PT1100880E - Urato-oxidase - Google Patents

Description

ΕΡ 1 100 880/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Urato-oxidase" Ο presente pedido reivindica a prioridade do Pedido Provisório US n.° 60/095489, apresentado em 6 de Agosto de 1998. A invenção aqui divulgada foi realizada com o apoio do Governo dos EUA sob a subvenção n.° DK48529, atribuída pelo National Institutes of Health. O Governo tem certos direitos na invenção. A presente invenção refere-se, em geral, a proteínas urato-oxidase (uricase) e a moléculas de ácido nucleico que as codificam. Em particular, a invenção refere-se a proteínas uricase que são particularmente úteis como, por exemplo, intermediários para a produção de proteínas uricase modificadas melhoradas com imunogenicidade reduzida e biodisponibilidade acrescida. As proteínas uricase modificadas preferenciais da presente invenção incluem as proteínas uricase covalentemente ligadas a poli(etilenoglicóis) ou poli(óxidos de etileno). O presente pedido descreve, portanto, proteínas uricase, anticorpos que se ligam especificamente às proteínas, moléculas de ácido nucleico que codificam as proteínas uricase e seus fragmentos úteis, vectores contendo as moléculas de ácido nucleico, células hospedeiras contendo os vectores e métodos de utilização e de preparação das proteínas uricase e das moléculas de ácido nucleico.

Antecedentes A gota é a mais comum doença inflamatória das articulações em homens com idade acima de 40 anos (Roubenoff 1990). A artrite gotosa dolorosa ocorre quando um nível elevado de ácido úrico no sangue (hiperuricemia) leva à formação episódica de cristais microscópicos de mono-hidrato de urato monossódico nas articulações. Com o tempo, a hiperuricemia crónica também pode resultar em depósitos de urato cristalinos destrutivos (tofos) ao redor das articulações, nos tecidos moles, e em alguns órgãos (Hershfield 1996) . O ácido úrico tem uma solubilidade limitada 2 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ na urina e quando excretado em excesso (hiperuricosúria) pode causar pedras nos rins (uricolitíase). Em pacientes com determinadas doenças malignas, principalmente leucemia e linfoma, acentuadas hiperuricemia e hiperuricosúria (devido à maior taxa de renovação das células tumorais e à lise durante a quimioterapia) representam um risco grave de insuficiência renal obstrutiva aguda, (Sandberg et ai. 1956; Gold e Fritz 1957; Cohen et al. 1980; Jones et al., 1990). A hiperuricemia grave e a gota estão associadas à disfunção renal por várias causas, incluindo a terapia com ciclosporinas para prevenir a rejeição de aloenxertos de órgãos (West et al. 1987; Venkataseshan et al. 1990; Ahn et al. 1992; Delaney et al. 1992; George e Mandell 1995). A hiperuricemia pode resultar tanto da superprodução como da sub-excreção de urato (Hershfield e Seegmiller 1976; Kelley et al. 1989; Becker e Roessler 1995). Quando a hiperuricemia é leve, pode ser controlada com dieta, mas quando é pronunciada, e associada a graves consequências clinicas, requer tratamento com fármacos, seja um agente uricosúrico que promove a excreção do ácido úrico (ineficaz se a função renal estiver reduzida), ou o inibidor de xantina-oxidase alopurinol, que bloqueia a formação de urato. O alopurinol é o esteio principal da terapia em pacientes com gota tofácea, insuficiência renal, leucemia e algumas doenças hereditárias. O tratamento para a hiperuricemia é geralmente eficaz e bem tolerado. No entanto, alguns pacientes com gota tofácea desfigurante e incapacitante são refractários a todas as terapias convencionais (Becker 1988; Fam 1990; Rosenthal e Ryan, 1995). Além disso, -2% dos pacientes tratados com alopurinol desenvolvem reacções alérgicas, e ocorre uma sindrome de hipersensibilidade grave em -0,4% (Singer e Wallace, 1986; Arellano e Sacristan, 1993) . Esta sindrome, muitas vezes com risco de vida, pode causar insuficiência renal e hepática aguda e lesão grave da pele (necrólise epidérmica tóxica, dermatite esfoliativa, eritema multiforme, sindrome de Stevens-Johnson). O alopurinol também interfere com o metabolismo da azatioprina e da 6-mercaptopurina, fármacos utilizados no tratamento da leucemia e para a prevenção da rejeição de aloenxertos de órgãos, condições em que ocorre hiperuricemia marcada e podem causar gota grave ou ameaçar a função renal. 3 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ

Em última análise, a hiperuricemia é o resultado da inactivação mutacional do gene humano para a urato-oxidase (uricase) durante a evolução (Wu et al., 1989; Wu et al. 1992) . A uricase activa em peroxissomas do fígado da maioria dos primatas não humanos e de outros mamíferos converte urato em alantoína (+ C02 e H202), que é 80-100 vezes mais solúvel que o ácido úrico e é tratada com mais eficiência pelos rins. Uricase parentérica, preparada a partir de Aspergillus flavus (Uricozyme®' Clin-Midy, Paris), tem sido utilizada para tratar a hiperuricemia grave associada com a quimioterapia da leucemia há mais de 20 anos em França e Itália (London e Hudson 1957; Kissel et al. 1968; Brogard et al. 1972; Kissel et al. 1972; Potaux et al. 1975; Zittoun et al. 1976; Brogard et al. 1978; Masera et al. 1982), e tem sido utilizada nos testes clínicos recentes em pacientes com leucemia nos EUA (Pui et al. 1997). A uricase tem um início de acção mais rápido do que o alopurinol (Masera et al. 1982; Pui et al. 1997). Em pacientes com gota, infusões de uricase podem interromper as crises agudas e diminuir o tamanho dos tofos (Kissel et al. 1968; Potaux et al. 1975; Brogard et al. 1978).

Embora eficaz para tratar a hiperuricemia aguda durante um curso curto da quimioterapia, infusões diárias de uricase de A. flavus seriam um grave inconveniente para o tratamento de gota tofácea ou recorrente. Além disso, a eficácia da uricase de A. flavus diminui rapidamente nos pacientes que desenvolvem anticorpos anti-uricase (Kissel et al. 1968; Brogard et al. 1978; Escudier et al. 1984; Mourad et al. 1984; Sibony et al. 1984). Têm ocorrido reacções alérgicas graves, incluindo anafilaxia, (Donadio et al. 1981; Montagnac e Schillinger, 1990; Pui et al. 1997). Uma preparação de uricase de acção mais prolongada e menos imunogénica é claramente necessária para terapia crónica.

Uma abordagem para sequestrar enzimas exógenas de proteases e do sistema imunitário envolve a ligação covalente do polímero atóxico inerte monometoxipolietilenoglicol (PEG) à superfície das proteínas (Harris e Zalipsky 1997). Mostrou-se pela primeira vez que o uso de PEG com Mr ~ 1000 a >10 000 prolonga a vida circulante e reduzir a imunogenicidade de várias proteínas estranhas em animais (Abuchowski et al. 4 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ 1977a; Abuchowski et al. 1977b; Davis et al. 1981a; Abuchowski et al. 1984; Davis et al. 1991). Em 1990, a adenosina-desaminase (ADA) bovina, modificada com PEG de Mr 5000 (PEGADA, ADAGEN®' produzida pela Enzon, Inc.) tornou-se a primeira proteína PEGuilada a ser aprovada pela Food and Drug Administration dos EUA, para o tratamento de doença de deficiência imunitária grave combinada devido à deficiência de ADA (Hershfield et al. 1987). A experiência dos últimos 12 anos mostrou que os anticorpos anti-ADA podem ser detectados por um teste ELISA sensível na maioria dos pacientes durante o tratamento crónico com PEG-ADA, mas não houve nenhuma reacção alérgica ou de hipersensibilidade; ocorreu depuração acelerada de PEG-ADA em alguns pacientes que produzem anticorpos anti-ADA, mas este era geralmente um efeito transitório (Chaffee et al. 1992; Hershfield 1997). Deve notar-se que a função imunitária dos pacientes com deficiência de ADA não costuma tornar-se normal durante o tratamento com PEG-ADA (Hershfield 1995; Hershfield e Mitchell 1995). Assim, a imunogenicidade pode ser um problema mais significativo no desenvolvimento de uma enzima PEGuilada para o tratamento crónico dos pacientes com função imunitária normal.

Imunogenicidade será entendida por uma pessoa competente na matéria como relacionada com a indução de uma resposta imunitária por uma preparação injectada de um antigénio (tal como proteína modificada com PEG ou proteína não modificada), enquanto antigenicidade se refere à reacção de um antigénio com anticorpos pré-existentes. Colectivamente, a antigenicidade e a imunogenicidade são referidas como imunorreatividade. Em estudos anteriores de PEG-uricase, a imunorreatividade foi avaliada por uma variedade de métodos, incluindo: a reacção In vitro de PEG-uricase com anticorpos pré-formados; medições da síntese induzida de anticorpos; e taxas de depuração aceleradas após injecções repetidas.

Mostrou-se que a PEGuilação reduz a imunogenicidade e prolonga a vida circulante de uricases fúngica e suína em animais (Chen et al. 1981; Savoca et al. 1984; Tsuji et al. 1985; Veronese et al. 1997). A uricase de Candida modificada com PEG baixou rapidamente o urato no soro para níveis indetectáveis em 5 voluntários humanos normouricémicos (Davis 5 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ et al. 1981b). A uricase de Arthrobacter PEGuilada produzida por Enzon, Inc. foi usada numa base compassiva para tratar um paciente com hipersensibilidade ao alopurinol com linfoma, que apresentava um quadro de insuficiência renal e hiperuricemia acentuada (Chua et al. 1988; Greenberg e Hershfield 1989). Foram administradas quatro injecções intramusculares durante cerca de duas semanas. Durante este breve período, a hiperuricemia foi controlada e não havia anticorpos anti-uricase detectáveis por ELISA no plasma do paciente. Não foi prosseguido o desenvolvimento e utilização clínica dessa preparação.

Até à data, nenhuma forma de uricase ou PEG-uricase foi desenvolvida que tivesse uma vida circulante suficientemente longa e uma imunogenicidade suficientemente reduzida para uma utilização segura e fiável em terapia crónica. O objectivo da presente invenção é proporcionar uma melhor forma de uricase que, em combinação com a PEGuilação, possa atender a esses requisitos. A invenção é uma uricase recombinante única de derivação de mamífero, que foi modificada por mutação de uma forma que se mostrou melhorar a capacidade de PEGuilação para mascarar epítopos potencialmente imunogénicos.

Sumário da Invenção É um objecto genérico da presente invenção proporcionar novas proteínas uricase e sequências de ácido nucleico que codificam as mesmas. É um outro objecto da presente invenção proporcionar vectores e células hospedeiras contendo as sequências de ácido nucleico aqui descritas e métodos para utilização dos mesmos para produzir as proteínas uricase codificadas pelos mesmos. A actividade uricolítica é aqui expressa em Unidades Internacionais (UI) por mg de proteína, em que uma UI de actividade de uricase é definida como a quantidade de enzima que consome um micromole de ácido úrico por minuto. A presente invenção proporciona uma proteína uricase recombinante de uma espécie de mamífero que tenha sido modificada para inserir um ou mais resíduos de lisina. 6 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ

Proteína recombinante, tal como aqui utilizado, refere-se a qualquer proteína produzida artificialmente e que se distingue das proteínas produzidas naturalmente (isto é, que são produzidas em tecidos de um animal que possui apenas o gene natural para a proteína de interesse específica). Proteína inclui péptidos e sequências de aminoácidos. A proteína uricase recombinante da presente invenção é uma quimera ou um híbrido de duas ou mais proteínas, péptidos ou sequências de aminoácidos de mamífero. Numa concretização, a presente invenção pode ser usada para preparar uma proteína uricase recombinante de uma espécie de mamífero, a qual tenha sido modificada para aumentar o número de lisinas ao ponto em que, após PEGuilação da proteína uricase recombinante, o produto de uricase PEGguilado é substancialmente tão enzimaticamente activo como a uricase não modificada e o produto de uricase PEGuilado não é inaceitavelmente imunogénico. Também são aqui contempladas formas truncadas de uricase da presente invenção em que podem não estar presentes as extremidades amino- e/ou carboxi-terminais da uricase. Preferencialmente, a uricase não é truncada numa extensão tal que sejam removidas lisinas.

Uma pessoa competente na matéria notará que o complexo conjugado transportador-uricase não pode conter tantas ligações que reduza significativamente a actividade enzimática da uricase nem tão poucas ligações que fique inaceitavelmente imunogénica. Preferencialmente, o conjugado reterá, pelo menos, cerca de 70% a cerca de 90% da actividade uricolítica da proteína uricase não modificada enquanto sendo mais estável, de tal forma que retenha a sua actividade enzimática enquanto armazenada, no plasma e/ou soro de mamífero à temperatura fisiológica, em relação à proteína uricase não modificada. A retenção de pelo menos cerca de 80% a cerca de 85% da actividade uricolítica seria aceitável. Além disso, numa concretização preferida, o conjugado proporciona uma imunogenicidade e/ou imunorreatividade substancialmente reduzidas relativamente à proteína uricase não modificada. Numa concretização, a presente invenção proporciona uma proteína uricase aqui descrita que pode ser modificada pela ligação a um transportador farmaceuticamente aceitável, não tóxico, não imunogénico, tal como PEG, por ligação covalente a pelo menos 1 das lisinas contidas na proteína uricase. Alternativamente, a proteína uricase é modificada por ligação 7 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ covalente a um transportador através de menos de cerca de 10 lisinas da sua sequência de aminoácidos. A ligação a qualquer de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 das lisinas estão contempladas como concretizações alternativas.

Uma proteína uricase da presente invenção é uma molécula recombinante que inclui segmentos de proteínas uricase do fígado de suínos e babuínos. É também proporcionada uma sequência modificada de babuíno. Numa concretização, a presente invenção proporciona uma uricase quimérica de porco-babuíno (uricase PBC (SEQ ID NO:2)), que inclui aminoácidos (aa) 1-225 de uricase suína (SEQ ID NO:7) e aa 226-304 de uricase de babuíno (SEQ ID NO: 6) (ver também a sequência na Figura 5). Em outra concretização, a presente invenção proporciona uma uricase quimérica de porco-babuíno (uricase PKS) , que inclui aa 1-288 de uricase suína e aa 289-304 de uricase de babuíno (SEQ ID NO:4). Derivados truncados de PBC e PKS também são contemplados. As formas truncadas preferidas são proteínas PBC e PKS truncadas para excluir os 6 aminoácidos amino-terminais ou os aminoácidos carboxi-terminais, ou ambos. Sequências representativas são dadas em SEQ ID NO:8 (PBC amino-truncada), 9 (PBC carboxi-truncada), 10 (PKS amino-truncada) e 11 (PKS carboxi-truncada) . Cada uma entre uricase PBC, uricase PKS e as suas formas truncadas têm mais uma a quatro lisinas do que as encontradas em outras uricases de mamífero que foram clonadas. A presente invenção proporciona moléculas de ácido nucleico (ADN e ARN) (sequências), incluindo formas isoladas, purificadas e/ou clonadas das moléculas de ácido nucleico, que codificam para as proteínas uricase e proteínas truncadas aqui descritas. Concretizações preferidas são mostradas em SEQ ID NO:l (uricase PBC) e SEQ ID NO:3 (uricase PKS).

Vectores (de expressão e de clonagem), incluindo estas moléculas de ácido nucleico também são proporcionados pela presente invenção.

Além disso, a presente invenção proporciona células hospedeiras contendo estes vectores. 8 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ São também descritos anticorpos que se ligam especificamente às proteínas uricase da presente invenção. Anticorpos contra a porção amino contra a uricase de suíno e anticorpos contra a porção carboxi da uricase de babuíno, quando utilizados em conjunto, devem ser úteis para detecção de PBC, ou outras proteínas quiméricas similares. Preferivelmente, os anticorpos contra a porção amino da uricase quimérica não deverão reconhecer a porção amino da uricase de babuíno e, da mesma forma, o anticorpo contra a porção carboxi da uricase quimérica não deverá reconhecer a porção carboxi da uricase suína. Mais preferivelmente, são proporcionados anticorpos que se ligam especificamente a PBC ou PKS, mas não se ligam a proteínas nativas, como as uricases de suíno e/ou babuíno. A presente invenção pode ser usada para preparar uma composição farmacêutica para reduzir a quantidade de ácido úrico em fluidos corporais, como a urina e/ou soro ou plasma, contendo pelo menos uma das proteínas uricase ou conjugados de uricase aqui descritos e um transportador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis. A presente invenção também pode ser utilizada num método para reduzir a quantidade de ácido úrico em fluidos corporais de um mamífero. 0 método inclui administrar a um mamífero uma quantidade que baixa eficazmente o ácido úrico, de uma composição contendo uma proteína uricase ou conjugado de uricase da presente invenção e um diluente, um transportador ou um excipiente, que são de preferência um transportador, um diluente ou um excipiente farmaceuticamente aceitáveis. O mamífero a tratar é de preferência um ser humano. A etapa de administração pode ser, por exemplo, a injecção por via intravenosa, intradérmica, subcutânea, intramuscular ou intraperitoneal. Os níveis elevados de ácido úrico podem estar no sangue ou na urina, e podem estar associados com gota, tofos, insuficiência renal, transplante de órgãos ou doenças malignas. O presente pedido descreve também um método para isolar e/ou purificar uma uricase a partir de uma solução de uricase contendo, por exemplo, restos celulares e subcelulares de, por 9 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ exemplo, um processo de produção recombinante. Preferivelmente, o método de purificação aproveita a solubilidade limitada da uricase de mamífero a um pH baixo (Conley et al. 1979), por lavagem do extracto recombinante bruto a um pH de cerca de 7 até cerca de 8,5, para remover a maioria das proteínas que são solúveis nesta gama de pH baixo, depois do que a uricase activa é solubilizada num tampão, de preferência um tampão de carbonato de sódio, a um pH de cerca de 10-11, de preferência cerca de 10,2. A uricase activa solubilizada pode então ser aplicada a uma coluna de troca iónica, como uma coluna de Sepharose Q, que é lavada com um gradiente de sal baixo a elevado num tampão a um pH de cerca de 8,5, após o que a uricase purificada é obtida por eluição com um gradiente de cloreto de sódio num tampão de carbonato de sódio a um pH de cerca de 10 a cerca de 11, de preferência cerca de 10,2. A enzima pode ser adicionalmente purificada por cromatografia de filtração em gel a um pH de cerca de 10 a cerca de 11. Nesta fase, a enzima pode ser adicionalmente purificada através da redução do pH para cerca de 8,5 ou menos, para precipitar selectivamente a uricase, mas não contaminantes mais solúveis. Após a lavagem em pH baixo (7-8) a uricase é então solubilizado a um pH de cerca de 10,2. A preparação de uricase pode então ser analisadas por métodos conhecidos na especialidade das preparações farmacêuticas, tais como, por exemplo, qualquer um entre cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), outros métodos cromatográficos, dispersão de luz, centrifugação e/ou electroforese em gel.

Breve descrição dos desenhos

Figura 1. Análise PAGE com SDS e mercaptoetanol (gel a 12%)

Figura 2. Vida circulante de uricase PBC nativa e PEGuilada.

Figura 3. Relação entre a actividade sérica de uricase e as concentrações de ácido úrico no soro e na urina.

Figura 4. Manutenção do nível circulante de actividade de uricase (medido em soro) após injecções repetidas. 10 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ A Figura 5 mostra as sequências deduzidas de aminoácidos de uricase quimérica de porco-babuino (uricase PBC) e uricase suína contendo as mutações R291K e T301S (uricase PKS) , em comparação com as sequências de suíno e de babuíno.

Figura 6. Comparação das sequências de aminoácidos de PKS e de uricase porcina.

Figura 7. Comparação das sequências de aminoácidos de PBC e PKS.

Figura 8. Comparação das sequências de aminoácidos de PBC e de uricase porcina.

Figura 9. Comparação da sequência de aminoácidos de uricase porcina e D3H.

Figura 10. Comparação das sequências de aminoácidos de PBC e D3H.

Figura 11-1 e 11-2. Comparação BestFit (software GCG) das sequências de codificação dos ADNc de PKS e de uricase porcina.

Figura 12-1 e 12-2. Comparação BestFit (software GCG) das sequências de codificação dos ADNc de PKS e de uricase de babuíno.

Figura 13-1 e 13-2. Comparação BestFit (software GCG) das sequências de codificação dos ADNc de PBC e de uricase porcina.

Figura 14-1 e 14-2. Comparação BestFit (software GCG) das sequências de codificação dos ADNc de PBC e de uricase de babuíno.

Descrição detalhada da Invenção A presente invenção proporciona proteínas uricase que são intermediários úteis para conjugados de uricase melhorados de polímeros solúveis em água, preferivelmente poli(etilenoglicóis) ou poli (óxidos de etileno), com uricases. Uricase, como aqui utilizado, inclui subunidades individuais, bem como o tetrâmero nativo, salvo indicação em contrário. 11 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ

Embora os seres humanos não produzam uma enzima activa, transcritos de ARNm de uricase foram amplificadas a partir do ARN do figado humano (Wu et al. 1992). É teoricamente possível que alguns transcritos de uricase humanos sejam traduzidos; mesmo que os produtos peptídicos não tenham o comprimento total ou sejam instáveis, podem ser processados por células apresentadoras de antigénios e desempenhar um papel na determinação da resposta imunitária a uma uricase exógena utilizada para tratamento. Pode, em teoria, ser possível reconstruir e expressar um ADNc de uricase humana eliminando as duas mutações sem sentido ("nonsense") conhecidas. No entanto, na ausência de pressão selectiva, é muito provável que se tenham acumulado no gene humano mutações de sentido errado ("missense") deletérias durante os milhões de anos desde que a primeira mutação sem sentido ("nonsense") foi introduzida (Wu et al., 1989; Wu et al. 1992). Identificar e "corrigir" todas as mutações para obter a máxima actividade catalítica e estabilidade da proteína seria muito difícil.

Os presentes inventores perceberam que há um alto grau de homologia (similaridade) entre a sequência de aminoácidos deduzida da uricase humana e a de suíno (aproximadamente 86%) e de babuíno (cerca de 92%) (ver Figuras 6-14, para exemplo da medida da similaridade), enquanto a homologia (similaridade) entre a uricase humana e a de A. flavus é <40% (Lee et al., 1988; Reddy et al., 1988; Wu et al., 1989; Legoux et al., 1992; Wu et al., 1992). A presente invenção proporciona proteínas uricase quiméricas recombinantemente produzidas de dois mamíferos diferentes, que foram concebidas para serem menos imunorreactivas para os seres humanos do que as mais afastadamente relacionadas enzimas fúngicas ou bacterianas. O uso de um derivado de uricase de mamífero espera-se ser mais aceitável para os pacientes e seus médicos. A experiência mostrou que PEG activados, como tem sido usado para preparar PEG-ADA e modificar outras proteínas ligam-se por via de grupos amino primários do resíduo amino-terminal (quando presente e desbloqueado) e grupos épsilon-amino de lisinas. Esta estratégia é útil tanto porque podem ser usadas condições de reacção suaves, como porque as lisinas positivamente carregadas tendem a estar localizadas na 12 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ superfície das proteínas. Este último ponto é importante pois para qualquer proteína terapêutica os efeitos desejados da PEGuilação dependerão, em parte, das características do polímero PEG (por exemplo, massa, estrutura ramificada ou não ramificada, etc.), bem como do número e distribuição dos locais de ligação a PEG da proteína em relação aos epítopos e elementos estruturais que determinam a função e a depuração da proteína. Foi concebida uma estratégia para aumentar a capacidade da PEGuilação para 'mascarar' epítopos e reduzir a imunogenicidade através da introdução semi-selectiva de novos resíduos de lisina para adição potencial de PEG (Hershfield et ai. 1991). Esta estratégia utiliza mutagénese para substituir codões de arginina seleccionados por codões de lisina, uma substituição que mantém a carga positiva e tem efeito mínimo sobre os índices previstos por computador de probabilidade de superfície e antigenicidade (útil quando somente a sequência de aminoácidos é conhecida).

Como um teste experimental desta estratégia, foi utilizada purina-nucleósido-fosforilase de E. coli (EPNP) recombinante (Hershfield et al., 1991). Foram introduzidas substituições Arg-por-Lys em 3 locais, aumentando o número de lisinas por subunidade de 14 a 17, sem alterar a actividade catalítica. O mutante triplo purificado manteve a totalidade da actividade após a modificação de ~70% dos grupos NH2 acessíveis com excesso de disuccinil-PEG5000. A titulação de grupos amino reactivos antes e depois da PEGuilação sugeriu que o mutante triplo poderia aceitar mais uma cadeia de PEG por subunidade do que a enzima do tipo selvagem. A PEGuilação aumentou a vida circulante tanto das enzimas do tipo selvagem como das EPNP mutantes em ratinhos de ~4 horas para >6 dias. Após uma série de injecções intraperitoneais em intervalos semanais/quinzenais, todos os ratinhos tratados com ambas as EPNP não modificadas, e 10 dos 16 ratinhos (60%) injectados com EPNP do tipo selvagem PEGuilada, desenvolveram altos níveis de anticorpo anti-EPNP e um declínio acentuado na vida circulante. Em contraste, apenas 2/12 ratinhos (17%) tratados com a PEG-EPNP mutante desenvolveram depuração rápida; os baixos níveis de anticorpos nestes ratinhos não se correlacionam com a vida circulante. Esta estratégia foi, assim, bem sucedida para a redução substancial da 13 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ imunogenicidade, embora apenas 1 das 3 novas lisinas ficassem modificadas após o tratamento com PEG activado.

As subunidades de uricase de babuíno e de porco consistem cada uma em 304 aminoácidos, dos quais 29 (ou seja, 1 em cerca de 10 resíduos) são lisinas. As tentativas iniciais para introduzir duas substituições Arg-por-Lys no ADNc clonado para uricase de babuíno, e também uma substituição por Lys de um codão Glu na posição 208, que se sabe ser uma Lys no gene da uricase humana, resultaram numa proteína mutante expressa de babuíno que tinha actividade catalítica de uricase bastante reduzida. Foi evidente a partir desta experiência que a capacidade de manter a actividade da enzima de uricase após a mutação de arginina para lisina da sequência de ADN de mamífero não era previsível.

Posteriormente, foi notado que o resíduo de aminoácido 291 na uricase de babuíno é lisina, mas o resíduo correspondente no porco é arginina. O local de restrição Apal presente em ambos os ADNc foi explorado para construir uma uricase quimérica em que os primeiros 225 aminoácidos são derivados do ADNc de porco e os 79 do terminal carboxi são derivados do ADNc de babuíno. A uricase quimérica de porco-babuíno (PBC) resultante (SEQ ID NO:2) possui 30 lisinas, uma a mais do que cada enzima "progenitora". Uma característica adicional da uricase PBC é que a sua porção de "babuíno" difere da uricase humana em 4 de 79 resíduos de aminoácido, enquanto a uricase de suíno e humana diferem em 10 na mesma região. Foi posteriormente construída uma versão modificada de PBC que mantém a lisina extra na posição 291 e difere da uricase de porco apenas por uma substituição por serina da treonina no resíduo 301 (uricase "porcoKS" (SEQ ID NO:4)). Tendo em vista os resultados descritos no parágrafo anterior em que várias outras inserções de lisinas foram deletérias à actividade, era inesperado que as uricases quiméricas PBC e PKS fossem integralmente tão activas em comparação com a uricase de porco nativa não mutante e cerca de quatro vezes mais activas do que a uricase de babuíno nativa não mutante. A presente invenção proporciona uma uricase quimérica de porco-babuíno recombinante, composta de porções das sequências de uricase do fígado de babuíno e de porco. Um exemplo de uma 14 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ

tal uricase quimérica contém os primeiros 225 aminoácidos da sequência de uricase suina (SEQ ID NO:7) e os últimos 79 aminoácidos da sequência da uricase de babuíno (SEQ ID NO:6) (uricase de porco-babuíno, ou uricase PBC; Figura 6 e SEQ ID NO:2). Outro exemplo de uma tal uricase quimérica contém os primeiros 288 aminoácidos da sequência suína (SEQ ID NO:7) e os últimos 16 aminoácidos da sequência de babuíno (SEQ ID NO:6). Uma vez que esta última sequência difere da sequência de suíno em apenas duas posições, tendo uma lisina (K) no lugar da arginina no resíduo 291 e uma serina (S) no lugar da treonina no resíduo 301, este mutante é conhecido como uricase porco-K-S ou uricase PKS. São também proporcionados vectores (de expressão e de clonagem) incluindo as moléculas de ácido nucleico de codificação das proteínas da presente invenção. Os vectores preferidos incluem aqueles que são aqui exemplificados. Uma pessoa competente na matéria notará que podem ser inseridas moléculas de ácido nucleico num vector de expressão, como um plasmídeo, na orientação correcta adequada e quadro de leitura correcto para a expressão. Se necessário, o ácido nucleico (ADN) pode estar ligado a sequências nucleotídicas de regulação da transcrição e da tradução adequadas, reconhecidas pelo hospedeiro desejado, apesar destes elementos de controlo estarem geralmente disponíveis em vectores de expressão utilizados e conhecidos na especialidade. O vector pode então ser introduzido nas células hospedeiras através de técnicas padronizadas. Geralmente, nem todas as células hospedeiras serão transformadas pelo vector. Pode ser necessário, portanto, seleccionar as células hospedeiras transformadas. Um destes métodos de selecção conhecido na especialidade implica a incorporação no vector de expressão de uma sequência de ADN, com quaisquer elementos de controlo necessários, que codifica para um traço marcador seleccionável na célula transformada, como uma resistência a antibióticos. Alternativamente, o gene para este traço seleccionável pode estar em outro vector, que é utilizado para co-transformar as células hospedeiras desejadas. Os vectores também podem incluir um promotor adequado, como um promotor procariótico capaz de expressão (transcrição e tradução) do ADN numa célula hospedeira bacteriana, como E. coli, com ele transformada. Muitos sistemas de expressão estão disponíveis e são conhecidos na 15 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ especialidade, incluindo células bacterianas (por exemplo, E. coli e Bacillus subtilis), leveduras (por exemplo,

Saccharomyces cerevisiae), fungos filamentosos (por exemplo, Aspergillus), células vegetais, células animais e células de insecto.

Os vectores adequados podem incluir um replicão procariótico, como ColEl ori, para a propagação em, por exemplo, um procariota. Os plasmideos vectores procarióticos típicos são pUC18, pUC19, pUC322 e pBR329 disponíveis em Biorad Laboratories (Richmond, CA) e pTcr99A e pKK223-3 disponíveis em Pharmacia (Piscataway, NJ) . Um plasmídeo vector típico de células de mamífero é o pSVL disponível em Pharmacia (Piscataway, NJ) . Este vector utiliza o promotor tardio de SV40 para conduzir a expressão de genes clonados, tendo-se encontrado o maior nível de expressão em células produtoras do antigénio T, tais como células COS-1. Um exemplo de um vector de expressão indutível de mamífero é o pMSG, também disponível em Pharmacia. Este vector utiliza o promotor indutível por glucocorticóides da repetição terminal longa do vírus do tumor mamário do ratinho, para conduzir a expressão do gene clonado. Os vectores plasmídicos de levedura úteis são pRS403-406 e pRS413-416, e estão geralmente disponíveis em Stratagene Cloning Systems (LaJolla, CA) . Os plasmideos pRS403, pRS404, pRS405 e pRS406 são plasmideos de integração em levedura (Yip) e incorporam os marcadores seleccionáveis de levedura HIS3, TRPl, leu2 e URA3. Os plasmideos pRS413-416 são plasmideos de centómero de levedura (Ycp).

Além disto, a presente invenção proporciona células hospedeiras contendo estes vectores. As células hospedeiras preferidas incluem as que são aqui exemplificadas e descritas.

As proteínas uricase da presente invenção podem ser conjugadas através de uma ligação covalente biologicamente estável, atóxica, a um número relativamente pequeno de cadeias de PEG para melhorar a meia-vida biológica e a solubilidade das proteínas e reduzir a sua imunorreactividade. Tais ligações podem incluir ligações de uretano (carbamato), ligações de amina secundária e ligações amida. Vários PEG activados adequados para esta conjugação, estão comercialmente disponíveis em Shearwater Polymers, Huntsville, AL. 16 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ A invenção também pode ser usada para preparar composições farmacêuticas das proteínas uricase na forma de conjugados. Estes conjugados são substancialmente não imunogénicos e retêm pelo menos 70%, de preferência 80%, e com mais preferência pelo menos cerca de 90% ou mais da actividade uricolítica da enzima não modificada. Os polímeros solúveis em água adequados para uso na presente invenção incluem poli(etilenoglicóis) ou poli(óxidos de etileno) lineares e ramificados, todos comummente conhecidos como PEG. Um exemplo de PEG ramificado é objecto da Patente US 5643575.

Numa concretização da invenção, o número médio de lisinas inseridas por subunidade de uricase está entre 1 e 10. Numa concretização preferida, o número de lisinas adicionais por subunidade de uricase está entre 2 e 8. Entenda-se que o número de lisinas adicionais não deverá ser tão elevado que constitua um prejuízo para a actividade catalítica da uricase. As moléculas de PEG do conjugado são preferencialmente conjugadas através de lisinas da proteína uricase, mais preferencialmente, através de uma lisina ou lisinas que não de ocorrência natural que foram introduzidas na porção de uma proteína projectada que não contém naturalmente uma lisina nessa posição. O presente pedido descreve um método para aumentar os locais não deletérios disponíveis para ligação de PEG a uma proteína uricase em que uma proteína uricase nativa é mutada de maneira a introduzir-lhe pelo menos um resíduo de lisina. Preferencialmente, este método inclui a substituição de argininas por lisinas.

Os conjugados PEG-uricase utilizando a presente invenção são úteis para reduzir os níveis (ou seja, reduzir a quantidade) de ácido úrico no sangue e/ou na urina de mamíferos, preferivelmente seres humanos, e podem assim ser usados para o tratamento de níveis elevados de ácido úrico associados com condições, incluindo gota, tofos, insuficiência renal, transplante de órgãos e doenças malignas.

Os conjugados PEG-uricase podem ser introduzidos num mamífero com níveis excessivos de ácido úrico por qualquer de 17 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ várias vias, incluindo a oral, através de enema ou supositório, por via intravenosa, subcutânea, intradérmica, intramuscular e intraperitoneal. Patton, JS, et al., (1992) Adv Drug Delivery Rev 8:179-228. A dose eficaz de PEG-uricase dependerá do nível de ácido úrico e do tamanho do indivíduo. Numa concretização, o PEG-uricase pode ser administrado num excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitáveis numa quantidade que varia de 10 yg a cerca de 1 g. Numa concretização preferida, a quantidade administrada está entre cerca de 100 yg e 500 mg. Mais preferivelmente, a uricase conjugada é administrada numa quantidade entre 1 mg e 100 mg, como, por exemplo, 5 mg, 20 mg ou 50 mg. As massas dadas para as quantidades de dosagem das concretizações referem-se à quantidade de proteína no conjugado.

As formulações farmacêuticas contendo PEG-uricase podem ser preparadas por técnicas convencionais, por exemplo, conforme descrito em Remington's Pharmaceutical Sciences, (1985) Easton, PA: Mack Publishing Co. Os excipientes adequados para a preparação de soluções injectáveis incluem, por exemplo, solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer lactada, água, polióis e glicerol. As composições farmacêuticas para administração parentérica compreendem líquidos aquosos ou não aquosos, dispersões, suspensões ou emulsões, estéreis, farmaceuticamente aceitáveis, bem como pós estéreis para reconstituição em soluções ou dispersões estéreis injectáveis, imediatamente antes da utilização. Estas formulações podem conter componentes adicionais, como, por exemplo, conservantes, solubilizantes, estabilizantes, agentes molhantes, emulsionantes, tampões, antioxidantes e diluentes. O PEG-uricase também pode ser proporcionado na forma de composições de libertação controlada para implantação num indivíduo para controlar continuamente os níveis elevados de ácido úrico no sangue e na urina. Por exemplo, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, colagénio regenerado, poli-L-lisina, alginato de sódio, goma gelana, quitosana, agarose, lipossomas multilamelares e muitas outras formulações de depósito convencionais incluem materiais bio-erodíveis ou biodegradáveis que podem ser formulados com composições 18 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ biologicamente activas. Estes materiais, quando implantados ou injectados, degradam-se gradualmente e libertam o material activo para o tecido circundante. Por exemplo, um método de encapsulação de PEG-uricase compreende o método divulgado na Patente US 5653974, que é aqui incorporada por referência. O uso de formulações bio-erodiveis, biodegradáveis e outras formulações de depósito está expressamente contemplado na presente invenção. O uso de bombas de infusão e sistemas de aprisionamento em matriz para entrega de PEG-uricase também está dentro do escopo da presente invenção. O PEG-uricase também pode vantajosamente ser aprisionado em micelas ou lipossomas. A tecnologia de encapsulamento em lipossomas é bem conhecida na especialidade. Ver, por exemplo, Lasic, D, et al., (Eds.) Stealth Liposomes (1995), Boca Raton, FL:. CRC Press.

As composições farmacêuticas de PEG-uricase aqui descritas irão diminuir a necessidade de hemodiálise em pacientes com alto risco de falha renal induzida por urato, por exemplo, beneficiários de transplantes de órgãos (ver Venkataseshan, VS, et al. (1990) Nephron 56:317-321) e pacientes com algumas doenças malignas. Em pacientes com grandes acumulações de urato cristalino (tofos), estas composições farmacêuticas irão melhorar a qualidade de vida mais rapidamente do que os tratamentos actualmente disponíveis.

Os exemplos a seguir, que não devem ser interpretados como, de alguma forma, limitantes da invenção, ilustram os diversos aspectos divulgados acima. EXEMPLO 1 A. Construção de ADNc de PBC, PKS e uricases relacionadas.

Foram utilizados métodos padrão, e as instruções proporcionadas pelos fabricantes dos reagentes, quando aplicável, para preparação de ARN celular total, para a amplificação por PCR (Patentes US 4683195 e 4683202, 4965188 & 5075216) dos ADNc de urato-oxidase, e para clonagem e sequenciação destes ADNc (Erlich, 1989; Sambrook et al. 1989; Ausubel, 1998) . Os iniciadores de PCR para as urato-oxidases 19 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ de porco e de babuíno (Tabela 1) foram desenhados com base em sequências codificadoras publicadas (Wu et al. 1989) e usando o programa de computador PRIME (Genetics Computer Group, Inc.).

Tabela 1. Iniciadores para Amplificação por PCR de ADNc de Urato-oxidase ADNc de uricase de fígado de porco: Sentido directo: 5'gcgcgaattccATGGCTCATTACCGTAATGACTACA3'. Anti-sentido: 5'gcgctctagaagcttccatggTCACAGCCTTGAAGTCAGC3’.

ADNc de uricase de fígado de babuíno D3H: Sentido directo: 5'gcgcgaatcccATGGCCCACTACCATAACAACTAT3' Anti-sentido: 5'gcgcccatggtctagaTCACAGTCTTGAAGACAACTTCCT

As sequências de enzimas de restrição (em minúsculas) introduzidas nas extremidades dos iniciadores são EcoRI e Ncol de sentido directo (suíno e babuíno); Ncol, HindIII, Xbal anti-sentido (porco); Ncol anti-sentido (babuíno). No caso do iniciador de sentido directo de babuíno, o terceiro codão GAC (Aspartato) presente na urato-oxidase do babuíno (Wu et al. 1992) foi substituído por CAC (histidina), o codão que está presente nesta posição na sequência de codificação do pseudogene da urato-oxidase do ser humano (Wu et al. 1992). Por isto, a urato-oxidase recombinante de babuíno gerada a partir da utilização destes iniciadores foi denominada urato-oxidase de babuíno D3H. O ARN celular total de fígados de suíno e babuíno foi transcrito de modo inverso usando um kit de primeira cadeia (Pharmacia Biotech Inc. Piscataway, NJ) . A amplificação por PCR usando ADN-polimerase Taq (GibcoBRL, Life Technologies, Gaithersburg, MD) foi realizada num termociclador (Ericomp, San Diego, CA) com o programa [30 s, 95°C, 30 s, 55° e 60 s, 70o], 20 ciclos, seguidos de [30 s, 95°C; 60 s, 70o] 10 ciclos. Os produtos da PCR da urato-oxidase foram digeridos com EcoRI e HindIII e clonados em pUC18 (porco) , e foram também clonados directamente (suíno e babuíno D3H), utilizando o sistema de clonagem TA (Invitrogen, Carlsbad, CA). Os clones de ADNc foram transformados na estirpe de E. coli XLl-Blue 20 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ (Stratagene, La Jolla, CA). O ADN plasmídico contendo os ADNc de uricase clonados foi preparado e a sequência do inserto de ADNc foi analisada pela técnica padrão do didesoxi. Os clones que possuíam as sequências de codificação de ADN da urato-oxidase publicadas (excepto para a substituição D3H na urato-oxidase de babuíno descrita na Tabela I) foram construídos e verificados numa série de etapas subsequentes através de uma metodologia padrão de ADN recombinante.

Os ADNc de porco e de babuíno D3H contendo sequências de codificação de comprimento completo foram introduzidos em vectores de expressão pET (Novagen, Madison, WI) como se segue. O ADNc de uricase de babuíno D3H foi excisado do plasmídeo TA com as enzimas de restrição Ncol e BamHI e depois foi subclonado nos locais de clonagem Ncol e BamHI dos plasmídeos de expressão pET3d e pET9d. O ADNc de uricase de suíno de comprimento completo foi excisado de um clone do plasmídeo pUC com as enzimas de restrição EcoRI e HindIII e subclonado nos locais EcoRI e HindIII de pET28b. A região de codificação do ADNc de porco também foi introduzida nos locais Ncol e BlpI do plasmídeo de expressão pET9d após excisão dos locais Ncol e BlpI de pET28b. O ADNc da quimera de porco-babuíno (PBC) foi construída por excisão do fragmento de restrição Ncol-Apal de 624 pb do ADNc de uricase de babuíno D3H de um clone de babuíno pET3d-D3H, e depois substituição desse segmento de babuíno D3H pelo correspondente fragmento de restrição Ncol-Apal de 624 pb do ADNc de porco. O ADNc de urato-oxidase PBC resultante consiste nos codões 1-225 de urato-oxidase de porco ligados em enquadramento aos codões 226-304 de urato-oxidase de babuíno. O ADNc da urato-oxidase porco-KS ("PigKS") foi construído por excisão do fragmento de restrição Ncol-Ndel de 864 pb de ADNc de uricase de babuíno D3H de um clone de babuíno pET3d-D3H, e depois substituição deste segmento de babuíno D3H pelo correspondente fragmento de restrição Ncol-Ndel de 864 pb do ADN de porco. O resultante ADNc de urato-oxidase PKS consiste nos codões 1-288 da urato-oxidase de porco ligados em enquadramento aos codões 289-304 da urato-oxidase de babuíno. 21 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ

As sequências de aminoácidos das urato-oxidases de babuíno D3H, de porco, PBC e PKS estão mostradas na Figura 5 e na LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS). Utilizaram-se técnicas padrão para preparar lotes em glicerol a 15% de cada um destes transformantes, e estes foram armazenados a -70°C. Quando cada uma destas espécies foi expressa e as enzimas recombinantes isoladas (Tabela 2) , as uricases de porco, quimera PBC e Porco-KS tinham actividade específica muito semelhante, que era aproximadamente 4-5 vezes maior do que a actividade específica da uricase de babuíno recombinante. Esta ordem foi confirmada em várias outras experiências. A actividade específica de uricase PBC preparada por vários procedimentos diferentes variou numa gama de 2-2,5 vezes.

Tabela 2: Comparação de uricases de mamífero recombinantes expressas

Construção Actividade Específica* Actividade Relativa (Unidades/mg) (Quimera=l) PBC 7, 02 1,00 Porco-KS 7,17 1,02 Porco 5, 57 0,79 Babuíno 1,36 0,19 * A proteína foi determinada pelo método de Lowry. A actividade de uricase foi determinada por espectrofotometria (Priest e Pitts, 1972) . O ensaio foi realizado a 23-25°C numa célula de quartzo de 1 cm contendo 1 ml de mistura reaccional (borato de sódio 0,1 M, pH 8,6, ácido úrico 0,1 mM) . 0 desaparecimento do ácido úrico foi monitorizado pela redução na absorvância a 292 nm. Uma unidade internacional (UI) de uricase catalisa o desaparecimento de um pmol de ácido úrico por minuto.

Os transformantes E.coli BL21 (DE3)pLysS das 4 construções ADNc de uricase-pET indicadas na Tabela 2 foram plaqueados em ágar LB contendo antibióticos selectivos (carbenicilina e cloranfenicol para pET3d (porco-KS); canamicina e cloranfenicol para pET9d (PBC, porco, babuíno)), tal como indicado no manual do sistema pET (pET System Manual, Novagen, Madison Wl) . Inocularam-se culturas de 5 ml (LB acrescido de antibióticos) com colónias de transformantes individuais e cresceram por 3 horas a 37°C. Em seguida, alíquotas de 0,1 ml foram transferidas para 100 ml de meio LB contendo 22 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ antibióticos selectivos e 0,1% de lactose (para induzir a expressão de uricase) . Depois de um crescimento durante a noite a 37°, as células bacterianas de aliquotas de 0,5 ml das culturas foram extraídas para tampão de carregamento de SDS-PAGE e analisadas por PAGE com SDS e mercaptoetanol; isto estabeleceu que haviam sido expressos níveis comparáveis de proteína uricase em cada uma das quatro culturas (resultados não mostrados). As células restantes de cada cultura de 100 ml foram colhidas por centrifugação e lavadas em PBS. As células foram então ressuspensas em 25 ml de solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4 (PBS) contendo inibidor de protease AEBSF 1 mM (Calbiochem, San Diego, CA) e, em seguida, foram lisadas no gelo num disruptor de células bacterianas (Microfluidics, Boston MA) . O material insolúvel (incluindo a uricase) foi sedimentado em peletes por centrifugação (20 190 xg, 4°, 15 min). As peletes foram lavadas duas vezes com 10 ml de PBS e em seguida foram extractadas durante a noite a 4o com 2 ml de Na2CC>3 1 M, pH 10,2. Os extractos foram diluídos para 10 ml com água e, em seguida, centrifugados (20 190 xg, 4o, 15 min). Foram então determinadas a actividade de uricase e as concentrações de proteína. EXEMPLO 2

Expressão e isolamento de uricase PBC recombinante (prep. em fermentador de 4 litros). O transformante de uricase pET3d-PBC foi plaqueado a partir de um lote de glicerol numa placa de ágar LB contendo carbenicilina e cloranfenicol, conforme indicado no Manual do Sistema pET da Novagen. Preparou-se um inoculo de 200 ml iniciado a partir de uma única colónia em meio líquido LB com antibiótico num agitador rotatório (250 rpm) a 37°, utilizando os procedimentos recomendados no manual do sistema pET para maximizar a retenção do plasmídeo pET. A uma DO525 de 2,4, células desta cultura de 200 ml foram recolhidas por centrifugação e ressuspensas em 50 ml de meio fresco. Esta suspensão foi transferida para um fermentador de alta densidade contendo 4 litros de meio SLBH contendo carbenicilina e cloranfenicol (a composição do meio SLBH, e a concepção e operação do fermentador são descritos em (Sadler et al. 1974)). Após 20 horas de crescimento sob O2 a 32° 23 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ (DC>525= 19) foi adicionado isopropiltiogalactósido (IPTG) até 0,4 mM para induzir a produção de uricase. Após mais seis horas (DOs25= 37) as células bacterianas foram colhidas por centrifugação (10 410 xg, 10 min, 4°C), lavadas uma vez com PBS e armazenadas congeladas a -20°C.

As células bacterianas (189 g) foram ressuspensas em 200 ml de PBS e lisadas enquanto arrefecidas num banho de gelo/sal por ultra-sons (Heat Systems Sonicador XL, sonda modelo CL, Farmingdale, NY) por pulsos de 4 x 40 segundos a 100% de intensidade, com um descanso de um minuto entre os pulsos. O material insolúvel de PBS (que inclui uricase) foi sedimentado em pelete por centrifugação (10 410 xg, 10 min, 4°C), e foi então lavado 5 vezes com 200 ml de PBS. A uricase na pelete insolúvel de PBS foi extraida para 80 ml de Na2C03 1 M, pH 10,2, contendo de fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF) 1 mM e 130 yg/ml de aprotinina. Os detritos insolúveis foram removidos por centrifugação (20 190 xg, 2 horas, 4°C). Todas as outras etapas da purificação foram a 4°C (resultados resumidos na Tabela 3). O extracto a pH 10,2 foi diluído para 1800 ml com PMSF 1 mM (para reduzir o Na2C03 para 0,075 M). Este foi aplicado a uma coluna (2,6 x 9 cm) de Q-Sepharose fresca (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ), que tinha sido equilibrada com 0,075 M de Na2CC>3, pH 10,2. Após o carregamento, a coluna foi lavada sucessivamente com 1) Na203 0,075 M, pH 10,2 até a absorvância A22o do efluente atingir o valor de base; 2) NaHC03 10 mM, pH 8,5 até o pH do efluente cair para 8,5; 3) 50 ml de NaHC03 10 mM, pH 8,5, NaCl 0,15 M; 4) um gradiente de 100 ml de

NaCl de 0,15 M a 1,5 M em NaHC03 10 mM, pH 8,5; 5) 150 ml de

NaHC03 10 mM, pH 8,5, NaCl 1,5 M; 6) NaHCO310 mM, pH 8,5; 7) Na2C03 0,1 M, pH 11 até que o pH do efluente aumentar para 11. Finalmente, a uricase foi eluída com um gradiente de 500 ml de NaCl de 0 a 0,6 M em Na2C03 0,1 M, pH 11. A actividade eluiu em dois picos de absorção A2so, que foram agrupados separadamente (Fracção A e Fracção B, Tabela 3) . A uricase em cada um destes grupos foi então precipitada por redução do pH para 7,1 através de adição lenta de ácido acético 1 M, seguida por centrifugação (7000 xg, 10 min). As peletes resultantes foram dissolvidas em 50 ml de Na2C03 1 M, pH 10,2 e armazenados a 4°C. 24 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ

Tabela 3

Purificação de uricase quimérica de porco-babuíno (PBC) recombinante

Pasta de células induzidas com IPTG = 189,6 g

Fracção Proteína Actividade Unidades Actividade Total mg de Uricase de Uricase Específica U/ml Total U/mg Tratada com ultra-sons, pH 7 + lavagem, pH 7 74, 9 Extraída, pH 10,2 4712 82,7 11 170 2,4 Q-Sepharose Fracção A 820 11,5 1081* 1,9 Fracção B 1809 31,7 4080 2,3 Precipitada & redissolvida, pH 7,1 Fracção A 598 35, 0 1748 3,0 Fracção B 1586 75, 5 3773 2,4 Recuperação Total 2184 5521 *A uricase presente na fracção A começou a precipitar espontaneamente após eluição da coluna. Portanto, a actividade medida nesta etapa de purificação estava subestimada. EXEMPLO 3

Preparação e PEGuilação em pequena escala de uricase PBC recombinante.

Este exemplo mostra que a uricase PBC recombinante purificada pode ser usada para produzir uma uricase PEGuilada. Nesta reacção, todas as subunidades de uricase foram modificadas (Figura 1, pista 7), com retenção de cerca de 60% da actividade catalítica (Tabela 4). A. Expressão e isolamento em pequena escala de uricase PBC (Tabela 4, Figura 1).

Uma cultura de 4 litros de E.coli BL21(DE3)pLysS transformada com ADNc de pET3d-PBC foi incubada num agitador rotatório (250 rpm) a 37°. A D0525 de 0,7, a cultura foi induzida com IPTG (0,4 mM, 6 horas). As células foram colhidas e congeladas a -20° C. As células (15,3 g) foram rompidas por 25 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ

congelamento e descongelamento, e extraídas com Na2CC>3 1 M, pH 10,2, PMSF 1 mM. Após centrifugação (12 000 xg, 10 min, 4°C), o sobrenadante (85 ml) foi diluído 1:10 com água e então depois cromatografado em Q-Sepharose de uma maneira similar à descrita no Exemplo 1. A actividade de uricase reunida desta etapa foi concentrada por ultrafiltração sob pressão utilizando uma membrana PM30 (Amicon, Beverly, MA) . O concentrado foi cromatografado numa coluna (2,5 x 100 cm) de

Sephacryl S-200 (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), que foi equilibrada e corrida em Na2CC>3 0,1 M, pH 10,2. As fracções contendo actividade de uricase foram agrupadas e concentradas por ultrafiltração sob pressão, como acima. B. PEGuilação

Deixaram-se reagir 100 mg de uricase PBC concentrada em Sephacryl S-200 (5 mg/ml, 2,9 pmol de enzima; 84,1 ymol de lisina) em Na2C03 0,1 M, pH 10,2, com um excesso de duas vezes (mol de PEG: mol de lisinas da uricase) de uma forma activada de PEG a 4o por 60 min. A uricase PEGuilada foi libertada de qualquer PEG não reagido ou hidrolisado por diafiltração de fluxo tangencial. Nesta etapa, a mistura reaccional foi diluída de 1:10 em Na2C03 0,1 M, pH 10,2 e diafiltrada vs. 3,5 vol de Na2C03 0,1 M, pH 10,2, em seguida, vs. 3,5 vol de fosfato de sódio 0,05 M, NaCl 0,15 M, pH 7,2. A enzima esterilizada por filtração, ficou estável a 4o durante pelo menos um mês.

Tabela 4

Resumo da Purificação e PEGuilação da Uricase Quimérica de Porco-Babuíno (PBC) Recombinante A. Fracção de Purificação Proteína Total Actividade de Uricase Total Actividade Específica Recuperação da Actividade mg pmol/min pmol/min/mg o. 0 Extracto bruto 1565 1010 0, 6 100 Q-Sepharose 355 1051 3,0 104 Sephacryl S-200 215 1170 5,5 116 B. PEGuilação Uricase S-200 100 546 5,5 100 PEG-uricase 97 336 3,5 62 26 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ A Figura 1 mostra uma análise PAGE com SDS e mercaptoetanol (gel a 12%) das fracções obtidas durante a purificação e PEGuilação de uricase quimérica de porco-babuino (PBC) recombinante. Pistas: 1= marcadores de PM; 2= extracto de SDS de células transformadas com ADNc de pET3d-PBC não induzidas (E. coli BL21(DE3)pLysS); 3= extracto de SDS de células transformadas com ADNc de pET-PBC induzidas com IPTG; 4= extracto bruto (ver Tabela 5), 5= uricase concentrada em Q-Sepharose; 6= conjunto de uricase concentrada em Sephacryl S-200; 7= uricase PBC recombinante PEGuilada em Sephacryl S-200.

Os resultados apresentados na Tabela 4 mostram que a uricase PBC purificada pôde ser modificada com retenção de cerca de 60% da actividade catalítica. Nesta reacção de PEGuilação todas as subunidades de uricase foram modificadas (Figura 1, pista 7). Em estudos não mostrados, a enzima PEGuilada tinha propriedades cinéticas semelhantes às da uricase PBC não modificada (KM 10-20μΜ). É importante que a enzima modificada era muito mais solúvel do que a enzima não modificada ao pH fisiológico (>5 mg/ml em PBS vs <1 mg/ml) . A enzima PEGuilada também pôde ser liofilizada e depois reconstituída em PBS, pH 7,2, com um mínimo de perda de actividade. Em outras experiências, foram comparadas as actividades desta preparação de PEG-uricase PBC com a preparação clínica de uricase de A. flavus. A pH 8,6 em tampão de borato, a enzima de A. flavus tinha Vmax 10-14 vezes superior e um KM duas vezes superior. Contudo, em PBS, pH 7,2, o PEG-PBC e enzimas fúngicas não modificadas diferiam em actividade de uricase <2 vezes. EXEMPLO 4

Vida Circulante em Ratinhos de Uricase PBC Não Modificada e PEGuilada A Figura 2 mostra a vida circulante de uricase PBC nativa e PEGuilada Grupos de ratinhos (3 por ponto de tempo) foram injectados IP com uma unidade de uricase PBC nativa (círculos) ou modificada com PEG recombinante (quadrados) (preparação descrita no Exemplo 3). Nos tempos indicados, foi obtido sangue a partir de conjuntos de três ratinhos para medir a actividade de uricase no soro. A uricase PEGuilada (descrita 27 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ no Exemplo 3) tinha uma semi-vida em circulação de cerca de 48 horas, contra <2 horas para a enzima não modificada (Fig. 2) . EXEMPLO 5

Eficácia da uricase PEGuilada da invenção. A Figura 3 mostra a relação entre a actividade de uricase no soro e as concentrações no soro e na urina do ácido úrico. Nesta experiência, um ratinho knockout homozigótico deficiente em uricase (Wu et ai. 1994) recebeu duas injecções, às 0 e 72 horas, de 0,4 UI de uricase PBC recombinante que tinha sido PEGuilada. O ratinho knockout deficiente em uricase foi utilizado nesta experiência porque, ao contrário dos ratinhos normais que têm uricase, como os seres humanos, estes ratinhos knockout têm niveis elevados de ácido úrico no seu sangue e fluidos corporais e excretam niveis elevados de ácido úrico na sua urina. Estes niveis elevados de ácido úrico causam lesões graves nos rins destes ratinhos, que são muitas vezes fatais (Wu et al. 1994). A experiência mostrada na Figura 3 demonstra que injecções intraperitoneais de uma preparação PEGuilada de uricase PBC recombinante resultaram num aumento da actividade da uricase no soro, que foi acompanhado por uma redução acentuada das concentrações sérica e urinária de ácido úrico num ratinho deficiente em uricase. EXEMPLO 6

Ausência de imunogenicidade do complexo construção- transportador

A uricase PBC recombinante PEGuilada foi injectada repetidamente em ratinhos homozigóticos deficientes em uricase sem induzir depuração acelerada, consistente com ausência de imunogenicidade significativa. Isto foi confirmado por ELISA. A Figura 4 mostra a manutenção dos níveis circulantes de actividade de uricase (medida no soro) após injecções repetidas. A uricase PBC PEGuilada foi administrada por injecção intraperitoneal em intervalos de 6-10 dias. A 28 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ actividade sérica de uricase foi determinada 24 horas após a injecção. EXEMPLO 7

Ligação covalente a lisina introduzida por mutação A PEGuilação de uricase PBC de recombinante purificada deverá resultar em ligação de PEG à nova lisina (residuo 291). Nesta experiência, uma preparação de uricase PBC pôde ser modificada por PEGuilação. Pode ser determinado por meios conhecidos na especialidade se o péptido contendo a nova lisina (residuo 291) foi modificado por PEGuilação.

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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> MICHAEL S. HERSHFIELD, SUSAN J. KELLY,

<120> URATO-OXIDASE <13 0 > 1579-267 < 14 0 > <141> <160>11 <170> Patentln Ver. 2.0

<210> 1 <211> 915 <212> ADN <213> Sequência Artificial 35 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ <2 2 0 > <221> CDS <222> (1) . . (915) <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: QUIMERA PBC <4 0 0> 1 atg gct cat tac cgt aat gac tac aaa aag aat gat gag gta gag ttt 48 Met Ala His Tyr Arg Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe 1 5 10 15 gtc cga act ggc tac ggg aag gat atg ata aaa gtt ctc cat att cag 96 Vai Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His Ile Gin 20 25 30 cga gat gga aaa tat cac age att aaa gag gtg gea act tea gtg caa 144 Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Vai Ala Thr Ser Val Gin 35 40 45 ctg act Ctg age tcc aaa aaa gat tac ctg cat gga gac aat tea gat 192 Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp 50 55 60 gtc ate cct aca gac acc ate aag aac aca gtt aat gtc ctg gcg aag 240 Vai lie Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Vai Asn Val Leu Ala Lys 65 70 75 80 ttc aaa ggc ate aaa age ata gaa act ttt gct gtg act ate tgt gag 288 Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu 85 90 95 cat ttc ctt cct tcc ttc aag cat gtc ate aga gct caa gtc tat gtg 336 His Phe Leu Ser Ser Phe Lys HiS Vai Ile Arg Ala Gin Val Tyr val 100 105 110 gaa gaa gtt cct tgg aag cgt ttt gaa aag aac gga gtt aag cat gtc 384 Glu Glu vai Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val 115 120 125 cat gea ttc act tat act cct act gga acg cac ttc tgt gag gtt gaa 432 His Ala Phe Ile Tyr Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu 480 36 480 36 130 135 140 cag aca agg aac gga ccc cca gtc acc cat tet gga acc aaa gac cta Gin ile Arg Asn Gly Pro Pro Vai Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu 145 ISO 155 160 aaa gcc ttg aaa aca acc cag tet ggc ttc gaa gga ttc ate aag gac Lys Vai Leu Lys Thr Thr Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp 165 170 175 cag ttc acc acc ccc ccc gag gtg aag gac cgg tgc ttt gcc acc caa Gin Phe Thr Thr Leu Pro Glu Vai Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gin 180 185 190 gtg tac tgc aaa cgg ege cac cac cag ggc aga gat gtg gac ttt gag Vai Cys Lys Trp Arg Tyr His Gin Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu 195 200 205 gcc acc cgg gac acc gtt agg age att gtc ctg cag aaa ttt gct ggg Ala Thr Trp Asp Thr Vai Arg Ser Ile Val Leu Gin Lys Phe Ala Gly 210 215 220 ccc tat gac aaa ggc gag tac cca ccc tec gtg cag aag acc ccc cat Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gin Lys Thr Leu Tyr 225 230 235 240 gac acc cag gtg ccc ccc ccg age cga gtt ccc gag aca gaa gat atg Asp Ile Gin Vai Leu Ser Leu Ser Arg Val Pro Glu Ile Glu Asp Mec 245 250 255 gaa acc age ccg cca aac acc cac cac tcc aat ata gac atg CCC aaa Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Mec Ser Lys 260 265 270 atg ggt ctg ate aac ãag gâa gag gtc teg ccg cca cca gac aac cca Mec Gly Leu lie Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro 275 280 285 cat gga aaa acc acc ggt aca gtc aag agg aag ttg tet cca aga ccg Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu 290 295 300 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ

Cga 305

< 210 > 2 <211> 304 < 212 > PRT <213> Sequência Artificial <400> 2 528 576 624 672 720 768 816 864 912 915

Met Ala His Tyr Arg Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe 1 5 10 15 Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His Ile Gin 20 25 30 Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu val Ala Thr Ser val Gin 35 40 45 Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu HiS Gly Asp Asn Ser Asp 37 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ 50 55 60 Vai Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys 65 70 75 80 Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ue Cys Glu 85 90 95 His Phe Leu Ser Ser Phe Lys His Val Ile Arg Ala Gin Val Tyr val 100 105 110 Glu Glu Vai Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val 115 120 125 His Ala Phe Ile Tyr Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu 130 135 140 Gin Ile Arg Asn Gly Pro Pro Vai Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu 145 150 155 160 Lys vai Leu Lys Thr Thr Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp 165 170 175 Gin Phe Thr Thr Leu Pro Glu Vai Lys Asp Arg cys Phe Ala Thr Gin 180 185 190 Vai Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gin Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu 195 200 205 Ala Thr Trp Asp Thr Vai Arg Ser Ile Val Leu Gin Lys Phe Ala Gly 210 215 220 Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gin Lys Thr Leu Tyr 225 230 235 240 Asp Ile Gin Vai Leu Ser Leu Ser Arg Val Pro Glu Ile Glu Asp Met 245 250 255 Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Mec Ser Lys 260 265 270 Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro 275 280 285 Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Vai Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu 290 295 300 < 210 > 3 <211> 915

< 212 > ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <221> CDS <222> (1) . . (915) <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: QUIMERA PKS <400> 3 atg gct cat tac cgt aat gac tac aaa aag aat gat gag gta gag ttt 48 Met Ala His Tyr Arg Asa Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Vai Glu Phe 38 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ 1 5 10 15 gtc cga act ggc tat ggg aag gat atg ata aaa gtt ccc cat att cag 96 Vai Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His Ile Gin 20 25 30 cga gat gga aaa tat cac age att aaa gag gtg gea act cca gtg caa 144 Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser val Gin 35 40 45 ccg act ttg age tcc aaa aaa gat tac ctg cat gga gac aat tea gat 192 Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp 50 55 60 gtc ate cct aca gac acc ate aag aac aca gtt aat gtc ctg gcg aag 240 Vai Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys 65 70 75 80 ttc aaa ggc ate aaa age ata gaa act tet gct gtg act ate tgc gag 288 Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu 85 90 95 cat ttc ctt tet tcc ttc aag cat gtc ate aga gct caa gtc tat gtg 336 His Phe Leu Ser Ser Phe Lys His Val Ile Arg Ala Gin Val Tyr Val 100 105 110 gaa gaa gcc cct tgg aag cgt tet gaa aag aat gga gtt aag cat gcc 384 Glu Glu Val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val 115 120 125 cat gea ctt att tac acc cct act gga acg cac tcc tgt gag gct gaa 432 His Ala Phe Ile Tyr Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu 130 135 140 cag ata agg aat gga cct cca gtc att cat tet gga ate aaa gac cta 480 Gin Ile Arg Asn Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly He Lys Asp Leu 145 150 155 160 aaa gtc ttg aaa aca acc cag tet ggc trt gaa gga ttc ate aag gac 528 Lys Vai Leu Lys Thr Thr Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp 165 170 175 cag ttc acc acc etc cct gag gtg aag gac cgg tgc Ctt gcc acc caa 576 Gin Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gin 180 135 190 gcg tac tgc aaa tgg ege tac cac cag ggc aga gat gtg gac tet gag 624 Vai Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gin Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu 195 200 205 gcc acc tgg gac act gtc agg age att gtc ccg cag aaa ttc gct ggg 672 Ala Thr Trp ASP Thr Val Arg Ser lie val Leu Gin Lys Phe Ala Gly 210 215 220 ccc cat gac aaa ggc gag tac teg ccc tet gtc cag aag aca etc tat 720 Ero Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gin Lys Thr Leu Tyr 225 230 235 240 gac ate cag gtg etc acc ccg ggc cag gtt ccc gag ata gaa gat atg 76Θ Asp Ile Gin Val Leu Thr Leu Gly Gin Val Pro Glu Ile Glu Asp Met 245 250 255 gaa ate age ccg cca aat att cac tac tta aac ata gac atg tcc aaa 816 39 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ

Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Leu· Asn Ile Asp Met Ser Lys 260 265 270 atg gga ctg ate aac aag gaa gag gtc ttg cta cct tta gacaat cca 864 Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Vai Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro 275 280 285 cac gga aaa ate act ggc aca gtc aag agg aag ttg tet tea aga ctg 912 Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Vai Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu 290 295 300 tga 915 305 < 210 > 4 <211> 304

< 212 > PRT <213> Sequência Artificial <400> 4

Met Ala His Tyr Arg Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe 1 5 10 15 Vai Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Ile Lys Val Leu ΗΪΞ Ile Gin 20 25 30 Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Vai Ala Thr Ser Val Gin 35 40 45 Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp 50 55 60 Vai Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys 65 70 75 80 Phe Lys Gly Ile Lys Ser ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu 85 90 95 His Phe Leu Ser Ser Phe Lys His Vai Ile Arg Ala Gin Val Tyr val 100 105 110 Glu Glu Vai Pro Trp LyS Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val 115 120 125 His Ala Phe Ile Tyr Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu 130 135 140 Gin Ile Arg Asn Gly Pro Pro Vai Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu 145 150 155 160 Lys Vai Leu Lys Thr Thr Gin Ser Glv Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp 165 170 175 Gin Phe Thr Thr Leu Pro Glu Vai Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gin 180 185 190 Vai Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gin Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu 195 200 205 Ala Thr Trp Asp Thr Vai Arg Ser Ile Vai Leu Gin Lys Phe Ala Gly 210 215 220 40 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ

Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gin Lys Thr Leu Tyr 225 230 235 240 Asp Ile Gin Val Leu Thr Leu Gly Gin Val Pro Glu Ile Glu Asp Met 245 250 255 Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Leu Asn Ile Asp Met Ser Lys 260 265 270 Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro 275 280 285 Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu 290 295 300 < 210 > 5 <211> 304

< 212 > PRT <213> Sequência Artificial, < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: babuíno D3H < 4 0 0 > 5

Met Ala His Tyr His Asn Asn Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Leu Glu Phe 1 5 10 15 Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Vai Lvs Val Leu His Ile Gin 20 25 30 Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gin 35 40 45 Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp 50 55 60 Ile Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val His Val Leu Ala Lys 65 70 75 80 Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Ala Phe Gly Val Asn Ile Cys Glu 85 90 95 Tyr Phe Leu Ser Ser Phe Asn His Val Ile Arg Ala Gin Val Tyr· Val 100 105 110 Glu Glu Ile Pro Trp Lys Arg Leu Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val 115 120 .125 HiS Ala Phe lie His Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu 130 135 140 Gin Leu Arg Ser Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu 145 150 155 160 Lys val Leu Lys Thr Thr Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp 165 170 175 Gin Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gin 180 185 190

Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gin Cys Arg Asp Vai Asp Phe Glu 41 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ 195 200 205.

Ala Thr Trp Gly Thr Ile Arg Asp Leu Vai Leu Glu Lys phe Ala Gly 210 215 220

Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Vai Gin Lys Thr Leu Tyr 225 230 235 240

Asp Ile Gin Vai Leu Ser Leu Ser Arg Vai Pro Glu Ile Glu Asp Met 245 250 255

Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys 260 265 270

Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Vai Leu Leu Pro Leu Asp Asn pro 275 280 285

Tyr Gly Lys 290

Ile Thr Gly Thr Vai Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu 295 300 <210> 6 <211> 304 < 212 > PRT <213> babuíno <400> 6 Met Ala Asp Tyr His Asn Asn Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Leu Glu Phe 1 5 10 15 Vai Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Val Lys val Leu His Ile Gin 20 25 30 Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gin 35 40 45 Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp 50 55 60 Ile Ile Pro Thr Asp Thr lis Lys Asn Thr Val His Val Leu Ala Lys 65 70 75 80 Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Ala Phe Gly Val Asn Ile Cys Glu 85 90 95 Tyr Phe Leu Ser Ser Phe Asn His Val Ile Arg Ala Gin Val Tyr Val 100 105 110 Glu Glu Ile Pro Trp Lys Arg Leu Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val 115 120 125 His Ala Phe Ile His Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu 130 135 140 Gin Leu Arg Ser Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu 145 - 150 155 160 r *< IA Vai Leu Lys Thr Thr Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp 165 170 175 42 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ

Gin Phe Thr Thr Leu Pro Glu val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gin 180 185 190 Vai Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gin cys Arg Asp Val Asp Phe Glu 195 200 205 Ala Thr Trp Gly Thr Ile Arg Asp Leu Val Leu Glu Lys Phe Ala Gly 210 215 220 Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gin Lys Thr Leu Tyr 225 230 235 240 Asp Ile Gin Vai Leu Ser Leu Ser Arg Val Pro Glu Ile Glu Asp Met 245 250 255 Glu ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys 280 265 270 Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro 275 280 285 Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu 290 295 300 < 210 > 7 <211> 304 < 212 > PRT <213> porco 4 0 0 > 7 Met Ala HiS Tyr Arg Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe 1 5 10 15 Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His ile Gin 20 25 30 Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gin 35 40 45 Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp 50 55 60 Val Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys 65 70 75 80 Phe Lys Gly Ile Lys Ser ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu 85 90 95 His Phe Leu Ser Ser Phe Lys His Val Ile Arg Ala Gin Val Tyr Val 100 105 110 Glu Glu Val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly val Lys His Val 115 120 125 His Ala Phe Ile Tyr Thr Pro Thr Gly Thr Kis Phe Cys Glu Val Glu 130 13S 140 Gin Ile Arg Asn Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu 145 150 155 160 43

ΕΡ 1 100 880/PT

Lys Vai Leu Lys Thr Thr Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp 165 170 175 Gin Phe Thr Thr Leu Pro Glu Vai Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gin 180 185 190 Vai Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr Hi.S Gin Gly Arg Asp Vai Asp Phe Glu 195 200 205 Ala Thr Trp Asp Thr Vai Arg Ser Ile Vai Leu Gin Lys Phe Ala Gly 210 215 220 Pro Tyr Asp Lys· Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Vai Gin Lys Thr Leu Tyr 225 230 235 240 Asp Ile Gin Vai Leu Thr Leu Gly Gin Vai Pro Glu Ile Glu Asp Met 245 250 255 Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Leu Asn Ile Asp Met Ser Lys 260 265 270 Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Vai Leu Leu Pro Leu ASp Asn Pro 275 280 285 Tyr Gly Arg Ile Thr Gly Thr Vai Lys Arg Lys Leu Thr Ser Arg Leu .290 295 300

< 210 > 8 <211> 298 < 212 > PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: PBC amino-truncada <400> 8

Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Vai Glu Phe Vai Arg Thr Gly Tyr Gly 1 5 10 15 Lys Asp Met Ile Lys Vai Leu His Ile Gin Arg Asp Gly Lys Tyr His 20 25 30 Ser Ile Lys Glu Vai Ala Thr Ser Vai Gin Leu Thr Leu Ser Ser Lys 35 40 45 Lys Asp Tyr Leu His Gly ASp Asn Ser Asp Vai Ile Pro Thr Asp Thr 50 55 60 Ile Lys Asn Thr VaL Asn Vai Leu Ala Lys Phe Lys Gly Ile Lys Ser 65 70 75 80 Ile Glu Thr Phe Ala Vai Thr Ile Cys Glu His Phe Leu Ser Ser Phe 85 90 95 Lys His Vai Ile Arg Ala Gin vai Tyr Vai Glu Glu Vai Pro Trp Lys 100 105 110

Arg phe Glu Lys Asn Gly Vai Lys His Vai His Ala Phe Ile Tyr Thr 44 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ 115 120 125

Pro Thr Gly Thr HiS Phe Cys Glu Val Glu Gin Ile Arg Asn Gly Pro 130 135 140 Pro Vai Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu Lys Val Leu Lys Thr Thr 145 150 155 160 Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp Gin Phe Thr Thr Leu Pro 155 170 175 Glu Vai Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gin Val Tyr Cys Lys Trp Arg 180 185 190 Tyr His Gin Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu Ala Thr Trp Asp Thr Val 195 200 205 Arg Ser Ile Vai Leu Gin Lys Phe Ala Gly Pro Tyr Asp Lys Gly Glu 210 215 220 Tyr Ser Pro Ser Val Gin Lys Thr Leu Tyr Asp Ile Gin Val Leu Ser 225 230 235 240 Leu Ser Arg Val Pro Glu Ile Glu Asp Met Glu Ile Ser Leu Pro Asn 245 250 255 Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Mec Ser Lys Met Gly Leu Ile Asn Lys 260 265 270 Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Aso Asn Pro Tyr Gly Lys Ile Thr Gly 275 280 285 Thr Vai Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu 290 295 < 210 > 9 <211> 301

< 212 > PRT <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: PBC carboxi-truncada 4 0 0 > 9 Mec Ala His Tyr Arg Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe 1 5 10 15 Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His Ile Gin 20 25 30 Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gin 35 40 45 Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp 50 55 60 Val Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys 65 70 75 80 Phe Lys Gly ile Lys Ser Ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu 45 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ 8S 90 95

His Phe Leu Ser Ser Phe Lys His Vai Ile Arg Ala Gin Vai Tyr Vai 100 105 110 Glu Glu Vai Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Vai Lys His Vai 115 120 125 His Ala Phe Ile Tyr Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Vai Glu 130 135 140 Gin Ile Arg Asn Gly Pro Pro Vai Ile His Ser Gly ile Lys Asp Leu 145 150 155 160 Lys Vai Leu Lys Thr Thr Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp 165 170 175 Gin Phe Thr Thr Leu Pro Glu Vai Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gin 180 185 190 Vai Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gin Gly Arg Asp Vai Asp Phe Glu 195 200 205 Ala Thr Trp Asp Thr vai Arg ser Ile Vai Leu Gin Lys Phe Ala Gly 210 215 220 Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser pro Ser Vai Gin Lys Thr Leu Tyr 225 230 235 240 Asp Ile Gin Vai Leu Ser Leu Ser Arg Vai Pro Glu Ile Glu Asp Met 245 250 255 Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys 260 265 270 Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Vai Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro 275 280 285 Tyr Gly Lys lie Thr Gly Thr Vai Lys Arg Lys Leu Ser 290 295 300

< 210 > 10 <211> 298 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: PKS carboxi-truncada <400> 10

Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Vai Glu Phe Vai Arg Thr Gly Tyr Gly 1 5 10 15 Lys Asp Met Ile Lys Vai Leu His Ile Gin Arg Asp Gly Lys Tyr His 20 25 30 Ser Ile Lys Glu Vai Ala Thr Ser Vai Gin Leu Thr Leu Ser Ser Lys 35 40 45

Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp Vai lie Pro Thr Asp Thr 46 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ 50 55 60

Lys Ser 80 Ser Phe 95 Trp Lys Tyr Thr Gly pro Thr Thr 160 Leu Pro 175 Trp Arg Thr Vai Gly Glu Leu Thr 240 Pro Asn 255 Asn Lys Thr Gly

Ile Lys Αεη Thr Vai Asn Vai Leu Ala Lys Phe Lys Gly Xle 65 70 75 lie Glu Thr Phe Ala Vai Thr Ile Cys Glu His Phe Leu Ser 85 90

Lys His Vai Ile Arg Ala Gin Vai Tyr Vai Glu Glu Vai Pro 100 105 110

Arg Phe Glu Lys Asn Gly Vai Lys His Vai His Ala Phe Ile 115 120 125

Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Vai Glu Gin Ile Arg Asn 130 135 140

Pro Vai Ile His ser Gly Ile Lys Asp Leu Lys Vai Leu Lys 145 150 155

Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp Gin Phe Thr Thr 165 170

Glu Vai Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gin Vai Tyr Cys Lys 180 185 190

Tyr His Gin Gly Arg Aso Vai Asp Phe Glu Ala Thr Trp asd 195 200 205

Arg Ser Ile Vai Leu Gin Lys Phe Ala Gly Pro Tyr Asp Lys 210 215 220

Tyr Ser Pro Ser Vai Gin Lys Thr Leu Tyr Aso Ile Gin Vai 225 230 235

Leu Gly Gin Vai Pro Glu Ile Glu Asp Met Glu Ile Ser Leu 245 250

Ile His Tyr Leu Asn Ile Asp Met Ser Lys Ket Gly Leu Ile 260 265 270

Glu Glu Vai Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro Tyr Gly Lys Ile 275 280 235

Thr Vai Lys Arg Lys 290

Leu Ser Ser Arg Leu 295

<210> 11 <211> 301 < 212 > PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: PKS carboxi-truncada <4 0 0> 11

Met Ala His Tyr Arg Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Vai Glu Phe 15 10 15 47 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ

Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His Ile Gin 20 25 30 Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser lie Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gin 35 40 45 Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp 50 55 60 Val Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys 65 70 75 80 Phe Lys Gly lie Lys Ser Ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu 85 90 95 Kis Phe Leu ser Ser Phe Lys His val Ile Arg Ala Gin val Tyr val 100 105 110 Glu Glu val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val 115 120 125 His Ala Phe Ile Tyr Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu 130 135 140 Gin Ile Arg Asn Gly Pro Pro Val Ile HiS Ssr Gly Ile Lys ASp Leu 145 150 155 160 Lys Val Leu Lys Thr Thr Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe lie Lys Asp 165 170 175 Gin Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gin 180 185 190 Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gin Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu 195 200 205 Ala Thr Trp Asp Thr Val Arg Ser lie Val Leu Gin Lys Phe Ala Gly 210 215 220 Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Vai Gin Lys Thr Leu Tyr 225 230 235 240 Asp lie Gin Val Leu Thr Leu Gly Gin Val Pro Glu ile Glu Asp Met 245 250 255 Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Leu Asn He Asp Met Ser Lys 260 265 270 Mec Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp ASn Pro 275 280 285 Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser 290 295 300

Lisboa, 2011-01-06

Claims (12)

1. ΕΡ 1 100 880/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Proteína compreendendo uma proteína uricase recombinante de uma espécie de mamífero que foi modificada para inserir um ou mais resíduos de lisina, em que a dita proteína recombinante é uma proteína quimérica de duas ou mais sequências de aminoácidos de proteínas de mamífero.
2. 2. Proteína de acordo com a reivindicação 1, em que a dita proteína uricase recombinante compreende 304 aminoácidos, sendo os primeiros 225 da porção N-terminal dos ditos 304 aminoácidos, os aminoácidos 1-225 de uricase suína e sendo os restantes 79 aminoácidos dos ditos 304 aminoácidos, os aminoácidos 226-304 da uricase de babuíno.
3. 3. Proteína de acordo com a reivindicação 1, em que a dita proteína uricase recombinante compreende 304 aminoácidos, sendo os primeiros 288 da porção N-terminal dos ditos 304 aminoácidos, os aminoácidos 1-288 de uricase suína e sendo os restantes 16 aminoácidos dos ditos 304 aminoácidos, os aminoácidos 289-304 da uricase de babuíno.
4. 4. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a proteína uricase recombinante é seleccionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 2, 4, 8, 9, 10 e 11.
5. 5. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 que foi modificada para inserir entre dois e oito resíduos de lisina.
6. 6. Molécula de ácido nucleico isolada e purificada que codifica a uricase recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes.
7. 7. Molécula de ácido nucleico isolada e purificada de acordo com a reivindicação 6 possuindo a sequência de nucleótidos de SEQ ID NO:l.
8. 8. Molécula de ácido nucleico isolada e purificada de acordo com a reivindicação 6 possuindo a sequência de nucleótidos de SEQ ID NO:3. ΕΡ 1 100 880/ΡΤ 2/2
9. 9. Vector compreendendo uma molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8.
10. 10. Célula hospedeira compreendendo o vector de acordo com a reivindicação 9.
11. 11. Conjugado de uma proteína de qualquer uma das reivindicações 1 a 5 e um poli(etilenoglicol) ou poli(óxido de etileno). Lisboa, 2011-01-06 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ 1/18 Figura 1

    ΕΡ 1 100 880/ΡΤ 2/18

    0 1 2 3 4 5 6 Dias após a injecção Figura 2 EP 1 100 880/PT 3/18 Ácido Úrico no Soro, mg/dl

    a primeira injecção de PEG-Uricase PBC Horas após Figura 3 EP 1 100 880/PT 4/18 Actividade de Uricase no Soro, relativa

    Figura 4 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ 5/18 Figura 5 Sequências de Aminoácidos Deduzidas de Uricase Quimérica de Porco-Babuíno (Uricase PBC) e Uricase Porcina Contendo as Mutações R291K e T301S (Uricase PKS). Comparação com as Sequências Porcina e de Babuíno. )r<nnlmliiivnwi,<1 Porcina Κ?.δΥδί®·4*£& ÍIDEbÃíVRiG IQJUXKYffST «C PBC 1-225 da sequência porcina - PKS 1-288 da sequência porcina - Babuíno tomimrsM mBa&swz»· SQKDGKYHSI ili Porcina KEV&TSVQL? iSSSKmBS DNS&VXFrD? ísamísvíjtít m PBC sequência porcina PKS sequência porcina -> * Babuíno K&íajsvçt? LSSÃOYLnc JaíSMíPTCT mrrvsvLAX m ' " ... Porcina ?ss’ks:s7r Ãvncsms S7S5WÍRÃCV 12C PBC sequência porcina -*· PKS sequência porcina - . Babuíno rvsMmm, ilu Porcina ~ΓίΤ?·ΤυΤΗ? CIVSQI&JS? PVIHSGÍKÍSL i(»c. PBC sequência porcina -> PKS sequência porcina -> Babuíno EíQJGVIíHVkÍí: F varrxnnse C^SSQLSSS? FV2HSCSXD& 1SC Porcina tMTZXOQfft y?SVSDRCFÃ T^VíCkWsyS 23? PBC sequência porcina -> PKS sequência porcina -* Babuíno L?riKDRCFÃ ^QVYCJWMH Mis Porcina çcaawrsA? 1 *®τν?.3ΓΛ$ ?4C PBC sequência porcina -* 1 <- sequência de babuíno PKS sequência porcina -> Babuíno QeaaVSfKK? W5TX»J»VI3 vspsvQioty Porcina híív^tlscv PiisasíSw s:«UiwK.àS :«·: PBC sequência de babuíno -» PKS sequência porcina - Babuíno DXQVLSLSRV ?&22E»SISá« wcsmiíMi SEKCLIiíJKSS m* Porcina •/lípí^pípc astervKRss. T5SL PBC sequência de babuíno -* 304 PKS porcina <- babuíno 289-304 Babuíno XrtGTmXL· «SSL· ΕΡ 1 100 880/ΡΤ 6/18 Figura 6 Comparação da versão "mínima" das sequências de aminoácidos da quimera, conhecida como "Porco-KS" (também denominada "Porco-Lys") vs. Uricase Porcina Uricase "Porco KS": ADNc de porco de 1 a S64 (local Ndel) e depois 865 a 915 de babuíno (fim) Uricase de porco: ADNc de Porco de 1 a 915 (fim) [programa GCG GAP] Peso de hiatos:
12. 12 Correspondência Média: 2,912 Peso de comprimento: 4 Não correspondência média: -2,003 Qualidade: 1601 Comprimento: 319 Razão: 5,249 Hiatos: 0 Percentagem de similaridade: 99,672 Percentagem de identidade: 99,344 Limiar da representação de correspondências para o(s) alinhamento(s): | = IDENTIDADE : = 2 1 pigKS.pep X Pig.pep 25 de Junho, 1998 17:11 porco ks i se 11Μ Π Π N i Π i 11 í 1S N Π i i M UIΠ í 1S Π! 1 i U Π Μ l H Porco I SO si ieo i m m m π m i ϊ m m m η! m iu m 11 π i f i m h i ϊ m m h m ti rm u m 11 m m 11 η π i i m m m i 101 ISO 151 mHSGIKDÍ^VlJClTQSOFSGFISX^FTI^^H^^CFÀlQmX^^l 200 ΠΜΠΪΝΙΗΜΙΠΗΙΙΜΙΙΜΙΙΙίΙΙΙΗΗΠΗΙίΙΜΙΝ 151 mSSÓIK&imi^SGOT 209 2C1 ^GmyDfSATA^^SIVLQKFAGPYMGEYSP^í^raTÇVLTI^QV 250 ΙΗΠΕΙΠΗίΗΙΙί ΗΠΗΠΗΠΝΗΠΗίΠΗΪΗΠίΠ 201 ^I^FE^lVSWBSÍVLQ^GP^^^SPSVOKTl.YDlQVtttiGaTf 250 S51 251 π 1 ri! i I . Μ111; m π μ π :EVLLPU5í^?^XSTOTV»jmJ mn MM 330 3G1 SSHL* 30S 301 *$31*, 30S 300 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ 7/18 Figura 7 Comparação de Sequências de Aminoácidos da Uricase Quimérica de Porco-Babuíno "original" ("quimera") com a versão "mínima" da quimera, conhecida como "Porco-KS" (também denominada "Porco-Lys") Uricase "Quimera": ADNc de porco de 1 a 674 (local Apa) e depois ADNc de babuíno de 675 a 915 (fim) Uricase "porco-KS": ADNc de Porco de 1 a 864 (local Ndel) e depois 865 a 915 de babuíno (fim) [programa GCG GAP] Peso de hiatos: 12 Correspondência Média: 2, 912 Peso de comprimento: 4 Não correspondência média: -2,003 Qualidade: 1589 Comprimento: 319 Razão: 5,210 Hiatos: 0 Percentagem de similaridade: 98,689 Percentagem de identidade: 98,689 Limiar da representação de correspondências para o(s) alinhamento(s): | = IDENTIDADE = 2 1 chimera.pep X PigKS.pep 25 de Junho, 1998 16:15 SÓ Quim. Porco-KS 51 ; ΠΠί ΓΙΗΠΙΠΠΙΠΙΠΠΗΜΠΗΗΠΠΠΜΠΠηΐ 51 100 10; 10: ! Π! i i í Π í Π11 i 11! 11Μ Π1111! S ΠI í! f 11H H i I! í 1 i U ISO 150 151 ICC III11i íIilΠ1 í!! 1 í 1!ií!i 1M!í111!t Π! SI!Π!í Π í íH „ 151 SKSfflTTLPSVTSDKCgATgVVCKSijRyH 200 201 Hl 7201 QGRDVDFHSlTWDTVaSXVl^ASP^X^^^ 2SB , f -è 251 PEimiEISLPSIHYFNI5lS35i5tINKÍEXli,fLDNSirGjei'KíTyK3Ua 300 immiimm immiiímmiiimniiiimm 4 251 !'EIiimiSL?KTmXKlSKSIKGLl>7í£mLPL3í®YGKITOTi?íCFKL 203 .301 SSflL*,, 305 ; π η 301 ®£SL* 305 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ 8/18 Figura 8 Comparação de Sequências de Aminoácidos da Uricase Quimérica de Porco-Babuíno "original" ("quimera") e da Uricase Porcina Uricase "Quimera": ADNc de porco de 1 a 674 (local Apa) e depois ADNc de babuíno de 675 a 915 (fim) Uricase de porco: ADNc de porco de 1 a 915 (fim) [programa GCG GAP] Peso de hiatos: 12 Correspondência Média: 2, 912 Peso de comprimento: 4 Não correspondência média: -2,003 Qualidade: 1583 Comprimento: 305 Razão: 5,190 Hiatos: 0 Percentagem de similaridade: 98,361 Percentagem de identidade: 98,033 Limiar da representação de correspondências para o(s) alinhamento(s): | = IDENTIDADE : = 2 1 chimera.pep X Pig.pep 25 de Junho, 1998 16:54 ΜΙΗίΓΕΙΠΠΗΙΙΠΙίΠΙΗΙίΙΗΠΗίηΠΙΗΗΠηί porco i x ííf/atswit so nn SI 100 ιοί smimAôwvsmfcKaFEKSGvmHi^^ iso .....MIMίΙΙΐΠΠΠΜίΙΜΊΠΠΙΠΓίΠΠΠΪΙΗΙΙΙΠΠΙ í 101 ISO isi trn l!í HílUninnS! ΙΙΠίϊίΗΙΙ: 151 2QQ 201 QGEDVUf^TWTVBSIVLQ¥XMP¥DKGIISP^KTL'ítíIQVLSLg»V 250imimniishniinmmmmíiímmnM λ 201 sso 251 PHEDHElSLPraff^rDkíSSaiH^aiFLOi^G^TCTVKRKL 300 u: I! ΙΙίΜΠΠΠ.ΠΙ.*Ι.Ι|.|.Μ..Ι II 301 SS.3L* S05 *im, 301 TSRL* 305 ΕΡ 1 100 880/PT 9/18 Figura 9 Comparação da Sequência de Aminoácidos da Uricase Quimérica de Porco-Babuíno "original" ("quimera") com a da Uricase de "Babuíno D3H" (de Babuíno excepto com His em substituição de Asp no aminoácido 3) Uricase de porco: ADNc de porco de 1 a 915 (fim) Uricase de "babuíno D3H": ADNc de "babuíno D3H" de 1 a 915 (fim) Porco Bab. 1 53 }! i! mmmmm [programa GCG GAP] Peso de hiatos: 12 Correspondência Média: 2,912 Peso de comprimento: 4 Não correspondência média: -2,003 Qualidade: 1493 Comprimento: 305 Razão: 4,895 Hiatos: 0 Percentagem de similaridade: 94,098 Percentagem de identidade: 90,820 Limiar da representação de correspondências para o(s) alinhamento(s): | = IDENTIDADE 2 1 pig.pep X baboon D3H.pep 25 de Junho, 1998 17:44 ιΠ 101 150 , μ iHmimhim ιιΐ!ΐιιπιιι>ιιιηιΐΗΐη*Μ! 101 S 150 1S1 PVlBSÍKIKÔjrtJaCTCI»»*^ 200 iiiiíiiiiHnmmHHtiiiiiNtMmiiHimiiin 151. P31HSGSKBL3StJ03?tQS(S®S^IKD(^WLPEV73®CfA1WICÍoaS23( 200 201 ÇiGSUlWSATWDmSXVLQ1^AGmEOmPSVQKfLΪDlQUL!fl©QO, 250 I ilIHIHí hl «ΙΜΙΗίΠηΠΠΠΙΠηΠΠΜ *1 201 250 251 3Õ8 immmnm ιημμηηιιηιηιμπιμππππ 251 PEim^XSLPííI^MXDMSMa.l2^E»GlL?LCmGjÇTi3?VKRKL. 300 301 *SRL* 305 301 ssm* 3 os ΕΡ 1 100 880/ΡΤ 10/18 Figura 10 Comparação da Sequência de Aminoácidos da Uricase Quimérica de Porco-Babuíno "original" ("quimera") com a da Uricase de "Babuíno D3H" (de Babuíno excepto com His em substituição de Asp no aminoácido 3) Uricase "quimera": ADNc de porco de 1 a 674 (local Apa) e depois ADNc de babuíno de 675 a 915 (fim) Uricase de "babuíno D3H": ADNc de "babuíno D3H" de 1 a 915 (fim) [programa GCG GAP] Peso de hiatos: 12 Correspondência Média: 2, 912 Peso de comprimento: 4 Não correspondência média: -2,003 Qualidade: 1516 Comprimento: 305 Razão: 4,970 Hiatos: 0 Percentagem de similaridade: 95,738 Percentagem de identidade: 92,787 Limiar da representação de correspondências para o(s) alinhamento(s): | = IDENTIDADE = 2 1 chimera.pep X baboon D3H.pep 25 de Junho, 1998 17:18 ouim i so Hl! ΜΙΠίΜΙΠΗΠΗΜΙΙΠΠΠΝΗΙΙΗΠΠΙΙΙ e muimm ,, ........ίΠΜΠ! ίίΠϋίΜΗΝΠΠΠΙΙΪΠΙ*Y-11 101 ISO , t T f λ 151 ÍVIHS^XmmElTQSGF^FIXEQFTTL?rvraRCP.11^WCKWE'írK 200 nimmuHmnrmimmMiminiiimniJH iSi !VÂHSGIK!50UnJtTTQSG?3S3n^nTLPEyiXiRari^vyCm«í 200 231 0®RDVOTSAT«T3l^m«mC5»K^S?.SV0mYDSQVLSLSRV 250 Ί nimm m ΗΜίπιπιΐίΐΐΝΐΊπΐίΠΠίπιη . *101 2»e 300 2Sl mimmmíHimmmmimímmnnmm 251 má^sxjiiLHimnEHSí®^^ 300 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ 11/18 Figura 11-1 Comparação Bestfit (software GCG) das sequências de codificação dos ADNc da Uricase Porco-KS ("PKS") vs. Uricase porcina Pricase "Porco-KS": ADNc de porco de 1 a 864 (local Ndel) e depois de babuíno de 865 a 915 (fim) Peso de hiatos: 50 Correspondência Media: 10,000 Peso de comprimento: 3 Não correspondência média: -9,000 Qualidade: 9036 Comprimento: 915 Razão: 9,875 Hiatos: 0 Percentagem de similaridade: 99,344 Percentagem de identidade: 99,344 Limiar da representação de correspondências para o(s) alinhamento(s): | = IDENTIDADE : = 5 1 pigKS.seq X pig.seq 25 de Julho, 1998 10:14 PKS porco 1 50 íímímmmmnmitmmmmimmimf! mimmmmmiimMthiiiiiMntuitmim 51 CCSSACTGGCTATGGGAAG^TATSATAAAAÊTTCTCCJvTASTCAíSCSAG xoo 101 ISO mmimiimiimmníMHmimiimÍHUNi 101 ÂT^>AtoTATCACAGCÂTTMAG?£(*-,PSGCMCETCAGTSCAA.CTSÂCT 150 151 TTGAO^TCCAAÃ^AGATTA^CTOOA^SAOACMfTCâGATCTÇAÍCCC 2ÕÔ mmiiimmmimmímnÍinmmnimm 151 mAaCTCCj^AAAAGATTACCTGCA^ASACMlTCASATÍÍTCATCCC 2õ® 201 mCAGACACCATCAA^CAÇAGTrAA^tCCTO^SAA5TT<lAAASGCA 250 ΓΗ ΠIΠ m Η Η Π! 11Μ Π H UHΙΊ m! Η π e I m H i u 2531 T&CASAaC^^^AASMCAaGrMTGTCCTCÍsCa^STJCAMGISCA 3SQ 251 tOLAAA^A?AiGWiAACTTr5K"WTO.StóT,WCTStGÃOCATTTCCTTT50T 300 h i π tu u rn π η π i mi ! m π ΐ u e n. rrn π m m m 251 TCMAíOTTAQtóACriTI^TOTC^miCtOTÂSCAmCCmCT 3C0 *301 1CCrrCW^ATGTCATCftGAiSCTCAiSyS?(3AT!SSGGAAGAAStTCCTtG 350 111! IΠ Π! 1! ΗI! 1 í I! í ΠIU! 111 j I j Π11! 11 i I f í Μ M H 301 tCCTTCAAGCATGiCATCA0-A5íCrCAASTC2AirSiGC'AAGÃAGTTCCT,TG 350 3.51 GAftGCGlTrK»A?AâGAA1^3A<rrrMSCATGTCCA.TGCATTTATTTAT 400 mmmEHmimnmnimiiiímnmfmmí 351 SAAGCGTrn^MAAGÃATSGAGTTAAÊCA.iíSTCCATSCATTTATFtATA 400 450 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ 12/18 Figura 11-2 401 401 451 451 11 f! IΠ1 η IΗ Η1Μ Η!η ΠIIf 1 !J! ΗU ϊ! ί i! 1Η Η Η Π 11Π111 ί Π Μ1Π SIΠ ί ί I! S1 i 111! Π ί I ί 1! [ π Π Π11S Η1 501551551 m mi551¢51 701701 751 ' I i CtC7^CTTOMCCA'nOT^GGACC^7TaCCACCCTCCCl^ÍwOG mimt m 11 m m m m m t u i 11 π j 111111 m m 11 m ιέ π π WAA0GACCG0t^rm^CÃCCCAA0TGfAC«^AM7^CGCTACCAC 450500SOO 550550 500 £00 CAG^GQtG^tOT^^m^GCCCACCtÔOí^CACTCm^AGCAT ΝΠΜίΠΠΙΠΜίΠΙΗΙΙΜΠ ΠΜΠΠΜ ΙΜΗΠΜΜί 0\GG^Á<5AeÃTGTGGACrrTGACK:<€ÂCCrr^GACAC7^TTA(^âGCAr TCTCCTGC^GA-^TT^I^^CCTAI^ACAAACGCGAOTACTCGCCCTπ ϊ t í e i i í i i m i m í ! i π m π i h i m i 11 h i i n f m π TCTCCTÔCA<^ÂTnt>C7i3^CCC7A^ACAAAGCCGAGTACTC<K:C^ CTG^lCAí^^AaCI^TATGAC^CA^TQaíJACC^Í^C.ÃGGTT S i $ s I CTrGTCCAGA^SACÂCtCTATC^^tCCAGOTOCTCACCCTOOOCCAGOTT * -4 * * * CCX^âGATAGAAGATA7^AA?íTCAGCCTGCCL\AA7“AOTCM^AC’ITAAA 751 iií 5 £ ! CCTGAGATASASATAI^SÁMfCAQCCfSCeAAAírATTCACTACfTA.sA 101 f^rA0A£ATG:T€:C>AU^^AC7GA7CMmC^A^AGGÍCT^GCTAC ηηιηπΕίΓίΠΕίΜίππίΗπππιηιιΐΜΐιπιιιη CATÂaACÁtGTCCAAA^l^^TCATCAAC^CGtóGAGGtCt^GCTAC 851 CmAGACMTCCA?ATGaAMMmC7Xs0tACA07Oa«GAASffí3 iimmmmimi i mmuiiiMiitmum u 551 CTÍGAGACMTCCATATC^AGGA^ACTGQTACAGTCIAGAGÇAAGCT'·'! 501 TCnCAAGACTGTGA 915iiiiii! 111m901 ICTTCAASOCtóTGa, SIS 550 700 700 750750 soo soo 650 ISOsoo 900' ΕΡ 1 100 880/ΡΤ 13/18 Figura 12-1 Comparação Bestfit (software GCG) das sequências de codificação dos ADNc da Uricase Porco-KS ("PKS") vs. Uricase de babuíno Uricase "Porco-KS": ADNc de porco de 1 a 864 (local Ndel) e depois de babuíno de 865 a 915 (fim) Peso de hiatos: 50 Correspondência Média: 10,000 Peso de comprimento: 3 Não correspondência média: -9,000 Qualidade: 7573 Comprimento: 915 Razão: 8,277 Hiatos: 0 Percentagem de similaridade: 90,929 Percentagem de identidade: 90,929 Limiar da representação de correspondências para o(s) alinhamento(s): | = IDENTIDADE = 5 1 pigKS.seq X baboon.seq 25 de Julho, 1998 10:21 PKS Bab. 1 Sfl i 1 50 51 COi&AOt^ÇAfGGCAAOWTATGATAlAASTTCTCCATAWCAGCGÃG 100 li; MHIi mi 51 CCGAAGTGGCTRTGíSGíliAGGATATGCTAAAAGTTCÍPCCATArsCWjCõtó 100 101 ATi^l^^AAtAitlÃCA^ÃCTÃMõÃSGlGGÇAACttCMTSCMCi^Ct ISO immmHmimmtmmmijmmmm m 101 ATCKl^AÃATATÇACâiSCATr?JJU^lSíTC^OAirXTÇSGTGCàAC'TTÂCT 150 151 TTGASCTCCAAAAAAC^TrACCTGCÁTGviKSACAATICAGATGTCATCCv 230 mi immmmmiHimm mmm mnn 151 CTGAGTTCCMAAMGÃmCClXKACGOâGATAATTCàGATATCATCCC 200 201 TACACUCACCATCAAGAACACAGTTAA’tQTCCTGGCQAAG'l'TCAAAGGCA 250 mΐϊίπίπππmimi!f um mriiiiúi n ι 201 TACÁQÁCACCATQy^AAC^CAGTTCAT^TCTiGGÇAAÂGJTTAASGGAA 250 251 TCAA.tAtXmGAAACrmGCTG^AC?À*X^TCN\GC^mCClTrd' 300 iiiiimimu i nu um m mm mi mm 251 TCAAAlCCATAGAAíXXlTn^TísTííAATATTTGTG&GTAiTITCTTiCT 300 r301 TCCTTCAA<KATGTCATCAC^CCTCAAOT’2TATO'TâOÀÃGAÃGTTCClT'Í''S 350 u π π mu m miimum mmm i mu 301 I^TrrTAACCAT^AAiCCCACCTCXAC-K^ACGISC^&^.líCCrrG 350 3S1 GAÃGCOTmGAAASSAATC^TTAAíKlA^ÍSTCI^TGCAT^ÃITCATA 4CC Híim Π Μ Ui M U Μ I ItlUM UI Ι1Π itti iil! Ί! I t 351 GASSCSTCTTGÃAAAGAATGOAOl/rSÃSÍAlGTCCATQCATÍfATTCACA 400 ΕΡ 1 100 880/ΡΤ 14/18 Figura 12-2

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