KR20220004145A - 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소 - Google Patents
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- C12Y107/03003—Factor-independent urate hydroxylase (1.7.3.3), i.e. uricase
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Abstract
본 발명은 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소를 제안한다. 상기 요산 산화효소의 하기 아미노산 부위 중 적어도 11개가 PEG 변형을 갖는다: T1, K3, K4, K30, K35, K76, K79, K97, K112, K116, K120, K152, K179, K222, K231, K266, K272, K285, K291, K293.
Description
본 발명은 생물 의약 분야에 관한 것으로, 구체적으로는 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소에 관한 것이며, 보다 구체적으로는 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소, 약학 조성물, 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소의 제약적 용도 및 요산 산화효소의 면역원성을 감소시키는 방법에 관한 것이다.
통풍은 퓨린 대사 장애에 의해 발생되는 질환으로, 고요산혈증이 그 임상 특징이며, 파하, 관절, 신장에 요산염이 침착되어 토푸스가 형성된다. 인체 내의 퓨린은 일련의 변화를 거쳐 최종적으로 요산이 형성되는데, 혈중 요산 농도가 70mg/L을 초과하면 고요산혈증을 유발할 수 있고, 그 중 고요산 환자5% ~ 12%는 통풍으로 발전할 수 있다. 혈액이나 활액에서 요산 나트륨의 농도가 포화 상태에 도달하면 요산 나트륨염의 미세결정이 형성되어 통풍성 관절염을 유발할 수 있다. 시간이 지남에 따라 만성 고요산혈증은 또한 관절 주위, 연조직 및 일부 기관에 파괴적인 결정성 요산 침착물을 침착시켜 통풍성 급성 관절염, 토푸스성 만성 관절염 및 관절 기형 등 질환을 유발할 수 있다. 신장 손상은 통풍의 두번째로 흔한 임상 표현으로 간주된다. 만성 고요산혈증의 점진적인 성질로 인해 수질, 신세뇨관 및 신간질에 요산염이 침착되어 국소 부위를 자극하고 염증 반응을 유발하게 되는데 이는 만성 요산염 신병증으로 지칭되며; 중증 고요산혈증 환자(예를 들어, 일부 악성 종양, 특히 백혈병 및 및 림프종 환자)는 단기간에 신장 집합관, 신우, 신배 및 요관에 다량의 요산이 침착되어 내강 폐쇄, 소변의 폐색을 일으켜 급성 신부전(요산 신병증으로도 지칭됨)을 유발한다.
최근 수십년 동안 사람들의 삶의 질이 향상되고 음식 및 생활 습관이 변화함에 따라 고단백 및 고퓨린 음식물의 섭취가 증가하여 통풍 환자의 수가 해마다 증가 추세를 보이고 있다. 유럽에서 통풍 환자의 수는 지난 20년 동안 약 두 배 증가하였고, 현재 중국에서 고요산혈증 및 통풍 발병률은 약 2 ~ 3%로 증가하였다. 고요산혈증은 임상 증상이 없는 경우 식이 조절을 하고, 임상 증상이 나타나면 약물 치료가 필요하다. 현재 임상에서 사용되는 일반적인 치료 수단은 다음과 같다. 콜히친(colchicine), 브프로펜(buprofen), 나프록센(naproxen) 등과 같은 진통제 및 항염증제는 주로 통풍성 관절염의 급성 발작 증상을 조절하고 관절 국소 부위 통증, 부종 및 염증을 제거하는데 사용되고; 프로베니시드(probenicid), 설핀피라존(sulfinpyrazone), 벤즈브로마론(benzbromarone) 등과 같은 요산제(신장 기능이 저하된 경우에는 효과 없음)는 요산 배설을 촉진하며; 알로퓨리놀(allopurinol)과 같은 요산 합성 억제 약물은 토푸스 통풍, 신부전, 백혈병 및 일부 유전 질환을 앓고 있는 환자의 주요 치료 약물로 크산틴 산화효소를 억제하여히포크산틴과 크산틴이 요산으로 전환되지 않도록 하는데, 이는 인체에서 점차 산화되어 물에 쉽게 용해되는 옥시푸리놀(oxipurinol)을 생성하여 소변을 통해 배출된다. 그러나, 기존의 모든 치료법으로 토푸스가 형성된 만성 통풍 환자를 치료하기 어렵고, 이 밖에, 상기 약물을 장기간 복용할 경우, 환자는 필연적으로 백혈구 감소증, 심장 기능 장애, 간 및 신장 기능 장애, 위장 시스템 자극, 당뇨병으로 이어지는 재생 불량성 빈혈, 통풍 등 합병증을 유발하게 된다.
인간 고요산혈증은 인간 진화 과정에서 우리카아제 유전자의 돌연변이 및 불활성화와 관련이 있으며, 돌연변이는 인간 우리카아제 유전자의 코딩 서열에 조기 종결 코돈(Wu X, Lee C C, Muzny D M, Caskey C T.Proc Natl Acad SciUSA.1989.86: 9412-9416.)을 도입한다. 따라서 인간은 자체로 활성 우리카아제를 합성할 수 없으므로 인간 퓨린 분해 대사는 요산에서 종결된다(Wu X, Muzny D M, Lee C C, Caskey C T.J Mol Evol.1992.34: 78-84.). 인간이 아닌 영장류와 기타 포유류의 간 과산화소체의 활성 우리카아제는 용해성이 낮은 요산염(~ 11mg/100ml 물)을 더 잘 용해되는 알란토인(~ 147mg/100ml 물), 신장에서 더 효과적으로 배설될 수 있다(Wortmann R L, Kelley W N.Kelley's textbook of rheumatology(6th).2001:1339-1376). 유럽과 미국에서는 스퍼질루스 플라부스(Aspergillus flavus)로 제조된 우리카아제(Uricozyme)가 종양 화학 요법과 관련된 중증 고요산혈증의 치료에 10년 이상 사용되고 있다(Zittoun R, Dauchy F, Teilaud C, Barthelemy M, Bouchard P.Ann Med Interne.1978.127: 479-482.). 프랑스 Sanofi사가 개발하고 맥주효모를 발효시켜 생산한 재조합 아스퍼질루스 플라부스 우리카아제 약물 ELITEK는 2002 년에 FDA 인증을 받았으며 이는 종양 화학 요법으로 인한 중증 고요산혈증의 단기 치료에 사용된다(Pui C H, Relling M V, Lascombes F, HarrisonP L, Struxiano A et al.Leukemia.1997.11:1813-1816.). 아울러, ELITEK 의 주입은 또한 토푸스의 부피를 감소시킬 수 있음을 입증하였다(Potaux L, Aparicio M, Maurel C, Ruedas M E, Mart in C L.Nouv PresseMed.1975.4: 1109-1112.). 2010년 9월 FDA는 상장된 미국 Savient사에서 생산한 PEG 변형 재조합 돼지 유래 우리카아제(Pegloticase)를 난치성 통풍 치료제로 승인했으나 면역원성 문제를 해결하지 못하여 임상 응용에서 약 50% 환자가 효과를 보지 못하고 있다.
우리카아제(E C 1.7.3.3)는 미생물(Bacillus fastidious, Candida monocytogenes, 아스퍼질루스 플라부스), 식물(대두, 병아리콩), 동물(돼지, 소, 개, 개코원숭이)에 널리 존재한다(Suzuki K, Sakasegawa S, Misaki H, SugiyamaM.J Biosci Bioeng.2004.98: 153-158). 이는 산소 존재 하에 요산을 촉매화하여 알란토인을 산화시키고 이산화탄소를 방출할 수 있다(Retailleau P, Colloc'h, Denis V, Francoise B.Acta Cryst D.2004.60: 453-462.).
활성을 갖는 우리카아제는 4량체 단백질로, 동일한 서브유닛으로 구성되며, 각 서브유닛의 분자량은 약 34kD이고, 301-304개의 아미노산으로 구성된다. 각 용액에서 우리카아제의 효소 활성이 가장 높을 때의 pH값은 8.0이다(Bayol A etal.Biophys Chem.1995.54: 229-235.). 현재 알려진 모든 유래의 우리카아제 중 활성이 가장 높은 것은 아스퍼질루스 플라부스로부터 유래되는 것으로, 27 IU/mg에 도달하고; 두번째는 Bacillus fastidious에서 유래되는 것으로 그 활성은 13 IU/mg을 유지한다(HuangS H, Wu T K.Eur J Biochem.2004.271:517-523.). 이 밖에, 콩류 식물 유래 우리카아제는 2 ~ 6 IU/mg의 활성만을 갖고 있으며; 포유동물 유래 우리카아제는 재조합 발현 후, 돼지 유래 우리카아제 활성이 5 IU/mg에 도달할 수 있으며, 개코원숭이 유래 우리카아제 활성은 1 IU/mg에 불과하고(Michael H, Susan J.K.2006.US7056713B1), 인간 유래 우리카아제는 비활성화되어 있다.
인체 응용에 있어서, 미생물 우리카아제의 높은 활성과 포유동물 우리카아제의 낮은 면역원성으로 인해 이들로부터 유래된 우리카아제는 현재 재조합 우리카아제의 개발 및 응용에서 연구 초점이 되고 있다. 그러나 아스퍼질루스 플라부스 유래 우리카아제와 추측된 인간 유래 우리카아제의 상동성은 40% 미만이다(Lee C C, Wu X, Gibbs R A, Cook R G, Muzny D M, CaskeyC T.Science.1988.239: 1288-1291.), 인체는 우리카아제에 대한 항체를 생성하기 쉽기 때문에 아스퍼질루스 플라부스 우리카아제의 효능이 급격이 약화됨과 동시에 중증 알레르기 반응을 유발하여 장기간 치료에 사용할 수 없다.
따라서, 요산 산화효소를 기반으로 한 고요산혈증 치료 기술은 아직 추가 개발 및 개선이 필요하다.
본원 발명은 아래 사실 및 문제점에 대한 발명인의 발견 및 이해를 기반으로 한다.
활성 요산 산화효소는 동종 4량체 단백질로, 그중 아미노산의 1/3은 강한 소수성 아미노산이고, 4량체 단백질 간에는 쉽게 응집되어 8량체 및 더 큰 응집체를 형성한다. 분자량이 100kDa 이상인 분자는 신체가 면역 반응을 일으키도록 효과적으로 유도할 수 있는 반면, 변형되지 않은 폴리머 요산 산화효소 단백질의 분자량은 이미 140kDa에 도달하고, 분자량이 더 큰 폴리머 우리카아제는 더 높은 면역원성을 갖는다. 인체는 우리카아제에 대한 항체를 생성하기 쉽기 때문에 그 효능을 급격히 약화시키고 심한 알레르기 반응을 일으켜 장기간 치료에 사용할 수 없다. PEG로 단백질을 공유적으로 변형함으로써 단백질 면역원성을 감소시킬 수 있고 단백질 용해도를 증가시킬 수 있으며 단백질의 반감기를 연장할 수 있음이 입증되었다.
Duke University와Savient사는 돼지 유래 및 개코원숭이 유래 키메라 우리카아제에 대한 연구를 수행하였다(Michael H, Susan J.K.2006.US7056713B1). 해당 연구의 방법은 효소 활성을 크게 감소시키지 않으면서 분자량이 10KDa인 메톡시 함유 폴리에틸렌 글리콜(10KDa-mPEG-NPC)로 돼지 유래 우리카아제 라이신 잔기의 ε-아미노기를 변형(얻어진 변형 생성물은 Pegloticase임)하여 인체 내 난치성 통풍 치료의 목표를 기본적으로 구현하였다. 발명인은 상기 연구 성과가 약물로 인한 면역원성을 완전히 해결할 수 없음을 발견하였는 바, 임상 피험자들은 여러 회 주사 후 우리카아제 효능의 소실 현상이 나타났는데 이는 과도하게 큰 Pegloticase 단백질 분자량과 관련이 있을 수 있는 것으로 발명인은 추측하였다(10kd의 PEG를 적용하면 Pegloticase 분자량이 540 kDa가 됨). 아울러 pegloticase는 주사에는 적합하지 않지만 정맥내 불루스 주사에 적합하므로 피험자의 장기간 사용 순응도를 감소시키고 나아가 이의 임상 응용을 심각하게 제한한다. 현재까지 면역원성이 더 낮고 피하 주사가 가능한 지속성 요산 산화효소 약물이 존재하지 않는 실정이다.
본 발명은 관련 기술의 기술적 과제 중 하나를 적어도 어느 정도 해결하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 제1 양태에서, 본 발명은 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소를 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 요산 산화효소의 하기 아미노산 부위 중 적어도 11개가 PEG 변형을 갖는다: T1, K3, K4, K30, K35, K76, K79, K97, K112, K116, K120, K152, K179, K222, K231, K266, K272, K285, K291, K293. 본 발명에서 언급된 "요산 산화효소"는 넓은 의미로 이해되어야 하며, 실제 생산 관행 중 동일한 배치에서 생산되는 요산 산화효소의 혼합물의 총칭을 의미한다는 점에 유의해야 한다. 발명인은 시판되는 유사 약물과 비교하여 본 발명의 실시예의 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소의 상기 아미노산 부위 중 적어도 11개 부위가 PEG 변형을 가지며, 이는 효소 활성을 최대한도로 보장하는 전제하에 생체내 요산 산화효소의 안정성을 크게 향상시키고, 면역원성을 감소시키며, 또한 근육내 주사 후 생체내 약효는 시판되는 유사 약물의 정맥내 주사 후와 동등한 생체내 약효에 도달할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 요산 산화효소는 아래 부가적 기술특징 중 적어도 하나를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 하기 4개 Lys 아미노산 부위 중 적어도 1개, 2개, 3개 또는 전부가 PEG 변형을 갖는다:
K30, K35, K222 및 K231.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 PEG 변형에 사용되는 폴리에틸렌 글리콜의 분자량은 6KD 이하이다. 발명인은 분자량이 6KD 이하인 폴리에틸렌 글리콜로 변형시켜 얻어진 요산 산화효소가 체내에서 지속성을 더욱 향상시키고 과도한 분자량으로 인해 심각한 항-PEG 항체를 생성하지 않는다는 것을 발견하였다. 즉 면역원성이 더욱 감소된다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 폴리에틸렌 글리콜은 모노메톡실기 또는 히드록실기를 갖는다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 폴리에틸렌 글리콜은 선형 또는 분지형 구조이다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 폴리에틸렌 글리콜과 요산 산화효소는 아미드 결합을 통해 접합된다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 폴리에틸렌 글리콜은 변형 폴리에틸렌 글리콜이고, 상기 변형 폴리에틸렌 글리콜의 변형기는, N-히드록시숙신이미드, N-히드록시숙신이미딜카르보네이트, N-히드록시숙신이미딜아세테이트, N-히드록시숙신이미딜프로피오네이트, N-히드록시숙신이미딜부티레이트, N-히드록시숙시닐숙시네이트 및 비스(p-니트로페닐)카보네이트로부터 선택되는 적어도 하나를 포함한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 변형 폴리에틸렌 글리콜의 변형기는 N-히드록시숙신이미딜프로피오네이트이다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 아미노산 부위는 SEQ ID NO:1로 표시되는 아미노산 서열에 의해 위치 결정된다.
TYKKNDEVEFVRTGYGKDMIKVLHIQRDGKYHSIKEVATTVQLTLSSKKDYLHGDNSDVIPTDTIKNTVNVLAKFKGIKSIETFAVTICEHFLSSFKHVIRAQVYVEEVPWKRFEKNGVKHVHAFIYTPTGTHFCEVEQIRNGPPVIHSGIKDLKVLKTTQSGFEGFIKDQFTTLPEVKDRCFATQVYCKWRYHQGRDVDFEATWDTVRSIVLQKFAGPYDKGEYSPSVQKTLYDIQVLTLGQVPEIEDMEISLPNIHYLNIDMSKMGLINKEEVLLPLDNPYGKITGTVKRKLSSRL(SEQ ID NO:1).
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 요산 산화효소는 SEQ ID NO:1 ~ 7로 표시되는 아미노산 서열을 갖거나; 또는 SEQ ID NO:1 ~ 7과 비교하여, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 갖거나; 또는 SEQ ID NO:1 ~ 7과 비교하여, 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 부가된 폴리펩티드를 갖는다.
MAHYRNDYKKNDEVEFVRTGYGKDMIKVLHIQRDGKYHSIKEVATSVQLTLSSKKDYLHGDNSDVIPTDTIKNTVNVLAKFKGIKSIETFAVTICEHFLSSFKHVIRAQVYVEEVPWKRFEKNGVKHVHAFIYTPTGTHFCEVEQIRNGPPVIHSGIKDLKVLKTTQSGFEGFIKDQFTTLPEVKDRCFATQVYCKWRYHQGRDVDFEATWDTVRSIVLQKFAGPYDKGEYSPSVQKTLYDIQVLTLGQVPEIEDMEISLPNIHYLNIDMSKMGLINKEEVLLPLDNPYGRITGTVKRKLTSRL(SEQ ID NO:2).
MYKNDEVEFVRTGYGKDMVKVLHIQRDGKYHSIKEVATSVQLTLSSKKDYVYGDNSDIIPTDTIKNTVHVLAKFKGIKSIETFAMNICEHFLSSFNHVIRAQVYVEEVPWKRFEKNGVKHVHAFIHNPTGTHFCEVEQMRSGPPVIHSGIKDLKVLKTTQSGFEGFIKDQFTTLPEVKDRCFATKVYCKWRYHQGRDVDFEATWDTVRDIVLEKFAGPYDKGEYSPSVQKTLYDIQVHSLSRVPEMEDMEISLPNIHYFNIDMSKMGLINKEEVLLPLDNPYGKITGTVKRKLSSRL(SEQ ID NO:3).
MAHYHNDYKKNDEVEFVRTGYGKDMVKVLHIQRDGKYHSIKEVATSVQLTLSSKKDYVYGDNSDIIPTDTIKNTVHVLAKFKGIKSIETFAMNICEHFLSSFNHVIRAQVYVEEVPWKRFEKNGVKHVHAFIHNPTGTHFCEVEQMRSGPPVIHSGIKDLKVLKTTQSGFEGFIKDQFTTLPEVKDRCFATKVYCKWRYHQGRDVDFEATWDTVRDIVLEKFAGPYDKGEYSPSVQKTLYDIQVHSLSRVPEMEDMEISLPNIHYFNIDMSKMGLINKEEVLLPLDNPYGRITGTAKRKLASKL(SEQ ID NO:4).
MAHYHNDYQKNDEVEFVRTGYGKDMVKVLHIQRDGKYHSIKEVATSVQLTLNSRREYLHGDNSDIIPTDTIKNTVQVLAKFKGIKSIETFAMNICEHFLSSFNHVIRVQVYVEEVPWKRFEKNGVKHVHAFIHTPTGTHFCEVEQLRSGPPVIHSGIKDLKVLKTTQSGFEGFLKDQFTTLPEVKDRCFATQVYCKWRYHQGRDVDFEATWEAVRGIVLKKFAGPYDKGEYSPSVQKTLYDIQVLSLSQLPEIEDMEISLPNIHYFNIDMSKMGLINKEEVLLPLDNPYGRITGTVKRKLTSRL(SEQ ID NO:5).
MAHYHNDYKKNDEVEFVRTGYGKDMVKVLHIQRDGKYHSIKEVATSVQLTLSSKKDYLHGDNSDIIPTDTIKNTVHALAKFKGIKSIEAFAVNICQHFLSSFNHVIRTQVYVEEIPWKRLEKNGVKHVHAFIHTPTGTHFCEVEQLRSGPPVIHSGIKDLKVLKTTQSGFEGFIKDQFTTLPEVKDRCFAAQVYCKWRYHQCRDVDFEATWDTIRDVVLEKFAGPYDKGEYSPSVQKTLYDIQVVSLSQVPEIDDMEISLPNIHYFNIDMSKMGLINKEEVLLPLDNPYGKITGTVKRKLSSRL(SEQ ID NO:6).
MADYHNNYKKNDELEFVRTGYGKDMVKVLHIQRDGKYHSIKEVATSVQLTLSSKKDYLHGDNSDIIPTDTIKNTVHVLAKFKGIKSIEAFGVNICEYFLSSFNHVIRAQVYVEEIPWKRLEKNGVKHVHAFIHTPTGTHFCEVEQLRSGPPVIHSGIKDLKVLKTTQSGFEGFIKDQFTTLPEVKDRCFATQVYCKWRYHQCRDVDFEATWGTIRDLVLEKFAGPYDKGEYSPSVQKTLYDIQVLSLSRVPEIEDMEISLPNIHYFNIDMSKMGLINKEEVLLPLDNPYGKITGTVKRKLSSRL(SEQ ID NO:7).
여기서, SEQ ID NO:1로 표시되는 아미노산 서열은 돼지 유래 및 개코원숭이 유래 키메라 우리카아제(돼지-개코원숭이)의 아미노산 서열이고; SEQ ID NO:2로 표시되는 아미노산 서열은 돼지 유래 요산 산화효소의 아미노산 서열이며; SEQ ID NO:3로 표시되는 아미노산 서열은 개 유래 및 개코원숭이 유래(개-개코원숭이) 키메라 요산 산화효소의 아미노산 서열이고; SEQ ID NO:4로 표시되는 아미노산 서열은 개 유래 요산 산화효소의 아미노산 서열이며; SEQ ID NO:5로 표시되는 아미노산 서열은 소 유래 요산 산화효소의 아미노산 서열이고; SEQ ID NO:6로 표시되는 아미노산 서열은 원숭이의 요산 산화효소아미노산 서열이며; SEQ ID NO:7로 표시되는 아미노산 서열은 개코원숭이의 요산 산화효소아미노산 서열이다.
유의해야 할 점은, 본 발명의 라이신은 SEQ ID NO:1로 표시되는 아미노산 서열에 의해 위치 결정되는 바, 예를 들어 K4는 SEQ ID NO:1로 표시되는 아미노산 서열에 기반하여 제4 위치에 위치하는 라이신을 의미한다. SEQ ID NO:1 ~ 7로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 우리카아제 또는 SEQ ID NO:1 ~ 7과 비교하여 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 폴리펩티드; 또는 SEQ ID NO:1 ~ 7과 비교하여, 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 부가된 폴리펩티드는 구조상에서 상동성을 가지며, 당업자는 서열 비교를 통해 SEQ ID NO:2 ~ 7 또는 SEQ ID NO:1 ~ 7과 비교하여, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 폴리펩티드 또는 SEQ ID NO:1 ~ 7과 비교하여, 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 부가된 폴리펩티드에서 T1, K3, K4, K30, K35, K76, K79, K97, K112, K116, K120, K152, K179, K222, K231, K266, K272, K285, K291, K293 부위에 대응되는 대응 부위를 결정하고, 나아가 상기 폴리펩티드의 비교에서 대응 부위에 발생하는 PEG 변형을 결정하여 본 발명의 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소의 낮은 면역원성, 높은 생체내 안정성, 근육내 주사에 적합한 장점를 구현할 수 있다. 서열 비교 방법은 당업자가 일반적으로 사용하는 방법으로, 서열 유래가 상이한 동종효소의 서열 동일성 비교에 사용되며, 상이한 서열 간에 돌연변이, 결실 등으로 인해 서열 길이 차이가 있을 수 있으나 당업자는 서열 비교 방식을 통해 상이한 서열 간의 동일성을 결정할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 실시예에 따르면, SEQ ID NO:2로 표시되는 서열과 SEQ ID NO:1로 표시되는 서열의 T1, K3, K4, K30, K35, K76, K79, K97, K112, K116, K120, K152, K179, K222, K231, K266, K272, K285, K291, K293 부위의 대응 부위는 M1, K9, K10, K36, K41, K82, K85, K103, K118, K122, K126, K158, K185, K228, K237, K272, K278, K297, K299를 포함하고; SEQ ID NO:3로 표시되는 서열과 SEQ ID NO:1로 표시되는 서열에 해당되는 부위의 대응 부위는 M1, K3, K29, K34, K75, K78, K111, K115, K119, K151, K178, K221, K230, K265, K271, K284, K290, K292를 포함하며; SEQ ID NO:4로 표시되는 서열과 SEQ ID NO:1로 표시되는 서열에 해당되는 부위의 대응 부위는 M1, K9, K10, K36, K41, K82, K85, K118, K122, K126, K158, K185, K228, K237, K272, K278, K297, K299를 포함하고; SEQ ID NO:5로 표시되는 서열과 SEQ ID NO:1로 표시되는 서열에 해당되는 부위의 대응 부위는 M1, K10, K36, K41, K82, K85, K118, K122, K126, K158, K185, K228, K237, K272, K278, K297, K299를 포함하며; SEQ ID NO:6로 표시되는 서열과 SEQ ID NO:1로 표시되는 서열에 해당되는 부위의 대응 부위는 M1, K9, K10, K36, K41, K82, K85, K103, K118, K122, K126, K158, K185, K228, K237, K272, K278, K297, K299를 포함하고; SEQ ID NO:7로 표시되는 서열과 SEQ ID NO:1로 표시되는 서열에 해당되는 부위의 대응 부위는 M1, K9, K10, K36, K41, K82, K85, K103, K118, K122, K126, K158, K185, K228, K237, K272, K278, K297, K299를 포함한다. 발명인은 실험을 통해 상기 SEQ ID NO:2 ~ 7로 표시되는 아미노산 서열의 해당 부위 중 적어도 11개 부위를 PEG 변형시킨 후, 얻어진 PEG에 의해 변형된 요산 산화효소가 낮은 면역원성, 높은 생체내 안정성, 근육내 주사에 적합한 장점을 갖는다는 것을 발견하였다.
본 발명의 제2 양태에서, 본 발명은 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소를 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소의 펩타이드 맵은 폴리에틸렌 글리콜에 의해 변형되지 않은 상기 요산 산화효소의 펩타이드 맵과 비교하여, 적어도 11개의 소정의 펩타이드 단편을 갖는 피크 면적이 감소된 상대적 비율은 75% 이상이고, 바람직하게는 80% 이상이며, 보다 바람직하게는 90% 이상이다. 본 발명의 실시예에 따른 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소는 낮은 면역원성, 높은 생체내 안정성, 근육내 주사에 적합한 장점을 갖는다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소는 아래 부가적 기술특징 중 적어도 하나를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소의 펩타이드 맵은 표 5에 도시된 피크 면적 감소 펩타이드 단편을 갖는다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소의 펩타이드 맵은 도 6 또는 도 7에 도시된 바와 같다.
본 발명의 제3 양태에서, 본 발명은 약학 조성물을 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 약학 조성물은 전술한 요산 산화효소를 포함한다. 본 발명의 실시예에 따른 약학 조성물은 낮은 면역원성, 높은 생체내 안정성, 근육내 주사에 적합한 장점을 가져 고요산 관련 질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 약학 조성물은 아래 부가적 기술특징 중 적어도 하나를 더 포함한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 약학 조성물은 고요산 관련 질환을 치료 또는 예방하는 기타 약물을 더 포함한다.
본 발명의 제4 양태에서, 본 발명은 고요산 관련 질환을 치료하고, 필요로 하는 피험자의 생물학적 유체에서 요산 수준을 감소시키기 위한 약물 제조에 있어서의 전술한 요산 산화효소 또는 전술한 약학 조성물의 용도를 제안한다. 본 발명의 실시예에 따른 요산 산화효소는 면역원성이 낮고, 생체내 안정성이 높으며 근육내 주사에 적합한 장점을 가지며, 고요산 관련 질환의 치료에 유의한 장점을 갖는다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 용도는 아래 부가적 기술특징 중 적어도 하나를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 고요산 관련 질환은 만성 고요산혈증, 통풍, 신장 질환, 고요산 관절염, 신장결석, 통풍 결절, 고혈압, 당뇨병, 고중성지방혈증, 대사증후군, 관상동맥심장질환, 동맥경화증, 암 화학 요법으로 인한 고요산혈증으로부터 선택되는 질환을 포함한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 생물학적 유체는 소변 또는 혈액이다.
본 발명의 제5 양태에서, 본 발명은 요산 산화효소의 면역원성을 감소시키는 방법을 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 방법은 상기 요산 산화효소의 하기 아미노산 부위 중 적어도 11개 PEG 변형을 갖도록 하는 단계를 포함한다: T1, K3, K4, K30, K35, K76, K79, K97, K112, K116, K120, K152, K179, K222, K231, K266, K272, K285, K291, K293. 본 발명의 실시예에 따른 방법은 요산 산화효소의 면역원성을 효과적으로 감소시킬 수 있고, 나아가 얻어진 생체내 요산 산화효소의 안정성이 더욱 높으며, 작용이 더 오래 지속된다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 방법은 아래 부가적 기술특징 중 적어도 하나를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 요산 산화효소의 하기 4개 Lys 아미노산 부위 중 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 4개가 PEG 변형을 갖도록 한다:
K30, K35, K222, K231.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 PEG 변형에 사용되는 폴리에틸렌 글리콜의 분자량은 6KD 이하이다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 폴리에틸렌 글리콜은 변형 폴리에틸렌 글리콜이다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 변형 폴리에틸렌 글리콜의 변형기는 N-히드록시숙신이미드이다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 아미노산 부위는 SEQ ID NO:1로 표시되는 아미노산 서열에 의해 위치 결정된다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 요산 산화효소는 SEQ ID NO:1 ~ 7로 표시되는 아미노산 서열을 갖거나; 또는 SEQ ID NO:1 ~ 7과 비교하여, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 갖거나; 또는 SEQ ID NO:1 ~ 7과 비교하여, 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 부가된 폴리펩티드를 갖는다.
전술한 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소의 부가적 기술특징의 기술적 효과는 본 발명의 실시예에 따른 상기 요산 산화효소의 면역원성을 감소시키는 방법의 부가적 기술특징에 적용될 수 있음을 이해할 수 있다. 본 발명의 실시예에 따른 상기 요산 산화효소의 면역원성을 감소시키는 방법의 부가적 기술특징은 여기서 더 이상 설명하지 않는다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 PHC물리 화학적 기준 물질-SEC-HPLC-UV 검출 스펙트럼이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 PHC물리 화학적 기준 물질-SEC-HPLC-RI 검출 스펙트럼이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 PEG 기준 물질-SEC-HPLC-RI 검출 스펙트럼이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 PU5 변형 생성물-SEC-HPLC-UV 검출 스펙트럼이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 PU5 변형 생성물-SEC-HPLC-RI 검출 스펙트럼이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 Lys-c 및 트립신 이중 효소 소화를 각각 적용한 PHC 및 PU5의 비교도이다.
도 7은 본 발명의 실시예에 따른 PU5 Lys-C의 소화도이다.
도 8은 본 발명의 실시예에 따른 모델 랫트에 상이한 용량을 근육내 투여 후 혈청 요산 수준을 나타내는 도면이다.
도 9는 본 발명의 실시예에 따른 신장 손상, 괴사 및 염증 점수를 나타내는 도면이다.
도 10은 본 발명의 실시예에 따른 SD 랫트에 동일한 용량(1.0mg/kg)의 Pegloticase 및 페길화 우리카아제 주사액을 1회 정맥내 주사 후 각 그룹의 평균 혈중 농도-시간 곡선을 나타내는 도면이다.
도 11은 본 발명의 실시예에 따른 SD 랫트에 Pegloticase 및 상이한 용량의 페길화 우리카아제 주사액을 1회 근육내 주사 후 각 그룹의 평균 혈중 농도-시간 곡선을 나타내는 도면이다.
도 12는 본 발명의 실시예에 따른 SD 랫트에 상이한 용량으로 페길화 우리카아제 주사액을 1회 근육내 주사 후 각 그룹의 평균 혈중 농도-시간 곡선을 나타내는 도면이다.
도 13은 본 발명의 실시예에 따른 SD 랫트에 상이한 용량으로 Pegloticase 및 페길화 우리카아제 주사액을 1회 근육/정맥내 주사 후 각 그룹의 시간별 평균 혈중 요산 수치-시간 곡선을 나타내는 도면이다.
도 14는 본 발명의 실시예에 따른 SD 랫트에 먼저(Day1) 동일한 용량(1.0mg/kg)으로 Pegloticase 및 페길화 우리카아제 주사액을 정맥내 주사 후 수컷과 암컷의 평균 혈중 농도-시간 곡선을 나타내는 도면이다.
도 15는 본 발명의 실시예에 따른 SD 랫트에 마지막으로(Day22) 동일한 용량(1.0mg/kg)으로 Pegloticase 및 페길화 우리카아제 주사액을 정맥내 주사 후 수컷과 암컷의 평균 혈중 농도-시간 곡선을 나타내는 도면이다.
도 16은 본 발명의 실시예에 따른 SD 랫트에 먼저(Day1) 동일한 용량(1.0mg/kg)으로 Pegloticase 및 페길화 우리카아제 주사액을 근육내 주사 후 수컷과 암컷의 평균 혈중 농도-시간 곡선을 나타내는 도면이다.
도 17은 본 발명의 실시예에 따른 SD 랫트에 마지막으로(Day22) 동일한 용량(1.0mg/kg)으로 Pegloticase 및 페길화 우리카아제 주사액을 근육내 주사 후 수컷과 암컷의 평균 혈중 농도-시간 곡선을 나타내는 도면이다.
도 18은 본 발명의 실시예에 따른 SD 랫트에 Pegloticase 및 페길화 우리카아제 주사액을 여러 회 정맥내 주사 후 시간별 평균 혈중 요산 수치-시간 곡선을 나타내는 도면이다.
도 19는 본 발명의 실시예에 따른 SD 랫트에 Pegloticase 및 페길화 우리카아제 주사액을 여러 회 근육내 주사 후 시간별 평균 혈중 요산 수치-시간 곡선도이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 PHC물리 화학적 기준 물질-SEC-HPLC-RI 검출 스펙트럼이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 PEG 기준 물질-SEC-HPLC-RI 검출 스펙트럼이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 PU5 변형 생성물-SEC-HPLC-UV 검출 스펙트럼이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 PU5 변형 생성물-SEC-HPLC-RI 검출 스펙트럼이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 Lys-c 및 트립신 이중 효소 소화를 각각 적용한 PHC 및 PU5의 비교도이다.
도 7은 본 발명의 실시예에 따른 PU5 Lys-C의 소화도이다.
도 8은 본 발명의 실시예에 따른 모델 랫트에 상이한 용량을 근육내 투여 후 혈청 요산 수준을 나타내는 도면이다.
도 9는 본 발명의 실시예에 따른 신장 손상, 괴사 및 염증 점수를 나타내는 도면이다.
도 10은 본 발명의 실시예에 따른 SD 랫트에 동일한 용량(1.0mg/kg)의 Pegloticase 및 페길화 우리카아제 주사액을 1회 정맥내 주사 후 각 그룹의 평균 혈중 농도-시간 곡선을 나타내는 도면이다.
도 11은 본 발명의 실시예에 따른 SD 랫트에 Pegloticase 및 상이한 용량의 페길화 우리카아제 주사액을 1회 근육내 주사 후 각 그룹의 평균 혈중 농도-시간 곡선을 나타내는 도면이다.
도 12는 본 발명의 실시예에 따른 SD 랫트에 상이한 용량으로 페길화 우리카아제 주사액을 1회 근육내 주사 후 각 그룹의 평균 혈중 농도-시간 곡선을 나타내는 도면이다.
도 13은 본 발명의 실시예에 따른 SD 랫트에 상이한 용량으로 Pegloticase 및 페길화 우리카아제 주사액을 1회 근육/정맥내 주사 후 각 그룹의 시간별 평균 혈중 요산 수치-시간 곡선을 나타내는 도면이다.
도 14는 본 발명의 실시예에 따른 SD 랫트에 먼저(Day1) 동일한 용량(1.0mg/kg)으로 Pegloticase 및 페길화 우리카아제 주사액을 정맥내 주사 후 수컷과 암컷의 평균 혈중 농도-시간 곡선을 나타내는 도면이다.
도 15는 본 발명의 실시예에 따른 SD 랫트에 마지막으로(Day22) 동일한 용량(1.0mg/kg)으로 Pegloticase 및 페길화 우리카아제 주사액을 정맥내 주사 후 수컷과 암컷의 평균 혈중 농도-시간 곡선을 나타내는 도면이다.
도 16은 본 발명의 실시예에 따른 SD 랫트에 먼저(Day1) 동일한 용량(1.0mg/kg)으로 Pegloticase 및 페길화 우리카아제 주사액을 근육내 주사 후 수컷과 암컷의 평균 혈중 농도-시간 곡선을 나타내는 도면이다.
도 17은 본 발명의 실시예에 따른 SD 랫트에 마지막으로(Day22) 동일한 용량(1.0mg/kg)으로 Pegloticase 및 페길화 우리카아제 주사액을 근육내 주사 후 수컷과 암컷의 평균 혈중 농도-시간 곡선을 나타내는 도면이다.
도 18은 본 발명의 실시예에 따른 SD 랫트에 Pegloticase 및 페길화 우리카아제 주사액을 여러 회 정맥내 주사 후 시간별 평균 혈중 요산 수치-시간 곡선을 나타내는 도면이다.
도 19는 본 발명의 실시예에 따른 SD 랫트에 Pegloticase 및 페길화 우리카아제 주사액을 여러 회 근육내 주사 후 시간별 평균 혈중 요산 수치-시간 곡선도이다.
이하, 본 발명의 실시예를 상세히 설명하고, 그 실시예를 첨부된 도면에 예시한다. 첨부된 도면을 참조하여 후술하는 실시예들은 예시적인 것으로, 본 발명을 해석하기 위한 것일 뿐 본 발명을 제한하는 것으로 이해해서는 안된다.
본 발명의 목적은 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 새로운 요산 산화효소를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 요산 산화효소의 면역원성을 효과적으로 감소시키는 방법을 제공하는 것으로, 해당 기술은 요산 산화효소의 면역원성을 효과적으로 감소시키고, 생체내 요산 산화효소의 안전성 및 안정성을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 다른 목적은 체내 지속성을 구현하고 혈중 요산 수준을 유의하게 감소시킬 수 있으며 고요산혈증 및 통풍 치료에 사용할 수 있는, 상기에서 얻은 폴리에틸렌 글리콜 옥시우리카아제 접합체의 응용을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에서는 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “요산 산화효소”, “우리카아제”는 상호 교환적으로 사용 가능하며, 모두 본 발명에 기재된 요산의 산화를 촉매하여 알란토인 및 과산화수소를 생산할 수 있는 일종의 효소를 지칭한다. 용어 “요산 산화효소 유사체”, “우리카아제 유사체”, “우리카아제 유도체”는 상호 교환이 가능하며, 모두 요산의 알란토인 및 과산화수소로의 전환을 특이적으로 촉매하는 요산 산화효소의 활성을 유지하는 기초 상에서, 요산 산화효소의 단백질 구조 서열은 부분적 아미노산 치환, 결실 또는 부가 등에 의해 구조적으로 개선될 수 있으며, 나아가 면역원성을 감소시키고, 단백질 안정성을 증가시키며, 폴리에틸렌 글리콜의 추가 변형에 유리한 등 이점을 포함하나 이에 제한되지 않는 본 구현예의 이점을 달성한다.
요산 산화효소는 특별히 제한되지 않는 바, 임의의 공급원으로부터 유래된 요산 산화효소 및 이의 요산 산화효소 유사체일 수 있으며, 대표적인 예로는 포유동물 유래, 미생물, 식물 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 요산 산화효소 및 이의 요산 산화효소 유사체는 포유동물로부터 유래된다. 바람직하게는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4로 표시되는 아미노산 서열, 보다 바람직하게는 SEQ ID NO:1로 표시되는 아미노산 서열로부터 유래된다.
본 발명에 기재된 이종으로부터 유래된 요산 산화효소는 천연 추출, 화학 합성, 유전 공학 재조합 발현 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 경로를 통해 얻을 수 있다.
다른 바람직한 예에서, 요산 산화효소는 재조합 기술을 통해 요산 산화효소 단백질 서열(SEQ ID NO:1)의 코딩 서열을 숙주 세포에서 재조합 발현한다.
다른 바람직한 예에서, 대장균 또는 효모를 숙주로 하여 재조합 발현 균주를 구축하는 방법을 통해 제조되며, 보다 바람직하게는 대장균을 숙주균으로 사용하여 재조합 발현을 수행한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 본 발명에 기재된 폴리에틸렌 글리콜 요산 산화효소는 요산 산화효소를 폴리에틸렌 글리콜로 공유적으로 변형하여 얻은 것이다. 상기 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 에틸렌옥사이드 축합 중합체와 물의 혼합물을 의미하며, 일반식 H(OCH2CH2)nOH로 표시되고, 이는 pH가 중성이며 독성이 없고 수용성이 우수한 친수성 폴리머이고, 선형 또는 분지형 구조를 갖는다. PEG의 무독성 및 양호한 생체 적합성으로 인해 현재 FDA는 다양한 PEG 변형 재조합 단백질 약물 출시를 승인하였는 바, 이는 PEG가 단백질의 면역원성을 감소시키고 단백질의 용해성을 증가시키며 단백질의 반감기를 연장시키는데 사용될 수 있음을 입증한다. PEG가 단백질과 결합하기 위해서는 PEG의 일단 또는 다단이 활성화되어야 하는데, 아미노기, 설프히드릴기, 카르복실기 또는 히드록실기 등과 같은 변형된 표적 단백질에 따라, 해당되는 변형기를 선택하여 활성화할 수 있다.
다른 바람직한 예에서, 본 발명에서 옥시우리카아제 및 우리카아제 유사체의 PEG 변형을 위해 사용되는 부위는 라이신 잔기의 ε 아미노기이지만, 소량의 N 말단 라이신 잔기의 α 아미노기도 변형된다. 요산 산화효소는 아미노 지질 결합, 2차 아미노 결합 또는 아미드 결합을 통해 PEG의 변형기에 공유적으로 연결되어 있으며, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜 분자와 요산 산화효소가 접합되어 아미드 결합을 형성하고, 폴리에틸렌 글리콜의 변형기는N-히드록시숙신이미드계를 포함하나 이에 한정되지 않으며, N-히드록시숙신이미드(NHS), N-히드록시숙신이미딜카르보네이트(SC), N-히드록시숙신이미딜아세테이트(SCM), N-히드록시숙신이미딜프로피오네이트(SPA), N-히드록시숙신이미딜부티레이트(SBA), N-히드록시숙시닐숙시네이트(SS) 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 여기서 폴리에틸렌 글리콜의 차단기는 모노메톡실기, 에톡실기, 글루코스 또는 갈락토스, 바람직하게는 모노메톡실기를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
다른 바람직한 예에서, 폴리에틸렌 글리콜은 선형 또는 분지형일 수 있다.
다른 바람직한 예에서, 폴리에틸렌 글리콜 요산 산화효소에 적용되는 폴리에틸렌 글리콜의 상대 분자량은 6KD 이하, 바람직하게는 1KD ~ 5KD, 보다 바람직하게는 2KD, 5KD, 가장 바람직하게는 5KD이다. 본 발명에서 언급된 “폴리에틸렌 글리콜 상대 분자량”은 변형기가 없는 폴리에틸렌 글리콜 상대 분자량을 의미하며, 이는 당업계에서 일반적인 의미를 갖는다는 점에 유의해야 한다. PEG는 활성화 그룹에 의해 활성화된 후, 총 상대 분자량은 5KD+10% 범위와 같이 5KD보다 약간 크다.
다른 바람직한 예에서, 상기 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소는 하기와 같은 특징을 갖는다.
(1) 요산 산화효소의 하기 아미노산 부위 중 적어도 11개가 PEG 변형을 갖는다:
T1, K3, K4, K30, K35, K76, K79, K97, K112, K116, K120, K152, K179, K222, K231, K266, K272, K285, K291, K293.
(2) 1개의 요산 산화효소 단량체 분자는 평균 11 ~ 13개의 폴리에틸렌 글리콜 분자와 접합된다.
(3) Seq ID NO:1 요산 산화효소 서열 중 K30 및/또는 K35를 포함하고, K222 및/또는 K231은 폴리에틸렌 글리콜 접합 변형이 발생된다.
(4) 폴리에틸렌 글리콜 요산 산화효소는 보다 낮은 체내 면역원성을 갖는다.
본 발명의 다른 양태에서, 요산 산화효소의 면역원성을 효과적으로 감소시키는 방법을 제공한다. 상기 기술은 요산 산화효소의 면역원성을 효과적으로 감소시킬 수 있고 생체내 요산 산화효소의 안정성을 향상시킨다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소는 하기와 같은 특징을 갖는다. 요산 산화효소는 특별히 제한되지 않는 바, 임의의 공급원으로부터 유래된 요산 산화효소 및 이의 요산 산화효소 유사체일 수 있으며, 대표적인 예로는 포유동물 유래, 미생물, 식물 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 요산 산화효소 및 이의 요산 산화효소 유사체는 포유동물로부터 유래된다. 바람직하게는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4로 표시되는 아미노산 서열, 보다 바람직하게는 SEQ ID NO:1로 표시되는 아미노산 서열로부터 유래된다.
본 발명에 기재된 이종으로부터 유래된 요산 산화효소는 천연 추출, 화학 합성, 유전 공학 재조합 발현 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 경로를 통해 얻을 수 있다.
다른 바람직한 예에서, 대장균 또는 효모를 숙주로 하여 재조합 발현 균주를 구축하는 방법을 통해 제조되며, 보다 바람직하게는 대장균을 숙주균으로 사용하여 재조합 발현을 수행한다.
본 발명에 기재된 요산 산화효소는 대장균에서 재조합 발현되어 다량의 요산 산화효소를 얻을 수 있으며, 발현된 요산 산화효소는 세포 내, 또는 세포막 상에서 발현되거나 세포 밖으로 분비될 수 있다. 필요한 경우, 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 고순도 요산 산화효소를 얻을 수 있다. 이러한 방법의 예에는 원심분리, 멸균, 염석, 한외여과, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 분자체 크로마토그래피 및 기타 다양한 기술의 조합이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
상기에서 얻은 요산 산화효소는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 연결기를 통해 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합될 수 있다.
다른 바람직한 예에서, 폴리에틸렌 글리콜은 요산 산화효소 공간 구조 표면의 라이신 잔기를 방향적으로 변형시킨다. 요산 산화효소는 아미드 결합을 통해 PEG의 변형기(활성 그룹으로도 지칭됨)에 공유적으로 연결되고, 폴리에틸렌 글리콜의 변형기(활성 그룹으로도 지칭됨)는 N-히드록시숙신이미드(NHS), N-히드록시숙신이미딜카르보네이트(SC), N-히드록시숙신이미딜아세테이트(SCM), N-히드록시숙신이미딜프로피오네이트(SPA), N-히드록시숙신이미딜부티레이트(SBA), N-히드록시숙시닐숙시네이트(SS)를 포함하나 이에 한정되지 않으며, 여기서 폴리에틸렌 글리콜의 차단기는 모노메톡실기, 에톡실기, 글루코스 또는 갈락토스, 바람직하게는 모노메톡실기를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
다른 바람직한 예에서, 폴리에틸렌 글리콜은 선형 또는 선형일 수 있다.
다른 바람직한 예에서, 폴리에틸렌 글리콜 상대 분자량은 6KD 이하, 바람직하게는 1 KD ~ 5 KD, 가장 바람직하게는 5 KD이다.
다른 바람직한 예에서, 본 발명은 하기 특징 중 하나 또는 하나 이상을 갖는 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소의 제조 방법을 제공한다.
(1) 요산 산화효소 대 폴리에틸렌 글리콜의 변형 공급물 몰비는 1:50 ~ 1:150(요산 산화효소: 폴리에틸렌 글리콜)이고, 바람직하게는 1:55 ~ 1:95의 공급물 몰비로 변형된다.
(2) 접합 반응 시스템은 변형 pH 범위가 9 ~ 11인 탄산염 완충액이다.
상기 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소의 제조 방법은 다양한 정제 수단을 적용하여 고순도 폴리에틸렌 글리콜 변형요산 산화효소를 얻는다.
다른 바람직한 예에서, 변형 샘플의 정제는 분자체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 접선 흐름 한외여과, 또는 조합을 포함하나 이에 한정되지 않으며, 보다 바람직하게는 분자체 크로마토그래피, 접선 흐름 한외여과이다.
본 발명의 다른 양태에서, 상기 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소 및 이의 응용을 제공한다. 상기 접합체는 체내 지속성을 구현하고 혈중 요산 수준을 유의하게 감소시킬 수 있으며 고요산혈증 및 통풍 치료에 사용할 수 있다.
상기 폴리에틸렌 글리콜 요산 산화효소는 만성 고요산혈증 또는 통풍을 치료하는 약물 및 이의 조합물로 더 적합하다. 상기 고요산혈증 및 통풍의 주요 증상에는 요산 신병증 및 통풍 관절염이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
상기 폴리에틸렌 글리콜 요산 산화효소의 투여 경로는 정맥내 주사, 피하 주사, 근육내 주사 및 복강 주사 등을 포함하나 이에 한정되지 않으며, 바람직하게는 정맥내 주사, 근육내 주사, 보다 바람직하게는 근육내 주사이다.
상기 폴리에틸렌 글리콜 요산 산화효소는 보다 낮은 체내 면역원성을 갖는다.
상기 폴리에틸렌 글리콜 요산 산화효소가 낮은 면역원성을 갖는다는 것은 인간 또는 동물 체내에 폴리에틸렌 글리콜 요산 산화효소를 근육내 주사 후, 신체가 항-폴리에틸렌 글리콜 분자 항체를 생성하지 않거나 또는 낮은 역가의 항-폴리에틸렌 글리콜 분자 항체를 생성하며 요산 산화효소에 대한 항체를 생성하지 않음을 의미한다.
상기 폴리에틸렌 글리콜 요산 산화효소는 근육내 주사 후 체내에 반감기가 더 길고 체내 요산 수준을 낮추는 효과가 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 본 발명의 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소는 효소 활성을 최대한도로 보장하는 전제하에 생체내 요산 산화효소의 안정성을 크게 향상시키고, 면역원성을 감소시키며, 또한 근육내 주사 후 생체내 약효는 시판되는 약물의 정맥내 주사 후와 동등한 생체내 약효에 도달할 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소 및 상기 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소를 포함하는 약학 조성물은 고요산 관련 질환의 치료 또는 예방시 투여할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 “투여”는 소정량의 물질을 적절한 방식으로 환자에게 도입하는 것을 의미한다. 본 발명의 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소는 원하는 조직에 도달할 수 있는 한 임의의 일반적인 경로로 투여될 수 있다. 복막, 정맥, 근육, 피하, 피질, 경구, 국소 부위, 비강, 폐 및 직장을 비롯한 다양한 방식이 고려되나 본 발명은 이러한 예시된 투여 방식에 한정되지 않는다. 이 밖에, 본 발명의 약학 조성물은 활성 성분을 표적 세포에 전송하는 특정 기기를 사용하여 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여 빈도 및 용량은 치료할 질환의 유형, 투여 경로, 환자의 년령, 성별, 체중 및 질환의 중증 정도, 활성 성분인 약물 유형을 포함하는 복수의 관련 요인에 의해 결정될 수 있다.
용어 “치료학적 유효량”은 질환 또는 병증과 관련된 일부 증상을 유의하게 개선하기에 충분한 화합물의 양, 즉 주어진 병증 및 투여안에 대한 치료 효과를 제공하는 양을 의미한다. 예를 들어, 만성 고요산혈증 또는 통풍의 치료에서, 질환 또는 병증의 임의의 증상을 감소, 예방, 지연, 억제 또는 차단하는 약물 또는 화합물은 치료학적으로 효과적이여야 한다. 치료학적 유효량의 약물 또는 화합물은 질환 또는 병증을 치유할 필요가 없지만 질환 또는 병증에 대한 치료를 제공하여 개체의 질환 또는 병증의 발병을 지연, 저지 또는 예방하거나, 질환 또는 병증의 증상이 완화되거나 질환 또는 병증의 기간이 변경되거나 예를 들어 질환 또는 병증이 덜 심각해지거나 회복이 가속화되도록 한다.
용어 "치료"는 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 지칭하는데 사용된다. 상기 효과는 질환 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방한다는 점에서 예방적일 수 있거나, 질환 및/또는 질환으로 인한 부작용을 부분적으로 또는 완전히 치유한다는 점에서 치료적일 수 있다. 본 명세서에 사용된 “치료"는 (a) 질병에 걸리기 쉬우나 아직 진단되지 않은 개체의 질병 예방; (b) 질병의 진행을 차단하는 것과 같은 질병의 억제; 또는 (c) 질병 관련 증상을 감소시키는 것과 같은 질병의 완화를 포함하여 포유동물, 특히 인간의 질병(주로 고요산 관련 질환을 의미함)의 치료가 포함된다. 본 명세서에 사용된 “치료”는 기체의 질병을 치료, 치유, 완화, 개선, 감소 또는 억제하기 위해 약물 또는 화합물을 개체에게 투여하는 임의의 약물을 포함한다. 본 명세서에 기재된 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 실시예에 따르면, 본 발명의 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소 또는 약학 조성물은 일반적인 치료 방법 및/또는 요법과 조합하여 사용되거나 일반적인 치료 방법 및/또는 요법과 별도로 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소 또는 약학 조성물이 기타 약물과의 병용 요법으로 투여되는 경우, 순차적이거나 동시에 개체에 투여될 수 있다. 또는, 본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소, 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 약학적으로 허용 가능한 부형제 및 당업계에 공지된 기타 치료 약물 또는 예방 약물의 조합을 포함할 수 있다.
용어 "평균 변형도”는 각 우리카아제 단량체에 결합된 PEG의 수를 의미한다.
본 명세서에서, 달리 명시되지 않는 한, 발현 방식인 “아미노산 부위가 PEG 변형을 갖는다”는 것은 해당 폴리펩티드의 3차원 구조에서, PEG 분자가 상기 아미노산 부위를 커버하여 상기 아미노산 부위 중 적어도 일부분 그룹이 노출되지 않는 것을 의미한다. 당업자는 통상적인 기술 수단에 의해 특정 아미노산 부위가 PEG 분자에 의해 변형되는지 여부를 결정할 수 있으며, 예를 들어 본 발명의 실시예 3의 "폴리에틸렌 글리콜로 변형된 부위 검출" 부분에 나열된 방법을 참조하여 검증할 수 있음을 이해할 수 있다. 요약하면, 상기 방법은, 1) Lys-C 또는 Trypsin을 적용한 1회 효소 소화, 또는 Lys-C 및 Trypsin을 적용한 이중 효소 소화와 같은 하나 또는 하나 이상의 효소를 적용하여 비 페길화 및 페길화 요산 산화효소를 소화하는 단계; 2) 소화된 단편을 고성능 액체 크로마토그래피 방법으로 분리하여 비 페길화 및 페길화 요산 산화효소의 크로마토그램, 즉 펩타이드 맵을 생성하는 단계; 3) 비 페길화 및 페길화 요산 산화효소의 펩타이드 맵의 차이를 비교하고, 소정의 내부 표준 펩타이드 단편과 결합하여 페길화 요산 산화효소 중 특정 아미노산 부위가 위치한 펩타이드 단편 피크 감소 또는 소실의 상대적 비율을 결정하며, 나아가 펩타이드 단편에서 상기 특정 아미노산 부위가 PEG에 의해 변형되었는지 여부를 판정하는 단계를 포함한다. 구체적으로, 본 발명의 실시예 3에서, 특정 아미노산 부위가 위치한 펩타이드 단편의 피크 면적 감소 또는 소실의 상대적 비율은 다음 공식을 통해 산출할 수 있다.
P(%)=(A2-A1)/A2×100%,
여기서, A1=A0×t이며,
A0은 측정할 변형 단백질의 특정 아미노산 부위가 위치한 펩타이드 단편의 실제 측정된 피크 면적이고, t는 PHC 펩타이드 맵과 측정할 변형 단백질 펩타이드 맵에서 내부 참조 펩타이드 단편의 피크 면적 비율의 평균값이며;
P(%)는 특정 아미노산 부위가 위치한 펩타이드 단편의 피크 면적의 감소 또는 소실의 상대적 비율을 나타내고, A2는 PHC 펩타이드 맵에서 특정 아미노산 부위가 위치한 펩타이드 단편의 펩타이드 단편 피크 면적이며, A1은 측정할 변형 단백질 펩타이드 맵에서 내부 참조로 변환된 특정 아미노산 부위가 위치한 펩타이드 단편의 피크 면적이다.
본 발명의 범위 내에서, 본 발명의 상기 각 기술특징 및 이하에서(예를 들어 실시예)에서 구체적으로 설명되는 다양한 기술특징은 서로 조합되어 신규 또는 바람직한 기술적 해결수단을 구성할 수 있음을 이해해야 하며, 이는 다음 구현예를 참조하여 보다 명확히 이해할 수 있을 것이다. 편폭의 제한으로 인해 상기 구현예는 단지 설명을 위한 것이며 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다.
이하, 본 발명의 실시예를 더욱 상세히 설명하고, 그 실시예의 예시를 도면에 도시하였다. 첨부된 도면을 참조하여 후술되는 실시예들은 예시적인 것으로, 본 발명을 해석하기 위한 것일 뿐 본 발명을 한정하는 것으로 이해해서는 안된다.
실시예 1: 재조합 요산 산화효소의 제조
1.1 우리카아제 발현을 위한 유전자 및 발현 플라스미드의 구축
E.coli 코돈의 사용 선호도 데이터에 따라 코돈 선호도 및 GC 함량 등 요인과 결부하여 우리카아제 단백질(코드: PHC)(SEQ ID NO: 1)의 cDNA 서열을 설계하고, 전체 유전자를 합성하여 pUC-57-PHC 플라스미드로 명명하였다. 표적 유전자 삽입 부위로 Nde I 및 BamH I를 사용하고, 발현 벡터(pET-30a-PHC)로 pET-30a 플라스미드를 사용하였다.
1.2 발현 플라스미드의 세균 숙주 세포로의 형질 전환
발현 벡터 pET-30a-PHC를 CaCl2법으로 대장균 BL21(DE3)에 도입하고, Kanamycin을 이용한 내성 스크리닝을 통해 고발현 클론을 스크리닝하였으며, 원래 종자은행 균주(E3B)를 보존하였다. 이러한 단계는 분자 생물학 분야에서 일반적으로 사용되는 방법에 따라 수행되었다.
1.3 재조합 요산 산화효소의 제조
형질 전환 및 조작된 균주를 하기와 같은 제어 조건하에 발효기에서 발효 및 발현시켰다. 먼저 30℃, pH 약 7.2에서 OD600=30 이상으로 배양하고, IPTG를 0.5mmol/L로 첨가한 후, 요산 산화효소가 축적되도록 3h 이상 계속해서 유도하였다. 원심분리하여 세포를 수집한 후 -15℃ 이하에 방치하여 보존하였다.
동결 보존된 균을 취하여 25 mmol/L Tris, 5 mmol/L EDTA 완충액에 1:10(W/V)의 현탁비로 현탁시키고, 고압으로 세균 세포를 파괴한 후, 원심분리하여 요산 산화효소 침전물을 수집하였다. 침전물을 50 mmol/L NaHCO3으로 1회 세척한 후, 농축된 우리카아제 침전물을 100 mmol/L Na2HCO3(pH9.7 ~ 10.3) 완충액에 1:50(W/V)의 현탁비로 현탁시키고, 실온에서 밤새 교반하여 용해시킨 후 원심분리하여 상등액을 수집하였다.
요산 산화효소는 여러 크로마트그래피 단계를 거쳐 추가로 정제되고, SDS-PAGE에 의해 검출된 순도는 95% 이상이며, Superdex 200 컬럼에 의해 검출된 순도는 95% 이상이고, 응집체 형태가 없었다. Lowry법으로 단백질 농도를 측정하고, 분광 광도계로 요산 산화효소의 활성을 측정하였다. 여기서 1단위(U)의 효소 활성은37℃의 최적 반응 온도에서, 최적의 pH9.0 완충액 조건하에 분당 1μmol의 요산을 형절 전환하는데 필요한 효소의 양으로 정의된다.
실시예 2: 페길화 옥시우리카아제의 제조
5KD의 분자량을 갖는 N-숙신이미딜프로피오네이트 PEG(5K-PEG-SPA)를 2mmol/L HCl로 200 mmol/L PEG 용액으로 용해시키고, 용해 후, 이를 1:55 ~ 1:95의 몰비(요산 산화효소: 5K-PEG-SPA)로 탄산염 농도가 0.1 ~ 0.3mol/L이고 pH가 10.0인 요산 산화효소가 용해된 탄산염 완충액에 첨가하여 PEG와 요산 산화효소가 접합 반응이 일어나도록 하였다. 여기서 요산 산화효소는 단량체 형태를 기준으로 5K-PEG-SPA과의 몰비를 계산한 것인 바, 즉 1:55 ~ 1:95의 몰비는 단량체 형태의 요산 산화효소와 5K-PEG-SPA의 몰비를 의미한다. 접합 반응은 PEG 접합 정도가 시간이 지남에 따라 더 이상 변하지 않을 때까지 5 ~ 30℃의 온도 조건하에 60분 이상 교반 반응시켜야 한다. 반응 종료 후, 한외여과 및/또는 크로마트그래피법을 통해 변형되지 않은 PEG 및 부산물을 반응에서 제거하였다. 적절한 분자체 크로마토그래피 매질을 선택하여 변형 부산물을 분리 제거할 수 있으며, 마지막으로 멸균 여과를 통해 5K 변형 페길화 요산 산화효소(코드: PU5)를 얻었다.
실시예 3: 페길화 옥시우리카아제의 특성 분석
3.1 평균 변형도 및 효소 활성 검출
Lowry법으로 단백질 농도를 측정하고, 분광 광도계로 폴리에틸렌 글리콜 요산 산화효소의 활성을 측정하였다. 우리카아제 기질인 요산의 최대 자외선 흡수 파장은 293nm이고, 생성물 알란토인의 최대 자외선 흡수 파장은 224nm로, 일정 농도 범위 내에서 293nm에서의 요산의 흡수값은 농도에 비례하며, 요산의 정량적 측정은 분광 광도계법으로 수행할 수 있는 바, 구체적인 과정은 다음과 같다. UV-Vis 분광 광도계를 켜고 파장을 293nm로 조절한 후, 상기 기기의 워터 배스 순환 시스템을 켜서 온도를 37℃로 유지하였다. 블랭크 대조군으로 사붕산나트륨 완충액을 사용하고, 영점 보정하였으며; 2.95ml의 기질 반응액(0.1mol/L 사붕산나트륨, 100μmol/L요산, pH 9.5, 37℃로 예열됨)을 취하여 석영 큐벳에 넣은 후, 시험 시료 50μl를 첨가하고 빠르게 혼합하여 293nm에서의 흡수값을 측정하였다. 293nm에서의 흡수도 변화를 연속적으로 측정하고; C=A/εL(여기서, A는 293 nm에서 특정 농도의 요산 흡광값이고, ε는 요산 몰 흡광 계수이며, L은 큐벳의 광로이고, C는 요산의 몰 농도임)에 따라 요산의 분해 농도 및 효소 활성을 산출하였으며; 효소 활성은 37℃의 최적 반응 온도에서 최적의 반응 pH가 9.5인 경우, 분당 1μmol의 요산을 알란토인으로 형질 전환하는데 필요한 효소량을 1 활성 단위(U)로 정의하였다.
UV/RI(자외선 및 굴절 인덱스 검출기 병용)와 직렬로 연결된 SEC-HPLC를 사용하여 폴리에틸렌 글리콜 요산 산화효소의 평균 변형도를 검출하였다. 단백질은 자외선 280nm에서 최대 흡수 피크를 가지고 있으나 상기 파장에서 PEG는 흡수가 없으며 시차 굴절률 검출기에 의한 일정 범위 내에서 단백질과 PEG의 흡수값은 다양한 농도에 비례한다. 따라서 PEG 기준 물질 및 PHC물리 화학적 기준 물질을 사용하여 외부 표준 방식으로 페길화 요산 산화효소 중 PEG 부분의 함량과 단백질 부분의 함량을 얻을 수 있으며, 나아가 다음 계산 방식으로 각 요산 산화효소 단량체에서 PEG 분자의 수, 즉 평균 변형도를 구할 수 있다.
PEG 요산 산화효소 평균 변형도=(요산 산화효소 서브유닛 상대 분자량×샘플 내 PEG의 양)/(PEG 상대 분자량×샘플 내 단백질의 양)
여기서, PHC 물리 화학적 기준 물질, PEG 기준 물질, PU5 변형 생성물의 SEC-HPLC-UV/RI 검출 스펙트럼을 도 1 내지 도 5에 나타내었다.
실시예 2에서 상이한 공급비 하에 얻어진 폴리에틸렌 글리콜 옥시우리카아제의 효소 활성 및 평균 변형도를 표 1에 나타내었다.
단백질:5K-PEG의 공급 몰비 | 효소 활성 | 효소 활성 유지 | 평균 변형도 |
변형되지 않은 단백질 | 11.4U/mg | 100% | 0 |
1:55 | 11.7 U/mg | 102.6% | 11.3 |
1:68 | 12.1 U/mg | 106.1% | 11.7 |
1:82 | 11.9U/mg | 104.4% | 12.1 |
1:95 | 12.3U/mg | 107.9% | 12.2 |
참고: 평균 변형도는 각 요산 산화효소 단량체에 결합된 PEG 분자의 수를 나타낸다.
표 1로부터 본 발명의 폴리에틸렌 글리콜 요산 산화효소의 평균 변형도는 11 이상에서 안정화되고, 효소 활성은 비 변형된 요산 산화효소의 효소 활성보다 유지율이 높으며, 효소 활성이 감소하지 않고 오히려 증가하고 있고 또한 상대적으로 안정적임을 알 수 있는데, 이는 시판되는 약물인 Krystexx(pegloticase)와는 완전히 다르다. Savient사의 특허(CN1264575C, 도 2A-도 3B)에 개시된 내용 및 당업자의 일반적인 인식에 따르면, 5kD PEG의 변형도가 증가함에 따라 효소 활성은 유의하게 감소된다. 그러나 예상외로 본 발명에서 얻은 폴리에틸렌 글리콜 우리카아제는 11 이상의 평균 변형도에서 변형되지 않은 때에 비해 효소 활성이 크게 변화하지 않았다. 따라서 본 발명의 폴리에틸렌 글리콜 요산 산화효소는 시판되는 약물과 비교하여 폴리에틸렌 글리콜 평균 변형도가 더 높고, 효소 활성 유지 측면에서도 예상치 못한 기술적 효과를 얻었다. 발명인의 추측에 따르면, 이는 폴리에틸렌 글리콜 요산 산화효소의 PEG 변형도 또는 변형 부위의 차이에 기인한 것일 수 있다.
발명인이 SEQ ID NO: 2-7의 단백질을 변형할 때에도 유사한 기술적 효과가 얻어졌다. 즉 5kd 변형도가 11보다 큰 경우, 효소 활성이 거의 감소되지 않는 PEG화된 요산 산화효소가 얻어졌다.
3.2 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 부위 검출
아래 단계에서, 발명인은 실시예 2에서 얻은 요산 산화효소에 대한 변형 부위 검출을 수행하였다.
폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소의 PEG 변형 부위는 먼저 하나 또는 하나 이상의 효소로 비 페길화 및 페길화 요산 산화효소를 소화한 후, 크로마트그래피 검출을 통해 크로마토그램, 즉 펩타이드 맵을 획득함으로써 확인할 수 있다. 비 페길화 및 페길화 요산 산화효소는 1회 효소 소화(Lys-C 또는 Trypsin) 및/또는 이중 효소 소화(Lys-C 및 Trypsin 병용)를 통해 소화될 수 있다. 역상 컬럼으로 소화 단편을 분리하고, 내부 참조 펩타이드 단편 보정 및 펩타이드 단편의 소실 또는 감소 비율의 비교를 통해 폴리에틸렌 글리콜 요산 산화효소의 변형 부위를 판단하였다.
트립신 및 Lys-C이중 효소 소화 품질 펩타이드 맵의 변형 부위 분석 원리: Lys-C는 라이신(K)의 C 말단을 특이적으로 소화할 수 있고, 트립신은 염기성 아미노산인 아르기닌(R)과 라이신(K)을 소화 부위로 사용하여 C 말단 펩타이드를 특이적으로 소화한다. PHC와 PU5의 소화 전후 대응되는 각 펩타이드 단편의 변화 상황을 비교하고, 내부 표준 펩타이드 단편과 결합하여 PEG 변형 펩타이드 단편의 감소 또는 소실의 상대적 비율을 분석하고 확인할 수 있다. 펩타이드 단편의 감소 또는 소실의 상대적 비율을 통해 펩타이드 단편의 상기 라이신 부위가 PEG에 의해 변형되었는지 여부 및 변형된 비율을 판단할 수 있다. PEG 변형은 불균일한 변형이며, 어느 부위의 변형 비율이 높다는 것은 해당 부위가 변형된 것으로 간주될 수 있음에 유의해야 한다.
구체적으로 설명하면 다음과 같다.
(1) 샘플 처리: 요산 산화효소 및 페길화 요산 산화효소를 취하여 각각 소화 완충액(25mmol/L Tris-HCl, 20% 아세토니트릴, pH 9.0)으로 용해시켜 1mg/ml로 희석하고, 각 희석 용액 100μl를 취하여 2μl의 Lys-C를 첨가하고 37℃에서 4시간 동안 소화시켰다. 이어서 상기 용액을 판크레아틴 반응관(비율 1:100)에 옮기고 37도에서 2시간 동안 소화를 계속한 후, 4μl의 TCEP환원 용액을 첨가하여 30분 동안 반응을 계속한 후, 1mol/L 염산 용액 10μl를 첨가하여 반응을 종료하였다.
(2) 분석 조건:
기기: Thermo Ultimate 3000 HPLC 및 MSQ Plus;
크로마트그래피 컬럼: Welch Materials μltimate®XB-C18(4.6mmХ250mm, 5μm);
분석 조건: A 용액(0.1% TFA 함유 수용액), B 용액(0.1% TFA 함유 아세토니트릴 용액);
구배: 0-70min, B는 3-70%;
LC 검출 파장: 214nm.
이온 소스: ESI;
이온 유형: 양이온;
콘 전압: 50V;
스캐닝 범위: 300-2000Da;
스캐닝 시간: 1S;
컬럼후 흐름 전환: 약 0.3ml/min.
100μl의 샘플을 주입하고 크로마토그램을 기록하였다.
(3) 결과 처리:
요산 산화효소와 페길화 요산 산화효소의 크로마토그램(펩타이드 맵)을 비교하고, 차등 펩타이드 단편의 면적 감소의 상대적 비율을 산출하였다.
(4) 실험 결과를 표 2 내지 표 5, 및 도 6 ~ 도 7에 나타내었다.
펩타이드 단편 | 소화 부위 | 서열 | 이론적 분자량(Da) | 실제 측정된 분자량 |
T1 | 3 | TYK | 410.47 | 410.2 |
T2 | 4 | K | 146.189 | / |
T3 | 17 | NDEVEFVRTGYGK | 1513.627 | / |
T2+T3 | KNDEVEFVRTGYGK | 1641.089 | 1642.2 | |
T4 | 21 | DMIK | 505.63 | 505.4 |
T5 | 30 | VLHIQRDGK | 1065.241 | 1065 |
T6 | 35 | YHSIK | 646.744 | 646.5 |
T7 | 48 | EVATTVQLTLSSK | 1376.57 | / |
T8 | 49 | K | 146.189 | / |
T9 | 66 | DYLHGDNSDVIPTDTIK | 1903.032 | 1903 |
T10 | 74 | NTVNVLAK | 858.005 | 857.7 |
T11 | 76 | FK | 293.366 | 293.1 |
T12 | 79 | GIK | 316.401 | 316.2 |
T13 | 97 | SIETFAVTICEHFLSSFK | 2059.364 | 2059 |
T14 | 112 | HVIRAQVYVEEVPWK | 1853.154 | 1852.8 |
T15 | 116 | RFEK | 578.669 | 578.4 |
T16 | 120 | NGVK | 416.478 | 417.2 |
T17 | 152 | HVHAFIYTPTGTHFCEVEQIRNGPPVIHSGIK | 3586.088 | 3586.2 |
T18 | 155 | DLK | 374.437 | 374.1 |
T19 | 158 | VLK | 358.481 | 358.2 |
T20 | 169 | TTQSGFEGFIK | 1214.34 | 1213.8 |
T21 | 179 | DQFTTLPEVK | 1177.32 | 1176.8 |
T22 | 190 | DRCFATQVYCK | 1333.543 | 1333.2 |
T23 | 215 | WRYHQGRDVDFEATWDTVRSIVLQK | 3106.45 | 3106.5 |
T24 | 222 | FAGPYDK | 796.878 | 796.5 |
T25 | 231 | GEYSPSVQK | 994.069 | 993.7 |
T26 | 266 | TLYDIQVLTLGQVPEIEDMEISLPNIHYLNIDMSK | 4046.66 | 4046.1 |
T27 | 272 | MGLINK | 674.856 | / |
T28 | 285 | EEVLLPLDNPYGK | 1486.685 | 1486.6 |
T27+ T28 | MGLINK EEVLLPLDNPYGK | 2143.54 | 2143.2 | |
T29 | 291 | ITGTVK | 617.743 | 617.4 |
T30 | 293 | RK | 302.377 | / |
T31 | 298 | LSSRL | 574.678 | 574.4 |
펩타이드 단편 | 서열위치 | 서열 | 이론적 상대 분자량[Da] | 실제 측정된 분자량 |
T1 | 1-3 | TYK | 410.470 | 410.3 |
T2 | 4 | K | 146.189 | / |
T3 | 5-12 | NDEVEFVR | 1007.068 | / |
T2+3 | 4-12 | KNDEVEFVR | 1135.4 | |
T4 | 13-17 | TGYGK | 524.574 | 524.5 |
T5 | 18-21 | DMIK | 505.630 | 505.5 |
T6 | 22-27 | VLHIQR | 764.926 | 764.8 |
T7 | 28-30 | DGK | 318.330 | / |
T8 | 31-35 | YHSIK | 646.744 | 646.7 |
T9 | 36-48 | EVATTVQLTLSSK | 1376.570 | / |
T10 | 49 | K | 146.189 | / |
T11 | 50-66 | DYLHGDNSDVIPTDTIK | 1903.032 | 1903.4 |
T12 | 67-74 | NTVNVLAK | 858.005 | 857.9 |
T13 | 75-76 | FK | 293.366 | 293.1 |
T14 | 77-79 | GIK | 316.401 | / |
T15 | 80-97 | SIETFAVTICEHFLSSFK | 2059.364 | 2059.6 |
T16 | 98-101 | HVIR | 523.636 | 523.6 |
T17 | 102-112 | AQVYVEEVPWK | 1347.534 | 1347.4 |
T18 | 113 | R | 174.203 | / |
T19 | 114-116 | FEK | 422.481 | / |
T18+19 | 113-116 | RFEK | 578.684 | 578.6 |
T20 | 117-120 | NGVK | 416.478 | 417.1 |
T21 | 121-141 | HVHAFIYTPTGTHFCEVEQIR | 2485.802 | 2486.8 |
T22 | 142-152 | NGPPVIHSGIK | 1118.301 | 1118.8 |
T21+22 | 121-152 | 3586.103 | 3587.7 | |
T23 | 153-155 | DLK | 374.437 | / |
T24 | 156-158 | VLK | 358.481 | 358.3 |
T25 | 159-169 | TTQSGFEGFIK | 1214.340 | 1214.2 |
T26 | 170-179 | DQFTTLPEVK | 1177.320 | 1177.2 |
T27 | 181-181 | DR | 289.291 | / |
T28 | 182-190 | CFATQVYCK | 1062.267 | / |
T27+28 | 181-190 | 1333.558 | 1333.6 | |
T29 | 191-192 | WR | 360.416 | 360.1 |
T30 | 193-197 | YHQGR | 659.702 | 659.6 |
T31 | 198-209 | DVDFEATWDTVR | 1453.528 | 1453.6 |
T32 | 210-215 | SIVLQK | 686.850 | 686.8 |
T33 | 216-222 | FAGPYDK | 796.878 | 796.8 |
T34 | 223-231 | GEYSPSVQK | 994.069 | 994.1 |
T35 | 262-266 | TLYDIQVLTLGQVPEIEDMEISLPNIHYLNIDMSK | 4046.660 | 4047 |
T36 | 267-272 | MGLINK | 674.856 | 674.7 |
T37 | 273-285 | EEVLLPLDNPYGK | 1486.685 | 1486.7 |
T36+37 | 2143.541 | 2143.6 | ||
T38 | 286-291 | ITGTVK | 617.743 | 617.7 |
T39 | 292 | R | 174.203 | / |
T40 | 293 | K | 146.189 | / |
T41 | 294-297 | LSSR | 461.519 | 461.5 |
T42 | 298 | L | 131.175 | / |
PU5 펩타이드 단편의 피크 면적 감소 백분율의 계산 방법:
다음 공식을 이용하여 PHC의 농도와 동일한 PU5 농도에서 대응되는 PU5 펩타이드 단편의 피크 면적을 계산할 수 있다.
A1=A0Хt
여기서, A1은 2개의 내부 참조 펩타이드 단편의 변환 후 PU5 펩타이드 단편 피크 면적이고, A0은 PU5 펩타이드 맵 펩타이드 단편의 실제 측정된 피크 면적이며, t는 T30, T31 내부 참조 펩타이드 단편에서 PHC 펩타이드 맵과 PU5 펩타이드 맵의 피크 면적 비율의 평균값, 즉 0.588이다.
펩타이드 단편 번호 | 서열 | PHC 펩타이드 맵 | PU5 펩타이드 맵 | PHC와 PU5 피크 면적 비율 | |||
보유 시간 | 피크 면적 | 보유 시간 | 피크 면적 | 각 값 | 평균값 | ||
T30 | YHQGR | 7.5 | 13.4 | 7.467 | 22.9 | 0.585 | 0.588 |
T31 | DVDFEATWDTVR | 28.31 | 35.5 | 28.28 | 60.1 | 0.591 |
내부 참조로 변환된 펩타이드 단편의 피크 면적 및 PHC펩타이드 맵의 피크 면적으로 다음 공식을 이용하여 PU5펩타이드 맵에서 특정 펩타이드 단편의 피크 면적 감소의 상대적 백분율을 계산할 수 있다.
P(%)=(A2-A1)/A2×100%
여기서, A2는 PHC펩타이드 맵에서 특정 펩타이드 단편의 피크 면적이고, A1은 내부 참조로 변환 후 PU5에서 상기 펩타이드 단편의 피크 면적이다.
펩타이드 단편 위치 | 펩타이드 단편 서열 | 펩타이드 단편의 감소된 피크 면적의 상대적 비율 |
1-3 | TYK | 100.00% |
4-12 | KNDEVEFVR | 94.07% |
31-35 | YHSIK | 100.00% |
75-76 | FK | 82.27% |
80-97 | SIETFAVTICEHFLSSFK | 100.00% |
102-112 | AQVYVEEVPWK | 100.00% |
113-116 | RFEK | 100.00% |
117-120 | NGVK | 100.00% |
121-152 | HVHAFIYTPTGTHFCEVEQIRNGPPVIHSGIK | 100.00% |
193-197 | YHQGR | 내부 참조 펩타이드 단편 |
198-209 | DVDFEATWDTVR | 내부 참조 펩타이드 단편 |
216-222 | FAGPYDK | 91.37% |
223-231 | GEYSPSVQK | 86.40% |
232-266 | TLYDIQVLTLGQVPEIEDMEISL PNIHYLNIDMSK |
100.00% |
273-285 | EEVLLPLDNPYGK | 100.00% |
본 실시예의 단백질 서열(SEQ ID NO:1)의 분석으로부터 요산 산화효소의 변형을 위한 잠재적 부위는 T1, K3, K4, K17, K21, K30, K35, K48, K49, K66, K74, K76, K79, K97, K112, K116, K120, K152, K155, K158, K169, K179, K190, K215, K222, K231, K266, K272, K285, K291, K293 등 31개 부위임을 알 수 있다.
표 2, 표 3, 표 4, 표 5 및 도 6의 분석에 나타낸 바와 같이, 실시예 2에서 얻은 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소 변형 부위의 분석으로부터 PU5 소화 후 펩타이드 단편이 90% 이상 소실된 부위는 K3, K4, K35, K97, K112, K116, K120, K152, K222, K266, K285이고, PU5 소화 후 펩타이드 단편이 80% ~ 90% 범위 내에서 소실된 부위는 K76, K231이며, PU5에서 이러한 부위는 모두 변형됨을 알 수 있다.
아울러 발명인은 본 발명의 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소는 시판되는 약물과 비교하여 더 많은 변형 부위를 가지며 유의한 차이를 갖는다는 것을 발견하였다. 예를 들어, 1회 효소에 대한 소화를 통해, 본 발명의 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소에서 K30, K35, K222 및 K231 이 4개 부위가 위치하는 펩타이드 단편의 소실률은 80% 이상이나, 시판되는 유사 약물 Krystexx(pegloticase)를 해당 방법으로 분석한 결과, 이들 4개 부위가 위치하는 펩타이드 단편은 거의 소실되지 않았다. 즉 시판되는 유사 약물은 K30, K35, K222 및 K231 이 4개 부위에서 발생하는 변형률이 본 발명의 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소보다 훨씬 낮았다. 이 밖에, 본 발명의 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소는 시판되는 약물에 비해 유의하게 낮은 면역원성을 갖는데, 이는 변형 부위의 수 및 변형 부위의 차이와 관련이 있을 수 있다고 발명인은 추측하고 있다. 다른 변형 부위와 변형도로 인해 체내에서 효소의 면역원성 부위에 대한 보호와 및 효소 활성 중심의 노출은 모두 상이하다. 상기 차이는 체내에서 다른 변형 효소의 생물학적 성질의 차이를 유발할 수 있다.
동물에서 본 발명의 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소(PU5)의 동물 체내 약물 평가는 하기에서 상세히 설명될 것이다. 여기서, 실험에 사용된 pegloticase는 배치 번호 5085B로 시판되는 유사 약물을 의미한다.
실시예4: 폴리에틸렌 글리콜 요산 산화효소의 체내 약력학 연구
4.1, 모델 랫트에서 폴리에틸렌 글리콜 요산 산화효소의 생체내 약효 평가
옥사지네이트 음용수와 고요산 사료를 병용하여 만성 고요산혈증 모델 랫트를 유도함으로써 랫트의 만성 고요산혈증에 대한 폴리에틸렌 글리콜 요산 산화효소(PU5)의 치료 효과를 평가하였다.
40마리의 모델 랫트를 선택하여 무작위로 4개의 군, 즉 모델군, 저용량 페길화 우리카아제 투여군(0.3mg/kg), 중용량 페길화 우리카아제 투여군(1.0mg/kg), 고용량 페길화 우리카아제 투여군(3.0mg/kg)으로 나누었다. 군 당 10마리, 추가로 10마리의 정상 SD 랫트를 블랭크 대조군으로 선택하여 모델 구축 시험을 연속 5주 동안 진행하였고, 모델 구축 시작 1주일 후 근육내 투여를 시작하였다. 연속 4주 동안 주 1회씩 투여하여 투여전과 투여 후 7일째 랫트의 혈청 요산, 혈청 요소질소, 혈청 크레아티닌 수준을 측정하고, 시험 종료 후 랫트 신장의 조직학적 변화를 관찰하였다.
도 8의 결과는 블랭크 대조군과 비교하여 모델 구축 후 7일, 14일, 21일, 28일 및 35일째에 모델 대조군 혈중 요산 수치가 모두 유의하게 증가하였음을 나타낸다. 모델 구축7일 후 모델군 랫트의 혈청 요소질소, 크레아티닌 및 요산은 각각 블랭크군 랫트의 2.73배, 2.40배 및 7.83배였다. 신장 병리학적 관점에서(도 9에 도시된 바와 같음), 모델 대조군의 세뇨관 확장, 괴사, 염증 및 섬유화 점수가 모두 유의하게 증가하고, 아울러 요산염 결정의 수도 유의하게 증가하였다. 중간 및 고용량의 시험물질인 페길화 우리카아제는 모두 용량 의존적 관계를 나타내는 혈청 요산 수준을 유의하게 감소시켰다. 14일 ~ 35일까지의 기간 동안 중용량군의 평균 혈중 요산 수치는 303.80-660.60μmol/L로 유지되었고, 고용량군의 평균 혈중 요산 수치는 153.70-403.40μmol/L로 유지되었다. 모델군과 비교하여 중용량군의 혈중 요산 감소폭은 34.46-67.94%이고; 고용량군의 혈중 요산 감소폭은 65.67-83.78%이였다. 모델 대조군 과 비교하여 페길화 우리카아제의 각 투여군은 세뇨관 확장, 신장 괴사 및 염증에 모두 유의한 개선 효과를 갖는다.
4.2, 랫트 체내에서 폴리에틸렌 글리콜 요산 산화효소의 1회 투여 평가
36마리의 SD 랫트(반은 암컷, 반은 수컷)를 6개 군(표 6 참조), 즉 시판 약물 Pegloticase 정맥내 주사군, 근육내 주사군, 폴리에틸렌 글리콜 요산 산화효소 정맥내 주사군 및 폴리에틸렌 글리콜 요산 산화효소 저용량, 중용량 및 고용량(0.5, 1.0, 2.0mg/kg) 근육내 주사군으로 무작위로 나누었다. 구체적인 투여 요법 및 용량을 표 6에 나타내었다. 경정맥에서 채혈하여 PK 및 PD를 검출하였다.
번호 | 군별 | 투여 경로 | 투여 빈도 | 용량 (mg/kg) |
투여 농도 (mg/ml) |
투여 부피 (ml/kg) |
동물의 수(마리) | |
수컷 | 암컷 | |||||||
1 | pegloticase 정맥내 주사군 | 정맥내 주사 | 1회 | 1.0 | 0.1 | 10.0 | 3 | 3 |
2 | pegloticase근육내 주사군 | 근육내 주사 | 1회 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 3 | 3 |
3 | PU5 정맥내 주사군 | 정맥내 주사 | 1회 | 1.0 | 0.1 | 10.0 | 3 | 3 |
4 | PU5 저용량 근육내 주사군 | 근육내 주사 | 1회 | 0.5 | 0.5 | 1.0 | 3 | 3 |
5 | PU5 중용량 근육내 주사군 | 근육내 주사 | 1회 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 3 | 3 |
6 | PU5 고용량 근육내 주사군 | 근육내 주사 | 1회 | 2.0 | 2.0 | 1.0 | 3 | 3 |
4.2.1, 약동학적 비교
SD 랫트는 투여 전 모든 개체의 혈청 약물 농도 수준이 모두 정량 하한치(LLOQ: 312.500ng/mL)보다 낮고, 0.5, 1.0, 2.0mg/kg의 1회 근육내 주사 시, 0 ~ 168h(0 ~ 7일)의 기간 동안 페길화 우리카아제 주사액(PU5)의 혈청 약물 농도는 용량 의존적이였으며 용량이 증가함에 따라 전반적인 수준이 증가하였다. 168h 후, pegloticase 근육내 투여군의 혈중 약물 농도는 정량 하한치보다 낮은 반면, PU5 근육내 투여군은 240h 이상까지 계속 유지되었다.
투여후, 1.0mg/kg Pegloticase 정맥내 주사 및 근육내 주사군, 1.0mg/kg 페길화 우리카아제 주사액 정맥내 주사 및 0.5, 1.0, 2.0mg/kg페길화 우리카아제 주사액 근육내 주사군 각각의 암컷과 수컷 SD 랫트 체내 Cmax(C5min) 비율은 0.75 ~ 0.99 범위 내이고, AUClast 비율은 0.54 ~ 0.94 범위 내이며, AUC0-∞ 비율은 0.58 ~ 0.97 범위 내이다. 이로부터 Pegloticase와 페길화 우리카아제(PU5) 주사액의 SD 랫트 체내 노출 수준에는 성별에 따른 유의한 차이가 없음을 알 수 있다.
그러나, SD 랫트에 동일한 용량(1.0mg/kg)의 시판 약물 Pegloticase를 투여한 정맥내 투여군의 AUClast는 426.48±65.34이고, 근육내 주사군의 AUClast는 264.19±78.22이며; PU5 주사액 정맥내 투여군의 AUClast는 565.61±161.60이고, 근육내 주사군의 AUClast는 337.86±227.34였다. 동일한 용량 및 동일한 투여 방식 조건하에 PU5의 AUClast는 시판 약물 Pegloticase보다 높다.
SD 랫트에 동일한 용량(1.0mg/kg)의 시판 약물 Pegloticase를 투여한 정맥내 투여군의 t1/2(h)는 49.51±8.12이고, 근육내 투여군의 t1/2(h)은 55.21±13.50이며, PU5 주사액 정맥내 투여군의 t1/2(h)는 86.12±33.82이고, 근육내 투여군의 t1/2(h)는 60.45±21.37이였다. 동일한 용량 및 동일한 투여 방식 조건하에 PU5 주사액의 t1/2(h)는 시판 약물 Pegloticase보다 길다.
상기 약동학 결과는 표 7 ~ 표 12, 도 10 ~ 도 12에 나타내었다.
채취 시간 (h) |
수컷 | 암컷 | 암컷+수컷 | ||||||||||||
1M001 | 1M002 | 1M003 | N | Mean | SD | 1F001 | 1F002 | 1F003 | N | Mean | SD | N | Mean | SD | |
0 | BLQ | BLQ | BLQ | 0 | / | / | BLQ | BLQ | BLQ | 0 | / | / | 0 | / | / |
0.08333 | 8.03 | 7.466 | 8.078 | 3 | 7.858 | 0.340 | 6.495 | 6.402 | 7.828 | 3 | 6.908 | 0.798 | 6 | 7.383 | 0.756 |
0.5 | 8.042 | 7.352 | 7.926 | 3 | 7.773 | 0.369 | 6.257 | 6.141 | 7.618 | 3 | 6.672 | 0.821 | 6 | 7.223 | 0.830 |
2 | 5.917 | 7.235 | 6.914 | 3 | 6.689 | 0.687 | 6.056 | 5.875 | 6.836 | 3 | 6.256 | 0.511 | 6 | 6.472 | 0.591 |
4 | 7.598 | 7.047 | 6.757 | 3 | 7.134 | 0.427 | 5.595 | 4.922 | 7.164 | 3 | 5.894 | 1.150 | 6 | 6.514 | 1.031 |
8 | 7.144 | 5.852 | 6.492 | 3 | 6.496 | 0.646 | 5.005 | 4.121 | 5.748 | 3 | 4.958 | 0.815 | 6 | 5.727 | 1.069 |
24 | 4.992 | 3.923 | 4.469 | 3 | 4.461 | 0.535 | 3.764 | 3.341 | 4.862 | 3 | 3.989 | 0.785 | 6 | 4.225 | 0.654 |
48 | 3.552 | 2.934 | 3.304 | 3 | 3.263 | 0.311 | 2.988 | 2.415 | 3.836 | 3 | 3.080 | 0.715 | 6 | 3.172 | 0.503 |
72 | 3.009 | 2.271 | 2.422 | 3 | 2.567 | 0.390 | 2.223 | 1.994 | 3.103 | 3 | 2.440 | 0.585 | 6 | 2.504 | 0.450 |
120 | 1.522 | 1.483 | 1.246 | 3 | 1.417 | 0.149 | 0.985 | 1.098 | 1.734 | 3 | 1.272 | 0.404 | 6 | 1.345 | 0.284 |
168 | 0.652 | 0.629 | 0.316 | 3 | 0.532 | 0.188 | 0.497 | 0.672 | 0.726 | 3 | 0.632 | 0.120 | 6 | 0.582 | 0.151 |
240 | BLQ | BLQ | BLQ | 0 | / | / | BLQ | BLQ | BLQ | 0 | / | / | 0 | / | / |
336 | BLQ | BLQ | BLQ | 0 | / | / | BLQ | BLQ | BLQ | 0 | / | / | 0 | / | / |
참고: "/"는 관련 정보가 없음을 의미한다.
채취 시간 | 수컷 | 암컷 | 암컷+수컷 | ||||||||||||
(h) | 3M001 | 3M002 | 3M003 | N | Mean | SD | 3F001 | 3F002 | 3F003 | N | Mean | SD | N | Mean | SD |
0 | BLQ | BLQ | BLQ | 0 | / | / | BLQ | BLQ | BLQ | 0 | / | / | 0 | / | / |
0.08333 | 7.364 | 9.941 | 7.74 | 3 | 8.348 | 1.392 | 7.236 | 5.991 | 6.657 | 3 | 6.628 | 0.623 | 6 | 7.488 | 1.348 |
0.5 | 7.316 | 9.469 | 7.693 | 3 | 8.159 | 1.150 | 7.051 | 5.513 | 6.36 | 3 | 6.308 | 0.770 | 6 | 7.234 | 1.340 |
2 | 7.742 | 9.084 | 7.338 | 3 | 8.055 | 0.914 | 6.063 | 5.522 | 6.44 | 3 | 6.008 | 0.461 | 6 | 7.032 | 1.294 |
4 | 7 | 8.837 | 6.997 | 3 | 7.611 | 1.061 | 6.508 | 5.735 | 6.288 | 3 | 6.177 | 0.398 | 6 | 6.894 | 1.064 |
8 | 6.628 | 7.43 | 6.61 | 3 | 6.889 | 0.468 | 5.387 | 4.85 | 5.52 | 3 | 5.252 | 0.355 | 6 | 6.071 | 0.971 |
24 | 4.672 | 5.628 | 4.746 | 3 | 5.015 | 0.532 | 4.291 | 3.919 | 4.129 | 3 | 4.113 | 0.187 | 6 | 4.564 | 0.609 |
48 | 3.307 | 4.264 | 3.497 | 3 | 3.689 | 0.507 | 3.406 | 3.042 | 3.014 | 3 | 3.154 | 0.219 | 6 | 3.422 | 0.456 |
72 | 2.933 | 3.762 | 3.124 | 3 | 3.273 | 0.434 | 2.859 | 2.596 | 2.319 | 3 | 2.591 | 0.270 | 6 | 2.932 | 0.494 |
120 | 1.986 | 2.279 | 1.989 | 3 | 2.085 | 0.168 | 1.604 | 1.617 | 1.454 | 3 | 1.558 | 0.091 | 6 | 1.822 | 0.313 |
168 | 1.268 | 1.742 | 1.391 | 3 | 1.467 | 0.246 | 1.187 | 1.031 | 0.699 | 3 | 0.972 | 0.249 | 6 | 1.220 | 0.350 |
240 | 0.67 | 1.19 | 0.734 | 3 | 0.865 | 0.284 | BLQ | BLQ | BLQ | 0 | / | / | 3 | 0.865 | 0.284 |
336 | BLQ | 0.853 | 0.368 | 2 | 0.611 | 0.343 | BLQ | BLQ | BLQ | 0 | / | / | 2 | 0.611 | 0.343 |
참고: "/"는 관련 정보가 없음을 의미한다.
채취 시간 | 수컷 | 암컷 | 암컷+수컷 | ||||||||||||
(h) | 2M001 | 2M002 | 2M003 | N | Mean | SD | 2F001 | 2F002 | 2F003 | N | Mean | SD | N | Mean | SD |
0 | BLQ | BLQ | BLQ | 0 | / | / | BLQ | BLQ | BLQ | 0 | / | / | 0 | / | / |
0.5 | 0.652 | BLQ | 0.581 | 2 | 0.617 | 0.050 | 0.388 | BLQ | BLQ | 1 | 0.388 | / | 3 | 0.540 | 0.137 |
2 | 1.337 | 1.249 | 1.62 | 3 | 1.402 | 0.194 | 1.172 | 1.135 | BLQ | 2 | 1.154 | 0.026 | 5 | 1.303 | 0.194 |
4 | 2.298 | 1.699 | 2.348 | 3 | 2.115 | 0.361 | 1.812 | 1.371 | 0.773 | 3 | 1.319 | 0.521 | 6 | 1.717 | 0.593 |
8 | 2.56 | 2.058 | 2.396 | 3 | 2.338 | 0.256 | 1.915 | 1.657 | 1.273 | 3 | 1.615 | 0.323 | 6 | 1.977 | 0.474 |
24 | 3.808 | 3.235 | 3.309 | 3 | 3.451 | 0.312 | 2.947 | 2.808 | 2.493 | 3 | 2.749 | 0.233 | 6 | 3.100 | 0.456 |
48 | 3.188 | 2.618 | 2.749 | 3 | 2.852 | 0.299 | 2.317 | 2.279 | 1.729 | 3 | 2.108 | 0.329 | 6 | 2.480 | 0.495 |
72 | 2.694 | 2.263 | 2.211 | 3 | 2.389 | 0.265 | 1.984 | 2.016 | 1.261 | 3 | 1.754 | 0.427 | 6 | 2.072 | 0.471 |
120 | 1.56 | 1.169 | 1.332 | 3 | 1.354 | 0.196 | 0.884 | 1.111 | 0.174 | 3 | 0.723 | 0.489 | 6 | 1.038 | 0.480 |
168 | BLQ | 0.341 | 0.869 | 2 | 0.605 | 0.373 | BLQ | 0.635 | BLQ | 1 | 0.635 | / | 3 | 0.615 | 0.265 |
240 | BLQ | BLQ | BLQ | 0 | / | / | BLQ | BLQ | BLQ | 0 | / | / | 0 | / | / |
336 | BLQ | BLQ | BLQ | 0 | / | / | BLQ | BLQ | BLQ | 0 | / | / | 0 | / | / |
참고: "/"는 관련 정보가 없음을 의미한다.
채취 시간 | 수컷 | 암컷 | 암컷+수컷 | ||||||||||||
(h) | 5M001 | 5M002 | 5M003 | N | Mean | SD | 5F001 | 5F002 | 5F003 | N | Mean | SD | N | Mean | SD |
0 | BLQ | BLQ | BLQ | 0 | / | / | BLQ | BLQ | BLQ | 0 | / | / | 0 | / | / |
0.5 | BLQ | 1.421 | 0.328 | 2 | 0.875 | 0.773 | BLQ | BLQ | BLQ | 0 | / | / | 2 | 0.875 | 0.773 |
2 | BLQ | 2.295 | 0.923 | 2 | 1.609 | 0.970 | 0.593 | 0.905 | 0.674 | 3 | 0.724 | 0.162 | 5 | 1.078 | 0.695 |
4 | 0.729 | 2.897 | 1.648 | 3 | 1.758 | 1.088 | 1.356 | 1.222 | 0.762 | 3 | 1.113 | 0.312 | 6 | 1.436 | 0.798 |
8 | 1.305 | 3.628 | 2.054 | 3 | 2.329 | 1.186 | 1.559 | 1.249 | 1.266 | 3 | 1.358 | 0.174 | 6 | 1.844 | 0.926 |
24 | 2.408 | 4.617 | 3.069 | 3 | 3.365 | 1.134 | 3.01 | 2.339 | 2.216 | 3 | 2.522 | 0.427 | 6 | 2.943 | 0.895 |
48 | 2.068 | 3.877 | 2.4 | 3 | 2.782 | 0.963 | 2.739 | 2.298 | 2.189 | 3 | 2.409 | 0.291 | 6 | 2.595 | 0.668 |
72 | 1.76 | 3.606 | 2.027 | 3 | 2.464 | 0.998 | 2.385 | 1.761 | 1.863 | 3 | 2.003 | 0.335 | 6 | 2.234 | 0.712 |
120 | 1.042 | 2.9 | 1.107 | 3 | 1.683 | 1.054 | 1.169 | 0.811 | 0.926 | 3 | 0.969 | 0.183 | 6 | 1.326 | 0.782 |
168 | 0.479 | 2.419 | 0.631 | 3 | 1.176 | 1.079 | 0.595 | BLQ | BLQ | 1 | 0.595 | / | 4 | 1.031 | 0.928 |
240 | BLQ | 1.303 | BLQ | 1 | 1.303 | / | BLQ | BLQ | BLQ | 0 | / | / | 1 | 1.303 | / |
336 | BLQ | 0.719 | BLQ | 1 | 0.719 | / | BLQ | BLQ | BLQ | 0 | / | / | 1 | 0.719 | / |
참고: "/"는 관련 정보가 없음을 의미한다.
용량 | 성별 | 파라미터 | t1/2 | C5min | AUClast | AUC0-∞ | Vz | Cl | MRTlast |
(mg/kg) | (h) | (μg/mL) | (h*μg/mL) | (h*μg/mL) | (mL/kg) | (mL/h/kg) | (h) | ||
1.0 (Pegloticase) |
수컷 | N | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 |
Mean | 45.70 | 7.86 | 448.57 | 484.58 | 136.90 | 2.08 | 52.36 | ||
SD | 7.57 | 0.34 | 42.16 | 46.96 | 26.57 | 0.19 | 2.58 | ||
암컷 | N | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | |
Mean | 53.32 | 6.91 | 404.38 | 453.63 | 173.91 | 2.26 | 54.64 | ||
SD | 7.98 | 0.80 | 86.21 | 90.21 | 43.64 | 0.40 | 2.62 | ||
암컷+수컷 | N | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | |
Mean | 49.51 | 7.39 | 426.48 | 469.11 | 155.40 | 2.17 | 53.50 | ||
SD | 8.12 | 0.76 | 65.34 | 66.52 | 38.14 | 0.30 | 2.64 | ||
1.0 (PU5) |
수컷 | N | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 |
Mean | 105.16 | 8.35 | 692.29 | 794.77 | 186.76 | 1.31 | 90.87 | ||
SD | 41.08 | 1.39 | 128.22 | 197.50 | 24.94 | 0.29 | 14.06 | ||
암컷 | N | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | |
Mean | 67.09 | 6.63 | 438.93 | 535.17 | 180.63 | 1.88 | 58.58 | ||
SD | 9.24 | 0.62 | 26.51 | 59.13 | 11.64 | 0.21 | 2.76 | ||
암컷+수컷 | N | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | |
Mean | 86.12 | 7.49 | 565.61 | 664.97 | 183.70 | 1.59 | 74.73 | ||
SD | 33.82 | 1.35 | 161.60 | 192.92 | 17.73 | 0.39 | 19.87 |
용량 | 성별 | 파라미터 | t1/2 | Tmax | Cmax | AUClast | AUC0-∞ | Vz_F | Cl_F | MRTlast |
(mg/kg) | (h) | (h) | (μg/mL) | (h*μg/mL) | (h*μg/mL) | (mL/kg) | (mL/h/kg) | (h) | ||
1.0 (Pegloticase) |
수컷 | N | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 |
Mean | 58.31 | 24.00 | 3.45 | 318.23 | 405.13 | 203.75 | 2.54 | 60.57 | ||
SD | 20.10 | 0.00 | 0.31 | 15.37 | 80.13 | 42.90 | 0.54 | 6.54 | ||
암컷 | N | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | |
Mean | 52.12 | 24.00 | 2.75 | 210.14 | 278.56 | 276.83 | 3.72 | 51.27 | ||
SD | 4.78 | 0.00 | 0.23 | 79.35 | 60.90 | 50.57 | 0.91 | 15.28 | ||
암컷+수컷 | N | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | |
Mean | 55.21 | 24.00 | 3.10 | 264.19 | 341.85 | 240.29 | 3.13 | 55.92 | ||
SD | 13.50 | 0.00 | 0.46 | 78.22 | 94.12 | 57.97 | 0.93 | 11.68 | ||
0.5 (PU5) |
수컷 | N | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 |
Mean | 63.57 | 24.00 | 1.93 | 181.10 | 233.11 | 199.06 | 2.21 | 60.26 | ||
SD | 18.68 | 0.00 | 0.26 | 79.19 | 48.71 | 56.50 | 0.45 | 23.89 | ||
암컷 | N | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | |
Mean | 48.20 | 24.00 | 1.91 | 170.63 | 205.87 | 167.09 | 2.56 | 55.67 | ||
SD | 17.38 | 0.00 | 0.14 | 41.99 | 61.41 | 21.47 | 0.67 | 11.48 | ||
암컷+수컷 | N | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | |
Mean | 55.88 | 24.00 | 1.92 | 175.87 | 219.49 | 183.07 | 2.38 | 57.97 | ||
SD | 18.20 | 0.00 | 0.19 | 56.98 | 51.77 | 42.05 | 0.54 | 16.95 | ||
1.0 (PU5) |
수컷 | N | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 |
Mean | 70.47 | 24.00 | 3.36 | 439.83 | 504.61 | 225.86 | 2.57 | 84.20 | ||
SD | 28.55 | 0.00 | 1.13 | 307.66 | 344.91 | 54.21 | 1.32 | 31.10 | ||
암컷 | N | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | |
Mean | 50.44 | 24.00 | 2.52 | 235.90 | 293.04 | 252.46 | 3.46 | 58.28 | ||
SD | 5.05 | 0.00 | 0.43 | 58.01 | 45.24 | 46.82 | 0.50 | 6.96 | ||
암컷+수컷 | N | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | |
Mean | 60.45 | 24.00 | 2.94 | 337.86 | 398.83 | 239.16 | 3.02 | 71.24 | ||
SD | 21.37 | 0.00 | 0.89 | 227.34 | 248.66 | 47.59 | 1.02 | 24.65 | ||
2.0 (PU5) |
수컷 | N | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 |
Mean | 66.65 | 24.00 | 4.84 | 590.58 | 649.31 | 292.61 | 3.10 | 85.42 | ||
SD | 20.11 | 0.00 | 0.46 | 59.68 | 55.26 | 64.39 | 0.27 | 19.91 | ||
암컷 | N | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | |
Mean | 72.51 | 32.00 | 4.55 | 537.05 | 628.72 | 339.98 | 3.22 | 79.26 | ||
SD | 15.56 | 13.86 | 0.91 | 124.85 | 78.17 | 100.19 | 0.42 | 9.60 | ||
암컷+수컷 | N | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | |
Mean | 69.58 | 28.00 | 4.70 | 563.81 | 639.01 | 316.30 | 3.16 | 82.34 | ||
SD | 16.40 | 9.80 | 0.66 | 92.30 | 61.59 | 79.67 | 0.32 | 14.38 |
4.2.2, 생체내 약효 비교(요산)
0.5, 1.0, 2.0mg/kg 페길화 우리카아제 주사액을 1회 근육내 주사하여 투여 1일, 3 일 후 요산 농도는 낮은 수준으로 유지되었고, 투여 7일 후 각 용량군의 요산 수준은 회복되기 시작하였으며, 용량이 높을 수록 요산이 체내에서 낮은 수치를 유지하는 시간이 더 길었다. 동일한 용량의 정맥내 주사군을 비교하였을 때, PU5 정맥내 주사군은 pegloticase 정맥내 주사군에 비해 낮은 혈청 요산 농도를 더 오래 유지하였고, PU5 근육내 주사군은 pegloticase 근육내 주사군에 비해 낮은 혈청 요산 농도를 더 오래 유지하였다. 동일한 용량군을 비교하였을 때, PU5 정맥내 주사 또는 근육내 주사군은 pegloticase 정맥내 주사군 또는 근육내 주사군에 비해 낮은 혈청 요산 농도를 더 오래 유지하였는 바, 즉 PU5는 각각의 경우에 모두 pegloticase에 비해 낮은 체내 요산 농도를 더 오래 유지하였으며, 그 결과를 도 13에 나타내었다.
4.3, 랫트 체내에서 폴리에틸렌 글리콜 요산 산화효소의 여러 회 투여 평가
해당 시험에는 4개 군, 즉 시판 약물 Pegloticase 정맥내 주사군, 근육내 주사군, 페길화 우리카아제 주사액(PU5) 정맥내 주사군, 근육내 주사군이 설정되고, 군 당 8마리(반은 수컷, 반은 암컷)씩 총 32마리의 SD 랫트로 구성되었다. Pegloticase 및 페길화 우리카아제 주사액 정맥내 주사군은 정맥내 주사를 시행하고; Pegloticase 및 페길화 우리카아제 주사액 근육내 주사군은 근육내 주사를 시행하였다. 투여량은 모두 1.0mg/kg이고, 주 당 1회씩 연속 4회 투여하였다.
결과 분석으로부터 SD 랫트에 1.0mg/kg Pegloticase 및 페길화 우리카아제 주사액을 여러 회 정맥/근육내 주사한 랫트의 일반적인 상황은 약물과 관련된 비정상적인 변화가 없었음을 알 수 있다.
4.3.1 항-PEG 항체 검출
SD 랫트에 연속 4회 투여하였다. 1차 투여전에는 모든 개체 동물에서 항-PEG 항체 및 항-PHC 항체가 모두 검출되지 않았고; 투여 종료 후에 모든 동물에서 항-PHC 항체가 검출되지 않았으며, Pegloticase 정맥내, 근육내 주사군, 페길화 우리카아제 주사액 정맥내 주사군, 근육내 주사군에서 각각 항-PEG 항체가 검출되었고, 양성 결과 비율은 각각 3/8, 1/8, 1/8, 1/8이였다. PEG 면역 조직 화학적 검사 결과, pegloticase 정맥내 주사군 및 근육내 주사군의 비장, 간 및 신장에서는 약한 PEG양성 발현이 관찰되었고, 페길화 우리카아제 주사액 정맥내 주사군 및 근육내 주사군에서는 PEG 양성 발현이 관찰되지 않았으며, 그 결과를 표 13에 나타내었다.
이상 분석으로부터 PU5 및 pegloticase에 의해 생성된 항체는 요산 산화효소 부분에 대한 항체가 아니라 주로 PEG 부분에 대한 항체임을 알 수 있으며, 이는 둘 다 요산 산화효소의 면역원성 부위를 효과적으로 은폐할 수 있음을 의미한다. PEG항체의 생성은 체내에서 일부 부작용을 일으킬 수 있는데, 표 13의 결과에 따르면 본 발명의 PU5 면역원성은 시판 생성물 pgeloticase보다 낮음을 알 수 있다.
PEG 항체 및 PEG 면역 조직 화학적 검사 결과로부터 근육내 투여에서 PU5 및 pegloticase 모두 정맥내 투여군보다 우수하였으며, 그중 정맥내 투여군에서 생성된 항-PEG 항체는 PU5가 pegloticase보다 우수하였고; 근육내 투여군에서 생성된 항-PEG 항체는 PU5가 pegloticase보다 우수하였다.
발생율(Incidence) | |||||||||
pegloticase 정맥내 주사군 | pegloticase근육내 주사군 | PU5 정맥내 주사군 | PU5 근육내 주사군 | ||||||
현미경 관찰 | 수컷 | 암컷 | 수컷 | 암컷 | 수컷 | 암컷 | 수컷 | 암컷 | |
비장 | 총 검사 횟수: | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 |
--PEG, 백색 펄프 | 1 | 0 | 1 | 1 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
총 발생예의 수: | 0 | 1 | 1 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
--PEG, 적색 펄프 | 1 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
총 발생예의 수: | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
간 | 총 검사 횟수: | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 |
--PEG, 혈관 내피세포/쿠퍼세포 | 1 | 4 | 4 | 1 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 |
총 발생예의 수: | 4 | 4 | 1 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
신장 | 총 검사 횟수: | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 |
--PEG, 신세뇨관 | 1 | 3 | 1 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
총 발생예의 수: | 3 | 1 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
-- PEG, 혈관 내피세포 | 1 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
총 발생예의 수: | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
양성 등급: 1=매우 약한 양성, 2=약한 양성, 3=중간 양성, 4=강한 양성.
4.3.2 약동학 검출
SD 랫트에 Pegloticase 및 페길화 우리카아제 주사액을 여러 회 정맥내, 근육내 주사 후, 각 그룹 동물의 주요 약동학 파라미터는 유의한 성별 차이를 나타내지 않았다. 4회 연속 투여후, 2종의 약물은 랫트 체내에 약간 축적되었다.
SD 랫트에 동일한 용량(1.0mg/kg)의 시판 약물 Pegloticase를 여러 회 정맥 /근육내 주사 투여한 경우, 1차 투여 후, 랫트 체내에서의 절대 생체 이용률은 각각 51.35%이였고; 마지막 투여 후, 랫트 체내에서의 절대 생체 이용률은 각각 45.98%이였다. SD 랫트에 동일한 용량(1.0mg/kg)의 페길화 우리카아제 주사액을 여러 회 정맥 /근육내 주사 투여한 경우, 1차 투여후, 랫트 체내에서의 절대 생체 이용률은 각각 58.29%이였고; 마지막 투여 후, 랫트 체내에서의 절대 생체 이용률은 각각 52.60%이였다.
4.3.3 생체내 약효 비교(요산)
SD 랫트에 1.0mg/kg Pegloticase 및 페길화 우리카아제 주사액을 4회 연속(1회/주) 정맥내, 근육내 주사하였다. 혈청 요산 농도는 각각의 투여 후에 모두 낮은 수준으로 유지되었고, Pegloticase 근육내 주사군은 마지막 투여 14일 후 회복되었으며, 나머지 각 그룹은 마지막 투여 18일 후 회복되었다. 동일한 용량의 시판 약물 Pegloticase와 비교하여 2종 약물 정맥내 주사군의 유지 시간은 비교적 일치하였으나, 페길화 우리카아제 주사액 근육내 주사군의 유지 시간은 시판 약물보다 길었는 바, 즉 근육내 투여에서 PU5의 효능은 Pegloticase보다 우수하였다.
상기 결과는 표 14 ~ 표 17, 도 14 ~ 도 19에 도시된 바와 같다.
시험 시간 | 용량 | 성별 | 파라미터 | t1/2 | Tmax | Cmax | AUClast | AUC0-∞ | Vz | Cl | MRTlast |
약물 명칭 | (h) | (h) | (μg/mL) | (h*μg/mL) | (h*μg/mL) | (mL/kg) | (mL/h/kg) | (h) | |||
Day1 | 1.0mg/kg Pegloticase |
수컷 | N | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 |
Mean | 72.17 | 2.13 | 11.12 | 632.58 | 778.65 | 133.74 | 1.29 | 56.91 | |||
SD | 4.53 | 1.44 | 0.28 | 25.32 | 45.00 | 4.49 | 0.07 | 1.17 | |||
암컷 | N | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | ||
Mean | 66.24 | 0.50 | 8.84 | 514.21 | 633.80 | 149.07 | 1.59 | 54.93 | |||
SD | 17.91 | 0.00 | 1.07 | 50.98 | 64.84 | 27.23 | 0.16 | 7.58 | |||
암컷+수컷 | N | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | ||
Mean | 69.21 | 1.31 | 9.98 | 573.40 | 706.22 | 141.41 | 1.44 | 55.92 | |||
SD | 12.51 | 1.28 | 1.42 | 73.43 | 93.08 | 19.84 | 0.20 | 5.13 | |||
1.0mg/kg PU5 |
수컷 | N | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | |
Mean | 67.98 | 1.75 | 9.47 | 527.73 | 634.48 | 158.66 | 1.60 | 55.50 | |||
SD | 8.87 | 1.66 | 0.91 | 91.07 | 91.12 | 39.53 | 0.22 | 0.89 | |||
암컷 | N | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | ||
Mean | 79.29 | 1.38 | 6.42 | 369.05 | 481.09 | 238.12 | 2.16 | 59.68 | |||
SD | 17.07 | 1.75 | 0.61 | 49.11 | 98.31 | 15.34 | 0.53 | 2.84 | |||
암컷+수컷 | N | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | ||
Mean | 73.63 | 1.56 | 7.94 | 448.39 | 557.79 | 198.39 | 1.88 | 57.59 | |||
SD | 13.97 | 1.59 | 1.78 | 108.54 | 120.10 | 50.74 | 0.48 | 2.96 | |||
Day22 | 1.0mg/kg Pegloticase |
수컷 | N | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 |
Mean | 135.63 | 1.75 | 12.33 | 1159.18 | 1300.99 | 149.28 | 0.78 | 118.29 | |||
SD | 40.45 | 1.66 | 0.94 | 134.20 | 208.65 | 28.13 | 0.13 | 9.91 | |||
암컷 | N | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | ||
Mean | 96.09 | 0.88 | 8.02 | 672.95 | 747.61 | 186.89 | 1.35 | 92.46 | |||
SD | 7.69 | 0.75 | 0.87 | 78.50 | 78.66 | 24.21 | 0.14 | 9.52 | |||
암컷+수컷 | N | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | ||
Mean | 115.86 | 1.31 | 10.17 | 916.07 | 1024.30 | 168.09 | 1.07 | 105.37 | |||
SD | 34.25 | 1.28 | 2.45 | 279.12 | 329.86 | 31.53 | 0.33 | 16.48 | |||
1.0mg/kg PU5 |
수컷 | N | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | |
Mean | 149.80 | 2.25 | 9.00 | 840.78 | 947.08 | 229.16 | 1.07 | 117.99 | |||
SD | 24.68 | 2.02 | 0.73 | 91.96 | 104.82 | 36.69 | 0.11 | 6.88 | |||
암컷 | N | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | ||
Mean | 103.90 | 1.25 | 6.63 | 576.81 | 636.52 | 236.33 | 1.63 | 101.66 | |||
SD | 21.25 | 0.87 | 0.72 | 128.81 | 128.02 | 17.98 | 0.39 | 20.03 | |||
암컷+수컷 | N | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | ||
Mean | 126.85 | 1.75 | 7.82 | 708.79 | 791.80 | 232.75 | 1.35 | 109.82 | |||
SD | 32.51 | 1.54 | 1.44 | 175.05 | 198.21 | 27.02 | 0.40 | 16.38 |
시험 시간 | 용량 | 성별 | 파라미터 | t1/2 | Tmax | Cmax | AUClast | AUC0-∞ | Vz_F | Cl_F | MRTlast |
약물 명칭 | (h) | (h) | (μg/mL) | (h*μg/mL) | (h*μg/mL) | (mL/kg) | (mL/h/kg) | (h) | |||
Day1 | 1.0mg/kg Pegloticase |
수컷 | N | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 |
Mean | 59.68 | 24.00 | 3.16 | 318.22 | 395.66 | 217.53 | 2.54 | 62.05 | |||
SD | 13.70 | 0.00 | 0.38 | 29.92 | 29.26 | 49.49 | 0.19 | 6.59 | |||
암컷 | N | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | ||
Mean | 80.53 | 24.00 | 2.80 | 270.69 | 415.60 | 282.07 | 2.48 | 57.80 | |||
SD | 16.48 | 0.00 | 0.36 | 66.91 | 84.31 | 37.74 | 0.52 | 6.21 | |||
암컷+수컷 | N | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | ||
Mean | 70.11 | 24.00 | 2.98 | 294.46 | 405.63 | 249.80 | 2.51 | 59.92 | |||
SD | 17.91 | 0.00 | 0.39 | 54.29 | 59.39 | 53.39 | 0.36 | 6.35 | |||
1.0mg/kg PU5 |
수컷 | N | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | |
Mean | 82.25 | 6.00 | 3.06 | 290.64 | 403.89 | 294.92 | 2.50 | 61.83 | |||
SD | 9.79 | 2.31 | 0.25 | 34.67 | 48.73 | 29.13 | 0.31 | 6.88 | |||
암컷 | N | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | ||
Mean | 70.44 | 48.00 | 2.21 | 232.11 | 306.59 | 340.32 | 3.50 | 66.28 | |||
SD | 13.41 | 19.60 | 0.26 | 59.53 | 90.62 | 46.97 | 1.09 | 10.28 | |||
암컷+수컷 | N | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | ||
Mean | 76.34 | 27.00 | 2.63 | 261.38 | 355.24 | 317.62 | 3.00 | 64.06 | |||
SD | 12.57 | 25.90 | 0.51 | 54.89 | 85.10 | 43.56 | 0.91 | 8.44 | |||
Day22 | 1.0mg/kg Pegloticase |
수컷 | N | 3 | 4 | 4 | 4 | 3 | 3 | 3 | 4 |
Mean | 198.20 | 25.00 | 3.18 | 486.70 | 799.90 | 353.52 | 1.35 | 112.01 | |||
SD | 83.85 | 18.00 | 0.85 | 298.21 | 293.71 | 23.56 | 0.42 | 60.30 | |||
암컷 | N | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | ||
Mean | 97.92 | 20.00 | 2.69 | 355.77 | 427.75 | 344.97 | 2.65 | 94.51 | |||
SD | 33.98 | 8.00 | 0.71 | 134.18 | 155.69 | 88.41 | 1.19 | 30.45 | |||
암컷+수컷 | N | 7 | 8 | 8 | 8 | 7 | 7 | 7 | 8 | ||
Mean | 140.90 | 22.50 | 2.93 | 421.23 | 587.25 | 348.64 | 2.09 | 103.26 | |||
SD | 76.12 | 13.17 | 0.77 | 225.23 | 283.63 | 64.14 | 1.12 | 45.20 | |||
1.0mg/kg PU5 |
수컷 | N | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | |
Mean | 140.04 | 15.00 | 2.52 | 395.82 | 478.83 | 610.95 | 9.64 | 102.76 | |||
SD | 90.61 | 10.52 | 1.15 | 255.45 | 300.26 | 419.13 | 16.09 | 61.50 | |||
암컷 | N | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | ||
Mean | 122.51 | 30.00 | 2.41 | 349.84 | 428.61 | 416.41 | 2.82 | 103.39 | |||
SD | 59.33 | 12.00 | 0.50 | 178.08 | 204.30 | 72.32 | 1.36 | 44.91 | |||
암컷+수컷 | N | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | ||
Mean | 131.27 | 22.50 | 2.46 | 372.83 | 453.72 | 513.68 | 6.23 | 103.08 | |||
SD | 71.52 | 13.17 | 0.82 | 205.33 | 239.26 | 297.23 | 11.18 | 49.85 |
성별 측정 시간 |
1.0mg/kg Pegloticase 정맥내 주사군 |
1.0mg/kg Pegloticas 근육내 주사군 |
1.0mg/kg PU5 정맥내 주사군 |
1.0mg/kg PU5 근육내 주사군 |
||||
n | n | n | n | |||||
수컷 | ||||||||
1차 투여전 | 4 | 71.250± 19.103 | 4 | 62.250± 5.315 | 4 | 58.750± 7.632 | 4 | 50.750± 6.850 |
1차 투여후 3일 | 4 | 0.250± 0.500 | 4 | 0.500± 0.577 | 4 | 0± 0 | 4 | 0± 0 |
2차 투여전 | 4 | 0.500± 0.577 | 4 | 69.750± 46.133 | 4 | 0.500± 0.577 | 4 | 0.250± 0.500 |
2차 투여후 3일 | 4 | 1.000± 0 | 4 | 20.750± 40.178 | 4 | 0.500± 0.577 | 4 | 17.500± 33.670 |
3차 투여전 | 4 | 1.000± 0 | 4 | 26.500± 30.116 | 4 | 1.250± 0.957 | 4 | 18.000± 32.680 |
3차 투여후 3일 | 4 | 1.000± 0.816 | 4 | 19.000± 37.336 | 4 | 0.500± 0.577 | 4 | 20.500± 38.336 |
4차 투여전 | 4 | 0± 0 | 4 | 15.500± 31.000 | 4 | 0.250± 0.500 | 4 | 19.250± 37.170 |
4차 투여후 1일 | 4 | 0.750± 0.500 | 4 | 1.750± 1.500 | 4 | 0.750± 0.500 | 4 | 9.750± 16.840 |
4차 투여후 3일 | 4 | 0.500± 0.577 | 4 | 10.500± 21.000 | 4 | 0± 0 | 4 | 12.750± 24.838 |
4차 투여후 7일 | 4 | 0.250± 0.500 | 4 | 22.250± 44.500 | 4 | 0± 0 | 4 | 16.250± 31.837 |
4차 투여후 10일 | 4 | 0± 0 | 4 | 20.000± 38.670 | 4 | 0.250± 0.500 | 4 | 16.000± 30.681 |
4차 투여후 14일 | 4 | 1.250± 0.500 | 4 | 29.250± 28.123 | 4 | 2.000± 0.816 | 4 | 19.250± 30.015 |
4차 투여후 18일 | 4 | 25.000± 10.296 | 4 | 53.500± 14.933 | 4 | 24.000± 13.614 | 4 | 50.000± 29.833 |
암컷 | ||||||||
1차 투여전 | 4 | 61.250± 8.057 | 4 | 63.000± 15.470 | 4 | 50.250± 7.500 | 4 | 43.250± 9.743 |
1차 투여후 3일 | 4 | 0± 0 | 4 | 0± 0 | 4 | 0.250± 0.500 | 4 | 0± 0 |
2차 투여전 | 4 | 42.000± 48.132 | 4 | 38.250± 44.507 | 4 | 0.500± 0.577 | 4 | 4.000± 7.348 |
2차 투여후 3일 | 4 | 0.250± 0.500 | 4 | 40.250± 41.080 | 4 | 0.250± 0.500 | 4 | 0.500± 0.577 |
3차 투여전 | 4 | 19.500± 35.01 | 4 | 46.750± 28.547 | 4 | 1.000± 0.816 | 4 | 13.500± 25.000 |
3차 투여후 3일 | 4 | 1.250± 0.500 | 4 | 0.500± 0.577 | 4 | 0.750± 0.500 | 4 | 0.750± 0.500 |
4차 투여전 | 4 | 0.250± 0.500 | 4 | 33.750± 40.285 | 4 | 0.500± 0.577 | 4 | 3.750± 6.850 |
4차 투여후 1일 | 4 | 0.750± 0.500 | 4 | 3.000± 2.708 | 4 | 0.500± 0.577 | 4 | 1.250± 0.500 |
4차 투여후 3일 | 4 | 0.250± 0.500 | 4 | 0± 0 | 4 | 0± 0 | 4 | 0± 0 |
4차 투여후 7일 | 4 | 0.250± 0.500 | 4 | 6.750± 12.842 | 4 | 1.000± 0 | 4 | 1.750± 1.258 |
4차 투여후 10일 | 4 | 0± 0 | 4 | 8.500± 16.340 | 4 | 0.250± 0.500 | 4 | 2.000± 2.828 |
4차 투여후 14일 | 4 | 6.750± 7.089 | 4 | 33.500± 19.689 | 4 | 1.500± 0.577 | 4 | 9.500± 8.699 |
4차 투여후 18일 | 4 | 48.000± 24.993 | 4 | 54.750± 4.031 | 4 | 14.000± 6.00. | 4 | 32.000± 13.638 |
본 명세서의 설명에서, 용어 "일 실시예", "일부 실시예", "예시", "구체 예시" 또는 "일부 예시"등을 참조한 설명은 해당 실시예 또는 예시를 결부하여 설명된 구체적 특징, 구조, 재료 또는 특성이 본 발명의 적어도 하나의 실시예 또는 예시에 포함됨을 의미한다. 본 명세서에서 상기 용어에 대한 개략적 표현은 반드시 동일한 실시예 또는 예시를 지칭하는 것은 아니다. 또한, 설명된 구체적 특징, 구조, 재료 또는 특성은 적합한 방식으로 임의의 하나 또는 하나 이상의 실시예 또는 예시에서 결합될 수 있다. 이 밖에, 당업자는 서로 모순되지 않는 한 본 명세서에 설명된 상이한 실시예 또는 예시 및 상이한 실시예 또는 예시의 특징을 결합 및 조합할 수 있다.
이상 본 발명의 실시예를 도시하고 설명하였으나, 상기 실시예는 예시적이며 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안됨을 이해할 수 있다. 당업자라면 본 발명의 범위 내에서 상기 실시예를 변경, 수정, 대체 및 변형할 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> HANGZHOU GRAND BIOLOGIC PHARMACEUTICAL INC.
PEG-BIO BIOPHARM CO., LTD. (CHONGQING)
<120> POLYETHYLENE GLYCOL-MODIFIED URATE OXIDASE
<130> PIDC3196280P
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 298
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Amino acid sequence of chimeric uricase (pig-baboon) derived from pig and baboon
<400> 1
Thr Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe Val Arg Thr Gly Tyr Gly
1 5 10 15
Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His Ile Gln Arg Asp Gly Lys Tyr His
20 25 30
Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Thr Val Gln Leu Thr Leu Ser Ser Lys
35 40 45
Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp Val Ile Pro Thr Asp Thr
50 55 60
Ile Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys Phe Lys Gly Ile Lys Ser
65 70 75 80
Ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu His Phe Leu Ser Ser Phe
85 90 95
Lys His Val Ile Arg Ala Gln Val Tyr Val Glu Glu Val Pro Trp Lys
100 105 110
Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val His Ala Phe Ile Tyr Thr
115 120 125
Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu Gln Ile Arg Asn Gly Pro
130 135 140
Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu Lys Val Leu Lys Thr Thr
145 150 155 160
Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp Gln Phe Thr Thr Leu Pro
165 170 175
Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gln Val Tyr Cys Lys Trp Arg
180 185 190
Tyr His Gln Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu Ala Thr Trp Asp Thr Val
195 200 205
Arg Ser Ile Val Leu Gln Lys Phe Ala Gly Pro Tyr Asp Lys Gly Glu
210 215 220
Tyr Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr Asp Ile Gln Val Leu Thr
225 230 235 240
Leu Gly Gln Val Pro Glu Ile Glu Asp Met Glu Ile Ser Leu Pro Asn
245 250 255
Ile His Tyr Leu Asn Ile Asp Met Ser Lys Met Gly Leu Ile Asn Lys
260 265 270
Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro Tyr Gly Lys Ile Thr Gly
275 280 285
Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu
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<210> 2
<211> 304
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Amino acid sequence of pig-derived urate oxidase
<400> 2
Met Ala His Tyr Arg Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe
1 5 10 15
Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His Ile Gln
20 25 30
Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gln
35 40 45
Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp
50 55 60
Val Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys
65 70 75 80
Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu
85 90 95
His Phe Leu Ser Ser Phe Lys His Val Ile Arg Ala Gln Val Tyr Val
100 105 110
Glu Glu Val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val
115 120 125
His Ala Phe Ile Tyr Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu
130 135 140
Gln Ile Arg Asn Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu
145 150 155 160
Lys Val Leu Lys Thr Thr Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp
165 170 175
Gln Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gln
180 185 190
Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gln Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu
195 200 205
Ala Thr Trp Asp Thr Val Arg Ser Ile Val Leu Gln Lys Phe Ala Gly
210 215 220
Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr
225 230 235 240
Asp Ile Gln Val Leu Thr Leu Gly Gln Val Pro Glu Ile Glu Asp Met
245 250 255
Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Leu Asn Ile Asp Met Ser Lys
260 265 270
Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro
275 280 285
Tyr Gly Arg Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Thr Ser Arg Leu
290 295 300
<210> 3
<211> 297
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Amino acid sequence of chimeric urate oxidase (canine-baboon) derived from canine and baboon
<400> 3
Met Tyr Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys
1 5 10 15
Asp Met Val Lys Val Leu His Ile Gln Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser
20 25 30
Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gln Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys
35 40 45
Asp Tyr Val Tyr Gly Asp Asn Ser Asp Ile Ile Pro Thr Asp Thr Ile
50 55 60
Lys Asn Thr Val His Val Leu Ala Lys Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile
65 70 75 80
Glu Thr Phe Ala Met Asn Ile Cys Glu His Phe Leu Ser Ser Phe Asn
85 90 95
His Val Ile Arg Ala Gln Val Tyr Val Glu Glu Val Pro Trp Lys Arg
100 105 110
Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val His Ala Phe Ile His Asn Pro
115 120 125
Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu Gln Met Arg Ser Gly Pro Pro
130 135 140
Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu Lys Val Leu Lys Thr Thr Gln
145 150 155 160
Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp Gln Phe Thr Thr Leu Pro Glu
165 170 175
Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Lys Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr
180 185 190
His Gln Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu Ala Thr Trp Asp Thr Val Arg
195 200 205
Asp Ile Val Leu Glu Lys Phe Ala Gly Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr
210 215 220
Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr Asp Ile Gln Val His Ser Leu
225 230 235 240
Ser Arg Val Pro Glu Met Glu Asp Met Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile
245 250 255
His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu
260 265 270
Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr
275 280 285
Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu
290 295
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<211> 304
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Amino acid sequence of canine-derived urate oxidase
<400> 4
Met Ala His Tyr His Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe
1 5 10 15
Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Val Lys Val Leu His Ile Gln
20 25 30
Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gln
35 40 45
Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Val Tyr Gly Asp Asn Ser Asp
50 55 60
Ile Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val His Val Leu Ala Lys
65 70 75 80
Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Thr Phe Ala Met Asn Ile Cys Glu
85 90 95
His Phe Leu Ser Ser Phe Asn His Val Ile Arg Ala Gln Val Tyr Val
100 105 110
Glu Glu Val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val
115 120 125
His Ala Phe Ile His Asn Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu
130 135 140
Gln Met Arg Ser Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu
145 150 155 160
Lys Val Leu Lys Thr Thr Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp
165 170 175
Gln Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Lys
180 185 190
Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gln Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu
195 200 205
Ala Thr Trp Asp Thr Val Arg Asp Ile Val Leu Glu Lys Phe Ala Gly
210 215 220
Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr
225 230 235 240
Asp Ile Gln Val His Ser Leu Ser Arg Val Pro Glu Met Glu Asp Met
245 250 255
Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys
260 265 270
Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro
275 280 285
Tyr Gly Arg Ile Thr Gly Thr Ala Lys Arg Lys Leu Ala Ser Lys Leu
290 295 300
<210> 5
<211> 304
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Amino acid sequence of bovine-derived urate oxidase
<400> 5
Met Ala His Tyr His Asn Asp Tyr Gln Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe
1 5 10 15
Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Val Lys Val Leu His Ile Gln
20 25 30
Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gln
35 40 45
Leu Thr Leu Asn Ser Arg Arg Glu Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp
50 55 60
Ile Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val Gln Val Leu Ala Lys
65 70 75 80
Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Thr Phe Ala Met Asn Ile Cys Glu
85 90 95
His Phe Leu Ser Ser Phe Asn His Val Ile Arg Val Gln Val Tyr Val
100 105 110
Glu Glu Val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val
115 120 125
His Ala Phe Ile His Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu
130 135 140
Gln Leu Arg Ser Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu
145 150 155 160
Lys Val Leu Lys Thr Thr Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Leu Lys Asp
165 170 175
Gln Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gln
180 185 190
Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gln Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu
195 200 205
Ala Thr Trp Glu Ala Val Arg Gly Ile Val Leu Lys Lys Phe Ala Gly
210 215 220
Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr
225 230 235 240
Asp Ile Gln Val Leu Ser Leu Ser Gln Leu Pro Glu Ile Glu Asp Met
245 250 255
Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys
260 265 270
Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro
275 280 285
Tyr Gly Arg Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Thr Ser Arg Leu
290 295 300
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<211> 304
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Amino acid sequence of monkey-derived urate oxidase
<400> 6
Met Ala His Tyr His Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe
1 5 10 15
Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Val Lys Val Leu His Ile Gln
20 25 30
Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gln
35 40 45
Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp
50 55 60
Ile Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val His Ala Leu Ala Lys
65 70 75 80
Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Ala Phe Ala Val Asn Ile Cys Gln
85 90 95
His Phe Leu Ser Ser Phe Asn His Val Ile Arg Thr Gln Val Tyr Val
100 105 110
Glu Glu Ile Pro Trp Lys Arg Leu Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val
115 120 125
His Ala Phe Ile His Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu
130 135 140
Gln Leu Arg Ser Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu
145 150 155 160
Lys Val Leu Lys Thr Thr Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp
165 170 175
Gln Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Ala Gln
180 185 190
Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gln Cys Arg Asp Val Asp Phe Glu
195 200 205
Ala Thr Trp Asp Thr Ile Arg Asp Val Val Leu Glu Lys Phe Ala Gly
210 215 220
Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr
225 230 235 240
Asp Ile Gln Val Val Ser Leu Ser Gln Val Pro Glu Ile Asp Asp Met
245 250 255
Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys
260 265 270
Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro
275 280 285
Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu
290 295 300
<210> 7
<211> 304
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Amino acid sequence of baboon-derived urate oxidase
<400> 7
Met Ala Asp Tyr His Asn Asn Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Leu Glu Phe
1 5 10 15
Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Val Lys Val Leu His Ile Gln
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35 40 45
Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp
50 55 60
Ile Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val His Val Leu Ala Lys
65 70 75 80
Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Ala Phe Gly Val Asn Ile Cys Glu
85 90 95
Tyr Phe Leu Ser Ser Phe Asn His Val Ile Arg Ala Gln Val Tyr Val
100 105 110
Glu Glu Ile Pro Trp Lys Arg Leu Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val
115 120 125
His Ala Phe Ile His Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu
130 135 140
Gln Leu Arg Ser Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu
145 150 155 160
Lys Val Leu Lys Thr Thr Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp
165 170 175
Gln Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gln
180 185 190
Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gln Cys Arg Asp Val Asp Phe Glu
195 200 205
Ala Thr Trp Gly Thr Ile Arg Asp Leu Val Leu Glu Lys Phe Ala Gly
210 215 220
Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr
225 230 235 240
Asp Ile Gln Val Leu Ser Leu Ser Arg Val Pro Glu Ile Glu Asp Met
245 250 255
Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys
260 265 270
Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro
275 280 285
Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu
290 295 300
Claims (17)
- 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소로서,
상기 요산 산화효소의 하기 아미노산 부위 중 적어도 11개가 PEG 변형을 갖는 것을 특징으로 하는 요산 산화효소:
T1, K3, K4, K30, K35, K76, K79, K97, K112, K116, K120, K152, K179, K222, K231, K266, K272, K285, K291, K293. - 제1항에 있어서,
하기 4개 아미노산 부위 중 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 4개가 PEG 변형을 갖는 것을 특징으로 하는 요산 산화효소:
K30, K35, K222 및 K231. - 제1항에 있어서,
상기 PEG 변형에 사용되는 폴리에틸렌 글리콜의 분자량은 6KD 이하인 것을 특징으로 하는 요산 산화효소. - 제1항에 있어서,
상기 폴리에틸렌 글리콜은 모노메톡실기 또는 히드록실기를 갖고;
선택적으로, 상기 폴리에틸렌 글리콜은 선형 또는 분지형 구조이며;
선택적으로, 상기 폴리에틸렌 글리콜과 요산 산화효소는 아미드 결합을 통해 접합되고;
바람직하게는, 상기 폴리에틸렌 글리콜은 변형 폴리에틸렌 글리콜이며, 상기 변형 폴리에틸렌 글리콜의 변형기는,
N-히드록시숙신이미드, N-히드록시숙신이미딜카르보네이트, N-히드록시숙신이미딜아세테이트, N-히드록시숙신이미딜프로피오네이트, N-히드록시숙신이미딜부티레이트, N-히드록시숙시닐숙시네이트 및 비스(p-니트로페닐)카보네이트로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하고;
바람직하게는, 상기 변형 폴리에틸렌 글리콜의 변형기는 N-히드록시숙신이미딜프로피오네이트인 것을 특징으로 하는 요산 산화효소. - 제1항에 있어서,
상기 아미노산 부위는 SEQ ID NO:1로 표시되는 아미노산 서열에 의해 위치 결정되고;
선택적으로, 상기 요산 산화효소는 SEQ ID NO:1 ~ 7로 표시되는 아미노산 서열을 갖거나; 또는,
SEQ ID NO:1 ~ 7과 비교하여, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 갖거나; 또는,
SEQ ID NO:1 ~ 7과 비교하여, 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 부가된 폴리펩티드를 갖고;
바람직하게는, 상기 요산 산화효소는 SEQ ID NO:1 ~ 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 요산 산화효소. - 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소로서,
폴리에틸렌 글리콜에 의해 변형되지 않은 상기 요산 산화효소의 펩타이드 맵과 비교하여, 상기 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소의 펩타이드 맵은 적어도 11개의 소정의 펩타이드 단편의 피크 면적 감소 상대적 비율이 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상인 것을 특징으로 하는 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소. - 제6항에 있어서,
상기 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소의 펩타이드 맵은 표 5에 도시된 피크 면적 감소 펩타이드 단편을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소. - 제6항에 있어서,
상기 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소의 펩타이드 맵은 도 6 또는 도 7에 도시된 바와 같은 것을 특징으로 하는 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소. - 약학 조성물로서,
제1항 내지 제8항에 따른 요산 산화효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물. - 제9항에 있어서,
고요산 관련 질환을 치료 또는 예방하기 위해 병용 투여되는 기타 약물을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물. - 고요산 관련 질환을 치료하고, 필요로 하는 피험자의 생물학적 유체에서 요산 수준을 감소시키기 위한 약물 제조에 있어서의 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 요산 산화효소 또는 제9항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 약학 조성물의 용도로서,
선택적으로, 상기 고요산 관련 질환은 만성 고요산혈증, 통풍, 신장 질환, 고요산 관절염, 신장결석, 통풍 결절, 고혈압, 당뇨병, 고중성지방혈증, 대사증후군, 관상동맥심장질환, 동맥경화증, 암 화학 요법으로 인한 고요산혈증으로부터 선택되는 질환을 포함하고;
선택적으로, 상기 생물학적 유체는 소변 또는 혈액인 용도. - 요산 산화효소의 면역원성을 감소시키는 방법으로서,
상기 요산 산화효소의 하기 아미노산 부위 중 적어도 11개가 PEG 변형을 갖도록 하는 것을 특징으로 하는 방법:
T1, K3, K4, K30, K35, K76, K79, K97, K112, K116, K120, K152, K179, K222, K231, K266, K272, K285, K291, K293. - 제12항에 있어서,
상기 요산 산화효소의 하기 4개 아미노산 부위 중 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 4개가 PEG 변형을 갖도록 하는 것을 특징으로 하는 방법:
K30, K35, K222 및 K231. - 제12항에 있어서,
상기 PEG 변형에 사용되는 폴리에틸렌 글리콜의 분자량은 6KD 이하이고;
바람직하게는, 상기 폴리에틸렌 글리콜은 변형 폴리에틸렌 글리콜이며;
바람직하게는, 상기 변형 폴리에틸렌 글리콜의 변형기는 N-히드록시숙신이미드인 방법. - 제12항에 있어서,
상기 아미노산 부위는 SEQ ID NO:1로 표시되는 아미노산 서열에 의해 위치 결정되고;
바람직하게는, 상기 요산 산화효소는 SEQ ID NO:1 ~ 7로 표시되는 아미노산 서열을 갖거나; 또는
SEQ ID NO:1 ~ 7과 비교하여, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 갖거나; 또는,
SEQ ID NO:1 ~ 7과 비교하여, 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 부가된 폴리펩티드를 갖고;
바람직하게는, 상기 요산 산화효소는 SEQ ID NO:1 ~ 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법. - 고요산 관련 질환을 치료 또는 예방하고, 필요로 하는 피험자의 생물학적 유체에서 요산 수준을 감소시키는 방법으로서,
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 요산 산화효소 또는 제9항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 약학 조성물의 치료학적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제16항에 있어서,
상기 고요산 관련 질환은 만성 고요산혈증, 통풍, 신장 질환, 고요산 관절염, 신장결석, 통풍 결절, 고혈압, 당뇨병, 고중성지방혈증, 대사증후군, 관상동맥심장질환, 동맥경화증, 암 화학 요법으로 인한 고요산혈증으로부터 선택되는 질환을 포함하고;
선택적으로, 상기 생물학적 유체는 소변 또는 혈액인 것을 특징으로 하는 방법.
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