b) i IL-2.
W dodatkowych wykonaniach, wynalazek dostarcza sposoby syntezy koniugatów polimerowych białek wiążących receptor, które zachowują nieoczekiwanie wysoką aktywność wiązania receptora względem koniugatów polimerowych tego samego białka wiążącego receptor, w którym jeden lub więcej polimerów jest przyłączonych losowo. Wynalazek także dostarcza koniugaty produkowane takimi sposobami i kompozycje zawierające jeden lub więcej takich koniugatów według wynalazku, które mogą dalej zawierać jeden lub więcej dodatkowych składników lub odczynników, takich jak jedna lub więcej soli buforowych, jedna lub więcej zaróbek węglowodanowych, jedno lub więcej białek nośnikowych, jeden lub więcej enzymów, jeden lub więcej detergentów, jedna lub więcej cząsteczka kwasu nukleinowego, jeden lub więcej polimerów takich jak niekoniugowany PEG lub glikol polietylenowy i tym podobnie. Wynalazek także dostarcza zestawy zawierające koniugaty i/lub kompozycje według wynalazku.
Wynalazek także dostarcza kompozycje farmaceutyczne lub weterynaryjne obejmujące koniugaty według wynalazku i przynajmniej jedną zaróbkę lub nośnik, która jest dopuszczalna do zastosowań farmaceutycznych lub weterynaryjnych. Wynalazek także dostarcza sposoby leczenia lub zapobiegania szeregu zaburzeń fizycznych stosując takie kompozycje, obejmujące podanie skutecznej ilości jednego lub więcej koniugatów lub kompozycji według wynalazku zwierzęciu cierpiącemu na lub mającemu predyspozycję do zaburzenia lub stanu fizycznego.
Dalej wynalazek dostarcza stabilizowane białka wiążące receptor i sposoby ich produkcji do stosowania w przemysłowej hodowli komórek, przez co uzyskuje się nieoczekiwanie wysokie moce działania w wyniku kombinowanego wpływu znacznego zachowania bioaktywności i większego czasu trwania działania w zastosowaniu przemysłowym. Niezwykle wysokie moce działania koniugatów we14
PL 219 741 B1 dług wynalazku mogą znaleźć odbicie w niezwykle wysokiej produkcji biomasy, niezwykle wysokich poziomach ekspresji zrekombinowanych białek i innych ulepszeń wydajności bioprocesingu.
W dodatkowych wykonaniach wynalazek dostarcza alternatywne sposoby zwiększania mocy biologicznej preparatu interferonu-beta, szczególnie preparatu interferonu-beta-1b. Sposoby według tego aspektu wynalazku mogą obejmować na przykład usunięcie jednego lub więcej składników hamujących z preparatu interferonu-beta (lub interferonu-beta-1b). Według tego aspektu wynalazku, jeden lub więcej składników inhibitorowych może być usuniętych z preparatów za pomocą szeregu znanych w dziedzinie sposobów obróbki, analizy białka i peptydów, obejmujące na przykład chromatografię wykluczania wielkości, chromatografię odwróconej fazy, chromatografię interakcji hydrofobowych i chromatografię powinowactwa. Jako zagadnienie praktyczne, oznaczenie mocy biologicznej danego preparatu interferonu-beta (tzn. czy moc jest zwiększona, zmniejszona lub niezmieniona względem wzorcowego roztworu interferonu-beta) można uzyskać za pomocą szeregu oznaczeń in vitro lub in vivo znanych osobie o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie. Na przykład oznaczenie w hodowli komórek, która odpowiada na interferon-beta może być stosowane do oznaczenia mocy biologicznej preparatów interferonu-beta. Nieograniczające przykłady odpowiednich oznaczeń w hodowlach komórkowych obejmują oznaczenia antyproliferacyjne, oznaczenia antywirusowe, oznaczenia transdukcji sygnału i oznaczenia aktywacji genów, których przykłady są dobrze znane osobom o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie.
W pokrewnych wykonaniach, wynalazek także dostarcza sposoby określenia ilości polimeru, który jest przyłączony do końca aminowego białka, mającego N-końcową resztę seryny, w koniugacie polimer-białko syntetyzowanym za pomocą redukcyjnej alkilacji. Sposoby według tego aspektu wynalazku obejmują, na przykład, (a) reakcję koniugatu z dostateczną ilością czynnika utleniającego aby odciąć polimer od reszty serynowej białka; i (b) pomiar zwiększenia części nieskoniugowanego białka w preparacie. Białka odpowiednie do stosowania zgodnie z takimi sposobami obejmują, ale nie są ograniczone do, cytokiny (obejmujące interferon-beta (szczególnie interferon-beta-1b, który korzystnie ma sekwencją aminokwasów podaną w SEQ ID NO: 1) i czynnik wzrostu i rozwoju megakariocytów (Guerra, P.I. i wsp., (1998) Pharm Res 15:1822-1927, którego ujawnienie jest tu niniejszym włączone w formie odniesienia). Czynnik utleniający stosowany w pewnych takich sposobach według wynalazku może być nadjodanem, obejmując, ale nie ograniczone do, metanadjodan sodu, metanadjodan potasu, metanadjodan litu, nadjodan wapnia, nadjodan baru i kwas nadjodowy. Odpowiednie sposoby pomiaru zwiększenia porcji nieskoniugowanego białka w preparacie obejmują szereg sposobów znanych w dziedzinie analizy białka i peptydów, obejmujące na przykład chromatografię wykluczania wielkości, chromatografię odwróconej fazy, elektroforezę w żelu, elektroforezę kapilarną, ultrawirowanie, ultrasączenie, rozpraszanie światła i spektrografię masową.
W dodatkowych pokrewnych wykonaniach, wynalazek dostarcza sposoby selektywnego oksydacyjnego cięcia N-końcowej reszty seryny bioaktywnego białka bez utleniania funkcjonalnie niezbędnych reszt aminokwasów tego białka bioaktywnego. Pewne takie sposoby według wynalazku obejmują, na przykład, (a) doprowadzenie stężenia jonów wodorowych w roztworze bioaktywnego białka do pH między około 5 i około 10, bardziej korzystnie pH między około 7 i około 8; (b) zmieszanie roztworu bioaktywnego białka z około 0,1 mola do około 10 moli, lub bardziej korzystnie około 0,5 mola do około 5 moli, nadjodanu na mol bioaktywnego białka; i (c) inkubację tej mieszaniny przez przynajmniej jedną godzinę, korzystnie w temperaturze między około 2°C i około 40°C. Białka odpowiednie do stosowania z takimi sposobami obejmują, ale nie są ograniczone do, cytokiny (obejmujące interferon-beta (szczególnie interferon-beta-1b, który ma korzystnie sekwencję podaną w SEQ ID NO: 1).
Metody
Obecni wynalazcy odkryli, że adresowanie polimerów do aminokońcowego aminokwasu białka wiążącego receptor „RN” lub w pobliżu miejsca glikozylacji białka wiążącego receptor „RG” zapewnia, że polimer jest przyłączony w miejscu odległym od jednego lub więcej regionów lub domen wiążących receptor białka, w ten sposób minimalizując zawadę przestrzenną interakcji z receptorem przez przyłączone cząsteczki polimeru. W efekcie w koniugowanych białkach może być zachowany wyższy procent aktywności wiążącej receptor według sposobów tego wynalazku niż może być zachowany, jeśli polimer byłby przyłączony w obrębie lub w pobliżu części cząsteczki, która bierze udział we wiązaniu swojego receptora (receptorów). Ta zasada, która może dać nieoczekiwanie wysokie zachowanie aktywności wiązania receptora może być wykazana dla białek wiążących receptor, które są wybrane z następujących: zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów („bFGF” lub „FGF-2”), nabłonkowy czynnik wzrostu („EGF”), insulinopodobny czynnik wzrostu 1 („IGF-1”), interferon-alfa („IFN-alfa”), interferonPL 219 741 B1
-beta („IFN-beta”, obejmujący ale nie ograniczony do, IFN-beta-1b), czynnik stymulujący kolonie granulocytów-makrofagów („GM-CSF”), czynnik stymulujący kolonie monocytów („M-CSF”), ligand Flt3, czynnik komórek macierzystych („SCF”), interleukiny 2, 3, 4, 6, 10, 12, 13 i 15, transformujący czynnik wzrostu beta („TGF-beta”), ludzki czynnik wzrostu („hGH”), prolaktyna, łożyskowy hormon laktogenny, rzęskowy czynnik neurotroficzny („CNTF”), Ieptyna i strukturalne analogi tych białek wiążących receptor, które imitują działanie tych białek lub są ich wiążącymi receptor antagonistami. W przeciwieństwie, nie przewiduje się, by selektywne przyłączenie dużego polimeru do końca aminowego IFN-gamma zachowało większość aktywności tej cytokiny, ponieważ oczekuje się, że takie przyłączenie będzie interferowało z wiązaniem aktywnego dimeru do jego receptorów (oparte o dane Walter, M.R. i wsp., (1995) Nature 376:230-235).
W takim pokrewnym wykonaniu wynalazku, polimery są przyłączane do reszty aminokońcowej mutein białek wiążących receptor, które działają jako kompetycyjni antagoniści naturalnego białka przez wiązanie do jednego lub więcej receptora bez inicjacji transdukcji sygnału. Przykładami są koniugaty polimerów antagonisty hGH, który zawiera mutację punktową G120R (Sundstroem, M. i wsp., (1996) J Biol Chem 271:32197-32203) i antagonista prolaktyny, który zawiera mutację punktową G129R (Goffin, V. i wsp., (1997) J Mammary Gland Biol Neoplasia 2:7-17; Chen, W.Y. i wsp. (1999) Clin Cancer Res 5:3583-3593; Chen, W.Y., Publikacja PCT Nr WO 99/58182 A1). Inni antagoniści białek wiążących receptor mogą być produkowani przez selektywne mutacje punktowe, skrócenia lub delecje (patrz np. Tchelet, A. i wsp., (1997) Mol Cell Endocrinol 130:141-152; Petersom, F.C., (1998) Identification of Motifs Associated with the Lactogenic and Somatotropic Activities of Human Growth Hormone, rozprawa doktorska, Ohio State University, UMI Nr 9822357).
W dodatkowych wykonaniach wynalazku dla białek wiążących receptor „RG” sposoby według wynalazku dają wiązanie jednego lub więcej syntetycznych polimerów w pobliżu naturalnego miejsca przyczepu reszt węglowodanowych tych białek wiążących receptor, które są glikoproteinami. To daje „pseudoglikozylację” tych białek wiążących receptor (na przykład gdy były wyrażane za pomocą technologii rekombinacji DNA w E. coli lub innych komórkach prokariotycznych, które nie przeprowadzają glikozylacji posttranslacyjnej) lub daje „pseudohiperglikozylację” ich form glikoproteinowych (na przykład dla naturalnie produkowanych glikoprotein lub glikoprotein produkowanych przez eukariotyczne komórki gospodarza (np. drożdże, komórki roślinne i komórki zwierzęce (obejmujące komórki ssaków i owadów), które przeprowadzają glikozylację posttranslacyjną). Przykładami są koniugaty interferonów-alfa i beta jak i erytropoetyny („Epo”) i interleukiny-2. Przyłączenie syntetycznych polimerów w lub w pobliżu miejsc naturalnej glikozylacji może być przeprowadzone za pomocą dowolnego sposobu znanego w dziedzinie, obejmując metodę mutacyjną R.J. Goodson i wsp., ((1990) Biotechnology 8:343346) i metodę R.S. Larson i wsp. ((2001) Bioconjug Chem 12:861-869), która obejmuje uprzednią oksydację węglowodanu; ujawnienia tych odnośników są tu włączone w całości w formie odniesienia.
Amino-końcowa modyfikacja pewnych białek była ujawniona uprzednio (patrz np. Dixon, H.B.F., (1984) J Protein Chem 3:99-108). Na przykład opisano, że N-terminalna modyfikacja białek stabilizuje pewne białka na działanie aminopeptydaz (Guerra, P.J. i wsp., powyżej) poprawia rozpuszczalność białka (Hinds, K. i wsp. (2000) Bioconjug Chem 11:195-201), zmniejsza ładunek na N-końcowej grupie aminowej, lub poprawia homogenność powstałych koniugatów (Kinstler, O, i wsp., Patent Europejski Publikacja Nr EP 0 822 199 A2; Kinstler, O. i wsp., (2002) Adv Drug Deliv Rev 54:477-485), między innymi. Alternatywna metoda przyłączania polimerów do grupy alfa aminowej N-końcowej reszty cysteiny lub histydyny przez adaptację procedury znanej w dziedzinie jako „natywna ligacja chemiczna” została ujawniona (Roberts, M.J. i wsp. Publikacja Patentowa PCT Nr WO 03/031581 A2 i Zgłoszenie Patentowe US Publikacja Nr 2003/0105224, których ujawnienia są tu włączone w całości w formie odniesienia). Jednak istnienie podklas „RN” i „RG” białek wiążących receptor, ogólnie stosowalne metody selekcji tych członków tych klas i zastosowanie koniugatów polimerowych takich białek wiążących receptory jako sposób zachowania nieoczekiwanie wysokiej aktywności funkcjonalnej białek wiążących receptor „RN” nie były uprzednio stwierdzone ani opisane.
Tak więc istnieje zaleta określenia czy dana cytokina, ma - czy nie ma - N-koniec i/lub miejsce (miejsca) glikozylacji, które są odległe od miejsca (miejsc) wiązania receptora ligandu. Zdolność przewidywania czy dana cytokina jest ligandem „RN” czy „RG” przed koniugacją ligandu z polimerem znacząco zmniejsza eksperymentowanie wymagane do produkcji koniugatów polimer-ligand (np. cytokin lub ich antagonistów koniugowanych z polimerami np. PEG), w których antygenowość i immunogenność koniugatu jest obniżona względem antygenowości/immunogenności niekoniugowanego ligandu,
PL 219 741 B1 zarazem nie zmniejszając znacznie aktywności wiązania receptora i fizjologicznych koniugowanego ligandu.
Tak więc w dodatkowych wykonaniach obecny wynalazek dostarcza metody identyfikacji i selekcji ligandów białek wiążących receptor (np. cytokin lub ich antagonistów), które mają N-koniec i/lub miejsce (miejsca) glikozylacji, które są odległe od miejsc wiązania receptora ligandów białkowych (tzn. metody identyfikacji i selekcji białek „RN” lub „RG”). W pewnych wykonaniach wynalazku optymalna lokalizacja dla koniugacji jednego lub więcej polimerów (np. jednego lub więcej PEG) może być określona za pomocą modelowania molekularnego ηρ. przez oglądanie 3-wymiarowej struktury białka (cytokiny lub jej antagonisty) stosując oprogramowanie do modelowania molekularnego do przewidywania lokalizacji, w której (których) jeden lub więcej polimerów może być przyłączonych do białka bez znaczącej utraty aktywności biologicznej lub wiązania receptora białka (patrz też Schein, C.H., powyżej). Analogiczne podejście było wykazane, na przykład, dla koniugacji PEG do G-CSF w próbie poprawienia jego oporności na trawienie proteolityczne (patrz opublikowane Zgłoszenie US Nr 2001/0016191 A1 T.D. Osslund, którego ujawnienie jest tu włączone w całości w formie odniesienia). Odpowiednie oprogramowanie do modelowania molekularnego do stosowania w obecnym wynalazku takie jak RASMOL (Sayle i wsp., powyżej) i inne programy stosowane w generowaniu bazy danych struktur makromolekularnych zdeponowane w Protein Data Bank (PDB, patrz Laskowski, R.A. i wsp., powyżej) są dobrze znane w dziedzinie i będą znane osobom o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie. Stosując takie oprogramowanie molekularne, trójwymiarowa budowa polipeptydu, np. cytokiny lub jej antagonisty może być przewidziana i określona z wysokim poziomem ufności, w oparciu o krystalograficzną analizę ligandów i ich receptorów. W ten sposób, osoba o przeciętnych umiejętnościach może łatwo określić, które ligandy są ligandami „RN” lub „RG”, które są odpowiednie do stosowania zgodnie z wynalazkiem.
Aby praktykować obecny wynalazek jedną wygodną drogą przyłączenia kowalencyjnego rozpuszczalnego w wodzie polimeru do grupy alfa aminowej N-końcowej reszty aminokwasu jest przez redukcyjną alkilację zasad Schiffa tworzonych z polimerami niosącymi pojedynczą grupę aldehydową, np. jak zastrzega G.P. Roher (Patent US Nr 4,002,531) ale nie jak zastrzega J.M. Harris (Patent US Nr 5,252,714) ponieważ ci ostatni wynalazcy zastrzegają tylko polimery derywatyzowane na obu końcach grupami aldehydowymi, które są czynnikami sieciującymi więc słabo nadają się do syntezy długo działających białek wiążących receptor, które nadal zachowują znaczną aktywność wiązania receptora.
Skierowanie redukcyjnej alkilacji zasad Schiffa monoaldehydów PEG do grupy alfa aminowej N-końcowego aminokwasu białka wiążącego receptor i od grup epsilon aminowych jego reszt lizyny można uzyskać za pomocą szeregu sposobów, opartych na ujawnieniach w J.T. Edsall w rozdziałach 4 i 5 Proteins Amino Acids and Peptides as Ions and Dipolar Ions ((1943), Reinhold Publishing Corporation, New York), którego ujawnienie jest tu włączone w całości w formie odniesienia. Oczekuje się, że stała dysocjacji kwasowej („pKa”) grupy alfa aminowej N-końcowego aminokwasu polipeptydu będzie poniżej 7,6, podczas gdy oczekuje się, że wartości pKa grup epsilon aminowych reszt lizyny w polipeptydach będą około 9,5. Edsall ((1943), powyżej) jasno podał, że aldehydy będą się łączyły z grupą aminową aminokwasu „tylko po stronie alkalicznej jego punktu izoelektrycznego”.
Tak więc w oparciu o to ujawnienie i informację, która jest łatwo dostępna w dziedzinie, osoba o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie łatwo stwierdzi, że (1) selektywna reakcja aldehydów z grupą alfa aminową białka będzie faworyzowana przez zakres pH, który jest poniżej 9,5 (w przybliżeniu pKa grup epsilon aminowych białka); (2) tempo reakcji aldehydów z grupami epsilon aminowymi obniży się jeśli pH reakcji będzie obniżone w stronę 7,6 (w przybliżeniu pKa grupy alfa aminowej białka); (3) szybkość reakcji aldehydów z grupą alfa aminową będzie zmniejszać się mniej niż ta dla grup epsilon aminowych gdy pH reakcji jest obniżane do 7,6 i (4) selektywność dla reakcji aldehydu z grupą alfa aminową będzie nieco poprawiona przez obniżenie pH do 6,6. Ponieważ ta ostatnia wartość jest w przybliżeniu jedną jednostkę pH poniżej pKg grupy alfa aminowej i trzy jednostki pH poniżej pKa grup epsilon aminowych około 10% grup alfa aminowych i około 0,1% grup epsilon aminowych będzie w swoim reaktywnym, nieprotonowanym stanie. Tak więc przy pH 6,6 frakcja nieprotonowanych grup alfa aminowych jest 100 razy wyższa niż frakcja nieprotonowanych grup epsilon aminowych. Tak więc uzyska się bardzo niewielki wzrost selektywności przez dalsze obniżenie pH reakcji np. do 5,6 gdzie teoretycznie 1% grup alfa aminowych i 0,01% grup epsilon aminowych będzie w swoim reaktywnym, nieprotonowanym stanie. Tak więc w pewnych wykonaniach wynalazku, ligandy białkowe (w szczególności ligandy „RN” lub „RG”, obejmujące cytokiny i ich antagonistów) są koniugowane z jednym lub więcej polimerów przez tworzenie mieszaniny między ligandem (ligandami) i jednym lub więcej poliPL 219 741 B1 merem w pH około 5,6 do około 7,6; pH około 5,6 do około 7,0; pH około 6,0 do około 7,0; pH około 6,5 do około 7,0; pH około 6,6 do około 7,6; pH około 6,6 do około 7,0; lub w pH około 6,6. Obecne sposoby różnią się więc znacząco od tych znanych w dziedzinie, w których przyłączanie polimerów do grup alfa aminowych na N-końcowych resztach aminokwasów ligandów są przeprowadzane w pH około 5 (Kinstler, O. i wsp., powyżej, EP 0 822 199 A2; Patenty US Nr 5,824,784 i 5,985,265; Roberts,
M.J. i wsp., (2002) powyżej; Delgado, C. i wsp., Zgłoszenie Patentowe US Publikacja Nr 2002/0127244 A1), podczas gdy przyłączanie polimerów do grup epsilon aminowych reszt lizyny w szkielecie polipeptydowym ligandu przeprowadza się w pH 8,0 (Kinstler, O. i wsp., (2002) powyżej, EP 0 822 199 A2; Patenty US Nr 5,824,784 i 5,985,265). W ten sam sposób obecne metody są także znacząco odrębne od metod enzymatycznych, które były stosowane do przyłączania pochodnych alkiloaminowych glikolu polietylenowego do pewnych białek stosując transglutaminazę, co jest przeprowadzane w pH 7,5 (Sato, H., (2002), Adv Drug Deliv Rev 54:487-504).
Redukcja powstałych zasad Schiffa łagodnymi czynnikami redukującymi takimi jak cyjanoborowodorek sodu lub boran pirydyny (Cabacungan, J.C. i wsp., (1982) Anal Biochem 124: 272-278) tworzy drugorzędowe wiązania aminowe, które zachowują dodatni ładunek N-końcowej grupy alfa aminowej białka w fizjologicznym pH. Takie wiązania, które zachowują ten sam ładunek jak natywne białko mają większą szansę zachowania jego aktywności biologicznej niż alternatywne chemie wiązania, które zobojętniają ładunek np. przez tworzenie wiązań amidowych (Burg, J. i wsp., Publikacja PCT Nr WO 02/49763 A2; Kinstler, O. i wsp., Europejskie Zgłoszenie Patentowe Nr EP 0822 199 A2; Kinstler, O. i wsp., (1996) Pharm Res, 13:996-1002; Kita, Y. i wsp., powyżej) lub wiązania uretanowe (Gilbert, C.W. i wsp., Patent US Nr 6,042,822; Grace, M. i wsp., (2001) J Interferon Cytokine Res 21:1103-1115; Youngster, S. i wsp., (2002) Curr Pharm Des 8:2139-2157).
Alternatywne podejścia do selektywnego przyłączania polimerów do N-końcowych reszt aminokwasów są znane osobom biegłym w dziedzinie. Objęte są sposoby przyłączania hydrazydów, hydrazyn, semikarbamidów lub innych polimerów zawierających aminy do N-końcowych reszt seryny lub treoniny, które były oksydacyjnie przecięte do aldehydów nadjodanem (Dicon, H.B.F., powyżej; Geoghegan, K.F., Patent US Nr 5,362,852; Gaertner, H.F. i wsp., (1996) Bioconjug Chem 7:38-44; Drummond, R.J. i wsp., Patent US Nr 6,423,685).
Odpowiednie polimery
W pewnych wykonaniach wynalazku jest pożądana minimalizacja tworzenia usieciowań między cząsteczkami i w obrębie cząsteczki przez polimery takie jak PEG w czasie reakcji, w której polimer jest przyłączany do składnika bioaktywnego aby wyprodukować koniugaty według wynalazku. Można to uzyskać przez stosowanie polimerów, które są aktywowane tylko na jednym końcu (określane tutaj jako „monofukcyjnie aktywowane PEG” lub „monofunkcyjnie aktywowane PAG”) lub preparatów polimerów, w których procent bifunkcyjnie aktywowanych (określanych w przypadku liniowych PEG jako „bisaktywowane diole PEG”) lub multifunkcyjnie aktywowanych polimerów jest mniej niż około 30% lub bardziej korzystnie mniej niż około 10% i najbardziej korzystnie mniej niż około 2% (masa/masa). Zastosowanie aktywowanych polimerów, które są całkowicie lub nieomal całkowicie monofunkcyjne może minimalizować wytwarzanie wszystkiego co następuje: wewnątrzcząsteczkowych połączeń w obrębie pojedynczych cząsteczek białek, struktur „hantli”, w których jedna nić polimeru łączy dwie cząsteczki białka i większych agregatów lub żeli.
Aktywowane formy polimerów, które są odpowiednie dostosowania w metodach i kompozycjach wynalazku obejmują dowolne liniowe lub rozgałęzione monofunkcyjne formy polimerów, które są znane w dziedzinie. Na przykład włączone są takie o masach cząsteczkowych w zakresie około 1 kDa do około 100 kDa. Odpowiednie zakresy mas cząsteczkowych obejmują, ale nie są ograniczone do, około 5 kDa do około 30 kDa; około 8 do około 14 kDa; około 10 kDa do około 20 kDa; około 18 kDa do około 60 kDa; około 18 do około 22 kDa; około 12 kDa do około 30 kDa; około 5 kDa, około 10 kDa, około 20 kDa lub około 30 kDa. W przypadku liniowych PEG masy cząsteczkowe około 10 kDa, około 20 kDa lub około 30 kDa odpowiadają stopniom polimeryzacji (n) około 230, około 450 lub około 680 monomerycznych jednostek tlenku etylenu, odpowiednio. Należy zauważyć, że długo przed rozpoznaniem istnienia klas „RN” i „RG” białek wiążących receptory, zalety przyłączania terapeutycznych białek do polimerów mających stosunkowo wysokie masy cząsteczkowe (tzn. > 20-30 kDa) były ujawnione po raz pierwszy (Saifer, M. i wsp., Publikacja PCT Nr WO 89/01033 A1, opublikowana 9 lutego, 1989, która jest tu włączona w całości w formie odniesienia).
W innych wykonaniach wynalazku koniugaty białek wiążących receptor z niezwykle wysokimi procentami zachowanej bioaktywności mogą być przygotowane do stosowania in vitro np. w hodowli
PL 219 741 B1 komórkowej przez połączenie monofunkcyjnie aktywowanych polimerów około 1 kDa, około 2 kDa lub około 5 kDa według sposobów wynalazku. Do takich zastosowań in vitro ten niższy zakres mas cząsteczkowych może być korzystny.
Dowolnie liniowy polimer może mieć reaktywną grupę na jednym końcu lub dwóch końcach w ten sposób tworząc „reaktywny polimer”. W pewnych wykonaniach wynalazku może być pożądane stosowanie estru N-hydroksysukcynoimidowego pochodnej kwasu monopropionowego PEG, jak ujawniono w J.M, Harris i wsp., Patent US 5,672,662, który jest tu włączony w całości w formie odniesienia lub innych aktywowanych N-hydroksysukcynoimidem monokarboksylowych kwasów PEG W pewnych innych wykonaniach może być pożądane stosowanie albo pochodnych węglanu monosukcynoimidylu PEG („S.C.-PEG”) jak opisano w M. Saifer i wsp., Patenty US Nr 5,006,333;5,080,891; 5,283,317 i 5,468,478 lub mono-p-nitrofenylową pochodną PEG, jak ujawniono w S.J, Kelly i wsp., powyżej; w L.D. Williams i wsp., Publikacja PCT Nr WO 00/07629 A2; L.D. Williams i wsp., Patent US Nr 6, 576,235 i w M.R. Sherman i wsp., Publikacja PCT Nr WO 01/59078 A2. Co więcej, inne typy reaktywnych grup mogą być stosowane do syntezy koniugatów polimerów białek. Te pochodne obejmują, ale nie są ograniczone do, monoaldehydowe pochodne PEG (Royer, G.P., Patent US Nr 4,002,531; Harris, J.M. i wsp., Patent US Nr 5,252,714) monoamina, węglan monotribromofenylu, monokarbonyloimidazol, węglan monotrichromofenylu, węglan monotrifluorofenylu, monohydrazyd, monosemikarbazyd, monokarbazan, monotiosemikarbazyd, monojodoacetamid, monomaleimid, disiarczek monoortopirydylu, monooksym, monofenyloglioksal, mono-tiazolidyno-2-tion, monotioester, monotiol, monotriazyna i monowinylosulfonowe pochodne PEG. W dodatkowych wykonaniach cytokiny, chemokiny, czynniki wzrostu, hormony polipeptydowe i ich antagoniści mogą być połączone do jednego lub więcej polimerów jak opisano we wspólnie posiadanym równocześnie zgłoszonym Zgłoszeniu Patentowym US Nr 10/669,597, którego ujawnienie jest tu włączone w całości w formie odniesienia.
Składniki bioaktywne
Jak zanotowano powyżej, koniugaty według wynalazku obejmują jeden PAG lub PAO, i w szczególności jedną nić PEG kowalencyjnie przyłączoną do jednego lub więcej składników bioaktywnych. Bioaktywne składniki, do których kowalencyjnie przyłączono jeden lub więcej polimerów (lub ich nici) są tu w różny sposób określane równoważnie jako „koniugowane składniki bioaktywne” lub „modyfikowane składniki bioaktywne”. Te określenia mają być tu odróżnione od „niekoniugowanych składników bioaktywnych”, „wyjściowych składników bioaktywnych” lub „niezmodyfikowanych składników bioaktywnych”, które to wszystkie terminy dotyczą bioaktywnych składników, które nie mają przyłączonych do siebie kowalencyjnie polimerów. Należy jednak rozumieć, że bioaktywny składnik „niekoniugowany”, „niemodyfikowany” lub „wyjściowy” może zawierać inne, niepolimerowe koniugaty lub modyfikacje w porównaniu z cząsteczką typu dzikiego lub natywną i by nadal był uważany za „niekoniugowany”, „niemodyfikowany lub „wyjściowy” w zgodzie z tym wynalazkiem ponieważ składnik bioaktywny byłby „niekoniugowany”, „niemodyfikowany” lub „wyjściowy” względem przyłączenia polimerów co ma miejsce dla składników bioaktywnych, które są tu określane jako „pozornie PEGylowane”.
Określenie „stabilizujący” składnik bioaktywny (lub „metody stabilizacji” czy „stabilizowany składnik bioaktywny”) wskazuje, że składnik bioaktywny został stabilizowany według metod tego wynalazku (tzn. składnik bioaktywny, do którego został kowalencyjnie przyłączony polimer według sposobów wynalazku). Takie stabilizowane składniki bioaktywne będą wykazywały pewne zmienione cechy w porównaniu ze składnikiem bioaktywnym, który nie został zmodyfikowany (tzn. składnikiem bioaktywnym, do którego nie został kowalencyjnie przyłączony polimer). Wśród takich zmienionych parametrów biochemicznych i biofizycznych, w szczególności dla białek wiążących receptory, może być zmniejszona podatność na degradację proteolityczną i w szczególności utrzymanie aktywności białka wiążącego receptor w czasie inkubacji w pewnych ostrych warunkach środowiska lub eksperymentalnych. W pewnych wykonaniach wynalazku zmienione parametry biochemiczne i biofizyczne mogą obejmować, na przykład, zwiększony okres połowicznego rozpadu w krwiobiegu, zwiększoną biodostępność, zwiększony czas działania in vitro i tym podobne.
Dowolne białko wiążące receptor (typowo cytokina) mające aktywność biologiczną (tzn. fizjologiczną, biochemiczną lub farmaceutyczną) związaną z częściami cząsteczki, które są odległe od końca aminowego lub od naturalnie istniejącego lub wprowadzonego za pomocą mutacji miejsca glikozylacji może być odpowiednio stosowane jako wyjściowy składnik w tym wynalazku. Takie bioaktywne składniki obejmują, ale nie są ograniczone do, peptydy, polipeptydy, białka i tym podobne, w szczególności takie fragmenty, muteiny i pochodne mające aktywność biologiczną (tzn. fizjologiczną, biochemiczną lub farmaceutyczną).
PL 219 741 B1
Odpowiednie peptydy, polipeptydy i białka, glikoproteiny i tym podobne, które są pożyteczne jako związki bioaktywne obejmują dowolny peptyd, polipeptyd lub białko itd. mające jedną lub więcej niż jedną grupę aminową, grupę tiolową lub inną grupę, która jest odległa od regionu lub regionów wiążących składnika bioaktywnego i do którego mogą być selektywnie przyłączone polimery. Takie peptydy, polipeptydy, białka, glikoproteiny i tym podobne obejmują cytokiny, które mogą mieć różną budowę (Nicola, N.A., powyżej; Schein, C.H., powyżej).
Na przykład odpowiednie interesujące peptydy, polipeptydy i białka obejmują, ale nie są ograniczone do, klasy cytokin mających strukturę czterech wiązek a-helis (zarówno podklasy z długimi łańcuchami i krótkimi łańcuchami) (przegląd patrz Schein, C.H., powyżej). Szereg takich białek z czterema wiązkami helikalnymi jest odpowiednich do stosowania w tym wynalazku obejmując, ale nie ograniczone do, interleukiny, np. IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 (podjednostka p35), IL-13, IL-15, IL-17; czynniki stymulujące kolonie, np. czynnik stymulujący kolonie makrofagów (M-CSF) i czynnik stymulujący kolonie granulocytów (G-CSF; Rozwarski, D.A. i wsp., 1996 Proteins 26:304-313); interferony, np. IFN-a, IFN-β (obejmujący, ale nie ograniczony do, IFN^-1b) i konsensusowy IFN; czynnik hamujący białaczkę (LIF); erytropoetynę (Epo); trombopoetynę (Tpo), czynnik wzrostu i rozwoju megakariocytów (MGDF); czynnik komórek macierzystych (SCF), także znany w dziedzinie jako Steel Factor (Morrissey, P. i wsp., (1994) Cell Immunol 157:118-131; McNiece, I.K. i wsp., (1995) J Leukoc Biol 58:14-22); onkostatynę M (OSM), białko aktywujące fosfolipazę (PLAP), czynniki neurotroficzne; i ich peptydowe mimetyki. Choć prolaktyna i hormon wzrostu są klasycznymi hormonami, które krążą w całym organizmie, w odróżnieniu od cytokin, które są na ogół produkowane w pobliżu swoich docelowych komórek, prolaktyna i hormon wzrostu należą do tej samej klasy strukturalnej jak cytokiny z czterema wiązkami a-helis (Nicola, N.A., powyżej; Goffin, V. i wsp., powyżej) i są podobnie odpowiednimi celami dla przyłączania polimerów i produkcji obecnych koniugatów zgodnie z wynalazkiem.
Białka wiążące receptory z klas strukturalnych kartki β lub baryłki β (przegląd patrz Schein, C.H., powyżej) są także odpowiednie do stosowania w przygotowaniu koniugatów i kompozycji według wynalazku. Obejmują one, ale nie są ograniczone do: rodzinę cytokin czynnika martwicy guzów np. TNF -a, TNF-β i ligandy Fas, które wykazują struktury rolady β; IL-1 (obejmujący IL-1 a i IL-1β) i FGF (obejmujący zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF), kwaśny FGF, FGF-4 i czynnik wzrostu keratynocytów (KGF; FGF-7), rodziny, które wykazują zwinięcie beta-trójlistne (Schein, C.H., powyżej), Schlessinger, J. i wsp., powyżej); IL-12, IL-16, nabłonkowy czynnik wzrostu (EGF; Lu, H.-S. i wsp., powyżej); i czynniki wzrostu pochodzące od płytek (PDGF), transformujące czynniki wzrostu (obejmujące transformujący czynnik-a i transformujący czynnik-β (TGF-β)) i czynniki wzrostu nerwów, które przyjmują struktury węzła cystynowego.
Dodatkowa klasa strukturalna białek, które są korzystnie stosowane w koniugatach i kompozycjach według wynalazku to klasa bogatych w dwusiarczki mieszanych cytokin i czynników wzrostu α/β (przegląd patrz Schein, C.H., powyżej) obejmujące ale nie ograniczone do, rodzinę EGF, która ma strukturę beta meandru; IL-8; RANTES; peptyd-2 aktywujący neutrofile (NAP- 2), czynnik 1 a pochodzący ze zrębu (SDF-1 a); białka chemoatraktantów monocytów (MCP-1, MCP-2 i MCP-3); eotaksyny (np. eotaksyna-1, eotaksyna-2 i eotaksyna-3), czynnik-1 hamujący prekursory szpiku (MPIF-1; aktywność stymulującą związaną z wzrostem onkogen/czerniak (GRO-a/MGSA); somatomedyny; i insulinę i insulinopodobne czynniki wzrostu (np, IGF-1 i IGF-2). Pokrewna klasa strukturalna białek do stosowania w koniugatach i kompozycjach według wynalazku to cytokiny ze strukturami mozaikowymi, które obejmują czynniki wzrostu takie jak IL-12 i czynnik wzrostu hepatocytów (Nicola, N.A., powyżej).
Inne interesujące białka obejmują, ale nie są ograniczone do: czynniki wzrostu (w szczególności ludzki hormon wzrostu (hGH; patrz Tchelet, A, i wsp., (1997) Mol. Cell Endocrinol 130:141-152) i jego antagonistów (patrz Sundstroem, M. i wsp., powyżej), prolaktynę i jej antagonistów, gonadotropinę kosmówkową, hormon folikulotropowy, hormon stymulujący tarczycę, hormony barwnikowe, czynniki uwalniające podwzgórza, hormony antydiuretyczne i wiążący receptory antagoniści cytokin i czynników wzrostu wszystkich powyższych klas strukturalnych. Wiele takich białek istnieje zarówno w formach glikozylowanych i nieglikozylowanych. Nieglikozylowane formy mogą wynikać z ich produkcji stosując techniki rekombinowanego DNA u prokariontów lub stosując syntezę chemiczną. Takie nieglikozylowane produkty są wśród peptydów i białek, które są odpowiednimi składnikami bioaktywnymi obecnego wynalazku. Na koniec, choć pewne przeciwciała działają jako agoniści lub antagoniści wiążący receptor (patrz np. Morris, J.C. i wsp., (2000) Ann Rheum Dis 59 (Suppl I): 1109-1114), takie immunoglobuliny nie są odpowiednimi kandydatami dla przyłączania N-końcowych polimerów w za20
PL 219 741 B1 kresie tego wynalazku, tzn. nie są białkami wiążącymi receptor RN, ponieważ aminokońcowe regiony zarówno lekkiego i ciężkiego łańcucha biorą udział w rozpoznawaniu antygenu.
Szczególnie korzystne do stosowania jako składniki bioaktywne do przygotowania koniugatów według wynalazku są interferon-alfa, interferon-beta, IL-2, IL-4, IL-10, hGH, prolaktyna, insulina, IGF-1, EGF, bFGF i erytropoetyna (Epo). Także szczególnie użyteczne są muteiny i fragmenty takich składników bioaktywnych, w szczególności te zdolne do wiązania do receptorów dla odpowiedniego polipeptydu typu dzikiego lub nienaruszonego, niezależnie od tego czy to wiązanie powoduje efekt biologiczny czy fizjologiczny. W pewnych wykonaniach muteiny i fragmenty składników bioaktywnych mogą działać jako antagoniści odpowiednich ligandów, którzy zmniejszają, znacznie zmniejszają lub całkowicie hamują wiązanie ligandów do ich receptorów i/lub aktywność ligandów względem ich komórek docelowych, tkanek i/lub organizmów. Inni antagoniści, którzy mogą być lub nie być strukturalnymi analogami, muteinami, wariantami i fragmentami interesujących ligandów są także odpowiedni do przygotowania koniugatów zgodnie z wynalazkiem. Jako zagadnienie praktyczne, określenie czy dana muteina, fragment, pochodna lub antagonista antagonizuje biologiczne i/lub fizjologiczne efekty danego ligandu może być przeprowadzone, bez nadmiernego eksperymentowania, stosując oznaczenia dla biologicznych/fizjologicznych efektów samego ligandu, których wiele jest znanych dobrze w dziedzinie i/lub są tu opisane.
Struktury (pierwszorzędowe, drugorzędowe, trzeciorzędowe, i gdy to dotyczy, czwartorzędowe) dla tych i innych interesujących peptydów, które są korzystnie stosowane zgodnie z wynalazkiem są dobrze znane w dziedzinie i będzie je znała osoba o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie, szczególnie ze względu na podane tu struktury i cytowane tu odnośniki, które są tu włączone w całości w formie odniesienia.
Koniugaty
Obecny wynalazek dostarcza stabilne koniugaty składników bioaktywnych, w szczególności cytokin, do stosowania w szeregu zastosowań. Takie koniugaty według wynalazku mają szereg zalet w stosunku do tych znanych uprzednio w dziedzinie jak wykazują następujące przykładowe i nie ograniczające porównania znanych w dziedzinie koniugatów:
H. Hiratani (Patent Europejski Nr EP 098 110) i Patent US Nr 4,609,546) ujawniają koniugaty kopolimerowe tlenku etylenu i tlenku propylenu („PEG-PPG”, członek ogólnej klasy PAG) z białkami, obejmującymi interferony i interleukiny, gdzie nie jest ujawniona preferencja dla unikania regionów białek biorących udział we wiązaniu receptora. W tych ujawnieniach, interferony alfa, beta i gamma były uważane za równoważne cele dla przyłączania do PAG, w odróżnieniu od obecnego wynalazku, gdzie interferon gamma nie jest uważany za odpowiedni cel do przyłączania N-końcowego ponieważ jego koniec aminowy jest w obrębie regionu wiązania receptora tej cytokiny. Dodatkowo Haratani ujawnia koniugaty syntetyzowane tylko z PAG 1 kDa do 10 kDa, podczas gdy sposoby tego wynalazku preferują połączenie rozpuszczalnych w wodzie syntetycznych polimerów z masami cząsteczkowymi przekraczającymi 10 kDa do zastosowań terapeutycznych. Analogicznie, N.V. Katre ((1990), powyżej) ujawnia, że przyłączanie dużych ilości nici 5-kDa mPEG do ludzkiej zrekombinowanej interleukiny-2 zwiększa czas życia powstałych koniugatów w krwiobiegach myszy i królików. Jednak ten odnośnik nie ujawnia ani nie rozpoznaje korzyści przyłączania mniejszej ilości dłuższych nici PEG lub przyłączania pojedynczej nici PEG o wysokiej masie cząsteczkowej do końca aminowego IL-2, jak jest dostarczone w tym wynalazku.
G. Shaw (Patent US Nr 4,904,584 i Publikacja PCT Nr WO 89/05824 A2) ujawnia sposoby indukcji specyficznego względem miejsca przyłączenia polimerów przez wprowadzenie, zastąpienie lub wydeletowanie reszt lizyny w docelowym białku, szczególnie Epo, G-CSF i IL-2. Jednak w odróżnieniu od ujawnienia tego wynalazku, te odnośniki nie ujawniają, że amino-reaktywne polimery mogą reagować z dowolną aminą w docelowym białku inną niż grupy epsilon aminowe reszt lizyny, jasno odróżniając te ujawnienia od obecnego wynalazku.
D.E. Nitecki i wsp., (Patent US Nr 4,902,502) ujawniają wielokrotnie PEGylowane koniugaty IL-2, które przygotowano z różnych chloromrówczanowych pochodnych PEG, które miały na celu reagowanie z grupami epsilon aminowymi reszt lizyny. Jednak w odróżnieniu od obecnych metod te odnośniki nie ujawniają metody uniknięcia PEGylacji reszt lizyny w regionach białka IL-2, które biorą udział we wiązaniu receptora ani jakiejkolwiek świadomości, że unikanie takich miejsc jest korzystne.
N. Katre i wsp., (Patent US Nr 5,206,344) ujawniają koniugaty PEG-IL-2, w których PEG jest przyłączony do grup epsilon aminowych reszt lizyny, do niesparowanej grupy sulfhydrylowej naturalnie występującej reszty cysteiny w pozycji 125 (licząc od końca aminowego) lub do grupy sulfhydrylowej
PL 219 741 B1 reszty cysteiny, która została wprowadzona za pomocą mutacji między pierwszą i dwudziestą resztą od końca aminowego IL-2. Wśród mutein ujawnionych w patencie '344 jest „des-ala-1” IL-2, tzn. muteina, w której aminokońcowa alanina jest wydeletowana i nie PEGylowana. Jednak w odróżnieniu od tego ujawnienia, patent '344 nie ujawnia żadnego sposobu uniknięcia przyłączenia PEG do reszt aminokwasów, które biorą udział we wiązaniu receptorów, ani świadomości, że takie podejście byłoby korzystne. Zgodnie z tym pojęciem, i w przeciwieństwie do obecnego wynalazku, szeroki zakres punktów przyczepu proponowanych w patencie '344 nie sugerował, że przyłączenie PEG do końca aminowego IL-2 by było szczególnie korzystne.
S.P. Monkarsh i wsp., (1997) Anal Biochem 247:434-440 i S,P. Monkarsh i wsp., (1997) w Harris, J.M. i wsp., red., Poly(ethylene glycol): Chemistry and Biological Applications, str. 207-216, American Chemical Society, Washington, D.C., ujawniają, że reagowanie interferonu-alfa-2a z trzykrotnym molowym nadmiarem aktywowanego PEG z masą cząsteczkową 5300 daltonów daje jedenaście izomerów pozycyjnych monoPEG-interferonu, odpowiadających jedenastu resztom lizyny interferonualfa-2a. Nie opisano żadnego PEG-interferonu, w którym PEG jest przyłączony do grupy alfa aminowej na końcu aminowym interferonu. Jedenaście izomerów pozycyjnych opisanych w tych odnośnikach wykazywało aktywności antywirusowe w hodowlach tkankowych, które były w zakresie 6% do 40% aktywności niezmodyfikowanego interferonu i aktywności antyproliferacyjne w hodowlach tkankowych w zakresie 9% do 29% aktywności niezmodyfikowanego interferonu. Takie wyniki jasno wykazują, że losowa PEGylacja reszt lizyny przeprowadzona przez tych badaczy interferowała z funkcjami interferonu-alfa-2a, w których brały udział jego receptory w przeciwieństwie do koniugatów przygotowanych za pomocą sposobów według wynalazku. Dodatkowo, w odróżnieniu od koniugatów tego wynalazku, w tych odnośnikach nie doniesiono o N-końcowo PEGylowanym interferonie.
O. Nishimura i wsp., (Statutowa Rejestracja Nr H1662 Patentu US) ujawniają koniugaty interferonu-alfa, interferonu-gamma i IL-2, które są przygotowane za pomocą redukcyjnej alkilacji aktywowanych „aldehydów eteru metylowego glikolu polietylenowego” z cyjanoborowodorkiem sodu w pH 7,0 (dla koniugatów interferonu) lub pH 7,15 (dla koniugatów IL-2). Jednak opisano, że koniugaty przygotowane za pomocą tych sposobów utraciły do 95% bioaktywności niezmodyfikowanych związków zapewne ze względu na obecność wielokrotnych miejsc przyłączenia polimeru, wszystkie z których opisano, że są na grupach epsilon aminowych reszt lizyny (patrz Fig. 1 i 4 tego wynalazku).
D.K. Petit i wsp., (1997) J Biol Chem 272:2312-2318 ujawniają koniugaty polimerów interleukiny-15 („IL-15”). Jednak koniugowana IL-15 opisana w tym odnośniku nie tylko utraciła swoją zdolność podobną do IL-2 promowania wzrostu w wyniku przyłączania polimerów do reszt lizyny w regionach białka, które biorą udział we wiązaniu receptora, ale także wykazywała antagonizm raczej niż agonizm. Autorzy ci wnioskują, że selektywna inhibicja wiązania IL-15 do jednego z kilku receptorów na powierzchni komórki może być efektem koniugacji polimeru i że taka inhibicja może nie tylko zmniejszyć wiązanie receptora, ale może odwrócić efekt biologiczny białka. Przez uniknięcie przyłączania polimerów do części białka wiążących receptor, które biorą udział w interakcjach ze swoimi receptorami obecny wynalazek unika tej niepożądanej konsekwencji przyłączania polimerów.
J. Hakimi i wsp., (Patenty US Nr 5,792,834 i 5,834,594) ujawniają połączone z uretanem koniugaty PEG białek, w tym interferon-alfa, IL-2, interleukina-1 („IL-1”) i antagonista receptora IL-1, i podają, że przygotowano je aby zmniejszyć immunogenność, zwiększyć rozpuszczalność i zwiększyć okres połowicznego rozpadu odpowiednich białek. W tych odnośnikach, PEG przyłączano do „różnych wolnych grup aminowych aminokwasów”, bez odniesienia do N-końcowej PEGylacji i bez ujawnienia, że N-końcowe grupy alfa aminowe mogły lub powinny być PEGylowane. Te patenty także podają, że ujawniony tam koniugat ma „przynajmniej część” oryginalnej aktywności biologicznej wyjściowego białka, tak wskazując na możliwą utratę znacznej bioaktywności. Ten wynik byłby zgodny ze stosowaniem nieadresowanych metod PEGylacji tam ujawnionych. W przeciwieństwie do obecnego wynalazku, te patenty nie ujawniają jakiejkolwiek próby poprawienia zatrzymywania bioaktywności ich koniugatów przez zmianę selektywności ujawnionych tam procesów PEGylacji.
O.B. Kinstler i wsp., (Europejskie Zgłoszenie Patentowe Nr EP 0 822 199 A2) ujawniają proces reagowania glikolu polietylenowego z grupą alfa aminową aminokwasu na końcu aminowym polipeptydu, szczególnie konsensusowego interferonu i G-CSF, które są dwoma z białek produkowanych przez Amgen, Inc., właściciela tego zgłoszenia patentowego. Ta publikacja wskazuje, że „pH dostatecznie kwaśne by selektywnie aktywować grupę alfa aminową” jest konieczną cechą podanego procesu. W przeciwieństwie, w tym wynalazku wykryto, że obniżenie pH zmniejsza reaktywność grup aminowych z aldehydami PEG i że grupa alfa aminowa jest bardziej reaktywna, gdy nie jest protono22
PL 219 741 B1 wana, tzn. przy pH powyżej jej pKa. Tak więc obecni wynalazcy stwierdzają, że żadne pH nie jest „dostatecznie kwaśne by selektywnie aktywować grupę alfa aminową” jakiegokolwiek z koniugatów cytokin RN według wynalazku. Wyjaśnienia zależności od pH reaktywności N-końcowych grup alfa aminowych z aldehydami podane przez J.T. Edsall (powyżej) i R.S. Larsen i wsp., ((2001) Bioconjug Chem 12:861-869) są bardziej kompatybilne z doświadczeniem obecnych wynalazców. Co więcej, Kinstler i wsp., opisują stosowanie N-końcowej PEGylacji polipeptydów dla zwiększonej homogenności powstających koniugatów i ochrony końca aminowego przed degradacją przez proteinazy, ale nie ujawniają, że N-końcowa PEGylacja może zachować większą frakcję aktywności wiążącej receptor pewnych białek wiążących receptory (patrz np. Publikacja PCT Nr WO 96/11953; Patent Europejski Nr EP 0733067B1 i Patenty US Nr 5,770,577, 5,824,784 i 5,985,265, wszystkie dla Kinstler, O.B. i wsp.,).
Europejskie zgłoszenie Kinstler i wsp., (EP 0 822 199 A2) także uogólnia korzyści N-terminalnej PEGylacji do wszystkich polipeptydów, co nie było doświadczeniem obecnych wynalazców. Specyficznie, ponieważ końce aminowe cząsteczek przeciwciał występują w pobliżu regionów łączących się z antygenem białek przeciwciał (Chapman, A.P. (2002) Adv Drug Deliv Rev 54:531-545), N-końcowa PEGylacja przeciwciał jest nieoczekiwanie szkodliwa dla bioaktywności, w porównaniu z losową PEGylacją reszt lizyny, jak ujawnili Larsen, R.S. i wsp., powyżej. Podobnie, oczekuje się, że N-końcowa PEGylacja białek wiążących receptor, które nie są białkami wiążącymi receptor „RN” np. interferon-gamma (patrz Fig. 8) będzie bardziej hamująca dla interakcji z receptorami niż losowa PEGylacja reszt lizyny takich białek wiążących receptor. Tak więc jak zanotowano powyżej, sposoby tego wynalazku różnią się od tych ujawnionych przez Kinstler i wsp., w cytowanych tu publikacjach tym, że koniugaty według wynalazku są przygotowywane przez koniugację jednej lub więcej cytokin lub ich antagonistów, które są wybrane z białek wiążących receptor RN z jednym lub więcej polimerem przez wytworzenie mieszaniny między ligandem (ligandami) i jednym lub więcej polimerów w pH około 5,6 do około 7,6; pH około 5,6 do około 7,0; pH około 6,0 do około 7,0; pH około 6,5 do około 7,0; pH około 6,6 do około 7,6; pH około 6,6 do około 7,0; lub w pH około 6,6. W przeciwieństwie, metody Kinstler i wsp., polegają na koniugacji ligandów w pH poniżej 5,5, który to zakres pH został stwierdzony przez obecnych wynalazców jako suboptymalny lub gorszy do przygotowywania preparatów ligandów selektywnie koniugowanych z polimerami w odległym N-końcowych aminokwasach i/lub odległych miejscach glikozylacji.
Pepinsky, B. i wsp., (publikacja PCT Nr WO 00/23114 i Publikacja Zgłoszenia Patentowego US Nr 2003/0021765 A1) ujawniają polimerowe koniugaty glikozylowanego interferonu-heta-1a, które są bardziej aktywne niż nieglikozylowany interferon-heta-1b w oznaczeniu antywirusowym. Gdy Pepinski i wsp., przyłączyli 5 kDa lub 20 kDa mPEG do końca aminowego IFN-3-1a przez alkilację redukcyjną, nie stwierdzili wpływu PEGylacji na moc przeciwwirusową, podczas gdy przyłączanie PEG o wyższej masie cząsteczkowej zmniejszało lub eliminowało moc. Ten odnośnik także ujawnia, że glikol polietylenowy może być przyłączony do interferonu-heta-1a poprzez różne grupy sprzęgające w różnych miejscach, w tym koniec aminowy, koniec karboksylowy i reszta węglowodanowa glikozylowanego białka. Jednak jest podane, że metody ujawnione w tej publikacji nie mogą być uogólnione do innych białek; „(t)e badania wskazują, że mimo konserwacji w sekwencji między interferonem-heta-1a i interferonem-beta-1b, są one odrębnymi jednostkami biochemicznymi i tak więc wiele z tego, co jest wiadome o interferonie-heta-1b nie może być zastosowane do interferonu-heta-1a i vice versa”. Przeciwnie, obecny wynalazek ujawnia wspólne cechy ucieleśnione w białkach wiążących receptor „RN” i „RG” jak są tu zdefiniowane. Według obecnego wynalazku, zarówno interferon-heta-1a i interferonheta-1b są białkami wiążącymi receptor „RN”. Dodatkowo interferon-heta-1b jest białkiem wiążącym receptor „RG”. Tak więc w przeciwieństwie do metod WO 00/23114 metody według wynalazku są pożyteczne do przygotowania stabilnych, bioaktywnych koniugatów zarówno interferonu-heta-1b i interferonu-heta-1a.
Z. Wei i wsp., (Patent US Nr 6,077,939) ujawniają sposoby przyłączenia rozpuszczalnych w wodzie polimerów (szczególnie PEG) do N-końcowego atomu węgla alfa polipeptydu (szczególnie erytropoetyny) gdzie amina na węglu alfa N-końcowego aminokwasu jest najpierw transaminowana do grupy alfa-karbonylowej, która następnie jest reagowana z pochodną PEG aby wytworzyła oksym lub wiązanie hydrazonowe. Ponieważ ujawnionym celem tego odnośnika było opracowanie sposobu, który byłby odpowiedni ogólnie do wszystkich białek, nie poświęcono uwagi zachowaniu aktywności wiązania receptora, która może być wynikiem wyboru końca aminowego jako miejsca PEGylacji pewnych białek wiążących receptor. Tak więc w przeciwieństwie do odkrycia Wei i wsp., obecny wynalaPL 219 741 B1 zek nie wymaga usuwania N-końcowej grupy alfa-aminowej ale przeciwnie, może zachować ładunek na N-końcowej grupie aminowej w neutralnym pH poprzez tworzenie drugorzędowego wiązania aminowego między białkiem i polimerem.
C.W. Gilbert i wsp., (Patent US Nr 6,042,822; Patent Europejski Nr EP 1 039 922) ujawniają zalety mieszaniny izomerów pozycyjnych PEG-interferonu-alfa-2b gdzie szczególnie pożądany izomer ma PEG przyłączony do reszty histydyny interferonu-alfa-2b, szczególnie histydyny 34, i wykazują, że wiązanie PEG do histydyny-34 jest niestabilne. Ponieważ histydyna-34 leży na powierzchni interferonu-alfa-2b w regionie, który musi wejść w ścisły kontakt z receptorem interferonu, aby wywołać transdukcję sygnału (patrz Fig. 1b tej specyfikacji) niestabilność wiązania między PEG i histydyną-34 ujawniona w tych odnośnikach wydaje się być niezbędna dla funkcji opisanego tam koniugatu PEGinterferon. Zasadniczo czyste połączone z histydyną koniugaty polimerów były opisane przez S. Lee i wsp., Patent US Nr 5,985,263. Przeciwnie, obecny wynalazek wykazuje, że jeden korzystny koniugat jest koniugatem PEG-interferon, gdzie PEG jest stabilnie związany w miejscu, które jest odległe od domen wiążących receptor składnika interferonowego.
P. Bailon i wsp., ((2001) Bioconjug Chem 12:195-202) ujawniają, że interferon-alfa-2a, który jest PEGylowany jedną cząsteczką 40 kDa di-mPEG-lizyny na cząsteczkę interferonu składa się z czterech głównych izomerów pozycyjnych. Ten odnośnik ujawnia, że nieomal cały PEG był przyłączony poprzez wiązania amidowe do lizyn 31, 121, 131 lub 134, każda z których jest w obrębie lub przylega do domen wiążących interferon-alfa-2a (reszty 29-35 i 123-140, według Bailon i wsp. patrz Fig. 1a tej specyfikacji). N-końcowa PEGylacja nie była opisana przez Bailon i wsp., Aktywność antywirusowa mieszaniny izomerów pozycyjnych PEG-interferonu wobec wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej w komórkach nerki bydlęcej Madin-Darby in vitro była opisana jako 7% testowanego niekoniugowanego interferonu-alfa-2a. Znaczna utrata bioaktywności, którą obserwowano dla tych koniugatów PEG-interferon, które nie obejmują N-końcowo PEGylowanego interferonu jasno więc odróżnia koniugaty Bailon i wsp., od tych z tego wynalazku.
R.B. Pepinsky i wsp., ((2001) J Pharmacol Exp Ther 297:1059-1066) ujawniają syntezę koniugatu z (1) glikozylowanego interferonu-beta-1a mającego N-końcową resztę metioniny i (2) 20-kDa aldehydu PEG. Podano, że koniugat, który jest określany w odnośniku jako monoPEGylowany na N-końcowej metioninie, zachowuje pełną bioaktywność w oznaczeniu antywirusowym. Podczas gdy ci autorzy ujawniają, że ich wybór N-końcowego miejsca do PEGylacji glikozylowanego interferonu-beta1a był podyktowany przez dostępność specyficznych względem miejsca odczynników do PEGylacji i modelowanie molekularne, przyznają, że „pewne efekty są specyficzne dla danego produktu”. Co więcej, i w przeciwieństwie do tego wynalazku, obserwacje tam podane nie zostały uogólnione, aby obejmowały klasę białek wiążących receptor, które są tu definiowane jako białka wiążące receptor „RN”.
J. Burg i wsp., (Publikacja PCT Nr WO 01/02017 A2) ujawniają produkcję koniugatów alkoksyPEG glikoprotein erytropoetyny, gdzie jedna do trzech nici metoksy PEG była reagowana z grupami sulfhydrylowymi, które były wprowadzane chemicznie poprzez modyfikację grup epsilon aminowych reszt lizyny na powierzchni glikoproteiny. Jednak w przeciwieństwie do tego wynalazku ten odnośnik nie ujawnia jakiejkolwiek próby przyłączenia PEG do wolnej grupy alfa aminowej N-końcowego aminokwasu erytropoetyny ani unikania modyfikacji reszt lizyny w regionach glikoproteiny erytropoetyny, które są niezbędne dla interakcji z receptorami erytropoetyny.
J. Burg i wsp., (Publikacja PCT Nr WO 02/49673 A2) ujawniają syntezę N-końcowo połączonych z amidem koniugatów PEG naturalnych i muteinowych glikoprotein erytropoetyny za pomocą procesu, który stosuje możliwe do selektywnego cięcia N-końcowe przedłużenia peptydów, które są cięte przed PEGylacją i po odwracalnej cytrakonylacji wszystkich epsilonowych grup aminowych reszt lizyny glikoproteiny. Ujawnione uzasadnienie dla wieloetapowego procesu w tym odnośniku mogło by uczynić proces PEGylacji selektywnym dla pierwszej wolnej grupy alfa aminowej N-końcowego aminokwasu aby wyprodukować homogenne, monoPEGylowane koniugaty z wielokrotnie PEGylowanych pochodnych. Ta metoda różni się od metod według wynalazku pod kilkoma ważnymi względami obejmującymi, ale nie ograniczonymi do: (1) podejście Burg i wsp., jest ograniczone do glikoprotein erytropoetyny, do których alkoksyPEG jest przyłączony poprzez wiązania amidowe, podczas gdy obecny wynalazek ma zastosowanie do szeregu składników bioaktywnych koniugowanych z użyciem różnych syntetycznych polimerów; (2) obecny wynalazek dotyczy zarówno glikozylowanych i nieglikozylowanych białek wiążących receptor „RN” i „RG”, podczas gdy Burg i wsp., ujawniają tylko koniugację glikoprotein; (3) obecny wynalazek obejmuje zarówno alkoksyPEG, takie jak mPEG, i monofunkcyjnie aktywowane hydroksyPEG, podczas gdy Burg i wsp., ujawniają tylko stosowanie alkoksyPEG;
PL 219 741 B1 i (4) w tym wynalazku drugorzędowe wiązania aminowe pomiędzy polimerem i białkiem są preferowane od wiązań amidowych stosowanych przez Burg i wsp., ponieważ te pierwsze są bardziej stabilne i zachowują ładunek dodatni na grupie aminowej. W analogicznej pracy z tej samej grupy J. Burg i wsp., (Patent US Nr 6,340,742) ujawniają produkcję sprzęgniętych z amidem koniugatów glikoprotein erytropoetyny, gdzie jedna do trzech nici alkoksyPEG jest połączona do jednej z trzech grup aminowych białka. Jednak w przeciwieństwie do tego wynalazku, ten odnośnik nie opisuje żadnej preferencji dla grupy alfa aminowej N-końcowego aminokwasu ani dla grup aminowych, które nie są w regionach, które biorą udział w interakcjach z receptorami.
C. Delgado i wsp., (Patent US Nr 6,384,195) ujawniają koniugaty czynnika stymulującego kolonie granulocytów-makrofagów, które są przygotowywane stosując reaktywny polimer, który jest przedstawiany jako trezylo monometoksyPEG i jest tam określany jako „TMPEG”. Ten odnośnik wskazuje, że gdy TMPEG jest kontaktowany z ludzkim GM-CSF „modyfikowany materiał zawiera formy bez aktywności i z wyższą aktywnością niż niemodyfikowany materiał”. Jak łatwo stwierdzi osoba o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie, formy bez aktywności są niepożądane w mieszaninie koniugatów polimer-składnik bioaktywny ponieważ mogą wpłynąć na ryzyko podawania koniugatu pacjentowi potrzebującemu takiego podawania bez wpływania na korzystne efekty. Jak tu zanotowano, obecny wynalazek przezwycięża to ograniczenie w dziedzinie przynajmniej częściowo przez unikanie modyfikacji GM-CSF i innych białek wiążących receptor w miejscach na białkach, które biorą udział w aktywności wiązania receptora, w ten sposób zmniejszając lub eliminując syntezę form bez aktywności. Obecny wynalazek także dostarcza metody frakcjonowania i oczyszczania koniugatów, które mają różne wielkości, różne ładunki i/lub różne stopnie osłaniania ładunków na białku przez polimer (patrz Fig. 9-12).
Należy zauważyć, że Patent US Nr 6,384,195 nie wspomina o N-końcowej PEGylacji GM-CSF, tak więc nie rozpoznaje korzyści metod według tego wynalazku. Na koniec, Patent US 6,384,195 wskazuje preferencję dla koniugatów, w których więcej niż jedna cząsteczka PEG jest połączona do każdej cząsteczki GM-CSF bez jakiegokolwiek rozważania gdzie na cząsteczce GM-CSF są przyłączone te cząsteczki PEG (poza tym, że są przyłączone do reszt lizyny). Przez podanie preferencji dla koniugatów z do sześcioma cząsteczkami PEG na GM-CSF, odnośnik podaje więc preferencję dla koniugatów, w których PEG może być przyczepiony do wszystkich możliwych reszt lizyny, w ten sposób zapewniając, że PEG będzie przyczepiony w pozycjach, które stanowią zawadę przestrzenną dla bliskiego podejścia białka do jego receptorów na powierzchni komórki (patrz Fig. 3 tej specyfikacji). Przeciwnie, niniejszy wynalazek wskazuje niekorzystność przyłączania PEG do reszt lizyny, poza tym, gdy te reszty lizyny są odległe od domen białka wiążącego receptor, które są niezbędne dla interakcji z receptorami i tak więc do transdukcji sygnału (w przypadku agonistów) lub aby kompetycyjnie hamować transdukcję sygnału (w przypadku antagonistów).
T. Nakamura i wsp., (Publikacja PCT Nr WO 02/32957 A1) ujawniają, że zwiększenie masy cząsteczkowej PEG, który jest przyłączony do grupy epsilon aminowej reszty lizyny w pozycji 52 glikoproteiny eryrtopoetyny zwiększa efekt erytropoetynowy koniugatu in vivo zarazem zmniejszając powinowactwo koniugatu do receptorów erytropoetyny. Jednak w przeciwieństwie do tego wynalazku, ten odnośnik nie ujawnia przyłączania PEG na końcu aminowym ani w pobliżu miejsca glikozylacji ani też nie zauważa żadnej korzyści z takiego postępowania.
Tak więc obecny wynalazek dostarcza koniugaty składników bioaktywnych połączonych z syntetycznymi polimerami, które mają wyraźne przewagi strukturalne i funkcjonalne w stosunku do tych, które ujawniono uprzednio.
Kompozycje
Wynalazek dostarcza koniugaty lub kompleksy zawierające jeden lub więcej składników bioaktywnych, odpowiednio jedną lub więcej cytokinę przyłączoną do jednego lub więcej stabilizującego polimeru takiego jak jeden lub więcej PEG. Typowo takie koniugaty są produkowane za pomocą opisanych tu sposobów według wynalazku; jednak koniugaty mające struktury i aktywności tu opisane niezależnie od sposobów stosowanych do produkcji takich koniugatów są uważane za równoważne do produkowanych za pomocą obecnych sposobów i są więc objęte przez ten wynalazek. W pokrewnych aspektach, wynalazek także dostarcza kompozycje obejmujące jeden lub więcej takich koniugatów lub kompleksów. Kompozycje według tego aspektu wynalazku będą obejmowały jeden lub więcej (np. jeden, dwa, trzy, cztery, pięć, dziesięć itp.) opisanych powyżej koniugatów lub kompleksów według wynalazku. W pewnych takich aspektach kompozycje mogą zawierać jeden lub więcej dodatkowy składnik taki jak jedna lub więcej soli buforowych, jeden lub więcej czynnik chaotropowy, jeden lub
PL 219 741 B1 więcej detergent, jedno lub więcej białko (np. albumina lub jeden lub więcej enzymów), jeden lub więcej niezwiązanych polimerów, jeden lub więcej czynników czynnych osmotycznie i tym podobnie. Kompozycje według tego aspektu wynalazku mogą być w dowolnej postaci, obejmującej stałą (np. suchy proszek) lub roztwór (szczególnie w formie fizjologicznie odpowiedniego buforowanego roztworu soli zawierającego jeden lub więcej koniugatów według wynalazku).
A. Kompozycje farmaceutyczne
Pewne kompozycje według wynalazku są szczególnie formułowane do stosowania jako kompozycje farmaceutyczne do stosowania w zastosowaniach profilaktycznych, diagnostycznych lub terapeutycznych. Takie kompozycje będą typowo zawierały jeden lub więcej koniugatów, kompleksów lub kompozycji według wynalazku i jeden lub więcej farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub zaróbkę. Określenie „farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub zaróbka” jak jest tu stosowane dotyczy nietoksycznego stałego, półpłynnego lub płynnego wypełniacza, rozcieńczalnika, materiału do kapsułkowania, lub pomocy do formułowania dowolnego typu, który jest zdolny do bycia tolerowanym przez biorcę zwierzę, obejmując człowieka lub innego ssaka, do którego jest wprowadzana kompozycja farmaceutyczna, bez niekorzystnych efektów wynikających z jego dodania.
Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą być podawane biorcy poprzez dowolny odpowiedni sposób podawania, taki jak doustnie, doodbytniczo, pozajelitowo, doustrojowo, dopochwowo, dootrzewnowo, miejscowo (za pomocą proszków, maści, kropelek lub łatek przezskórnych), doustnie jako sprej do ust lub do nosa lub poprzez inhalację. Określenie „pozajelitowy” jak jest tu stosowane dotyczy sposobów podawania, które obejmują dożylne, dotętnicze, domięśniowe, dootrzewnowo, docysternowe, podskórne i śródstawowe iniekcje i wlewy.
Kompozycje farmaceutyczne dostarczane przez wynalazek do iniekcji pozajelitowej mogą obejmować sterylne wodne lub niewodne roztwory, dyspersje, zawiesiny lub emulsje jak i sterylne proszki do rekonstytucji do sterylnych roztworów lub dyspersji do iniekcji przed użyciem. Przykłady odpowiednich wodnych i niewodnych nośników, rozcieńczalników, rozpuszczalników lub wehikułów obejmują wodę, etanol, poliole (takie jak glicerol i tym podobne, glikol propylenowy, glikol polietylenowy), karboksymetylocelulozę i jej odpowiednie mieszaniny, oleje roślinne (takie jak oliwa z oliwek) i organiczne estry do iniekcji takie jak oleinian etylu. Odpowiednia płynność może być utrzymana na przykład poprzez zastosowanie materiałów powlekających takich jak lecytyna, przez utrzymanie pożądanej wielkości cząsteczek w przypadku dyspersji i przez stosowanie związków powierzchniowo czynnych.
Takie kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą także zawierać adiuwanty takie jak konserwanty, czynniki zwilżające, czynniki emulgujące i czynniki rozpraszające. Zapobieganie działaniu mikroorganizmów można zapewnić poprzez włączenie różnych czynników przeciwbakteryjnych i przeciwgrzybowych, na przykład parabenów, alkoholu benzylowego, chlorobutanolu, fenolu, kwasu sorbowego i tym podobnych. Może być też pożądane włączenie czynników osmotycznych takich jak cukry, chlorek sodu i tym podobne. Przedłużona absorpcja formy farmaceutycznej do iniekcji może być uzyskana przez włączenie czynników, które opóźniają absorpcję takich jak monostearynian glinu, hydrożele i żelatyna.
W niektórych przypadkach aby przedłużyć efekty leków jest pożądane opóźnienie absorpcji z iniekcji podskórnych lub domięśniowych. To może być uzyskane przez stosowanie płynnej zawiesiny materiałów krystalicznych lub amorficznych ze słabą rozpuszczalnością w płynach ustrojowych. Tempo absorpcji leku wówczas zależy od jego szybkości rozpuszczania, które z kolei może zależeć od jego formy fizycznej. Alternatywnie, opóźniona absorpcja formy leku podawanej pozajelitowo może być uzyskana przez rozpuszczenie lub zawieszenie leku w nośniku olejowym.
Formy do iniekcji typu depot przygotowuje się przez tworzenie mikrokapsułkowanych macierzy leku w biodegradowalnych cząsteczkach takich jak polilaktyd-poliglikozyd. W zależności od stosunku leku do polimeru nośnikowego i natury danego stosowanego polimeru nośnikowego, można kontrolować tempo uwalniania leku. Przykłady innych biodegradowalnych polimerów obejmują biodegradowalne poliortoestry i polibezwodniki. Formuły typu depot do iniekcji przygotowuje się także przez wyłapanie leku w liposomach lub mikroemulsjach, które są kompatybilne z tkankami organizmu.
Formy do iniekcji mogą być sterylizowane, na przykład, przez sączenie przez filtr zatrzymujący bakterie lub przez włączenie czynników sterylizujących w formie stałych sterylnych kompozycji, które mogą być rozpuszczone lub rozproszone w sterylnej wodzie lub innym sterylnym podłożu do iniekcji przed użyciem.
PL 219 741 B1
Stałe formy dawki do podawania doustnego obejmują kapsułki, tabletki, pigułki, proszki i granulki. W takich stałych formach dawki, aktywne składniki miesza się z przynajmniej jedną farmaceutycznie dopuszczalną zaróbką lub nośnikiem takim jak cytrynian sodu lub fosforan dwuwapniowy i/lub a) wypełniaczami lub domieszkami objętościowymi takimi jak skrobie, laktoza, sacharoza, glukoza, mannitol i kwas krzemowy, b) czynnikami wiążącymi takimi jak na przykład karboksyceluloza, alginiany, żelatyna, poliwinylopyrolidon, sacharoza i guma akacjowa, c) środkami zwilżającymi takimi jak glicerol, d) czynnikami dezintegrującymi takimi jak agar-agar, węglan wapnia, skrobia ziemniaczana lub z tapioki, kwas algininowy, pewne krzemiany i węglan sodu, e) czynnikami opóźniającymi rozpuszczanie takimi jak parafina, f) czynnikami przyspieszającymi absorpcję takimi jak czwartorzędowe związki amonu, g) czynnikami zwilżającymi takimi jak na przykład alkohol cetylowy i monostearynian glicerolu, h) absorbentami takimi jak kaolin i glina bentonitowa, i i) środkami smarującymi takimi jak talk, stearynian wapnia, stearynian magnezu, stałe PEG, siarczan laurylu sodu, i ich mieszaniny. W przypadku kapsułek, tabletek i pigułek forma dawki może także zawierać czynniki buforujące.
Kompozycje stałe podobnego typu mogą być też stosowane jako wypełniacze w miękkich i twardych wypełnionych kapsułkach z żelatyny stosując takie zaróbki jak laktoza (cukier mlekowy) jak i PEG o wysokiej masie cząsteczkowej i tym podobnie.
Stałe formy dawkowania kapsułek, tabletek, pigułek, proszków i granulek mogą być przygotowane z powłoczkami lub skorupkami takimi jak jelitowe lub chronomodulujące powłoczki i innymi powłoczkami dobrze znanymi w dziedzinie formuł farmaceutycznych. Mogą dowolnie zawierać środki zmętniające i mogą także mieć taki skład, że uwalniają tylko składnik (składniki) czynne, lub preferencyjnie w danej części przewodu pokarmowego lub dowolnie w sposób opóźniony. Przykłady kompozycji macierzowych, które mogą być stosowane obejmują substancje polimerowe i woski. Składniki czynne mogą być także w formie mikrokapsułkowanej, jeśli jest to odpowiednie, z jedną lub więcej wyżej wymienionych zaróbek.
Formy płynne dawkowania do podania doustnego mogą obejmować farmaceutycznie dopuszczalne emulsje, roztwory, zawiesiny, syropy i eliksiry. Oprócz składników czynnych formy płynne dawkowania mogą zawierać bierne rozpuszczalniki powszechnie stosowane w dziedzinie takie jak na przykład woda lub inne rozpuszczalniki, czynniki solubilizujące i emulganty takie jak alkohol etylowy, alkohol izopropylowy, węglan etylu, octan etylu, alkohol benzylowy, benzoesan benzylu, glikol propylenowy, glikol 1,3-butylenowy, dimetyloformamid, oleje (w szczególności z nasion bawełny, orzeszków ziemnych, kukurydzy, kiełków, oliwek, rycyny i sezamu), glicerol, alkohol tetrahydrofurfurylowy, glikole polietylenowe i estry kwasu tłuszczowego sorbitanu i ich mieszaniny.
Oprócz biernych rozcieńczalników kompozycje doustne mogą także obejmować adiuwanty takie jak czynniki zwilżające, czynniki emulgujące i zawieszające, czynniki słodzące, smakowe i perfumujące.
Zawiesiny oprócz aktywnych związków mogą zawierać czynniki zawieszające, jak na przykład etoksylowane alkohole izostearylowe, sorbitol polioksyetylenu i estry sorbitanu, celuloza mikrokrystaliczna, metawodorotlenek glinu, bentonit. agar-agar, tragakant i ich mieszaniny.
Podawanie miejscowe obejmuje podawanie na skórę lub śluzówki, obejmując powierzchnie płuc i oka. Kompozycje do miejscowego podawania, obejmujące te do inhalacji, mogą być przygotowane jako suchy proszek, który może być pod ciśnieniem lub nie. W kompozycjach proszku nie pod ciśnieniem czynne składniki w bardzo rozdrobnionej postaci mogą być stosowane jako domieszka do większych cząsteczek dopuszczalnego farmaceutycznie biernego nośnika obejmującego cząsteczki mające wielkość, np. do 100 mikrometrów średnicy. Odpowiednie bierne nośniki obejmują cukry takie jak laktoza i sacharoza. Korzystnie przynajmniej 95% wagowo cząsteczek składnika czynnego ma efektywną wielkość cząsteczki w zakresie 0,01 do 10 mikrometrów.
Alternatywnie kompozycja farmaceutyczna może być pod ciśnieniem i zawierać sprężony gaz, taki jak azot lub ciekły propelent gazowy. Ciekłe podłoże propelentu i faktycznie cała kompozycja może być korzystnie taka, by składniki czynne nie rozpuszczały się w niej w jakimkolwiek znacznym stopniu. Kompozycja pod ciśnieniem może też zawierać związek powierzchniowo czynny. Związek powierzchniowo czynny może być ciekłym lub stałym niejonowym związkiem powierzchniowo czynnym lub może być stałym anionowym związkiem powierzchniowo czynnym. Jest korzystne stosowanie stałego związku powierzchniowo czynnego w formie soli sodowej.
Dalsza forma podawania miejscowego jest do oka. W tym sposobie podania, koniugaty lub kompozycje według wynalazku są dostarczane w dopuszczalnym farmaceutycznie nośniku okulistycznym, takim, że składniki czynne są utrzymywane w kontakcie z powierzchnią oka przez dostateczny okres czasu, aby pozwolić związkom na penetrację spojówki lub regionów rogówki lub wewnętrznych
PL 219 741 B1 oka, na przykład komory przedniej, komory tylnej, ciała szklistego, cieczy wodnistej, cieczy szklistej, rogówki, tęczówki/ciała rzęskowego, soczewki, naczyniówki oka/siatkówki i twardówki. Farmaceutycznie dopuszczalny okulistyczny nośnik może być na przykład maścią, olejem roślinnym lub materiałem kapsułkującym.
Kompozycje do podawania doodbytniczo lub dopochwowo są korzystnie czopkami, które mogą być przygotowane przez zmieszanie koniugatów lub kompozycji według wynalazku z odpowiednimi niepodrażniającymi zaróbkami lub nośnikami takimi jak masło kakaowe, PEG lub wosk do czopków, które są ciałami stałymi w temperaturze pokojowej, ale są płynne w temperaturze ciała, więc topią się w odbycie lub jamie pochwy i uwalniają leki.
Kompozycje farmaceutyczne stosowane w obecnych metodach terapeutycznych mogą być podawane w formie liposomów. Jak wiadomo w dziedzinie, liposomy na ogół uzyskuje się z fosfolipidów lub innych substancji lipidowych. Liposomy są tworzone przez jedno- lub wieloblaszkowe uwodnione ciekłe kryształy, które są rozproszone w podłożu wodnym. Dowolny nietoksyczny, fizjologicznie dopuszczalny i metabolizowany płyn zdolny do tworzenia liposomów może być stosowany. Oprócz jednego lub więcej koniugatów lub kompozycji według wynalazku, obecne kompozycje farmaceutyczne w formie liposomów mogą także zawierać jeden lub więcej stabilizatorów, konserwantów, zaróbek i tym podobnie. Korzystnymi lipidami są fosfolipidy i fosfatydylocholiny (lecytyny), zarówno naturalne i syntetyczne. Sposoby wytwarzania liposomów są znane w dziedzinie (patrz np. Zalipsky, S. i wsp., Patent US Nr 5,395,619). Liposomy, które zawierają fosfolipidy, które są koniugowane z PEG, najczęściej fosfatydyloetanoloamina połączona z monometoksyPEG mają korzystne właściwości, w tym przedłużone okresy trwania w układzie krążenia ssaków (Fischer, D., Patent US Nr 6,132,763).
B. Zastosowania
Jak zanotowano tu w innym miejscu, sposoby, koniugaty i kompozycje według wynalazku są korzystnie stosowane w metodach utrzymywania lub zwiększania bioaktywności składników biologicznych bez interferowania ze zdolnością składników biologicznych do wiązania się ze swoimi receptorami. Pewne takie sposoby według wynalazku mogą obejmować dostarczenie jednego lub więcej koniugatów i kompozycji do komórek, tkanek, narządów lub organizmów. W szczególności wynalazek dostarcza kontrolowane dostarczanie jednego lub więcej składników koniugatów, kompleksów lub kompozycji do komórek, tkanek, narządów lub organizmów, w ten sposób dając użytkownikowi zdolność regulowania, czasowo i przestrzennie, ilości danego składnika, który jest uwalniany do aktywności w komórkach, tkankach, narządach lub organizmach.
Ogólnie takie sposoby według wynalazku obejmują jedną lub więcej aktywności. Na przykład jeden taki sposób według wynalazku obejmuje: (a) przygotowanie jednego lub więcej koniugatów lub kompozycji według wynalazku jak tu podano; i (b) kontaktowanie jednej lub więcej komórek, tkanek, narządów lub organizmów z jednym lub więcej koniugatem lub kompozycją, w warunkach sprzyjających wiązaniu jednego lub więcej koniugatu lub kompozycji według wynalazku do komórek, tkanek, narządów lub organizmów. Gdy bioaktywne składniki koniugatów i/lub kompozycji według wynalazku zostaną związane przez (lub w pewnych przypadkach internalizowane przez) komórki, tkanki, narządy lub organizmy, składniki spełniają swoje zamierzone funkcje biologiczne. Na przykład składniki peptydowe mogą wiązać się do receptorów lub innych składników na lub w komórkach, tkankach, narządach lub organizmach; biorą udział w reakcjach metabolicznych w komórkach, tkankach, narządach lub organizmach; przeprowadzają, podwyższają poziom lub aktywują lub obniżają poziom lub hamują jedną lub więcej aktywności enzymatycznych w komórkach, tkankach, narządach lub organizmach; dostarczają brakujący składnik strukturalny komórkom, tkankom, narządom lub organizmom; zaspakajają jedno lub więcej zapotrzebowań odżywczych komórek, tkanek, narządów lub organizmów; hamują, leczą, odwracają lub w inny sposób poprawiają jeden lub więcej procesów lub objawów choroby lub zaburzenia fizycznego i tym podobnie.
W dodatkowych wykonaniach koniugaty i kompozycje według wynalazku mogą być stosowane do przemysłowej hodowli komórek, ze względu na nieoczekiwanie wysokie moce składników bioaktywnych koniugatów, które uzyskuje się w wyniku połączonych efektów znacznego utrzymania ich bioaktywności i zwiększonego czasu trwania działania nawet w ostrych warunkach zastosowań przemysłowych. Te nieoczekiwanie wysokie moce obecnych koniugatów mogą prowadzić do niezwykle wysokiej produkcji biomasy, niezwykle wysokich poziomów ekspresji zrekombinowanych białek i innych ulepszeń w wydajnościach bioprocesingu.
PL 219 741 B1
C. Dawkowanie
Koniugaty, kompleksy lub kompozycje według wynalazku mogą być podawane in vitro, ex vivo lub in vivo komórkom, tkankom, narządom lub organizmom, aby dostarczyć do nich jeden lub więcej składników bioaktywnych (np. jedną lub więcej cytokin lub ich antagonistów). Osoba o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie doceni, że skuteczne ilości danego aktywnego związku, koniugatu, kompleksu lub kompozycji mogą być oznaczone empirycznie i mogą być stosowane w postaci czystej, lub, gdzie takie formy istnieją, w farmaceutycznie dopuszczalnej formule lub formie proleku. Związki, koniugaty, kompleksy lub kompozycje według wynalazku mogą być podawane zwierzęciu-pacjentowi (obejmując ssaka, takiego jak człowiek) tego potrzebującemu jako kompozycje weterynaryjne lub farmaceutyczne w kombinacji z jedną lub więcej farmaceutycznie dopuszczalną zaróbką. Poziom terapeutycznie skutecznej dawki dla danego pacjenta będzie zależał od szeregu czynników obejmujących typ i stopień odpowiedzi komórkowej, która ma być uzyskana; tożsamości i/lub aktywności specyficznych stosowanych związków, koniugatów, kompleksów i kompozycji; wieku, masy ciała lub powierzchni ciała, ogólnego stanu zdrowia, płci i diety pacjenta; czasu podawania, drogi podawania i szybkości wydalania związku czynnego; innych leków stosowanych razem lub współistniejących ze specyficznymi związkami, koniugatami, kompleksami lub kompozycjami; i podobnych czynników, które są dobrze znane osobom o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie nauk farmaceutycznych lub medycznych. Na przykład dobrze mieści się w zakresie umiejętności w dziedzinie rozpoczęcie dawkowania związku, koniugatu, kompleksu lub kompozycji według wynalazku na poziomach niższych niż wymagane do osiągnięcia pożądanego efektu terapeutycznego i stopniowe zwiększanie dawki aż do osiągnięcia pożądanych efektów.
Protokoły dawkowania mogą także być ułożone w sposób specyficzny względem pacjenta aby dostarczyć z góry ustalone stężenie danego związku czynnego w krwi, określanego za pomocą technik przyjętych i rutynowych w dziedzinie, np. wykluczanie wielkości, wymiana jonów lub wysoko wydajna chromatografia cieczy w fazie odwróconej („HPLC”), biooznaczenia lub immunooznaczenia. Tak więc dawkowanie u pacjenta może być dopasowane aby uzyskać względnie stałe poziomy w krwiobiegu, mierzone za pomocą HPLC lub immunooznaczeń, według sposobów, które są rutynowe i znane osobom biegłym w dziedzinie w naukach medycznych, farmaceutycznych i/lub farmakologicznych.
D. Zastosowania diagnostyczne i terapeutyczne
Diagnostyczne zastosowanie koniugatu według wynalazku mogłoby być do lokalizacji komórek lub tkanek mających niezwykle wysoką zdolność wiązania cytokiny, np. raka, w obrębie ciała zwierzęcia, w szczególności człowieka, przez podanie koniugatu lub kompozycji według wynalazku, w której koniugat (lub jeden lub więcej składników, np. składnik bioaktywny i/lub polimer syntetyczny) jest oznakowany lub zawiera jeden lub więcej wykrywalnych znaczników tak by umożliwić wykrycie, np. za pomocą detekcji optycznej, radiometrycznej, fluorescencyjnej lub rezonansowej według sposobów znanych w dziedzinie. Na przykład większość niedrobnokomórkowych raków płuca wyraża niezwykle wysokie stężenie receptorów dla nabłonkowego czynnika wzrostu (Bunn, P.A. i wsp., (2002) Semin Oncol 29 (Suppl 14):38-44. Tak więc w innym aspekcie wynalazku koniugaty i kompozycje według wynalazku mogą być stosowane w metodach diagnostycznych lub terapeutycznych, na przykład w diagnozowaniu, leczeniu lub zapobieganiu szeregowi zaburzeń fizycznych u zwierzęcia, w szczególności ssaka takiego jak człowiek, mającego predyspozycję do lub cierpiącego na takie zaburzenie. W takich podejściach celem terapii jest opóźnienie lub zapobieganie rozwojowi choroby, i/lub wyleczenie, indukcja remisji lub utrzymanie remisji tego zaburzenia, i/lub zmniejszenie lub minimalizowanie efektów ubocznych innych procedur terapeutycznych.
Stąd też koniugaty, kompleksy i kompozycje według wynalazku mogą być stosowane do ochrony, supresji lub leczenia zaburzeń fizycznych takich jak zakażeń lub chorób. Określenie „ochrona” przed zaburzeniem fizycznym, jak jest to stosowane, obejmuje „zapobieganie”, „supresję” i „leczenie”. „Zapobieganie” obejmuje podanie kompleksu lub kompozycji według wynalazku przed indukcją choroby lub zaburzenia fizycznego podczas gdy „supresja” obejmuje podanie koniugatu lub kompozycji przed pojawieniem się klinicznym choroby; stąd też „zapobieganie” i „supresja” zaburzenia fizycznego są typowo podejmowane u zwierzęcia, które ma predyspozycję do lub jest podatne na zaburzenie, ale jeszcze na nie nie cierpi. Jednak „leczenie” zaburzenia fizycznego obejmuje podanie terapeutycznego koniugatu lub kompozycji według wynalazku po pojawieniu się choroby. Będzie zrozumiałe, że w medycynie ludzkiej i weterynaryjnej nie zawsze jest możliwe rozróżnienie między „zapobieganiem” i „supresją” zaburzenia fizycznego. W wielu przypadkach, ostateczne zdarzenie lub zdarzenia indukujące mogą być nieznane lub utajone, i ani pacjent ani lekarz może nie mieć świadomości zdarzenia indukPL 219 741 B1 cyjnego do długiego czasu po jego wystąpieniu. Tak więc jest powszechne stosowanie określenia „profilaktyka” jako odrębne od „leczenia” aby obejmowało zarówno „zapobieganie” i „supresję” jak tu zdefiniowano. Określenie „ochrona” stosowane zgodnie ze sposobami tego wynalazku ma więc obejmować „profilaktykę”. Sposoby według tego aspektu wynalazku mogą obejmować jeden lub więcej etapów, które pozwalają klinicyście na osiągnięcie opisanych powyżej celów terapeutycznych. Jeden taki sposób według wynalazku może obejmować, na przykład, (a) identyfikację zwierzęcia (korzystnie ssaka, takiego jak człowiek) cierpiącego na lub mającego predyspozycję do zaburzenia fizycznego; i (b) podanie zwierzęciu skutecznej ilości jednego lub więcej koniugatów, kompleksów lub kompozycji według wynalazku jak tu opisano, tak, by podanie koniugatu, kompleksu lub kompozycji zapobiegało, opóźniało lub diagnozowało rozwój, lub leczyło lub indukowało remisję zaburzenia fizycznego u zwierzęcia.
Jak jest to tu stosowane, zwierzę, które „ma predyspozycję” do zaburzenia fizycznego jest definiowane jako zwierzę, które nie wykazuje szeregu wyraźnych fizycznych objawów choroby, ale które ma ryzyko genetyczne, fizjologiczne lub inne rozwinięcia choroby. W obecnych sposobach, identyfikacja zwierzęcia (takiego jak ssak, obejmując człowieka) które ma predyspozycję do, lub ma ryzyko cierpienia na, dane zaburzenie fizyczne może być przeprowadzone według standardowych sposobów znanych w dziedzinie obejmujących np. oznaczenia radiologiczne, oznaczenia biochemiczne (np. oznaczenia względnych poziomów danych peptydów, białek, elektrolitów itp. W próbce uzyskanej od zwierzęcia), sposobów chirurgicznych, skriningu genetycznego, wywiadu rodzinnego, fizyczne wymacanie, testy patologiczne lub histologiczne (np. mikroskopowa ocena próbek tkanki lub płynów ustrojowych lub wymazów, oznaczeń immunologicznych), testowanie płynów ustrojowych (np. krew, surowica, osocze, płyn mózgowo-rdzeniowy, mocz, ślina, nasienie i tym podobne), obrazowanie (np. radiologiczne, fluorescencyjne, optyczne, rezonansowe), (np. stosujące magnetyczny rezonans jądrowy („NMR”) lub elektryczny rezonans spinowy („SR”) itp. Po identyfikacji zwierzęcia za pomocą jednego lub więcej takich sposobów, zwierzę może być leczone agresywnie i/lub proaktywnie, aby zapobiec, suprymować, opóźnić lub wyleczyć zaburzenie fizyczne.
Zaburzenia fizyczne, którym można zapobiegać, lub je diagnozować lub leczyć za pomocą koniugatów, kompleksów, kompozycji i sposobów według wynalazku obejmują dowolne zburzenia fizyczne, dla których składnik bioaktywny (typowo składnik cytokiny, lub ich antagonista) koniugatów lub kompozycji może być stosowany w zapobieganiu, diagnozie lub leczeniu. Takie zaburzenia obejmują, ale nie są ograniczone do, szereg nowotworów (np. raki piersi, raki macicy, raki jajnika, raki prostaty, raki jąder, białaczki, chłoniaki, raki płuc, raki neurologiczne, raki skóry, raki głowy i szyi, raki kości, raki jelita grubego i inne raki przewodu pokarmowego, raki trzustki, raki pęcherza, raki nerki i inne raki, gruczolaki i szpiczaki); choroby jatrogenne; choroby zakaźne (np. choroby bakteryjne, choroby grzybowe, choroby wirusowe (obejmujące zapalenie wątroby, choroby powodowane przez wirus kardiotropowy, HIV AIDS i tym podobne), choroby pasożytnicze, i tym podobne); choroby genetyczne (np. mukowiscydoza, stwardnienie boczne zanikowe, dystrofia mięśniowa, choroba Gauchera, choroba Pompe'a, złożony wrodzony niedobór odporności, karłowatość i tym podobne), anemia, neutropenia, małopłytkowość, hemofilia i inne zaburzenia krwi; choroby neurodegeneracyjne (np. stwardnienie rozsiane („MS”, takie jak MS z wznową i remisją, pierwotne postępujące MS i wtórne postępujące MS i tym podobne), choroba Creuzfeldta-Jacoba, choroba Alzheimera i tym podobne; choroby enzymatyczne (np. dna, obecność moczanów w krwi, hipercholesterolemia i tym podobne); choroby o nieznanej lub wieloogniskowej etiologii (np. choroby układu krążenia, nadciśnienie, zapalna choroba jelit i tym podobne); choroby autoimmunizacyjne (np. ogólnoustrojowy rumień, reumatoidalne zapalenie stawów, łuszczyca i tym podobne) lub istotne medycznie zaburzenia, które będą jasne dla osoby o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie. Koniugaty, kompleksy, kompozycje i sposoby według wynalazku mogą być także stosowane w zapobieganiu progresji choroby, tak jak w chemoprewencji progresji zmiany chorobowej przedzłośliwej do złośliwej.
Terapeutyczne sposoby według wynalazku stosują więc jeden lub więcej koniugatów, kompleksów lub kompozycji według wynalazku, które mogą być podawane potrzebującemu tego zwierzęciu poprzez szereg dróg podawania, obejmujące doustnie, doodbytniczo, pozajelitowo (obejmując dożylnie, dotętniczo, domięśniowo, dootrzewnowo, docysternowo, podskórnie i iniekcje i wlewy do stawów), doustrojowo, dopochwowo, dootrzewnowo, miejscowo (za pomocą proszków, maści, kropelek lub łatek przezskórnych), doustnie jako sprej do ust lub do nosa lub poprzez inhalację. Według wynalazku skuteczna ilość koniugatów, kompleksów lub kompozycji może być podawana in vitro, ex vivo lub in vivo komórkom, tkankom, narządom lub zwierzętom cierpiącym na lub predysponowanym do dane30
PL 219 741 B1 go zaburzenia, w ten sposób zapobiegając, opóźniając, diagnozując lub lecząc zaburzenie u zwierzęcia. Jak jest to tu stosowane, „skuteczna ilość koniugatu (lub kompleksu lub kompozycji)” dotyczy ilości takiej, że koniugat (lub kompleks lub kompozycja) przeprowadza aktywność biologiczną bioaktywnego składnika (np. cytokiny lub jej antagonistów) koniugatu, kompleksu lub kompozycji w ten sposób zapobiegając, opóźniając, diagnozując lub powodując wyleczenie zaburzenia u zwierzęcia, któremu podano koniugat, kompleks lub kompozycję według wynalazku. Osoba o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie doceni, że skuteczne ilości koniugatów, kompleksów lub kompozycji mogą być ustalone empirycznie według standardowych metod dobrze znanych osobom o przeciętnych umiejętnościach w naukach medycznych i farmaceutycznych; patrz np. Bers, M.H. i wsp., (red) (1999) Merck Manual of Diagnosis & Therapy, wyd. 17, Merck and Co., Rathway, NJ; Hardman, J.G. i wsp., red. (2001) Goldman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, wyd. 10, McGraw-Hill Medical Publishing Division, New York; Speight, T.M. i wsp., red. (1997) Avery's Drug Treatment, wyd. 4, Adis International, Auckland, Nowa Zelandia; Katzung, B.G. (2000) Basic & Clinical Pharmacology, wyd. 8, Lange Medical Books/McGraw-Hill, New York; które to odnośniki i odnośniki w nich cytowane są tu włączone w całości w formie odniesienia.
Będzie zrozumiałe, że gdy jest podawana pacjentowi człowiekowi, całkowita dawka dzienna, tygodniowa lub miesięczna koniugatów, kompleksów i kompozycji według wynalazku będzie określona przez lekarza prowadzącego w zakresie dobrej oceny lekarskiej. Na przykład uzyskuje się zadawalające wyniki przez podawanie niektórych koniugatów, kompleksów lub kompozycji według wynalazku w odpowiednich dawkach w zależności od specyficznego stosowanego związku bioaktywnego, które to dawki będą łatwe do ustalenia przez osobę o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie stosując tylko rutynowe eksperymenty. Według tego aspektu wynalazku, koniugaty, kompleksy i kompozycje mogą być podawane raz lub w dawkach podzielonych, np. jeden lub dwa razy dziennie, lub jeden lub dwa razy na tydzień, lub jeden lub dwa razy na miesiąc itd. Odpowiednie dawkowanie dla różnych sposobów podawania (np. pozajelitowe, podskórne, domięśniowe, do oka, donosowe itd.) może być także łatwo ustalone empirycznie stosując tylko rutynowe eksperymenty lub będzie łatwo widoczne dla osoby o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie, w zależności od tożsamości składnika bioaktywnego (np. cytokiny lub jej antagonistów) koniugatu, kompleksu lub kompozycji.
W dodatkowych zastosowaniach koniugaty, kompleksy lub kompozycje według wynalazku mogą być stosowane do specyficznego adresowania diagnostycznego lub terapeutycznego czynnika do komórki, tkanki, narządu lub organizmu, który wyraża receptor dla, wiąże, włącza lub w inny sposób pobiera czynnik bioaktywny (tzn. cytokinę lub jej antagonistów) koniugatu, kompleksu lub kompozycji. Sposoby według tego aspektu wynalazku mogą obejmować, na przykład, kontaktowanie komórki, tkanki, narządu lub organizmu z jednym lub więcej koniugatami, kompleksami lub kompozycjami według wynalazku, które dodatkowo zawierają jeden lub więcej czynników diagnostycznych lub terapeutycznych, tak, że koniugat, kompleks lub kompozycja jest związana do lub pobierana przez komórkę, tkankę, narząd lub organizm, w ten sposób dostarczając czynnik diagnostyczny lub terapeutyczny do komórki, tkanki, narządu lub organizmu. Czynnik diagnostyczny lub terapeutyczny stosowany zgodnie z tym aspektem wynalazku może być, ale nie jest ograniczony do, przynajmniej jednym czynnikiem wybranym z kwasu nukleinowego, związku organicznego, białka lub peptydu, przeciwciała, enzymu, glikoproteiny, lipoproteiny, pierwiastka, lipidu, sacharydu, izotopu, węglowodanu, czynnika obrazującego, wykrywalnej sondy lub ich dowolnej kombinacji, co może być wykrywalnie oznakowane jak tu opisano. Czynnik terapeutyczny stosowany w tym aspekcie wynalazku może mieć efekt terapeutyczny na docelową komórkę (lub tkankę, narząd lub organizm), efekt może być wybrany z, ale nie jest ograniczony do, poprawienia defektywnego genu lub białka, działania leku, efektu toksycznego, efektu stymulacji wzrostu, efektu hamowania wzrostu, efektu metabolicznego, efektu katabolicznego, efektu anabolicznego, efektu przeciwwirusowego, efektu przeciwgrzybowego, efektu przeciwbakteryjnego, efektu hormonalnego, efektu neurohumoralnego, efektu stymulacji różnicowania komórek, efektu hamowania różnicowania komórek, efektu neuromodulacyjnego, efektu antyneoplastycznego, efektu przeciw guzowi nowotworowemu, efektu stymulacji lub hamowania insuliny, efektu stymulacji szpiku kostnego, efektu stymulacji pluripotencyjnych komórek macierzystych, efektu stymulacji układu odpornościowego, i dowolne inne znane efekty terapeutyczne, które mogą być dostarczone przez czynnik terapeutyczny dostarczony do komórki (lub tkanki, narządu lub organizmu) poprzez system dostarczania według tego aspektu wynalazku.
Takie dodatkowe czynniki terapeutyczne mogą być wybrane z, ale nie są ograniczone do, znanych i nowych związków i kompozycji obejmujących antybiotyki, steroidy, związki cytotoksyczne, leki
PL 219 741 B1 naczyniowoczynne, przeciwciała i inne czynniki terapeutyczne. Nieograniczające przykłady takich związków obejmują antybiotyki i inne leki stosowane w leczeniu szoku bakteryjnego, takie jak gentamycyna, tobramycyna, nafcylina, pozajelitowe cefalosporyny itd.; kortikosteroidy nadnercza i ich analogi takie jak deksametazon ograniczają uszkodzenia komórek powodowane przez endotoksyny; leki naczyniowoczynne takie jak czynniki blokujące receptor alfa adrenergiczny (np. fenoksybenzmaina) i agonista receptora heta adrenergicznego (np. izoproterenol) i dopamina.
Koniugaty, kompleksy i kompozycje według wynalazku mogą także być stosowane do diagnozy choroby i monitorowania odpowiedzi terapeutycznej. W pewnych takich metodach, koniugaty, kompleksy i kompozycje według wynalazku mogą zawierać jeden lub więcej wykrywalnych znaczników (takich jak te tu opisane gdzie indziej). W takich specyficznych metodach, te wykrywalnie znakowane koniugaty, kompleksy i kompozycje według wynalazku mogą być stosowane do wykrywania komórek, tkanek, narządów lub organizmów wyrażających lub w inny sposób pobierających składnik bioaktywny (np. cytokinę lub jej antagonistów) koniugatów, kompleksów lub kompozycji. W jednym przykładzie takich metod komórka, tkanka, narząd lub organizm jest kontaktowana z jednym lub więcej koniugatem, kompleksem lub kompozycją według wynalazku w warunkach, które sprzyjają wiązaniu lub pobieraniu koniugatu przez komórkę, tkankę lub organizm (np. przez wiązanie koniugatu do receptora na powierzchni komórki lub przez pinocytozę lub dyfuzję koniugatu do komórki) i następnie wykrywanie koniugatu związanego lub inkorporowanego do komórki stosując sposoby detekcji specyficzne względem stosowanego znacznika (np. detekcja fIuorescencji dla koniugatów znakowanych fIuorescencją; obrazowanie rezonansem magnetycznym dla magnetycznie znakowanych koniugatów; radioobrazowanie koniugatów znakowanych radioaktywnie itp.). Inne zastosowania takich wykrywalnie znakowanych koniugatów obejmują na przykład obrazowanie komórki, tkanki, narządu lub organizmu, lub wewnętrznej struktury zwierzęcia (w tym człowieka) przez podanie skutecznej ilości znakowanej formy jednego lub więcej koniugatów według wynalazku i pomiar wykrywalnej radioaktywności związanej z komórką, tkanką, narządem lub organizmem (lub zwierzęciem). Metody detekcji różnych typów znaczników i ich zastosowania są dobrze znane osobie o przeciętnych umiejętnościach i są tu opisane w innym miejscu.
W innym aspekcie koniugaty i kompozycje według wynalazku mogą być stosowane w metodach do modulacji stężenia lub aktywności specyficznego receptora składnika bioaktywnego koniugatu na powierzchni komórki, która wyraża taki receptor. Przez „modulację” aktywności danego receptora rozumie się, że koniugat po związaniu receptora albo aktywuje albo hamuje aktywność fizjologiczną, w której pośredniczy ten receptor (np. kaskadę sygnalizacji wewnątrzkomórkowej). Nie chcąc wiązać się z jakimkolwiek mechanistycznym wyjaśnieniem aktywności regulatorowej koniugatów według wynalazku, takie koniugaty mogą antagonizować aktywność fizjologiczną receptora komórkowego przez wiązanie receptora poprzez składnik bioaktywny koniugatu, w ten sposób blokując wiązanie naturalnego agonisty (np. nieskoniugowanego składnika bioaktywnego) i zapobiegając aktywacji receptora przez naturalnego agonistę zarazem nie wprowadzając znacznej aktywacji aktywności fizjologicznej samego receptora. Sposoby według tego aspektu wynalazku mogą obejmować jeden lub więcej etapów, na przykład kontaktowanie komórki (które może być przeprowadzone in vitro, ex vivo lub in vivo) z jednym lub więcej koniugatów według wynalazku w warunkach takich, że koniugat (tzn. bioaktywny składnik koniugatu) wiąże się do receptora dla składnika bioaktywnego na powierzchni komórki, ale nie aktywuje znacznie receptora. Takie sposoby będą pożyteczne w szeregu zastosowań diagnostycznych i terapeutycznych, jak łatwo doceni osoba o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie.
Zestawy
Wynalazek także dostarcza zestawy obejmujące koniugaty i/lub kompozycje według wynalazku. Takie zestawy typowo zawierają nośnik, taki jak pudełko, karton, tubę lub tym podobnie mający w ścisłym zamknięciu w środku jeden lub więcej pojemników takich jak fiolki, probówki, ampułki, butelki, strzykawki i tym podobnie, gdzie pierwszy pojemnik zawiera jeden lub więcej koniugatów i/lub kompozycji według wynalazku. Zestawy objęte przez ten aspekt wynalazku mogą dalej zawierać jeden lub więcej dodatkowych składników (np. odczynników i związków) potrzebnych do przeprowadzenia jednej lub więcej szczególnych aplikacji koniugatów i kompozycji według wynalazku, takich jak jeden lub więcej składników pożytecznych do diagnozy, leczenia lub zapobiegania danej chorobie lub zaburzeniu fizycznemu (np. jeden lub więcej dodatkowy terapeutyczny związek lub kompozycja, jeden lub więcej odczynnik diagnostyczny, jeden lub więcej nośnik lub zaróbka i tym podobnie), jedna lub więcej kompozycja lub koniugat według wynalazku, i tym podobnie.
PL 219 741 B1
Będzie łatwo widoczne dla osoby o przeciętnych umiejętnościach w odpowiedniej dziedzinie, że można zrobić inne odpowiednie modyfikacje i adaptacje sposobów i aplikacji tu opisanych bez oddalania się od zakresu wynalazku lub jego dowolnego wykonania. Obecnie po opisaniu szczegółowym wynalazku, to samo będzie jasno zrozumiałe przez odniesienie do następujących przykładów, które są tu włączone dla celu ilustracji i nie mają być ograniczające dla wynalazku.
P r z y k ł a d y
P r z y k ł a d 1: Koniugaty PEG-interferon-alfa
Interferon-alfa jest handlowo ważnym białkiem medycznym z rynkiem światowym w roku 2001 przekraczającym 2 biliony US $ przede wszystkim do leczenia pacjentów z zakażeniami wirusem zapalenia wątroby typu C („HCV”). W Stanach Zjednoczonych między trzy i cztery miliony osób jest zakażonych przewlekłym zapaleniem wątroby typu C i co roku jest około 10000 zgonów związanych z HCV (Chander, G. i wsp., (2002) Hepatology 36:5135-5144). Próbując poprawić pożyteczność IFN-alfa obie firmy, które są głównie odpowiedzialne za jego rozwój i sprzedaż (Schering-Plough Corp. i F. Hoffman-La Roche AG) opracowały i wylansowały handlowo koniugaty IFN-alfa z glikolem monometoksypolietylenowym lub „mPEG”. W każdym przypadku mPEG jest połączony do każdej cząsteczki interferonu alfa tylko w jednym punkcie przyłączenia. W każdym przypadku produkt zawiera mieszaninę izomerów pozycyjnych z wyraźnie obniżoną zdolnością wiązania w porównaniu z niezmodyfikowanym interferonem. W każdym przypadku zwiększona biodostępność i czas trwania koniugatu in vivo więcej niż kompensuje obniżoną bioaktywność in vitro, która jest wynikiem koniugacji PEG mierzonej za pomocą poprawionej klinicznej skuteczności jednego zastrzyku koniugatu tygodniowo w porównaniu ze trzema zastrzykami niezmodyfikowanego białka tygodniowo, do leczenia przewlekłego zakażenia HCV (Manns, M.P. i wsp., (2001), Lancet 358:958-965).
W koniugacie PEG-interferon-alfa-2a Hoffman-LaRoche dwie nici 20-kDa mPEG są przyłączone do pojedynczego linkera lizynowego (tak zwany „rozgałęziony PEG”), który jest przyłączony przede wszystkim do jednej z Lys 31, Lys 121, Lys 131 lub Lys 134 (Bailon, P. i wsp., powyżej), z których wszystkie są w lub w pobliżu domeny wiążącej receptor interferonu-alfa-2a (patrz miejsce wiązania 1 na Fig. 1a).
W koniugacie PEG-interferon-alfa-2b Schering-Plough Corp., pojedyncza nić 12-kDa mPEG jest przyłączona przede wszystkim do reszty histydyny w pozycji 34 (His 34; Wylie, D.C. i wsp., powyżej, Gilbert, C.W. i wsp., Patent US Nr 6,042,822; Wang, Y.-S., i wsp., powyżej), która jest w regionie, który jest ważny dla wiązania do receptora (patrz Figura 1b). Widać także, że inne miejsca przyłączenia PEG w produkcie Schering-Plough (Lys 121, Tyr 129 i Lys 131) są w lub w pobliżu miejsca wiązania 1 (Fig. 1b).
W przeciwieństwie do tych dwóch produktów handlowych, koniugat według wynalazku ma pojedynczą nić rozpuszczalnego w wodzie syntetycznego polimeru, korzystnie PEG lub mPEG, przyłączoną do N-końcowej reszty aminokwasu, która jest odległa od regionu wiązania receptora białka (patrz stosunek przestrzenny między Cys-1 i miejscami wiązania na Fig. 1c i 1d), wykazującymi, że interferon-alfa jest cytokiną „RN”. Fig. 9 i 10 przedstawiają odpowiednio, chromatogram wymiany kationowej i wykluczania wielkości przykładowego koniugatu PEG-interferon-alfa według wynalazku. Mieszanina reakcyjna przedstawiała interferon-alfa-2b, w którym dodatkowa reszta metioniny była obecna na końcu aminowym, poprzedzając Cys-1, która jest pierwszą resztą sekwencji naturalnej. Reaktywny PEG był 20-kDa aldehydem PEG, który był obecny w stężeniu 0,2 mM. Czynnikiem redukującym był cyjanoborowodorek sodu w końcowym stężeniu 14 mM. Postęp reakcji monitorowano okresowo poprzez chromatografię wykluczania wielkości w czasie inkubacji w 4°C. Chociaż I FN-alfa był dostatecznie rozpuszczalny by mógł być PEGylowany w opisanych warunkach, inne cytokiny, np. IFN-beta są mniej rozpuszczalne i może być konieczna ich PEGylacja w obecności związku powierzchniowo czynnego, jak opisali dla IFN-alfa C.W. Gilbert i wsp., (Patent US Nr 5,711,944) i dla interferonu alfa i beta R.B. Greenwald i wsp., (Patent US Nr 5,738,846).
Kolumna kationowymienna stosowana do frakcjonowania przedstawiona na Fig. 9 była ToyoPearl MD-G SP (1x6,8 cm; Tosoh Biosep, Montgomeryville, PA), rozwijana liniowym gradientem 0-0,4 M NaCl w 20 mM buforze octan sodu, pH 4,6 z tempem przepływu 0,5 mL/minutę. Kolumna wykluczania wielkości stosowana do uzyskania danych na Fig. 10 była Superdex® 200 (HR 10/30; Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) eluowana przy 0,5 mL/minutę w 20 mM buforze octan sodu zawierającym 150 mM NaCl, pH 4,6. Inne odpowiednie podłoża do chromatografii i jonowymiany i warunki frakcjonowania są znane osobom biegłym w dziedzinie. Analiza aminokońcowych aminokwasów za pomocą automatycznej degradacji Edmana oczyszczonego monoPEG-IFN-alfa-2b według
PL 219 741 B1 wynalazku wykazała, że > 90% PEG była przyłączona do reszty N-końcowej. Analizę przeprowadzili Commonwealth Biotechnologies, Inc. (Richmond, VA).
P r z y k ł a d 2: Koniugaty PEG-interleukina-2
Interleukina-2 („IL-2”) jest cytokiną, która wykazuje aktywność immunomodulacyjną przeciw pewnym nowotworom, w tym rakowi komórek nerki i czerniakowi złośliwemu. Jednak skuteczność kliniczna jest słaba, co powoduje, że tylko niewielka część pacjentów ma częściowe lub całkowite odpowiedzi (Weinreich, D.M. i wsp., (2002) J. Immunother 25:185-187). IL-2 ma krótki okres połowicznego rozpadu w krwiobiegu, co jest wskazane przez niską częstość indukcji remisji u pacjentów chorych na raka. Próby uczynienia IL-2 bardziej użyteczną przez losową PEGylację reszt lizyny nie były optymalne (Chen, S.A. i wsp., (2000) J Pharmacol Exp Ther 293:248-259). Próby selektywnego przyłączenia PEG do IL-2 w jej miejscu glikozylacji (Goodson, R.J. i wsp., powyżej) lub w nie niezbędnej cysteinie (Cys 125) lub do mutein IL-2 zawierających cysteinę między resztami 1 i 20 (Katre, N. i wsp., Patent US Nr 5,206,344) nie doprowadziły do klinicznie użytecznych produktów.
Fig. 4 pokazuje rozmieszczenie reszt lizyny względem regionów wiążących receptor IL-2, pokazując, że wiele dostępnych powierzchniowo reszt lizyny jest w regionach, które biorą udział we wiązaniu receptora. Faktycznie, zidentyfikowano Lys-35 i Lys-43 jako wymagane dla interakcji z receptorem alfa dla IL-2, sugerując mechanizm inaktywacji IL-2 przez PEGylację reszt lizyny (patrz SEQ ID NO: 6). Figura 4 także pokazuje, że N-końcowy region IL-2 jest odległy od regionów wiążących receptor białka, wskazując, że IL-2 ma strukturę cytokiny „RN”. Nasz wniosek, że IL-2 jest cytokiną RN jest kompatybilny z obserwacjami H. Sato i wsp., ((2000) Bioconjug Chem 11:502-509), który stosował enzymatyczną transglutaminację do przyłączenia jednej lub dwóch nici 10-kDa mPEG do jednej lub dwóch reszt glutaminy („Q”) w sekwencji AQQIVM, które ci autorzy wprowadzili do muteiny IL-2 jako N-końcowe przedłużenie. Sato i wsp., opisali, że ich koniugat, który był PEGylowany w pobliżu końca aminowego przez transglutaminację zachowywał więcej bioaktywności niż koniugat przygotowany przez losową PEGylację lizyn muteiny IL-2. Dla przeglądu podobnych podejść do PEGylacji innych białek patrz Sato, H., (2002) powyżej. W oparciu o przestrzenny rozdział końca aminowego IL-2 od regionów wiążących receptor białka, jak przedstawiono na Fig. 4, można zrozumieć, że miejsce glikozylacji w reszcie Thr-3 (nie przedstawione) czyni IL-2 białkiem „RG” wiążącym receptor, jak tu zdefiniowano. Tak więc IL-2 jest zarówno cytokiną RN i cytokiną RG.
Fig. 11 i 12 przedstawiają odpowiednio chromatogramy wymiany kationowej i wykluczania wielkości, przykładowego koniugatu PEG-IL-2 według wynalazku, który był PEGylowany poprzez selektywną dla N-końca redukcyjną alkilację, jak w przykładzie 1. Warunki stosowane do frakcjonowania były te same jak te opisane dla Fig. 9 i 10, odpowiednio. Fig. 13 przedstawia analizę za pomocą elektroforezy w żelu tego samego koniugatu w obecności siarczanu dodecylu sodu („SDS-PAGE”), przed i po jego oczyszczeniu za pomocą chromatografii jonowymiennej jak przestawiono na Fig. 11. Żel zawierał gradient 4-12% całkowitego akrylamidu w buforze Bis-Tris (Nr Katalogu NP0335, Invitrogen, Carlsbad, CA). Próbki, każda zawierająca około 1-2 mcg białka podgrzano w 90°C przez 10 minut przed analizą. Elektroforezę prowadzono przy stałym napięciu 117-120 przez około 135 minut, z chłodzeniem. Jedną część żelu wybarwiono barwnikiem do żeli Sypro® Ruby (Molecular Probes, Eugene OR) i drugą część wybarwiono na PEG przez adaptację metod C.E. Childs ((1975) Microchem J 20:190-192) i B. Skoog ((1979) Vox Sang 37:345-349). Analiza aminokwasu aminokońcowego za pomocą automatycznej degradacji Edmana oczyszczonej monoPEG-IL-2 w każdym z dwóch szczytów z Fig. 11 wykazała, że ponad 90% PEG było przyłączone do reszty N-końcowej. Analiza była przeprowadzona przez Commonwealth Biotechnologies, Inc. (Richmond, VA).
P r z y k ł a d 3: Białka będące i nie będące członkami klasy „RN” białek wiążących receptor
Fig. 2, 3 i 5-8 pokazują rozmieszczenie na powierzchni reszt lizyny białek wiążących receptor interferonu-beta, czynnika stymulującego kolonie granulocytów-makrofagów („GM-CSF”), nabłonkowego czynnika wzrostu („EGF”), zasadowego fibroblastowego czynnika wzrostu („bFGF”, który jest także znany w dziedzinie jako „FGF-2”), insulinopodobnego czynnika wzrostu-1 („IGF-1”) i interferonu-gamma („IFN-gamma”) względem ich regionów wiążących receptor jak i pokazują, które z tych białek są cytokinami i czynnikami wzrostu „RN”. Dodatkowo Fig. 2 pokazuje, że interferonbeta jest cytokiną „RG”.
Fig. 2 pokazuje reszty lizyny rozmieszczone w regionach miejsca wiązania 1 i miejsca wiązania 2 interferonu- beta, podczas gdy koniec aminowy łańcucha polipeptydowego jest odległy od regionów wiążących receptor białka, wykazując, że IFN-beta jest cytokiną RN.
PL 219 741 B1
Fig. 3 pokazuje reszty lizynowe rozmieszczone w regionach miejsca wiązania 1, które wiąże receptor alfa, i miejsca wiązania 2, które wiąże receptor beta, GM-CSF, podczas gdy koniec aminowy łańcucha polipeptydowego jest odległy od regionów wiążących receptor białka, wykazując, że GM-CSF jest cytokiną RN.
Fig. 5 pokazuje reszty lizynowe rozmieszczone wzdłuż łańcucha polipeptydowego nabłonkowego czynnika wzrostu („EGF”) obejmujące reszty lizyny, które są w lub w pobliżu regionów wiążących receptor białka, podczas gdy koniec aminowy łańcucha polipeptydowego jest bardziej odległy od regionów wiążących receptor białka.
Fig. 6 pokazuje, że kilka reszt lizyny zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów („bFGF”) bierze udział w wiązaniu receptorów lub heparyny, które są oba potrzebne do transdukcji sygnału przez bFGF (Schlessinger, J. i wsp., powyżej). Koniec aminowy bFGF jest odległy od regionu wiążącego heparynę bFGF i może być dostatecznie odległy od miejsc wiązania receptora, by uczynić bFGF czynnikiem wzrostu RN.
Fig. 7 pokazuje, że kilka reszt lizyny insulinopodobnego czynnika wzrostu-1 („IGF-1”) jest w obrębie lub przylega do regionów wiążących receptor polipeptydu, podczas gdy koniec aminowy IGF-1 jest odległy od regionów wiążących receptor wykazując, że IGF-1 jest czynnikiem wzrostu RN.
Fig. 8 pokazuje, że interferon-gamma („IFN-gamma”) istnieje jako homodimer, w którym dwa łańcuchy polipeptydowe mają rozległe interakcje. Kilka reszt lizyny każdego polipeptydu przylega do reszt aminokwasów IFN-gamma, o których wiadomo, że biorą udział we wiązaniu receptorów lub są na styku dimeryzacji. Format „kulka i kijek” reszty aminokwasu Gln-1 ma być odbiciem dowodów na funkcjonalną istotność tej reszty N-końcowej. (Struktura krystaliczna, na której jest oparta ta figura zawierała dodatkową metioninę, oznakowaną „Met-0”, która nie jest obecna w naturalnym białku). Ponieważ N-końcowe reszty IFN-gamma są odległe od styku dimeryzacji, N-PEGylacja mogłaby by unikać hamujących efektów PEGylacji lizyny na homodimeryzację IFN-gamma. Z drugiej strony interakcje dimeru z jego receptorami będą prawdopodobnie hamowane przez przyłączanie polimerów do końca aminowego, szczególnie gdy są przyłączone długie łańcuchy polimeru.
IFN-gamma, IL-10 i czynnik komórek macierzystych są przykładami cytokin, które działają jako homodimery (Walter, M.R. i wsp. powyżej; Josephson, K. i wsp. (2000) J Biol Chem 275:13552-13557; McNiece, I.K. i wsp., powyżej). Dimeryzacja białek wiążących receptor stawia specjalne zagadnienia dla charakterystyki ich N-końcowo monoPEGylowanych koniugatów, ponieważ różne możliwe struktury molekularne mogą być obecne w preparatach koniugatów z podobnymi lub identycznymi wielkościami i kształtami. Na przykład, dimer, który jest złożony z jednego diPEGylowanego monomeru i jednego niePEGylowanego monomeru (PEG2-białko1 + białko1) byłby trudny lub niemożliwy do odróżnienia od dimeru, który jest złożony z dwóch N-końcowo PEGylowanych monomerów (PEG1białko1)2 na podstawie większości analiz opartych na wielkości dimerycznego koniugatu (np. chromatografia wykluczania wielkości lub ocena stałej sedymentacji, rozpraszania światła lub współczynnika dyfuzji), jednak moc wiązania receptora tych dwóch koniugatów, z których każdy zawiera jeden PEG na białko monomeru, może być całkiem różna.
Dla białek wiążących receptor o długołańcuchowych kartkach beta, które tworzą homotrimery, np. czynnik martwicy guzów alfa („TNF-alfa”) liczba izomerów trimerów PEG3-białko3 jest jeszcze większa niż dla białek wiążących receptor, które występują w roztworze jako homodimery. Ponieważ wykazano, że modyfikacja chemiczna TFN w pobliżu końca aminowego inaktywuje tę cytokinę (Utsumi, T. i wsp. (1992) Mol Immunol 29:77-81) nie jest prawdopodobne, by TNF-alfa zachował znaczną aktywność po PEGylacji odczynnikami i w warunkach, które są selektywne dla reszty N-końcowej.
Dla charakterystyki koniugatów i cytokin, które działają jako oligomery wymagana jest kombinacja metod analitycznych. Analiza sekwencji aminokońcowych może wykryć obecność monomerów z wolnymi N-końcowymi grupami alfa aminowymi i analiza elektroforetyczna rozdysocjowanych monomerów (np. SDS-PAGE lub elektroforeza kapilarna) może wykazać obecność niePEGylowanych i wielokrotnie PEGylowanych monomerów białek wiążących receptor. Bez takich dowodów, synteza monoPEGylowanych koniugatów takich białek tworzących homodimery i homotrimery nie może być jednoznacznie wykazana.
Te przykłady, szczególnie jak pokazano graficznie na Fig. 1-8, dostarczają łatwo wizualizowaną podstawę do rozumienia potencjalnej roli zawady przestrzennej interakcji białko-receptor przez PEGylację białek wiążących receptor w obrębie lub w pobliżu domen wiążących receptor tych składników bioaktywnych. Duża objętość, która jest zajmowana przez wysoce rozciągnięte i elastyczne nici PEG (patrz Fig. 1d) także by tworzyła zawadę przestrzenną dla asocjacji monomerów pewnych białek wiąPL 219 741 B1 żących receptory do funkcjonalnych homodimerów lub homotrimerów, jeśli PEG by był przyłączony w regionach, które są wymagane do interakcji między monomerami. Tak więc adresowanie PEGylacji do miejsc, które są odległe od regionów wiążących receptor zmniejsza szansę, że PEG będzie interferować z reakcjami międzycząsteczkowymi, które są wymagane do ich funkcjonowania. Przez postępowanie według tego sposobu wynalazku można uzyskać więcej korzyści oczekiwanych z PEGylacji białek wiążących receptory. Powstałe koniugaty łączą oczekiwane korzyści polepszonej rozpuszczalności, zwiększonej biodostępności, większej stabilności i zmniejszonej immunogenności z nieoczekiwanie wysokim zachowaniem bioaktywności.
P r z y k ł a d 4. PEGylacja interferonuy-1b za pomocą alkilacji redukcyjnej
W jednej serii wykonań koniugaty interferonuy-1b („IFNy-1b”; SEQ ID NO: 1) z monometoksyPEH („mPEG”) syntetyzowano za pomocą redukcyjnej alkilacji z 20-kDa lub 30-kDa aldehydem mPEG, stosując kompleks boran-pirydyna jako czynnik redukujący. Interferony-1b, wolny od białek nośnikowych i w stężeniu około 1,9 mg/mL w roztworze zawierającym około 3 mg/mL SDS uzyskano od Chiron Corporation (Emeryville, CA). To białko jest określane jako „BETASERON®” w formule, która jest sprzedawana przez Berlex Laboratories, filię w USA Schering A.G., i jako „BETAFERON®” w formule sprzedawanej bezpośrednio przez Schering. Kompleks boran-pirydyna (Aldrich 17,975-2, Milwaukee, WI) rozcieńczono do 450 mM boranu w 60% (obj/obj) wodnym acetonitrylu. 20-kDa mPEG n-propionoaldehyd („PEG-aldehyd”) NOF Corporation, Tokio) rozpuszczono w 1 mM HCl w stężeniu 30 mg/mL. Po rozpuszczeniu dodano 0,1 mL roztworu PEG-aldehyd do 0,7 mL roztworu IFN^-1b i zmieszano. Dodatek 0,05 mL 100 mM buforu octanowego, pH 4,6 dało mieszaninie reakcyjnej ostateczny pH 5. Do innej mieszaniny reakcyjnej zawierającej 0,1 mL roztworu aldehydu-PEG i 0,7 mL roztworu IFN^-1b, dodano 0,05 mL mieszaniny 200 mM kwasu octowego, 200 mM Na2HPO4 i 68 mM NaOH do uzyskania ostatecznego pH 6,4. Do trzech próbek 0,85 mL każdej z tych mieszanin dodano 0,1 mL wody, albo 1,5 M NaCl lub 10 mg/mL SDS. Następnie dodano rozcieńczony kompleks boranpirydyna do każdej mieszaniny reakcyjnej aby uzyskać końcowe stężenie boranu 23 mM. Każdą z powstałych mieszanin reakcyjnych rozdzielono do dwóch probówek, które inkubowano przez 2 dni albo w 4°C albo w temperaturze pokojowej. Próbki mieszanin reakcyjnych analizowano przez HPLC wykluczenia wielkości w 10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,3, zawierającym 0,3 mg/mL SDS z tempem przepływu 0,5 mL/min na kolumnie Superose™12 (Amersham Biosciences HR 10/30; Piscataway, NJ). Absorbancję eluatu śledzono przy 214 nm. Przy stosunku wyjściowym około 2 moli PEG na mol białka główną formą był monoPEGylowany interferony-1b (PEGrIFNy-1b). Wydajność PEGi-IFNy-1b wynosiła między 65% i 72% we wszystkich testowanych warunkach (w pH 5 lub pH 6,6; w 4°C lub temperaturze pokojowej; w obecności lub nieobecności NaCl lub dodatkowego SDS).
W innych doświadczeniach stosowano NaBH3CN jako środek redukujący i próbki analizowano za pomocą HPLC wykluczenia wielkości na kolumnie Superdex 200 HR 30/10 (Amersham Biosciences) w 10 mM octanie, 150 mM NaCl, pH 4,6, zawierającym 1 mg/mL SDS, z tempem przepływu 0,5 mL/min, Wyniki jednego takiego doświadczenia przedstawiono na Fig. 14. Stężenia wyjściowe 20-kDa mPEG były około 0,1 mM, 0,2 mM i 0,4 mM (określone jako „1x”, „2x” i „4x” na Fig. 14, odpowiednio) i mieszaniny reakcyjne inkubowano w temperaturze pokojowej przez 3 dni. Próbka kontrolna (dolna linia) była inkubowana tylko z odczynnikiem redukującym. Gdy te same próbki poddano chromatografii w tych samych warunkach poza pominięciem SDS z buforu do elucji nie wykryto niePEGylowanego IFN^-1b w eluacie. Podobne wyniki uzyskano gdy zastosowano 30-kDa propionaldehyd mPEG zamiast 20-kDA n-propionaldehydu mPEG w metodach przykładu 4. Podobne wyniki uzyskano także gdy zastosowano 10-kDa propionaldehyd mPEG zamiast 20-kDA n-propionaldehydu mPEG. Alternatywnie mogą być stosowane mPEG-acetaldehydy lub butyroaldehydy. Selektywna N-końcowa PEGylacja IFN-beta za pomocą sposobu tego przykładu daje koniugaty ze zwiększoną bioaktywnością niezależnie czy N-końcowy aminokwas jest seryną, jak w IFN^-1b, metioniną, jak w IFNy-1a, lub innym aminokwasem.
P r z y k ł a d 5: Oznaczenie stopnia N-końcowej PEGylacji za pomocą cięcia oksydacyjnego
Oceniono ułamek PEG przyłączonego do grupy alfa aminowej N-końcowej reszty seryny białka raczej niż grup epsilon aminowych dostępnych reszt lizyny, za pomocą nowego sposobu obejmującego oksydacyjne cięcie alkilowanej reszty seryny. Mieszaninę reakcyjną, w której PEGi-IFNy-1b był główną formą (około 70% całkowitego białka) dializowano wobec 1 mg/mL SDS w buforze octanowym, pH 4,6. pH następnie doprowadzono do 7,4 przez dodanie 10 mM Na3PO4. Porcje tego roztworu inkubowana w 4°C przez do 20 godzin w nieobecności nadjodanu sodu lub z ostatecznymi stężeniami 0,1 do 10 MM NaIO4. Po inkubacji mieszaniny reakcyjne poddano chromatografii na kolumnie Supero36
PL 219 741 B1 se™6 w 10 mM buforze octanowym, 150 mM NaCl, pH 4,6, zawierającym 1 mg/mL SDS. Podobne wyniki pod względem odzyskania monoPEGylowanego IFN-p-1b uzyskano na kolumnie Superose 12, z zaletą, że kolumna Superose 12 pozwoliła na oddzielenie niezmodyfikowanego IFN-p-1b od „szczytu soli”. Wykres powierzchni pod szczytami absorbancji przy 214 nm odpowiadający PEG1-IFN-3-1b względem stężeniu nadjodanu pokazał szybki spadek w obszarze do około 1 mM nadjodanu i nieomal stały poziom resztkowego PEG1-IFN-3-1b między około 1 mM i 10 mM nadjodanem. Podobne analizy po traktowaniu > 3 mM nadjodanem przez 0,2, 2 lub 7 godzin wykazały, że cięcie oksydacyjne PEG związanego z seryną było zasadniczo kompletne W ciągu 2 godzin. Resztkowe koniugaty PEG zawierały tyko PEG związany z lizyną, które to wiązanie było stabilne przy traktowaniu do co najmniej 10 mM nadjodanem. Frakcja koniugatów, które zniosły utlenianie nadjodanem była podobna do frakcji ocenionej na podstawie degradacji Edmana jako PEGylowana w innych miejscach niż aminokońcowe. Podobne wyniki uzyskano, gdy oceniano dystrybucję koniugatów, które są stabilne lub niestabilne w procedurach oksydacji opisanych w tym przykładzie za pomocą szeregu metod analitycznych obejmujących, ale nie ograniczonych do, chromatografię fazy odwróconej, elektroforezę kapilarną, elektroforezę w żelu, ultrawirowanie, spektroskopię mas, rozpraszanie światła lub ultrawirowanie.
Interferon-3-1b połączono z 20-kDa aldehydem PEG z kompleksem boran-pirydyna jako czynnikiem redukującym w różnych warunkach, jak opisano w Przykładzie 4. MonoPEGylowany IFN-3-1b oczyszczono za pomocą chromatografii na kolumnie Superose12 w 20 mM buforze fosforan sodu, 150 mM NaCl, pH 7,4, zawierającym 0,3 mg/mL SDS z tempem przepływu 0,5 mL/min. Części oczyszczonych koniugatów PEG1-IFN-3-1b inkubowano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny w obecności lub nieobecności 3 mM nadjodanu sodu. Fig. 15 przedstawia chromatogramy nie traktowanych i ciętych oksydacyjnie próbek PEG1-IFN-3-1b na kolumnie Superose 12 w 10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,3 zawierającym 0,3 mg/mL SDS, puszczanej z szybkością 0,5 mL/min. Te dane wskazują, że około 90% PEG W PEG1-IFN-3-1b syntetyzowanego w pH 6,4 było połączone z Nkońcową seryną. Ten wynik nie był zmieniony znacząco przez przeprowadzenie przyłączania po dodaniu albo 150 mM NaCl (dolna krzywa) lub 1 mg/mL SDS (górna krzywa) do mieszanin reakcyjnych lub przez przeprowadzenie reakcji sprzęgania w pH 5 (dane nie przedstawione). Podobne wyniki uzyskano gdy podstawiono monohydroksyPEG n-propionaldehydy za mPEG propionaldehydy lub gdy stosuje się aldehydy PEG inne niż n-propionoaldehyd. Podobnie, sposób w tym przykładzie mierzy stopień N-końcowego redukcyjnie alkilowanych białek innych niż IFN-p-1b, gdzie takie białka mają N-końcową resztę seryny lub treoniny. Podobnie oksydacyjne cięcie polimerów połączonych za pomocą redukcyjnej alkilacji do N-końcowych reszt seryny lub treoniny można uzyskać stosując nadjodany inne niż nadjodan sodu, obejmujące, ale nie ograniczone do, metanadjodan sodu (określane gdzie indziej i znane w dziedzinie jako nadjodan sodu), metanadjodan potasu, metanadjodan litu, nadjodan wapnia, nadjodan i kwas nadjodowy.
Koniugaty polimerowe syntetyzowane za pomocą alkilacji redukcyjnej innych cytokin, do których można stosować metodę tego przykładu 5 obejmują interleukinę-1-alfa (Geoghegan, K.F. i wsp., powyżej) i czynnik wzrostu i rozwoju megakariocytów (Guerra, P.L. i wsp., powyżej).
P r z y k ł a d 6: Oczyszczanie koniugatów i usuwanie wolnego PEG i SDS za pomocą chromatografii fazy odwróconej
Chromatografię fazy odwróconej („RP”) stosowali S. Hershenson i wsp. (Patent US Nr 4,894,330) do oczyszczenia IFN-p-1b po jego ekspresji w hodowli komórek bakterii.
Obecni wynalazcy przystosowali metody Hershenson i wsp. do rozdziału poszczególnych PEGylowanych form syntetyzowanych w przykładzie 4 z niezmodyfikowanego białka. Ta procedura także oddzieliła wolny PEG i większość SDS od szczytów białka. Fig. 16 przedstawia analityczny chromatogram na kolumnie Jupiter™ C4 300A (15 cm x 4,6 mm; Phenomenex; Torrance, CA) z gradientem 20% acetonitrylu plus 0,04% kwas trifIuorooctowy do 80% acetonitrylu plus 0,1% kwas trifIuorooctowy. Naładowano jedną dziesiątą mililitra mieszaniny reakcyjnej i zebrano frakcje 0,5 mL z tempem przepływu 1 mL/min. Szczyt IFN-p-1b, który był niezmodyfikowany z wyjątkiem kontaktu z odczynnikami do PEGylacji („pozornie PEGylowany”) i szczyty koniugatów PEG zawierających jedną lub więcej nici PEG na cząsteczkę białka wykrywano przez monitorowanie absorbancji przy 280 nm (krzywa ciągła). W tym eksperymencie kolumnę utrzymywano w 40°C. Jakościowo podobne wyniki, ale z innymi czasami retencji uzyskano przy chromatografii w temperaturze pokojowej.
Białe trójkąty pokazują wyniki oznaczeń SDS w zebranych frakcjach. Roztwór wzorcowy odczynnika do oznaczania SDS zawierał 1 mg/mL barwnika karbocyjaninowego, Stains-All (Sigma #E-9379; 3,3'-dietylo-9-metylo-4,5,4',5'-dibenzotiokarbocyjanina) w 50% (obj/obj) wodnym izopropanolu (TuscoPL 219 741 B1 ni, F. i wsp., (2001) Anal Biochem 295:31-37). Odczynnik roboczy przygotowywano bezpośrednio przed użyciem przez zmieszanie 2 mL roztworu wzorcowego plus 2 mL N,N-dimetyIoformamidu i 41 mL wody. Dodatek SDS do tego odczynnika powodował zmiany widma, które są specyficzne dla SDS i powodował zmniejszenie szczytu absorbancji przy 510-515 nm i pojawienie się szczytu absorbancji przy 439 nm. Zmiany w absorbancji przy 439 nm po dodaniu 2 mcL każdej frakcji z kolumny chromatografii RP do 250 mcL odczynnika roboczego w 96-studzienkowej płytce monitorowano na czytniku płytek SpectraMax 250 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
Wyniki oznaczenia PEG w zebranych frakcjach przedstawiają czarne kółka na Fig. 16. Odczynnik do oznaczania PEG przygotowano bezpośrednio przed użyciem przez zmieszanie 1 objętości 20% (masa/obj) chlorku baru w 1 N HCl z 4 objętościami 4 mg/mL jodu w 1% (masa/obj) jodku potasu. Z każdej frakcji z kolumny do chromatografii RF (i standardów PEG) dodano próbkę 10 mcL do 90 mcL wody w studzienkach płytki 96-studzienkowej, a następnie dodano 100 mcL odczynnika do oznaczania PEG. Po zmieszaniu próbek i odczynnika i inkubacji w temperaturze pokojowej przez 15 minut, mierzono absorbancję przy 508 nm czytnikiem do płytek SpectraMax. Wykresy na Fig. 16 pokazują, że chromatografia RP w tych warunkach rozdzieliła pozornie PEGylowane białko od koniugatów zawierających jedną lub więcej nici 20-kDa PEG podczas rozdzielania niezwiązanego PEG i SDS od koniugatów. Podobne wyniki uzyskano z koniugatami zawierającymi PEG o innych masach cząsteczkowych (np. 10-kDa lub 30-kDa PEG) i inne stabilne w kwasie wiązania między PEG i IFN-Mb.
P r z y k ł a d 7: Analizy chromatograficzne i elektroforetyczne oczyszczonych frakcji z preparatywnej HPLC fazy odwróconej
Chromatografię fazy odwróconej w warunkach podobnych do tych opisanych w przykładzie 6 przeprowadzono na większych próbkach (0,3 lub 0,5 mL) mieszanin reakcyjnych do PEGylacji na tej samej kolumnie Jupiter C4 ze zmodyfikowanym gradientem. Gdy ładowano większe próbki, rozdział między różnymi formami interferonu (pozornie PEGylowany, PEG--IFN-Mb lub koniugatu z więcej niż jedną nicią PEG) nie był tak jasny jak przedstawiony na Fig. 16. Tym niemniej uzyskano frakcje, które były w wysokim stopniu wzbogacone w albo pozornie PEGylowane albo monoPEGylowane białko, jak pokazano za pomocą ponownej chromatografii małych próbek częściowo oczyszczonych frakcji na tej samej kolumnie RP (Fig. 17). Chromatogramy analizowano stosując oprogramowanie EZCHrom Elite (Scientific Software, Inc., Pleasanton, CA). Z tej analizy preparaty pokazane na górnej krzywej (Frakcja 51) zawierały około 99% PEG--IFN-Mb, podczas gdy preparaty pokazane na środkowej krzywej (Frakcja 51) zawierały około 99% PEG--IFN-Mb. Dolna krzywa na Fig. 17 pokazuje chromatograf mieszaniny reakcyjnej, z której pochodzą frakcje, w której około 19% absorbancji była związana z pozornie PEGylowanym białkiem, około 61% ze szczytem PEG1-IFN i około 12% ze szczytem oznaczonym PEG2-IFN, i 5-6% z formami, które eluowały wcześniej niż PEG2-IFN. Jakościowo podobne wyniki uzyskano gdy stosowano kolumny fazy odwróconej od innych producentów.
Ta sama mieszanina reakcyjna (analizowana za pomocą chromatografii RP na Fig. 17) i dwie frakcje PEG-interferonu oczyszczone za pomocą chromatografii RP analizowano za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym w obecności SDS („SDS-PAGE”). Wyniki przedstawiono na Fig. 18 i 19. Repliki próbek inkubowano z czynnikiem redukującym (Invitrogen, #NP0004, Carlsbad, CA) lub bez odczynnika redukującego przez 10 minut albo w temperaturze otoczenia lub w 102°C i poddano elektroforezie przez 140 minut przy 120 V przez 4-12% żel Bis-Tris (Invitrogen, #NP0321B). Wykresy przedstawione na Fig. 18 i 19 były z próbek, które nie były ani redukowane ani grzane. Białka w żelu barwiono SYPRO® Ruby Stain (Molecular Probes #S-12000, Eugene, OR), naświetlano przy 302 nm i fotografowano stosując filtr światła widzialnego Orange/Red (Molecular Probes, #3-6655) (Fig. 18). Digitalne obrazy analizowano stosując oprogramowanie ID Imaging Analysis od Kodak (Rochester, NY). Oś horyzontalna przedstawia odległość migracji względem czoła barwnika (100 jednostek) i oś pionowa przedstawia względną intensywność fluorescencyjnego barwnika białek. Wartości podstawowe z różnych ścieżek przesunięto pionowo by ułatwić analizę przedstawionych wyników. Dolny ślad przedstawia mieszaninę białek standardowych (Markl2™, #LC5677 od Invitrogen), w którym szczyty o numerach 1 do 9 są identyfikowane jako białka mające następujące masy cząsteczkowe (wszystkie w kDa): 200, 116, 97,1, 66,3, 55,4, 36,5, 31,0, 21,5 i 14,4. Drugi ślad od dołu pokazuje analizę elektroforetyczną mieszaniny reakcyjnej. W tej mieszaninie procenty barwnika białek związanego z każdą formą IFNA-1b były: 14% pozornie PEGylowany; 64% PEG1-IFN; 20% PEG2-IFN i około 2% form większych niż PEG2-IFN. Trzeci ślad od dołu przedstawia frakcję z kolumny chromatograficznej RF, która zawierała 33±1% PEG1-IFN; 64±1% PEG2-IFN i około 6% form większych niż PEG2-IFN. Górna krzywa pokazuje frakcję zawierającą 95±1% PEG1-IFN, około 2% pozornie PEGylowanego IFN i około 2% form większych
PL 219 741 B1 niż PEG2-IFN. Wskazane powyżej procenty są średnią i odchyleniem standardowym wyników analizy czterech powtórzeń każdej próbki. Jakościowo podobne wyniki uzyskano z PEG 10 kDa i 30 kDa.
Fig. 19 przedstawia wyniki analizy SDS-PAGE jak opisano dla Fig. 18 poza tym, że żel barwiono na PEG stosując 20% (masa/obj) BaCl2 w 1 N HCl połączony z 4 objętościami 4 mg/mL I2 w 1% KI. Dolny ślad przedstawia mieszaninę uprzednio barwionych standardów białkowych (SeeBlue Plus2™, Invitrogen #LC5625), w którym szczyty numerowane 1 do 9 identyfikują białka mające następujące masy cząsteczkowe (w kDa): 204, 111, 68,8, 51,5, 40,2, 28,9, 20,7 i 14,9 i ok. 6. Ilościowa analiza żelu barwionego PEG wskazuje, że około 99% PEG we Frakcji 51 z kolumny RP (górna krzywa) jest związana z PEG1-IFN podczas gdy frakcja wzbogacona koniugat di-PEG (druga krzywa od góry) zawierała 25±1% PEG1-IFN i około 3% form większych niż PEG2-IFN, oprócz około 71% PEG2-IFN. Oceniając względne ilości różnych form IFN-3-1b barwionych na PEG, podzielono obszar pod szczytem PEG2-IFN przez 2. W mieszaninie reakcyjnej (druga krzywa od dołu) około 50% barwnika PEG była związana z niezwiązanym PEG, około 35% z PEG1-IFN, około 14 z PEG2-IFN i około 1% z formami większymi niż PEG2-IFN.
P r z y k ł a d 8: Selektywna N-końcowa oksydacja interferonu-3-1b i przyłączenie karbazanu o niskiej masie cząsteczkowej
Zastosowano alternatywny sposób przyłączania PEG do końca aminowego IFN-3-1b aby zwiększyć widoczną selektywność tego przyłączenia do około 100% z wartości 90% uzyskanej przez alkilację redukcyjną, jak opisano w przykładach 4 i 5. Pierwszy etap tej metody PEGylacji jest oparty na podobnej zasadzie do cięcia oksydacyjnego redukcyjnie alkilowanego PEG-IFN-3-1b opisanego w przykładzie 5. To podejście wykorzystuje unikalną wrażliwość N-końcowej reszty seryny lub treoniny na cięcie do aldehydu przez nadjodan, jak opisał H.B.F. Dixon (powyżej) i K.F. Geoghegan i wsp. (1992), Bioconjug Chem 3:138-146; Geoghegan, K.F., Patent US Nr 5,362,852; Drummond, R.J. i wsp., Patent US Nr 6,423,685). Gdy N-końcowa reszta seryny IFN-p-1b była utleniona maksymalnie, tzn. po traktowaniu 3 mM NaIO4 przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, wynikający szczyt absorbancji białka wydawał się być szeroki po wstępnej chromatografii wykluczania wielkości na kolumnie Superose 6. Następna analiza na kolumnie Superose 12 w 10 mM octanie, 150 mM NaCl, pH 4,6, zawierającym 0,3 mg/mL SDS wyraźnie rozdzieliła utlenione białko na dwie formy, które uznano za monomery i dimery białka. Tożsamości tych dwóch szczytów potwierdzono za pomocą SDS-PAGE wykonanego jak opisano w przykładzie 7.
Analiza za pomocą chromatografii fazy odwróconej dalej udokumentowała odkrycie, że preferencyjne utlenianie N-końcowej seryny uzyskiwano z minimalnym utlenianiem przynajmniej jednej niezbędnej reszty metioniny. L.S. Lin i wsp., ((1996) Pharm Biotechnol 9:275-301) i L. Lin ((1998) Dev Biol Stand 96:97-104) wykazali, że chromatografia RP rozdzielała preparaty IFN-p-1b na główny składnik („Szczyt B”) i pomniejszy składnik, który ulegał wcześniej elucji („Szczyt A”). Lin ((1998) powyżej) dalej wykazał, że szczyt „A” zawierał IFN-3-1b, w którym funkcjonalnie czynna metionina (Mat 61 BETASERON) była utleniona do sulfotlenku. Obecni wynalazcy wykryli warunki, w których można uzyskać nieomal całkowite utlenianie N-końcowej seryny przy minimalnym utlenianiu Met 61, jak jest odbite w szczycie A w chromatografach RP. Utlenianie Met 61 mierzone za pomocą chromatografii RP, było stosowane jako marker zastępczy dla utleniania innych reszt metioniny IFN-3-1b (Met 35 i Met 116 BETASERON).
Badania stopnia utleniania Met 61 jako funkcji pH i czasu inkubacji z 0,25 mM NaIO4 w 4°C są podsumowane w tabeli 1.
T a b e l a 1
Wpływ pH i czasu ekspozycji na nadjodan na stopień utlenienia metioniny mierzony na podstawie powierzchni pod Szczytem A po chromatografii fazy odwróconej.
Czas ekspozycji na 0,25 mM NaIO4 | Procent szczytu A pH 6,9 | Procent szczytu A pH 7,7 |
0 | 4,9 | 4,8 |
2 godziny | 5,1 | 5,2 |
6 godzin | 5,6 | 5,0 |
18 godzin | 7,3 | 5,4 |
9 dni | 21,2 | 15,7 |
PL 219 741 B1
Wykazanie tworzenia aldehydu przez N-końcową oksydację IFN^-1b było ułatwione przez jej koniugację do 9-fluorenylometylo karbazanu („Fmoc-karbazan” znany też w dziedzinie jako „Fmoc-hydrazyd”) (Fluka 46917; Hang, R.-E., i wsp. (1991) Anal Biochem 195:160-167). Charakterystyczne widma absorbancji adduktów Fmoc-karbazydowych IFN^-1b pozwoliły na ich odróżnienie od odpowiednich nieskoniugowanych form białka bez stosowania detektora fIuorescencji. InterferonY-1b utleniano przez traktowanie różnymi stężeniami NaIO4 w pH 7,8 przez różne okresy czasu (0,5 do 2 godzin w temperaturze pokojowej lub do kilku dni w zimnie). W eksperymentach przedstawionych na Fig. 20, białko inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z 0,5 mM NaIO4. Reakcję zakończono przez dodatek glicerolu. Po 30 minutach w temperaturze pokojowej pH obniżono przez dodatek kwasu octowego do końcowego stężenia 19 mM. Do każdego mL powstałej mieszaniny dodano 182 mcL 15 mM Fmoc-karbazanu w metanolu do końcowego stężenia 2,3 mM Fmoc-karbazanu. Tę mieszaninę reakcyjną inkubowano przez noc w 4-8°C przed analizą za pomocą chromatografii fazy odwróconej.
Fig. 20 ilustruje wpływ na zachowanie w chromatografii RP IFN^-1b z 0,5 mM NaIO4 przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej i przyłączenia produktów utleniania do Fmoc-karbazanu. Porównanie wyników próby kontrolnej (górna krzywa) z tymi dla utlenionej próbki (środkowa krzywa z białymi kółkami) wykazuje, że czas retencji zarówno głównego składnika i szczytu A (stanowiącego odbicie obecności około 5% IFN^-1b z utlenioną resztą metioniny) są zwiększone o 0,2 do 0,3 minut przez utlenianie. Jak mierzono przez procent szczytu A w porównaniu szczytu A', mniej niż 1% utleniania metioniny wykryto po inkubacji z NaIO4 w tych warunkach.
Wyniki biooznaczeń, które są opisane w przykładzie 11 dostarczają dodatkowe dowody, że kontrolowane utlenianie (np. do 2 godzin w zimnie) z 0,1 do 0,3 mM nadjodanem zachowywało integralność reszt aminokwasu białka, które są konieczne do bioaktywności.
Jak wykazano dla niższej krzywej z czarnymi trójkątami na Fig. 20, dowody na tworzenie adduktów Fmoc były dostarczone przez przesunięcie czasu retencji dla zarówno głównego składnika i szczytu A' (pochodna szczytu A z N-końcowym aldehydem). Dalej, był przyrost 50% w stosunku absorbancji przy 278 nm do tej przy 214 nm dla przesuniętych szczytów. Dla obu form białka, zwiększenia czasów retencji powodowanych przez tworzenie odpowiednich N-końcowych aldehydów (0,2-0,3 minuty) były znacznie mniejsze niż przyrosty wynikające z tworzenia odpowiednich pochodnych Fmoc (1,0-1,2 minuty).
P r z y k ł a d 9: Synteza adduktów PEG-karbazanu N-końcowo utlenionego interferonuY-1b
InterferonY-1b selektywnie utleniony na końcu aminowym jak opisano w przykładzie 8 był także połączony z pochodną karbazanową PEG za pomocą adaptacji metod opisanych przez R.J. Drummond i wsp., (Publikacja PCT Nr WO 99/45026; Patent US Nr 6,423,685) i S. Zalipsky i WSP. (Publikacja PCT Nr WO 92/16555 A1 i W Harris, J.M. i wsp., red. (1997) Chemistry and Biological Applications of Poly(ethylene glycol) str. 318-341, Washington, D.C., American Chemical Society). KarbazanPEG syntetyzowano za pomocą reakcji hydrazyny z pochodną węglanową p-nitrofenylu 20-kDa PEG („NPC-PEG” od NOF Corporation). Po inkubacji białka w temperaturze pokojowej w nieobecności nadjodanu lub w obecności 0,125 mM NaIO4 przez 0,5, 1 lub 2 godziny, próbki rozcieńczono 4 objętościami 20-kDa PEG-karbazanu w 10 mM buforze octanowym, 150 mM NaCl, pH 4,6 zawierającym 1 mg/mL SDS i inkubowano przez 1 dzień w temperaturze pokojowej. Próbki analizowano za pomocą chromatografii wykluczania wielkości na kolumnie Superose 12 w 10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,3 zawierającym 0,3 mg/mL SDS. Jak pokazano na Fig. 21, utlenianie białka do 2 godziny przed reakcję z PEG-karbazanem dało postępujące obniżenie stężenia niezmodyfikowanego białka (eluowanego przy czasie retencji około 25 minut) i postępujący wzrost proporcji absorbancji związanej z koniugatem PEG1-IFN^-1b (eluowanego przy czasie retencji około 20 minut). Za pomocą tej metody uzyskano wydajności PEGrIFNY-1b przekraczające 80%. Podobne wyniki uzyskano stosując monokarbazanowe pochodne 10-kDa lub 30-kDa PEG.
P r z y k ł a d 10: Biooznaczenie MonoPEgylowanego interferonuY-1b, oczyszczonego przez HPLC fazy odwróconej
Zastosowanie komórek ludzkich Daudi chłoniaka Burkitta (ATCC #CCL-231, Manassas, VA) do oznaczeń antyproliferacyjnyych interferonuY-1a i różnych mutein było opisane przez L. Runkel i wsp. ((2000) Biochemistry 39:2538-2551). Fig. 22 przedstawia wyniki oznaczeń antyproliferacyjnych aktywności na komórkach Daudi nietraktowanego IFN^-1b i N-końcowo monoPEGylowanego koniugatu, który częściowo oczyszczono za pomocą chromatografii RP. Komórki hodowano w uzupełnionym podłożu RPMI 1640 (Gibco #11875-093, Grand Island, NY) z 10% (obj/obj) płodową surowicą cielęcą
PL 219 741 B1 (Irvine Scientific #3000, Santa Ana, CA). Zaszczepiono sto tysięcy komórek do 250 mcL podłoża w każdej studzience 48-studzienkowej płytki i pozwolono na wzrost w 37°C z 5% CO2 przez 4 godziny przed zmieszaniem z równą objętością uprzednio ogrzanego podłoża lub rozcieńczeniami IFN-p-1b lub koniugatu PEG w podłożu. W czasie 3 dni liczba komórek rozcieńczonych samym podłożem wzrosła do 590 +/-24% (SD) liczby w czasie zero, w oparciu o liczenie komórek licznikiem Coultera (Model Z1, Miami, FL). W warunkach maksymalnego wzrostu indukowanego przez ΙΕΝ-β-W lub jego koniugaty PEG liczba komórek wzrosła do 283 +/-8% liczby w czasie zero. Maksymalny procent inhibicji wzrostu obserwowany w tym eksperymencie wynosił 48%. Dane w Fig. 22 dla różnych stężeń dwóch preparatów IFN-p-1b są wyrażone jako procent hamowanego wzrostu komórek.
Fig. 22 przedstawia wyniki badań stosujących rozcieńczenia roztworu wzorcowego IFN-p-1b i frakcji z doświadczenia z preparatywnej chromatografii fazy odwróconej opisanego w przykładzie 7, który zawierał albo nieomal czysty koniugat monoPEG, jak pokazano w Fig. 17-19 (Frakcja 51), lub nieomal czysty pozornie PEGylowany IFN^-1b (Frakcja 53 kolumny pokazana na Fig. 17). Próbki rozcieńczono, w trzech powtórzeniach, do 1 mcg/mL w podłożu uzupełnionym płodową surowicą cielęcą i sterylizowano przez sączenie przez filtr 0,2 mikrometrów). Z każdego z wyjściowych rozcieńczeń, zrobiono rozcieńczenie 32 ng/mL i następne. Z danych na Fig. 22 wyliczono stężenie każdego preparatu wymaganego do hamowania 50% hamowanego wzrostu komórek („IC50”). Wyniki pokazały, że mono-PEGylowany IFN-p-1b (IC50 = ok. 40 pg/mL) był około 6 razy mocniejszy niż niezmodyfikowany IFN-p-1b (IC50 = ok. 250 pg/mL). Średnie przyrosty antyproliferacyjnych koniugatów PEG z różnymi wielkościami testowanymi w serii eksperymentów podobnych do wykazanych na Fig. 22, miały zakres około 2,5 krotny (dla 10 kDa PEG) do około 5 krotny (dla 30 kDa PEG).
Zadziwiająco pozornie PEGylowany preparat pokazany na Fig. 22 miał IC50 około 80 pg/mL, który był pośredni między tym dla wzorcowego roztworu IFN^-1b i preparatu monoPEGylowanego. Nie chcąc być związanym teorią lub jakimś mechanistycznym wyjaśnieniem, jest możliwe, że wzmożona aktywność antyproliferacyjna pozornie PEGylowanego preparatu jest odbiciem usuwania w czasie chromatografii fazy odwróconej materiału inhibitorowego, który jest obecny w wzorcowym roztworze IFN-3-1b. Ta interpretacja jest zgodna z wynikami chromatografii wykluczania wielkości na kolumnie Superose 6 w buforze zawierającym SDS (jak opisano w przykładzie 4), która wykazała szczyt absorbancji zarówno przy 214 nm i 280 nm, który eluował między pozycjami elucji ^Ν-β-^ i „szczytu soli”.
Doświadczenia biooznaczeń podobne do tych przedstawionych na Fig. 22 przeprowadzono na Frakcji 49 z kolumny RP, która zawierała mieszaninę PEG2-IFN^-1b i PEG1- ^Ν-β-^ (Patrz Fig. 18 i 19). Jak w przypadku pozornie PEGylowanej próbki, wielokrotnie PEGylowana próbka miała moc antyproliferacyjną, która była większa niż ta dla roztworu wzorcowego ΙΕΝ-β-W ale mniejsza niż ta dla monoPEGylowanego koniugatu. W innych doświadczeniach zwiększenie mocy obserwowane z mono PEGylowanym ^Ν-β-^ było w zakresie od sześciokrotnego do dziesięciokrotnego. Podobne zwiększanie mocy obserwować z adduktami karbazanu obserwowanymi w przykładzie 9, stosującym PEG 10, 20 i 30 kDa.
Antyproliferacyjne moce na komórkach Daudi uzyskane z koniugatami według wynalazku mogą być porównane z opisanymi specyficznymi aktywnościami trzech form farmaceutycznych interferonu-β mierzonymi w oznaczeniu antywirusowym. Według odpowiednich wkładek do opakowań, aktywności wynoszą 32 x 106 lU/mg dla BETASERON® Berle (iFN^-1b), 200 x 106 lU/mg dla AVONEX® (formuła Miogen ^Ν-β-^) i 270 x 106 IU/mg dla REBIF® (formuła Serano IFN^-1a). Tak więc zwiększenie przynajmniej sześciokrotne mocy monoPEGylowanego BETASERON w oznaczeniu antyproliferacyjnym ilustrowanym na Fig. 22 wskazuje, że N-końcowa PEGylacja BETASERON sposobami według wynalazku zwiększyła jego moc do zakresu oczekiwanego dla handlowo dostępnych preparatów, AVONEX i REBIF.
Poprzednio rozpuszczalność nieglikozylowanego interferonu-β (wyrażanego w Escherichia coli) była zwiększona przez stosowanie kwaśnych roztworów (Hanisch, W.H, i wsp., Patent US Nr 4,462,940) lub przez dodatek SDS (Thomson J.W., Patent US Nr 4,816,440). Bez chęci wiązania się teorią jeden mechanizm, za pomocą którego PEGylacja może zwiększać antyproliferacyjną skuteczność IFN^-1b mierzoną in vitro jest przez zmniejszenie jego skłonności do autoasocjacji w podłożu hodowlanym. Tak więc obserwacja, że próbka wzbogacona w PEG2-IFN^-1b była mniej skuteczna niż PEG1-IFN^-1b wskazuje, że pozytywne efekty zmniejszonej agregacji mogą być przezwyciężone przez negatywny wpływ nadmiernej PEGylacji na zdolność tej cytokiny do wiązania do jej receptorów i/lub inicjacji transdukcji sygnału odpowiedzialnej za jej aktywność antyproliferacyjną.
PL 219 741 B1
P r z y k ł a d 11: Biooznaczenie selektywnie utlenionego interferonu-3-1b
Oznaczenia aktywności antyproliferacyjnej na komórkach Daudi w różnym stopniu utlenionego IFN-p-Ib przeprowadzono jak opisano w przykładzie 10. Testowane próbki obejmowały roztwór wzorcowy IFN-3-1b i próbki, które był traktowane przez klika dni w 4°C 0,1, 0,3 lub 3 mM nadjodanem. Próbki rozcieńczono jak opisano w przykładzie 3 i mieszana z równą objętością zawiesiny komórek Daudi, 4 godziny po zaszczepieniu komórek. Komórki hodowano przez 2 dni w 37°C z 5% CO2 i następne liczono licznikiem Coultera. Antyproliferacyjna aktywność IFN-3-1b była niezmieniona lub zwiększona przez traktowanie 0,075-0,5 mM NaIO4 w badanych warunkach. Podobne wyniki uzyskano w 3-dniowych oznaczeniach antyproliferacyjnych, jak opisano w przykładzie 10. Moc antyproliferacyjną dalej zwiększała koniugacja selektywnie utlenionego IFN-p-Ib z PEG-karbazanem, jak opisano w Przykładzie 9. Podobne wyniki jak z PEG-karbazanem uzyskano z produktami koniugacji selektywnie utlenionego IFN-p-Ib do PEG-hydrazydu. Przeciwnie, efekt antyproliferacyjny na komórki Daudi był tłumiony lub całkowicie znoszony przez traktowanie IFN-p-Ib wyższymi stężeniami nadjodanu np. 1-3 mM. Te wysokie stężenia NaIO4 indukowały dimeryzację białka, co wykryto za pomocą HPLC wykluczania wielkości na kolumnie Superose 12, jak opisano w przykładzie 5 i utlenianie metioniny, jak wykryto za pomocą chromatografii fazy odwróconej, jak opisano w przykładzie 6 (dane nie przedstawione).
Bioaktywności koniugatów według wynalazku mogą być mierzone za pomocą znanych w dziedzinie oznaczeń antyproliferacyjnych i antywirusowych opartych na różnych liniach komórkowych lub hodowlach pierwotnych gdzie komórki niosą receptory na powierzchni komórek dla IFN-beta. Alternatywnie można monitorować odpowiedzi na IFN-beta, które obejmują indukcję neopteryny (Pepinsky, R.B. i wsp., powyżej), 32-mikroglobuliny (Pepinsky, R.B. i wsp., powyżej) lub syntetazy 2'-5'-oligoadenylowej (Bruchelt, G. i wsp., (1992) Eur J Clin Chem Clin Biochem 30:521-528) lub białek reporterowych funkcjonalnie połączonych z promotorami białek, które są indukowane przez IFN-beta. Dodatkowe sposoby oznaczania bioaktywności polimerowych koniugatów IFN-beta obejmują oznaczenia transdukcji i oznaczenia aktywacji genów (np. Pungor, E. i wsp., (1998) J Interferon Cytokines Res 18:1025-1030).
PL 219 741 B1
Lista sekwencji <110> Mountain View Pharraaceuticals, Inc.
3475-S Edison Way
Menlo Park, California 94025
United States of America <i2o> Koniugaty polimerowe interferonu-beta o zwiększonym potencjale biologicznym <130> 2057.012PCOl/JAG/BJD < 14 o > (θ° przypisania) <141> (herewith) <150> US 60/479,914 cl51> 2003-06-20 <150> US 60/479,913 cl51> 2003-06-20 <150> US 60/436,020 <151> 2002-12-26 <160> 2 <170> FastSEG for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 165 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1
Ser | Tyr | Asn | Leu | Leu | Gly | Phe | Leu | Gin | Arg | Ser | Ser | Asn | Phe | Gin | Ser |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Gin | Lys | Leu | Leu | Trp | Gin | Leu | Asn | Gly | Arg | Leu | Glu | Tyr | Cys | Leu | Lys |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Asp | Arg | Met | Asn | Phe | Asp | Ile | Pro | Glu | Glu | Ile | Lys | Gin | Leu | Gin | Gin |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Phe | Gin | Lys | Glu | Asp | Ala | Ala | Leu | Thr | Ile | Tyr | Glu | Met | Leu | Gin | Asn |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Ile | Phe | Ala | Ile | Phe | Arg | Gin | Asp | Ser | Ser | Ser | Thr | Gly | Trp | Asn | Glu |
SS | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Thr | Ile | Val | Glu | Asn | Leu | Leu | Ala | Asn | Val | Tyr | His | Gin | Ile | Asn | His |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Leu | Lys | Thr | Val | Leu | Glu | Glu | Lys | Leu | Glu | Lys | Glu | Asp | Phe | Thr | Arg |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Gly | Lys | Leu | Met | Ser | Ser | Leu | His | Leu | Lys | Arg | Tyr | Tyr | Gly | Arg | Ile |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Leu | His | Tyr | Leu | Lys | Ala | Lys | Glu | Tyr | Ser | His | cys | Ala | Trp | Thr | Ile |
130 | 135 | 140 |
PL 219 741 B1
Val Arg | Val | Glu | Ile | Leu | Arg | Asn | Phe | Tyr | Phe | Ile | Asn | Arg | Leu | Thr |
145 | 150 | 155 | 160 | |||||||||||
Gly Tyr | Leu | Arg | Asn | |||||||||||
165 | ||||||||||||||
<211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens | ||||||||||||||
<400> 2 Met Ser | Tyj? | Asn | Leu | Leu | Gly | Phe | Leu | Gin | Arg | Ser | Ser | Asn | Phe | Gin |
1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||
Cys Gin | Lys | Leu | Leu | Trp | Gin | Leu | Asn | Gly | Arg | Leu | Glu | Tyr | Cys | Leu |
20 | 25 | 30 | ||||||||||||
Lys Asp | Arg | Met | Asn | Phe | Asp | Ile | Pro | Glu | Glu | Ile | Lys | Gin | Leu | Gin |
35 | 40 | 45 | ||||||||||||
Gin Phe | Gin | Lys | Glu | Asp | Ala | Ala | Leu | Thr | l JL ¢2 | Tyr | Glu | Met | Leu | Gin |
50 | 55 | 60 | ||||||||||||
Asn Ile | Phe | Ala | Ile | Phe | Arg | Gin | Asp | Ser | Ser | Ser | Thr | Gly | Trp | Asn |
65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||
Glu Thr | Ile | Val | Glu | Asn | Leu | Leu | Ala | Asn | Val | His | Gin | Ile | Asn | |
85 | 90 | 95 | ||||||||||||
His Leu | Lys | Thr | Val | Leu | Glu | Glu | Lys | Leu | Glu | Lys | Glu | Asp | Phe | Thr |
100 | 105 | 110 | ||||||||||||
Arg Gly | Lys | Leu | Met | Ser | Ser | Leu | His | Leu | Lys | Arg | Tyr | Tyr | Gly | Arg |
115 | 120 | •3kb 2i | ||||||||||||
Ile Leu | His | Tyr | Leu | Lys | Ala | Lys | Glu | Tyr | Ser | His | Cys | Ala | Trp | Thr |
130 | 135 | 140 | ||||||||||||
Ile Val | Arg | Val | Glu | Ile | Leu | Arg | Asn | Phe | Tyr | Phe | Ile | Asn | Arg | Leu |
145 | 150 | 155 | 160 | |||||||||||
Thr Gly | Tyr | Leu | Arg | Asn |
165
Claims (36)
1. Sposób zwiększania antyproliferacyjnego potencjału nieglikozylowanego interferonu-beta-1b in vitro, znamienny tym, że obejmuje selektywne sprzęganie, w obecności dodecylosiarczanu sodowego (SDS), przynajmniej jednego syntetycznego, rozpuszczalnego w wodzie polimeru z alfaaminową grupą N-końcowego aminokwasu interferonu-beta-1b, w którym N-końcowy aminokwas jest położony daleko od wiążącej receptor domeny lub domen interferonu-beta-1b, przy czym rozpuszczalny w wodzie polimer posiada pojedynczą grupę aldehydową, a selektywne sprzęganie obejmuje utworzenie zasady Schiffa poprzez reakcję alfa-aminowej grupy N-końcowego aminokwasu interferonu-beta-1b z grupą aldehydową rozpuszczalnego w wodzie polimeru, a następnie redukcję tej zasady Schiffa łagodnym środkiem redukującym wybranym z grupy obejmującej kompleks boran-pirydyna i cyjanoborowodorek sodu, z utworzeniem wiązania drugorzędowej aminy, przy czym rozpuszczalny w wodzie polimer jest glikolem polialkilenowym wybranym z grupy obejmującej glikol monometoksypolietylenowy i glikol monohydroksypolietylenowy.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sprzęganie obejmuje utworzenie mieszaniny interferonu-beta-1b z rozpuszczalnym w wodzie polimerem przy pH w zakresie od 5,6 do 7,6.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że łagodny środek redukujący obejmuje cyjanoborowodorek sodu.
4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że łagodny środek redukujący obejmuje kompleks boran-pirydyna.
5. Sposób według zastrz. 1 do 4, znamienny tym, że proces prowadzi się tak, aby zminimalizować utlenianie przynajmniej jednej egzogennej reszty metioninowej interferonu-beta-1b.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wymieniony antyproliferacyjny potencjał oznacza się w teście hodowli komórkowej reagującej na interferon-beta-1b.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wymieniony interferon-beta-1b ma sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 1.
8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że interferon-beta-1b ma zasadniczo sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 1.
9. Sposób według dowolnego z poprzednich zastrzeżeń, znamienny tym, że jako glikol polialkilenowy stosuje się glikol monometoksypolietylenowy.
10. Sposób według dowolnego z poprzednich zastrzeżeń, znamienny tym, że jako glikol polialkilenowy stosuje się glikol monohydroksypolietylenowy.
11. Sposób według dowolnego z poprzednich zastrzeżeń, znamienny tym, że jako glikol polialkilenowy stosuje się glikol polialkilenowy o masie cząsteczkowej od 1 kDa do 100 kDa włącznie.
12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że jako glikol polialkilenowy stosuje się glikol polialkilenowy o masie cząsteczkowej od 8 kDa do 14 kDa włącznie.
13. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że jako glikol polialkilenowy stosuje się glikol polialkilenowy o masie cząsteczkowej od 10 kDa do 30 kDa włącznie.
14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że jako glikol polialkilenowy stosuje się glikol polialkilenowy o masie cząsteczkowej od 18 kDa do 22 kDa włącznie.
15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że jako glikol polialkilenowy stosuje się glikol polialkilenowy o masie cząsteczkowej około 20 kDa.
16. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że jako glikol polialkilenowy stosuje się glikol polialkilenowy o masie cząsteczkowej około 30 kDa.
17. Koniugat wytworzony sposobem określonym w dowolnym z poprzednich zastrzeżeń, zawierający nieglikozylowany interferon-beta-1b sprzężony kowalencyjnie w miejscu jego N-końcowego aminokwasu przynajmniej z jednym lub więcej syntetycznymi, rozpuszczalnymi w wodzie polimerami, przy czym antyproliferacyjny potencjał in vitro tego koniugatu interferonu-beta-1b jest zwiększony w porównaniu do potencjału takiego samego interferonu-beta-1 b, do którego został losowo przyłączony, poprzez dostępne dla rozpuszczalnika reszty lizyny, co najmniej jeden taki sam syntetyczny, rozpuszczalny w wodzie polimer.
18. Koniugat według zastrz. 17, znamienny tym, że interferon-beta-1b ma sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 1.
19. Koniugat według zastrz. 18, znamienny tym, że antyproliferacyjny potencjał interferonu-3-1b in vitro jest zwiększony w przybliżeniu do potencjału interferonu-3-1a, który ma sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 2 i którego reszta asparaginy 80 jest glikozylowana.
PL 219 741 B1
20. Koniugat określony w jednym z zastrz. 17-19, do zastosowania w zapobieganiu, diagnozowaniu lub leczeniu reagujących na beta-interferon zaburzeń u zwierząt cierpiących lub podatnych na te zaburzenia.
21. Koniugat według zastrz. 20, znamienny tym, że zwierzę jest ssakiem.
22. Koniugat według zastrz. 21, znamienny tym, że ssakiem jest człowiek.
23. Koniugat według zastrz. 20, znamienny tym, że zaburzenie reagujące na beta-interferon jest wybrane z grupy obejmującej raka, chorobę zakaźną, zaburzenie neurodegeneracyjne, zaburzenie autoimmunologiczne i zaburzenie genetycze.
24. Koniugat według zastrz. 23, znamienny tym, że rak jest wybrany z grupy obejmującej raka sutka, raka macicy, raka jajnika, raka prostaty, raka jąder, raka płuc, białaczki, chłoniaka, raka jelita grubego, raka przewodu pokarmowego, raka trzustki, raka pęcherza, raka nerki, raka kości, raka neurologicznego, raka głowy i szyi, raka skóry, raka, mięsaka, gruczolaka i szpiczaka.
25. Koniugat według zastrz. 24, znamienny tym, że choroba zakaźna reagująca na beta-interferon jest wybrana z grupy obejmującej wirusowe zapalenie wątroby, chorobę spowodowaną przez wirus kardiotropowy, oraz HIV/AIDS.
26. Koniugat według zastrz. 24, znamienny tym, że zaburzenie neurodegeneracyjne reagujące na interf eron-beta jest stwardnieniem rozsianym.
27. Koniugat według zastrz. 26, znamienny tym, że stwardnienie rozsiane jest wybrane z grupy obejmującej stwardnienie rozsiane w postaci remitująco-nawracającej, pierwotnie postępującej, i wtórnie postępującej.
28. Kompozycja farmaceutyczna, zawierająca substancję aktywną oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub zaróbkę, znamienna tym, że substancją aktywną jest koniugat określony w jednym z zastrz. 17-19.
29. Kompozycja farmaceutyczna określona w zastrz. 28, do zastosowania w zapobieganiu, diagnozowaniu, lub leczeniu reagujących na beta-interferon zaburzeń u zwierząt cierpiących lub podatnych na te zaburzenia.
30. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 29, znamienna tym, że zwierzę jest ssakiem.
31. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 30, znamienna tym, że ssakiem jest człowiek.
32. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 29, znamienna tym, że zaburzenie reagujące na beta-interferon jest wybrane z grupy obejmującej raka, chorobę zakaźną, zaburzenie neurodegeneracyjne, zaburzenie autoimmunologiczne i zaburzenie genetyczne.
33. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 32, znamienna tym, że rak jest wybrany z grupy obejmującej raka sutka, raka macicy, raka jajnika, raka prostaty, raka jąder, raka płuc, białaczki, chłoniaka, raka jelita grubego, raka przewodu pokarmowego, raka trzustki, raka pęcherza, raka nerki, raka kości, raka neurologicznego, raka głowy i szyi, raka skóry, raka, mięsaka, gruczolaka, i szpiczaka.
34. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 32, znamienna tym, że choroba zakaźna reagująca na beta-interferon jest wybrana z grupy obejmującej wirusowe zapalenie wątroby, chorobę spowodowaną przez wirus kardiotropowy, oraz HIV/AIDS.
35. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 32, znamienna tym, że zaburzenie neurodegeneracyjne reagujące na beta-interferon jest stwardnieniem rozsianym.
36. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 35, znamienna tym, że stwardnienie rozsiane jest wybrane z grupy obejmującej stwardnienie rozsiane w postaci remitująco-nawracającej, pierwotnie postępującej, i wtórnie postępującej.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US43602002P | 2002-12-26 | 2002-12-26 | |
US47991403P | 2003-06-20 | 2003-06-20 | |
US47991303P | 2003-06-20 | 2003-06-20 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PL379987A1 PL379987A1 (pl) | 2006-11-27 |
PL219741B1 true PL219741B1 (pl) | 2015-07-31 |
Family
ID=32719161
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL379987A PL219741B1 (pl) | 2002-12-26 | 2003-12-23 | Sposób zwiększania antyproliferacyjnego potencjału nieglikozylowanego interferonu-beta-1b in vitro, koniugat wytworzony tym sposobem i jego zastosowanie oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca koniugat i jej zastosowanie |
Country Status (26)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9125880B2 (pl) |
EP (1) | EP1667708B9 (pl) |
JP (2) | JP5207590B2 (pl) |
KR (1) | KR101238517B1 (pl) |
CN (1) | CN102319437B (pl) |
AU (1) | AU2003303635B2 (pl) |
BR (1) | BR0317742A (pl) |
CA (1) | CA2511814C (pl) |
CR (1) | CR7894A (pl) |
CY (1) | CY1113281T1 (pl) |
DK (1) | DK1667708T5 (pl) |
EA (1) | EA008866B1 (pl) |
EC (1) | ECSP055930A (pl) |
ES (1) | ES2389183T3 (pl) |
GE (1) | GEP20084486B (pl) |
HK (1) | HK1088822A1 (pl) |
IL (1) | IL169391A (pl) |
IS (1) | IS7932A (pl) |
MX (1) | MXPA05006944A (pl) |
NO (1) | NO339917B1 (pl) |
NZ (1) | NZ541124A (pl) |
PL (1) | PL219741B1 (pl) |
PT (1) | PT1667708E (pl) |
RS (1) | RS20050502A (pl) |
TW (1) | TWI406672B (pl) |
WO (1) | WO2004060299A2 (pl) |
Families Citing this family (85)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6057287A (en) | 1994-01-11 | 2000-05-02 | Dyax Corp. | Kallikrein-binding "Kunitz domain" proteins and analogues thereof |
US7666400B2 (en) * | 2005-04-06 | 2010-02-23 | Ibc Pharmaceuticals, Inc. | PEGylation by the dock and lock (DNL) technique |
US7173003B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-02-06 | Neose Technologies, Inc. | Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF |
US7214660B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-05-08 | Neose Technologies, Inc. | Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin |
EA009783B1 (ru) * | 2002-01-18 | 2008-04-28 | Байоджен Айдек Ма Инк. | Полиалкиленгликоль с остатком для конъюгации биологически активного соединения |
US8491896B2 (en) * | 2002-06-14 | 2013-07-23 | Immunomedics, Inc. | Anti-pancreatic cancer antibodies |
JP2005534647A (ja) | 2002-06-07 | 2005-11-17 | ダイアックス、コープ | 失血の予防及び軽減 |
US7153829B2 (en) | 2002-06-07 | 2006-12-26 | Dyax Corp. | Kallikrein-inhibitor therapies |
US9599619B2 (en) | 2002-06-14 | 2017-03-21 | Immunomedics, Inc. | Anti-pancreatic cancer antibodies |
US8821868B2 (en) | 2002-06-14 | 2014-09-02 | Immunomedics, Inc. | Anti-pancreatic cancer antibodies |
TWI364295B (en) * | 2002-12-26 | 2012-05-21 | Mountain View Pharmaceuticals | Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity |
KR20060003862A (ko) | 2003-03-14 | 2006-01-11 | 네오스 테크놀로지스, 인크. | 수용성분기폴리머 및 그 접합체 |
BRPI0408946A (pt) * | 2003-03-28 | 2006-04-04 | Biopolymed Inc | material biologicamente ativo conjugado com polìmero biocompatìvel com complexo 1:1, seu processo de preparação e composição farmacêutica compreendendo o mesmo |
WO2006127896A2 (en) | 2005-05-25 | 2006-11-30 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated factor ix |
US8791070B2 (en) | 2003-04-09 | 2014-07-29 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated factor IX |
US20070026485A1 (en) | 2003-04-09 | 2007-02-01 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods |
MXPA05012313A (es) * | 2003-05-12 | 2006-04-18 | Affymax Inc | Peptidos que se unen al receptor de eritropoyetina. |
BRPI0411160A (pt) * | 2003-05-12 | 2006-07-11 | Affymax Inc | novos compostos modificados com poli(glicol etilênico) e usos dos mesmos |
EP1628686A2 (en) * | 2003-05-12 | 2006-03-01 | Affymax, Inc. | Spacer moiety for poly (ethylene glycol)-modified peptides |
US9005613B2 (en) | 2003-06-16 | 2015-04-14 | Immunomedics, Inc. | Anti-mucin antibodies for early detection and treatment of pancreatic cancer |
WO2005012484A2 (en) | 2003-07-25 | 2005-02-10 | Neose Technologies, Inc. | Antibody-toxin conjugates |
CA2536873C (en) * | 2003-08-29 | 2019-09-10 | Dyax Corp. | Poly-pegylated protease inhibitors |
US20080305992A1 (en) | 2003-11-24 | 2008-12-11 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated erythropoietin |
US8633157B2 (en) | 2003-11-24 | 2014-01-21 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated erythropoietin |
US20060040856A1 (en) | 2003-12-03 | 2006-02-23 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated factor IX |
KR101439880B1 (ko) | 2004-01-08 | 2014-09-12 | 라티오팜 게엠베하 | 펩티드의 오-결합형 글리코실화 |
JP2007526317A (ja) * | 2004-03-01 | 2007-09-13 | エンゾン ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド | インターフェロン−ベータ・ポリマー結合体 |
EP1771066A2 (en) | 2004-07-13 | 2007-04-11 | Neose Technologies, Inc. | Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 glp-1 |
JP2008507297A (ja) * | 2004-07-26 | 2008-03-13 | エンゾン ファーマシューティカルズ,インコーポレーテッド | 最適化されたインターフェロンβ遺伝子 |
US7235530B2 (en) | 2004-09-27 | 2007-06-26 | Dyax Corporation | Kallikrein inhibitors and anti-thrombolytic agents and uses thereof |
ES2572779T3 (es) | 2004-10-29 | 2016-06-02 | Ratiopharm Gmbh | Remodelación y glucopegilación del Factor de Crecimiento de Fibroblastos (FGF) |
WO2006062685A2 (en) * | 2004-11-11 | 2006-06-15 | Affymax, Inc. | Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor |
JP2008519858A (ja) * | 2004-11-11 | 2008-06-12 | アフィーマックス・インコーポレイテッド | エリスロポエチンレセプターに結合する新規ペプチド |
ES2449195T3 (es) | 2005-01-10 | 2014-03-18 | Ratiopharm Gmbh | Factor estimulante de colonias de granulocitos glicopegilado |
US8067006B2 (en) * | 2005-04-06 | 2011-11-29 | Immunomedics, Inc. | Polymeric carriers of therapeutic agents and recognition moieties for antibody-based targeting of disease sites |
EP2386571B1 (en) | 2005-04-08 | 2016-06-01 | ratiopharm GmbH | Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants |
US7550433B2 (en) | 2005-06-03 | 2009-06-23 | Affymax, Inc. | Erythropoietin receptor peptide formulations and uses |
US7919461B2 (en) | 2005-06-03 | 2011-04-05 | Affymax, Inc. | Erythropoietin receptor peptide formulations and uses |
US8324159B2 (en) * | 2005-06-03 | 2012-12-04 | Affymax, Inc. | Erythropoietin receptor peptide formulations and uses |
US20070105755A1 (en) | 2005-10-26 | 2007-05-10 | Neose Technologies, Inc. | One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides |
US20100226884A1 (en) | 2009-01-20 | 2010-09-09 | Immunomedics, Inc. | Novel Class of Monospecific and Bispecific Humanized Antibodies that Target the Insulin-like Growth Factor Type I Receptor (IGF-1R) |
US8883162B2 (en) | 2005-10-19 | 2014-11-11 | Ibc Pharmaceuticals, Inc. | Multivalent antibody complexes targeting IGF-1R show potent toxicity against solid tumors |
US9862770B2 (en) | 2005-10-19 | 2018-01-09 | Ibc Pharmaceuticals, Inc. | Multivalent antibody complexes targeting IGF-1R show potent toxicity against solid tumors |
US20090048440A1 (en) | 2005-11-03 | 2009-02-19 | Neose Technologies, Inc. | Nucleotide Sugar Purification Using Membranes |
US20080299072A1 (en) * | 2005-12-15 | 2008-12-04 | Laboratoires Serono Sa | Chemokine Antagonists |
MX2008013024A (es) * | 2006-04-11 | 2009-04-16 | Mileutis Ltd | Manejo de ganado para la eficiencia reproductiva mejorada. |
US9187532B2 (en) | 2006-07-21 | 2015-11-17 | Novo Nordisk A/S | Glycosylation of peptides via O-linked glycosylation sequences |
EP2054521A4 (en) | 2006-10-03 | 2012-12-19 | Novo Nordisk As | METHODS OF PURIFYING CONJUGATES OF POLYPEPTIDES |
CA2916671C (en) * | 2007-01-17 | 2018-01-09 | Immunomedics, Inc. | Polymeric carriers of therapeutic agents and recognition moieties for antibody-based targeting of disease sites |
CA2682897C (en) | 2007-04-03 | 2016-11-22 | Biogenerix Ag | Methods of treatment using glycopegylated g-csf |
WO2008137471A2 (en) * | 2007-05-02 | 2008-11-13 | Ambrx, Inc. | Modified interferon beta polypeptides and their uses |
CN101778859B (zh) | 2007-06-12 | 2014-03-26 | 诺和诺德公司 | 改良的用于生产核苷酸糖的方法 |
CA2707840A1 (en) | 2007-08-20 | 2009-02-26 | Allozyne, Inc. | Amino acid substituted molecules |
US20090075887A1 (en) * | 2007-08-21 | 2009-03-19 | Genzyme Corporation | Treatment with Kallikrein Inhibitors |
KR20100099298A (ko) | 2007-12-20 | 2010-09-10 | 메르크 세로노 에스. 에이. | Peg인터페론베타 제형 |
US20130189239A1 (en) | 2008-02-27 | 2013-07-25 | Novo Nordisk A/S | Conjugated Factor VIII Molecules |
US9272029B2 (en) | 2009-03-26 | 2016-03-01 | Ibc Pharmaceuticals, Inc. | Interferon lambada-antibody complexes |
WO2010023670A2 (en) * | 2008-08-28 | 2010-03-04 | Insight Biopharmaceuticals Ltd. | Methods for covalently attaching a polymer to a methionine residue in proteins and peptides |
US20110171161A1 (en) | 2008-09-19 | 2011-07-14 | Nektar Therapeutics | Polymer conjugates of protegrin peptides |
EP2350118B1 (en) * | 2008-09-19 | 2016-03-30 | Nektar Therapeutics | Carbohydrate-based drug delivery polymers and conjugates thereof |
AU2010203712A1 (en) | 2009-01-06 | 2010-07-15 | Dyax Corp. | Treatment of mucositis with kallikrein inhibitors |
GB0908393D0 (en) * | 2009-05-15 | 2009-06-24 | Almac Sciences Scotland Ltd | Labelling method |
DE102009032179A1 (de) * | 2009-07-07 | 2011-01-13 | Biogenerix Ag | Verfahren zur Reinigung von Interferon beta |
SI2521568T1 (sl) | 2010-01-06 | 2019-01-31 | Dyax Corp. | Proteini, ki vežejo plazemski kalikrein |
EP2526421B1 (en) | 2010-01-22 | 2018-11-21 | Immunomedics, Inc. | Detection of early-stage pancreatic adenocarcinoma |
AR080993A1 (es) * | 2010-04-02 | 2012-05-30 | Hanmi Holdings Co Ltd | Formulacion de accion prolongada de interferon beta donde se usa un fragmento de inmunoglobulina |
NZ608630A (en) * | 2010-10-01 | 2015-03-27 | Biogen Idec Inc | Interferon-beta for use as monotherapy or in combination with other cancer therapies |
KR101309566B1 (ko) * | 2010-12-10 | 2013-09-17 | 포항공과대학교 산학협력단 | 히알루론산-단백질 컨쥬게이트 및 이의 제조 방법 |
CN103635489B (zh) | 2011-01-06 | 2016-04-13 | 戴埃克斯有限公司 | 血浆前激肽释放酶结合蛋白 |
CN103429263A (zh) | 2011-02-15 | 2013-12-04 | 免疫医疗公司 | 用于胰腺癌早期检测和治疗的抗粘蛋白抗体 |
ES2672974T3 (es) | 2012-06-01 | 2018-06-19 | Ibc Pharmaceuticals, Inc. | Complejos multiméricos con estabilidad in vivo, farmacocinética y eficacia mejoradas |
US9682143B2 (en) | 2012-08-14 | 2017-06-20 | Ibc Pharmaceuticals, Inc. | Combination therapy for inducing immune response to disease |
US20150231241A1 (en) | 2012-08-14 | 2015-08-20 | Ibc Pharmaceuticals, Inc. | Combination therapy for inducing immune response to disease |
US9382329B2 (en) | 2012-08-14 | 2016-07-05 | Ibc Pharmaceuticals, Inc. | Disease therapy by inducing immune response to Trop-2 expressing cells |
US9315567B2 (en) | 2012-08-14 | 2016-04-19 | Ibc Pharmaceuticals, Inc. | T-cell redirecting bispecific antibodies for treatment of disease |
US9452228B2 (en) | 2013-04-01 | 2016-09-27 | Immunomedics, Inc. | Antibodies reactive with an epitope located in the N-terminal region of MUC5AC comprising cysteine-rich subdomain 2 (Cys2) |
US9416197B2 (en) | 2013-11-01 | 2016-08-16 | Ibc Pharmaceuticals, Inc. | Bispecific antibodies that neutralize both TNF-α and IL-6: novel therapeutic agent for autoimmune disease |
CN106459210A (zh) | 2014-03-27 | 2017-02-22 | 戴埃克斯有限公司 | 用于治疗糖尿病黄斑性水肿的组合物和方法 |
US10988531B2 (en) | 2014-09-03 | 2021-04-27 | Immunogen, Inc. | Conjugates comprising cell-binding agents and cytotoxic agents |
CN107614515B (zh) | 2015-05-28 | 2022-03-22 | 免疫医疗公司 | 用于抗hiv(人免疫缺陷病毒)疗法和/或疫苗的t20构建体 |
EA201891388A1 (ru) | 2015-12-11 | 2018-11-30 | Дайэкс Корп. | Ингибиторы калликреина плазмы и их применение для лечения обострения наследственного ангионевротического отека |
EP3664856A4 (en) * | 2017-08-07 | 2021-04-28 | The University of Akron | POLY (ESTER-UREA) FOR MEMORY AND DRUG ADMINISTRATION |
CN109400695B (zh) * | 2018-10-31 | 2020-06-30 | 中南大学湘雅医院 | 一种多肽的修饰方法及应用 |
WO2021236474A1 (en) * | 2020-05-22 | 2021-11-25 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Novel processes for preparing conjugates of the il-2 protein |
TW202315940A (zh) * | 2021-10-13 | 2023-04-16 | 芯芮生技開發股份有限公司 | 幹細胞條件培養基於製備抑制癌症組成物的用途 |
Family Cites Families (116)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4179337A (en) * | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
US4002531A (en) * | 1976-01-22 | 1977-01-11 | Pierce Chemical Company | Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby |
GB1578348A (en) * | 1976-08-17 | 1980-11-05 | Pharmacia Ab | Products and a method for the therapeutic suppression of reaginic antibodies responsible for common allergic |
JPS6023084B2 (ja) * | 1979-07-11 | 1985-06-05 | 味の素株式会社 | 代用血液 |
US6610830B1 (en) | 1980-07-01 | 2003-08-26 | Hoffman-La Roche Inc. | Microbial production of mature human leukocyte interferons |
NZ198445A (en) | 1980-09-25 | 1984-05-31 | Genentech Inc | Production of human fibroblast interferon by recombinant dna technology |
DE3380726D1 (en) * | 1982-06-24 | 1989-11-23 | Japan Chem Res | Long-acting composition |
US4462940A (en) * | 1982-09-23 | 1984-07-31 | Cetus Corporation | Process for the recovery of human β-interferon-like polypeptides |
US4588585A (en) | 1982-10-19 | 1986-05-13 | Cetus Corporation | Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins |
WO1985003934A1 (en) | 1984-03-06 | 1985-09-12 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Chemically modified protein and process for its preparation |
US4732863A (en) * | 1984-12-31 | 1988-03-22 | University Of New Mexico | PEG-modified antibody with reduced affinity for cell surface Fc receptors |
US4766106A (en) | 1985-06-26 | 1988-08-23 | Cetus Corporation | Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation |
JP2524586B2 (ja) | 1985-06-26 | 1996-08-14 | シタス コーポレイション | ポリマ−接合を利用する医薬組成物用蛋白質の可溶化 |
US4917888A (en) | 1985-06-26 | 1990-04-17 | Cetus Corporation | Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation |
US5206344A (en) * | 1985-06-26 | 1993-04-27 | Cetus Oncology Corporation | Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof |
US4816440A (en) * | 1985-09-26 | 1989-03-28 | Cetus Corporation | Stable formulation of biologically active proteins for parenteral injection |
US5037969A (en) * | 1986-07-03 | 1991-08-06 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Glycosyl derivatives and use thereof |
US4894330A (en) * | 1986-12-23 | 1990-01-16 | Cetus Corporation | Purification of recombinant beta-interferon incorporating RP-HPLC |
US4961969A (en) * | 1987-05-11 | 1990-10-09 | Cetus Corporation | Process for recovering microbially produced interferon-β |
IE64284B1 (en) | 1987-08-03 | 1995-07-26 | Ddi Pharmaceuticals | Conjugates of superoxide dismutase |
US5080891A (en) * | 1987-08-03 | 1992-01-14 | Ddi Pharmaceuticals, Inc. | Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols |
US5006333A (en) * | 1987-08-03 | 1991-04-09 | Ddi Pharmaceuticals, Inc. | Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols |
US5004605A (en) * | 1987-12-10 | 1991-04-02 | Cetus Corporation | Low pH pharmaceutical compositions of recombinant β-interferon |
US4904584A (en) | 1987-12-23 | 1990-02-27 | Genetics Institute, Inc. | Site-specific homogeneous modification of polypeptides |
US4847325A (en) | 1988-01-20 | 1989-07-11 | Cetus Corporation | Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1 |
US6132763A (en) * | 1988-10-20 | 2000-10-17 | Polymasc Pharmaceuticals Plc | Liposomes |
US5349052A (en) * | 1988-10-20 | 1994-09-20 | Royal Free Hospital School Of Medicine | Process for fractionating polyethylene glycol (PEG)-protein adducts and an adduct for PEG and granulocyte-macrophage colony stimulating factor |
GB8824591D0 (en) * | 1988-10-20 | 1988-11-23 | Royal Free Hosp School Med | Fractionation process |
US5091176A (en) * | 1988-11-02 | 1992-02-25 | W. R. Grace & Co.-Conn. | Polymer-modified peptide drugs having enhanced biological and pharmacological activities |
US4902502A (en) * | 1989-01-23 | 1990-02-20 | Cetus Corporation | Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate |
US5122614A (en) * | 1989-04-19 | 1992-06-16 | Enzon, Inc. | Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides |
US5324844A (en) | 1989-04-19 | 1994-06-28 | Enzon, Inc. | Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides |
US5166322A (en) * | 1989-04-21 | 1992-11-24 | Genetics Institute | Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof |
EP0458064B1 (en) | 1990-05-04 | 1998-02-25 | American Cyanamid Company | Stabilization of somatotropins by modification of cysteine residues |
US5219564A (en) * | 1990-07-06 | 1993-06-15 | Enzon, Inc. | Poly(alkylene oxide) amino acid copolymers and drug carriers and charged copolymers based thereon |
JP3051145B2 (ja) * | 1990-08-28 | 2000-06-12 | 住友製薬株式会社 | 新規なポリエチレングリコール誘導体修飾ペプチド |
US5252714A (en) * | 1990-11-28 | 1993-10-12 | The University Of Alabama In Huntsville | Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde |
WO1992016555A1 (en) | 1991-03-18 | 1992-10-01 | Enzon, Inc. | Hydrazine containing conjugates of polypeptides and glycopolypeptides with polymers |
US5595732A (en) * | 1991-03-25 | 1997-01-21 | Hoffmann-La Roche Inc. | Polyethylene-protein conjugates |
WO1993000109A1 (en) | 1991-06-28 | 1993-01-07 | Genentech, Inc. | Method of stimulating immune response using growth hormone |
US5281698A (en) * | 1991-07-23 | 1994-01-25 | Cetus Oncology Corporation | Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation |
US5362852A (en) * | 1991-09-27 | 1994-11-08 | Pfizer Inc. | Modified peptide derivatives conjugated at 2-hydroxyethylamine moieties |
NZ244778A (en) * | 1991-10-21 | 1994-03-25 | Ortho Pharma Corp | Peg imidates and protein derivatives thereof |
US5221676A (en) * | 1992-02-06 | 1993-06-22 | Warner-Lambert Company | 7-substituted quinolones and naphthyridones as antibacterial agents |
ZA933926B (en) | 1992-06-17 | 1994-01-03 | Amgen Inc | Polyoxymethylene-oxyethylene copolymers in conjuction with blomolecules |
US5382657A (en) * | 1992-08-26 | 1995-01-17 | Hoffmann-La Roche Inc. | Peg-interferon conjugates |
CA2101361A1 (en) * | 1992-08-27 | 1994-02-28 | Robert A. Snow | Low diol polyalkylene oxide biologically active proteinaceous substances |
US5581476A (en) * | 1993-01-28 | 1996-12-03 | Amgen Inc. | Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs |
US5395619A (en) * | 1993-03-03 | 1995-03-07 | Liposome Technology, Inc. | Lipid-polymer conjugates and liposomes |
US5605976A (en) * | 1995-05-15 | 1997-02-25 | Enzon, Inc. | Method of preparing polyalkylene oxide carboxylic acids |
US5919455A (en) * | 1993-10-27 | 1999-07-06 | Enzon, Inc. | Non-antigenic branched polymer conjugates |
US5643575A (en) * | 1993-10-27 | 1997-07-01 | Enzon, Inc. | Non-antigenic branched polymer conjugates |
US5951974A (en) | 1993-11-10 | 1999-09-14 | Enzon, Inc. | Interferon polymer conjugates |
PT730470E (pt) * | 1993-11-10 | 2002-08-30 | Enzon Inc | Conjugados melhorados de interferao-polimero |
US5446090A (en) * | 1993-11-12 | 1995-08-29 | Shearwater Polymers, Inc. | Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules |
US5766581A (en) * | 1994-03-31 | 1998-06-16 | Amgen Inc. | Method for treating mammals with monopegylated proteins that stimulates megakaryocyte growth and differentiation |
US5889153A (en) * | 1994-05-20 | 1999-03-30 | Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. | Protein or polypeptide, method for producing the same and intermediate compound therefor |
JPH10500693A (ja) | 1994-05-24 | 1998-01-20 | アムジエン・ブルダー・インコーポレーテツド | 改変型インスリン様増殖因子 |
US5730990A (en) * | 1994-06-24 | 1998-03-24 | Enzon, Inc. | Non-antigenic amine derived polymers and polymer conjugates |
US20030053982A1 (en) * | 1994-09-26 | 2003-03-20 | Kinstler Olaf B. | N-terminally chemically modified protein compositions and methods |
US5824784A (en) * | 1994-10-12 | 1998-10-20 | Amgen Inc. | N-terminally chemically modified protein compositions and methods |
US5738846A (en) * | 1994-11-10 | 1998-04-14 | Enzon, Inc. | Interferon polymer conjugates and process for preparing the same |
US5770577A (en) * | 1994-11-14 | 1998-06-23 | Amgen Inc. | BDNF and NT-3 polypeptides selectively linked to polyethylene glycol |
US5932462A (en) * | 1995-01-10 | 1999-08-03 | Shearwater Polymers, Inc. | Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces |
US5756593A (en) * | 1995-05-15 | 1998-05-26 | Enzon, Inc. | Method of preparing polyalkyene oxide carboxylic acids |
WO1996040731A1 (en) | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Pegylated modified proteins |
US5672662A (en) * | 1995-07-07 | 1997-09-30 | Shearwater Polymers, Inc. | Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications |
US5747639A (en) * | 1996-03-06 | 1998-05-05 | Amgen Boulder Inc. | Use of hydrophobic interaction chromatography to purify polyethylene glycols |
CA2262994A1 (en) * | 1996-08-02 | 1998-02-12 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | Polypeptides having a single covalently bound n-terminal water-soluble polymer |
US5990237A (en) * | 1997-05-21 | 1999-11-23 | Shearwater Polymers, Inc. | Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines |
NZ502375A (en) | 1997-07-14 | 2001-11-30 | Bolder Biotechnology Inc | The addition of non-natural cysteine derivatives to cause the protein to act as antagonists of the GH family |
US6017876A (en) * | 1997-08-15 | 2000-01-25 | Amgen Inc. | Chemical modification of granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) bioactivity |
US5985263A (en) | 1997-12-19 | 1999-11-16 | Enzon, Inc. | Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates |
US5981709A (en) | 1997-12-19 | 1999-11-09 | Enzon, Inc. | α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same |
ATE279430T1 (de) * | 1998-03-05 | 2004-10-15 | Chiron Corp | Verfahren zur verbesserung der serum halbwertszeit von biologisch aktiven molekülen |
DK0985697T3 (da) * | 1998-03-24 | 2006-05-15 | Nof Corp | Oxiranderivater og fremgangsmåde til fremstilling deraf |
CA2330451A1 (en) * | 1998-04-28 | 1999-11-04 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Polyol-ifn-beta conjugates |
JP5259896B2 (ja) | 1998-05-12 | 2013-08-07 | オンコリクス インコーポレイテッド | 増殖性疾患を治療するための抗プロラクチン剤の使用 |
ES2245114T3 (es) * | 1998-08-06 | 2005-12-16 | Mountain View Pharmaceuticals, Inc. | Conjugados de peg-oxidasa de urato y su uso. |
US6783965B1 (en) * | 2000-02-10 | 2004-08-31 | Mountain View Pharmaceuticals, Inc. | Aggregate-free urate oxidase for preparation of non-immunogenic polymer conjugates |
ES2630278T3 (es) | 1998-10-16 | 2017-08-21 | Biogen Ma Inc. | Conjugados poliméricos de interferón beta-1a y usos de los mismos |
CN1210400C (zh) | 1999-01-14 | 2005-07-13 | 博尔德生物技术公司 | 制备含游离半胱氨酸残基的蛋白质的方法 |
JO2291B1 (en) * | 1999-07-02 | 2005-09-12 | اف . هوفمان لاروش ايه جي | Erythropoietin derivatives |
US7144574B2 (en) * | 1999-08-27 | 2006-12-05 | Maxygen Aps | Interferon β variants and conjugates |
US6531122B1 (en) * | 1999-08-27 | 2003-03-11 | Maxygen Aps | Interferon-β variants and conjugates |
BR0013638A (pt) * | 1999-08-27 | 2002-05-14 | Maxygen Aps | Novas moléculas semelhantes a interferon beta |
US7431921B2 (en) * | 2000-04-14 | 2008-10-07 | Maxygen Aps | Interferon beta-like molecules |
JP4593048B2 (ja) | 1999-12-24 | 2010-12-08 | 協和発酵キリン株式会社 | 分岐型ポリアルキレングリコール類 |
NZ522847A (en) | 2000-05-16 | 2004-11-26 | Bolder Biotechnology Inc | Methods for refolding proteins containing free cysteine residues |
EP1303292A4 (en) | 2000-06-30 | 2007-08-22 | Smithkline Beecham Corp | CHEMOKINKONJUGATE |
AU2001290312A1 (en) * | 2000-10-16 | 2002-04-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Peg-modified erythropoietin |
ATE505204T1 (de) | 2000-12-20 | 2011-04-15 | Hoffmann La Roche | Konjugate von erythropoietin (epo) mit polyethylenglykol (peg) |
JP2005502591A (ja) * | 2001-01-12 | 2005-01-27 | カイロン コーポレイション | 核酸粘膜免疫 |
YU48703A (sh) | 2001-02-27 | 2006-05-25 | Maxygen Aps | Novi interferonu beta-slični molekuli |
US6887462B2 (en) | 2001-04-09 | 2005-05-03 | Chiron Corporation | HSA-free formulations of interferon-beta |
JP2004522803A (ja) | 2001-06-29 | 2004-07-29 | マキシゲン・エイピーエス | インターフェロン製剤 |
US6908963B2 (en) | 2001-10-09 | 2005-06-21 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Thioester polymer derivatives and method of modifying the N-terminus of a polypeptide therewith |
WO2003049760A1 (en) | 2001-12-07 | 2003-06-19 | Intermune, Inc. | Compositions and method for treating hepatitis virus infection |
AU2002357806A1 (en) | 2001-12-11 | 2003-06-23 | Sun Bio, Inc. | Novel monofunctional polyethylene glycol aldehydes |
EA009783B1 (ru) * | 2002-01-18 | 2008-04-28 | Байоджен Айдек Ма Инк. | Полиалкиленгликоль с остатком для конъюгации биологически активного соединения |
WO2004009774A2 (en) | 2002-07-19 | 2004-01-29 | Amgen Inc. | Protein conjugates with a water-soluble biocompatible, biogradable polymer |
AU2003254641A1 (en) | 2002-08-28 | 2004-03-19 | Maxygen Aps | Interferon beta-like molecules for treatment of cancer |
UA80838C2 (en) * | 2002-09-09 | 2007-11-12 | Water-soluble polymer alkanals | |
US8129330B2 (en) * | 2002-09-30 | 2012-03-06 | Mountain View Pharmaceuticals, Inc. | Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof |
US20040062748A1 (en) * | 2002-09-30 | 2004-04-01 | Mountain View Pharmaceuticals, Inc. | Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof |
KR20050086498A (ko) | 2002-11-18 | 2005-08-30 | 맥시겐, 인크. | 인터페론-알파 폴리펩티드 및 접합체 |
TWI281864B (en) * | 2002-11-20 | 2007-06-01 | Pharmacia Corp | N-terminally monopegylated human growth hormone conjugates and process for their preparation |
JP4412461B2 (ja) | 2002-11-20 | 2010-02-10 | 日油株式会社 | 修飾された生体関連物質、その製造方法および中間体 |
US20040142870A1 (en) * | 2002-11-20 | 2004-07-22 | Finn Rory F. | N-terminally monopegylated human growth hormone conjugates, process for their preparation, and methods of use thereof |
US8828373B2 (en) * | 2002-11-20 | 2014-09-09 | Nof Corporation | Polyalkylene glycol derivative and modified bio-related substance |
TWI364295B (en) | 2002-12-26 | 2012-05-21 | Mountain View Pharmaceuticals | Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity |
AU2004227937B2 (en) | 2003-03-31 | 2007-09-20 | Xencor, Inc | Methods for rational pegylation of proteins |
GB0316294D0 (en) | 2003-07-11 | 2003-08-13 | Polytherics Ltd | Conjugated biological molecules and their preparation |
JP2007526317A (ja) | 2004-03-01 | 2007-09-13 | エンゾン ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド | インターフェロン−ベータ・ポリマー結合体 |
RU2298560C2 (ru) | 2004-04-30 | 2007-05-10 | Открытое Акционерное Общество "Верофарм" | Конъюгаты белка и производного полиэтиленгликоля, фармацевтическая композиция, способ борьбы с вирусной инфекцией |
AU2006332533A1 (en) * | 2005-12-30 | 2007-07-12 | Pharmaessentia Corp. | Drug-polymer conjugates |
-
2003
- 2003-12-23 PL PL379987A patent/PL219741B1/pl unknown
- 2003-12-23 GE GEAP2003008910 patent/GEP20084486B/en unknown
- 2003-12-23 EA EA200501050A patent/EA008866B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2003-12-23 CA CA 2511814 patent/CA2511814C/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-12-23 KR KR20057012126A patent/KR101238517B1/ko active IP Right Grant
- 2003-12-23 RS YUP20050502 patent/RS20050502A/sr unknown
- 2003-12-23 DK DK03808554T patent/DK1667708T5/da active
- 2003-12-23 BR BR0317742A patent/BR0317742A/pt not_active Application Discontinuation
- 2003-12-23 EP EP20030808554 patent/EP1667708B9/en not_active Revoked
- 2003-12-23 CN CN201110224336.2A patent/CN102319437B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2003-12-23 TW TW92136583A patent/TWI406672B/zh not_active IP Right Cessation
- 2003-12-23 JP JP2005508613A patent/JP5207590B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2003-12-23 WO PCT/US2003/041160 patent/WO2004060299A2/en active Search and Examination
- 2003-12-23 AU AU2003303635A patent/AU2003303635B2/en not_active Ceased
- 2003-12-23 ES ES03808554T patent/ES2389183T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-12-23 US US10/743,068 patent/US9125880B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-12-23 PT PT03808554T patent/PT1667708E/pt unknown
- 2003-12-23 MX MXPA05006944A patent/MXPA05006944A/es active IP Right Grant
- 2003-12-23 NZ NZ541124A patent/NZ541124A/en not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-06-26 IL IL169391A patent/IL169391A/en active IP Right Grant
- 2005-07-04 IS IS7932A patent/IS7932A/is unknown
- 2005-07-04 CR CR7894A patent/CR7894A/es unknown
- 2005-07-20 EC ECSP055930 patent/ECSP055930A/es unknown
- 2005-07-20 NO NO20053556A patent/NO339917B1/no not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-08-21 HK HK06109227A patent/HK1088822A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2012
- 2012-06-20 JP JP2012138434A patent/JP2012232984A/ja not_active Withdrawn
- 2012-09-05 CY CY20121100796T patent/CY1113281T1/el unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5207590B2 (ja) | 増強された生物学的能力を有するインターフェロン−βのポリマー結合体 | |
KR101162908B1 (ko) | 수용체-결합 활성이 보존된, 사이토카인, 케모카인,성장인자, 폴리펩티드 호르몬 및 이들의 길항제의 중합체접합체 | |
US20040142870A1 (en) | N-terminally monopegylated human growth hormone conjugates, process for their preparation, and methods of use thereof | |
JP2005015464A (ja) | 改良型インターフェロン‐ポリマーコンジュゲート | |
JP2006321808A (ja) | 化学的に修飾されたヒト成長ホルモンコンジュゲート | |
US20050079155A1 (en) | Generating protein pro-drugs using reversible PPG linkages | |
US20040127417A1 (en) | N-terminally monopegylated human growth hormone conjugates and process for their preparation | |
US8597634B2 (en) | Interferon alpha-2a modified by polyethylene glycol and methods of preparation thereof | |
ZA200505394B (en) | Polymer conjugates of interferon-beta with enhanced biological potency |