CZ2001466A3 - Rekombinantní protein urátoxidáza - Google Patents

Rekombinantní protein urátoxidáza Download PDF

Info

Publication number
CZ2001466A3
CZ2001466A3 CZ2001466A CZ2001466A CZ2001466A3 CZ 2001466 A3 CZ2001466 A3 CZ 2001466A3 CZ 2001466 A CZ2001466 A CZ 2001466A CZ 2001466 A CZ2001466 A CZ 2001466A CZ 2001466 A3 CZ2001466 A3 CZ 2001466A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
uricase
lys
wall
protein
leu
Prior art date
Application number
CZ2001466A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ304223B6 (cs
Inventor
Michael Hershfield
Susan J. Kelly
Original Assignee
Duke University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Duke University filed Critical Duke University
Publication of CZ2001466A3 publication Critical patent/CZ2001466A3/cs
Publication of CZ304223B6 publication Critical patent/CZ304223B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0044—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7)
    • C12N9/0046—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7) with oxygen as acceptor (1.7.3)
    • C12N9/0048—Uricase (1.7.3.3)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0044—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7)
    • C12N9/0046—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7) with oxygen as acceptor (1.7.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y107/00—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7)
    • C12Y107/03—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7) with oxygen as acceptor (1.7.3)
    • C12Y107/03003—Factor-independent urate hydroxylase (1.7.3.3), i.e. uricase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Oblast techniky
Předkládaný vynález se obecně týká proteinu urátoxidázy (urikázy) a nukleové kyseliny kódující tento protein. Vynález se zejména týká urikázového proteinu, který je užitečný např. jako meziprodukt pro přípravu zlepšených modifikovaných urikáz se sníženou imunogenicitou a zvýšenou biologickou dostupností. Výhodné modifikované urikázové proteiny podle vynálezu (dále zkráceně urikázy) zahrnují především urikázy kovalentně navázané na polyethylenglykoly nebo polyethylenoxidy. Předkládaný vynález poskytuje tudíž urikázu, protilátky, které se specificky váží na urikázu, molekulu nukleové kyseliny, která kóduje urikázu nebo její fragmenty, vektory obsahující takové molekuly nukleové kyseliny, hostitelské buňky obsahující tyto vektory a také způsoby přípravy urikázy a příslušné nukleové kyseliny.
Dosavadní stav techniky
Dna je nej rozšířenější zánětlivé onemocnění kloubů u mužů nad 40 let (Roubenoff 1990). Bolestivá dnavá artritida se objevuje, když zvýšená hladina kyseliny močové v krvi (hyperurikémie) vede k epizodickému vytváření mikroskopických krystalů urátu sodného v kloubech. Postupně může chronická • · »
hyperurikémie vést až k destruktivním depozitům urátu (fofy) kolem kloubů, v měkkých tkáních a v některých orgánech (Hershfield 1996). Kyselina močová má omezenou rozpustnost v moči a když je nadměrně secernována (hyperurikosurie), dochází ke vzniku ledvinových kaménků (urikolitiáza). U pacientů s některými maligními onemocněními, zejména leukémií a lymfomem, významná hyperurikémie a hyperurikosurie (v důsledku zvýšeného metabolického obratu a lýze buněk při chemoterapii) představuji značné riziko akutního obstrukčního selhání ledvin (Sandberg a kol. 1956, Gold a Fritz 1957, Cohen a kol., 1980, Jones a kol. 1990). Silná hyperurikémie a dna jsou spojeny s renální dysfunkcí z různých příčin, jednou z nich je např. cyklosporinová terapie zabraňující odhojeni cizorodého transplantátu (allotransplantátu) (West a kol., 1987, Venkataseshan a kol., 1990, Ahn a kol., 1992, Delaney a kol. 1992, George a Mandeli 1995).
Hyperurikémie je důsledkem buďto nadměrné tvorby urátu nebo jeho nedostatečné exkrece (Hershfield a Seegmiller 1976, Kelley a kol. 1989, Becker a Roessler 1995). Pokud je mírná, může být hyperurikémie regulována dietou, ale je-li silná a spojená s vážnými klinickými příznaky, vyžaduje farmakoterapii, a sice buďto podávání urikosurického agens, které odporuje exkreci kyseliny močové (což je neúčinné v případě snížené funkce ledvin) nebo podávání inhibitoru xanthinoxidázy, allopurinolu, který blokuje vytváření urátu. Allopurinol je dnes hlavní terapií u pacientů s dnavými tofy, nedostatečností ledvin, leukémií a některými dědičnými nemocemi. Léčeni hyperurikémie je obecně účinné a je dobře snášeno. Avšak někteří pacienti s deformující, invalidizující tofickou dnou jsou refrakterní ke všem dostupným léčbám (Becker 1988, Farn 1990, Rosenthal a Ryan 1995) . Kromě toho asi u 2 % pacientů léčených allopurinolem se vyvine alergická reakce a vážný syndrom hypersenzitivity se objevuje asi u 0,4 % (Singer a Wallace 1986, Arellano a Sacristan, 1993). Tento často život ohrožující syndrom může způsobit akutní selhání ledvin nebo jater, vážné poškozeni kůže (toxická epidermální nekrolýza, exfoliativní dermatitidy, erythema multiformě, Strevens-Johnonův syndrom). Allopurinol navíc interferuje s metabolismem azathiprinu a 6-merkaptopurinu, což jsou léčiva užívaná k léčeni leukémii a k prevenci odhojení allotransplantátu, při kterých se často objevuje hyperurikémie a může způsobit silnou dnu nebo ohrozit funkci ledvin.
Hyperurikémie je výsledkem mutační inaktivace lidského genu pro urátoxidázu (urikázu) v průběhu evoluce (Wu a kol. 1989, Wu a kol. 1992). Aktivní urikáza v jaterních peroxisomech u většiny primátů kromě člověka a ostatních savců přeměňuje urát na allantoin (a C02 a H2O2) , který je 80 až lOOx rozpustnější než kyselina močová a je účinněji zpracováván ledvinami. Pareneterální přípravek urikázy, připravené z Aspergillus flavus ÍUricozyme®, Clin-Midy, Paříž) se užívá k léčení silné hyperurikémie spojené s chemoterapií leukémie ve Francii a Itálii již déle než 20 let (London a Hudson 1957, Kissel akol. 1968, Brogard a kol. 1972, Kissel a kol. 1972, Potaux a kol. 1975, Zittoun a kol. 1976, Brogard a kol. 1978, Maséra a kol. 1982) a byl také užit nedávno v klinických testech v USA (Piu a kol. 1997) . Urikáza má rychlejší nástup účinku než allopurinol (Maséra akol. 1982, Pui a kol. 1997). U pacientů s dnou mohou infúze urikázy přerušit akutní dnavý záchvat a zmenšit velikost tofů (Kissel a kol. 1968, Potaux a kol. 1975, Brogard a kol. 1978).
Ačkoliv jsou účinné pro léčení akutní hyperurikémie během krátkodobé chemoterapie, denní infúze urikázy z Aspergillus flavus jsou nevýhodné při léčení rekurentní nebo tofické dny. Navíc účinnost urikázy z Aspergillus flavus rychle klesá u pacientů, u kterých se vyvíjejí protilátky proti urikáze (Kisel a kol. 1968, brogard a kol. 1978, Escudier a kol. 1984, Mourad a kol. 1984, Sibony a kol. 1984). Byl popsán výskyt závažných alergických reakcí, včetně anafylaktického šoku ······ · · · · · • · · · · · · · · • · · · · · · · · · · • · « · · #······ · ····· ·· · ·· ··· (Donadio a kol. 1981, Montagnac a Schillinger 1990, Pui a kol. 1997). Je evidentní, že pro použití při dlouhodobé terapii je potřebný jiný přípravek urikázy s dlouhodobým účinkem a menší imunogenicitou.
Jeden ze způsobů, jak ochránit exogenní enzym před působením proteáz a imunitním systémem je kovalentní navázání inertního netoxického polymeru, např. monomethoxypolyethylenglykolu (PEG) na povrch proteinu (Harris a Zalipsky 1997). Bylo ukázáno, že použití PEG s relativní molekulovou hmotností (Mr) přibližně 1000 až nejvýše 10 000 prodlužuje u zvířat biologický poločas a snižuje imunogenicitu u několika cizorodých proteinů (Abuchowski a kol. 1977a, Abuchowski a kol. 1977b, Davis a kol. 1981a, Abuchowski a kol. 1984, Davis a kol. 1991). V roce 1990 se hovězí adenosindeamináza (ADA) modifikovaná PEG s Mr 5000 (PEG-ADA, ADAGEN®, vyráběný firmou Enzon, lne.) stala prvním PEGylovaným (PEG-modifikovaným) proteinem, který FDA USA schválila pro léčení těžké kombinované imunodeficience, která je důsledkem deficience ADA (Hershfield a kol. 1987). Zkušenosti za uplynulých 12 let ukázaly, že anti-ADA protilátky mohou být detekovány citlivým testem ELISA u většiny pacientů po chronickém léčení PEG-ADA, ale nedochází k žádné alergické nebo hypersenzitivní reakci, zrychlená clearance PEG-ADA byla popsána u několika pacientů, u kterých se tvořily anti-ADA protilátky, ale zpravidla šlo o přechodný jev (Chaffee a kol. 1992, Hershfield 1997). Je třeba připustit, že imunitní funkce u pacientů s deficiencí ADA se obvykle nenormalizují v průběhu léčení PEG-ADA (Hershfield 1995, hershfiled a Mitchell 1995). Tudíž imunogenicita by mohla být závažnějším problémem při vývoji PEGylovaných enzymů pro chronické léčení pacientů, kteří mají normální imunitní funkce.
Odborníkovi je jasné, že imunogenicitou se rozumí indukce imunitní reakce injekcí přípravku fungujícího jako antigen (např. PEG-modifikovaný protein nebo nemodifikovaný protein), zatímco antigenicitou se rozumí reakce antigenu s již dříve existujícími protilátkami. Souhrnně se imunogenicita a antigenicita označují jako imunoreaktivita. V předchozích studiích s urikázou se imunoreaktivita hodnotila různými metodami, např. stanovením reakce in vitro PEG-urikázy s předem vytvořenými protilátkami, měřením syntézy indukovaných protilátek a stanovením zrychlení clearance po opakovaných injekcích.
Bylo ukázáno, že PEGylace snižuje imunogenicitu a prodlužuje u zvířat dobu oběhu urikázy pocházející z hub nebo z prasete (Chen a kol. 1981, Savoca a kol. 1984, Tsuji a kol. 1985, Veronese a kol. 1997), PEG-modifikovaná urikáza z Candida rychle snižovala hladinu urátu v séru až na nedetekovatelnou hladinu u 5 dobrovolníků s normální urémií (Davis a kol. 1981
b). PEG-modifikovaná urikáza z Arthrobacter produkovaná firmou Enzon lne. byla užita k léčení ze soucitu allopurinolhypersenzitivních pacientů s lymfomem, u kterých se vyskytlo selhání ledvin a významná hyperurikémie (Chua a kol. 1988, Greenberg a Hershfield 1989). Čtyři intramuskulární injekce byly podány v průběhu dvou týdnů. V průběhu této krátké doby byla hyperurikémie pod kontrolou a neobjevily se žádné protilátky proti urikáze, které by byly detekovatelné ELISA testem v plazmě pacientů. K dalšímu použití ani klinickému vývoji tohoto preparátu nedošlo.
Do dnešního dne nebyla vyvinuta žádná forma urikázy ani PEG-modifikované urikázy, která by měla dostatečnou dlouhou dobu cirkulace a přitom dostatečeně nízkou imunogenicitu pro bezpečné a spolehlivé použití při dlouhodobém léčení. Proto bylo cílem předkládaného vynálezu zlepšit dosavadní urikázu tak, aby v kombinaci s modifikací PEG splnila výše uvedené požadavky.
Vynález tedy poskytuje jedinečnou rekombinantní urikázu savčího původu, která byla modifikovaná mutací takovým způsobem, který vedl ke zvýšení schopnosti PEG-modifikace maskovat potenciálně imunogenní epitopy.
• · · · · • · · · · · · • · · · · · • · · · · • · · · · · ·
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález poskytuje nový protein - urikázu a sekvence nukleové kyseliny kódující tento protein.
Další aspekt vynález poskytuje způsob purifikace rekombinantně produkované urikázy podle vynálezu.
Další aspekt vynálezu se týká snižováni množství močové kyseliny v tělesných tekutinách u savců tím, že se jim podává přípravek obsahující urikázu podle vynálezu.
Další aspekt vynálezu poskytuje protilátky proti urikáze podle vynálezu.
Ještě další aspekt vynálezu poskytuje vektory a hostitelské buňky obsahující sekvence nukleové kyseliny podle vynálezu a způsoby, kdy se užívají k produkci urikázy.
Předkládaný vynález poskytuje urikázový protein, který lze použít pro výrobu v podstatě neimunogenní PEG-urikázy, která si uchovává všechnu nebo téměř všechnu urikolytickou aktivitu nemodifikovaného enzymu. Urikolytická aktivita se vyjadřuje v mezinárodních jednotkách (IU) na jeden miligram proteinu, přičemž 1 IU je definována jako množství enzymu, které spotřebuje 1 pmol kyseliny močové za 1 minutu.
Předkládaný vynález poskytuje rekombinantní urikázy savčího původu, která byla modifikována inzercí jednoho nebo více lysinových zbytků. Rekombinantní protein v předkládané přihlášce označuje jakýkoliv uměle připravený protein, který je odlišný od přírodního proteinu (tj. proteinu tvořeného v tkáni zvířete, které obsahuje pouze původní přírodní gen pro požadovaný protein). Protein obsahuje peptidy a sekvence aminokyselin. Rekombinantní urikáza podle vynálezu je chiméra nebo hybrid ze dvou nebo více savčích proteinů, peptidů nebo aminokyselinových sekvencí. V jednom provedení předkládaného vynálezu se vynález užívá k přípravě urikázy pocházející ze savce, která je modifikována zvýšením počtu lysinových zbytků až do stavu, kdy po modifikaci PEG je rekombinantní
Φ Φ Φ Φ ΦΦ ·· · φ φ · φφφ φφφ φφφφ • * φ · φ φφφφ φ φ · • · φφφ φ φ φ φ φ φ φ φ φ ·· φφφφ ··· φ · φ φ φ φ φ φ ·· φφ·
PEG-modifikovaná urikáza v podstatě stejně enzymaticky aktivní jako nemodifikovaná urikáza a přitom PEG-modifikovaný produkt není nepřijatelně imunogenní. Vynález zahrnuje i zkrácené formy urikázy, které postrádají amino- a/nebo karboxylový konec. Výhodně urikáza není zkrácena natolik, že by byl odstraněn lysin.
Odborníkovi je jasné, že konjugáty urikázy s nosičovým komplexem nesmí obsahovat tolik vazeb, že by mohly podstatně snížit enzymatickou aktivitu urikázy ani tak málo vazeb, že by zůstala nepřijatelně imunogenní. Výhodně si konjugát uchová alespoň 70 % až 90 % urikolytické aktivity nemodifikovnaé urikázy, přičemž je stabilnější, čili si uchovává aktivitu při skladování, v savčí plazmě a/nebo séru při fyziologické teplotě na rozdíl od nemodifikované urikázy. Uchování alespoň 80 % až 85 % urikolytické aktivity by bylo přijatelné. Kromě toho konjugát podle výhodného provedení vynálezu projevuje podstatně sníženou imunogenicitu a/nebo imunoreaktivitu ve srovnání s nemodifikovaným proteinem. V jednom provedení vynález poskytuje urikázový protein zde popsaný, který může být modifikován navázáním na netoxický, neimunogenní, farmaceuticky přijatelný nosič jako je např. PEG, kovalentní vazbou alespoň jednoho lysinu obsaženého v urikázovém proteinu. Alternativně je urikáza modifikována kovalentní vazbou k nosiči méně než 10 lysiny své aminokyselinové sekvence. Jako alternativní provedení vynálezu lze uvážit navázání ke 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 nebo 9 lysinům.
Urikázový protein podle vynálezu je rekombinantní molekula, která obsahuje segmenty urikázy z ledvin paviána a prasete. Vynález poskytuje také modifikovanou sekvenci opičí urikázy. V jednom provedení poskytuje vynález chimérickou urikázu prase-pavián (PBC urikáza, viz sekvence id. č. 2), která obsahuje aminokyseliny (aa) 1 až 225 z prasečí urikázy (sekvence id. č. 7) a aminokyeliny 226 až 304 z urikázy paviána (sekvence id. č. 6, viz také sekvence na obr. 5) . V jiném ·· ····
9 9 · · ·· • ···· · ··· · ·· • · 9999 9999 999· • · 9 9 9 9 9 99
999 99 9 99999 provedeni poskytuje vynález chimérickou urikázu prase-pavián (PKS urikáza), která obsahuje aminokyseliny 1 až 288 z prasečí urikázy a aminokyseliny 289 až 304 z urikázy paviána (sekvence id. č. 4). Vynález zahrnuje i zkrácené deriváty PBC a PKS urikáz. Výhodné zkrácené formy PBC a PKS urikáz jsou zkráceny tak, že je odstraněno 6 aminokyselin z aminokonce proteinu nebo 3 aminokyseliny z karboxylového konce proteinu nebo obojí, reprezentativní sekvence je zde uvedena jako sekvence id. č. 8 (PBC amino-zkrácená), 9 (PBC karboxy-zkrácená), 10 (PKS aminozkrácená) a 11 (PKS karboxy-zkrácená). Každá z PBC urikázy, PKS urikázy nebo jejich zkrácených forem má o 1 až 4 lysiny více než kolik se vyskytuje v ostatních savčích urikázách, které byly dosud klonovány.
Předkládaný vynález poskytuje molekuly nukleové kyseliny (DNA a RNA) včetně izolovaných, purifikovaných a/nebo klonovaných forem molekul nukleové kyseliny, které kódují urikázu a zkrácenou urikázu podle vynálezu. Výhodná provedení jsou zde uvedena jako sekvence id. č. 1 (PBC urikáza) a sekvence id. č. 3 (PKS urikáza).
Předkládaný vynález poskytuje také vektory, expresní a klonovací, obsahující molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu.
Navíc předkládaný vynález poskytuje i hostitelské buňky obsahující vektory podle vynálezu.
Dále vynález poskytuje protilátky, které se specificky váží na urikázový protein podle vynálezu. Protilátky k úseku amino-části prasečí urikázy a karboxylové části urikázy z paviána, když se užijí jako konjugát, jsou užitečné k detekci chimérického proteinu PBC nebo jiných podobných chimérických proteinů. Výhodně protilátky k amino-části chimérické urikázy by neměly rozpoznávat aminokoncovou část urikázy paviána a podobně protilátky ke karboxylovému konci chimérické urikázy by neměly rozpoznávat úsek karboxylového konce prasečí urikázy. Výhodně vynález poskytuje protilátky, které se specificky váží ······ ·♦ · ·· · • · · ··· · · · · • 4 »4· ·*·· ·· · • · · · · · ···· · · · · ·· ···· ··· ·· · · · · · · ·· · · · na PBC nebo PKS, ale neváži se na nativní proteiny, jako je prasečí urikáza a/nebo urikáza paviána.
V jiném provedení vynálezu lze užít vynález pro přípravu farmaceutického přípravku ke snížení kyseliny močové v tělních tekutinách jako je moč a/nebo sérum nebo plazma, kterýžto přípravek obsahuje alespoň jeden urikázový protein nebo urikázový konjugát podle vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič, ředidlo nebo excipient.
Předkládaný vynález může být využit ke snížení kyseliny močové v tělních tekutinách savců. Snížení spočívá v tom, že se savci podává přípravek obsahující urikázu nebo urikázový konjugát podle vynálezu v množství, které je účinné pro snížení kyseliny močové, a dále obsahující ředidlo, nosič nebo excipient, kdy jde výhodně o farmaceuticky přijatelné ředidlo, nosič nebo excipient. Savec je výhodně člověk.
Přípravek podle vynálezu lze podávat např. injekcí, a sice intravenózní, intradermální, subkutánní, intramuskulární nebo intraperitoneální. Zvýšená hladina kyseliny močové může být v krvi nebo moči, a může být spojena s dnou, tofy, nedostatečností ledvin, orgánovou transplantací nebo maligním onemocněním.
Jiné provedení předkládaného vynálezu poskytuje izolace a purifikace urikázy z roztoku, který obsahuje urikázu a např. buněčný a subbuněnčný debris jako pzůstatek rekombinantního způsobu přípravy. Výhodně způsob purifikace podle vynálezu využívá omezené rozpustnosti savčí urikázy při nízkém pH (Conlev a kol. 1979) a opláchnutím surového rekombinantního extraktu při pH 7 až 8,5 odstraní většinu proteinů rozpustných při tomto pH, zatímco aktivní urikáza je solubilizována v pufru, výhodně uhličitanovém pufru, při pH 10 až 11, výhodně 10,2. Solubilizovaná aktivní urikáza se pak nanese na kolonu s iontoměničem, jako je např. kolona s O-Sepharose, která se propláchne gradientem od nízké do vysoké koncentrace soli v pufru s pH přibližně 8,5, a pak se aktivní purifikovaná ·· · ···
··· ·· · ··· ·· urikáza získá elucí gradientem chloridu sodného v pufru uhličitanu sodného s pH 10 až 11, výhodně 10,2. Enzym může být dále purifikován gelovou filtrační chromatografií při pH 10 až
11. V tomto stadiu může být enzym ještě dále purifikován snížením pH na hodnotu 8,5 nebo nižší, čímž se selektivně precipituje urikáza, avšak nikoliv rozpuštěné nečistoty. Po opláchnutí při nízkém pH (7 až 8) se pak urikáza solubilizuje při pH přibližně 10,2. Preparát urikázy se pak může analyzovat odborníkovi známými metodami pro analýzu farmaceutických přípravků jako je některý druh vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC), jiné chromatografické metody, rozptyl světla, centrifugace a/nebo gelová elektroforéza.
Popis obrázků
Obr. 1. Analýza SDS-merkaptoetanol-PAGE (12 % gel).
Obr. 2. Doba oběhu (biologický poločas) nativní urikázy a PBC urikázy modifikované PEG.
Obr. 3. Vztah mezi aktivitou urikázy v séru a koncentrací kyseliny močové v moči a séru.
Obr. 4. Udržování hladiny urikázové aktivity v oběhu (měřené v séru) po opakovaných injekcích.
Obr. 5. Dedukovaná aminokyselinová sekvence chimérické urikázy prase-pavián (PBC urikázy) a prasečí urikázy obsahující mutace R291K a T301S (PKS urikáza) porovnané se sekvencemi urikázy prasete a paviána.
Obr. -6. Srovnáni aminokyselinových sekvencí PKS a prasečí urikázy.
000 ·« ·ι<· ·<· • 00 0 · · ·· • 0 0 00 0 000 ·0
0000 0000 00 0
000«··
000 00 000
Obr. 7. Srovnáni aminokyselinových sekvenci PBC a PKS.
Obr. 8.
Srovnáni aminokyselinových sekvenci PBC a prasečí urikázy.
Obr. 9. Srovnání aminokyselinových sekvencí prasečí urikázy a
D3H.
Obr. 10. Srovnání aminokyselinových sekvencí PBC a D3H.
Obr.
11-1 a 11-2. Srovnání kódujících a prasečí urikázy při dosažení nejlepší „Bestfit softwaru GCG).
sekvencí shody cDNA PKS (algoritmus
Obr. 12-1 a 12-2. Srovnání kódujících a urikázy paviána při dosažení nej lepší „Bestfit softwaru GCG).
sekvenci cDNA PKS shody (algoritmus
Obr. 13-1 a 13-2. Srovnání kódujících urikázy při dosažení nejlepší softwaru GCG).
a prasečí „Bestfit
Obr. 14-1 sekvencí
CDNA PBC shody (algoritmus a 14-2. Srovnání kódujících sekvencí urikázy paviána při dosažení nej lepší shody „Bestfit softwaru GCG).
cDNA PBC a (algoritmus
Předkládaný vynález poskytuje urikázové proteiny, které jsou vhodnými meziprodukty pro zlepšené konjugáty urikázy s polymery, které jsou rozpustné ve vodě, výhodně polyethylenglykoly nebo polyethylenoxidy. Termín urikáza zde označuje jak individuální podjednotky tak i nativní tetramer, pokud není výslovně uvedeno jinak.
Ačkoliv člověk nevytváří aktivní enzym, transkripty mRNA urikázy byly amplifikovány z RNA z lidských jater (Wu a kol.
• φ • φ • · · φ φ φ ·· • φφφφ φ φ φ φ ·φ • · φ φ φ φφφφφφφφ • · φφφφ φφ ·· ··♦ φφ φ φφ
1992). Teoreticky je možné, že některé transkripty jsou translatovány, a i když peptidové produkty nemají plnou délku nebo jsou nestabilní, mohou být zpracovány buňkami prezentujícími antigen a tudíž hrát roli pro určení imunitní reakce na exogenní urikázu použitou k léčení. Teoreticky je také možné rekonstruovat a exprimovat lidskou cDNA pro urikázu tím, že se odstraní dvě známé „nonsense mutace. Avšak je velmi pravděpodobné v nepřítomnosti selekčního tlaku se v lidském genu v průběhu milionů let od vzniku první nonsense mutace nahromadily škodlivé „missense mutace (Wu a kol. 1989, Wu a kol 1992). Identifikovat a „opravit všechny mutace, aby se získala maximální katalytická aktivita a stabilita proteinu by však bylo velmi obtížné.
Původci zjistili, že existuje vysoká míra homologie (podobnosti) mezi dedukovanou aminokyselinovou sekvencí lidské urikázy a prasečí urikázy (přibližně 86 %) a urikázy paviána (přibližně 92 %)(viz obr. 6 až 14, pro příklady srovnání podobnosti), zatímco lidská urikáza a urikáza z A. flavus sdílejí homologii (podobnost) menší než 40 % (Lee akol. 1988, Reddy a kol. 1988, Wu a kol. 1989, Legoux a kol. 1992, Wu a kol. 1992). Předkládaný vynález poskytuje rekombinantní urikázový protein ze dvou různých savců, který byl navržen tak, že je méně imunoreaktivní pro člověka než podstatně vzdálenější enzymy z baktérií nebo hub. Lze očekávat, že použití derivátů savčí urikázy bude podstatně přijatelnější pro pacienty i pro lékaře.
Zkušenosti ukazují, že aktivovaný PEG, jaký byl použit pro přípravu PEG-ADA a modifikaci jiných proteinů, se váže prostřednictvím primárních aminoskupin aminokyselinových zbytků amino-konce (pokud jsou přítomny a nejsou blokovány) a epsilonaminoskupin lysinových zbytků. Tato strategie je užitečná jednak proto, že mohou být užity mírné reakční podmínky, a také proto, že pozitivně nabité lysinové zbytky mají tendenci být lokalizovány na povrchu proteinu. Tento druhý rys je důležitý, • · ·· neboť pro jakýkoliv terapeutický protein bude požadovaný účinek modifikace charakteristice PEG pomocí PEG záviset zčásti na (např. hmotnosti, rozvětvené a pod.), ale také na počtu a míst proteinu pro PEG vzhledem k epitopům elementům, které určují funkci a clearance proteinu. Byla navržena strategie zvýšení schopnosti PEG modifikace „maskovat epitopy a snížení imunogenicity semi-selektivním vnesením nových lysinových zbytků pro potenciální adici PEG (Hershfield a kol. 1991). Tato strategie využívá mutagenezi k pro lysin, náboj a má ukazatele polymeru struktuře vybraných substituce, efekt na nebo nerozvětvené distribuci vazebných A~i a strukturním nahrazení což je minimální kodonů pro arginin kodony která zachovává pozitivní počítačově modelované pravděpodobnosti a antigenicity (užitečné, když je aminokyselinová sekvence).
Jako experimetální ověření této strategie rekombinantní purinnukleosidfosoforyláza . Substitutice Lys ž zvýšilo počet
17, aniž by se trojitá mutanta přibližně 70
EPNP povrchové známa pouze byla z E.
užita coli za Arg lysinových změnila katalytická si zachovala plnou % dostupných NH2 skupin byly vneseny zbytků aktivitu po modifikaci nadbytkem disukcinyl-PEG5000.
Titrace reaktivních skupin po srovnání trojitá mutanta by mohla ve přijmout PEGylace u enzymu na více navíc jeden PEG poločas typu tak : dnů. Po zvyšuje divokého než 6 řetězec oběhu mutanty sérii
PEGylaci předpokládá, že divokého typu podjednotku. poločas) jak z asi 4 hodin s enzymem na každou (biologický EPNP u myší intraperitoneálních injekcí v týdenních/dvoutýdenních intervalech všechny myši léčené oběma nemodifikovanými EPNP, a 10 ze 16 myší (60 %) myší po injekci PEGylovaného EPNP divokého typu vytvořily vysoké hladiny protilátek anti-EPNP a výrazně se u nich snížil biologický poločas enzymu. Naproti tomu pouze 2 z 12 myší (17 %) léčených * · · ·
PEG-EPNP mutantou projevily rychlou clearance (vymizeni), nízká hladina protilátek u těchto myši nekorelovala s biologickým poločasem. Tato strategie byla tedy úspěšná v podstatném snížení imunogenicity, i když pouze jeden ze tří nových lysinu byl modifikován po působení aktivovaného PEG.
Každá z podjednotek urikázy paviána a prasete se skládá z 304 aminokyselinových zbytků, z nichž je 29 lysinových zbytků (tj. přibližně vždy jeden z deseti zbytků). Počáteční pokusy vnést 2 substituce Lys za Arg do klonované cDNA pro urikázu paviána, a také substituce v kodonu pro glycin v poloze 208, kde je v lidské sekvenci urikázy lysin, za lysin, vedly k expresi mutovaného enzymu paviána, který měl výrazně sníženou urikázovou katalytickou aktivitu. Z těchto experimentů bylo zřejmé, že schopnost enzymu zachovat urikázovou aktivitu po záměně argininu lysinem v sekvenci savčí DNA byla nepredikovatelná.
Tudíž bylo oceněno jako výhoda, že aminokyselinový zbytek 291 v sekvenci urikázy paviána je lysin, ale odpovídající zbytek v sekvenci prasete je arginin. Restrikční místo Apal přítomné v obou cDNA bylo využito pro konstrukci chimérické urikázy, kde prvních 225 aminokyselin pochází z prasečí cDNA a 79 aminokyselin karboxylového konce pochází z cDNA paviána.
Výsledná chimérická urikáza prase-pavián (PBC urikáza) (viz sekvence id. č. 3) obsahuje 30 lysinových zbytků, tedy o jeden více než každý z parentálních enzymů. Dalším rysem PBC urikázy je to, že v části pocházející z paviána se liší 4 ze 79 aminokyselinových zbytků od lidské sekvence, zatímco prasečí a lidská sekvence se liší v 10 aminokyselinách ve stejném úseku.
Následně byla zkonstruována mimořádně lysin v poloze 291 pouze nahrazením threoninu urikáza, sekvence id. č. 4 v předchozím odstavci, kde modifikovaná verze PBC, která má jinak se liší od prasečí urikázy poloze 301 serinem („praseKS Vzhledem k výsledkům popsaným několik dalších inzercí lysinu proj evilo škodlivě na aktivitě, nedalo se očekávat, že PBC • · · * · · • · · * · · • to to « · · • · to · · ······· to • · · · to to to· • · · ·· ·· · ·· · a PKS chimérické urikázy budou plně aktivní jako nemutovaná nativní prasečí urikáza a přibližně čtyřikrát více aktivnější než nemutovaná urikáza paviána.
Předkládaný vynález poskytuje rekombinantní chimérickou urikázu prase-pavián, složenou z částí sekvence urikázy z jater prasete a paviána. Jeden příklad takové chimérické urikázy obsahuje prvních 225 aminokyselin ze sekvence prasečí urikázy (sekvence id. č. 7) a posledních 79 aminokyselin ze sekvence urikázy paviána (sekvence id. č. 6), je to urikáza prasepavián, zkráceně PBC, znázorněná na obr. 6 a sekvenci id. č. 2). Další příklad takové chimérické urikázy obsahuje prvních 288 aminokyselin ze sekvence prasečí urikázy (sekvence id. č. 7) a posledních 16 aminokyselin ze sekvence urikázy paviána (sekvence id. č. 6) . Jelikož se tato druhá sekvence liší od prasečí sekvence pouze ve dvou pozicích, má lysin (K) místo argininu v poloze 291 a serin (S) místo threoninu v poloze 301, tato mutanta se označuje jako prase-K-S, zkráceně PKS urikáza.
Předkládaný vynález také poskytuje vektory (expresní a klonovací) obsahující molekuly nukleové kyseliny kódující proteiny podle vynálezu. Výhodné vektory jsou ty, které jsou zde uvedeny v příkladech. Odborníkovi je jasné, že nukleové kyseliny mohou být vloženy do expresního vektoru. např. plazmidu, ve správné orientaci a čtecím rámci vhodném pro expresi. Pokud je to třeba, nukleová kyselina (DNA) se spojí s vhodnými sekvencemi DNA pro regulaci transkripce a translace, které jsou rozpoznávány v daném hostiteli, ačkoliv takové sekvence jsou obecně dostupné v expresních vektorech, které se v oboru užívají a odborníkovi jsou známy. Vektor je pak standardními metodami vnesen do hostitelské buňky. Obecně platí, že ne všechny hostitelské buňky jsou transformovány vektorem. Je proto potřeba selektovat transformované buňky, jedna ze známých metod selekce spočívá v tom, že se do sekvence expresního vektoru vloží sekvence DNA, včetně vhodných regulačních prvků, která kóduje selekční markér, tj . znak exprimovaný v transformovaných buňkách, např. rezistenci k antibiotikům, alternativně gen pro selekční znak může být v jiném vektoru, který je užit pro společnou transformaci (kotransformaci) hostitelské buňky. Vektory obsahují také vhodné promotory, jako je např. řídit expresi (transkripci hostitelské buňce, např. transformovaná.
E.
prokaryotický promotor schopný translaci) DNA coli, která v bakteriální je vektorem že jsou dostupné (např. E. coli
Saccharomyces mnohé expresní
Bacillus kvasinkových (např.
hub (např. Aspergillus} a také buněk.
cerevisiae'), rostlinných,
Odborníkovi je známo, systémy, včetně bakteriálních subtilis) , vláknitých zvířecích nebo hmyzích
Vhodné vektory obsahují prokaryotický replikon, jako např. ColEl ori, pro množení v prokaryotických buňkách, typické prokaryotické plazmidové vektory jsou např. pUC18, pUC19, pUC322 a pBR329 komerčně dostupné od firmy BIORAD Laboratories (Piscataway, NJ). Typickým plazmidovým vektorem pro savčí buňky je pSVL dostupný od firmy Pharmacia (Piscataway, NJ) . Tento vektor užívá pozdní promotor SV40 k řízení exprese klonovaného genu a nejvyšší hladina exprese byla zjištěna u buněk tvořících T antigen, jako jsou např. buňky COS-1. Příklad indukovatelného savčího expresního vektoru je pMSG, který je dostupný také od Pharmacia. Tento vektor užívá pro řízení exprese klonovaného genu glukokortikoidem indukovatelný promotor z dlouhé terminální repetice myšího viru rakoviny prsu. Vhodné plazmidové vektory pro expresi v kvasinkách jsou např. pRS403406 a pRS413-416, které jsou dostupné od firmy Stratagene Cloning Systems (LaJolla, CA). Plazmidy pRS403, pRS404, pRS405 a pRS406 jsou kvasinkové integrující plazmidy (Yip) a obsahují kvasinkové selekční markéry HIS3, TRPÍ, LEU2 a URA3. Plazmidy pRS413-416 jsou kvasinkové centromerové plazmidy (Ycp).
Kromě toho, předkládaný vynález poskytuje hostitelské buňky obsahující takové vektory. K výhodným hostitelským buňkám podle vynálezu patří buňky popsané v příkladech.
Urikázový protein podle předkládaného vynálezu může být konjugován prostřednictvím biologicky stálé, netoxické kovalentni vazby s relativně malým počtem řetězců PEG, aby se zlepšil jeho biologický poločas, zvýšila rozpustnost a snížila imunoreaktivita. K takovým vazbám patři např. uretanové (karbamátové) vazby, vazby sekundární aminové skupiny a amidové vazby. Různé aktivované PEG vhodné pro takovou konjugaci jsou komerčně dostupné např. od Shearwater Polymers, Huntswille, AL.
Předkládaný vynález se také může užit pro výrobu farmaceutického přípravku obsahujícího urikázový protein jako konjugát. Takové konjugáty jsou v podstatě neimunogenní a přitom si uchovávají alespoň 70 %, výhodně alespoň 80 %, a ještě výhodněji alespoň 90 % nebo více urikolytické aktivity původního nemodifikovaného enzymu. Ve vodě rozpustné polymery vhodné pro použití v předkládaném vynálezu obsahují lineární i rozvětvené polyethylenglykoly nebo polyethylenoxidy, obecně známé jako PEG. Jeden příklad rozvětveného PEG je předmětem patentu USA č. 5,643,575.
V jednom provedení vynálezu je průměrný počet lysinových zbytků vložených v jedné urikázové jednotce mezi 1 a 10. Ve výhodném provedeni vynálezu je počet dodatečných lysinu 2 až 8. Je třeba mít na paměti, že počet lysinu nemůže být příliš velký, aby urikázového konjugované proteinu, neměl škodlivý účinek proteinu. Molekuly PEG prostřednictvím lysinových výhodně prostřednictvím na katalytickou aktivitu v konjugátu zbytků lysinového jsou výhodně v urikázovém zbytku nebo lysinových zbytků, které se v molekule přirozeně nevyskytují, a které byly vneseny do úseku molekuly zkonstruovaného proteinu, která v přírodním stavu v této poloze lysin neobsahuje.
Předkládaný vynález poskytuje způsob, jak zvýšit dostupná místa v urikázovém proteinu pro připojeni PEG, která nejsou škodlivá, kdy se nativní urikázový protein modifikuje takovým
• ♦ · ·· ··· způsobem, že se do něho vnese alespoň jeden lysinový zbytek. Výhodně tento způsob obsahuje nahrazeni argininových zbytků lysinovými zbytky.
Konjugáty urikáza-PEG podle vynálezu jsou užitečné pro snížení hladin (tj. redukci množství) kyseliny močové v krvi a/nebo moči savců, výhodně člověka, a lze je užít pro léčení zvýšené hladiny kyseliny močové spojení s dnou, dnavými tofy, nedostatečností ledvin, orgánovými transplantacemi a maligními onemocněními.
Konjugáty PEG-urikáza se savci, který má příliš vysokou hladinu kyseliny močové, podávají jakýmkoliv známým způsobem, např. perorálně, klystýrem nebo čípkem, intravenózně, subkutánně, intradermálně, intramuskulárně a intraperitoneálně (Patton, J.S. a kol.(1992) Adv. Drug Delivery Rev 8: 179-228.
Účinná dávka PEG-urikázy je závislá na hladině kyseliny močové a velikosti pacienta. V jednom provedení vynálezu je PEG-urikáza podávána ve farmaceuticky přijatelném excipientu nebo ředidle v množství 10 μς až 1 g. Ve výhodném provedení je podávané množství 100 pg až 500 mg. nejvýhodněji je konjugát PEG-urikáza podáván v množství 1 mg až 100 mg, jak např. 5 mg, 20 mg nebo 50 mg. Tyto uvedené hmotnosti se týkají množství proteinu v konjugátu.
Farmaceutické přípravky obsahující PEG-urikázu se připraví konvenčními technikami, např. jak je popsáno v příručce Remington's Pharmaceutical Sciences, 1985, Easton, P.A., Mack Publishing Co.. K vhodným excipientům pro injikovatelný přípravek patří např. fosfátem pufrovaný fyziologický roztok, Ringerův roztok s laktátem, voda, polyoly a glycerol. Farmaceutické přípravky pro parenterální injekce obsahují farmaceuticky přijatelnou sterilní vodné nebo jiné roztoky, disperze, suspenze nebo emulze, a také sterilní prášky pro rekonstituci pře použitím na sterilní injikovatelný roztok nebo suspenzi. Tyto .přípravky mohou obsahovat další složky, jako např. konzervační látky, solubilizační činidla, ·· ····
4
9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 99 9 9 · 4 · 9
4 ··· 9999999 9
99999 99 9 99 4 stabilizační činidla, zvlhčovači činidla, emulgátory, pufry, antioxidanty a ředidla.
PEG-urikáza může být také ve formě přípravku s řízeným uvolňováním (terapeutického systému) pro implantaci pacientovi, který kontinuálně reguluje hladinu kyseliny močové v krvi a moči. Tak např. polymléčná kyselina, polyglykolová kyselina, regenerovaný kolagen, poly-L-lysin, alginát sodný, gellanová klovatina, chitosan, agaróza, multilamelárni liposomy a mnohé další konvenční depotní přípravky obsahující bioerodovatelné nebo biodegradovatelné materiály mohou být formulovány s biologicky účinnými látkami. Tyto materiály, když jsou implantovány nebo injikovány, se postupně rozpadají a uvolňuji účinnou látku do okolní tkáně. Tak např. jedna metoda enkapsulace PEG-urikázy obsahuje způsob popsaný v patentu USA 5,653,974, který je zahrnut formou odkazu. Použití biologicky erodovatelných nebo biologicky degradovatelných nebo i jiných depotních přípravků výslovně spadá do rozsahu předkládaného vynálezu. Použití infúzní pumpy a matricového zásobníkového systému pro podávání PEG-urikázy spadá také do rozsahu vynálezu. PEG-urikáza může být také výhodně uzavřena v micelách nebo liposomech. Technologie enkapsulace do lipozomů je odborníkům dostatečně známa, viz např. Lasic,D. a kol. (ed.), Stealth Liposomes, Boča Raton, FL, CRC Press.
Farmaceutické přípravky obsahující PEG-urikázu podle předkládaného vynálezu sníží potřebu hemodialýzy u pacientů s vysokým rizikem urátem indukovaného renálního selhání, např. u příjemců orgánového transplantátu (viz Venkataseshan, V.S. a kol., 1990, Nephron 56: 317-321) a pacientů s některými maligními chorobami. U pacientů s velkou akumulací krystalického urátu (tofy) takové farmaceutické přípravky zlepší kvalitu života rychleji než v současnosti dostupné přípravky.
Následující příklady, které vynález nijak neomezují, ilustrují různé aspekty předkládaného vynálezu.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
A. Konstrukce cDNA pro PBC, PKS a příbuzné urikázy
Standardní metody, a kde to bylo přiměřené, také instrukce výrobce, byly užity pro přípravu celkové buněčné RNA a PCR amplifikaci (patenty USA č. 4,683,195, 4,683,202,
4,965,188 a 5,075,216) různých cDNA urátoxidázy, také pro klonování a sekvencování těchto cDNA (Erlich 1989, Sambrook a kol., 1989, Ausubel 1998). Oligonukleotidové primery pro PCR (polymerázovou řetězovou reakci) urátoxidázy prasete a paviána (tabulka 1) byly navrženy na základě publikovaných kódujících sekvencí (Wu a kol., 1989) pomocí programového vybavení PRIME (Genetics Computer Group, lne.).
Tabulka 1
Primery pro PCR amplifikaci cDNA pro urátoxidázu
cDNA urikázy z jater prasete
„sense 5' gcgcgaattccATGGCTCATTACCGTAATGACTACA 3'
„antisense 5'gcgctctagaagcttccatggTCACAGCCTTGAAGTCAGC 3'
cDNA urikázy z jater paviána D3H
„sense 5 ' gcgcgaattccATGGCCCACTACCATAACAACTAT 3'
„antisense 5'gcgcccatggtctagaTCACAGTCTTGAAGACAACTTCCT 3'
Sekvence pro restrikční enzymy (uvedené malými písmeny) vnesené na konce primerů jsou „sense EcoRi a Ncol sekvence a „antisense Ncol, HindlII a Xbal (pro prase) a Ncol (pro paviána). V případě „sense primeru pro paviána, třetí kodon GAC (aspartát) přítomný v urát oxidáz epavána (Wu a kol., 1992) byl nahrazen GAC (histidin) , t j. kodonem, který je v této pozici přítomen v lidském pseudogenu urátoxidázy (Wu a kol. 1992). Z tohoto důvodu rekombinantní urátoxidáza paviána ·· ··*· ·· · ·· ··· · · ♦ · · · • · · · · · ··· · · • · · · · ······· · vytvořená užitím těchto primerů byla nazvána D3H urátoxidáza paviána.
Celková buněčná RNA z jater prasete a paviána byla reverzně transkribována pomoci soupravy pro syntézu prvního řetězce cDNA (Pharmacia Bioetch lne., Piscataway, NJ) . PCR amplifikace užitím Taq DNA polymerázy (GIBCO BRL, Life Technologies, Gaithersburg, MD) byla provedena v teplotním cyklovacím termostatu (Ericomp, San Diego, CA) s programem (30 s-95 °C, 30s-55 °C, 60 s - 72 °C, po 20 cyklů, pak následovalo 10 cyklů 30s-95 °C, 60s, 70 °C). PCR produkty urátoxidázy byly naštěpeny EcoRI a HindlII a klonovány do vektoru pUC18 (v případě prasete) nebo byly klonovány přímo (v případě paviána i prasete) pomocí TA klonovacího systému (Invitrogen, Carlsbad, CA). cDNA klony byly transformovány do kmenu XLl-Blue E. coli (Stratagene, La Jolla, CA) . Plazmidová DNA obsahující klonovanou cDNA pro urátoxidázu byla připravena a vložená cDNA sekvence byla sekvencována standardním terminančním postupem s dideoxynukleotidy. Klony, které obsahovaly publikovanou kódující sekvenci DNA urátoxidázy (s výjimkou substituci D3H v urátoxidáze paviána v tabulce 1) byly zkonstruovány a ověřeny v sérii dalších kroků s využitím standardních metod rekombinantní DNA (genového inženýrství).
cDNA prasete a D3H cDNA paviána obsahující kódující sekvence plné délky byly vloženy do expresního vektoru pET (Novagen, Madison, WI) následujícím postupem: D3H urikáza paviána byla vystřižena z TA plazmidu pomocí restrikčních enzymů Ncol a BamHI a pak byla subklonována do klonovacích míst Ncol a BamHI expresních plazmidu pET3d a pET9d. cDNA urikázy prasete v plné délce byla vystřižena z klonu v plazmidu pUC restrikčními enzymy EcoRI a HindlII a subklonována do klonovacích míst EcoRI a HindlII v pET28b. Kódující úsek cDNA prasete byl také vložen do míst Ncol a BlpI expresního plazmidu pET9d po vystřižení míst Ncl a BlpI pET28b.
Chimérická cDNA prase-pavián (PBC) byla zkonstruována ·· ···· ·· · ·· · ··· · · ····· • · ··· · · · · · ·· • · ··· ······· ·· ·· ♦ · · · · ·· ·· ··· ·· · ·· ··· vystřižením restrikčního fragmentu Ncol-Apal velikosti 624 bp z cDNA D3H urikázy paviána z pET3d-D3H klonu paviána a nahrazením segmentu D3H paviána odpovídajícím fragmentem NcolApal velikosti 624 bp z prasečí cDNA. Výsledná cDNA PBC urátoxidázy obsahovala kodony 1 až 225 prasečí urátoxidázy spojené ve čtecím rámci s kodony 226 až 304 urátoxidázy paviána.
cDNA urátoxidázy prase-KS byla zkonstruována vystřižením restrikčního fragmentu Ncol-Ndel velikosti 864 bp z cDNA urátoxidázy D3H paviána z pET3d-D3H klonu, a pak nahrazením úseku D3H segmentu paviána odpovídajícím fragmentem Ncol-Ndel z prasečí cDNA velikosti 864 bp. Výsledná cDNA pro PKS urátoxidázu obsahuje kodony 1 až 228 prasečí urátoxidázy spojené ve čtecím rámci s kodony 289 až 304 urátoxidázy paviána.
Aminokyselinové sekvence urátoxidázy D3H paviána, prasete, PBC a PKS jsou ukázány na obr. 5 a jsou také uvedeny v seznamu sekvencí. Standardní metody byly použity k přípravě 15% glycerolových zásobních roztoků všech těchto transformovaných baktérií a byly uloženy do -70 °C. Když byly tyto buňky rozmraženy a byl izolován rekombinantní enzym (tab. 2), ukázalo se, že prasečí urikáza, PBC chiméra a prase-KS urikáza měly velmi podobnou specifickou aktivitu, která byla přibližně 4 až 5 x vyšší než specifická aktivita rekombinantní urátoxidázy paviána. Zvýšení tohoto řádu bylo potvrzeno i v několika dalších experimentech. Specifická aktivita PBC urikázy připravené několika odlišnými postupy se lišila řádově 2 až 2, 5x.
·· ···· • 9
9 99
9 99
9 9 9 9 9
9 9 9 9 9
9 9 9 9 9999999 9
9 9 9 9 9 9 9
999 9 9 9 9 9 9
Tabulka 2
Srovnáni exprimovaných savčích urikáz
Konstrukt Specifická aktivita* (U/mg) Relativní aktivita
PBC 7,02 1,00
Prase-KS 7,17 1,02
Prase 5,57 0,79
Pavián 1,36 0,19
* Protein byl stanoven metodou podle Lowryho. Aktivita urikázy byla stanovena spektrofotometricky (Priest a Pitts 1972). test byl proveden při 23 až 25 °C v lem křemenné kyvetě obsahující 1 ml reakční směsi (O,1M borát odný, pH 8,6, O,1M kyselina močová). Vymizení kyseliny močové bylo monitorováno sledováním snižování absorbance při 292 nm. Jedna mezinárodní jednotka (IU) urikázy katalýzuje vymizení 1 gmol kyseliny močové za 1 minutu.
E. coli BL21 (DE3)pLysS transformanty s urikázovvými cDNA-pET konstrukty uvedenými v tabulce 2 byly vysety na LB agar obsahující antibiotika pro selekci (karbenicilin a chloramfenikol pro pET3d (praseKS), kanamycin a chloramfenikol pro pET9d (PBC, prase, pavián) podle instrukcí v příručce pro pET systé, (Novagen, madison, WI). 5ml kultury (LB plus antibiotika) byly inokulovány jedinou transformovanou kolonií a kultivováno 3 hodiny při 37 °C,. Pak byly přeneseny alikvoty po 0,1 ml do 100 ml LB média obsahujícího selektivní antibiotika a 0,1% laktózu (pro indukci exprese urikázy). Po kultivaci ve 37 °C přes noc byly bakteriální buňky z 0,5ml alikvotu z kultury extrahovány do nanášecího pufru SDS-PAGE a pak byly analyzovány na SDS-merkaptoetanol-PAGE, to zajistilo, že bylo exprimováno srovnatelné množství urikázového proteinu v každé ze 4 kultur (výsledky nejsou ukázány). Zbývající buňky z každé 100 ml kultury byly sklizeny centrifugací a promyty v PBS. Pak
9999 • · • ··· ·· · ·· · • · · · ··· • · · · * ·· • · ··· ······· · · ·· · · · · 9 99 ·· 999 99 9 99999 byly buňky resuspendovány ve 25 ml PBS, pH 7,4 (fosfátem pufrovaný fyziologický roztok) obsahujícím ImM AEBSF inhibitor proteáz (Calbiochem, San Diego, CA) a pak lyžovány na ledu v zařízení pro rozrušení bakteriálních buněk (Bacterial Cell Disruptor, Microfluidics, Boston, MA). Nerozpustný materiál (obsahující urikázu) byl peletován centrifugací (20 190 x g, 4 °C, 15 minut). Pelety byly opláchnuty dvakrát 10 ml PBS a pak byly extrahovány přes noc ve 4 °C ve 2 ml 1M Na2C03, pH 10,2. Extrakty byly naředěny na 10 ml vodou a pak centrifugovány (20 190 x g, 4 °C, 15 minut) . Nakonec byly stanoveny koncentrace proteinu a aktivita urikázy.
Příklad 2
Exprese a izolace fermentoru) rekombinantní PBC urikázy (příprava ve
Buňky transformované vektorem pET3d-PBC urikáza byly vysety z glycerolových zásobních roztoků na plotny s LB agarem obsahuj ící v příručce připraveno v rotační karbenicilin a k systému pET.
200 ml inokula
2,4 chloramfenikol podle instrukcí kolonie bylo s antibiotiky sice postupme jediné počáteční kapalném LB-médiu při 37 °C, a rpm) systému pET pro maximalizaci retence byly buňky z této 200 ml kultury a byly resuspendovány v 50 ml čerstvého byla přenesena
1 média do fermentoru s vysokou
SLBH s karbenicilinem a třepačce (250 doporučeným v příručce k plazmidů. Při ODs25 sklizeny centrifugací média. Tato suspenze hustotou obsahujícího chloramfenikolem (složení média popsány v publikaci Sadlera a kultivace s O2 ve 32 °C isopropylthiogalaktosid (IPTG) indukoval produkci urikázy.
SLBH a funkce fermentoru jsou 1974). Po (OD525 = 19) v koncentraci kol.
hodinách byl přidán
0,4mM, aby
Po dalších šesti hodinách ·· ··«· «· · ·· · « « · ··· ···· • · ··· · · · · · · · • · · » · ······· · · ·· · · · » ··· ♦·· ·♦ · ·· *»· (OD525 - 37) byly bakteriální buňky sklizeny centrifugací (10 410 x g, 10 minut, 4°C), jednou opláchnuty PBS a uloženy zamražené v -20 ’C.
Bakteriální buňky (189 g) pak byly resuspendovány ve 200 ml PBS a lyžovány sonikací (sonikátor Heat Systém Sonicator XL, sonda model CL, Farmingdale, NY) čtyřikrát opakovaným 40vteřinovým pulzem se 100% intenzitou a s lminutovou přestávkou mezi pulzy, přičemž byly umístěny v lázni led/sůl. materiál nerozpustný v PBS (který zahrnuje také urikázu) byl peletován centrifugací ((10 410 x g, 10 minut, 4°C), pak pětkrát opláchnut 200 ml PBS. Urikáza z peletu nerozpustného v PBS byla extrahována do 80 ml 1M Na2CO3, pH 10,2, obsahujícího lmM fenylmethylsulfonyfluorid (PMSF) a 130 gg/ml aprotininu. Nerozpustné zbytky byly odstraněny centrifugací (20,190 x g, 2 hodiny, 4 °C) . Všechny další kroky purifikace byly provedeny ve 4°C (výsledky jsou shrnuty v tabulce 3).
Extrakt s pH 10,2 byl naředěn na 1800 ml lmM PMSF (Na2CO3 se snížil na 0,075M). Pak byl nanesen na kolonu (2,6 x 9 cm) naplněnou čerstvou Q-Sepharose (Phramacia Biotech, lne., Piscataway, NJ), která byla ekvilibrovaná 0, 075M Na2CO3, pH 10,2. Po nanesení byla kolona postupně promyta 1) 0,075M
Na2CO3, pH 10,2, dokud absorbance na výtoku A280 nebyla shodná z pozadím, 2) lOmM NaHCO3, pH 8,5, dokud hodnota pH neklesla na 8,5, 3)50 ml lOmM NaHCO3, pH 8,5, 0,15M NaCl, 4) lOOml gradientu 0,15M až 1,5M NaCl v lOmM NaHCO3, pH 8,5, 5) 150 ml lOmM NaHCO3, pH 8,5, 1,5M NaCl, 6) lOmM NaHCO3, pH 8,5, 7) 0,lM Na2CO3 pH 11, dokud na výtoku nebylo zvýšeno pH na 11. Nakonec byla urikáza eluovaná 500ml gradientu 0 až 0,6M NaCl v 0,lM Na2CO3 pH 11. Aktivity eluované ve dvou vrcholech absorbujících ve 280 nm byly odděleně sloučeny (frakce A a frakce B, viz tabulka 3) . Urikáza z každého ze sloučených vzorků pak byla precipitována snížením pH na 7,1 pomalým přidáváním 1M kyseliny octové a následnou centrifugací (7000 x g, 10 minut). Výsledné pelety byly rozpuštěny v 50 ml 1M Na2CO3 pH 10,2 a uchovány ······ ♦ · » e · · ··· · · * · » · · • 9 ··· · · · · 9 J » · · · φ ΦΦΦΦΦΦΦ * · * · φ « · · Φ w · • Φ » · Λ Φ · € Φ Φ Φ Φ · při 4 °C.
Tabulka 3
Purifikace rekombinantní chimérické PBC (prase-pavián) urikázy.
Výchozí hmotnost buněčné hmoty indukované IPTG = 189,6 g
Frakce Celkový protein (mg) Aktivita urikázy (U/ml) Celkem jednotek urikázy Specifická aktivita (U/mg)
pH 7 sonikace + pH 7 promytí 74, 9
pH 10,2 extrakt 4712 82,7 11,170 2,4
Q-Sepharose
Frakce A 820 11,5 1,081* 1,9
Frakce B 1809 31,7 4,080 2,3
pH 7,1 precipitace + nové rozpuštění
Frakce A 598 35,0 1,7458 3,0
Frakce B 1586 75,5 3,773 2,4
Celkový výtěžek 2184 5,521
* Urikáza přítomná ve frakci A začala precipitovat spontánně po eluci z kolony. Tudíž aktivita měřená v této fázi purifikace byla podhodnocena.
modifikovány (viz obr. 1, dráha 7) s retencí přibližně 60 %
Příklad 3
Preparace a PEGylace rekombinantní PBC urikázy v malém měřítku
Tento příklad ukazuje, že purifikovaná rekombinantní PBC urikáza může být využita pro přípravu PEGylované (modifikované
PEG) urikázy. V této, reakci byly všechny podjednotky urikázy φ · ΦΦΦΦ Φ · φ
ΦΦΦ « · ♦
Φ φ φ
I φ
• •φ katalytické aktivity (tab. 4).
A. Exprese a izolace PBC urikázy v malém měřítku (viz tab. 4 a obr. 1) kultura buněk E. coli BL21 (DE3)pLysS transformovaných pET3d-PBC cDNA byla inkubována na rotační třepačce (250 rpm) ve 37 °C. Při dosažené OD525 0,7 byla kultura indukována IPTG (0,4M, 6 hodin). Buňky byly sklizeny a zmrazený v -20 °C. Buňky (15,3 g) byly rozrušeny mražením a táním a pak extrahovány 1M Na2CO3, pH 10,2, lmM PMSF. Po centrifugací (12000 x g, 10 minut, 4°C) byl supernatant (85 ml) naředěn 1:10 vodou a pak nanesen na chromatografován na koloně s Q-Sepharose jak bylo popsáno v příkladu 1. Sloučené frakce obsahující urikázovou aktivitu byly koncentrována tlakovou ultrafiltrací užitím membrány PRM30 (Amicon, beverly, MA) . Koncentrát byl chromatografován na koloně (2,5 x 100 cm) naplněné Sephacryl
S-200 (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), která byla ekvilibrována a pak použita s 0,lM Na2CO3, pH 10,2. Frakce obsahující urikázovou aktivitu byly sloučeny a koncentrovány tlakovou ultrafiltrací jak bylo popsáno výše.
B. PEGylace koncentroavné Sephacryl S-200 PBC 8 urikázy
100 mg
(5 mg/ml, 2,9 μιηοΐ enzymu, 84,1 pmol lysinu) v 0, 1M Na2CO3,
pH 10,2, bylo ponecháno reagovat s dvojnásobným nadbytkem
(mol PEG:mol lysiny urikázy) aktivované formy PEG 60 minut ve 4 °C. PEGylovaná urikáza byla oddělena od nezreagovaných nebo hydrolyzovaných PEG tangenciální průtokovou diafiltrací. V tomto kroku byla reakce naředěna 1:10 0,lM Na2CO3, pH 10,2 a diafiltrována proti 3,5 násobku objemu 0,lM Na2CO3, pH 10,2, pak proti 3,5 násobku objemu 0,05M NaH2PO4,0,15M NaCl, pH 7,2. Filtraci sterilizovaný enzym byl stabilní ve 4 °C nejméně 1 měsíc.
»9 · · · * · ♦ · · · · ··· 9 9 9 9 9 9 9
9 9 99 9 9 9 9 · Φ Φ
9 · f 9999999 9 9
99999 99 9 99 *«·
Tabulka 4
Souhrnné údaje o purifikaci a PEGylaci rekombinantní chimérické urikázy prase-pavián (PBC urikázy)
Frakce Celkový protein (mg) Celková urikázová aktivita (pmol/min) Specifická aktivita (pmol/min/mg) Výtěžek aktivity (%)
A. Purifikace
Surový extrakt 1565 1010 0, 6 100
Q-Sepharose 355 1051 3, 0 104
Sephacryl S-200 215 1170 5, 5 116
B. PEGylace
S-200 urikáza 100 546 5,5 100
PEG-urikáza 97 336 3,5 62
Obr. 1 ukazuje analýzu frakcí získaných při purifikaci a PEGylaci rekombinantní chimérické urikázy prase-pavián (PBC urikázy) pomocí SDS-merkaptoethanol PAGE (12% gel). Jednotlivé dráhy znamenají: 1 = markéry (standardy) molekulové hmotnosti, 2 = SDS extrakt z neindukovaných buněk transformovaných pET3dPBC cDNA (E. coli BL21 (DE3)pLysS), 3 = SDS extrakt z buněk transformovaných pET3d-PBC cDNA indukovaných IPTG, 4 = surový extrakt (viz tabu. 5), 5 = sloučené koncentrované frakce urikázy z Q-Sepharose, 6 = sloučené koncentrované frakce urikázy ze Sephacryl S-200, 7 = PEGylované rekombinantní PBC urikáza ze Sephacryl S-200.
Výsledky uvedené v tab. 4 ukazují, že purifikovaná PBC urikáza může být modifikována se zachováním přibližně 60 % katalytické aktivity. V této PEGylační reakci byly všechny urikázové podjednotky modifikovány (obr. 1, dráha 7). Ve studiícjh, které zde' nejsou ukázány, měl PEGylovaný enzym podobné kinetické vlastnosti jako nemodifikovaná PBC urikáza • « • 9 • ·· (KM 10 až 20 μΜ). Důležité je, že modifikovaný enzym měl vyšší rozpustnost než nemodifikovaný enzym při fyziologickém pH (> 5 mg/ml v PBS ve srovnání s < 1 mg/ml). PEGylovaný enzym může být lyofilizován a pak rekonstituován v PBS, pH 7,2 s minimální ztrátou aktivity. V jiném experimentu původci srovnali aktivity PEG-PBC urikázy z klinickým přípravkem urikázy z A. flavus. Při pH 8,6 v borátovém pufru enzym z A. flavus měl 10 až 14 x vyšší Vmax a 2 x vyšší hodnotu KM. Avšak v PBS, pH 7,2 PEG-PBC urikáza a nemodifikovaný enzym z houby se lišily v urikázové aktivitě méně než dvakrát.
Příklad 4
Doba oběhu (bioloický poločas) nemodifikované a PEGylované urikázy
Obr. 2 ukazuje dobu oběhu (tj. dobu, po kterou zůstává účinná látka v oběhu) nativní a PEGylované PBC urikázy. Skupiny myší (Tři pro každý časový bod) byly i.p. injikovány 1 jednotkou nativní (kroužky) nebo PEG-modifikované (čtverečky) rekombinantní PBC urikázy (vlastní přípravek popsán v příkladu 3) . V uvedených časových bodech byla odebrány krev skupině 3 myší a byla určena aktivita urikázy v séru. PEGylované urikáza (popsaná v příkladu 3) měla biologický poločas přibližně 48 hodin, zatímco nemodifikovaný enzym méně než 2 hodiny (viz obr. 2) .
Příklad 5
Účinnost PEGylované urikázy podle vynálezu
Obr. 3 ukazuje vztah mezi aktivitou urikázy v séru a ·· · ·· • · · ů· • · · · ·· • « ·····*« · • · · ·· • ? <
koncentrací kyseliny močové v moči. V tomto experimentu homozygotní myši, Wu a kol. 1994) dostaly dvě injekce, v 0. a 72. hodině, 0,4 IU rekombinantní PBC urikázy, která byla modifikována PEG. Knock-out myši deficientní na urikázu byly v tomtopokusu použity proto, že na rozdíl od normálních myší, které mají urikázu, tyto myši, podobně jako lidé, mají vysokou hladinu kyseliny močové v krvi a tělních tekutinách a vylučují vysoké hladiny kyseliny močové v moči. Tato vysoká hladiny kyseliny močové způsobuje u myší vážná poškození ledvin, která jsou často fatální (Wu a kol. 1994).
Experimenty uvedené na obr. 3 demonstrují, že intraperitoneální injekce PEGyloveného přípravku rekombinantní PBC urikázy vedly u myší deficientních na urikázu ke zvýšení urikázové aktivity v séru, která byly doprovázena výrazným poklesem koncentrace kyseliny močové v séru a moči.
Příklad 6
Komplex konstrukt-nosič je neimunogenní
PEGylovaná rekombinantní PBC urikáza byla injikována opakovaně homozygotním myším deficientním na urikázu, aniž by došlok urychlení clearance, což je v souladu s tím, že není přítomna výrazná imunogenicita. Tp bylo také potvrzeno ELISA testem. Obr. 4 ukazuje udržování stálé hladiny urikázy v oběhu (měřené v séru) po opakovaných injekcích. PEGylovaná PBC urikáza byla podávána intraperitoneální injekcí v 6 až 10 denních intervalech. Aktivita urikázy v séru byla měřena 24 hodin po injekci.
Přiklad 7
Kovalentní vazba na lysin vnesený mutací
PEGylace purifikované rekombinantní PBC urikázy by měla vést k navázání PEG na nový lysinový zbytek (zbytek 291) . V tomto experimentu preparát PBC urikázy byl modifikován PEGylací. Může být stanoveno metodami odborníkovi známými, zda peptid obsahující nově vnesený lysin (zbytek 291) byl modifikován PEGylací.
·*·«·* «· · φ » • · ♦ 9·· · ΦΦ φ t ·*« · Φ Φ φ φφ • · · · Φ ·····*«φ ·· · ·· ΦΦφ • · « · · ·· Φ« 0 φ
Seznam citované literatury
Abuchowski A, Kazo GM, Vernoest CR, Jr., van Es T, Kafkewitz D, Nucci ML, Viau
AT et al (1984) Cancer therapy with modified enzymes. I. Antitumor properties of polyethylene glycol-asparaginase conjugates. Cancer Biochem Biophys 7:175-186
Abuchowski A, McCoy JR, Palczuk NC, van Es T, Davis FF (1977a) Effect of attachment of polyethylene glycol on immunogenicity and circulating life of bovine liver catalase. J Biol Chem 252:3582-3586
Abuchowski A, van Es T, Palczuk NC, Davis rr (1977b) Alteration of immunological properties of bovine sérum albumin by covalent attachment of polyethylene glycol. J
Biol Chem 252:3578-3581
Ausubel FM (1998) Current Protocols in Molecular Biology John Wiley &. Sons
Ahn KJ, Kim YS, Lee HC, Park K, Huh KB (1992) Cyclosporine-induced hvperuricemia after renal transplant: Clinical characteristics and mechanisms.
Transplantation Proceedings 24:1391-1392
Arellano F, Sacristan JA (1993) Allopurinol hypersensitivity syndrome: A review. Ann
Pharmacother 27:337-343
Becker MA (1988) Clinical aspects of monosodium uráte monohydrate crystal deposition disease (gout). Rheumatic Disease Clinics of North America 14:377-394
Becker MA, Roessler BJ (1995) Hvperuricemia and gout. In: Scriver CR, Beaudet AL,
Sly WS, Valle D (eds) The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, 7 th ed.
McGraw-Hill, New York, pp 1655-1677
Brogard JM, Coumaros D, Frankhauser J, Stáhl A, Stáhl J (1972) Enzymatic uricolysis:
A study of the effect of a fungal uráte-oxydase. Eur J Clin Biol Res 17:890-895 . .!*** ·· * ·· · ·«· · · · ♦ · · • · · · · ··!···· φ • · · · · » · · ····· ·· ♦ «·
Brogard JM, Stáhl A, Stáhl J (1978) Enzymatic uricolysis and its use in therapy. In:
Kelley WN, Arnold WJ, Weiner IM (eds) Uric Acid, Springer-Verlag, New York, pp515-524
Chaffee S, Mary A, Stiehm ER, Girault D, Fischer A, Hershfield MS (1992) IgG antibody response to polyethylene glycol-modified adenosine deaminase (PEG-ADA) in patients with adenosine deaminase denciency. J Clin Invest 89:1643-1651
Chen RHL, Abuchowski A, van Es T, Palczuk NC, Davis FF (1981) Properaes of two uráte oxidases modified by the covalent attachment of polyethylene glycol). Biochim Biophys Acta 660:293-298
Chua CC, Greenberg ML, Viau AT. Nucci M, Brenckman WD, Jr., Hershneid MS (1988) Use of polyethylene glycol-modified uricase (PEG-uricase) to treat hyperuricemia in a patient with non-Hodgkin lymphoma. Ann Int Med 109:114-117
Cohen LF, Balow JE, Magratn IT, Poplack DG, Ziegler JL (1980) Acute tumor Ivsis syndrome: A review of 37 patients with Burkitťs lymphoma. Am J Med 64:468-491
Conley TG, Priest DG (1979) Purífication of uricase from mammalian tissue. Preparative Biochemistry 9:197-203
Davis FF, Kazo GM, Nucci ML, Abuchowski A (1991) Reduction of immunogenicity and extension of circulating life of peptides and proteins. In: Lee VHL (eds) Peptide and Protein Drug Delivery, Marcel Dekker, New York, pp831-864
Davis S, Abuchowski A, Park YK, Davis FF (1981a) Alteration of the circulating life and antigenic properties of bovine adenosine deaminase in mice by attachment of polyethylene glycol. Clin Exp Immunol 46:649-652 1 to······ • · · · · · 4* 9 φ
Davis S, Park YK, Abuchowski A, Davis FF (1981b) Hypouricaemic effect of polyethylene glycol modified uráte oxidase. Lancet 1:281-283
Delaney V, Sumrani N, Daskalakis P, Hong JH, Sommer BG (1992) Hyperuricemia and gout in renal allograft recipients. Transplantadon Proceedings 24:1773-1774
Donadio D, Errera J, Navarro M, Izam P (1981) Anaphylaxis-like manifestations after intravenous injection of uráte oxidase in an asthmatic child with acute leukemia (letter). Noův Presse Med 10:711-712
Erlich HA (1989) PCR Technology. Principles and applications for DNA amplification Stockton Press, New York
Escudier B, Leclercq B, Tandonnet F, Nitenberg G (1984) Hyperuricemia resistant to uráte oxidase. Efficacy of high doses (letter). Presse Med 13:1340
Fam AG (1990) Strategies and controversies in the treatment of gout and hyperuricaemia. Balliere's Clinical Rheumatology 4:177-192
George T, Mandeli Br (1995) Gout in the transplant patient. J Clin Rheumatol 1:328334 ······
Gold GL, Fritz BD (1957) Hyperuricemia associated with the treatment of leukemia.
Ann Int Med 47:428-434
Greenberg ML, Hershfíeld MS (1989) A radiochemical-high-performance liquid chromatographic assay for uráte oxidase in human plasma. Anal Biochem 176:290-293
Hairis JM, Zalipsky S (Ed.) (1997) Polyethylene glycol) Chemistry and Biological ApplicationsACS, Washington, DC • Φ ·φφ » φ · φ • φ φ φ φ φ φφ • φφφφ φ φφφ φ φ φ φ φφφ φφφφφφφ φ
3F *«·* ··. ·« · «·
Hershfield Μ, S. (1997) Biochemistry and immunology of polyethylene glycol)modined adenosine deaminase (PEG-ADA). In: Harris JM, Zalipsky S (eds) Polyethylene glycol) Chemistry and Biological Applicatíons, ACS, Washington, DC, pp!45-154
Hershfield MS (1995) PEG-ADA replacement therapy for adenosine deaminase deficiency: An update after 8.5 years. Clin Immunol Immunopathol 76:S22S-S232
Hershfield MS (1996) Gout and uric acid metabolism. In: Bennett JC, Plum F (eds) Cecil Textbook of Medicíně, XX ed. WB Saunders, New York, ppl508-1515
Hershfield MS, Buckley RH, Greenberg ML. Melton AL, Schiff R, Hatem C, Kurtzberg J et al (1987) Treatment of adenosine deaminase deficiency with polyethylene glycolmodified adenosine deaminase. N Engl J Med 316:589-596
Hershfield MS, Chaffee S, Koro-Johnscn L. Mary A, Smith AA, Short SA (1991) Use of site-directed mutagenesis to enhance the epitope shielding effect of covalent modification of proteins with polyethylene glycol. Proč Nati Acad Sci USA 88:71857189
Hershfield MS, Mitchell BS (1995) Immunodeficiency diseases caused by adenosine deaminase deficiency and purine nucleoside pnosphorylase deficiency. In: Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D (eds) The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, 7 th ed. McGraw-Hill, New York, ppl725-1768
Hershfield MS, Seegmiller JE (1976) Gout and the regulation of purine biosynthesis. In: Quagliariello E (eds) Horizons in Biochemistry and Biophysics, Addison-Wesley, Reading, MA, ppi34-162 • · ··
3G
Jones DP, Stapleton FB, Kaiwinsky D, McKay CP, Kellie SJ, Pui CH (1990) Renal dysfunction and hyperuricemia at presentation and relapse of acute Iymphoblastic leukemia. Med Pediatr Oncol 18:283-286
Kelley WN, Fox IH, Pallela TD (1989) Gout and related disorders of purine metabolism. In: Kelley WN, Harris ED, Ruddy S, Sledge CG (eds) Textbook of Rheumatology, 3rd ed. WB Saunders, Philadelphia, ppl395-1448
Kissel P, Lamarche M, Royer R (1968) Modification of uricaemia and the excretion of uric acid nitrogen by an enzyme of fungal origin. Nátuře 217:72-74
Kissel P, Schmitt J, Streiff F, Makuary G, Schmidt C, Toussain P (1972) L'urate oxvdase: son intérět dans la prévention des hyperuricemies therapeutiques en hematologie. Ann Med Nancy 11:519-535
Lee CC, Wu X, Gibbs RA, Cook RG, Muzny DM, Caskey CT (1988) Generation of cDNA directed by amino acid sequence: Cloning of uráte oxidase. Science 239:12881291
Legoux R, Delpech B, Dumont X, Guillemot JC, Ramond P, Shire D, Caput D et al (1992) Cloning and expression in Escherichia coli of the gene encoding Aspergillus flavus uráte oxidase. J Biol Chem 267:8565-8570
London M, Hudson PM (1957) Uricolytic activity of purified uricase in two human beings. Science 125:937-938
Maséra G, Jankovic M, Zurlo MG, Locasciulli A, Rossi MR, Uderzo C, Recchia M (1982) Urate-oxidase prophylaxis of uric acid-induced renal damage in childhood leukemia. J Pediatr 100:152-155 • *
ΛMontagnac R, Schillinger F (1990) Anaphylactic complicatíon tied to intravenous injection of uráte oxidase. Nephrologie 11:259
Mourad G, Cristol JP, Chong G, Andary M, Mion C (1984) Role of precipitating antiurate oxidase antibodies in uráte oxidase-resistant hyperuricemia (lerter). Presse Med 13:2585
Potaux L, Aparicio M, Maurel C, Ruedas ME, Martin-Dupont CL (1975) Uricolytic therapy. Value of uráte oxidase in the treacment of hyperuricemias. Noův Presse Med 4:1109-1112
Priest DG, Pitts OM (1972) Reaction intermediate effects on the spectrophotometric uricase assay. Analytical Biochemistrv 50:195-205
Pui C-H, Relling MV, Lascombes F, Harrison PL, Struxiano A, Mondesir J-NÍ, Riberio RC et al (1997) Uráte oxidase in prevention and treatment of hyperuricemia associated with lympnoid malignancies. Leukemia 11:1813-1816
Reddy PG, Nemalí MR, Reddy NIK, Reddy NIN, Yuan PM, Yuen S, Laffler TG et al (1988) Isolation and sequence determination of a cDNA cloně for rat peroxisomal uráte oxidase: Liver-specific expression in the rat. Proč Nati Acad Sci USA 85:9081-9085
Rosenthal AK, Ryan LM (1995) Treatment of refractory crystal-associated arthritis. RheumDis Clin North Amer 21:151-161
Roubenoff R (1990) Gout and hyperuricemia. Rheumadc Disease Clinics of North America 16:539-550
Sadler JR, Miwa J, Maas P, Smith T (1974) growth of high density bacterial cultures; a simple device. Laboratory Practice 23:632-643 ♦ · · · • · · · « · ·
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular cloning. A laboratory manual 2 nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Pages
Sandberg AA, Cartwright GB, Wintrobe MM (1956) Studies on leukemia. I. Uric acid excretion. Blood 11:154-166
Savoca KV, Davis FF, Palczuk NC (1984) Induction of tolerance in mice by uricase and monomethoxypolyethylene glycol-modified uricase. Int Arch Allergy Appl Immunol 75:58-67
Sibony G, North ML, Bergerat JP, Lang JM, Oberling F (1984) Hyperuricemia resistant to uráte oxidase. Role of anti-serum uráte oxidase precipitating antibodies (letter).
Presse Med 13:443
Singer JZ, Wallace SL (1986) The allopurinol hvpersensitivity syndrome. Unnecessary morbidity and mortality. Arthritis Rheum 29:82-87
Tsuji J, Hirose K, Kasahara E, Naitoh M, Yamamoto I (1985) Studies on the antigenicity of the polyethylene glycol-modiňed uricase. Int J Immunopharmacol 7:725730
Venkataseshan VS, Feingold R, Dikman S, Churg J (1990) Acute hyperuricemic nephropathy and renal failure after transplantation. Nephron 56:317-321
Veronese FM, Caliceti P, Schiavon O (1997) New synthetic polymers for enzyme and liposome modification. In: Harris JM, Zalipsky S (eds) Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications, ACS, Washington, DC, ppi82-192
West C, Carpenter BJ, Hakala TR (1987) The incidence of gout in renal transplant recipients. Am J Kidney Dis 10:369-371
Wu X, Lee CC, Muzny DNÍ, Caskey CT (1989) Uráte oxidase: Primary structure and evolutionary implications. Proč Nati Acad Sci USA 86:9412-9416
Wu X, Muzny DM, Lee CC, Caskey CT (1992) Two independent mutational events in the loss of uráte oxidase. J Mol Evol 34:78-84
Wu X. Wakamiya M, Vaishaav S, Geske R, Montgomerv CM, Jr., Jones P, Bradley A et al (1994) Hyperuricemia and uráte nephropathy in uráte oxidase-dencient mice. Proč Nati Acad Sci US A 91:742-746
Zittoun R, Dauchy F, Teillaud C, Barthelemy M, Bouchard P (1976) Le traitement des hyperuricemies en hematologie par furate-oxydase et 1'allopurinol. Ann Med Inteme 127:479-482
Všechny uvedené publikace jsou formou odkazu zahrnuty v popisu vynálezu.
• · e ···
SEZNAM SEKVENCÍ <110> HERSHFIELD, MICHAEL S.
KELLY, SUSAN J.
<120> URÁTE OXIDASE <130> 1579-267 <140>
<141>
<160>ll <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 915 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<221> CDS <222> (1)..(915) <220>
<223> Popis umělé sekvence: Chiméra PBC <400> 1
acg Mec 1 get Ala cat His tac Tyr cgt Arg 5 aa t Asn cac Asp tac Tyr aaa _<ys Lyš 10 aat Asn gat Asp gag Glu gta Val gag Glu 15 ttt Phe 43
gtc ega act ggc tat ggg aag gat atg aca aaa gtt ctc cat att cag 96
Val Arg Tnxr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Tle Lys Val Leu His Ile Gin
20 25 30
ega gat gga aaa ta t cac acc att aaa gag gtg gca act tea gcg caa 144
Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gin
35 40 » o
ctg act ttg age tcc aaa aaa gat tac ctg cat gga gac aat tea gat 192
Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp
50 55 60
gtc atc cct aca gac acc atc aag aac aca c aat gtc ctg gcg aag 240
Val Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn φΐη v* Val Asn Val Leu Ala Lys
65 70 75 80
ttc aaa ggc atc aaa age ata gaa act tet get gtg act atc tgt gag 288
Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cvs Glu
85 90 95
cat ttc ctt tet tcc ttc aag cat gtc acc aga get caa gtc tat gtg 336
His Phe Leu Ser Ser Phe Lys His Val T * o Arg Ala Gin Val Tyr Val
100 105 110
gaa gaa gtt cct tgg aag cgt ttt gaa aag aat gga gtt aag cat gtc 384
Glu Glu Val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val
115 120 125
cat gca ttt att tat act cct act gga acg cac ttc tgt gag gtt gaa 432
His Ala Phe Ile Tyr Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu
130 ·· ····
135
140
cag ata agg aat gga cct cca gtc att cat tet gga atc aaa gac cta 480
Gin Ile Arg Asn Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu
145 150 155 160
aaa gtc ttg aaa aca acc cag tet ggc ttt gaa gga ttc atc aag gac 528
Lys Val Leu Lys Thr Thr Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp
165 170 175
cag ttc acc acc ctc cct gag gtg aag gac cgg tgc ctc gcc acc caa 576
Gin Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala r“ Gin
180 185 190
gtg tac tgc aaa tgg cgc tac cac cag ggc aga gat gtg gac cct gag 624
Val Cys Lys Trp Arg Tyr His Gin Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu
195 200 205
gcc acc tgg gac act gtt agg agc act gtc ctg cag aaa ttt get ggg 672
Ala Thr <T>—~ Í4-P Asp Thr Val Arg Ser Ile Val Leu Gin Lys Phe Ala Gly
210 215 220
ccc tat gac aaa ggc gag tac tea ccc tet g=g cag aag acc ctc tat 720
Pro Tyr Asp Lys Gly Č-lu Tyr Ser Pro Ser Val Gin Lys T'-> v Leu Tyr
225 230 235 240
gat atc cag gtg ctc tcc ctc SCC CCa gtt cct gag ata gaa cat atg 768
Asp Ile Gin Val Leu Ser Leu Sec ACy Vsi Pro Glu Ile Glu Asn Met
245 250 255
gaa atc agc ctg cca aac att CHC t£C CCC aat ata gac atg tcc aaa 816
Glu Ile Ser Leu Pro Asn T Ί o His Tvr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys
260 265 270
atg ggt c cg atc aac aag caa gH^ ζ — u.Cf ctg cca tta gac aat cca 864
Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro
275 2S0 285
tat gga aaa atc act ggt aca gcc aag agg aag ttg tet tea aga ctg 912
Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser' Arg Leu
290 295 300
915 tga
305 <210>
<211>
<212>
<213>
<400>
304
PRT
Umělá sekvence
Met Ala His Tyr Arg Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu
1 5 10 15
Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His Ile
20 25 30
Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val
35 40 45
Phe
Gin
Gin
Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp ····
55 50
Val Ile Pro Thr A.sp Thr Ile Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys
65 70 75 80
Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu
85 90 95
His Phe Leu Ser Ser Phe Lys His Val Ile Arg Ala Gin Val Tyr Val
100 105 110
Glu Glu Val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val
115 120 125
His Ala Phe Ile Tyr Thr Pxo Thr Gly Thr His Dno Cys Glu Val Glu
130 135 140
Gin Ile Arg Asn Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu
145 150 155 160
Lys Val Leu Lys Thr Thr Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phs Ile Lys A.sp
165 170 175
Gin Phe rnU γ- Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Gin
180 185 190
Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gin Gly Arg Asp Val A.sp Phe Glu
195 200 205
Ala Thr Trp Asp Thr Val Arg Ser Ile Val Leu Gin Lys Piis Ala Gly
210 215 220
Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gin Lys Thr Leu Tyr
225 230 235 240
Asp Ile Gin Val Leu Ser Leu Ser Arg Val Pro Glu Ile Glu Aso Met
245 250 255
Glu Ile Ser Leu ‘ Pro Asn Ile His Tvx Plis Asn Ile Asp MeC Ser Lys
260 265 270
Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro
275 280 285
Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu
290 295 300
<210> 3 <211> 915 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<221> CDS <222> (1) . .(915) <220>
<223> Popis umělé sekvence: Chiméra PKS <400> 3 atg gcc cat tac cgt aat gac tac aaa aag aat gat gag gta gag ttt 48
Met Ala His Tyr Arg Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe
·· ····
gtc ega act ggc tat ggg aag gat atg ata aaa gtt ctc cat att cag 96
Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Zle Lys Val Leu His Ile Gin
20 25 30
ega gat gga aaa tat cac age β L· U aaa gag gtg gca act tea gtg caa 144
Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Zle Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gin
35 40 45
ctg act ttg age tec aaa aaa gat tac ctg cat gga gac aat tea gat 192
Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp
50 5 60
gtc atc cct aca gac acc atc aag aac aca gtt aat gtc ctg gcg aag 240
Val Zle Pro Thr Aso Thr Zle Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys
65 70 75 80
tec aaa ggc atc aaa age ata gaa act ttt get gtg act atc tgt gag 288
Ph© Lys Gly Zle Lys Ser Zle Glu Th.x* Phe Ala Val Thr' Zle Cys Glu
85 90 95
ca ttc ctt tet tec ttc aag cat gtc atc aga get caa gtc tat gtg 336
His Dna Leu Ser Ser Phe Lys Val Ile Arg Ala Gin Val m. rv-r- Val
100 105 110
gaa gaa gtt cct cgg aag cgt Ct aac aat gga gtt aag cat gtc 384
Glu Glu Val Pro Trp Lys Arg Glu Lys .Asn Glv Val Lys His Val
115 120 125
cat gca t L- att tat act cct act cca acg cac ttc tgt gag gtt gaa 432
His Ala P*ia Zle Tyr Thr Pro Thr GÍv His Phe Cvs Glu Val Glu
13 0 135 140
cag ata agg aat gga cct cca » -w att cat tet gga atc aaa gac cca 480
Gin Zle Arg .Asn Gly Pro Pro Val Zle His Ser Gly Tle Lys Asp Leu
145 150 155 160
aaa gcc ttg aaa aca acc cag Cw gcc t t gaa gga ttc atc aag gac 523
Lys Val Leu Lys Thr Thr Gin Ser Glv Pne Glu Gly Phe Tle Lys Asp
165 170 175
cag ttc acc acc ctc cct cag gtg aag gac cgg tgc ttt gcc acc caa 576
Gin Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys A.sp Arg Cys Phe Ala Thr Gin
180 185 190
gtg tac tgc aaa tgg ege tac cac cag gcc aga gat gtg gac ttt gag 624
Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gin Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu
195 200 205
gcc acc tgg gac act gtc agg acc CLU gtc ctg cag aaa ttt get ggg 672
Ala Thr Trp Asp Thr Val Arg Ser Zle Val Leu Gin Lys Phe Ala Gly
210 215 220
CCC tat gac aaa gcc gag tac tcg CCC tet gtc cag aag aca ctc tat 720
Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gin Lys Thr Leu Tyr
225 230 235 240
gac atc cag gtg ctc acc ctg gcc cag gtt cct gag ata gaa gat atg 768
Asp Zle Gin Val Leu Thr Leu Gly Gin Val Pro Glu Ile Glu Aso Met
245 , 250 255
gaa atc age ctg cca aat att cac tac tta aac ata gac atg tcc aaa 816
♦♦ ····
Glu Ile Ser Leu 260 Pro Asn Ile His Tyr Leu265 Asn Ile Asp Met 270 Ser Lys
atg gga ctg atc aac aag gaa gag gtc ttg cta cct tta gac aat cca 864
Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro
275 280 285
tat gga aaa att act ggt aca gtc aag agg aag ttg tet tea aga ctg 912
Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu
290 295 300
tga
915
305 <210> 4 <211> 304 <212> PRT <213> Umělá sekvence <400> 4
Mec 1 Ala His Tyr Arg Asn 5 Asp Τγτ Lys Lvs Asn Asp Glu 10 Val Glu 15 Phe
Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Me w Ile Lys Val Leu His Ile Gin
20 25 30
Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gin
35 40 45
Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lvs Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp
50 55 60
Val Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys
65 70 75 80
Phe Lys Gly Ile Lys Ser ΣΞβ Glu Thr Dh o Ala Val Thr Ile Cys Glu
85 90 95
His Phe Leu Ser Ser Phe Lvs His Val Ile Arg Ala Gin Val Tyr Val
100 105 110
Glu Glu Val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val
115 120 125
His Ala Phe Ile Tyr Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu
130 135 140
Gin Ile Arg Asn Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu
145 150 155 160
Lys Val Leu Lys Thr Thr Gin Ser Gly Phe Glu 'Gly Phe Ile Lys Asp’
165 170 175
Gin Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gin
180 185 190
Val Tyr Cys Lys Tip Arg Tyr His Gin Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu
195 200 205
Ala Thr Trp Asp Thr Val Arg Ser Ile Val Leu Gin Lys Phe Ala Gly
210 215 220
Pro 225 Tyr Asp Lys Gly Glu 230 Tyr Ser Pro Ser Val 235 Gin Lys Thr Leu Tyr 240
Asp Ile Gin Val Leu 245 Thr Leu Gly Gin Val 250 Pro Glu Ile Glu Asp 255 Met
Glu Ile Ser Leu 260 Pro Asn Ile His Tvt 265 Leu Asn Ile Asp Met 270 Ser Lys
Met Gly Leu 275 Ile Asn Lys Glu Glu 280 Val Leu Leu Pro Leu 285 Asp Asn Pro
Tyr Gly 290 Lys Ile Thr Gly Thr 295 Val Lys Arg Lys Leu 300 Ser Ser Arg Leu
<210> 5 <211> 304 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: pavián D3H
Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gin Cys Arg Asp Val Asp Phe Glu
Ms « 1 Ala His Tyr His 5 Asn Asn Tyr Lys Lvs ÍO Asn Asp Glu Leu Glu 15 Phe
Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Mez Val Lvs Val Leu His Ile Gin
20 25 30
Arg Asp Gly Lys Tyr M2.S Ser Ile Lys Glu Val Ala Ser Val Gin
35 40 45
Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Aso Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser A_sp
50 55 60
Ile Ti 3 Pro Thr Asp Tr* Ile Lys Asn 'Τ'’·* * Val His Val Leu Ala Lys
65 70 75 80
Phe Lys Gly Ile Lvs Ser Ile Glu Ala Phe Gly Val Asn Ile Cys Glu
85 90 95
Tyr Phe Leu Ser Ser Pns Asn His Val Ile Arg Ala Gin Val Tyr- Val
100 105 110
• Glu Glu Ile Pro Trp Lys Arg Leu Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val
115 120 125
e His Ala Phe Ile His Tnr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu
130 135 - 140
Gin Leu Arg Ser Gly Pro Pro Val Xle His Ser Gly Ile Lys Asp Leu
* 145 150 155 160
Lys Val Leu Lys Thr Thr Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys A.sp
165 170 175
Gin Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gin
Φ· ···· • · • ΦΦ· • φ • · ΦΦΦ·
195 200 205-
Ala Thr Trp Gly Thr Ile Arg Asp Leu Val Leu Glu Lys Phe Ala Gly
210 215 220
Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gin Lys Thr Leu Tyr
225 230 235 240
Asp Ile Gin Val Leu Ser Leu Ser Arg Val Pro Glu Ile Glu Asp Met
245 250 255
Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys
260 265 270
Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro
275 282 285
Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu
290 295 300
<210> 6 <211> 304 <212> PRT <213> pavián <400> 5
Met i_ Ala Asp Tyr His 5 Asn Asn Tyr Lys Lvs 10 Asn Asp Glu Leu Glu 15 Phe
Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp m2- Val Lys Val Leu His Ile Gin
20 25 30
Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gin
35 40 45
Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp
50 55 60
Ile Ile Pro Thr Asp Τ-ΧΓ Ile Lys Asn Thr Val His Val Leu Ala Lys
65 70 75 80
Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Ala Phe Gly Val Asn Ile Cys Glu
85 90 95
Tyr Phe Leu Ser Ser Phe Asn His Val Ti,® Arg Ala Gin Val Tyr Val
100 105 110
Glu Glu Ile Pro Trp Lys Arg Leu Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val
115 120 - 125
His Ala Phe Ile His Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu
130 135 140
Gin Leu Arg Ser Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu
145 150 155 160
Lys Val Leu Lys Thr Thr Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp
165 170 175
·· φφφφ • φφφ φφφφ
Gin. Phe Thr Thr 180 Leu Pro Glu Val Lys 185 Asp Arg Cys Phe Ala 190 Thr Gin
Val Tyr Cys 195 Lys Trp Arg Tyr His 200 Gin Cys Arg Asp Val 205 Asp Phe Glu
Ala Thr 210 Trp Gly Thr Zle Arg 215 Asp Leu Val Leu Glu 220 Lys Phe Ala Gly
Pro 225 Tyr Asp Lys Gly Glu 230 Tvx Ser Pro Ser Val 235 Gin Lys Thr Leu Tyr 240
Asp Zle Gin Val Leu 245 Ser Leu Ser Arg Val 250 Pro Glu Ile Glu Asp 255 Met
Glu Ile Ser Leu 260 Pro Asn Ile His Tyr 265 Phe Asn Ile Asp Met 270 Ser Lys
Met Gly Leu 275 Zle Asn Lys Glu Glu 280 Val Leu Leu Pro Leu 285 Asp Asn Pro
Tyr Gly Lys Zle Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu
290 295 300 <210> 7 <211> 304 <212> PRT <213> prase <400> 7
Met 1 Ala His Tyr Arg 5 Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp ÍO Glu Val Glu 15 Phe
Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp MeX T Lys Val Leu His Ile Gin
20 25 30
Arg Asp C-ly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gin
35 40 45
Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp
50 55 60
Val Ile Pro T-x* Asp Th-T Zle Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys
65 70 75 80
Phe Lys Gly Zle Lys Ser Zle Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu
85 90 95
His Phe Leu Ser Ser Phe Lys His Val Ile Arg Ala Gin Val Tyr Val
100 105 110
Glu Glu Val Pro Tro Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val
115 120 125
His Ala Phe Ile Tyr Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu
130 135 140
Gin Ile Arg Asn Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu
145 150 155 160
ifS
Lys Val Leu Lys Thr Thr Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys 175 Asp
165 170
Gin Phe Thr Thr 180 Leu Pro Glu Val Lys 185 Asp Arg Cys Phe Ala 190 Thr Gin
Val Tyr Cys 195 Lys Trp Arg Tyr His 200 Gin Gly Arg Asp Val 205 Asp Phe Glu
Ala Thr 210 Trp Asp Tiir Val Arg 215 Ser Ile Val Leu Gin 220 Lys Ala Gly
Pro 225 Tyr Asp Lys Gly Glu 230 Tyr Ser Pro Ser Val 235 Gin Lys Thr Leu Tvt 240
Asp Ile Gin Val Leu 245 Thr Leu Gly Gin Val 250 Pro Glu Ile Glu Asp 255 Met
Glu Ile Ser Leu 260 Pro Asn Ile His Tyr 265 Leu Asn Ile Asp Met 270 Ser Lys
Met Gly Leu 275 Ile Asn Lys Glu Glu 280 Val Leu Leu Pro Leu 285 A.sp Asn Pro
Tyr Gly Arg Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Thr Ser Arg Leu
290 295 300 <210> 8 <211> 298 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: PBC zkrácená na aminokonci <400> 8
Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe Val Arg Thr Gly Tyr Gly
1 5 10 15
Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His Ile Gin Arg Asp Gly Lvs Tyr His
20 25 30
Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gin Leu Thr Leu Ser Ser Lys
35 40 45
Lys Aso Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp Val Ile Pro Asp Thr
50 55 60
Ile Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys Phe Lys Gly Ile Lys Ser
65 70 75 80
Ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu His Phe Leu Ser Ser Phe
85 90 95
Lys His Val Ile Anrg Ala Gin Val Tyr Val Glu Glu Val Pro Trp Lys
100 105 110
Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val His Ala Phe Ile Tyr Thr
115
• · · * · · ·· ί ι : · ·· ··.»
120
125
Pro Thr Gly 130 Thr His Phe Cys Glu Val Glu Gin Ile Arg Asn Gly Pro
135 140
Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu Lys Val Leu Lys Thr Thr
145 150 155 160
Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp Gin β Thr Thr Leu Pro
165 170 175
Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gin Val Tyr Cys Lys Trp Arg
180 185 190
Tyr His Gin Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu Ala T- Trp Asp Thr Val
195 200 205
Arg Ser Ile Val Leu Gin Lys Phe Ala Gly Pro Tyr Asp Lys Gly Glu
210 215 220
Tyr Ser Pro Ser Val Gin Lys Thr Leu Tyr Aso Ile Gin Val Leu Ser
225 230 235 240
Leu Ser Arg Val Pro Glu Ile Glu Asp Met Glu Ile Ser Leu Pro Asn
245 250 255
Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Mez Ser Lys Gly Leu Ile Asn Lys
260 265 270
Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asn Asn Pro Tyr Gly Lvs Ile Thr Gly
275 280 235
Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu
290 295
<210> 9 <211> 301 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: PBC zkrácená na C-konci <400> 9
Met Ala His Tyr Arg Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe
1 5 10 15
Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His Ile Gin
20 25 30
Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gin
35 40 45
Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp
50 55 6*0
Val Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys
65 70 75 80
Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu so
90 95
His Phe Leu Ser Ser Phe 100 Lys His Val Ile Arg Ala Gin Val Tyr Val
105 110
Glu Glu Val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val
115 120 125
His Ala Phe Ile Tyr Thr Pro Thr Gly Thr Cys Glu Val Glu
130 135 140
Gin Ile Arg Asn Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu
145 150 155 160
Lys Val Leu Lys Thr Thr Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp
165 170 175
Gin Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gin
180 185 190
Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gin Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu
195 200 205
Ala Thr Trp Asp Thr Val Arg Ser Ile Val Leu Gin Lys Ala Gly
210 215 220
Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gin Lys Leu Tvr
225 230 235 240
Asp Ile Gin Val Leu Ser Leu Ser Arg Val Pro Glu Ile Glu Aso Met
245 250 255
Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys
260 265 270
Meu Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro
275 280 285
Tyr Gly Lys Ile Thr Gly ·£· Val Lys Arg Lys Leu Ser
290 295 300
<210> 10 <211> 298 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: PKS zkrácená na C-konci <400> 10
v ‘ Aso i Tyr Lys Lys Asn 5 'Asp Glu Val Glu Phe 10 Val Arg Thr Gly Tyr 15 Gly
.. - Lys Asp Met Ile 20 Lys Val Leu His Ile 25 Gin Arg Asp Gly Lys 30 Tyr His
Ser Ile Lys 35 Glu Val Ala Thr Ser 40 Val Gin Leu Thr Leu 45 Ser Ser Lys
Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp Val Ile Pro Thr Asp Thr • · · · · · • 9
9 « · f
* · ·
5Ί
55 60
Ile Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys Phe 75 Lys Gly Ile Lys Ser 80
65 70
Ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile cys Glu His Phe Leu Ser Ser Phe
85 90 95
Lys His Val Ile Arg Ala Gin Val Tyr Val Glu Glu Val Pro Trp Lys
100 105 110
Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val His Ala Ptie Ile Tyr Thr
115 120 125
Pro Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu Gin Ile Arg Asn Gly Pro
130 135 140
Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu Lys Val Leu Lys Thr Thr
145 150 155 160
Gin Ser Gly Piis Glu Gly Ile Lys Asp Gin Pns Thr Thr Leu Pro
165 170 175
Glu Val Lys Asn Arg Cys Ala Thr Gin Val Tyr Cys Lys Trp Arg
180 185 190
Tyr His Gin Gly Arg Asp Val Asn □ ‘«Id Glu Ala Thr Trp Asp Thr Val
195 200 205
Arg Ser Ile Val Leu Gin Lys Phe Ala Gly Pro Tyr Asp Lys Gly Glu
210 215 220
Tyr Ser Pro Ser Val Gin Lys Á il— Leu Tyr Asp Ile Gin Val Leu Thr
225 230 235 240
Leu Gly Gin Val Pro Glu Ile Glu Asp Met Glu Tis Ser Leu Pro Asn
245 250 255
Ile His Tyr Leu Asn Ile Asp MeC Ss- Lys Met Gly Leu Ile Asn Lys
260 265 270
Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro Tyr Gly Lys Ile Thr Gly
275 280 285
Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Sex* Arg Leu
290 295 <210> 11 <211> 301 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: PKS zkrácená na C-konci <400> 11
Met Ala His Tvr Arg Asn Asn Tyr Lvs Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe
5 ’ ‘ ' 10 15 a
·· 9 • · i • · to · ·····« • > · ·· i
Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His Ile Gin
20 25 30
Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gin
35 40 45
Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp
50 55 60
Val Ile Pro Tlix* Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys
65 70 75 80
Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Thr pna A* 3 Val Tl·* Zle Cys Glu
85 90 95
His Phe Leu Ser Ser Lys His Val Ile Arg Ala Gin Val Tyr Val
100 105 110
Glu Glu Val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val
115 120 125
His Ala Phe Ile Tyr Pro Thr Gly Tnr Hus Phs Cys Glu Val Glu
130 135 140
Gin Ile Arg Asn Gly Pro Pro Val Ile — - - C o — Gly Zle Lys .Asp Leu
145 150 155 160
Lys Val Leu Lys Thr ΤΓ12Γ Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp
165 170 175
Gin Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gin
180 185 190
Val Tyx Cys Lys Trp Arg Tyr His Gin Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu
195 200 205
Ala Thr Trp Asp Thr Val Arg Ser Zle Val Leu Gin Lys Phe Ala Gly
210 215 220
Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gin Lys Thr Leu Tyr
225 230 235 240
Asp Ile Gin Val Leu Thr Leu Gly Gin Val Pro Glu Zle Glu Asp Μβύ
245 250 255
Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Leu Asn Ile Asp Met Ser. Lys
260 2 65 270
Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro
275 280 285
Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser
290 295 ' 300 • to *
1.
1.
2.
2.
3.
3.
4.
4.
5.
5.
6.
6.
7.
7.

Claims (4)

PATENTOVÉ NÁROKY • · · · · · 9 · ♦ • · · · · * ( · « I · Protein obsahující rekombinantní urikázový protein savce, který byl modifikován vložením jednoho nebo více lysinových zbytků. Protein podle nároku 1, kde rekombinantní protein je chimérický protein ze dvou nebo více aminokyselinových sekvencí savců. Protein podle nároku 1, kde rekombinantní chimérický urikázový protein obsahuje 304 aminokyselin, přičemž prvních 225 N-koncových aminokyselin z uvedených 304 aminokyselin jsou aminokyseliny 1 až 225 z urikázy prasete a zbývajících 79 aminokyselin z uvedených 304 aminokyselin jsou aminokyseliny 226 až 304 urikázy paviána. Protein podle nároku 1, kde rekombinantní chimérický urikázový protein obsahuje 304 aminokyselin, přičemž prvních 288 N-koncových aminokyselin z uvedených 304 aminokyselin jsou aminokyseliny 1 až 288 z urikázy prasete a zbývajících 16 aminokyselin z uvedených 304 aminokyselin jsou aminokyseliny 289 až 304 urikázy paviána. Rekombinantní urikázový protein vybraný ze skupiny, která obsahuje sekvence id. č. 2, 4, 8, 9, 10 a 11. Izolovaná a purifikovaná molekula nukleové kyseliny kódující rekombinantní urikázu podle nároku 1. Izolovaná a purifikovaná molekula nukleové kyseliny kódující rekombinantní urikázu podle nároku 3. • · 4 · • · · · • 4 4 « 4 4 • 4 4 ♦ 4 « · • 4 4 • 4 4 4 • · 4 9 · • 4 9 4 • t 4 · .'> · 5 1 • · 9 4 « 4 í 4 4 4 4 4 •O 4 ·.· • 4 4 8. Izolovaná a purifikovaná molekula nukleové kódující rekombinantní urikázu podle nároku 4. 9. Izolovaná a purifikovaná molekula nukleové kyseliny kyseliny kódující rekombinantní urikázu podle nároku 5. 10. Izolovaná a purifikovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 9, která má sekvenci baží sekvence id. č. 1. 11. Izolovaná a purifikovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 9, která má sekvenci baží sekvence id. č. 3. 12. Vektor obsahuj ící molekulu nukleové kyseliny podle nároku 1. 13. Vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny podle nároku 9. 14. Hostitelská buňka obsahující vektor podle nároku 12. 15. Hostitelská buňka obsahující vektor podle nároku 13. 16. Způsob zvýšení navázání PEG počtu na vyznačuj mutuje vnesením ící nejméně Způsob zvýšení navázání PEG počtu na dostupných mutovaný se tím, jednoho lysinového zbytku. neškodlivých urikázový že urikázový míst pro protein protein se vyznačuj mutuje vnesením argininu. nejméně dostupných mutovaný i e tím, jednoho neškodlivých urikázový že urikázový lysinového zbytku místo míst pro protein protein se 17. • 4
1/18 • ♦ · · · *? « ♦ · · · · *.
• · · · · · · « « • · · · · ·«···· *·«·
2/18
Dny po injekci ·
» 4 ·
4* · • · * ·
4» 4 ·
4, 4 4 • « « • ·♦ * 44* * 4 4 · * 4»
3/18
Kys. močová v séru (mg/dl) >
'«J > o >0
0.2
C.1
Aktivita urikázy v séru (U/ml)
Hodiny po injekci PEG-PBC urikázy
4/18 • « • · · ♦ ·* ·
Aktivita urikázy v séru, relativní, vztažená k počáteční aktivitě
CZ2001-466A 1998-08-06 1999-08-05 Rekombinantní chimérický urikázový protein CZ304223B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US9548998P 1998-08-06 1998-08-06

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2001466A3 true CZ2001466A3 (cs) 2001-07-11
CZ304223B6 CZ304223B6 (cs) 2014-01-15

Family

ID=22252247

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2001-466A CZ304223B6 (cs) 1998-08-06 1999-08-05 Rekombinantní chimérický urikázový protein

Country Status (23)

Country Link
US (1) US7056713B1 (cs)
EP (2) EP2277998B1 (cs)
JP (3) JP2002524053A (cs)
KR (1) KR100841634B1 (cs)
CN (2) CN101280293B (cs)
AT (1) ATE483797T1 (cs)
AU (1) AU766421B2 (cs)
BR (1) BRPI9913360B8 (cs)
CA (1) CA2337967C (cs)
CY (1) CY1111001T1 (cs)
CZ (1) CZ304223B6 (cs)
DE (1) DE69942834D1 (cs)
DK (1) DK1100880T3 (cs)
ES (1) ES2352451T3 (cs)
HK (3) HK1037214A1 (cs)
HU (1) HU229774B1 (cs)
IL (3) IL141221A0 (cs)
NZ (1) NZ509633A (cs)
PL (1) PL207369B1 (cs)
PT (1) PT1100880E (cs)
RU (1) RU2290439C2 (cs)
WO (1) WO2000008196A2 (cs)
ZA (1) ZA200100974B (cs)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100488848B1 (ko) * 1998-08-06 2005-05-11 듀크 유니버서티 피이지-유레이트 옥시데이즈 접합체 및 그의 이용
US20060188971A1 (en) * 1998-08-06 2006-08-24 Duke University Urate oxidase
PT1588716E (pt) 1998-08-06 2011-05-25 Mountain View Pharmaceuticals Conjugados de peg-urato oxidase e sua utiliza??o
US6783965B1 (en) 2000-02-10 2004-08-31 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Aggregate-free urate oxidase for preparation of non-immunogenic polymer conjugates
CN101280293B (zh) * 1998-08-06 2013-09-11 杜克大学 尿酸氧化酶
CN100371439C (zh) * 2003-04-07 2008-02-27 北京双鹭药业股份有限公司 一种重组假丝酵母尿酸氧化酶的制备方法
CN100334207C (zh) * 2004-04-27 2007-08-29 杭州北斗生物技术有限公司 一种黄曲霉尿酸氧化酶的制备方法
US7811800B2 (en) * 2005-04-11 2010-10-12 Savient Pharmaceuticals, Inc. Variant form of urate oxidase and use thereof
AU2011257764B2 (en) * 2005-04-11 2012-04-05 Horizon Therapeutics Usa, Inc. A variant form of urate oxidase and use thereof
LT3321359T (lt) * 2005-04-11 2021-05-10 Horizon Pharma Rheumatology Llc Urato oksidazės variantinės formos ir jų panaudojimas
US8148123B2 (en) 2005-04-11 2012-04-03 Savient Pharmaceuticals, Inc. Methods for lowering elevated uric acid levels using intravenous injections of PEG-uricase
HU230758B1 (hu) * 2006-04-12 2018-03-28 Crealta Pharmaceuticals LLC 100% Fehérjék tisztítása kationos felületaktív anyaggal
CN101402688B (zh) * 2008-11-18 2011-04-20 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 一种融合蛋白及其编码基因与应用
MX2011009586A (es) 2009-03-24 2012-01-12 Meito Sangyo Kk Proteasa coagulante de leche de tipo mejorado derivada de microorganismo.
RU2535038C2 (ru) 2009-06-25 2014-12-10 Криэлта Фармасьютикалз ЭлЭлСи Способы и наборы для прогнозирования риска инфузионных реакций и опосредованной антителами потери ответа при терапии пэгилированной уриказой с помощью мониторинга содержания мочевой кислоты в сыворотке крови
CN102051348B (zh) 2009-10-27 2012-10-03 重庆富进生物医药有限公司 人源化重组尿酸酶及其突变体
RU2460793C2 (ru) 2010-01-15 2012-09-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий семейства enterobacteriaceae
US8940861B2 (en) 2010-04-08 2015-01-27 Georgia Tech Research Corporation Variants of ancestral uricases and uses thereof
CN102634492B (zh) 2011-02-14 2015-06-10 重庆富进生物医药有限公司 聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物及其制备方法和应用
CN102757945B (zh) * 2011-04-28 2015-03-18 杭州俊丰生物工程有限公司 人尿酸氧化酶蛋白及其制备方法和其聚乙二醇结合物
CN102260653B (zh) * 2011-06-30 2013-04-03 荣俊 一种peg化重组猪-人尿酸氧化酶融合蛋白的制备及应用方法
EP2986720B1 (en) * 2013-04-17 2017-09-06 Council of Scientific & Industrial Research Uricase mutants
CN103834623B (zh) * 2014-02-11 2017-11-07 中国药科大学 具有催化活性的人源尿酸氧化酶
CN104388467A (zh) * 2014-10-27 2015-03-04 李长贵 一种构建自发性高尿酸血症小鼠模型的方法及其用途
CN107614007B (zh) 2015-05-15 2022-03-25 免疫医疗有限责任公司 改进的尿酸酶序列和治疗方法
CN106554948B (zh) 2015-09-29 2019-06-25 上海生物制品研究所有限责任公司 突变型尿酸酶、peg修饰的突变型尿酸酶及其应用
CN108103079B (zh) * 2017-06-20 2021-07-13 北京锦篮基因科技有限公司 一种高尿酸血症的基因治疗药物
CN109554376B (zh) * 2018-11-13 2022-03-22 广西大学 一种碱性尿酸氧化酶及其在检测试剂盒和降低食品中尿酸的应用
CN111088268B (zh) * 2019-03-05 2022-08-02 北京锦篮基因科技有限公司 一种高尿酸血症的基因治疗药物
EP3967754A4 (en) 2019-05-10 2023-07-26 Peg-Bio Biopharm Co., Ltd. (Chongqing) URATE OXIDASE MODIFIED BY POLYETHYLENE GLYCOL
CN112646790A (zh) * 2019-10-11 2021-04-13 上海君实生物医药科技股份有限公司 改进的尿酸酶及其用于治疗高尿酸血症的方法
CN111920942A (zh) * 2020-08-24 2020-11-13 深圳前海鹰岗生物科技有限公司 一种用于快速溶解痛风石的聚合物微针及制备方法和应用
CN114438048A (zh) 2020-11-05 2022-05-06 重庆派金生物科技有限公司 尿酸氧化酶制剂及其应用
CN114438047A (zh) 2020-11-05 2022-05-06 重庆派金生物科技有限公司 制备聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶的方法
CN112852772A (zh) * 2021-01-19 2021-05-28 中国科学院过程工程研究所 一种基于分子内交联和聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶及其制备方法
CN112662640A (zh) * 2021-01-28 2021-04-16 中国药科大学 一种具有催化活性的尿酸氧化酶
CN113244412B (zh) * 2021-06-25 2021-10-26 深圳市瑞吉生物科技有限公司 一种基于mRNA剂型的治疗高尿酸血症或痛风的药物及其制备方法
AU2022340814A1 (en) * 2021-09-01 2024-02-15 Ginkgo Bioworks, Inc. Recombinant cells for treating diseases associated with uric acid and methods of use thereof

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE279486C (cs)
US3613231A (en) 1969-07-25 1971-10-19 Paul F Pugh Method for manufacturing high voltage cable systems
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
DE3126759A1 (de) 1981-07-07 1983-01-27 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Loesliche leber-uricase, verfahren zu ihrer herstellung und verwendung
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4917888A (en) * 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4847325A (en) 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
US5075216A (en) 1988-09-23 1991-12-24 Cetus Corporation Methods for dna sequencing with thermus aquaticus dna polymerase
US5349052A (en) 1988-10-20 1994-09-20 Royal Free Hospital School Of Medicine Process for fractionating polyethylene glycol (PEG)-protein adducts and an adduct for PEG and granulocyte-macrophage colony stimulating factor
US5324844A (en) 1989-04-19 1994-06-28 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5382518A (en) 1989-07-13 1995-01-17 Sanofi Urate oxidase activity protein, recombinant gene coding therefor, expression vector, micro-organisms and transformed cells
US5286637A (en) 1989-08-07 1994-02-15 Debiopharm, S.A. Biologically active drug polymer derivatives and method for preparing same
US5653974A (en) 1990-10-18 1997-08-05 Board Of Regents,The University Of Texas System Preparation and characterization of liposomal formulations of tumor necrosis factor
WO1994019007A1 (en) 1993-02-16 1994-09-01 Enzon, Inc. Ribosome inactivating protein compositions having reduced antigenicity
AU7113594A (en) 1993-06-21 1995-01-17 Enzon, Inc. Site specific synthesis of conjugated peptides
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
EP0796324A1 (en) 1994-12-07 1997-09-24 Novo Nordisk A/S Polypeptide with reduced allergenicity
JPH09154581A (ja) 1995-12-05 1997-06-17 Asahi Chem Ind Co Ltd ウリカーゼを生産する実質上純粋な微生物
JP2001511162A (ja) 1997-02-06 2001-08-07 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ 付加され、そして／又は除去された付着基を有するポリペプチド−ポリマー結合体
KR100488848B1 (ko) 1998-08-06 2005-05-11 듀크 유니버서티 피이지-유레이트 옥시데이즈 접합체 및 그의 이용
CN101280293B (zh) * 1998-08-06 2013-09-11 杜克大学 尿酸氧化酶
PT1588716E (pt) 1998-08-06 2011-05-25 Mountain View Pharmaceuticals Conjugados de peg-urato oxidase e sua utiliza??o
US6783965B1 (en) 2000-02-10 2004-08-31 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Aggregate-free urate oxidase for preparation of non-immunogenic polymer conjugates

Also Published As

Publication number Publication date
HU229774B1 (en) 2014-07-28
CA2337967A1 (en) 2000-02-17
KR20010053633A (ko) 2001-06-25
CY1111001T1 (el) 2015-06-11
US7056713B1 (en) 2006-06-06
KR100841634B1 (ko) 2008-06-26
HUP0103205A2 (hu) 2001-12-28
JP2002524053A (ja) 2002-08-06
NZ509633A (en) 2003-04-29
EP1100880B1 (en) 2010-10-06
RU2290439C2 (ru) 2006-12-27
HUP0103205A3 (en) 2006-01-30
DE69942834D1 (de) 2010-11-18
ZA200100974B (en) 2002-06-26
AU766421B2 (en) 2003-10-16
HK1125402A1 (en) 2009-08-07
WO2000008196A2 (en) 2000-02-17
EP2277998B1 (en) 2016-04-20
BRPI9913360B8 (pt) 2021-05-25
AU5336599A (en) 2000-02-28
JP2013215199A (ja) 2013-10-24
DK1100880T3 (da) 2011-01-24
HK1037214A1 (en) 2002-02-01
PT1100880E (pt) 2011-01-13
WO2000008196A3 (en) 2000-03-30
ES2352451T3 (es) 2011-02-18
WO2000008196A9 (en) 2000-07-13
PL346222A1 (en) 2002-01-28
IL141221A (en) 2010-06-16
HK1153508A1 (zh) 2012-03-30
EP1100880A4 (en) 2002-04-17
JP2010158244A (ja) 2010-07-22
CN101280293A (zh) 2008-10-08
ATE483797T1 (de) 2010-10-15
CN1322243A (zh) 2001-11-14
JP5721954B2 (ja) 2015-05-20
IL197339A (en) 2015-02-26
EP1100880A2 (en) 2001-05-23
CA2337967C (en) 2011-11-01
EP2277998A1 (en) 2011-01-26
CZ304223B6 (cs) 2014-01-15
IL141221A0 (en) 2002-03-10
BR9913360B1 (pt) 2013-09-24
IL197339A0 (en) 2011-07-31
BR9913360A (pt) 2001-07-03
PL207369B1 (pl) 2010-12-31
CN101280293B (zh) 2013-09-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ2001466A3 (cs) Rekombinantní protein urátoxidáza
AU2006235495B2 (en) Variant forms of urate oxidase and use thereof
KR100488848B1 (ko) 피이지-유레이트 옥시데이즈 접합체 및 그의 이용
US20030166249A1 (en) PEG-urate oxidase conjugates and use thereof
PL215157B1 (pl) Wyizolowana urykaza, zawierajaca ja kompozycja farmaceutyczna, kodujacy ja wyizolowany kwas nukleinowy, zawierajacy go wektor i obejmujaca ten wektor komórka gospodarza oraz sposoby wytwarzania urykazy oraz zawierajacej urykaze kompozycji farmaceutycznej
US20060188971A1 (en) Urate oxidase
MXPA01001342A (en) Urate oxidase

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20180805