CN111909906B - 聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶。该尿酸氧化酶中的下列氨酸位点的至少11个具有PEG修饰，T1、K3、K4、K30、K35、K76、K79、K97、K112、K116、K120、K152、K179、K222、K231、K266、K272、K285、K291、K293。相比于已上市类似药，本申请实施例的聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶中的上述氨基酸位点的至少11个位点具有PEG修饰，可以在最大限度保证酶活力的前提下，大大提高尿酸氧化酶的体内稳定性、降低免疫原性，并且肌肉注射后的体内药效可达到已上市药静脉注射后相当的体内药效。

Description

聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶，更具体地，本发明涉及聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶、药物组合、聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶的制药用途以及降低尿酸氧化酶免疫原性的方法。
背景技术
痛风是一种由嘌呤代谢紊乱所引起的疾病，其临床特点为高尿酸血症，并因尿酸盐沉积在皮下、关节、肾脏而形成痛风石。人体内的嘌呤经过一系列变化，最终形成的产物为尿酸，而血液尿酸浓度超过70mg/L时，便可引起高尿酸血症。其中，5％～12％的高尿酸患者可发展为痛风。在血液或滑囊液中，当尿酸钠浓度达到饱和状态，即可形成尿酸钠盐的微晶体，导致痛风性关节炎。随着时间的增长，慢性高尿酸血症也能在关节周围、软组织中以及在某些器官里沉积产生破坏性的结晶尿酸沉积物，即可导致痛风性急性关节炎、痛风石性慢性关节炎和关节畸形等疾病。而肾脏损害被认为是痛风的第二常见临床表现。由慢性高尿酸血症渐进性，导致髓质、肾小管及肾间质内尿酸盐沉积，刺激局部，引起炎症反应，称为慢性尿酸盐肾病；严重的高尿酸血症病人(如某些恶性肿瘤，特别是白血病和淋巴瘤患者)，在短期内可有大量尿酸沉积于肾脏集合管、肾盂、肾盏及输尿管，造成管腔阻塞、尿闭而引起急性肾功能衰竭(又称尿酸肾病)。
近几十年来，随着人们生活质量的提高以及饮食和生活习惯的改变，高蛋白和高嘌呤食物摄取增加，痛风患者的数量呈逐年增加的趋势。在欧洲，痛风患者的数量在过去的20 年中增长了约一倍。我国目前的高尿酸血症及痛风发病率提升至约2～3％。如果高尿酸血症没有出现临床症状，控制饮食即可；当出现了由其引起的临床症状时，则需要进行药物治疗。目前临床使用的常规治疗手段包括：镇痛消炎类药物，如秋水仙碱(colchicine)、布洛芬(buprofen)、萘普生(naproxen)等，它们主要用于控制痛风性关节炎的急性发作症状，消除关节局部疼痛、肿胀及炎症；促进尿酸排泄的促尿酸尿剂(如果肾功能降低则无效)，如羧苯磺胺(probenicid)、苯磺唑酮(sulfinpyrazone)、苯溴马龙(benzbromarone)等；抑制尿酸合成药物，如别嘌呤醇(allopurinol)。在患有痛风石性痛风、肾功能不全、白血病和某些遗传病的病人方面，别嘌呤醇是主要的治疗药物，它能抑制黄嘌呤氧化酶，使次黄嘌呤及黄嘌呤不能转换为尿酸，其本身则在人体内逐渐氧化，生成易溶于水的异黄嘌呤(oxipurinol) 经尿排出。然而，所有的常规疗法很难治愈已形成痛风石的慢性痛风的患者。此外，在长期服用上述药物以后，患者不可避免出现：白细胞减少、心脏功能受损、肝肾功能受损、刺激肠胃系统、再生障碍性贫血导致糖尿、痛风等并发症。
人高尿酸血症与人在进化过程中尿酸酶基因突变失活有关，突变在人尿酸酶基因编码序列中引入了提前终止密码子(Wu X，Lee C C，Muzny D M，Caskey C T.Proc NatlAcad SciUSA.1989.86：9412-9416.)，人类因此不能自身合成活性尿酸酶，使得人的嘌呤分解代谢终止于尿酸(Wu X，Muzny D M，Lee C C，Caskey C T.J Mol Evol.1992.34：78-84.)。在非人类灵长目动物和其他哺乳动物的肝过氧化物酶体中的活性尿酸酶可将溶解性较低的尿酸盐(～11mg/100ml水)转变为更易溶的尿囊素(～147mg/100ml水)，并能由肾更有效的排泄(Wortmann R L，Kelley W N.Kelley’s textbook of rheumatology(6th).2001：1339-1376)。在欧美，由黄曲霉(Aspergillus flavus)制备的尿酸酶(Uricozyme)在治疗与肿瘤化疗有关的严重高尿酸血症方面的时间已达10年以上(Zittoun R，Dauchy F，Teilaud C，Barthelemy M， Bouchard P.Ann Med Interne.1978.127：479-482.)。由法国Sanofi公司研制的由啤酒酵母发酵生产的重组黄曲霉尿酸酶药物ELITEK已于2002年通过FDA认证并用于由肿瘤化疗引起的严重高尿酸血症的短期治疗(Pui C H，Relling M V，Lascombes F，HarrisonP L，Struxiano A et al.Leukemia.1997.11：1813-1816.)，同时，证明ELITEK的输注还可以减小痛风石的体积(Potaux L，Aparicio M，Maurel C，Ruedas ME，Mart in C L.Nouv PresseMed.1975.4： 1109-1112.)。2010年9月FDA批准上市的由美国Savient公司生产的PEG修饰重组猪源尿酸酶(Pegloticase)，用于治疗顽固性痛风，但由于其没有解决免疫原性的问题，导致在临床应用中有约50％病人无效。
尿酸酶(E C 1.7.3.3)广泛存在于微生物(苛求芽孢杆菌、单假丝酵母、黄曲霉)、植物(大豆、鹰嘴豆)、动物(猪、牛、狗、狒狒)中(Suzuki K，Sakasegawa S，Misaki H，SugiyamaM.J Biosci Bioeng.2004.98：153-158)，在氧气存在的情况下，它能催化尿酸氧化尿囊素并放出二氧化碳(Retailleau P，Colloc’h，Denis V，Francoise B.Acta CrystD.2004.60：453-462.)。
具有活性的尿酸酶是一四聚体蛋白，由相同的亚基组成，每个亚基分子量在34kD左右，由301-304个氨基酸组成。每个溶液中尿酸酶的酶活力最高的pH值为8.0(Bayol Aetal.Biophys Chem.1995.54：229-235.)。在目前所知的所有来源的尿酸酶中，活性最高的来源于黄曲霉，达到27IU/mg；其次是来源于苛求芽胞杆菌，它的活性保持在13IU/mg(HuangS H，Wu T K.Eur J Biochem.2004.271：517-523.)。另外，来源于豆类植物的尿酸酶，其活性只有2～6IU/mg；来源于哺乳动物的尿酸酶，经过重组表达以后，猪的尿酸酶活性可以达到5IU/mg，狒狒的尿酸酶酶活性只有1IU/mg(Michael H，SusanJ.K.2006.US7056713B1)，而人源尿酸酶无活性。
作为人体应用，微生物尿酸酶的高活性和哺乳动物尿酸酶的低免疫原性，使得这两大来源的尿酸酶成了目前开发应用的重组尿酸酶的研究热点。但黄曲霉来源的尿酸酶与推测出的人源尿酸酶的同源性不足40％(Lee C C，Wu X，Gibbs R A，Cook R G，Muzny D M，CaskeyC T.Science.1988.239：1288-1291.)，人体易产生抗尿酸酶抗体，黄曲霉尿酸酶的功效迅速减弱，同时引发严重过敏性反应，无法用于长期治疗。
因此，基于尿酸氧化酶的治疗高尿酸血症的技术仍需要进一步开发和改进。
发明内容
本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
活性尿酸氧化酶是同源四聚体蛋白，其中三分之一的氨基酸为强疏水性氨基酸，四聚体蛋白间容易聚集形成八聚体及更大的聚合体。分子量超过100kDa的分子即可有效诱导机体产生免疫反应，而未修饰聚体尿酸氧化酶蛋白的分子量已经达到140kDa，更大分子量的多聚体尿酸酶将具有更高的免疫原性。人体易产生抗尿酸酶抗体，使其功效迅速减弱，同时引发严重过敏性反应，无法用于长期治疗。用PEG对蛋白进行共价修饰，已证明可降低蛋白免疫原性、增加蛋白溶解度并延长蛋白的半衰期。
杜克大学(Duke University)和山景公司(Savient)进行了猪来源和狒狒来源嵌合尿酸酶研究(Michael H，Susan J.K.2006.US7056713B1)。该研究的方法是在保证酶活性不明显减少的情况下，通过分子量为10KDa含甲氧基的聚乙二醇(10KDa-mPEG-NPC)对类猪源尿酸酶赖氨酸残基的ε-氨基进行修饰(所获得的修饰产品为Pegloticase)，初步实现了在人体中用于治疗顽固性痛风的目标。发明人发现，上述研究成果并不能彻底解决药物引起的免疫原性问题，临床受试者多次注射后出现了尿酸酶疗效消失的现象，发明人推测这可能与 Pegloticase蛋白分子量过大有关(采用10kd的PEG，导致Pegloticase分子量为540kDa)，同时由于pegloticase不适于注射，适于静脉推注，降低了受试者长期使用的依从性，进而严重限制了其临床应用。到目前为止，还没有免疫原性更低的以及可以采用皮下注射的长效尿酸氧化酶药物。
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶。根据本发明的实施例，所述尿酸氧化酶中的下列氨基酸位点的至少11个具有PEG修饰，T1、K3、K4、 K30、K35、K76、K79、K97、K112、K116、K120、K152、K179、K222、K231、K266、K272、K285、K291、K293。需要说明的是，本申请所述的“尿酸氧化酶”应作广义理解，它是指在实际生产实践中，在同一批次中所产出的尿酸氧化酶的混合物的总称。发明人发现，相比于已上市类似药，本申请实施例的聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶中的上述氨基酸位点的至少11个位点具有PEG修饰，可以在最大限度保证酶活力的前提下，大大提高尿酸氧化酶的体内稳定性、降低免疫原性，并且肌肉注射后的体内药效可达到已上市类似药静脉注射后相当的体内药效。
根据本发明的实施例，上述尿酸氧化酶还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，下列4个Lys氨酸位点的至少之一、两个、三个或全部具有PEG 修饰。
K30、K35、K222和K231。
根据本发明的实施例，所述PEG修饰用聚乙二醇的分子量不超过6KD。发明人发现，采用分子量不超过6KD聚乙二醇进行修饰，所获得的尿酸氧化酶在体内的长效性进一步增强，且不会因分子量过大产生严重抗PEG抗体，即免疫原性进一步降低。
根据本发明的实施例，所述聚乙二醇具有单甲氧基或羟基。
根据本发明的实施例，所述聚乙二醇为直链或支链结构。
根据本发明的实施例，所述聚乙二醇与尿酸氧化酶通过酰胺键偶联。
根据本发明的实施例，所述聚乙二醇为修饰性聚乙二醇，所述修饰性聚乙二醇的修饰基团包括选自下列的至少之一：N羟基琥珀酰亚胺、N羟基琥珀酰亚胺碳酸酯、N羟基琥珀酰亚胺乙酸酯、N羟基琥珀酰亚胺丙酸酯、N羟基琥珀酰亚胺丁酸酯、N羟基琥珀酰亚胺琥珀酸酯和对硝基苯碳酸酯。
根据本发明的实施例，所述修饰性聚乙二醇的修饰基团为N羟基琥珀酰亚胺丙酸酯。
根据本发明的实施例，所述氨基酸位点定位是以SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列定位的。
TYKKNDEVEFVRTGYGKDMIKVLHIQRDGKYHSIKEVATTVQLTLSSKKDYLHGDN SDVIPTDTIKNTVNVLAKFKGIKSIETFAVTICEHFLSSFKHVIRAQVYVEEVPWKRFEKNGVKHVHAFIYTPTGTHFCEVEQIRNGPPVIHSGIKDLKVLKTTQSGFEGFIKDQFTTLPEVK DRCFATQVYCKWRYHQGRDVDFEATWDTVRSIVLQKFAGPYDKGEYSPSVQKTLYDIQV LTLGQVPEIEDMEISLPNIHYLNIDMSKMGLINKEEVLLPLDNPYGKITGTVKRKLSSRL(SEQ ID NO:1)。
根据本发明的实施例，所述尿酸氧化酶具有SEQ ID NO:1～7所示的氨基酸序列或与 SEQ ID NO:1～7相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的多肽；或与SEQ ID NO:1～7相比具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失和/或添加的多肽。
MAHYRNDYKKNDEVEFVRTGYGKDMIKVLHIQRDGKYHSIKEVATSVQLTLSSKKD YLHGDNSDVIPTDTIKNTVNVLAKFKGIKSIETFAVTICEHFLSSFKHVIRAQVYVEEVPWKRFEKNGVKHVHAFIYTPTGTHFCEVEQIRNGPPVIHSGIKDLKVLKTTQSGFEGFIKDQF TTLPEVKDRCFATQVYCKWRYHQGRDVDFEATWDTVRSIVLQKFAGPYDKGEYSPSVQKTLYDIQVLTLGQVPEIEDMEISLPNIHYLNIDMSKMGLINKEEVLLPLDNPYGRITGTVK RKLTSRL(SEQ ID NO:2)。
MYKNDEVEFVRTGYGKDMVKVLHIQRDGKYHSIKEVATSVQLTLSSKKDYVYGDN SDIIPTDTIKNTVHVLAKFKGIKSIETFAMNICEHFLSSFNHVIRAQVYVEEVPWKRFEKNGVKHVHAFIHNPTGTHFCEVEQMRSGPPVIHSGIKDLKVLKTTQSGFEGFIKDQFTTLPEVK DRCFATKVYCKWRYHQGRDVDFEATWDTVRDIVLEKFAGPYDKGEYSPSVQKTLYDIQ VHSLSRVPEMEDMEISLPNIHYFNIDMSKMGLINKEEVLLPLDNPYGKITGTVKRKLSSRL(SEQ ID NO:3)。
MAHYHNDYKKNDEVEFVRTGYGKDMVKVLHIQRDGKYHSIKEVATSVQLTLSSKK DYVYGDNSDIIPTDTIKNTVHVLAKFKGIKSIETFAMNICEHFLSSFNHVIRAQVYVEEVP WKRFEKNGVKHVHAFIHNPTGTHFCEVEQMRSGPPVIHSGIKDLKVLKTTQSGFEGFIKDQFTTLPEVKDRCFATKVYCKWRYHQGRDVDFEATWDTVRDIVLEKFAGPYDKGEYSPSV QKTLYDIQVHSLSRVPEMEDMEISLPNIHYFNIDMSKMGLINKEEVLLPLDNPYGRITGTAKRKLASKL(SEQ ID NO:4)。
MAHYHNDYQKNDEVEFVRTGYGKDMVKVLHIQRDGKYHSIKEVATSVQLTLNSRR EYLHGDNSDIIPTDTIKNTVQVLAKFKGIKSIETFAMNICEHFLSSFNHVIRVQVYVEEVPWKRFEKNGVKHVHAFIHTPTGTHFCEVEQLRSGPPVIHSGIKDLKVLKTTQSGFEGFLKDQ FTTLPEVKDRCFATQVYCKWRYHQGRDVDFEATWEAVRGIVLKKFAGPYDKGEYSPSVQKTLYDIQVLSLSQLPEIEDMEISLPNIHYFNIDMSKMGLINKEEVLLPLDNPYGRITGTVKR KLTSRL(SEQ ID NO:5)。
MAHYHNDYKKNDEVEFVRTGYGKDMVKVLHIQRDGKYHSIKEVATSVQLTLSSKK DYLHGDNSDIIPTDTIKNTVHALAKFKGIKSIEAFAVNICQHFLSSFNHVIRTQVYVEEIPWKRLEKNGVKHVHAFIHTPTGTHFCEVEQLRSGPPVIHSGIKDLKVLKTTQSGFEGFIKDQF TTLPEVKDRCFAAQVYCKWRYHQCRDVDFEATWDTIRDVVLEKFAGPYDKGEYSPSVQKTLYDIQVVSLSQVPEIDDMEISLPNIHYFNIDMSKMGLINKEEVLLPLDNPYGKITGTVK RKLSSRL(SEQ ID NO:6)。
MADYHNNYKKNDELEFVRTGYGKDMVKVLHIQRDGKYHSIKEVATSVQLTLSSKK DYLHGDNSDIIPTDTIKNTVHVLAKFKGIKSIEAFGVNICEYFLSSFNHVIRAQVYVEEIPWKRLEKNGVKHVHAFIHTPTGTHFCEVEQLRSGPPVIHSGIKDLKVLKTTQSGFEGFIKDQF TTLPEVKDRCFATQVYCKWRYHQCRDVDFEATWGTIRDLVLEKFAGPYDKGEYSPSVQKTLYDIQVLSLSRVPEIEDMEISLPNIHYFNIDMSKMGLINKEEVLLPLDNPYGKITGTVKRK LSSRL(SEQ ID NO:7)。
其中，SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列是猪来源和狒狒来源嵌合尿酸酶(猪-狒狒)的氨基酸序列；SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列是猪源尿酸氧化酶的氨基酸序列；SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列是犬来源和狒狒来源(犬狒狒)嵌合尿酸氧化酶的氨基酸序列；SEQID NO:4所示的氨基酸序列是犬源尿酸氧化酶的氨基酸序列；SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列是牛源尿酸氧化酶的氨基酸序列；SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列是猴子的尿酸氧化酶氨基酸序列；SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列是狒狒的尿酸氧化酶氨基酸序列。
需要说明的是，本申请的赖氨酸的定位是依据SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列进行的，如K4是指基于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列，位于第4位的赖氨酸。具有SEQ ID NO:1～7 所示氨基酸序列的尿酸酶或与SEQ ID NO:1～7相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的多肽；或与SEQ ID NO:1～7相比具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失和/或添加的多肽在结构上具有同源性，本领域技术人员可经过序列比对，确定SEQ ID NO:2～7或与SEQ ID NO:1～7相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的多肽或与SEQ ID NO:1～7 相比具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失和/或添加的多肽上对应于T1、K3、K4、K30、K35、K76、K79、K97、K112、K116、K120、K152、K179、K222、K231、K266、K272、K285、K291、 K293位点的对应位点，进而在上述多肽所比对上的对应位点发生PEG修饰，实现本申请的聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶的低免疫原性、高体内稳定性、适于肌肉注射的优势。序列比对方法为本领域技术人员的一般方法，用来对序列来源不同的同工酶进行序列同一性比对，不同序列间可能因突变、缺失等造成序列长度存在差异，但本领域技术人员可通过序列比对的方式确定不同序列之间的同一性。
例如，根据本发明的实施例，SEQ ID NO:2所示序列与SEQ ID NO:1所示序列的T1、K3、K4、K30、K35、K76、K79、K97、K112、K116、K120、K152、K179、K222、K231、K266、K272、 K285、K291、K293位点的对应的位点包括M1、K9、K10、K36、K41、K82、K85、K103、K118、 K122、K126、K158、K185、K228、K237、K272、K278、K297、K299；SEQ ID NO:3所示序列与SEQ ID NO:1所示序列相应位点的对应位点包括M1、K3、K29、K34、K75、K78、K111、K115、K119、 K151、K178、K221、K230、K265、K271、K284、K290、K292；SEQ ID NO:4所示序列与SEQ ID NO:1 所示序列相应位点的对应位点包括M1、K9、K10、K36、K41、K82、K85、K118、K122、K126、 K158、K185、K228、K237、K272、K278、K297、K299；SEQ ID NO:5所示序列与SEQ ID NO:1 所示序列相应位点的对应位点包括M1、K10、K36、K41、K82、K85、K118、K122、K126、K158、 K185、K228、K237、K272、K278、K297、K299；SEQ ID NO:6所示序列与SEQ ID NO:1所示序列相应位点的对应位点包括M1、K9、K10、K36、K41、K82、K85、K118、K122、K126、K158、 K185、K228、K237、K272、K278、K291、K297、K299；SEQID NO:7所示序列与SEQ ID NO:1 所示序列相应位点的对应位点包括M1、K9、K10、K36、K41、K82、K85、K118、K122、K126、 K158、K185、K228、K237、K272、K278、K291、K297、K299。发明人通过实验发现，上述SEQ ID NO:2～7所示氨基酸序列的相应位点的至少11个位点发生PEG修饰后，所获得PEG修饰的尿酸氧化酶具有低免疫原性、高体内稳定性、适于肌肉注射的优势。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶。根据本发明的实施例，所述聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶的肽图与未被聚乙二醇修饰的所述尿酸氧化酶的肽图相比，具有至少11个预定肽段的峰面积减少的相对比例不低于75％，优选不低于80％，更优选不低于90％。根据本发明的实施例的聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶具有低免疫原性、高体内稳定性、适于肌肉注射的优势。
根据本发明的实施例，上述聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶的肽图具有表5所示的峰面积降低肽段。
根据本发明的实施例，所述聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶的肽图如图6或图7所示。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种药物组合。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括前面所述的尿酸氧化酶。根据本发明实施例的药物组合物具有低免疫原性、高体内稳定性、适于肌肉注射的优势，可用于高尿酸相关性疾病的治疗或预防。
根据本发明的实施例，所述药物组合物进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述药物组合物进一步包括其它治疗或预防高尿酸相关性疾病的药物。
在本发明的第四方面，本发明提出了前面所述的尿酸氧化酶或前面所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗高尿酸相关性疾病，降低有需要受试者的生物流体中尿酸水平。根据本发明实施例的尿酸氧化酶具有免疫原性低、体内稳定性高以及适于肌肉注射的优势，在高尿酸相关性疾病的治疗上具有显著优势。
根据本发明的实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述高尿酸相关性疾病包括选自慢性高尿酸血症、痛风、肾脏疾病、高尿酸性关节炎、肾结石、痛风结节、高血压、糖尿病、高甘油三酯血症、代谢综合征、冠心病、动脉粥样硬化、癌症化疗引起的高尿酸血症。
根据本发明的实施例，所述生物流体为尿液或者血液。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种降低尿酸氧化酶免疫原性的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括使得所述尿酸氧化酶中的下列氨基酸位点的至少11个发生PEG 修饰，T1、K3、K4、K30、K35、K76、K79、K97、K112、K116、K120、K152、K179、K222、K231、 K266、K272、K285、K291、K293。根据本发明实施例的方法，可有效降低尿酸氧化酶的免疫原性，进而所得到的尿酸氧化酶的体内安全性更高，作用更加长效。
根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，使得所述尿酸氧化酶中的下列4个Lys氨酸位点的至少之一、至少两个、至少三个或四个发生PEG修饰。
K30、K35、K222、K231。
根据本发明的实施例，所述PEG修饰用聚乙二醇的分子量不超过6KD。
根据本发明的实施例，所述聚乙二醇为修饰性聚乙二醇。
根据本发明的实施例，所述修饰性聚乙二醇的修饰基团为N羟基琥珀酰亚胺。
根据本发明的实施例，所述氨基酸位点定位是以SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列定位的。
根据本发明的实施例，所述尿酸氧化酶具有SEQ ID NO:1～7所示的氨基酸序列或与 SEQ ID NO:1～7相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的多肽；或与SEQ ID NO:1～7相比具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失和/或添加的多肽。
可以理解的是，前面所述的聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶的附加技术特征所具有的技术效果适用于根据本发明实施例的上述降低尿酸氧化酶免疫原性的方法的附加技术特征，根据本发明实施例的上述降低尿酸氧化酶免疫原性的方法的附加技术特征在此不再赘述。
附图说明
图1是根据本发明实施例的PHC理化对照品-SEC-HPLC-UV检测图；
图2是根据本发明实施例的PHC理化对照品-SEC-HPLC-RI检测图；
图3是根据本发明实施例的PEG参照品-SEC-HPLC-RI检测图；
图4是根据本发明实施例的PU5修饰产物-SEC-HPLC-UV检测图；
图5是根据本发明实施例的PU5修饰产物-SEC-HPLC-RI检测图；
图6是根据本发明实施例的PHC和PU5分别采用Lys-c和胰蛋白酶双酶切比对图；
图7是根据本发明实施例的PU5 Lys-C酶切图；
图8是根据本发明实施例的模型大鼠肌肉给药不同给药剂量后血清尿酸水平；
图9是根据本发明实施例的肾损伤坏死及炎症评分图；
图10是根据本发明实施例的SD大鼠单次静脉注射相同剂量(1.0mg/kg)Pegloticase 和聚乙二醇化尿酸酶注射液后各组平均血药浓度-时间曲线图；
图11是根据本发明实施例的SD大鼠单次肌肉注射Pegloticase和不同剂量聚乙二醇化尿酸酶注射液后各组平均血药浓度-时间曲线图；
图12是根据本发明实施例的SD大鼠单次肌肉注射不同剂量聚乙二醇化尿酸酶注射液后各组平均血药浓度-时间曲线图；
图13是根据本发明实施例的SD大鼠单次肌肉/静脉注射不同剂量Pegloticase和聚乙二醇化尿酸酶注射液后各组不同时间血尿酸平均值-时间曲线图；
图14是根据本发明实施例的SD大鼠首次(Day1)静脉注射相同剂量(1.0mg/kg)Pegloticase和聚乙二醇化尿酸酶注射液后雄性与雌性平均血药浓度-时间曲线图；
图15是根据本发明实施例的SD大鼠末次(Day22)静脉注射相同剂量(1.0mg/kg)Pegloticase和聚乙二醇化尿酸酶注射液后雄性与雌性平均血药浓度-时间曲线图；
图16是根据本发明实施例的SD大鼠首次(Day1)肌肉注射相同剂量(1.0mg/kg)Pegloticase和聚乙二醇化尿酸酶注射液后雄性与雌性平均血药浓度-时间曲线图；
图17是根据本发明实施例的SD大鼠末次(Day22)肌肉注射相同剂量(1.0mg/kg)Pegloticase和聚乙二醇化尿酸酶注射液后雄性与雌性平均血药浓度-时间曲线图；
图18是根据本发明实施例的SD大鼠多次静脉注射Pegloticase和聚乙二醇化尿酸酶注射液后不同时间血尿酸平均值-时间曲线图；以及
图19是根据本发明实施例的SD大鼠多次肌肉注射Pegloticase和聚乙二醇化尿酸酶注射液后不同时间血尿酸平均值-时间曲线图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明的目的是提供一种新型的聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶。
本发明的另一目是提供一种有效降低尿酸氧化酶免疫原性的方法，该技术可有效降低尿酸氧化酶的免疫原性，提高尿酸氧化酶的体内安全性和稳定性。
本发明的另一目的是提供上述获得的聚乙二醇氧化尿酸酶偶联物的应用，该偶联物可以实现体内长效且显著降低血液尿酸水平的功效，可用于高尿酸血症及通风的治疗。
在本发明的一方面提供了一种聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶。
如本文所用，术语“尿酸氧化酶”、“尿酸酶”可互换使用，都指本发明所述的一种可以将尿酸催化氧化生产尿囊素和过氧化氢的一类酶。术语“尿酸氧化酶类似物”、“尿酸酶类似物”、“尿酸酶衍生物”可互换，均指在保留尿酸氧化酶特异性催化尿酸转化为尿囊素和过氧化氢的活性基础上，可对尿酸氧化酶的蛋白结构序列进行部分氨基酸的取代、缺失或添加等结构改造，进而实现本实例的包括但不限于降低免疫原性、增加蛋白的稳定性、有利于进一步聚乙二醇修饰等。
尿酸氧化酶没有特别的限制，可以是任何来源的尿酸氧化酶及其尿酸氧化酶类似物，代表的例子包括但并不限于哺乳动物来源、微生物、植物等。
在另一优选例中，所述的尿酸氧化酶及其尿酸氧化酶类似物为哺乳动物来源。优选SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，更优选SEQID NO:1。
本发明所述的不同种属来源尿酸氧化酶，可通过多种途径获得，包括但不限于天然提取、化学合成、基因工程重组表达等。
在另一优选例中，尿酸氧化酶通过重组技术，将尿酸氧化酶蛋白序列(SEQ ID NO:1) 的编码序列在宿主细胞进行重组表达。
在另一优选例中，以大肠杆菌或酵母作为宿主，构建重组表达菌株的方法制备而得，更优选大肠杆菌作为宿主菌进行重组表达。
如本文所用，本发明所述聚乙二醇尿酸氧化酶是指通过聚乙二醇共价修饰尿酸氧化酶获得。所述聚乙二醇(PEG)，指环氧乙烷缩聚物和水的混合物，由通式H(OCH2CH2)nOH 表示，这是一种pH中性，无毒、水溶性较高的亲水聚合物，呈线性或支化状结构。由于 PEG无毒以及良好的生物相容性，目前FDA已经批准了多种PEG修饰重组蛋白药物上市，证明PEG可以用来降低蛋白的免疫原性，增加蛋白的溶解性以及延长蛋白的半衰期。PEG 要和蛋白结合需要对PEG的一端或多端进行活化，可根据所修饰的目标蛋白上如氨基、巯基、羧基或羟基等选择相应的修饰基团进行活化。
在另一优选例中，本发明用于氧化尿酸酶及尿酸酶类似物进行PEG修饰的位点为赖氨酸残基的ε氨基，但也有少量的N末端赖氨酸残基的α氨基的修饰。尿酸氧化酶通过氨脂键、仲氨键或酰胺键与PEG的修饰基团进行共价连接，优选聚乙二醇分子与尿酸氧化酶偶联形成为酰胺键，其聚乙二醇的修饰基团包括但不限于N羟基琥珀酰亚胺类，包括但不限于N羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N羟基琥珀酰亚胺碳酸酯(SC)、N羟基琥珀酰亚胺乙酸酯 (SCM)、N羟基琥珀酰亚胺丙酸酯(SPA)、N羟基琥珀酰亚胺丁酸酯(SBA)、N羟基琥珀酰亚胺琥珀酸酯(SS)等，其中聚乙二醇的封闭基团包括但不限于单甲氧基、乙氧基、葡萄糖或半乳糖糖，优选单甲氧基。
在另一优选例中，聚乙二醇可以是直链或支链。
在另一优选例中，聚乙二醇尿酸氧化酶所采用的聚乙二醇相对分子量为不超过6KD，优选1KD～5KD，更优选2KD、5KD，最优选5KD。需要说明的是，本申请所述的“聚乙二醇相对分子量”是指不带有修饰基团的聚乙二醇相对分子量，具有本领域的一般意义，PEG 经活化基团活化后总相对分子量略大于5KD，如在5KD+10％的范围内。
在另一优选例中，所述的聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶具有如下特征：
(1)尿酸氧化酶中的下列氨基酸位点的至少11个具有PEG修饰，
T1、K3、K4、K30、K35、K76、K79、K97、K112、K116、K120、K152、K179、K222、K231、 K266、K272、K285、K291、K293。
(2)一个尿酸氧化酶单体分子平均偶联11～13个聚乙二醇分子。
(3)包含位于Seq ID NO:1尿酸氧化酶序列中K30和/或K35，以及K222和/或K231发生聚乙二醇偶联修饰。
(4)聚乙二醇尿酸氧化酶具有更低的体内免疫原性。
在本发明的另一方面，提供了一种有效降低尿酸氧化酶免疫原性的方法，该技术可有效降低尿酸氧化酶的免疫原性和提高尿酸氧化酶的体内稳定性。
如本文所用，聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶其特征在于：尿酸氧化酶没有特别的限制，可以是任何来源的尿酸氧化酶及其尿酸氧化酶类似物，代表的例子包括但并不限于哺乳动物来源、微生物、植物等。
在另一优选例中，所述的尿酸氧化酶及其尿酸氧化酶类似物为哺乳动物来源。优选SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4的氨基酸序列，更优选SEQ IDNO:1。
本发明所述的不同种属来源尿酸氧化酶，可通过多种途径获得，包括但不限于天然提取、化学合成、基因工程重组表达等。
在另一优选例中，以大肠杆菌或酵母作为宿主，构建重组表达菌株的方法制备而得，更优选大肠杆菌作为宿主菌进行重组表达。
本发明所述的尿酸氧化酶在大肠杆菌中重组表达可获得大量的尿酸氧化酶，表达的尿酸氧化酶可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如有需要，可利用本领域技术人所熟知的方法获得高纯度的尿酸氧化酶。这些方法的例子包括但不限于：离心、破菌、盐析、超滤、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析和其它各种技术相结合。
上述获得的尿酸氧化酶可使用本领域已知的方法通过连接基团共价结合聚乙二醇。
在另一优选例中，聚乙二醇定向修饰尿酸氧化酶空间结构表面的赖氨酸残基。尿酸氧化酶通过酰胺键与PEG的修饰基团(亦可称为活性基团)进行共价连接，其聚乙二醇的修饰基团(亦可称为活性基团)包括但不限于N羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N羟基琥珀酰亚胺碳酸酯(SC)、N羟基琥珀酰亚胺乙酸酯(SCM)、N羟基琥珀酰亚胺丙酸酯(SPA)、N羟基琥珀酰亚胺丁酸酯(SBA)、N羟基琥珀酰亚胺琥珀酸酯(SS)，其中聚乙二醇的封闭基团包括但不限于单甲氧基、乙氧基、葡萄糖或半乳糖糖，优选单甲氧基。
在另一优选例中，聚乙二醇可以是直链或直链。
在另一优选例中，聚乙二醇相对分子量为不超过6KD，优选1KD～5KD，最优选5KD。
在另一优选例中，本发明提供了一种聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶的制备方法，具有以下一个或多个特征：
(1)、尿酸氧化酶与聚乙二醇的修饰投料摩尔比为1:50～1:150(尿酸氧化酶：聚乙二醇)，优选1:55～1:95的投料摩尔比修饰。
(2)、偶联反应体系为碳酸盐缓冲液，其修饰pH范围为9～11。
上述聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶的制备方法，采用多种纯化手段获得高纯度的聚乙二醇修饰尿酸氧化酶。
在另一优选例中，修饰样品的纯化采用包括但不限于分子筛层析、离子交换层析、疏水层析、切向流超滤、或组合。更优选分子筛层析、切向流超滤。
在本发明的另一方面，提供了一种上述聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶及其应用。该偶联物可以实现体内长效且显著降低血液尿酸水平的功效，可用于高尿酸血症及通风的治疗。
所述的聚乙二醇尿酸氧化酶更适用于作为一种治疗慢性高尿酸血症或通风的药物及其组合物。所述高尿酸血症及通风的主要症状包括但不限于尿酸性肾病和通风性关节炎。
所述的聚乙二醇尿酸氧化酶的给药途径包括但不局限于静脉注射、皮下注射、肌肉注射和腹腔注射等，优选静脉注射、肌肉注射，更优选肌肉注射。
所述的聚乙二醇尿酸氧化酶具有更低的体内免疫原性。
所述的聚乙二醇尿酸氧化酶具有低免疫原性是指在人或动物体内经肌肉注射聚乙二醇尿酸氧化酶后，机体不产生抗聚乙二醇分子的抗体或产生低滴度的抗聚乙二醇分子抗体。不产生针对尿酸氧化酶的抗体。
所述的聚乙二醇尿酸氧化酶经过经肌肉注射后体内具有更长的半衰期和降低体内尿酸水平的功效。
根据本发明的实施例，本发明的聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶能够在最大限度保证酶活力的前提下，大大提高尿酸氧化酶的体内稳定性、降低免疫原性，并且肌肉注射后的体内药效可达到已上市药静脉注射后相当的体内药效。因而，本发明的聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶以及包含该聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶的药物组合物可以在治疗或预防高尿酸相关性疾病时被给药。
在本文中所使用的术语“给药”指将预定量的物质通过某种适合的方式引入病人。本发明的聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶可以通过任何常见的途径被给药，只要它可以到达预期的组织。给药的各种方式是可以预期的，包括腹膜，静脉，肌肉，皮下，皮层，口服，局部，鼻腔，肺部和直肠，但是本发明不限于这些已举例的给药方式。此外，本发明的药物组合物可以使用将活性成分传送到靶细胞的特定器械来给药。
本发明的药物组合物的给药频率和剂量可以通过多个相关因素被确定，该因素包括要被治疗的疾病类型，给药途径，病人年龄，性别，体重和疾病的严重程度以及作为活性成分的药物类型。
术语“治疗有效量”是指化合物足以显著改善某些与疾病或病症相关的症状的量，也即为给定病症和给药方案提供治疗效果的量。例如，在慢性高尿酸血症或痛风治疗中，减少、预防、延缓、抑制或阻滞疾病或病症的任何症状的药物或化合物应当是治疗有效的。治疗有效量的药物或化合物不需要治愈疾病或病症，但将为疾病或病症提供治疗，使得个体的疾病或病症的发作被延缓、阻止或预防，或者疾病或病症的症状得以缓解，或者疾病或病症的期限被改变，或者例如疾病或病症变得不严重，或者加速康复。
术语“治疗”用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病(主要指高尿酸相关性疾病)的治疗，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶给予有需要的个体。
根据本发明的实施例，本发明的聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶或药物组合物可与常规治疗方法和/或疗法相结合使用，或者可与常规治疗方法和/或疗法分开使用。当本发明的聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶或药物组合物在采用与其它药物的联合疗法中给药时，它们可序贯地或同时地给予个体。或者，本发明的药物组合物可包含本发明的聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶、药学上可接受的载体或药学上可接受的赋形剂以及本领域已知的其它治疗药或预防药的组合。
术语“平均修饰度”是指每一个尿酸酶单体上结合的PEG个数。
在本文中，如无特别说明，表达方式“氨基酸位点具有PEG修饰”的含义是指在相应多肽的立体结构中，PEG分子覆盖该氨基酸位点，从而该氨基酸位点的至少一部分基团未被暴露。本领域技术人员能够理解的是，本领域技术人员可以通过常规的技术手段确定特定的氨基酸位点是否被PEG分子修饰，例如可以参考本申请实施例3“聚乙二醇修饰位点检测”部分中所列出的方法进行鉴定。简言之，该方法包括：1)将非聚乙二醇化和聚乙二醇化尿酸氧化酶采用一种或多种酶进行酶切，如可以采用Lys-C或Trypsin进行单酶切，也可以采用Lys-C和Trypsin进行双酶切；2)通过高效液相色谱方法分离酶切片段，产生非聚乙二醇化和聚乙二醇化尿酸氧化酶的色谱图，即肽图；3)比较非聚乙二醇化和聚乙二醇化尿酸氧化酶肽图的差异，结合预定内标肽段，确定聚乙二醇化尿酸氧化酶中特定的氨基酸位点所在肽段峰的减少或消失的相对比例，进而判定肽段上该特定的氨基酸位点是否被PEG修饰。具体地，在本申请实施例3中，特定的氨基酸位点所在肽段的峰面积的减少或消失的相对比例可通过如下公式计算获得：
P(％)＝(A2-A1)/A2×100％，
其中，A1＝A0×t
A0为待测修饰蛋白特定的氨基酸位点所在肽段的实测峰面积，t为内参肽段在PHC肽图与待测修饰蛋白肽图的峰面积比值平均值；
P(％)表示特定的氨基酸位点所在肽段的峰面积的减少或消失的相对比例，A2为特定的氨基酸位点所在肽段在PHC肽图中的肽段峰面积，A1为经内参换算后的特定的氨基酸位点所在肽段在待测修饰蛋白肽图中的峰面积。
应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中的具体描述的各种技术特征之间都可以相互组合，从而构成新的或优选的技术方案，参照以下实例能够对之有更清楚的理解。限于篇幅，所述实例仅为说明目的而并不旨在对本发明进行限制。
下面将进一步详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1重组尿酸氧化酶的制备
1.1用于尿酸酶表达的基因和表达质粒的构建
根据E.coli密码子使用偏好性数据，结合密码子偏爱性及GC含量等因素，设计尿酸酶蛋白(代号：PHC)(SEQ ID NO：1)的cDNA序列，进行全基因合成，并命名为pUC-57-PHC质粒。以Nde I和BamH I作为目的基因插入位点，采用pET-30a质粒作为表达载体 (pET-30a-PHC)。
1.2表达质粒向细菌宿主细胞中的转化
采用CaCl2法将表达载体pET-30a-PHC引导入到大肠杆菌BL21(DE3)中，Kanamycin进行抗性筛选，筛选出高表达克隆，并保存原始种子库菌种(E3B)，这些步骤按照分子生物学领域常用方法实施。
1.3重组尿酸氧化酶的制备
将转化的工程菌种采用发酵罐进行发酵表达，控制条件为先30℃、pH约7.2培养至OD600＝30以上，添加IPTG至0.5mmol/L，继续诱导3h以上，以让尿酸氧化酶积累。离心收集细胞，然后放置在-15℃以下保存。
取冻存菌体，悬浮于25mmol/L Tris，5mmol/L EDTA缓冲中，悬浮比例1:10(W/V)。采用高压破开细菌细胞后，离心收集尿酸氧化酶沉淀，沉淀用50mmol/L NaHCO3洗涤一次后，将富集的尿酸酶沉淀悬浮于100mmol/L Na2HCO3(pH9.7～10.3)缓冲液中，悬浮比例 1:50(W/V)，室温搅拌过夜溶解，随后离心收集上清。
尿酸氧化酶通过几个色谱步骤作进一步的纯化，SDS-PAGE检测纯度大于95％以上，用Superdex 200柱检测出纯度大于95％以上，无聚集体形式，采用Lowry法测定蛋白浓度，用分光光度计测定尿酸氧化酶活性，1单位(U)酶活定义为，在最适反应温度37℃、最适pH9.0缓冲液条件下，每分钟转化1μmol尿酸所需酶的量。
实施例2聚乙二醇化氧化尿酸酶的制备
将5KD分子量的N-琥珀酰亚胺丙酸酯PEG(5K-PEG-SPA)用2mmol/L HCl溶解成200mmol/L的PEG溶液，溶解后以1：55～1：95摩尔比(尿酸氧化酶：5K-PEG-SPA)，其中尿酸氧化酶按照单体形式计算与5K-PEG-SPA的摩尔比，即1：55～1：95的摩尔比是指单体形式的尿酸氧化酶与5K-PEG-SPA的摩尔比，加入溶有尿酸氧化酶的碳酸盐浓度为 0.1～0.3mol/LpH为10.0的碳酸盐缓冲液中，使得PEG与尿酸氧化酶发生偶联反应，偶联反应需在5～30℃的条件下搅拌反应60分钟以上，直到PEG偶联程度不再随时间而变化。反应结束后，通过超滤和/或色谱法将未修饰的PEG及副产物从反应中去除。可以选用合适的分子筛层析介质，进行修饰副产物的分离去除。最后无菌过滤即得5K修饰的聚乙二醇化尿酸氧化酶(代号为PU5)。
实施例3聚乙二醇化氧化尿酸酶的特性分析
3.1平均修饰度及酶活检测
采用Lowry法测定蛋白浓度，聚乙二醇尿酸氧化酶活性测定在分光光度计下进行。尿酸酶底物尿酸最大紫外吸收波长为293nm，而产物尿囊素的最大紫外吸收波长为224nm，在一定浓度范围内，尿酸在293nm的吸收值与其浓度成正比，可用分光光度计法进行尿酸的定量测定。具体过程如下：打开紫外可见分光光度计，将波长调至293nm，并打开该仪器水浴循环系统使温度保持为37℃。以四硼酸钠缓冲液作空白对照，校零点；取2.95ml 底物反应液(0.1mol/L四硼酸钠、100μmol/L尿酸，pH9.5，37℃预热)置石英比色杯中，然后加入50μl的供试品迅速混匀后于293nm处测定吸收值。连续测定293nm处吸收度变化；根据C＝A/εL(其中A为特定浓度尿酸在293nm处吸光值，ε为尿酸摩尔消光系数，L 为比色杯光程，C为尿酸摩尔浓度)计算尿酸降解浓度，并计算酶活；酶活定义：在最适反应温度37℃，最适反应pH9.5时，每分钟转化1μmol尿酸为尿囊素所需的酶量定义为一个活性单位(U)。
采用SEC-HPLC串联UV/RI(紫外和折光指数检测器联合)进行聚乙二醇尿酸氧化酶的平均修饰度检测。根据蛋白在紫外280nm处有最大吸收峰，而该波长下PEG没有吸收，同时示差折光检测器对蛋白和PEG在一定范围内吸收值与其各种浓度成正比。因此可通过 PEG参照品和PHC理化对照品外标方式得到聚乙二醇化尿酸氧化酶中PEG和蛋白部分各自的含量，进而可通过以下计算方式获得每一个尿酸氧化酶单体上PEG分子数，即平均修饰度。
PEG尿酸氧化酶平均修饰度＝(尿酸氧化酶亚基相对分子量×样品中PEG的量)/(PEG 相对分子量×样品中蛋白质的量)。
其中，PHC理化对照品、PEG参照品、PU5修饰产物SEC-HPLC-UV/RI检测图见图1 至图5。
实施例2不同投料比下，所获得的聚乙二醇氧化尿酸酶的酶活和平均修饰度如表1所示。
表1：不同投料比下的酶活
蛋白：5K-PEG投料摩尔比 酶活 酶活保留 平均修饰度
未修饰蛋白 11.4U/mg 100％ 0
1:55 11.7U/mg 102.6％ 11.3
1:68 12.1U/mg 106.1％ 11.7
1:82 11.9U/mg 104.4％ 12.1
1:95 12.3U/mg 107.9％ 12.2
备注：平均修饰度表示每一个尿酸氧化酶单体上结合的PEG分子数。
由表1可以看出，本申请的聚乙二醇尿酸氧化酶的平均修饰度稳定在11个以上，且酶活相比于未修饰的尿酸氧化酶，酶活保留率高，酶活性并没有降低，反而升高，且酶活相对稳定。这与已上市的药物Krystexx(pegloticase)完全不同，根据山景公司专利中所披露的内容(CN1264575C)和本领域技术人员的一般认识，随着5kD PEG修饰度的提高，酶活性显著下降。然而出乎意料的是，本申请获得的聚乙二醇尿酸酶在超过11的平均修饰度下，酶活性和未修饰时相比无明显变化。因此本申请的聚乙二醇尿酸氧化酶与已上市药相比，聚乙二醇平均修饰度更高，在酶活保留方面也取得了预料不到的技术效果。发明人推测可能是由于聚乙二醇尿酸氧化酶的PEG修饰度或修饰位点不同导致的。
发明人对SEQ ID NO：2-7的蛋白进行修饰也得到了类似的技术效果，即在5kd修饰度大于11的情况下，获得了酶活性基本不降低的PEG化的尿酸氧化酶。
3.2聚乙二醇修饰位点检测
在以下步骤中，发明人对实施例2所获得的尿酸氧化酶进行修饰位点的检测。
聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶的PEG修饰位点可通过对非聚乙二醇化和聚乙二醇化尿酸氧化酶采用一种或多种酶进行酶切，然后经过色谱检测，获得色谱图，即肽图确认。非聚乙二醇化和聚乙二醇化尿酸氧化酶可以采用单酶切(Lys-C或Trypsin)和或双酶切(Lys-C 和Trypsin联用)进行酶切。反相柱分离酶切片段，通过内参肽段校正比较肽段消失或降低比例判断聚乙二醇尿酸氧化酶的修饰位点。
胰蛋白酶和Lys-C双酶切质量肽图中修饰位点分析原理：Lys-C可对赖氨酸(K)C端进行特异性酶切，胰蛋白酶以碱性氨基酸-精氨酸(R)和赖氨酸(K)作为酶切位点，对其C端肽键进行特异性酶切。比较PHC和PU5中酶切前后对应各肽段变化情况，并结合内标肽段可分析确认PEG修饰肽段减小或消失的相对比例。通过肽段的减小或消失相对比例，可判定肽段上该赖氨酸位点是否被PEG修饰以及修饰的比例。需要指出的是，PEG修饰是一种非均一的修饰，某位点修饰比例高则可以认为该位点被修饰。
具体如下：
(1)样品处理：取尿酸氧化酶和聚乙二醇化尿酸氧化酶分别用酶切缓冲液(25mmol/L Tris-HCl，20％乙腈，pH9.0)溶解稀释为1mg/ml，各取100μl，加入2μl Lys-C，于37℃酶切4小时。即将该溶液转移至胰酶反应管中(1：100的比例)于37度继续酶切2小时，用4μl TCEP还原溶液继续反应30分钟，再加入10μl 1mol/L盐酸溶液终止反应。
(2)分析条件：
仪器：Thermo Ultimate 3000HPLC和MSQ Plus；
色谱柱：月旭Welch Materials(4.6mm×250mm，5μm)；
分析条件：A液(含0.1％TFA的水溶液)，B液(含0.1％TFA的乙腈溶液)；
梯度：0-70min，B从3-70％；
LC检测波长：214nm。
离子源：ESI；
离子类型：正离子；
锥孔电压：50V；
扫描范围：300-2000Da；
扫描时间：1S；
柱后分流约0.3ml/min。
样品量进样100μl，记录色谱图。
(3)结果处理：
比较尿酸氧化酶和聚乙二醇化尿酸氧化酶的色谱图(肽图)，计算差异肽段的面积减少的相对比例。
(4)实验结果见表2至表5，及图6～图7。
表2：PHC经Lys-C酶切肽段表
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表3：PHC经Lys-C和胰蛋白酶双酶切后的肽段表
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/>
PU5肽段峰面积的降低百分比计算方法：
利用以下公式可计算PU5与PHC相同浓度下对应的PU5肽段峰面积：
A1＝A0×t
其中A1为经内参两肽段换算后PU5肽段峰面积，A0为PU5肽图肽段实测峰面积，t 为T30、T31号内参肽段中PHC肽图与PU5肽图峰面积比值平均值，即0.588。
表4：PHC和PU5内参肽段比对
将内参换算后肽段峰面积与PHC肽图峰面积利用如下公式，即可计算出PU5肽图中某肽段峰面积减少的相对百分比例：
P(％)＝(A2-A1)/A2×100％
其中，A2为某肽段在PHC肽图中肽段峰面积，A1为经内参换算后该肽段在PU5肽段峰面积。
表5：PU5经双酶切后肽图中峰面积降低肽段总结结果
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根据本实施例的蛋白序列(SEQ ID NO:1)分析可知，尿酸氧化酶被修饰的潜在位点有 T1、K3、K4、K17、K21、K30、K35、K48、K49、K66、K74、K76、K79、K97、K112、K116、K120、 K152、K155、K158、K169、K179、K190、K215、K222、K231、K266、K272、K285、K291、K293等31 个位点。
通过对实施例2中所获得聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶修饰位点的分析可知，如表2、表3、表4、表5和图6分析所示，PU5酶切后肽段消失在90％以上的位点有K3、K4、K35、 K97、K112、K116、K120、K152、K222、K266、K285，PU5酶切后肽段消失在80％～90％范围内的位点有K76、K231，在PU5中，这些位点均被修饰。
同时发明人发现，本申请的聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶的修饰位点相比于已上市药物，修饰位点更多，具有显著差异，如通过对单酶切发现，本申请的聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶在K30、K35、K222和K231四个位点所在的肽段消失比例高于80％以上，而通过方法分析已上市类似药Krystexx(pegloticase)，在这四个位点所在的肽段几乎未消失，即上市类似药在K30、K35、K222和K231四个位点修饰率远低于本申请的聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶。另外，本申请的聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶，相比于已上市药物，免疫原性显著更低，发明人推测可能与修饰位点的多少和修饰位点的不同有关。由于修饰位点的不同以及修饰度的不同，导致酶在体内免疫原性位点的保护和酶活性中心的暴露均不同，上述不同可能造成了不同修饰酶在体内生物性质的不同。
下面将详细描述本申请的聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶(PU5)的药物动物体内评价，其中，实验中所用到的pegloticase是指已上市类似药，批号为5085B。
实施例4聚乙二醇尿酸氧化酶体内药效学研究
4.1、聚乙二醇尿酸氧化酶在模型大鼠体内药效评价
采用氧嗪酸钾饮水联合高尿酸饲料诱导大鼠慢性高尿酸血症模型，评价聚乙二醇尿酸氧化酶(PU5)对大鼠慢性高尿酸血症的治疗作用。
选取40只模型大鼠，随机分为4组，即模型组、聚乙二醇化尿酸酶低剂量给药组(0.3 mg/kg)、聚乙二醇化尿酸酶中剂量给药组(1.0mg/kg)、聚乙二醇化尿酸酶高剂量给药组(3.0 mg/kg)，每组10只，另选10只正常SD大鼠为空白对照组。试验连续造模5周，造模1周后开始肌肉给药，每周给药一次，连续给药4周，分别检测给药前及每次给药后7天的大鼠血清尿酸、血清尿素氮、血清肌酐水平，试验结束后观察大鼠肾脏组织学变化。
图8结果显示，在造模后第7、14、21、28和35天，与空白对照组相比，模型对照组血尿酸水平均显著增加，造模7天后模型组大鼠血清尿素氮、肌酐及尿酸分别为空白组大鼠的2.73倍、2.40倍和7.83倍。从肾脏病理来看(如图9所示)，模型对照组的肾小管扩张、坏死、炎症及纤维化评分均显著增加，同时尿酸盐结晶数量也显著增加。受试物聚乙二醇化尿酸酶中高剂量均显著降低血清尿酸水平，且呈剂量相关性，在14天～35天期间，中剂量组血尿酸水平均值维持在303.80-660.60μmol/L，高剂量组血尿酸水平均值维持在 153.70-403.40μmol/L，与模型组相比，中剂量组血尿酸降低的幅度为34.46-67.94％；高剂量组血尿酸降低的幅度为65.67-83.78％。与模型对照组相比，聚乙二醇化尿酸酶各给药组对肾小管扩张、肾脏坏死及炎症均有显著改善作用。
4.2、聚乙二醇尿酸氧化酶大鼠体内单次给药评价
取36只SD大鼠，雌雄各半随机分为6组(见表6)，即上市药Pegloticase静脉注射组、肌肉注射组，聚乙二醇尿酸氧化酶静脉注射组及聚乙二醇尿酸氧化酶低、中、高(0.5、1.0、 2.0mg/kg)剂量肌肉注射组，给药具体方案和剂量见表6。颈静脉取血检测PK和PD。
表6：动物分组及剂量设计
4.2.1、药代动力学对比
SD大鼠给药前所有个体的血清药物浓度水平均低于定量下限(LLOQ：312.500ng/mL)，单次肌肉注射0.5、1.0、2.0mg/kg，在0～168h(0～7天)范围内，聚乙二醇化尿酸酶注射液(PU5)后血清药物浓度具有剂量相关性，整体水平随给药剂量增加而增加，当超过168h后，pegloticase肌肉给药组的血药浓度低于定量下限，而PU5肌肉给药组可继续维持至240h 以上。
给药后，1.0mg/kg Pegloticase静脉注射和肌肉注射组，1.0mg/kg聚乙二醇化尿酸酶注射液静脉注射及0.5、1.0、2.0mg/kg聚乙二醇化尿酸酶注射液肌肉注射组各组雌性与雄性SD 大鼠体内Cmax(C5min)比值在0.75～0.99范围内，AUClast比值在0.54～0.94范围内，AUC0-∞比值在0.58～0.97范围内。由此可见，Pegloticase和聚乙二醇化尿酸酶(PU5)注射液在SD大鼠体内暴露水平无明显性别差异。
然而，SD大鼠给予相同剂量(1.0mg/kg)的上市药Pegloticase静脉给药组的AUClast为426.48±65.34，肌肉注射组的AUClast为264.19±78.22；PU5注射液静脉给药组的AUClast为565.61±161.60，肌肉注射组的AUClast为337.86±227.34。在相同剂量，相同给药方式条件下，PU5的AUClast高于上市药Pegloticase。
SD大鼠给予相同剂量(1.0mg/kg)的上市药Pegloticase静脉给药组t1/2(h)为49.51±8.12，肌肉给药组t1/2(h)为55.21±13.50。PU5注射液静脉给药组t1/2(h)为86.12±33.82，肌肉给药组 t1/2(h)为60.45±21.37。在相同剂量，相同给药方式条件下，PU5注射液的t1/2(h)长于上市药 Pegloticase。
上述药代动力学结果如表7～表12，图10～图12所示。
表7：SD大鼠单次静脉注射1.0mg/kg Pegloticase的个体血药浓度数据及统计分析数据(单位：μg/mL)
备注：“/”表示无相关信息。
表8：SD大鼠单次静脉注射1.0mg/kg聚乙二醇化尿酸酶注射液的个体血药浓度数据及统计分析数据(单位：μg/mL)
备注：“/”表示无相关信息。
表9：SD大鼠单次肌肉注射1.0mg/kg Pegloticase的个体血药浓度数据及统计分析数据(单位：μg/mL)
备注：“/”表示无相关信息。
表10：SD大鼠单次肌肉注射1.0mg/kg聚乙二醇化尿酸酶注射液的个体血药浓度数据及统计分析数据(单位：μg/mL)
备注：“/”表示无相关信息。
表11：SD大鼠单次静脉注射Pegloticase和聚乙二醇化尿酸酶注射液后平均药代动力学参数
表12：SD大鼠单次肌肉注射Peglocticase和聚乙二醇化尿酸酶注射液后平均药代动力学参数
4.2.2、体内药效对比(尿酸)
单次肌肉注射0.5、1.0、2.0mg/kg聚乙二醇化尿酸酶注射液后，给药后1天、3天尿酸浓度均维持在较低水平，给药后7天各剂量组尿酸水平开始恢复，而给药剂量越高，尿酸在体内维持低水平的时间越长。与相同剂量静脉注射组的相比，PU5静脉注射组血清尿酸维持低浓度水平的时间均较pegloticase静脉注射组长。与相同剂量肌肉注射组的相比，PU5肌肉注射组血清尿酸维持低浓度水平的时间均较pegloticase肌肉注射组长。与相同剂量组相比，PU5静脉注射或肌肉注射组血清尿酸维持低浓度水平的时间均较pegloticase静脉注射组或肌肉注射组长，即PU5在体内维持维持低浓度水平的时间均较pegloticase更长。结果如图 13所示。
4.3、聚乙二醇尿酸氧化酶大鼠体内多次给药评价
本试验设4个组，分别为上市药Pegloticase静脉注射组、肌肉注射组，聚乙二醇化尿酸酶注射液(PU5)静脉注射组、肌肉注射组，每组8只，雌雄各半，共32只SD大鼠。Pegloticase 及聚乙二醇化尿酸酶注射液静脉注射组采用静脉注射；Pegloticase和聚乙二醇化尿酸酶注射液肌肉注射组采用肌肉注射。给药剂量均为1.0mg/kg。每周给药1次，连续给药4次。
结果分析可知：
SD大鼠多次静脉/肌肉注射1.0mg/kg Pegloticase和聚乙二醇化尿酸酶注射液。大鼠一般状况未见与药物相关异常改变。
4.3.1抗PEG抗体检测
SD大鼠连续4次给药后，首次给药前，所有个体动物均未检出抗PEG抗体和抗PHC抗体；给药结束后，所有动物未检出抗PHC抗体，Pegloticase静脉、肌肉注射组，聚乙二醇化尿酸酶注射液静脉、肌肉注射组各组检出抗PEG抗体，阳性结果的比例分别为：3/8、 1/8、1/8、1/8。通过PEG免疫组织化学检查发现：pegloticase静脉注射组和肌肉注射组的脾脏、肝脏和肾脏可见PEG较弱阳性表达。聚乙二醇化尿酸酶注射液静脉注射组和肌肉注射组未见PEG阳性表达，结果见表13。
从以上分析可知，PU5和pegloticase产生的抗体主要是针对PEG部分的抗体，而非针对尿酸氧化酶部分的抗体，说明二者均能有效遮蔽尿酸氧化酶的免疫原性位点。PEG抗体的产生在体内会导致部分副作用的发生，根据表13的结果显示，本申请PU5免疫原性低于市售产品pgeloticase。
针对PEG抗体以及PEG免疫组化的结果可知，PU5和pegloticase均是肌肉给药组优于静脉给药组，其中静脉给药组产生的抗PEG抗体，PU5优于pegloticase；肌肉给药组产生的抗PEG抗体，PU5优于pegloticase。
表13：PEG免疫组织化学阳性表达结果
阳性分级：1＝较弱阳性，2＝弱阳性，3＝中度阳性，4＝强阳性。
4.3.2药代动力学检测
SD大鼠多次静脉、肌肉注射给予Pegloticase和聚乙二醇化尿酸酶注射液后，各组动物主要药代动力学参数无明显性别差异。连续4次给药后，两种药物在大鼠体内有轻微蓄积。
SD大鼠多次静脉/肌肉注射给予相同剂量(1.0mg/kg)的上市药Pegloticase,首次给药后，在大鼠体内的绝对生物利用度分别为51.35％；末次给药后，在大鼠体内的绝对生物利用度分别为45.98％。SD大鼠多次静脉/肌肉注射给予相同剂量(1.0mg/kg)的聚乙二醇化尿酸酶注射液，首次给药后，在大鼠体内的绝对生物利用度分别为58.29％；末次给药后，在大鼠体内的绝对生物利用度分别为52.60％。
4.3.3体内药效对比(尿酸)
SD大鼠连续4次(1次/周)静脉、肌肉注射1.0mg/kg Pegloticase和聚乙二醇化尿酸酶注射液，每次给药后血清尿酸浓度均维持在较低水平，末次给药后14天Pegloticase肌肉注射出现恢复，其余各组于末次给药后18天出现恢复。与相同剂量的上市药Pegloticase相比，两种药物静脉注射组的维持时间比较一致，而聚乙二醇化尿酸酶注射液肌肉注射组的维持时间较上市药长，即PU5在肌肉给药的疗效优于Pegloticase。
上述结果如表14～表17，图14～图19所示。
表14：SD大鼠连续静脉注射Pegloticase和聚乙二醇化尿酸酶注射液后平均药代动力学参数结果
/>
表15：SD大鼠连续肌肉注射Pegloticase和聚乙二醇化尿酸酶注射液后平均药代动力学参数结果
/>
表16：SD大鼠多次肌肉/静脉注射Pegloticase和聚乙二醇化尿酸酶注射液后各剂量组尿酸统计结果(Mean+SD)
/>
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州远大生物制药有限公司
重庆派金生物科技有限公司
<120> 聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶
<130> PIDC3196280
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 298
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 猪来源和狒狒来源嵌合尿酸酶（猪-狒狒）的氨基酸序列
<400> 1
Thr Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe Val Arg Thr Gly Tyr Gly
1 5 10 15
Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His Ile Gln Arg Asp Gly Lys Tyr His
20 25 30
Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Thr Val Gln Leu Thr Leu Ser Ser Lys
35 40 45
Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp Val Ile Pro Thr Asp Thr
50 55 60
Ile Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys Phe Lys Gly Ile Lys Ser
65 70 75 80
Ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu His Phe Leu Ser Ser Phe
85 90 95
Lys His Val Ile Arg Ala Gln Val Tyr Val Glu Glu Val Pro Trp Lys
100 105 110
Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val His Ala Phe Ile Tyr Thr
115 120 125
Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu Gln Ile Arg Asn Gly Pro
130 135 140
Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu Lys Val Leu Lys Thr Thr
145 150 155 160
Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp Gln Phe Thr Thr Leu Pro
165 170 175
Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gln Val Tyr Cys Lys Trp Arg
180 185 190
Tyr His Gln Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu Ala Thr Trp Asp Thr Val
195 200 205
Arg Ser Ile Val Leu Gln Lys Phe Ala Gly Pro Tyr Asp Lys Gly Glu
210 215 220
Tyr Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr Asp Ile Gln Val Leu Thr
225 230 235 240
Leu Gly Gln Val Pro Glu Ile Glu Asp Met Glu Ile Ser Leu Pro Asn
245 250 255
Ile His Tyr Leu Asn Ile Asp Met Ser Lys Met Gly Leu Ile Asn Lys
260 265 270
Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro Tyr Gly Lys Ile Thr Gly
275 280 285
Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu
290 295
<210> 2
<211> 304
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 猪源尿酸氧化酶的氨基酸序列
<400> 2
Met Ala His Tyr Arg Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe
1 5 10 15
Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His Ile Gln
20 25 30
Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gln
35 40 45
Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp
50 55 60
Val Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys
65 70 75 80
Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu
85 90 95
His Phe Leu Ser Ser Phe Lys His Val Ile Arg Ala Gln Val Tyr Val
100 105 110
Glu Glu Val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val
115 120 125
His Ala Phe Ile Tyr Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu
130 135 140
Gln Ile Arg Asn Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu
145 150 155 160
Lys Val Leu Lys Thr Thr Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp
165 170 175
Gln Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gln
180 185 190
Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gln Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu
195 200 205
Ala Thr Trp Asp Thr Val Arg Ser Ile Val Leu Gln Lys Phe Ala Gly
210 215 220
Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr
225 230 235 240
Asp Ile Gln Val Leu Thr Leu Gly Gln Val Pro Glu Ile Glu Asp Met
245 250 255
Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Leu Asn Ile Asp Met Ser Lys
260 265 270
Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro
275 280 285
Tyr Gly Arg Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Thr Ser Arg Leu
290 295 300
<210> 3
<211> 297
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 犬来源和狒狒来源（犬狒狒）嵌合尿酸氧化酶的氨基酸序列
<400> 3
Met Tyr Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys
1 5 10 15
Asp Met Val Lys Val Leu His Ile Gln Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser
20 25 30
Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gln Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys
35 40 45
Asp Tyr Val Tyr Gly Asp Asn Ser Asp Ile Ile Pro Thr Asp Thr Ile
50 55 60
Lys Asn Thr Val His Val Leu Ala Lys Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile
65 70 75 80
Glu Thr Phe Ala Met Asn Ile Cys Glu His Phe Leu Ser Ser Phe Asn
85 90 95
His Val Ile Arg Ala Gln Val Tyr Val Glu Glu Val Pro Trp Lys Arg
100 105 110
Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val His Ala Phe Ile His Asn Pro
115 120 125
Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu Gln Met Arg Ser Gly Pro Pro
130 135 140
Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu Lys Val Leu Lys Thr Thr Gln
145 150 155 160
Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp Gln Phe Thr Thr Leu Pro Glu
165 170 175
Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Lys Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr
180 185 190
His Gln Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu Ala Thr Trp Asp Thr Val Arg
195 200 205
Asp Ile Val Leu Glu Lys Phe Ala Gly Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr
210 215 220
Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr Asp Ile Gln Val His Ser Leu
225 230 235 240
Ser Arg Val Pro Glu Met Glu Asp Met Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile
245 250 255
His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu
260 265 270
Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr
275 280 285
Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu
290 295
<210> 4
<211> 304
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 犬源尿酸氧化酶的氨基酸序列
<400> 4
Met Ala His Tyr His Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe
1 5 10 15
Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Val Lys Val Leu His Ile Gln
20 25 30
Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gln
35 40 45
Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Val Tyr Gly Asp Asn Ser Asp
50 55 60
Ile Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val His Val Leu Ala Lys
65 70 75 80
Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Thr Phe Ala Met Asn Ile Cys Glu
85 90 95
His Phe Leu Ser Ser Phe Asn His Val Ile Arg Ala Gln Val Tyr Val
100 105 110
Glu Glu Val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val
115 120 125
His Ala Phe Ile His Asn Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu
130 135 140
Gln Met Arg Ser Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu
145 150 155 160
Lys Val Leu Lys Thr Thr Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp
165 170 175
Gln Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Lys
180 185 190
Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gln Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu
195 200 205
Ala Thr Trp Asp Thr Val Arg Asp Ile Val Leu Glu Lys Phe Ala Gly
210 215 220
Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr
225 230 235 240
Asp Ile Gln Val His Ser Leu Ser Arg Val Pro Glu Met Glu Asp Met
245 250 255
Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys
260 265 270
Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro
275 280 285
Tyr Gly Arg Ile Thr Gly Thr Ala Lys Arg Lys Leu Ala Ser Lys Leu
290 295 300
<210> 5
<211> 304
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 牛源尿酸氧化酶的氨基酸序列
<400> 5
Met Ala His Tyr His Asn Asp Tyr Gln Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe
1 5 10 15
Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Val Lys Val Leu His Ile Gln
20 25 30
Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gln
35 40 45
Leu Thr Leu Asn Ser Arg Arg Glu Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp
50 55 60
Ile Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val Gln Val Leu Ala Lys
65 70 75 80
Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Thr Phe Ala Met Asn Ile Cys Glu
85 90 95
His Phe Leu Ser Ser Phe Asn His Val Ile Arg Val Gln Val Tyr Val
100 105 110
Glu Glu Val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val
115 120 125
His Ala Phe Ile His Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu
130 135 140
Gln Leu Arg Ser Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu
145 150 155 160
Lys Val Leu Lys Thr Thr Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Leu Lys Asp
165 170 175
Gln Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gln
180 185 190
Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gln Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu
195 200 205
Ala Thr Trp Glu Ala Val Arg Gly Ile Val Leu Lys Lys Phe Ala Gly
210 215 220
Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr
225 230 235 240
Asp Ile Gln Val Leu Ser Leu Ser Gln Leu Pro Glu Ile Glu Asp Met
245 250 255
Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys
260 265 270
Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro
275 280 285
Tyr Gly Arg Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Thr Ser Arg Leu
290 295 300
<210> 6
<211> 304
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 猴子的尿酸氧化酶氨基酸序列
<400> 6
Met Ala His Tyr His Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe
1 5 10 15
Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Val Lys Val Leu His Ile Gln
20 25 30
Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gln
35 40 45
Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp
50 55 60
Ile Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val His Ala Leu Ala Lys
65 70 75 80
Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Ala Phe Ala Val Asn Ile Cys Gln
85 90 95
His Phe Leu Ser Ser Phe Asn His Val Ile Arg Thr Gln Val Tyr Val
100 105 110
Glu Glu Ile Pro Trp Lys Arg Leu Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val
115 120 125
His Ala Phe Ile His Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu
130 135 140
Gln Leu Arg Ser Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu
145 150 155 160
Lys Val Leu Lys Thr Thr Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp
165 170 175
Gln Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Ala Gln
180 185 190
Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gln Cys Arg Asp Val Asp Phe Glu
195 200 205
Ala Thr Trp Asp Thr Ile Arg Asp Val Val Leu Glu Lys Phe Ala Gly
210 215 220
Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr
225 230 235 240
Asp Ile Gln Val Val Ser Leu Ser Gln Val Pro Glu Ile Asp Asp Met
245 250 255
Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys
260 265 270
Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro
275 280 285
Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu
290 295 300
<210> 7
<211> 304
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 狒狒的尿酸氧化酶氨基酸序列
<400> 7
Met Ala Asp Tyr His Asn Asn Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Leu Glu Phe
1 5 10 15
Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Val Lys Val Leu His Ile Gln
20 25 30
Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gln
35 40 45
Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp
50 55 60
Ile Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val His Val Leu Ala Lys
65 70 75 80
Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Ala Phe Gly Val Asn Ile Cys Glu
85 90 95
Tyr Phe Leu Ser Ser Phe Asn His Val Ile Arg Ala Gln Val Tyr Val
100 105 110
Glu Glu Ile Pro Trp Lys Arg Leu Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val
115 120 125
His Ala Phe Ile His Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu
130 135 140
Gln Leu Arg Ser Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu
145 150 155 160
Lys Val Leu Lys Thr Thr Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp
165 170 175
Gln Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gln
180 185 190
Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gln Cys Arg Asp Val Asp Phe Glu
195 200 205
Ala Thr Trp Gly Thr Ile Arg Asp Leu Val Leu Glu Lys Phe Ala Gly
210 215 220
Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr
225 230 235 240
Asp Ile Gln Val Leu Ser Leu Ser Arg Val Pro Glu Ile Glu Asp Met
245 250 255
Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys
260 265 270
Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro
275 280 285
Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu
290 295 300

Claims (8)

1.一种聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶，所述尿酸氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其特征在于，所述聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶采用Lys-C或胰蛋白酶进行酶切处理后，K30、K35、K222和K231四个位点所在的肽段消失比例高于80％以上；
所述聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶是通过如下方式制备的：
将5KD分子量的N-琥珀酰亚胺丙酸酯PEG用2mmol/L HCl溶解成200mmol/L的PEG溶液，溶解后以尿酸氧化酶单体与所述5KD分子量的N-琥珀酰亚胺丙酸酯PEG的摩尔比为1：55～1：95的比例加入溶有尿酸氧化酶的碳酸盐浓度为0.1～0.3mol/L pH为10.0的碳酸盐缓冲液中，使得PEG与尿酸氧化酶发生偶联反应，偶联反应在5～30℃的条件下搅拌反应60分钟以上，直到PEG偶联程度不再随时间而变化。
2.根据权利要求1所述的聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶，其特征在于，所述聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶的肽图具有表5所示的峰面积降低肽段。
3.根据权利要求1所述的聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶，其特征在于，所述聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶的肽图如图6或图7所示。
4.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1～3任一项所述的尿酸氧化酶。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，包括其它使用联合用药治疗或预防高尿酸相关性疾病的药物。
6.权利要求1～3任一项所述的尿酸氧化酶或权利要求4～5任一项所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗高尿酸相关性疾病，降低有需要受试者的生物流体中尿酸水平。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述高尿酸相关性疾病包括选自慢性高尿酸血症、痛风、高尿酸引起的肾脏疾病、高尿酸性关节炎、痛风结节、癌症化疗引起的高尿酸血症。
8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述生物流体为尿液或者血液。
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