ES2245114T3 - Conjugados de peg-oxidasa de urato y su uso. - Google Patents
Conjugados de peg-oxidasa de urato y su uso.Info
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Abstract
Un conjugado de uricasa, que mantiene por lo menos aproximadamente el 75 % de la actividad uricolítica de la uricasa no conjugada y es sustancialmente no inmunogénico, y que comprende una uricasa purificada que comprende subunidades en las cuales cada subunidad de dicha uricasa está enlazada covalentemente con, por término medio, entre 2 y 10 cadenas de PEG, en las que cada molécula de PEG tiene un peso molecular de entre 10 kDa y 100 kDa.
Description
Conjugados de PEG-oxidasa de
urato y su uso.
La presente invención trata sobre la modificación
química de proteínas para prolongar su vida en circulación y reducir
su inmunogenia. Más específicamente, la invención aborda la
conjugación de polietilenglicol o polióxietileno con oxidasas de
urato, que elimina considerablemente la inmunogenia de la oxidasa de
urato sin comprometer su actividad uricolítica.
Las declaraciones que aparecen en esta sección no
constituyen una admisión de la tecnología anterior, sino que
reflejan los comentarios e interpretaciones subjetivas de los
inventores sobre el estado que guardaba la tecnología en el momento
que se llevó a cabo esta invención. Dichas interpretaciones pueden
reflejar las ideas personales de los inventores, y por lo tanto no
conocidas, las cuales no forman parte por sí mismas de la arte
anterior.
Las oxidasas de urato (uricasas; E. C. 1.7.3.3)
son enzimas que catalizan la oxidación del ácido úrico en un
producto más soluble, alantaína, un metabolito que es más fácil de
excretar. Los seres humanos no producen uricasas activas
enzimáticamente como resultado de varias mutaciones del gen para
uricasa adquirido durante la evolución de los primates superiores.
Wu, X, et al., (1992) J Mol Evol
34:78-84. En consecuencia, en individuos
susceptibles, una concentración excesiva de ácido úrico en sangre
(hiperuricemia) y en orina (hiperuricosuria) pueden ocasionar
artritis dolorosa (gota), depósitos de urato desfigurantes (tofos) e
insuficiencia renal. En algunos individuos afectados, los
medicamentos disponibles como el alopurinol (un inhibidor de la
síntesis del ácido úrico) producen efectos secundarios limitadores
del tratamiento o no alivian los síntomas de manera satisfactoria.
Hande, KR, et al., (1984) Am J Med
76:47-56; Fam, AG, (1990) Baillière's Clin
Rheumatol 4:177-192. Las inyecciones de
uricasa pueden disminuir la hiperuricemia e hiperuricosuria, por lo
menos de manera transitoria. No obstante, dado que la uricasa es una
proteína extraña en los seres humanos, incluso la primera inyección
de proteína no alterada de Aspergillus flavus ha dado lugar a
reacciones anafilácticas en diferentes porcentajes de pacientes bajo
tratamiento (Pui, C-H, et al., (1997)
Leukemia 11:1813-1816) y las
respuestas inmunológicas restringen su utilidad para tratamientos
crónicos o intermitentes. Donadio, D, et al., (1981) Nouv
Presse Méd 10:711-712; Leaustic, M, et
al., (1983) Rev Rhum Mal Osteoartic
50:553-554.
Durante varias décadas se ha reconocido que los
resultados de los tratamientos disponibles para la hiperuricemia no
alcanzan un nivel óptimo. Kissel, P, et al., (1968)
Nature 217:72-74. De la misma manera,
hace años que se reconoce la posibilidad de que determinados grupos
de pacientes con gota severa podrían verse beneficiados por un
tratamiento con uricasa inyectable en forma segura y eficaz. Davis,
FF, et al., (1978) in GB Broun, et al., (Eds.)
Enzyme Engineering, Vol. 4 (pp. 169-173) New
York, Plenum Press; Nishimura, H, et al., (1979)
Enzyme 24:261-264; Nishimura, H, et
al., (1981) Enzyme 26:49-53;
Davis, S, et al., (1981) Lancet
2(8241):281-283; Abuchowski, A, et
al., (1981) J Pharmacol Exp Ther
219:352-354; Chen, RH-L,
et al., (1981) Biochim Biophys Acta
660:293-298; Chua, CC, et al., (1988)
Ann Int Med 109:114-117; Greenberg,
ML, et al., (1989) Anal Biochem
176:290-293. Las uricasas derivadas de los
órganos animales son prácticamente insolubles en disolventes que son
compatibles con la administración segura mediante inyección. Patente
estadounidense 3,616,231. Ciertas uricasas derivadas de las plantas
o microorganismos son más solubles en disolventes aceptables en
términos médicos. Sin embargo, la inyección de enzimas microbianas
induce con rapidez respuestas inmunológicas que pueden ocasionar
reacciones alérgicas potencialmente mortales o una inactivación o
eliminación acelerada de la uricasa de la circulación. Donadio,
et al., (1981); Leaustic, et al., (1983). Las enzimas
basadas en secuencias de aminoácidos deducidas de uricasas de
mamíferos, incluyendo el cerdo y el babuino, o de insectos, como
Drosophila melanogaster o Drosophila pseudoobscura
(Wallrath, LL, et al., (1990) Mol Cell Biol
10:5114-5127), no han sido candidatos
aconsejables para su uso clínico, debido a los problemas de
inmunogenia e insolubilidad en el pH fisiológico.
Se han utilizado las alteraciones covalentes de
las proteínas con polietilenglicol o polióxietileno (ambos conocidos
como PEG) para aumentar la hemivida de las proteínas y reducir la
inmunogenia. Patentes estadounidenses 4,179,337, 4,766,106 y
4,847,325; Saifer, MGP, et al., (1994) Adv Exp Med
Biol 366:377-387. La combinación de PEG
de peso molecular elevado para producir conjugados con ciclos
vitales de circulación prolongada o inmunogenia reducida -mientras
que se conserva la actividad funcional- se demostró con anterioridad
para otra enzima, la dismutasa de superóxido (Somack, R, et
al., (1991) Free Rad Res Commun
12-13:553-562; Patentes
estadounidenses 5,283,317 y 5,468,478) y para otros tipos de
proteínas, por ejemplo citocinas (Saifer, MGP, et al.,
(1997) Polym Preprints 38:576-577;
Sherman, MR, et al., (1997) in JM Harris, et
al., (Eds.), Poly(ethylene glycol) Chemistry and
Biological Applications. ACS Symposium Series 680 (pp.
155-169) Washington, DC: American Chemical Society).
Asimismo, se han descrito conjugados de uricasa con polímeros
distintos a PEG. Patente estadounidense 4,460,683.
Prácticamente todos los intentos registrados de
PEGilar la uricasa (es decir, combinar covalentemente PEG con
uricasa), el PEG se agregó predominalmente a grupos amino,
incluyendo los residuos amino-terminal y los
residuos disponibles de lisina. En las uricasas más utilizadas, el
número total de lisinas en cada una de las cuatro subunidades
idénticas se encuentra entre 25 (Aspergillus flavus (Patente
estadounidense 5,382,518)) y 29 (cerdo (Wu, X, et al., (1989)
Proc Natl Acad Sci USA 86:9412-9416)).
Algunas lisinas no están disponibles para la PEGilación en la
conformación nativa de la enzima. El método más común para reducir
la inmunogenia de la uricasa ha sido combinar grandes cantidades de
cadenas de PEG de bajo peso molecular. Esto ha tenido como resultado
un gran descenso de la actividad enzimática de los conjugados
resultantes.
Los investigadores anteriores utilizaron uricasa
inyectada para catalizar la conversión del ácido úrico en alantaína
in vivo. Véase Pui, et al., (1997). Ésta es la
base para el uso en Francia e Italia de la uricasa derivada del
hongo Aspergillus flavus (Uricozyme®) para prevenir o
corregir provisionalmente la hiperuricemia asociada con la terapia
citotóxica para neoplasias hematológicas y para reducir de manera
transitoria la hiperuricemia grave en pacientes con gota. Potaux, L,
et al., (1975) Nouv Presse Méd
4:1109-1112; Legoux, R, et al., (1992)
J Biol Chem 267:8565-8570; Patentes
estadounidenses 5,382,518 y 5,541,098. Debido a su corta vida de
circulación, Uricozyme® requiere inyecciones diarias y, además, no
es muy aconsejable para terapias de largo plazo debido a su
inmunogenia.
Una sola inyección intravenosa de un preparado de
uricasa derivado de Candida utilis combinado con PEG de 5 kDa
redujo el urato sérico a niveles indetectables en cinco sujetos
humanos cuyo promedio de concentración de urato sérico antes de la
inyección era de 6,2 mg/dL, lo cual está dentro del intervalo normal
(Davis, et al., (1981). A los sujetos se les administró una
inyección adicional cuatro semanas después, pero no se registraron
sus respuestas. Utilizando un ensayo de difusión en gel
relativamente no sensible, no se detectó ningún anticuerpo a la
uricasa después de la segunda (última) inyección. Esta referencia no
aportó resultados sobre tratamientos crónicos o subcrónicos en
humanos o en animales utilizados con fines experimentales.
Un preparado de uricasa derivado de
Arthrobacter protoformiae combinado con PEG de 5 kDa se
utilizó para controlar por un tiempo la hiperuricemia en un solo
paciente con linfoma cuya concentración de urato sérico antes de la
inyección era de 15 mg/dL, Chua, et al., (1988). Debido al
estado crítico del paciente y a la corta duración del tratamiento
(cuatro inyecciones en un periodo de 14 días), no fue posible
evaluar la eficacia o seguridad a largo plazo del conjugado.
En esta solicitud, el término "inmunogenia"
se entiende como la inducción de una respuesta inmunológica mediante
la inyección de un preparado de uricasa modificada con PEG o no
modificada (el antígeno), en tanto que la "antigenia" se
entiende como la reacción de un antígeno con anticuerpos ya
existentes. En conjunto, la antigenia y la inmunogenia se entienden
como la "inmunorreactividad". En investigaciones anteriores de
la PEG-uricasa, la inmunorreactividad se evaluaba
mediante diferentes métodos, incluyendo: 1) la reacción in
vitro de PEG-uricasa con anticuerpos
preformados; 2) medición de la síntesis de anticuerpos inducida; y
3) tasas de eliminación acelerada tras inyecciones repetidas.
Se sabe que se realizaron intentos previos para
eliminar la inmunogenia de uricasas derivadas de diferentes fuentes
mediante la combinación de varias cantidades de cadenas de PEG a
través de varios vínculos, lo cual tuvo un éxito limitado. Los
primeros en descubrir las PEG-uricasas fueron Davis
e Inada junto con sus colaboradores. Davis, et al., (1978);
patente estadounidense 4,179,337; Nishimura, et al., (1979);
patentes japonesas 55-99189 y
62-55079. El conjugado descrito en la patente '337
fue sintetizado al reaccionar la uricasa de origen desconocido con
un excedente molar de 2.000 veces de 750 Da de PEG, indicando que
una gran cantidad de moléculas del polímero era semejante al que se
había añadido a cada subunidad de uricasa. La patente '337 aborda la
combinación de PEG o del polipropilenglicol con pesos moleculares de
500 a 20.000 Da, preferiblemente entre 500 y 5.000 Da, para brindar
conjugados activos, solubles en agua y no inmunogénicos de varias
hormonas de polipéptidos y enzimas incluyendo oxidoreductasas, de
los cuales la uricasa es uno de los tres ejemplos. Además, la
patente '337 destaca la combinación de 10 a 100 cadenas de polímeros
por molécula de la enzima y la retención de por lo menos 40% de
actividad enzimática. No se informaron los resultados de las pruebas
en relación con la combinación de PEG con los grupos amino
disponibles de uricasa, la actividad uricolítica específica residual
o la inmunorreactividad del conjugado.
El resumen de los datos derivados de las 13
menciones relacionadas con PEGilación de uricasa se encuentra en la
tabla 1. Asimismo, algunos de estos resultados se presentan
gráficamente en las figuras 1A-2B. Siete de estas
publicaciones describen importantes reducciones en la actividad
uricolítica medida in vitro generada por la combinación de
grandes cantidades de cadenas de PEG con la uricasa derivada de
Candida utilis. La combinación de grandes cantidades de
cadenas de PEG de 5 kDa con la uricasa del hígado porcino da
resultados semejantes, según lo describe la publicación de Chen y en
la presentación en un simposio del mismo grupo. Chen, et al.,
(1981); Davis, et al., (1978).
Entre los estudios resumidos en la tabla 1, se
documentó que en siete de ellos se redujo la inmunorreactividad,
mientras que se eliminó en cinco de ellos gracias a la PEGilación.
En tres de los últimos cinco estudios, la eliminación de la
inmunorreactividad se asoció a la marcada disminución de la
actividad uricolítica, hasta casi el 15, 28 o 45% de su actividad
inicial. Nishimura, et al., (1979) (15% actividad); Chen,
et al., (1981) (28% actividad); Nishimura, et al.,
(1981) (45% actividad). En el cuarto informe, se documentó que el
PEG se combinó con el 61 % de los residuos de lisina disponibles,
sin embargo no se expresó la actividad específica residual
Abuchowski, et al., (1981). No obstante, un equipo de
investigadores que contaba con dos de los mismos científicos y que
utilizaba los mismos métodos documentó que este exceso de
combinación dejaba una actividad residual de sólo
23-28%. Chen, et al., (1981). Las
publicaciones de 1981 de Abuchowski et al. y Chen et al.,
indican que para reducir significativamente la inmunogenia de la
uricasa, el PEG debe combinarse con aproximadamente el 60% de los
residuos de lisina disponibles (tabla 1). En la primera publicación
en que se dio a conocer la eliminación de la inmunorreactividad no
se reveló el exceso de combinación de PEG, la actividad uricolítica
residual o la naturaleza del enlace PEG-proteína.
Veronese, FM, et al., (1997) in JM Harris, et
al., (Eds.), Poly(ethylene glycol) Chemistry and
Biological Applications. ACS Symposium Series 680 (pp.
182-192) Washington, DC: American Chemical
Society.
La conjugación de PEG con una pequeña fracción de
residuos de lisina en uricasa redujo pero no eliminó su
inmunorreactividad en el caso de los animales experimentales. Tsuji,
J, et al., (1985) Int J Immunopharmacol
7:725-730 (28-45% de los
grupos amino acoplados); Yasuda, Y, et al., (1990) Chem
Pharm Bull 38:2053-2056 (38% de los
grupos amino acoplados). Las actividades uricolíticas residuales de
los aductos correspondientes comprende desde <33% (Tsuji, et
al.) hasta el 60% (Yasuda, et al.) de sus valores
iniciales. Tsuji, et al. sintetizaron los conjugados de
PEG-uricasa con PEG de 7,5 kDa y 10 kDa, además de
PEG de 5 kDa. Todos los conjugados resultantes fueron de alguna
manera inmunogénicos y antigénicos, si bien mostraban actividades
enzimáticas notablemente reducidas (Tabla 1; figuras
1A-1B).
Se documentó que un preparado PEGilado de uricasa
derivada de Candida utilis que se administró de manera segura
dos veces a cinco seres humanos retuvo sólo el 11% de su actividad
inicial. Davis, et al., (1981). Varios años después, la
uricasa modificada con PEG derivada de Arthrobacter
protoformiae se administró cuatro veces a un paciente con
linfoma avanzada e hiperuricemia severa. Chua, et al.,
(1988). Mientras que la activida residual de esta preparacion
enzimatica no fue medida, Chua, et al., demostraron la
ausencia de anticuerpos de antiuricasa en el suero del paciente 26
días después de la primera inyección de PEG-uricasa,
utilizando el ensayo inmunoenzimático (ELISA,
enzyme-linked immunosorbent assay).
Como se resume en la tabla 1, estudios previos de
uricasa PEGilada muestran que la actividad catalítica se reduce
significativamente al combinar una cantidad suficiente de cadenas de
PEG para reducir en un grado importante su inmunorreactividad.
Además, la mayoría de los preparados anteriores de
PEG-uricasa se sintetizaban utilizando el PEG
activado con cloruro de cianuro, un derivado de triazina
(2,4,6-tricloro-1,3,5-triazina)
que introducía nuevos determinantes antigénicos, así como inducir
anticuerpos en los conejos. Tsuji, et al., (1985).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
La patente japonesa 3-148298 de A
Sano, et al., describe proteínas modificadas, incluyendo
uricasa, derivatizada con PEG que tiene un peso molecular de
1-12 kDa que muestra una antigenia reducida y una
acción "mejor y prolongada" así como métodos para realizar
dichos péptidos derivatizados. Sin embargo, no existe información
sobre el recuento de cadenas, ensayo de enzimas, pruebas biológicas
o el significado de "mejor y prolongada". Las patentes
japonesas 55-99189 y 62-55079, ambas
de Y Inada, incluyen conjugados de uricasa preparada con
PEG-triazina o
bis-PEG-triazina (denotado como PEG_{2} en
la tabla 1), respectivamente (Nishimura, et al., (1979 y
1981). En el primer tipo de conjugado, los pesos moleculares de los
PEG son 2 kDa y 5 kDa, mientras que en el segundo tipo de conjugado,
sólo se utilizó 5 kDa. Nishimura et al. (1979) dieron a
conocer la recuperación del 15% de actividad uricolítica después de
la modificación del 43% de lisinas disponibles con PEG lineales de 5
kDa, en tanto que Nishimura, et al., (1981) registraron la
recuperación del 31% o 45% de la actividad uricolítica después de la
modificación del 46% o 36% de lisinas, respectivamente, con
PEG_{2}.
Estudios previos muestran que cuando una
reducción importante en la inmunogenia o antigenia de uricasa se
logra mediante la PEGilación, de manera invariable se asocia con una
pérdida sustancial de la actividad uricolítica. La seguridad,
conveniencia y la relación coste-eficacia de los
productos biofarmaceúticos se ven negativamente afectados por las
reducciones en sus potencias y la necesidad resultante de aumentar
la dosis administrada. Por lo tanto, existe la necesidad de contar
con medios alternativos seguros y eficaces para reducir los elevados
niveles de ácido úrico en los fluidos corporales, incluyendo la
sangre y la orina. La presente invención presenta una
PEG-uricasa esencialmente no inmunogénica que
retiene toda o casi toda la actividad de la enzima no
modificada.
Una aportación de la presente invención es un
conjugado de oxidasa de urato (uricasa) que retiene al menos en
torno al 75% de la actividad uricolítica de la uricasa no conjugada
y que presenta una inmunogenia sustancialmente reducida. Esta
aportación incluye una uricasa purificada en la cual cada subunidad
puede combinarse covalentemente con un promedio de 2 a 10 cadenas de
PEG, que puede ser lineales o ramificadas, en el que cada molécula
de PEG puede tener un peso molecular de entre 5 kDa y 100 kDa. La
uricasa de este aspecto de la invención puede ser recombinante. Ya
sea o no recombinante, la uricasa puede ser de origen mamífero. En
un aspecto de esta aportación, la uricasa puede ser uricasa de
hígado porcino, bovino u ovino. En otro aspecto de esta aportación,
la uricasa puede ser quimérica. Es posible que la uricasa quimérica
contenga porciones del hígado porcino o uricasa de hígado de
babuino. Por ejemplo, la uricasa quimérica puede ser uricasa
quimérica de cerdo-babuino (uricasa PBC, por sus
siglas en inglés) o uricasa porcina que contenga las mutaciones
R291k y T301S (uricasa PKS) (véase secuencias de la figura 6
y los resultados de los estudios fisiológicos e inmunológicos de las
figuras 7-12). Alternativamente, la uricasa puede
ser uricasa de bazo e hígado en la cual la tirosina 97 se reemplaza
por histidina, por medio de lo cual la actividad específica de la
uricasa puede aumentarse al menos en casi un 60%. La uricasa de la
invención, cualquiera que sea su origen, puede también tener una
forma que sea truncada, ya sea en el terminal de amino, en el
terminal de carboxilo o en ambos terminales. Asimismo, la uricasa
puede ser uricasa fúngica o microbiana. En un aspecto de esta
aportación, la uricasa fúngica o microbiana puede ser una forma
naturalmente ocurrente o recombinante de uricasa derivada de
Aspergillus flavus, Arthrobacter globiformis o Candida
utilis. De manera alternativa, la uricasa puede ser una uricasa
invertebrada, como una forma naturalmente ocurrente o recombinante
de uricasa derivada de Drosophila melanogaster o
Drosophila pseudoobscura. Asimismo, es posible que esta
uricasa de la invención sea una uricasa vegetal, por ejemplo
una forma naturalmente ocurrente o recombinante de uricasa derivada
del nódulo de la raíz de la soja (Glycine max). El PEG puede
tener un peso molecular promedio de entre 5 kDa y 100 kDa;
preferiblemente, el PEG puede tener un peso molecular promedio de
entre 10 kDa y 60 kDa; idealmente, el PEG puede tener un peso
molecular promedio de entre 20 kDa y 40 kDa, por ejemplo 30
kDa. La cantidad promedio de las cadenas combinadas covalentemente
de PEG puede ser de 2 a 10 cadenas por subunidad de uricasa;
preferiblemente, la cantidad promedio de las cadenas combinadas
covalentemente de PEG pueden ser de 3 a 8 cadenas por subunidad de
uricasa; idealmente, la cantidad promedio de las cadenas combinadas
covalentemente de PEG pueden ser de 4 a 6 cadenas por subunidad de
uricasa. En un aspecto de esta aportación, la uricasa puede ser
tetramérica. Las cadenas de PEG pueden unirse covalentemente a la
uricasa por vía de enlaces de uretano (carbamato), enlaces
secundarios de amina y/o enlaces de amida. Cuando la uricasa es una
forma recombinante de cualesquiera de las uricasas aquí mencionadas
en el presente, la forma recombinante puede tener sustancialmente la
secuencia de la forma naturalmente ocurrente.
Otra aportación de la presente invención es una
composición farmacéutica que sirve para reducir los niveles de ácido
úrico en los fluidos corporales, que contienen cualesquiera de los
conjugados de PEG-uricasa ya descritos y un portador
aceptable en términos farmacéuticos. La composición puede ser
estabilizada por liofilización y disuelta inmediatamente después de
la reconstitución para ofrecer soluciones aconsejables en la
administración parenteral.
Asimismo, la presente invención presenta el uso
de PEG-oxidasa de urato para reducir los niveles de
ácido úrico en los fluidos y tejidos del cuerpo de un mamífero. Este
uso abarca la administración a un mamífero de una cantidad de
PEG-uricasa que reduce con eficacia el ácido úrico.
La PEG-uricasa puede ser una uricasa purificada de
dos o más subunidades en la que cada subunidad puede unirse
covalentemente con un promedio de 2 a 10 cadenas de PEG lineal o
ramificado, en el que cada molécula de PEG puede tener un peso
molecular medio de entre aproximadamente 5 kDa y 100 kDa, en un
portador aceptable farmacéuticamente. El mamífero puede ser un ser
humano. La fase de administración puede ser, por ejemplo, una
inyección vía intravenosa, intradérmica, subcutánea, intramuscular o
intraperitoneal; o bien, una presentación en aerosol para su
inhalación. Los elevados niveles de ácido úrico pueden encontrarse
en la sangre, orina u otros fluidos y tejidos corporales, así como
estar relacionados con la gota, tofos, insuficiencia renal,
transplante de órgano o cualquier otra enfermedad maligna.
Otras aportaciones de la presente invención son
un método para separar una forma tetramérica de uricasa derivada de
una solución que contiene múltiples formas de uricasa y el producto
de dicho método. En primer lugar, la solución puede contener uricasa
tetramérica y agregados de uricasa. El método puede incluir las
siguientes fases: aplicar la solución a por lo menos una columna de
separación en un pH de entre casi 9 y 10,5, por ejemplo 10,2;
recuperar las fracciones del eluato e identificar aquellos que
puedan contener uricasa tetramérica separada, en la que las
fracciones están básicamente libres de agregados de uricasa; y
combinar las fracciones de la uricasa tetramérica separada. La
columna de separación puede fundamentarse en un intercambio de
iones, exclusión de tamaño o cualquier otro criterio de separación
válido. De igual manera, el método puede abarcar un análisis de las
fracciones para determinar la presencia de uricasa tetramérica o la
ausencia de agregados de uricasa. Por ejemplo, dicho análisis
puede incluir cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC:
high performance liquid chromatography), otros métodos de
cromatografía, dispersión de la luz, centrifugación y/o
electroforesis. En un aspecto de esta aportación, la uricasa
tetramérica purificada puede contener menos del 10% de agregados de
uricasa.
La figura 1A muestra la retención de la actividad
por medio de la uricasa PEGilada derivada de Candida utilis
como una función del número de cadenas de PEG acoplado por
subunidad.
La figura 1B muestra la retención de la actividad
por medio de la uricasa PEGilada derivada de Candida utilis
como una función de la masa total de PEG acoplado por subunidad.
La figura 2A muestra la retención de la actividad
por medio de la uricasa PEGilada derivada del hígado porcino como
una función del número de cadenas de PEG acoplado por subunidad.
La figura 2B muestra la retención de la actividad
por medio de la uricasa PEGilada derivada del hígado porcino como
una función de la masa total de PEG acoplado por subunidad.
La figura 3A muestra la retención de la actividad
por medio de la uricasa PEGilada quimérica de
cerdo-babuino (PBC: pig-baboon
chimeric) como una función del número de cadenas de PEG acoplado
por subunidad.
La figura 3B muestra la retención de la actividad
por medio de la uricasa PEGilada PBC como una función de la masa
total de PEG acoplado por subunidad.
La figura 4A muestra la retención de la actividad
por medio de la uricasa PEGilada derivada de Aspergillus flavus
como una función del número de cadenas de PEG acoplado por
subunidad.
La figura 4B muestra la retención de la actividad
por medio de la uricasa PEGilada derivada de Aspergillus flavus
como una función de la masa total de PEG acoplado por
subunidad.
La figura 5A muestra la retención de la actividad
por medio de la uricasa PEGilada recombinante derivada del nódulo de
la raíz de soja como una función del número de cadenas de PEG
acoplado por subunidad.
La figura 5B muestra la retención de la actividad
por medio de la uricasa PEGilada recombinante derivada del nódulo de
la raíz de soja como una función de la masa total de PEG acoplado
por subunidad.
La figura 6 muestra las secuencias de aminoácidos
dedicidas de uricasa quimérica de cerdo-babuino
(uricasa PBC), la uricasa PBC que se trunca en terminales amino y
carboxilo (PBC-NT-CT) y la uricasa
porcina que contiene las mutaciones R291K y T301S (uricasa PKS), en
comparación con las secuencias porcinas y de babuino.
La figura 7 muestra la actividad de uricasa en el
suero de ratón 24 horas después de cada cuatro o cinco inyecciones
intraperitoneales de uricasa modificada-PEG PBC, en
relación con el valor de 24 horas después de la primera
inyección.
La figura 8 muestra la relación inversa entre la
actividad de la uricasa inyectada modificada-PEG PBC
en el suero de un ratón carente de uricasa y la concentración del
ácido úrico en el suero y la orina.
La figura 9 muestra una menor gravedad de un
defecto concentrante en la orina en ratones (uox-/-) carentes
de uricasa que fueron tratados con uricasa
modificada-PEG PBC.
La figura 10 muestra la menor gravedad de la
diabetes insípida nefrogénica en ratones (uox-/-) carentes de
uricasa que fueron tratados con uricasa
modificada-PEG PBC.
La figura 11 muestra la menor gravedad de la
nefropatía inducida por ácido úrico, según se observó a través del
microscopio de resonancia magnética, en ratones (uox-/-)
carentes de uricasa que fueron tratados con uricasa
modificada-PEG PBC.
La figura 12 muestra la eliminación acelerada
derivada de la circulación de ratones BALB/c de octámero de uricasa
PBC inyectada, en comparación con el tetrámero, cuando ambos están
acoplados con 5-6 cadenas de PEG de 10 kDa por
subunidad.
La presente invención brinda mejores conjugados
de polímeros solubles en agua, preferiblemente polietilenglicoles o
polióxietilenos, con uricasas. Asimismo, la invención ofrece
composiciones farmacéuticas de conjugados mejorados. Estos
conjugados son sobre todo no inmunogénicos y retienen el 75% como
mínimo, preferentemente el 85%, e idealmente el 95% o más de la
actividad uricolítica de la enzima no modificada. Las uricasas
aconsejables para la conjugación con polímeros solubles en agua
incluyen oxidasas de urato de origen natural aisladas de bacterias,
hongos y tejidos de plantas o animales, tanto vertebrados como
invertebrados, así como formas recombinantes de uricasa, incluyendo
las variantes mutadas, híbridas y/o truncadas enzimáticamente
activas. Entre los polímeros solubles en agua aconsejables para su
uso en la presente invención se encuentran los polietilenglicoles o
polióxietilenos lineales y ramificados, mejor conocidos como PEG.
Ejemplos de PEG ramificados son los sujetos a la patente
estadounidense 5,643,575. Un ejemplo preferido de PEG lineales es el
monometoxiPEG, de estructura general
CH_{3}O-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}H, en donde n varia
aproximadamente desde 100 a 2.300.
Una uricasa de origen mamífero preferida es la
uricasa recombinante PBC, compuesta por porciones de secuencias de
hígado de cerdo e hígado de babuino, Wu, et al., (1989),
fueron los primeros en determinarlos. Un ejemplo de dicha uricasa
quimérica contiene los primeros 225 aminoácidos derivados de la
secuencia de uricasa porcina (SEQ ID NO:1) y los últimos 79
aminoácidos derivados de la secuencia de uricasa de babuino (SEQ ID
NO:2) (uricasa de cerdo-babuino o uricasa PBC;
véase la figura 6). Otro ejemplo de esto es que una uricasa
contiene residuos 7-225 de secuencia porcina (SEQ ID
NO. 1) y residuos 226-301 de la secuencia de babuino
(SEQ ID NO. 2); lo que es equivalente a la uricasa PBC que se trunca
en terminales de amino y carboxilo
(PBC-NT-CT; véase figura 6).
Otro ejemplo de esto es que la uricasa quimérica contiene los
primeros 288 aminoácidos derivados de la secuencia porcina (SEQ ID
NO. 1) y los últimos 16 aminoácidos derivados de la secuencia de
babuino (SEQ ID NO.2). Debido a que la última secuencia difiere de
la secuencia porcina en sólo dos posiciones, con una lisina (K) en
lugar de arginina en el residuo 291 y una serina (S) en lugar de
treonina en el residuo 301, se hace referencia a esta mutación como
una uricasa porcina-K-S o PKS. Cada
una de las uricasas PKS, PBC y
PBC-NT-CT tienen un residuo de
lisina más y, por ende, un sitio más potencial de PEGilación que la
secuencia porcina o de babuino.
Se subclonaron las cADN para varias uricasas de
mamíferos, incluyendo uricasa PBC, uricasa PKS y uricasa
recombinante similar al babuino, y se determinaron las condiciones
óptimas para expresión en E. coli, utilizando los métodos
estándar. Véase Erlich, HA, (Ed.) (1989) PCR Technology.
Principles and Applications for DNA Amplification. New York:
Stockton Press; Sambrook, J, et al., (1989) Molecular
Cloning. A Laboratory Manual, Second Edition. Cold Spring
Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Se extrajeron y
purificaron las uricasas recombinantes, así como se evaluó su
estabilidad y actividad utilizando una modificación de ensayos
estándar. Véase Fridovich, I, (1965) J Biol Chem
240:2491-2494; Nishimura, et al.,
(1979), y Ejemplo 1.
En una aportación de la invención, la uricasa
puede conjugarse a través de un enlace biológicamente estable, no
tóxico, covalente con una cantidad relativamente pequeña de cadenas
de PEG. Tales enlaces pueden incluir enlaces de uretano (carbamato),
enlaces secundarios de amina y enlaces de amida. Shearwater
Polymers, Huntsville, AL comercializa varios PEG activados
aconsejables para dicha conjugación.
Por ejemplo, los enlaces de uretano con la
uricasa pueden formarse mediante la incubación de uricasa en
presencia del carbonato de succinimidilo (SC) o
4-nitrofenil carbonato (NPC) derivados de PEG. El
SC-PEG puede sintetizarse utilizando el
procedimiento descrito en la patente estadounidense 5,612,460, aquí
incorporada a modo de referencia. NPC-PEG puede
sintetizarse reaccionando el PEG con 4-nitrofenil
cloroformato de acuerdo con los métodos descritos en Veronese, FM,
et al., (1985) Appl Biochem Biotechnol
11:141-152, y en la patente estadounidense
5,286,637, incorporada a la presente a modo de referencia. Los
métodos descritos en la patente '637 están adaptados a los PEG de
peso molecular más elevado al ajustar las concentraciones de los
reactantes para mantener una estoiquiometría semejante. Se describe
un método alternativo de síntesis de NPC-PEG en
Büttner, W, et al., East German Patent Specification DD 279
486 A1.
Los enlaces de amida con la uricasa pueden
obtenerse utilizando un éster de N-hidroxisuccinimida de un
derivado de ácido carboxílico de PG (Shearwater Polymers). Los
enlaces secundarios de amina pueden formarse utilizando
2,2,2-trifluoetanesulfonil PEG (PEG tresilo;
Shearwater Polymers) o mediante la alquilación reductiva que
utiliza PEG aldehido (Shearwater Polymers) y cianoborohidrido de
sodio.
En conjugados que contienen PEG con pesos
moleculares de entre 5 kDa y 30 kDa, la cantidad máxima de cadenas
de PEG que fueron combinadas por subunidad, mientras que retiene por
lo menos el 75% de la actividad uricolítica de la enzima no
modificada, tiene una gama entre un promedio de 2 cadenas para
uricasa de soja a más de 10 cadenas para uricasa PBC (Véase
condiciones de ensayo en el Ejemplo 1 y los resultados en las
figuras 1A-5B). El último excedente de PEGilación
corresponde a cerca de una tercera parte del total de grupos amino.
En una aportación de la invención, la cantidad promedio de cadenas
de PEG combinadas por subunidad de uricasa se encuentra entre 2 y
10. En una aportación preferida, la cantidad promedio de cadenas de
PEG combinadas por subunidad de uricasa se encuentra entre 3 y 8. En
una aportación de mayor preferencia, la cantidad promedio de cadenas
acopladas covalentemente de PEG por subunidad de uricasa se
encuentra entre 4 y 6. En otra aportación, el peso molecular de PEG
utilizado para la reacción de combinación se localiza entre 5 kDa y
100 kDa, preferiblemente entre 10 kDa y 60 kDa, e idealmente entre
20 kDa y 40 kDa, por ejemplo 30 kDa.
Existen varios factores que pueden afectar la
elección del peso molecular óptimo y la cantidad de cadenas de PEG
para la combinación con una determinada forma de uricasa. En
general, la reducción o eliminación de inmunogenia sin sufrir una
pérdida sustancial de la actividad uricolítica pueden requerir la
combinación de relativamente más cadenas de PEG de peso molecular
inferior, en comparación con las relativamente pocas cadenas de PEG
de peso molecular más elevado. Por ejemplo, ya sea 6 cadenas
de PEG de 20 kDa por subunidad o 4 cadenas de PEG de 30 kDa por
subunidad puede dar resultados óptimos. Asimismo, cada forma
diferente de uricasa puede dar resultados óptimos diferentes en
relación con el tamaño y la cantidad de cadenas. Véase
figuras 1A-5B.
La conjugación de PEG convierte todas las
uricasas solubles y estables en tampones para el pH fisiológico, sin
la incorporación de un sustrato análogo o inhibidor, como en el caso
de la 8-azaxantina que se utiliza como estabilizador
en la uricasa fúngica (Uricozyme®) que vende Sanofi Winthrop en
Francia e Italia. Dos diferentes conjugados de uricasa PBC, uno con
aproximadamente 6 cadenas de PEG de 10 kDa por subunidad y el otro
con aproximadamente 2 cadenas de PEG de 19 kDa por subunidad,
retienen una actividad importante después de la incubación en el
suero de ratón durante un periodo mayor de un mes a 37ºC. Además,
varios de los conjugados de esta invención registraron una hemivida
en circulación, en el caso de los ratones, mayor de dos días, en
comparación con las medias vidas de 8 o 24 horas dadas a conocer
para las uricasas modificadas-PEG de mamíferos y
microbios. Chen, et al., (1981); Fuertges, F, et al.,
(1990) J Contr Release 11: 139-148;
Fujita, T, et al., (1991) J Pharmacobiodyn
14:623-629. Las medias vidas más duraderas de
los medicamentos de proteínas inyectados las vuelven más efectivas
en cuanto a costos y pueden mejorar la aceptación del paciente. La
hemivida prolongada también es indicio de productos que son mejor
tolerados por el cuerpo.
Cuando se prepararon los conjugados PEG de
uricasa PBC de la forma tetramérica purificada de la enzima (cuatro
subunidades de 35 kDa), pusieron en evidencia una inmunogenia
profundamente reducida en ratones (figura 7), en comparación con la
inmunogenia moderada de conjugados PEG en formas más grandes de la
enzima (por ejemplo, octámeros de subunidad de 35 kDa;
véase figura 12) y la inmunogenia muy elevada en la enzima no
modificada. Los ratones carentes de uricasa inyectados en repetidas
ocasiones con PEG-uricasa de la presente invención
no presentaron hiperuricemia por más de dos meses y la estructura y
función de sus riñones se vieron protegidos en contra de daños
ocasionados por el ácido úrico (figuras 8-11).
Las inyecciones de conjugados totalmente activos
de uricasa PBC con PEG de 10 kDa (figuras 3A-3B)
redujeron significativamente la hiperuricemia de homocigotos,
ratones carentes de uricasa (figura 8). Los niveles de ácido úrico
en la orina también se vieron reducidos de manera significativa en
todos los ratones carentes de uricasa tratados con uricasa
modificado-PEG PBC. Los ratones carentes de uricasa
recibieron una serie de inyecciones con un preparado de
PEG-uricasa semejante a las que se utilizaron para
obtener los datos de la figura 8. Este tratamiento redujo la
gravedad de un defecto concentrante en la orina, según se probó por
las medidas de la osmolalidad de orina en condiciones normales y
después de un periodo de 12 horas de privación de agua (figura 9) y
por su consumo de agua y producción de orina, en comparación con las
medidas correspondientes en ratones genéticamente iguales no
tratados. De igual manera, se demostró que diez semanas de
tratamiento, iniciando dentro de los primeros diez días de vida, en
ratones knockout homozigóticos carentes de uricasa
(oux-/-) con una PEG-uricasa de esta
invención disminuyó la gravedad del trastorno inducido por el urato
de la arquitectura renal, según se apreció mediante microscopio de
resonancia magnética (figura 11). Para obtener más información sobre
los métodos de microscopio, véase Hedlund, LW, et al.,
(1991) Fund Appl Toxicol 16:787-797;
Johnson, GA, et al., (1992) in JC Gore, (Ed.),
Reviews of Magnetic Resonance in Medicine, Vol. 4 (pp.
187-219) New York: Pergamon Press.
Las preparaciones purificadas de uricasas de
origen natural y recombinantes por lo general contienen una mezcla
de agregados de enzimas, además de tener la forma tetramérica (140
kDa). El porcentaje de cada preparado de uricasa que presenta la
forma tetramérica varía por lo general entre aproximadamente el 20%
y el 90%. A pesar de la evidencia que los agregados no PEGilados de
otras proteínas son altamente inmunogénicas (véase, por ejemplo,
Moore, WV, et al., (1980) J Clin Endocrinol Metab
51:691-697), estudios anteriores de
PEG-uricasa no describen ninguno de los esfuerzos
para limitar el contenido de los agregados, lo que sugiere que la
inmunogenia potencial de los agregados
modificados-PEG no se consideraron. Con base en las
observaciones de los inventores de la presente invención, parece que
tales agregados estuvieron presentes en las preparaciones de enzimas
utilizadas para la síntesis previas de PEG-uricasa.
Su presencia puede hacer más difícil la tarea de preparar conjugados
no inmunogénicos. Asimismo, parece que las grandes pérdidas de la
actividad uricolítica observada en los esfuerzos anteriores para
uricasa PEGilada se relacionaron con una gran cantidad de cadenas de
PEG de bajo peso molecular que fueron combinadas. Por otro lado, los
métodos de purificación de uricasa y PEGilación descritos en el
presente permiten la incorporación covalente de casi 10 cadenas de
PEG por subunidad mientras que se retiene más del 75% de la
actividad uricolítica, al menos para ciertas uricasas, por
ejemplo, la uricasa quimérica de cerdo-babuino y
la enzima derivada de A. flavus (véase figuras 3A y
4A)
En otra aportación preferente, sustancialmente
todos los agregados de la forma tetramérica de la enzima puede
eliminarse mediante la cromatografía de intercambio de iones o
exclusión por tamaño en un pH entre 9 y 10,5, preferiblemente 10,2,
previa a la conjugación con PEG del preparado de uricasa resultante,
sustancialmente tetramérico. El peso molecular de la uricasa en cada
fracción derivada de la columna de preparación puede supervisarse
mediante cualquier técnica de análisis del tamaño, incluyendo,
por ejemplo, HPLC, cromatografía de exclusión por tamaño
convencional, centrifugación, dispersión de la luz, electroforesis
capilar o de gel en un tampón no desnaturalizante. En el caso de la
uricasa tetramérica aislada mediante la cromatografía de exclusión
por tamaño, las fracciones que contienen sólo la forma de 140 kDa de
la enzima pueden reunirse y utilizarse en la conjugación con PEG. En
el caso de la uricasa tetramérica aislada mediante la cromatografía
de intercambio de iones, las fracciones de la columna de intercambio
de iones pueden analizarse en relación con el tamaño para determinar
cuáles fracciones contienen cantidades importantes de la forma
tetramérica sin agregados detectables. De la uricasa así reunida,
por lo menos el 90% puede tener la forma tetramérica; los agregados
no aconsejables pueden de este modo representar aproximadamente el
10%, 5%, 2% o menos del total de uricasa aislada.
Los resultados presentados aquí indican que las
formas, aún cuando sean ampliamente PEGiladas, de uricasa PBC más
grandes que el tetrámero son altamente inmunogénicas en los ratones
(figura 12). Además, en ratones que recibieron una inyección de
conjugados PEG de agregados de uricasa, la actividad uricolítica en
inyecciones subsecuentes de tetrámeros PEGilado o agregados
PEGilados se eliminó con rapidez de la circulación. Por el
contrario, los conjugados preparados y derivados de uricasa que
contenía menos del 5% de agregados pudieron administrarse varias
veces sin acelerar sus tasas de eliminación (figura 7) y sin la
formación detectable de anticuerpos, según las mediciones arrogadas
por un inmunoensayo sensible de enzimas acopladas. Además, el uso de
uricasa tetramérica altamente purificada distingue los conjugados
mejorados de la presente invención de las preparaciones de
PEG-uricasa descritas con anterioridad. Por el
contrario, la presencia de una proporción significativa (por
ejemplo >10%) de agregados en las preparaciones de uricasa
utilizadas por algunos otros investigadores pudo haberlo llevado a
combinar grandes cantidades de cadenas de PEG a fin de suprimir la
inmunogenia. En consecuencia, se redujo notablemente la actividad
enzimática de los conjugados resultantes. En otras aportaciones, la
presente invención de manera expresa contempla la uricasa PEGilada
de forma no tetramérica, como los dímeros de uricasa, en tanto que
las preparaciones de dicha uricasa conjugada retienen por lo menos
cerca del 75% de su actividad uricolítica y son en esencia no
inmunogénica.
En otra aportación de la presente invención, se
abastece de una uricasa mutada de hígado de babuino de potencia
inesperadamente aumentada, respecto a aquella de la enzima no
modificada. Esta uricasa mejorada primaria se preparó utilizando las
técnicas convencionales de ADN recombinantes. En particular no se
esperaba que la sustitución de un residuo de aminoácido (tirosina
por histidina en la posición 97) en la uricasa de babuino diera como
resultado un aumento sustancia en la actividad específica
enzimática. Cuando se expresó en E. coli, esta proteína
mutada se encontró que tenía por lo menos 60% más de actividad
específica que la enzima recombinante de babuino de la cual se
derivó.
En otra aportación, la actividad específica se
incrementó y/o la solubilidad la enzima no PEGilada se mejoró al
expresar variantes truncadas de uricasas porcinas o de
cerdo-babuino quiméricas de las cuales por lo menos
los primeros seis aminoácidos de los terminales de amino y/o por lo
menos los últimos tres aminoácidos en el terminal carboxilo se
eliminaron de las proteínas expresadas (véase figura 6). Las
uricasas recombinantes con la truncación
carboxilo-terminal pudo mejorar la solubilidad
previa a la PEGilación debido a la eliminación de la secuencia del
objetivo peroxisomal. Véase Miura, S, et al., (1994)
Eur J Biochem 223:141-146.
Los conjugados de PEG-uricasa de
la presente invención son de utilidad para reducir los niveles de
ácido úrico en los fluidos y tejidos corporales de los mamíferos,
preferentemente en seres humanos, y por lo tanto pueden ocuparse en
el tratamiento de elevados niveles de ácido úrico relacionados con
las condiciones que incluyen gota, tofos, insuficiencia renal,
transplante de órganos y enfermedades malignas. Los conjugados de
PEG-uricasa pueden inyectarse a un mamífero con
niveles elevados de ácido úrico por vía intravenosa, subcutánea,
intradermal, intramuscular o intraperitoneal entre otras.
Alternativamente, pueden ser convertido a un aersol e inhaló.
Véase Patton, JS, (1996) Adv Drug Delivery Rev
19:3-36 y patente estadounidense 5,458,135.
La dosis efectiva de PEG-uricasa de la presente
invención dependerá del nivel de ácido úrico, así como del tamaño
del individuo. En una aportación de este aspecto de la invención, la
PEG-uricasa se administra en un excipiente o
diluyente farmacéuticamente aceptable en una cantidad que va de casi
10 \mug a 1 g. En una aportación preferida, la cantidad
administrada se encuentra entre 100 \mug y 500 mg. Es aún más
preferible que la cantidad administrada de uricasa sea entre 1 mg y
100 mg, por ejemplo 5 mg, 20 mg o 50 mg. Las masas
determinadas para las cantidades de las dosis respecto a las
aportaciones se refieren a la cantidad de la proteína contenida en
el conjugado.
Las fórmulas farmacéuticas que contengan
PEG-uricasa pueden prepararse utilizando técnicas
convencionales, por ejemplo, como se describe en Gennaro, AR
(Ed.) (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th
Edition, Easton, PA: Mack Publishing Co. Entre los excipientes
recomendados para la preparación de soluciones inyectables se
encuentran: tampón salino de fosfato, solución lactada de Ringer,
agua, polioles y glicerol. Las composiciones farmacéuticas para
inyección parenteral contienen líquidos farmacéuticamente aceptables
estériles acuosos o no acuosos, dispersiones, suspensiones o
emulsiones así como polvos estériles para la reconstitución en
soluciones o dispersiones estériles inyectables justo antes de
usarse. Estas formulaciones pueden contener componentes adicionales,
como preservativos, solubilizadores, agentes humectantes,
emulsificadores, tampones, antioxidantes y diluyentes.
Asimismo, la PEG-uricasa puede
suministrarse como composiciones de liberación controlada para
implantación en un individuo con el fin de controlar de manera
constante los elevados niveles de ácido úrico en los fluidos
corporales. Por ejemplo, el ácido poliláctico, ácido
poliglicólico, colágeno regenerado,
poli-L-lisina, alginato de sodio,
goma gelana, quitosana, agarosa, liposomas multilamelar y muchas
otras formulaciones convencionales de depósito comprenden materiales
bioerodible o biodegradable que pueden formularse con composiciones
biológicamente activas. Estos materiales, ya sean implantados o
inyectados, de manera progresiva se rompen y liberan el material
activo en el tejido circundante. Por ejemplo, un método para
encapsular la PEG-uricasa comprende el método
descrito en la patente estadounidense 5,653,974. El uso de
formulaciones bioerodible, biodegradables o de otro depósito se
consideran de manera expresa en la presente invención. Dentro del
alcance de la presente invención también radica el uso de bombas de
infusión y sistemas matriciales de trampas para la liberación de
PEG-uricasa. La PEG-uricasa también
puede contenerse en micelas o liposomas. En el ámbito es muy
conocida la tecnología para encapsular liposomas. Véase, por
ejemplo, Lasic, D, et al., (Eds.) (1995) Stealth
Liposomes. Boca Raton, FL: CRC Press.
Las composiciones farmacéuticas de
PEG-uricasa de la invención reducirán la necesidad
de hemodiálisis en pacientes con alto riesgo de insuficiencia renal
inducida por el urato, por ejemplo, en receptores de un
transplante de órgano (Venkataseshan, VS, et al., (1990)
Nephron 56:317-321) y los pacientes
con ciertas enfermedades malignas. En pacientes con grandes
acumulaciones de urato cristalino (tofos), tales composiciones
farmacéuticas mejorarán la calidad de vida con mayor rapidez que los
tratamientos con los que actualmente se cuentan.
Los siguientes ejemplos muestran los diversos
aspectos que ya se mencionaron. Estos ejemplos describen las
PEG-uricasas preparadas mediante la combinación de
derivados de PEG activados (es decir, electrofílicos) de varios
tamaños y composiciones con uricasas porcinas, fúngica o bacteriana
de origen natural o con uricasa recombinante de soja, porcina o
quimérica de cerdo-babuino. Se incluyen los
resultados de la actividad, la solubilidad, la estabilidad, la
farmacoquinética, la farmacodinámica y los estudios inmunológicos.
Los datos de las figuras 8-11 dan pruebas de la
capacidad de la uricasa modificada-PEG PBC de esta
invención para corregir la hiperuricemia y la hiperuricosuria, así
como para conservar la estructura y función renal en un modelo
animal que presenta hiperuricemia e hiperuricosuria, las cuales
causan serios daños en el riñón (Wu, X, et al., (1994)
Proc Natl Acad Sci USA 91:742-746).
Estos ejemplos ofrecen una guía para los expertos en la materia en
lo que se refiere a la producción de conjugados no inmunogénicos de
uricasa que retiene por lo menos casi el 75% de la actividad
uricolítica de la enzima no modificada.
La forma tetramérica de uricasa (peso molecular
ca. 140 kDa) se purificó de una solución de uricasa de hígado
porcino mediante una cromatografía preparativa de exclusión por
tamaño o intercambio de iones, seguida por una cromatografía
analítica de exclusión por tamaño. La uricasa de hígado porcino se
obtuvo del Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, catálogo
n.º U2350 o U3377; o Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN.
Las cromatografías preparativa y analítica de
exclusión por tamaño se realizaron con un pH de
10-10,5, preferiblemente 10,2, en un tampón de
carbonato de sodio de 10 mM que contiene NaCl 0.1 M, en columnas
Superdex 200 que fueron previamente calibradas con proteínas de peso
molecular conocido. Se obtuvo Superdex de Amersham Pharmacia,
Piscataway, NJ. Puede utilizarse cualquier tampón que tenga la
capacidad de mantener el pH deseado y que sea compatible con la
química que va utilizarse para la copulación PEG. Tales tampones son
muy conocidos en el ámbito. La absorbancia ultravioleta del eluato
derivado de la columna de preparación se supervisó a 280 nm, en
tanto que las porciones con eluato de uricasa que corresponden al
peso molecular de la forma tetramérica deseada, pero libre de
especies de peso molecular elevado, se recolectaron para utilizarse
en la PEG-uricasa no inmunogénica como se describe
en el ejemplo 2. Opcionalmente, las formas tetraméricas de uricasa
pueden aislarse utilizando otro medio de exclusión por tamaño como
Superose 12 (Amersham Pharmacia) o cualquier otro medio que sea
compatible con soluciones ligeramente alcalinas y que tenga un
intervalo adecuado de fraccionación por tamaño. Dichos medios se
consiguen sin problemas, además son muy conocidos en el ámbito.
La cromatografía de intercambio de iones se llevó
a cabo con un pH de 10-10,5, preferiblemente 10,2,
en las columnas Mono Q (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ) que se
equilibró con tampón de carbonato de sodio de 0,1 M. Es posible
utilizar cualquier tampón que sea compatible con la química de
acoplamiento de PEG y cuente con la capacidad de mantener el pH
deseado, en la concentración de iones suficientemente baja para
permitir la absorción de uricasa a la columna. Tales tampones son
muy conocidos en el ámbito. La absorbencia ultravioleta del eluato
se controló en 280 nm durante la elución de la uricasa derivada de
la resina de intercambio de iones al aumentar la concentración de
iones de la solución tampón aplicada, por ejemplo por un
gradiente lineal de 0 a 0,5 M NaCl en el tampón de carbonato de
sodio. Luego, se utilizo la HPLC de exclusión por tamaño a fin de
identificar las fracciones del eluato que contenga la forma
tetramérica deseada de uricasa, sin los agregados detectables, para
la síntesis de PEG-uricasa sustancialmente no
inmunogénica. De manera opcional, la forma tetramérica de uricasa
puede aislarse utilizando otro medio de intercambio de iones, como
Q-Sepharose (Amersham Pharmacia) o cualquier otro
medio que sea compatible con soluciones ligeramente alcalinas.
Dichos medios se consiguen sin problemas, además son muy conocidos
en el ámbito.
La actividad de uricasa se ensayó utilizando una
modificación de los métodos estándar. Véase, por ejemplo,
Fridovich (1965); Nishimura, et al., (1979). Las soluciones
de ácido úrico se prepararon todos los días en un tampón de borato
de sodio de 50 mM, pH 9,2, para dar concentraciones finales en el
ensayo de 6-10 \muM. Las preparaciones de uricasa
se diluyeron en este tampón de burato que contenía albúmina de suero
bovino (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, catálogo n.º
A-7030), de modo que la concentración final de
albúmina en el ensayo fue de 0.1 mgr/mL. Después de mezclar varias
diluciones de la enzima con el sustrato en una placa de
microtitulación para un lector de microplacas, la tasa de
eliminación de ácido úrico en 25ºC se supervisó en 292 nm cada
cuatro segundos durante 3 minutos. De las muestras en las que entre
el 10% y el 40% del sustrato se consumió en un periodo de tres
minutos, por lo menos 20 puntos de datos se utilizaron para calcular
la tasa máxima de reducción en la absorción por minuto. Una unidad
internacional (IU, international unit) de actividad de
uricasa se definió respecto a la cantidad de enzima que consume un
micromol de ácido úrico por minuto; las actividades específicas se
expresan como proteína IU/mg. Algunos de los datos en relación con
las actividades de uricasa relativas de las figuras
1A-5B se obtuvieron utilizando ácido úrico de 100
\muM en el ensayo. Otros resultados en relación con la velocidad
en el ácido úrico de 100 \muM (V_{100}) se calcularon a partir
de los valores de la constante de Michaelis (K_{M}) y la velocidad
máxima (V_{máx}) para las respectivas preparaciones de enzima,
utilizando la fórmula:
V_{100} = 100
x V_{máx}/(K_{M} +
100)
Donde K_{M} se expresa en micromol
Para una solución de uricasa tetramérica en un
tampón de carbonato de sodio de 0,1 M, pH 10,2,
10-200 moles de un derivado activado de
monometoxiPEG, por ejemplo, el carbonato de
4-nitrofenil (NPC-PEG), de varios
tamaños (5 kDa a 30 kDa) se agregaron por cada mol de subunidad de
uricasa (peso molecular 35 kDa). Estos y otros PEG activados
recomendados se pueden obtener en Shearwater Polymers. Las
instrucciones para acoplar estos PEG con las proteínas se incluyen
en el catálogo de Shearwater Polymer que puede encontrarse en su
sitio de Internet, www.swpolymers.com, y en JM Harris, et
al., (Eds.) (1997) Poly(ethylene glycol) Chemistry and
Biological Applications. ACS Symposium Series 680, Washington,
DC: American Chemical Society. La reacción de acoplamiento se
permitió a fin de proceder en 0-8ºC hasta que el
acomplamiento de PEG no cambiase de manera significativa con el
tiempo. Luego, el PEG no reaccionado se eliminó del producto de la
reacción mediante cromatografía y/o ultrafiltración.
El número de cadenas de PEG acoplado por
subunidad de uricasa se determinó gracias a una adaptación de
métodos descritos Kunitani, M, et al., (1991) J
Chromatogr 588:125-137; Saifer, et
al., (1997) y Sherman, et al., (1997). En resumen, las
alícuotas de las mezclas o fracciones de la reacción de la
PEGilación derivada de las columnas de preparación de intercambio de
iones o exclusión por tamaño se caracterizaron por la HPLC de
análisis de exclusión por tamaño en una columna TSK 5,000 PW_{XL}
a temperatura ambiente en un tampón de carbonato de sodio de 10 mM,
pH 10,2, que contenía NaCl 0,1 M. La columna de la HPLC se obtuvo de
TosoHaas (Montgomeryville, PA). Las proteínas y PEG se controlaron
mediante absorbencia ultravioleta y detectores de índice refractivo.
El volumen proteico de los conjugados se calculó a partir de la
absorbencia ultravioleta en comparación con la del estándar adecuado
de uricasa no modificada. La cantidad de PEG del conjugado se
calculó a partir del área del punto máximo del índice de refracción,
corregido para la contribución de la proteína para el índice de
refracción, en relación con el área del punto máximo del índice de
refracción del estándar adecuado de PEG.
La figura 2A muestra la retención de la actividad
mediante la uricasa PEGilada de hígado porcino como una función de
la cantidad de cadenas de PEG acopladas por subunidad. Los datos de
los autores de la presente invención (\blacktriangle, \Box) se
comparan con los de Chen, et al., (1981). El punto de datos
dentro de un círculo grande denota un conjugado que Chen, et
al., (1981) describió como no inmunorreactivo. Como se muestra
en la figura 2A, los conjugados de la uricasa tetramérica porcino
con hasta 6 cadenas de PEG de 30 kDa por subunidad o hasta 7 cadenas
de PEG de 5 kDa por subunidad retuvieron por lo menos el 75% de la
actividad de la enzima no modificada. El aparente aumento de la
actividad específica con una cantidad creciente de cadenas de PEG de
5 kDa o 30 kDa (hasta casi 4 cadenas por subunidad) puede reflejar
la insolubilidad o inestabilidad relativa de la enzima no modificada
en comparación con los conjugados. Tal y como se muestra en la
figura 2B, los conjugados de uricasa porcina con un promedio de más
de 3 cadenas de PEG 30 kDa por subunidad contienen una masa mayor de
PEG que la que Chen, et al., (1981) consideró suficiente para
descartar la inmunorreactividad.
La uricasa recombinante quimérica de
cerdo-babuino (PBC) cADN se subclonó en el vector de
expresión pET3d (Novagen, Madison, WI) y el constructo resultante de
plásmido se transformó y expresó en una copia de Escherichia
coli BL21(DE3)pLysS (Novagen). Estos
procedimientos se realizaron utilizando métodos muy conocidos en el
ámbito de la biología molecular. Véase Erlich (1989);
Sambrook, et al., (1989); Ausubel, F, et al., (Eds.),
(1997) Short Protocols in Molecular Biology. New York: John
Wiley & Sons.
La figura 6 muestra la secuencia deducida de
aminoácidos de uricasa PBC (aminoácidos 1-225 de SEQ
ID NO:1) y aminoácidos 226-304 de SEQ ID NO:2), en
comparación con las secuencias porcina (SEQ ID NO:1) y de babuino
(SEQ ID NO: 2). Los residuos en la secuencia que difieren de
aquellos en la secuencia porcina se destacan en negrita. Wu, et
al., (1989) determinaron por primera vez las secuencias porcina
y de babuino, algo que ha sido confirmado por los autores de la
presente invención. La SEQ ID NO. 1 es idéntica a la Adhesión n.º
p16164 de GenBank, salvo por la ausencia del residuo inicial de
metionilo en la secuencia. La SEQ ID NO. 2 es idéntica a la
Adhesión n.º p25689 de GenBank, salvo por la ausencia del residuo
inicial de metionilo y un cambio de treonina a histidina en el
residuo 153 en la secuencia GenBank (residuo 154 de la figura
6).
La forma tetramérica de la uricasa PBC se separó
y acopló a PEG de distintos pesos moleculares tal y como se señala
en los ejemplos 1 y 2. Los conjugados preparados con PEG de 5 kDa,
10 kDa o 30 kDa contenían hasta 10 cadenas de PEG por subunidad. Los
preparados con PEG de por lo menos 10 kDa retuvieron más del 95% de
la actividad específica inicial de la uricasa recombinante (figuras
3A-3B).
Las siguientes propiedades de un conjugado de
uricasa PBC tetramérica con aproximadamente 6 cadenas de PEG de 10
kDa por subunidad se indicaron en las figuras señaladas: la falta de
inmunogenia (figura 7) y la eficacia en los ratones carentes de
uricasa para 1) corregir hiperuricemia e hiperuricosuria (figuras
8); 2) reducir la gravedad de un defecto concentrante en la orina
(figura 9); y 3) disminuir la gravedad de la diabetes insípida
nefrogénica. Además, esta PEG-uricasa disminuye la
gravedad de los daños en el riñón ocasionados por el ácido úrico,
como se observó mediantel microscopio de resonancia magnética
(figura 11).
La figura 7 muestra la actividad de la uricasa
PBC en suero de ratón 24 horas después de cada una de las cuatro o
cinco inyecciones intraperitoneales de PEG-uricasa
en relación con el valor 24 horas después de la primera inyección.
Los conjugados PEG se elaboraron a partir de tres diferentes
preparaciones de uricasa PBC utilizando dos diferentes técnicas para
la activación de PEG. Se probó un preparado (\bullet) en ratones
carentes de uricasa (uox-/-); las otras dos (\Delta,
\sqbullet) se probaron en ratones normales BALB/C. El preparado
más inmunoreactivo (\Delta) se elaboró a partir de la uricasa PBC
purificada que contenía una cantidad desconocida de agregados de
uricasa acoplados a un promedio de 7 cadenas de PEG de 5 kDa por
subunidad, utilizando el derivado de carbonato de succinimidilo de
PEG (SC-PEG). Zalipsky, patente estadounidense
5,612,460, que se incorpora a la presente por referencia. El
preparado moderadamente inmunorreactivo (\blacksquare) se preparó
mediante el acoplamiento de un preparado de uricasa PBC que contenía
11% de agregados a un promedio de 2 cadenas de PEG de 19 kDa por
subunidad, utilizando un derivado de carbonato de
4-nitrofenilo de PEG (NPC-PEG).
Sherman, et al., (1997). El conjugado menos inmunorreactivo
(\bullet) se preparó mediante el acoplamiento de un promedio de 6
cadenas de NPC-PEG de 10 kDa por subunidad para un
preparado de uricasa PBC que contenía <5% de agregados de
uricasa.
La figura 8 muestra la relación inversa entre las
concentraciones de ácido úrico en el suero y orina, así como la
actividad de PEG-uricasa inyectada en el suero de un
ratón carente de uricasa (uox-/-). Las inyecciones en tiempo
cero y después de 72 horas contenían 0,43 IU de uricasa PBC
conjugada con un promedio de 6 cadenas de PEG de 10 kDa por
subunidad de enzima.
La figura 9 muestra que el tratamiento de ratones
carentes de uricasa con uricasa modificada-PEG PBC
disminuyó la gravedad de un defecto concentrante en la orina. El
promedio y la desviación estándar de los datos en relación con la
osmolalidad de orina se muestran en dos ratones que tenían una copia
del gen normal de uricasa murino (uox +/-), seis ratones no
tratados homocigotos carentes de uricasa (uox -/-) y seis
ratones homocigotos carentes de uricasa que recibieron 10
inyecciones entre el tercer y 72º día de vida con 95 o 190 mIU de
PEG-uricasa. Los ratones de cada uno de los grupos
genéticos recibieron agua ad libitum (barras sólidas)
o se les privó de agua por un periodo de 12 horas (barras
urdidas) antes de la recolección de su orina.
La figura 10 muestra que el tratamiento de los
ratones carentes de uricasa con uricasa
modificada-PEG PBC redujo la gravedad de diabetes
insípida nefrogénica, que se caracteriza por un consumo inusualmente
elevado de agua y salida de orina inusualmente elevada. Los
antecedentes genéticos de los ratones y el protocolo del tratamiento
fueron los mismos que en la figura 9. Se muestran el promedio y la
desviación estándar del consumo de agua diario (barras
sólidas) y la salida de orina (barras urdidas) para tres
grupos de seis ratones.
La figura 11 muestra que el tratamiento de
ratones carentes de uricasa con uricasa
modificada-PEG PBC disminuyó la gravedad de la
nefropatía inducida por el ácido úrico, como se apreció a través del
microscopio de resonancia magnética. Los antecedentes genéticos de
los tres grupos de ratones y el protocolo de tratamiento fueron los
mismos que se utilizaron en las figuras 9 y 10. El estudio con
microscopio de resonancia magnética se realizó en el Center for
in vivo Microscopy, Duke University Medical Center, Durham,
North Carolina.
Además de los resultados resumidos en la figuras
8-11, se demostró que los niveles de ácido úrico en
la orina de todos los ratones carentes de uricasa disminuyeron de
forma dramática después del tratamiento con uricasa
modificada-PEG PBC. Por último, la figura 12 muestra
que, a diferencia de la forma tetramérica
modificada-PEG de uricasa PBC, la forma octamérica
(peso molecular = 280 kDa), aún si es ampliamente PEGilada, es
inmunogénica en los ratones. Esta propiedad se refleja en la
eliminación acelerada del octámero modificado-PEG
durante un periodo de 5 días tras una sola inyección
intraperitoneal. Los mismos ratones recibieron otra inyección con la
misma dosis de las mismas preparaciones de
PEG-uricasa en los días 8 y 15. Veinte cuatro horas
después de la segunda y tercera inyección, la actividad uricolítica
no fue detectable en los sueros de ratones inyectados con el
octámero PEGilado, pero fue más fácil de detectar en los sueros de
los ratones inyectados con el tetrámero PEGilado. Estos hallazgos,
en combinación con la eliminación acelerada del octámero PEGilado
que se observó después de la primera inyección (figura 12), apoyan
la utilidad de eliminar todas las formas de uricasa mayores del
tetrámero antes de la PEGilación de la enzima.
\newpage
La uricasa derivada de Candida utilis se
obtuvo de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO; catálogo n.º
U1878) o Worthington Biochemical Corporation (Freehold, NJ; catálogo
n.º URYW). Procediendo según lo descrito en los ejemplos 1 y 2, la
forma tetramérica se aisló y los conjugados PEG se sintetizaron con
PEG 5 kDa, 10 kDa o 30 kDa (figuras 1A-1B). La
figura 1A muestra la retención de actividad gracias a la uricasa
PEGilada derivada de Candida utilis como una función del
número de cadenas de PEG acopladas por subunidad. Los datos de los
autores de la presente invención(\blacktriangle, \bullet,
\Box) se compararon con los de Nishimura, et al., (1979);
Nishimura, et al., (1981); Chen, et al., (1981);
Davis, et al., (1981); Tsuji, et al., (1985); Yasuda,
et al., (1990) y Fujita, et al., (1991). Los datos
illustrados por los círculos grandes denotan conjugados que
Nishimura, et al., (1979 o 1981) informaron como no
antigénicos o que Chen, et al., (1981) reportó como no
inmunoreactivos.
La figura 1B muestra la retención de la actividad
mediante la uricasa PEGilada derivada de Candida utilis como
una función de la masa total de PEG acoplada por subunidad. Los
datos de los autores de la presente invención (\blacktriangle,
\bullet, \Box) se comparan con los que aparecen en los informes
de la figura 1A. Los datos ilustrados por los círculos grandes
tienen el mismo significado que en la figura 1A.
Como aparece en la figura 1A y 1B, los conjugados
con un promedio de hasta 6 cadenas de PEG de 5 kDa o 30 kDa, o 9
cadenas de PEG de 10 kDa por subunidad retuvieron por lo menos el
75% de la actividad de la enzima no modificada. El aparente aumento
en la actividad específica cuando se incorpora un número creciente
de cadenas de PEG de 30 kDa se incorpora (hasta 5 o 6 cadenas por
subunidad) puede reflejar la relativa insolubilidad o inestabilidad
de la enzima no modificada en comparación con los conjugados.
La uricasa derivada de Aspergillus flavus
se obtuvo de Sanofi Winthrop (Gentilly Cédex, France). Procediendo
según lo descrito en el ejemplo 2, los conjugados con PEGs de varios
pesos moleculares fueron sintentizados (figuras
4A-4B). Los conjugados elaborados mediante el
acoplamiento de enzima derivada de A. flavus con un promedio
de hasta 12 cadenas de PEG de 5 kDa o hasta 7 cadenas de PEG de 30
kDa por subunidad retuvieron por lo menos el 75% de la actividad
específica inicial de la uricasa fúngica.
La uricasa recombinante derivada del nódulo de la
raíz de la soja (también conocido como nodulin 35) se preparó y
purificó según el procedimiento de Kahn y Tipton (Kahn, K, et
al., (1997) Biochemistry
36:4731-4738) y el Dr. Tipton (University of
Missouri, Columbia, MO) lo abasteció. Procediendo según lo descrito
en los ejemplos 1 y 2, la forma tetramérica se aisló y los
conjugados se prepararon con PEG de diversos pesos moleculares
(figuras 5A-5B). A diferencia de la uricasa derivada
de Candida utilis (figura 1A), la uricasa porcina (figura
2A), la uricasa quimérica de cerdo-babuino (figura
3A) y la uricasa derivada de Aspergillus flavus (figura 4A),
la enzima de soja toleró el acoplamiento de sólo aproximadamente 2
cadenas de PEG de 5 kDa o 30 kDa por subunidad con retención del
75%, como mínimo, de la actividad inicial uricolítica.
La uricasa derivada de Anthrobacter
globiformis se obtuvo de Sigma-Aldrich (catálogo
n.º U7128). Véase patente japonesa 9-154581.
Procediendo según lo descrito en los ejemplos 1 y 2, se aisló la
forma tetramérica y se prepararon los conjugados con PEG de 5 kDa y
30 kDa. Si bien los conjugados con un promedio de más de 3 cadenas
de PEG de 5 kDa por subunidad retuvieron menos del 60% de la
actividad específica inicial, los conjugados con un promedio de
aproximadamente 2 cadenas de PEG de 30 kDa por subunidad retuvieron
por lo menos el 85% de la actividad específica inicial.
Las uricasas porcinas y PBC recombinantes
derivadas de las cuales se eliminaron los primeros seis aminoácidos
en el terminal de amino se expresaron en E. Coli y se
purificaron en el mismo por medio de las técnicas estándar, según se
ha descrito en el ejemplo 3. Procediendo tal y como se describe en
los ejemplos 1 y 2, los conjugados PEG de uricasas truncadas en
amino se sintetizan para producir conjugados sustancialmente no
inmunogénicos que retengan por lo menos el 75% de la actividad
específica inicial.
Las uricasas porcina y PBC recombinante derivadas
de las cuales se eliminaron los últimos tres aminoácidos en el
terminal de carboxilo se expresaron en E. coli y purificaron
en el mismo por medio de las técnicas estándar, tal y como se ha
descrito en el ejemplo 3. La eliminación del terminal de carboxilo
puede aumentar la solubilidad de las enzimas no modificadas, ya que
elimina la señal del objetivo peroxisomal. Véase Miura, et
al., (1994). Procediendo tal y como se ha descrito en los
ejemplos 1 y 2, los conjugados PEG de uricasas truncadas en
carboxilos se sintetizan para producir conjugados sustancialmente no
inmunogénicos que retengan por lo menos el 75% de la actividad
específica inicial. En la figura 6 se describe la secuencia de
uricasa PBC recombinante truncada por seis residuos en el terminal
de amino y tres residuos en el terminal de carboxilo
(PBC-NT-CT). Esta uricasa fue
expresada, purificada y PEGilada como se describe en los ejemplos 1,
2 y 3 para producir conjugados sustancialmente no inmunogénicos que
retengan por lo menos el 75% de la actividad específica inicial.
Las uricasas porcinas recombinantes se prepararon
de acuerdo con el ejemplo 3, en las cuales el número potencial de
puntos de fijación de PEG se aumentó al reemplazar uno o más
residuos de arginina con lisina. Véase Hershfield, MS, et
al., (1991) Proc Natl Acad Sci USA
88:7185-7189. En la figura 6 se muestra la
secuencia de aminoácidos de un ejemplo de un mutante (uricasa PKS),
en el que la arginina en el residuo 291 se sustituye por lisina y la
treonina en el residuo 301, por serina. Procediendo tal y como se ha
descrito en los ejemplos 1 y 2, se conjuga el PEG con esta uricasa
para producir conjugados sustancialmente no inmunogénicos que
retengan por lo menos el 75% de la actividad específica inicial de
la uricasa recombinante.
Mediante el uso de métodos estándar de biología
molecular, como en el ejemplo 3, la uricasa de babuino recombinante
se construye teniendo una sustitución de aminoácido (histidina por
tirosina) en la posición 97 (véase secuencia de babuino en la
figura 6). Procediendo tal y como se ha descrito en los ejemplos 1 y
2, los conjugados PEG de forma tetramérica del mutante de uricasa de
babuino recombinante se sintetizan para producir conjugados de
inmunogenia sustancialmente reducida que retienen por lo menos el
75% de la actividad específica inicial de la uricasa
recombinante.
Las uricasas de Candida utilis, Aspergillus
flavus y Arthrobacter globiformis se obtuvieron como se
describió en los ejemplos 4, 5 y 7, respectivamente. Procediendo tal
y como se ha descrito en los ejemplos 1 y 2, los conjugados PEG se
sintetizan con PEG de 5 kDa, 10 kDa, 20 kDa o 30 kDa. La inmunogenia
de estos conjugados se reduce significativamente o se elimina.
<110> WILLIAMS, L. DAVID
\hskip1cmHERSHFIELD, MICHAEL S.
\hskip1cmKELLY, SUSAN J.
\hskip1cmSAIFER, MARK G. P.
\hskip1cmSHERMAN, MERRY R.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> CONJUGADOS DE
PEG-OXIDASA DE URATO Y SU USO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> MVIEW.001VPC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 09/130,392
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1998 08-06
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Version 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 304
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus scrofa
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 304
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<212> PRT
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<213> Papio hamadryas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (40)
1. Un conjugado de uricasa, que mantiene por lo
menos aproximadamente el 75% de la actividad uricolítica de la
uricasa no conjugada y es sustancialmente no inmunogénico, y que
comprende una uricasa purificada que comprende subunidades en las
cuales cada subunidad de dicha uricasa está enlazada covalentemente
con, por término medio, entre 2 y 10 cadenas de PEG, en las que cada
molécula de PEG tiene un peso molecular de entre 10 kDa y 100
kDa.
2. El conjugado según la reivindicación 1, en el
que la uricasa es uricasa de origen mamífero.
3. El conjugado según la reivindicación 2, en el
que la uricasa es uricasa de hígado porcino, bovino u ovino.
4. El conjugado según la reivindicación 1, en el
que la uricasa es recombinante.
5. El conjugado según la reivindicación 4, en el
que la uricasa tiene sustancialmente la secuencia de la uricasa del
hígado porcino, bovino, ovino o de babuino.
6. El conjugado según la reivindicación 4, en el
que la uricasa es quimérica.
7. El conjugado según la reivindicación 6, en el
que la uricasa quimérica contiene fracciones de uricasa de hígado
porcino y de babuino.
8. El conjugado según la reivindicación 7, en el
que la uricasa quimérica es uricasa PBC.
9. El conjugado según la reivindicación 7, en el
que la uricasa quimérica es uricasa PKS.
10. El conjugado según la reivindicación 4, en el
que la uricasa tiene sustancialmente la secuencia de la uricasa del
hígado de babuino en la cual la tirosina 97 se ha sustituido por
histidina.
11. El conjugado según la reivindicación 4, en el
que la uricasa comprende un terminal amino y un terminal carboxilo,
y en el que la uricasa está truncada en uno o en ambos
terminales.
12. El conjugado según la reivindicación 1, en el
que la uricasa es una uricasa fúngica o microbiana.
13. El conjugado según la reivindicación 12, en
el que la uricasa fúngica o microbiana se aísla del Aspergillus
flavus, el Arthrobacter globiformis o el Candida
utilis, o es una enzima recombinante que tiene sustancialmente
la secuencia de una de dichas uricasas.
14. El conjugado según la reivindicación 1, en el
que la uricasa es una uricasa de invertebrado.
15. El conjugado según la reivindicación 14, en
el que la uricasa de invertebrado se aísla del Drosophila
melanogaster o del Drosophila pseudoobscura, o es una
enzima recombinante que tiene sustancialmente la secuencia de una de
dichas uricasas.
16. El conjugado según la reivindicación 1, en el
que la uricasa es una uricasa vegetal.
17. El conjugado según la reivindicación 16, en
el que la uricasa vegetal se aísla de nódulos radicales de
Glycine max o es una enzima recombinante que tiene
sustancialmente la secuencia de dicha uricasa.
18. El conjugado según la reivindicación 1, en el
que el PEG tiene un peso molecular promedio de entre 10 kDa y 60
kDa.
19. El conjugado según la reivindicación 18, en
el que el PEG tiene un peso molecular promedio de entre 20 kDa y 40
kDa.
20. El conjugado según la reivindicación 1, en el
que el número medio de cadenas acopladas covalentemente de PEG es de
3 a 8 cadenas por subunidad de uricasa.
21. El conjugado según la reivindicación 20, en
el que el número medio de cadenas acopladas covalentemente de PEG es
de 4 a 6 cadenas por subunidad de uricasa.
22. El conjugado según la reivindicación 1, en el
que la uricasa es tetramérica.
23. El conjugado según la reivindicación 1, en el
que las cadenas de PEG están acopladas covalentemente a la uricasa a
través de enlaces seleccionados de entre el grupo que consta de
enlaces de uretano, enlaces secundarios de amina y enlaces de
amida.
24. El conjugado según la reivindicación 1, en el
que el PEG es lineal.
25. El conjugado según la reivindicación 1, en el
que el PEG es ramificado.
26. Una composición farmacéutica para reducir los
niveles de ácido úrico en un fluido o tejido corporal, que comprende
el conjugado de la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
27. La composición farmacéutica según la
reivindicación 26, en la que dicha composición está estabilizada por
liofilización y se disuelve inmediatamente después de la
reconstitución para proporcionar disoluciones adecuadas para
administrarse por vía parenteral.
28. Uso de una cantidad eficaz de uricasa PEG,
reductora del ácido úrico, para la fabricación de un medicamento
para reducir niveles elevados de ácido úrico en un fluido o tejido
corporal de un mamífero, comprendiendo dicha uricasa PEG una uricasa
purificada que comprende por lo menos dos subunidades en las cuales
cada subunidad está enlazada covalentemente con, por término medio,
entre 2 y 10 cadenas de PEG, en las que cada molécula de PEG tiene
un peso molecular de ente 10 kDa y 100 kDa.
29. El uso según la reivindicación 28, en el que
dicho mamífero es un ser humano.
30. El uso según la reivindicación 28, en el que
dichos niveles elevados de ácido úrico se asocian a una condición
seleccionada de entre el grupo que consta de gota, tofos,
insuficiencia renal, transplante de un órgano y enfermedad
maligna.
31. El uso según la reivindicación 28, en el que
el PEG es lineal.
32. El uso según la reivindicación 28, en el que
el PEG es ramificado.
33. Un método para realizar un conjugado de
uricasa, que comprende las siguientes fases:
- aplicación de una disolución de uricasa que comprende uricasa tretramérica y agregados de uricasa en por lo menos una columna de separación a un pH de entre aproximadamente 9 y 10,5;
- recuperación desde dicha columna de una o más fracciones que contienen uricasa tetramérica aislada, en la que dicha una o mas fracciones están sustancialmente exentas de agregados de uricasa tetramérica; y
- PEGilado de dicha uricasa tetramérica para obtener el conjugado de la reivindicación 1.
34. El método según la reivindicación 33, en el
que dicha disolución de dicha uricasa se aplica a dicha columna con
un pH de 10,2.
35. El método según la reivindicación 33, en el
que dicha separación se basa en una propiedad seleccionada del grupo
que consta del intercambio iónico y de la exclusión por tamaño.
36. El método según la reivindicación 33, que
además comprende la fase de analizar dichas fracciones a fin de
determinar por lo menos una propiedad seleccionada del grupo que
consta de la presencia de dicha uricasa tetramérica y la ausencia de
agregados de uricasa tetramérica.
37. El método según la reivindicación 36, en el
que dicha fase de análisis comprende por lo menos un análisis
seleccionado de entre el grupo que consta de cromatografía,
centrifugación, dispersión de la luz y electroforesis.
38. El método según la reivindicación 37, en el
que dicha cromatografía es una cromatografía líquida de alta
resolución.
39. El método según la reivindicación 33, en el
que dicha uricasa tetramérica aislada contiene menos que
aproximadamente el 10% de agregados de uricasa.
40. Una uricasa tetramérica aislada producida
según el método de la reivindicación 33.
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2018
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