CN101875922B - 一种重组苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶及其聚乙二醇修饰与应用 - Google Patents
一种重组苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶及其聚乙二醇修饰与应用 Download PDFInfo
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Abstract
一种重组苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶及其聚乙二醇修饰与应用；具体涉此尿酸酶的氨基酸序列，其编码序列可用大肠杆菌进行重组表达；该酶蛋白用聚乙二醇修饰后保留大部分活性；该尿酸酶及其聚乙二醇修饰产物都可分解尿酸。
Description
发明的技术领域
本发明涉及苛求芽孢杆菌胞内和胞外两种可溶天然单纯蛋白质同四聚体尿酸酶，及这两种天然尿酸酶的突变体和它们的聚乙二醇单甲醚修饰产物，这些尿酸酶和其聚乙二醇单甲醚修饰产物可用于临床检验测定血清尿酸和降低哺乳动物体内的血浆尿酸水平。
发明的技术背景
尿酸酶可特异性氧化尿酸，并生成尿囊素和过氧化氢。人体缺乏尿酸酶，尿酸是体内嘌呤碱代谢终产物，主要经肾脏排泄。血浆中尿酸浓度过高称为高尿酸血症。尿酸在血浆中的溶解度低，浓度过高会在血管壁沉积，诱发组织器官损伤和引起痛风等疾病，严重时造成肾衰，危及生命。故血清尿酸水平是诊断痛风和肾脏功能的常规指标，而尿酸酶是实验诊断领域测定血清尿酸含量的关键工具酶。尿酸的前体黄嘌呤是尿酸酶的强效竞争性抑制剂，而血浆高尿酸通常伴随血浆高黄嘌呤。因此，需要抗黄嘌呤且催化效率高的尿酸酶。
在白血病、淋巴瘤等血液肿瘤化疗时肿瘤细胞大量死亡裂解，胞内核酸大量降解造成血浆尿酸急剧升高，形成以高尿酸血症为代表的肿瘤溶解综合症(tumor lysis syndrome，TLS)，容易造成患者肾衰而死亡。所以，在肿瘤化疗过程中，需快预防和速降低血浆尿酸应对TLS。另外，降尿酸也是治疗痛风的关键策略；别嘌呤醇等药物都有明显肝肾毒性易引起过敏反应，在初始尿酸浓度很高时无效且对某些难治性痛风无效。尿囊素的优良水溶性和肾脏对尿囊素的高效排泄使尿酸酶成为治疗高尿酸血症相关疾病的候选药物。临床研究表明尿酸酶可快速高效降低血清尿酸，且几乎没有毒副作用；在应对肿瘤裂解综合症时尿酸酶比别嘌呤醇更安全有效；尿酸酶可用于治疗痛风，给予一次尿酸酶后严重痛风患者血浆尿酸水平可长时间维持正常。因此，抗黄嘌呤、催化效力高的尿酸酶也是治疗高尿酸血症相关疾病的理想药物。
已报道苛求芽孢杆菌可产生胞内和分泌到胞外的两种尿酸酶，但至今未明确此两种尿酸酶的编码基因和对应的氨基酸序列。实验数据已证实苛求芽孢杆菌胞外尿酸酶和胞内尿酸的催化能力都很高，且抗黄嘌呤，在治疗高尿酸血症和血清尿酸测定两方面都可有重要应用。苛求芽孢杆菌的天然胞内和胞外尿酸酶都可直接用于尿酸含量测定。外源尿酸酶用于治疗高尿酸血症相关疾病时都需将其注射到血液中才能发挥作用。异源蛋白在人体内半衰期短且易诱发机体免疫反应。用聚乙二醇单甲醚修饰蛋白是延长其体内半衰期、降低其免疫原性的有效方法。常用的聚乙二醇单甲醚修饰试剂与蛋白质表面氨基或巯基反应。对来自苛求芽孢杆菌的胞内和胞外尿酸酶及其突变体也可用活化聚乙二醇单甲醚修饰其表面的氨基或巯基，从而延长其体内半衰期并降低此外源蛋白的免疫原性，保障用药的安全性。
所以，本发明涉及来自苛求芽孢杆菌的两种天然尿酸酶及其对应突变体和聚乙二醇单甲醚修饰产物，及它们在血清尿酸测定和应对哺乳动物高尿酸血症相关疾病等方面的应用。
发明概述
本发明提供来自苛求芽孢杆菌两种可溶性尿酸酶的氨基酸序列和编码它们的cDNA序列及对两种酶蛋白和其突变体，及这些尿酸酶用聚乙二醇单甲醚进行修饰的方式和这些对应尿酸酶的应用。同时，本发明还提供进行重组表达获得所需要尿酸酶和其突变体的途径，及对此苛求芽孢杆菌尿酸酶表面的氨基用聚乙二醇单甲醚修饰或将特定位点的中性氨基酸残基突变成半胱氨酸后对其巯基进行选择性修饰的方式。
本发明所述来自苛求芽孢杆菌的两种天然尿酸酶都可直接用于临床检验测定血清尿酸含量；重组表达的此类尿酸酶和其突变体在其N端或C端带有连续的六个组氨酸残基可作为标签用于亲和纯化；来自苛求芽孢杆菌的两种天然尿酸酶和这些尿酸酶的突变体重组表达产物都可用于动力学方法或者终点平衡法测定血清尿酸。
用N-羟基琥珀酰亚胺酯活化的分子量在2000Dalton及以上的聚乙二醇单甲醚可在碱性条件下修饰本发明所述的天然尿酸酶或重组表达突变体酶蛋白表面的氨基；如是带有特定位置发生定点突变所生成的半胱氨酸残基的重组表达突变体尿酸酶，就可用聚乙二醇单甲醚的碘乙酸酯或溴乙酸酯修饰这些巯基从而实现位点特异性修饰。用上述聚乙二醇单甲醚修饰后的这些尿酸酶及其突变体都可用于治疗和预防哺乳动物，尤其是灵长类动物高尿酸血症相关的疾病，包括肿瘤溶解综合症和痛风等；在应用中单次给药后体内尿酸在较长时间内可维持在正常水平，从而有效缓解和预防高尿酸血症相关的疾病。
应用实施例
实施例1：血清尿酸测定
本实施例说明此尿酸酶在直接动力学方法测定血清尿酸中的应用。尿酸酶活性用75μM尿酸在25℃的硼酸钠缓冲液(pH 9.2)中测定，每分钟氧化一微摩尔尿酸的酶量为一个单位。
(1).反应体系含15μl血清，5μl重组表达的胞内尿酸酶(＞6U/mg，如未声明则其浓度大于6.0U/ml，在反应体系的终浓度大于0.0025U/ml)和pH9.2的硼酸钠缓冲液共1.20ml。
(2).测定加入尿酸酶启动反应前体系在293nm的吸收，校正加入酶液的体积效应(0.3％)和酶制剂吸收(低于0.004)得酶作用前吸收(A0)。
(3).将加入酶后的混合物在石英比色杯内混匀，在加酶30秒后以10到30秒间隔监测293nm吸收在5min内的变化(最大吸收低于1.270)，代表性反应曲线如图1。
(4).尿酸消光系数固定为11.5(mmol·L-1·cm)-1，米氏常数(Km)固定为0.22mmol/L(如用来自苛求芽孢杆菌尿酸酶的突变体则需要实验测定其米氏常数)，用以反应时间为自变量的积分速度方程拟合反应曲线(见附图1)预测本底(Ab)。A0和Ab之差，即ΔA，代表反应体系中尿酸的吸收(详细数据处理方法见中国发明专利专利ZL03135649.4)。
实施例2：重组表达苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶的聚乙二醇单甲醚5000修饰
用分子量为5000的聚乙二醇单甲醚修饰苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶重组表达产物是其用于哺乳动物体内降低血浆尿酸水平的前提，修饰其氨基的代表性操作过程如下：
(1).在25℃的0.1M硼酸钠缓冲液中(pH 9.2)用75.0μM尿酸测定尿酸酶活性。
(2).将序列5对应苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶重组表达，Ni-NTA柱亲和层析纯化到10.0U/mg以上，冻干浓缩到6.0mg/ml后对含有0.1M硼酸钠的缓冲液透析12小时，每4小时更换一次透析外液，直到用2，4，6-三硝基苯磺酸或荧光胺测定无明显的小分子氨基化合物为止。
(2).用分子量为5000的聚乙二醇单甲醚和丁二酸酐生成其羧基衍生物，纯化后与N-羟基琥珀酰亚胺用二环己基碳二亚胺脱水生成对应的N-羟基琥珀酰亚胺酯，纯化产物。
(3).测定透析后无氨基化合物的重组胞内尿酸酶的蛋白浓度，按编码序列对应分子量计算其所含氨基数量，按照摩尔当量比值递增方式逐步增加N-羟基琥珀酰亚胺酯活化的聚乙二醇单甲醚5000量，然后在pH9.0的硼酸钠缓冲液中混匀，室温反应3小时后取样测定剩余的尿酸酶活性；反应体系活化聚乙二醇单甲醚5000量对修饰后剩余酶活性的影响如图2。
(4).将聚乙二醇单甲醚修饰的此重组表达胞内尿酸酶对生理盐水多次换液透析后备用。
实施例3：离体人血浆中聚乙二醇单甲醚修饰重组苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶的降尿酸作用
用离体血浆中的降尿酸活性表征聚乙二醇单甲醚修饰的重组苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶的降尿酸活性比用氧嗪酸抑制内源性尿酸酶的动物灌胃给尿酸后测定的降尿酸活性更可靠，因为消除了所用氧嗪酸对药用聚乙二醇单甲醚修饰尿酸酶抑制作用的干扰。
(1).通过跟踪293nm吸收变化检测反应进程，在25℃硼酸钠缓冲液(pH 9.2)测定其氧化75μM尿酸的初速度表示活性，每分钟氧化一微摩尔尿酸的酶活性为一个单位。
(2).将聚乙二醇单甲醚修饰重组苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶对生理盐水换液透析，用0.22μm的微孔滤膜除菌后备用。
(3).来自血液中心的健康个体血浆，加入固体尿酸粉末到终浓度高于0.40mM以上，加入体积比例小于2％而终浓度为16U/L的聚乙二醇单甲醚修饰重组苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶，在指定时间取样0.20ml，迅速加入20μl浓度为55％的高氯酸混匀终止尿酸酶作用。
(4).在上述终止反应的样品中加入在25℃饱和的碳酸钾溶液20μl使得体系的pH高于7.0，剧烈震荡混匀后2000g离心10分钟后取上清液为待测样品，按照应用实施例1中所述测定残余尿酸的含量；所得血浆尿酸水平随着时间变化的代表性结果如图3。
(5).在血浆中加入0.30mM黄嘌呤考察其对降尿酸效力表明此尿酸酶明确抗黄嘌呤。
实施例4：聚乙二醇单甲醚修饰的重组苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶在大鼠体内的变化。
未经过聚乙二醇单甲醚修饰的重组苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶在哺乳动物体内2小时内活性降低到10％以下；而经过聚乙二醇单甲醚修饰的重组苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶在哺乳动物体内血浆中活性衰减速度明显减慢。
(1).在25℃硼酸钠缓冲液(pH 9.2)测定其氧化75μM尿酸的初速度表示活性，每分钟氧化一微摩尔尿酸的酶活性为一个单位。
(2).将聚乙二醇单甲醚修饰重组苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶对生理盐水换液透析，用0.22μm的微孔滤膜除菌后备用。
(3).将成年的健康大鼠乙醚麻醉，尾静脉注射灭菌的聚乙二醇单甲醚修饰重组苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶0.60U总量(0.25ml)。
(4).在注射尿酸酶之前、之后指定时间眼球取血，肝素钠抗凝制备血浆，测定血浆中的尿酸酶活性变化，代表性的结果如图4。
图1.重组苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶测定血清尿酸含量的反应进程。
图2.重组苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶用N-羟基琥珀酰亚胺酯活化聚乙二醇单甲醚5000修饰后的剩余活性随所用活化聚乙二醇单甲醚对氨基当量比值的变化。
图3.离体人血浆中尿酸在聚乙二醇单甲醚5000修饰重组苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶作用下的衰减曲线。
图4.重组苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶经聚乙二醇单甲醚5000修饰后在大鼠体内活性衰减过程。
氨基酸和编码区DNA序列表
<110>重庆医科大学
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ggcttctcag tacaccaaga agatcttgca agagaaaaag catcagctaa ctcggagtat 960
gttgcactaa agcttgcggc cgcactcgag caccaccacc accaccactg a 1011
Claims (4)
1.一种重组苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶，其氨基酸序列如Seq ID NO：1所示。
2.一种用聚乙二醇单甲醚5000修饰的重组苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶，其氨基酸序列如SeqID NO：1所示。
3.如权利要求1或2所述的重组苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶在体外分解尿酸中的应用。
4.如权利要求1或2所述的重组苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶在制备分解尿酸的药物中的应用。
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