PL207369B1 - Zrekombinowane białko urykazy, wyizolowane i oczyszczone cząsteczki kwasu nukleinowego, wektory, komórki gospodarza, sposoby zwiększania dostępności nieszkodliwych miejsc przyłączenia PEG do białka urykazy - Google Patents

Zrekombinowane białko urykazy, wyizolowane i oczyszczone cząsteczki kwasu nukleinowego, wektory, komórki gospodarza, sposoby zwiększania dostępności nieszkodliwych miejsc przyłączenia PEG do białka urykazy

Info

Publication number
PL207369B1
PL207369B1 PL346222A PL34622299A PL207369B1 PL 207369 B1 PL207369 B1 PL 207369B1 PL 346222 A PL346222 A PL 346222A PL 34622299 A PL34622299 A PL 34622299A PL 207369 B1 PL207369 B1 PL 207369B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
uricase
lys
val
thr
leu
Prior art date
Application number
PL346222A
Other languages
English (en)
Other versions
PL346222A1 (en
Inventor
Michael Hershfield
Susan J. Kelly
Original Assignee
Univ Duke
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Duke filed Critical Univ Duke
Publication of PL346222A1 publication Critical patent/PL346222A1/xx
Publication of PL207369B1 publication Critical patent/PL207369B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0044—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7)
    • C12N9/0046—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7) with oxygen as acceptor (1.7.3)
    • C12N9/0048—Uricase (1.7.3.3)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0044—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7)
    • C12N9/0046—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7) with oxygen as acceptor (1.7.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y107/00—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7)
    • C12Y107/03—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7) with oxygen as acceptor (1.7.3)
    • C12Y107/03003—Factor-independent urate hydroxylase (1.7.3.3), i.e. uricase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest zrekombinowane białko urykazy, wyizolowane i oczyszczone cząsteczki kwasu nukleinowego, wektory, komórki gospodarza, sposoby zwiększania dostępności nieszkodliwych miejsc przyłączenia PEG do białka urykazy.
Ogólnie obecny wynalazek dotyczy białek oksydazy moczanowej (urykazy) i kodujących je cząsteczek kwasów nukleinowych. W szczególności wynalazek dotyczy białek urykazy, które są szczególnie użyteczne, na przykład, jako związki pośrednie do wytworzenia udoskonalonych, zmodyfikowanych białek urykazy, które mają zmniejszoną immunogenność i zwiększoną biodostępność.
Skaza moczanowa (dna) jest pospolitą chorobą związaną ze stanami zapalnymi stawów u ludzi w wieku około 40 lat (Roubenoff 1990). Bolesne, ostre dnawe zapalenie stawów występuje, gdy we krwi podwyższony jest poziom kwasu moczowego (hyperuricemia) prowadząc do sporadycznego tworzenia się mikroskopijnych kryształków jednowodnego moczanu jednosodowego w stawach. Z czasem, przewlekła hiperurycemia może również prowadzić do niszczycielskiego odkładania się krystalicznego moczanu (tophi) wokół stawów, w tkankach miękkich i niektórych narządach (Hershfield, 1996). Kwas moczowy ma ograniczoną rozpuszczalność w moczu i gdy jest nadmiernie wydalany (hyperuricosuria) może również powodować powstanie kamieni nerkowych (uricolithiasis). U pacjentów z pewnymi schorzeniami, szczególnie białaczką i chłoniakiem, znacząca hiperurycemia i hiperurykozuria (w następstwie zwiększonej aktywnoś ci komórek guza i lizy podczas chemoterapii) stanowią poważne ryzyko ostrej, czopującej niewydolności nerek (Sandberg i wsp., 1956; Gold i Fritz, 1957; Cohen i wsp., 1980; Jones i wsp., 1990). Ciężka hiperurycemia i skaza moczanowa towarzyszą niewydolności nerek wywołanej różnymi przyczynami włącznie z leczeniem cyklosporynami, które ma na celu zapobieżenie odrzutowi allograficznego przeszczepu narządu (West i wsp., 1987; Venkataseshan i wsp., 1990; Ahn i wsp., 1992; Delaney i wsp., 1992; George i Mandell, 1995).
Hiperuricemia może być wynikiem zarówno nadprodukcji moczanu i jego niewystarczającego wydalania (Hershfield i Seegmiller, 1976; Kelley i wsp., 1989; Becker i Roessler, 1995). Gdy jest łagodna, hiperurycemia może być kontrolowana dietą, lecz w postaci ostrzejszej i gdy towarzyszą jej poważne kliniczne konsekwencje wymaga leczenia lekami, zarówno środkami moczopędnymi, które pobudzają wydalanie kwasu moczowego (nieskutecznymi, jeśli funkcja nerek jest zmniejszona) lub allopurynolem będącym inhibitorem oksydazy ksantynowej, blokującym tworzenie moczanu. Allopurynol jest głównym elementem terapii u pacjentów z guzkiem dnawym, niewydolnością nerek, białaczką i niektórymi chorobami wrodzonymi. Ogólnie, leczenie hiperurycemii jest skuteczne i dobrze tolerowane. Jednak u niektórych pacjentów ze zniekształcającym, powodującym niezdolność funkcjonowania, guzkiem dnawym są oporne na wszystkie tradycyjne sposoby leczenia (Becker, 1988; Fam, 1990; Rosenthal i Ryan, 1995). Ponadto, u ~2% pacjentów leczonych allopurynolem rozwijają się reakcje alergiczne, a u ~0,4% występuje ostry zespół nadwrażliwości (Singer i Wallace, 1986; Arellano i Sacristan, 1993). Ten, zazwyczaj zagrażający życiu, zespół może powodować ostrą niewydolność nerek i wątroby i ostre uszkodzenia skóry (toksynowa nekroliza skóry, złuszczeniowe zapalenie skóry, rumień wielopostaciowy, zespół Stevens-Johnson). Allopurynol wpływa również na metabolizm azatiopryny i 6-merkaptopuryny, leków używanych w leczeniu białaczki i dla zapobiegania odrzutowi allograficznego przeszczepu narządu, warunków, w których występuje znacząca hiperurycemia i może powodować ciężką skazę moczanową oraz zagraża działaniu nerki.
Ostatecznie, hiperurycemia jest wynikiem inaktywacji przez mutację ludzkiego genu dla oksydazy moczanowej (urykazy) podczas ewolucji (Wu i wsp., 1989; Wu i wsp., 1992). Aktywna urykaza w peroksysomach wą troby wię kszoś ci naczelnych nie bę d ą cych ludź mi i innych ssaków przekształ ca moczan do allantoiny (+ CO2 i H2O2), która jest 80-100 razy bardziej rozpuszczalna niż kwas moczowy i jest skuteczniej traktowana przez nerkę. Od ponad dwudziestu lat we Francji i Włoszech urykaza do podania pozajelitowego sporządzona z Aspergillus flavus (Uricozyme®, Clin-Mid, Paryż) jest używana w leczeniu ostrej hiperurycemii towarzyszącej chemoterapeutycznemu leczeniu białaczki (London i Hudson, 1957; Kissel i wsp., 1968; Brogard i wsp., 1972; Kissel i wsp., 1972; Potaux i wsp., 1975; Zittoun i wsp., 1976; Brogard i wsp., 1978; Masera i wsp., 1982), i została użyta we współczesnym leczeniu pacjentów z białaczką w USA (Pui i wsp., 1997). Urykaza ma szybsze działanie niż allopurynol (Masera i wsp., 1982; Pui i wsp., 1997). U pacjentów ze skazą moczanową wlewka z urykazą może przerwać ostre ataki i zmniejszyć wielkość guzków (Kissel i wsp., 1968; Potaux i wsp., 1975; Brogard i wsp., 1978).
PL 207 369 B1
Choć skuteczna w leczeniu ostrej hiperurykemii podczas krótkiego leczenia chemoterapeutycznego, dzienna wlewka z urykazy z A. flavus będzie poważną niedogodnością w leczeniu nawrotowej lub guzkowej skazy moczanowej. Ponadto, skuteczność urykazy z A. flavus szybko ulega zmniejszeniu u pacjentów, którzy rozwijają przeciwciała przeciw urykazie (Kissel i wsp., 1968; Brogard i wsp., 1978; Escudier i wsp., 1984; Mourad i wsp., 1984; Sibony i wsp., 1984). Występują poważne reakcje alergiczne, łącznie z szokiem anafilaktycznym (Donadio i wsp., 1981; Montagnac i Shillinger, 1990; Pui i wsp., 1997). Jest to oczywiste, że do przewlekłego leczenia potrzebna jest urykaza o dłuższym działaniu i mniejszej immunogenności.
Jeden sposób dla oddzielenia egzogennych enzymów od proteaz i układu odpornościowego wymaga kowalencyjnego przyłączenia obojętnego, nietoksycznego polimeru, glikolu monometoksypolietylenowego (PEG) do powierzchni białek (Harris i Zalipsky, 1997). Po raz pierwszy pokazano, że użycie PEGu o Mr~1000 do >10 000 u ssaków przedłuża czas krążenia i ogranicza immunogenność kilku obcych białek (Abuchowski i wsp., 1977a; Abuchowski i wsp., 1977b; Davis i wsp., 1981a; Abuchowski i wsp., 1984; Davis i wsp., 1991). W 1990 roku bydlęca deaminaza adenozynowa (ADA) zmodyfikowana PEG o Mr 5000 (PEG-AD A, ADAGEN®, wyprodukowana przez Enzon Inc.) stała się pierwszym PEG-ylowanym białkiem dopuszczonym przez United States Food and Drug Administration do leczenia ostrych, złożonych chorób niewydolności układu odpornościowego wywołanych niedoborem ADA (Hershfield i wsp., 1987). Doświadczenia ostatnich dwunastu lat pokazały, że przeciwciała przeciw ADA można wykryć przez czuły test ELISA u większości pacjentów podczas przewlekłego leczenia PEG-ADA, lecz nie zaobserwowano nadwrażliwości lub reakcji alergicznych; przyśpieszone usuwanie PEG-ADA wystąpiło u nielicznych pacjentów wytwarzających przeciwciała przeciw ADA, lecz zazwyczaj był to efekt przejściowy (Chaffee i wsp., 1992; Hershfield, 1997). Należy rozumieć, że funkcje odpornościowe pacjentów z niedoborem ADA zazwyczaj nie są prawidłowe podczas leczenia PEG-ADA (Hershfield, 1995; Hershfield i Mitchell, 1995). Tak więc immunogenność może być bardziej znaczącym problemem przy opracowywaniu PEGylowanych enzymów do przewlekłego leczenia pacjentów z prawidłowo funkcjonującym układem odpornościowym.
Specjalista rozumie, że immunogenność jest to zależna od indukcji odpowiedź odpornościowa wywoływana przez wstrzyknięcie preparatu antygenu (takiego jak zmodyfikowane PEG-iem białko lub białko niezmodyfikowane), podczas gdy antygenowość dotyczy reakcji antygenu z wcześniej istniejącymi przeciwciałami. Łącznie antygenowość i immunogenność są określane jako immunoreaktywność. We wcześniejszych badaniach PEG-urykazy immunoreaktywność była oceniana różnymi metodami, w tym, reakcją in vitro PEG-urykazy z wcześniej wytworzonymi przeciwciałami; pomiarami indukowanej syntezy przeciwciała i większymi szybkościami oczyszczania po kolejnych iniekcjach.
Pokazano, że PEG-ylacja ogranicza immunogenność i przedłuża czas krążenia grzybowej i świńskiej urykazy w zwierzę tach (Chen i wsp., 1981; Savoca i wsp., 1984; Tsuji i wsp., 1985; Veronese i wsp., 1997). Modyfikowana PEG urykaza z Candida szybko obniża poziom moczanu w surowicy do poziomów nie wykrywalnych u pięciu ochotników o prawidłowym poziomie moczanu (Davis i wsp., 1981b). PEG-ylowana urykaza z Arthrobacter produkowana przez Enzon, Inc., była stosowana ze względów humanitarnych w leczeniu nadwrażliwych na allopurynol pacjentów z chłoniakiem, którzy ujawniali niewydolność nerki i znaczącą hiperurycemię (Chua i wsp., 1988; Greenberg i Hershfield, 1989). Przez około 2 tygodnie podano 4 domięśniowe iniekcje. W czasie tego krótkiego okresu kontrolowano hiperurycemię i w surowicy pacjentów nie można było wykryć testem ELISA przeciwciał przeciw urykazie. Ponadto, celem nie było zastosowanie i kliniczne badanie takiego preparatu. Do chwili obecnej nie opracowano postaci urykazy lub PEG-urykazy, która miałaby odpowiednio długi czas krążenia i wystarczająco obniżoną immunogenność dla bezpiecznego i niezawodnego stosowania w dł ugotrwał ym leczeniu. Celem tego wynalazku jest dostarczenie udoskonalonej postaci urykazy, która w połączeniu z PEG-ylacją może spełnić te wymagania. Wynalazkiem jest pochodząca od ssaków unikalna, zrekombinowana urykaza, która została tak zmodyfikowana w wyniku mutacji, że jak to pokazano, wzrosła zdolność PEG-ylacji w celu maskowania potencjalnie immunogennych epitopów.
Niniejszy wynalazek dotyczy zrekombinowanego białka urykazy zawierającego jedno lub więcej ssaczych białek urykazy, które zostało zmodyfikowane przez wprowadzenie od jednej do dziesięciu reszt lizynowych, przy czym modyfikująca reszta nie znajduje się pośród trzech C-końcowych aminokwasów.
Korzystnie ssacze białko urykazy zostało zmodyfikowane przez wprowadzenie jednej reszty lizyny.
Bardziej korzystnie modyfikacja występuje w pozycji aminokwasowej 291 w Sekw. Id. Nr :7.
Korzystnie zrekombinowane białko urykazy według wynalazku jest białkiem chimerowym zbudowanym z dwóch lub większej liczby ssaczych sekwencji aminokwasowych.
PL 207 369 B1
Bardziej korzystnie chimerowe zrekombinowane białko urykazy zawiera 304 aminokwasy, pierwszą 225- aminokwasową N-końcową jego część stanowią aminokwasy 1-225 ze świńskiej urykazy, a pozostałe 79 aminokwasów w pozycjach 226-304 pochodzi z urykazy pawiana lub chimerowe zrekombinowane białko urykazy zawiera 304 aminokwasy, pierwszą 288- aminokwasową N-końcową jego część stanowią aminokwasy 1-288 ze świńskiej urykazy, a pozostałe 16 aminokwasów w pozycjach 289-304 pochodzi z urykazy pawiana.
Niniejszy wynalazek dotyczy również zrekombinowanego białka urykazy, które jest wybrane z grupy skł adają cej się z Sek. Id. Nr: 2, 4, 8, 9, 10 i 11.
W zakres wynalazku wchodzi też wyizolowana i oczyszczona cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje zrekombinowaną urykazę określoną powyżej.
Ponadto niniejszy wynalazek dotyczy wektora obejmującego cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku.
Zakres niniejszego wynalazku obejmuje również komórkę gospodarza wybraną z grupy składającej się z bakterii, drożdży, grzybów z filamentami, komórek roślinnych, komórek zwierzęcych i komórek owadzich, która zawiera wektor okreś lony powyż ej.
W zakres wynalazku wchodzi również sposób zwiększenia dostępności nieszkodliwych miejsc przyłączenia PEG do białka urykazy, który obejmuje wprowadzenie przez mutację do białka urykazy z gatunków ssaczych od jednej do dziesięciu reszt lizynowych, przy czym modyfikująca reszta nie znajduje się pośród trzech C-końcowych aminokwasów.
Niniejszy wynalazek dotyczy też sposobu zwiększenia dostępności nieszkodliwych miejsc przyłączenia PEG do białka urykazy, który obejmuje wprowadzenie przez mutację do białka urykazy z gatunków ssaczych od jednej do dziesię ciu reszt lizynowych w miejsce argininy, przy czym modyfikująca reszta nie znajduje się pośród trzech C-końcowych aminokwasów.
Obecny wynalazek dostarcza białek urykazy, które mogą być użyte do wytworzenia zasadniczo nieimmunogennej PEG-urykazy, która zachowuje całą, lub prawie całą urykolityczną aktywność niemodyfikowanego enzymu. Aktywność urykolityczna jest wyrażona tutaj w międzynarodowych jednostkach (lU) na mg białka, gdzie lU aktywności urykazy jest zdefiniowana jako ilość enzymu, która przekształca 1 mikromol kwasu moczowego w ciągu minuty.
Obecny wynalazek dostarcza zrekombinowanego białka urykazy pochodzącego od ssaków, które zostało zmodyfikowane przez wprowadzenie jednej lub większej liczby reszt j lizyny. Zrekombinowane białko w użytym tu znaczeniu odnosi się do jakiegokolwiek sztucznie wytworzonego białka i róż ni się od naturalnie wytwarzanych biał ek (np. które są wytworzone w tkankach zwierzą t mają cych jedynie naturalny gen dla określonego, interesującego białka). Białka obejmują peptydy i sekwencje aminokwasowe.
Zrekombinowane białko urykazy według wynalazku może być chimerowe lub hybrydowe zbudowane z dwóch lub większej liczby ssaczych białek, peptydów lub sekwencji aminokwasowych. Obecny wynalazek może być stosowany dla wytwarzania pochodzącego od ssaków zrekombinowanego białka urykazy, które zostało zmodyfikowane celem zwiększenia liczby lizyn do poziomu, w którym po PEG-ylacji zrekombinowanego białka urykazy otrzymana PEG-ylowana urykaza jest zasadniczo tak aktywna enzymatycznie, jak urykaza niezmodyfikowana, a produkt PEG-ylacji urykazy nie jest immunogenny w niedopuszczalnym stopniu. Bierze się również pod uwagę skróconą postać urykazy według obecnego wynalazku, w której może nie występować aminowy i/lub karboksylowy koniec urykazy. Korzystnie, urykaza nie jest skrócona w takim stopniu, że usunięte są lizyny.
Białka urykazy mogą być zmodyfikowane przez przyłączenie do nietoksycznego, nieimmunogennego farmaceutycznie akceptowalnego nośnika, takiego jak PEG, przez kowalencyjne wiązanie z co najmniej jedną, zawartą w białku urykazy, lizyną . Alternatywnie, białko urykaza jest modyfikowane przez przyłączenie do nośnika za pośrednictwem mniej niż około 10 lizyn występujących w jego sekwencji aminokwasowej. Jako alternatywne postaci, rozważane jest przyłączenie do którychkolwiek z 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 lub 9 lizyn.
Białko urykazy według obecnego wynalazku jest zrekombinowaną cząsteczką obejmującą fragmenty świńskiego i pochodzącego od pawiana białka urykazy z wątroby. Dostarczona jest również zmodyfikowana sekwencja z pawiana. W jednym wykonaniu obecny wynalazek dotyczy chimerowej urykazy świnia-pawian (urykaza PBC (Sekw. Id. Nr:2)), która obejmuje aminokwasy (aa) 1-225 ze świńskiej urykazy (Sekw.Id. Nr:7) i aa226-304 urykazy pawiana (Sekw.Id. Nr:6) (patrz również sekwencja na Fig. 5). W kolejnym wykonaniu obecny wynalazek dotyczy chimerowej urykazy świniapawian (urykaza PKS) obejmującej aa1-288 ze świńskiej urykazy i aa289-304 z urykazy z pawiana
PL 207 369 B1 (Sekw. Id. Nr: 4). Rozważa się również skrócone pochodne PBC i PKS. Korzystnymi skróconymi formami są skrócone białka PBC i PKS, z których usunięto 6 aminokwasów z końca aminowego lub 3 aminokwasy z końca karboksylowego, lub jedne i drugie. Reprezentatywne sekwencje podano jako Sekw. Id. Nr: 8 (PBC skrócony na końcu aminowym), 9 (PBC skrócony na końcu karboksylowym), 10 (PKS skrócony na końcu aminowym) i 11 (PKS skrócony na końcu karboksylowym). PBC urykaza, PKS urykaza i ich skrócone postaci mają jedną do czterech dodatkowych lizyn w porównaniu do sklonowanych, znalezionych u innych ssaków urykaz.
Obecny wynalazek dotyczy cząsteczek kwasu nukleinowego (DNA i RNA) (sekwencji), włącznie z wyizolowanymi, oczyszczonymi i/lub sklonowanymi postaciami cząsteczek kwasu nukleinowego kodującymi białka urykazy i opisane tutaj skrócone białka. Korzystne postaci są przedstawione na Sekw. Id. Nr: 1 (urykaza PBC) i Sekw. Id. Nr: 3 (urykaza PKS).
Wektory (ekspresyjne i dla klonowania) zawierające te cząsteczki kwasu nukleinowego są również dostarczone przez obecny wynalazek.
Ponadto, obecny wynalazek dotyczy zawierających takie wektory komórek gospodarzy.
Białka urykazy mogą wiązać się ze swoistymi przeciwciałami. Przeciwciała do aminowej części świńskiej urykazy i przeciwciała do karboksylowej części urykazy z pawiana, gdy stosuje się je łącznie, powinny być przydatne do wykrywania PBC lub innych, podobnych białek chimerowych. Korzystnie, przeciwciało do aminowej części chimerowej urykazy nie powinno rozpoznawać aminowej części urykazy pochodzącej od pawiana i podobnie przeciwciało do karboksylowej części chimerowej urykazy nie powinno rozpoznawać karboksylowej części urykazy świńskiej. Korzystne są przeciwciała, które specyficznie wiążą PBC lub PKS, ale nie wiążą naturalnych białek, takich jak urykazy świńska i/lub z pawiana.
Co najmniej jedno białko urykazy według wynalazku lub opisane tu koniuganty urykazy i farmaceutycznie akceptowalny nośnik, rozcieńczalnik lub wypełniacz mogą wchodzić w skład kompozycji farmaceutycznej do zmniejszania poziomu kwasu moczowego w płynach ciała, takich jak mocz i/lub surowica lub osocze.
Korzystnie ssakiem, u którego stosuje się tę kompozycję, jest człowiek. Kompozycję można podać, na przykład, drogą iniekcji dożylnej, śródskórnej, domięśniowej lub dootrzewnowej. Podwyższony poziom kwasu moczowego może być we krwi lub w moczu i może towarzyszyć skazie moczanowej, skazie moczanowej z guzkiem, niewydolności nerek, transplantacji narządu lub chorobie nowotworowej. Zrekombinowaną urykazę izoluje się i/lub oczyszcza z roztworu zawierającego urykazę, na przykład ze szczątków komórkowych i pozakomórkowych. Korzystnie, sposób oczyszczania wykorzystuje ograniczoną rozpuszczalność ssaczej urykazy przy niskim pH (Conley i wsp., 1979). Nieoczyszczony ekstrakt zawierający zrekombinowany produkt płucze się przy pH od około 7 do około 8,5 w celu usunięcia większości białek, które są rozpuszczalne przy takim niskim zakresie pH, podczas gdy aktywna urykaza jest rozpuszczana w buforze, korzystnie buforze z węglanu sodu o pH około 10-11, korzystnie około 10,2. Rozpuszczona, aktywna urykaza może być następnie naniesiona na kolumnę anionowowymienną, taką jak kolumna z Q Sepharose, która jest płukana gradientem stężenia soli niskim do wysokiego w buforze o pH około 8,5, po czym oczyszczoną urykazę uzyskuje się przez wypłukiwanie gradientem chlorku sodu w buforze z węglanu sodu o pH około 10 do około 11, korzystnie około 10,2. Enzym może być dalej oczyszczony przez chromatografię żelową przy pH od około 10 do około 11. Na tym etapie enzym może być dalej oczyszczany przez obniżenie pH do około 8,5 lub mniej w celu wybiórczego wytrącenia urykazy, a nie bardziej rozpuszczalnych zanieczyszczeń. Po płukaniu przy niskim pH (7-8) urykaza jest następnie rozpuszczana przy pH około 10,2. Preparat urykazy może być dalej analizowany sposobami znanymi w preparatyce farmaceutycznej, takimi jak, na przykład, wysokorozdzielcza chromatografia cieczowa (HPLC), inne metody chromatograficzne, rozpraszanie światła, wirowanie i/lub elektroforeza w żelu.
Krótki opis rysunków
Figura 1 Analiza przez SDS-merkaptoetanol PAGE (12% żel)
Figura 2 Czas krążenia natywnej i j PEG-ylowanej urykazy PBC.
Figura 3 Zależność aktywności urykazy z surowicy od stężenia kwasu moczowego w surowicy i moczu.
Figura 4 Podtrzymywanie poziomu aktywności krążącej urykazy (mierzonego w surowicy) po kolejnych iniekcjach.
Figura 5 przedstawia wydedukowane sekwencje aminokwasowe chimerowej urykazy świniapawian (urykaza PBC) i świńskiej urykazy z mutacjami R291K i T301S (urykaza PKS) porównanych z sekwencjami ś wiń ską i pawiana.
PL 207 369 B1
Figura 6 Porównanie sekwencji aminokwasowych PKS i świńskiej urykazy
Figura 7 Porównanie sekwencji aminokwasowych PBC i PKS.
Figura 8 Porównanie sekwencji aminokwasowych PBC i świńskiej urykazy
Figura 9 Porównanie sekwencji aminokwasowych świńskiej urykazy i D3H.
Figura 10 porównanie sekwencji aminokwasowych PBC i D3H.
Figura 11-1 i 11-2. Bestfit (program GCG) porównanie sekwencji kodujących cDNA dla PKS i ś wińskiej urykazy.
Figura 12-1 i 12-2. Bestfit (program GCG) porównanie sekwencji kodujących cDNA dla PKS i urykazy pawiana.
Figura 13-1 i 13-2. Bestfit (program GCG) porównanie sekwencji kodujących cDNA dla PBC i ś wińskiej urykazy.
Figura 14-1 i 14-2. Bestfit (program GCG) porównanie sekwencji kodujących cDNA dla PBC i urykazy pawiana.
Białko urykazy według wynalazku jest użytecznym produktem wyjściowym do wytwarzania udoskonalonego koniugatu urykazy z rozpuszczalnymi w wodzie polimerami, korzystnie poli(glikolami polietylenowymi) lub poli(tlenkami etylenu) z urykazą. Urykaza obejmuje pojedyncze podjednostki, jak również naturalne tetramery, chyba, że podano inaczej.
Chociaż człowiek nie wytwarza aktywnego enzymu, transkrypt mRNA dla urykazy został zamplifikowany na matrycy RNA z wątroby człowieka (Wu i wsp. 1992). Teoretycznie jest możliwe, że translacji ulegają niektóre transkrypty kodujące u człowieka urykazę; nawet jeśli peptydowe produkty nie są pełnej długości lub są niestabilne, to mogą być obrabiane przez komórki prezentujące antygen i odgrywać rolę w określaniu odpowiedzi odpornościowej na egzogenną urykazę, użytą w leczeniu. W teorii jest moż liwa rekonstrukcja i ekspresja cDNA dla ludzkiej urykazy, przez wyeliminowanie dwóch znanych mutacji nonsens. Jednak przy braku presji selekcyjnej, jest bardzo prawdopodobne, że w ciągu milionów lat od pojawienia się pierwszej mutacji typu nonsens gromadziły się szkodliwe mutacje typu missens (Wu i wsp. 1989; Wu i wsp. 1982). Identyfikacja i „poprawianie wszystkich mutacji dla uzyskania maksymalnej aktywności katalitycznej i stabilności białka, będą bardzo trudne.
Autorzy obecnego wynalazku zdają sobie sprawę, że istnieje wysoka homologia (podobieństwo) między wydedukowaną sekwencją aminokwasową ludzkiej urykazy a świńską (około 86%) i pawiana (około 92%) (patrz Figury 6-14, dla przykładowego pomiaru podobieństwa), podczas gdy homologia (podobieństwo) pomiędzy ludzką urykazą i pochodzącą z A. flavus wynosi <40% (Lee i wsp. 1988; Reddy i wsp. 1988; Wu i wsp. 1989; Legoux i wsp. 1992; Wu i wsp. 1992). Obecny wynalazek dotyczy wytworzonego przez rekombinację białka chimerowej urykazy od dwóch różnych ssaków, która jest mniej immunoreaktywna dla ludzi niż mniej spokrewnione bardziej odległe enzymy grzybowe i bakteryjne. Oczekuje się, że zastosowanie pochodnych ssaczej urykazy będzie lepiej akceptowane przez pacjenta i jego lekarza.
Doświadczenie pokazało, że aktywowane PEG-i, takie jakie były użyte do wytwarzania PEGADA i modyfikacji innych białek, przyłączają się za pośrednictwem pierwszorzędowych grup aminowych aminokońcowego aminokwasu (gdy są obecne i nie są zablokowane) i epsilon aminowych grup lizyny. Ta strategia jest użyteczna, ponieważ mogą być zastosowane łagodne warunki reakcji i ponieważ dodatnio naładowana lizyna wykazuje skłonność do umiejscawiania się na powierzchniach białek. To ostatnie jest ważne, bowiem dla któregokolwiek z leczniczych białek pożądany wpływ PEG-ylacji będzie zależał w części od charakterystyki polimeru PEG (np. masy, struktury rozgałęzionej lub nierozgałęzionej itd.) jak również od liczby i rozmieszczenia miejsc przyłączenia PEG na białku względem epitopów i elementów strukturalnych, które determinują funkcję i usuwanie białka. Opracowano strategię zwiększania zdolności PEG-ylacji do „maskowania epitopów i zmniejszania immunogenności przez semiselektywne wprowadzanie nowych reszt lizyny dla potencjalnego dodania PEG (Hershfield i wsp., 1991). Strategia ta wykorzystuje mutagenezę do zastą pienia wybranych kodonów dla argininy kodonami dla lizyny, substytucję, która zachowuje dodatni ładunek i ma minimalny wpływ na przewidziane komputerowo wskaźniki prawdopodobieństwa powierzchni i antygenowość (użyteczną, gdy znana jest jedynie sekwencja aminokwasowa).
Jako test eksperymentalny tej strategii zastosowano fosforylazę nukleozydów purynowych z E. coli (EPNP) (Hershfield i wsp., 1991). Wprowadzono podstawienia Arg na Lys w trzech miejscach, zwiększając liczbę lizyn w podjednostce z 14 do 17 bez zmiany aktywności katalitycznej. Oczyszczony potrójny mutant zachowuje pełną aktywność po modyfikacji ~70% dostępnych grup NH2 nadmiarem disukcynylo-PEG 5000. Miareczkowanie reaktywnych grup aminowych przed i po modyfikowaniu
PL 207 369 B1
PEG-em sugeruje, że potrójny mutant może przyjąć o jeden więcej łańcuch PEG na podjednostkę niż enzym typu dzikiego. PEGylacja wydłuża czas krążenia zarówno enzymu EPNP typu dzikiego jak i mutanta, u myszy z ~4 godzin do >6 dni. Po serii dootrzewnowych iniekcji wykonanych w tygodniowych/dwutygodniowych odstępach czasu, wszystkie myszy poddane działaniu niezmodyfikowanego EPNP i 10 z 16-tu myszy (60%)) nastrzykniętych zmodyfikowanym PEG EPNP typu dzikiego rozwinęło wysoki poziom przeciwciał przeciw EPNP i znaczącemu skróceniu uległ czas krążenia. Przeciwnie, jedynie 2/12 myszy (17%) poddanych działaniu zmutowanego PEG-EPNP ujawniało szybkie jego usuwanie; niski poziom przeciwciał u tych myszy nie korelował z czasem krążenia. Tak więc strategia ta odniosła powodzenie w zasadniczym ograniczeniu immunogenności nawet, jeśli jedynie 1 z 3 nowych lizyn uległa modyfikacji po działaniu aktywowanym PEG.
Zarówno świńska urykaza jak i urykaza z pawiana zbudowane są z 304 aminokwasów, z których 29 (to jest 1 na około 10) są lizynami. Początkowe próby wprowadzenia dwóch substytucji Arg na Lys do sklonowanego cDNA dla urykazy z pawiana, jak również podstawienie kodonem dla lizyny kodonu Glu w pozycji 208, o którym wiadomo, że koduje Lys w genie dla ludzkiej urykazy doprowadziło do wyrażenia zmutowanego białka urykazy z pawiana o znacznie zmniejszonej katalitycznej aktywności urykazy. Z eksperymentu tego wynika, że zdolność do zachowania enzymatycznej aktywności urykazy po zamianie, w wyniku mutacji w sekwencji DNA ssaka, argininy na lizynę jest nieprzewidywalna.
Z kolei należ y rozumieć , ż e w urykazie z pawiana 291 aminokwasem jest lizyna, lecz odpowiadającym jej aminokwasem w urykazie świni jest arginina. Obecne w obu cDNA miejsce dla enzymu restrykcyjnego Apal zostało wykorzystane do konstrukcji chimerowej urykazy, w której pierwsze 225 aminokwasów pochodzi ze świńskiego cDNA, a tworzących karboksylowy koniec 79 aminokwasów pochodzi z cDNA pawiana. Uzyskana chimerowa urykaza świnia-pawian (PBC) (Sekw. Id. Nr: 2) posiada 30 lizyn, o jedną więcej niż każdy z „rodzicielskich enzymów. Dodatkową właściwością urykazy PBC jest to, że jej „pawiania część różni się od ludzkiej urykazy 4 aminokwasami z 79, podczas gdy świńska i ludzka różnią się w tym samym regionie 10. Następnie skonstruowano zmodyfikowaną wersję PBC, która zachowała dodatkową lizynę w pozycji 291 i ponadto różniła się od świńskiej urykazy jedynie podstawieniem seryny na treoninę w pozycji 301 („świński KS urykaza (Sekw. Id. Nr: 4)). W świetle wyników opisanych w poprzednim paragrafie, gdzie szereg innych insercji lizyny było szkodliwych dla aktywności, niespodziewanie chimerowe urykazy PBC i PKS były w pełni aktywne w porównaniu z niezmutowaną świńską urykazą i około ponad czterokrotnie bardziej aktywne w porównaniu z niezmutowaną naturalną urykazą pawiana.
Obecny wynalazek dostarcza zrekombinowanej chimerowej urykazy, złożonej z części świńskiej i sekwencji urykazy z wątroby pawiana. Jedna taka, przykładowa urykaza chimerowa zawiera pierwsze 225 aminokwasów z sekwencji urykazy ze świni (Sekw. Id. Nr: 7) i ostatnie 79 aminokwasów z sekwencji urykazy z pawiana (Sekw. Id Nr: 6) (urykaza świńsko-pawiana lub urykaza PBC; Figura 6 i Sekw. Id. Nr: 2). Inna taka przykładowa, chimerowa urykaza zawiera pierwsze 288 aminokwasów z sekwencji świńskiej (Sekw. Id. Nr: 7) i ostatnie 16 aminokwasów z sekwencji szympansa (Sekw. Id. Nr: 6). Ponieważ ostatnia sekwencja różni się od sekwencji świńskiej tylko w dwóch miejscach, mając lizynę (K) zamiast argininy w pozycji 291 i serynę (S) zamiast treoniny w pozycji 301, taki mutant jest określany jako świńska-K-S lub PKS urykaza.
Wektory według wynalazku (do ekspresji i klonowania) obejmują cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące białka według wynalazku. Korzystne wektory obejmują te, które podano tu dla przykładu. Specjalista w dziedzinie rozumie, że cząsteczki kwasów nukleinowych mogą być wbudowane do wektora ekspresyjnego, takiego jak plazmid, w odpowiedniej orientacji i odpowiedniej dla ekspresji ramce odczytu. Jeśli jest to niezbędne, kwas nukleinowy (DNA) może być połączony z odpowiednią sekwencją nukleotydową regulującą transkrypcję i translację rozpoznawaną przez odpowiedniego gospodarza, bowiem takie elementy kontrolne są ogólnie dostępne w znanych w dziedzinie wektorach ekspresyjnych. Wektor może być wprowadzony do komórek gospodarza standardowymi technikami. Ogólnie, nie wszystkie komórki gospodarza będą stransformowane wektorem.
Ponadto, może być niezbędne selekcjonowanie stransformowanych komórek gospodarza. Jedna z takich metod selekcji, znana w dziedzinie, wymaga wbudowania sekwencji DNA do wektora ekspresyjnego z dowolnymi niezbędnymi kontrolnymi elementami, które kodują w stransformowanej komórce marker selekcyjny, taki jak odporność na antybiotyk. Alternatywnie, gen dla takiej, podlegającej selekcji właściwości może znajdować się na innym wektorze użytym w kotransformacji żądanych komórek gospodarza. Wektory mogą również zawierać odpowiedni promotor, taki jak promotor prokariotyczny zdolny do uruchomienia ekspresji (transkrypcji i translacji) DNA w komórce bakteryjnego go8
PL 207 369 B1 spodarza, takiego jak E. coli, którym zostały stransformowane. Liczne systemy ekspresji są dostępne i znane w dziedzinie i obejmują systemy bakteryjne (na przyk ł ad E. coli i Bacillus subtilis), drożd żowe (na przykład Saccharomyces cerevisiae), grzyby nitkowate (na przykład Aspergillus), komórki roślinne, komórki zwierzęce i komórki owadzie.
Odpowiednie wektory mogą obejmować prokariotyczne replikony, takie jak Co1E1 ori dla namnażania, na przykład w prokarioncie. Typowymi prokariotycznymi wektorami plazmidowymi są pUC18, pUC19, pUC322 i pBR329 dostępne z Biorad Laboratories (Richmond CA) i pTcr99A i pKK223-3 dostępne z Pharmacia (Piscataway, NJ). Typowym wektorem plazmidowym dla komórek ssaczych jest pSVL dostępny z Pharmacia (Piscataway, NJ). Wektor ten wykorzystuje późny promotor SV40 do wywoływania ekspresji sklonowanych genów, przy czym najwyższy poziom ekspresji stwierdzono w komórkach wytwarzających antygen T, takich jak komórki COS-1. Przykładem indukowalnego ssaczego wektora ekspresyjnego jest pMSG dostępny również z Pharmacia. Wektor ten wykorzystuje indukowalny glukokortykoidem promotor z długiego końcowego powtórzenia z mysiego wirusa guza gruczołu mlecznego, do wywoływania ekspresji sklonowanego genu. Użytecznymi drożdżowymi wektorami plazmidowymi są pRS403-406 i pRS413-416, które są ogólnie dostępne z Stratagene Cloning Systems (LaJolla, CA). Plazmidy pRS403, pRS404, pRS405 i pRS406 są drożdżowymi plazmidami integracyjnymi (Yips) i włączają drożdżowe markery selekcyjne HIS3, TRP1, LEU2 i URA3. Plazmidy pRS413-416 są drożdżowymi plazmidami centomerowymi (Ycps).
Ponadto, obecny wynalazek dostarcza niosących te wektory komórek gospodarza. Korzystne komórki gospodarza obejmują te, które podano dla przykładu i opisano tutaj.
Białka urykazy według obecnego wynalazku mogą być skoniugowane przez biologicznie stabilne, nie toksyczne wiązania kowalencyjne ze stosunkowo małą liczbą łańcuchów PEG celem wydłużenia ich biologicznego półokresu trwania i rozpuszczalności i ograniczenia ich immunoreaktywności. Takie wiązania mogą obejmować wiązania uretanowe (karbaminianowe), drugorzędowe wiązania aminowe i wiązania amidowe. Różnorodne, aktywowane PEG odpowiednie dla koniugacji są komercyjnie dostępne z Shearwater Polimers, Huntsville, al.
Specjalista rozumie, że skoniugowany kompleks urykaza-nośnik nie może zawierać tak wielu wiązań, które zasadniczo zmniejszałyby aktywność enzymatyczną urykazy lub zbyt mało wiązań, co spowoduje, że kompleks będzie nieakceptowany z uwagi na immunogenność. Korzystnie, koniugat powinien zachować co najmniej około 70% do około 90% aktywności urykolitycznej nie zmodyfikowanego białka urykazy będąc bardziej stabilnym tak, że zachowuje aktywność enzymatyczną podczas przechowywania, w osoczu i/lub surowicy ssaka w temperaturze fizjologicznej w porównaniu z niezmodyfikowanym białkiem urykazy. Akceptowane będzie zachowanie co najmniej około 80% do około 85% aktywności urykolitycznej. Ponadto, w korzystnej postaci, koniugat charakteryzuje się zasadniczo ograniczoną immunogennością i/lub immunoreaktywnością w porównaniu z niezmodyfikowanym białkiem urykazy.
Wynalazek może być również zastosowany do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej z białkami urykazy jako koniugatami. Koniugaty te są zasadniczo nieimmunogenne i zachowują co najmniej 70%, korzystnie 80% i najkorzystniej co najmniej około 90% lub więcej urykolitycznej aktywności niezmodyfikowanego enzymu. Rozpuszczalne w wodzie polimery odpowiednie do stosowania obejmują liniowe i rozgałęzione poli(glikole etylenowe) lub poli(tlenki etylenu), wszystkie powszechnie znane jako PEG. Na przykład rozgałęziony PEG jest przedmiotem patentu U.S. 5,643,575.
W korzystnym wykonaniu liczba dodatkowych lizyn na podjednostkę urykazy jest w zakresie od 2 do 8. Należy rozumieć, że liczba dodatkowych lizyn nie powinna być zbyt duża, aby nie spowodować obniżenia aktywności katalitycznej urykazy. Przyłączane cząsteczki PEG są korzystnie koniugowane przez lizynę białka urykazy, korzystniej za pośrednictwem nie występujących w naturze lizyn lub lizyn, które zostały wprowadzone do części zaprojektowanego białka, która naturalnie, w tej pozycji nie zawiera lizyny.
Koniugaty PEG-urykaza są przydatne do obniżania poziomu (np. ograniczania ilości) kwasu moczowego we krwi i/lub moczu ssaków, korzystnie ludzi i co za tym idzie mogą być użyte do leczenia podwyższonych poziomów kwasu moczowego towarzyszących chorobom, w tym skazie moczanowej, guzka dnawego, niewydolności nerek, przy przeszczepach narządów i chorobach o charakterze złośliwym.
Koniugaty PEG-urykaza mogą być wprowadzone do organizmu ssaka, u którego stwierdzono podwyższone poziomy kwasu moczowego, dowolną drogą w tym doustnie, przez lewatywę lub czopek, dożylnie, podskórnie, śródskórnie, domięśniowo i dootrzewnowo. Patton, JS i wsp., (1992) Adv. Drug Delivery Rev. 8:179-228.
Skuteczna dawka PEG-urykazy będzie zależała od poziomu kwasu moczowego i wielkości osobnika. PEG-urykaza może być podawana z farmaceutycznie dopuszczalną substancją pomocniPL 207 369 B1 czą lub rozpuszczalnikiem w ilości w zakresie od 10 μg do około 1 g. Korzystnie, podawana ilość jest w zakresie między około 100 μg i 500 mg. Bardziej korzystnie, skoniugowana urykaza jest podawana w ilości między 1 mg i 100 mg, tak jak na przykład 5 mg, 20 mg lub 50 mg. Masy podane dla ilości w dawce określają ilość białka w koniugacie.
Farmaceutyczna kompozycja zawierająca PEG-urykazę może być wytworzona tradycyjnymi technikami np. jak opisano w Remingtons Pharmaceutical Sciences (1985) Easton, PA: Mack Publishing Co. Odpowiednie substancje pomocnicze do wytwarzania roztworów do iniekcji obejmują na przykład, sól fizjologiczną buforowaną fosforanem, płyn Ringera z dodatkiem mleczanu, wodę, poliole i glicerol. Kompozycja farmaceutyczna do iniekcji pozajelitowej obejmuje farmaceutycznie dopuszczalne, sterylne, wodne i niewodne płyny, dyspersje, zawiesiny lub emulsje jak również sterylne proszki do rekonstytuowania bezpośrednio przed użyciem w jałowych roztworach do iniekcji. Takie formulacje mogą zawierać dodatkowe składniki, takie jak, na przykład, środki konserwujące, substancje solubilizujące, substancje stabilizujące, czynniki zwilżające, emulgatory, bufory, antyoksydanty i rozpuszczalniki.
PEG-urykaza może być również w postaci kompozycji o przedłużonym uwalnianiu do wszczepienia osobnikowi w celu ciągłego kontrolowania podwyższonych poziomów kwasu moczowego we krwi i moczu. Na przykład kwas polimlekowy, kwas poliglikolowy, regenerowany kolagen, poli-L-lizyna, alginian sodu, guma gallen, chitosan, agaroza, multilamelarne liposomy i wiele innych, dogodnych postaci preparatu obejmujących biologicznie niszczone i biodegradowalne materiały, które mogą wchodzić w skład biologicznie aktywnej kompozycji. Materiały te, gdy są wszczepione lub wstrzyknięte, powoli rozkładają się uwalniając aktywny materiał do otaczających tkanek. Na przykład, jeden sposób kapsułkowania PEG-urykazy obejmuje opisany tu sposób ujawniony w opisie patentowym U.S. Nr. 5,653,974. Do dostarczenia PEG-urykazy można również stosować pompy infuzyjne i systemy zamykania w matrycy. Korzystnie PEG-urykaza może być również zamknięta w micellach lub liposomach. Technologia zamykania w liposomach jest dobrze znana w dziedzinie. Patrz np. Lasic, D, i wsp., (wyd.) (1995) Stealth Liposomes, Boca Raton, FL: CRC Press.
Opisana tu farmaceutyczna kompozycja PEG-urykaza zmniejsza potrzebę hemodializy u pacjentów z wysokim zagrożeniem niewydolności nerek indukowanej przez moczan, np. u biorców przeszczepów narządów (patrz Venkataseshan VS i wsp., (1990) Nephron 56:317-321) i u pacjentów z pewnymi chorobami o charakterze złośliwym. U pacjentów z dużym nagromadzeniem krystalicznego moczanu (guzki) taka farmaceutyczna kompozycja będzie poprawiała jakość życia znacznie szybciej niż obecnie dostępne sposoby leczenia.
Poniższe przykłady, które nie są skonstruowane jako ograniczające wynalazek w jakikolwiek sposób, obrazują różne aspekty powyższego ujawnienia.
P r z y k ł a d 1
A. Konstrukcja PBC, PKS i pokrewnych cDNA urykazy.
Standardowe metody i ewentualnie instrukcje dostarczone przez wytwórców odczynników zostały użyte do sporządzenia całkowitego, komórkowego RNA, do amplifikacji PCR (opis patentowy U.S. Nr. 4,683,195 i 4,683,202, 4,965,188 i 5,075,216) cDNA dla oksydazy moczanowej i do klonowania i sekwencjonowania tych cDNA (Erlich, 1989; Sambrook i wsp., 1989; Ausubel, 1998). Startery PCR dla oksydaz moczanowych ze świni i pawiana (Tabela 1) zaprojektowano w oparciu o opublikowane sekwencje kodujące (Wu i wsp., 1989) i stosując program PRIME (Genetics Computer Group, Inc.).
T a b e l a 1. Startery dla amplifikacji PCR cDNA oksydazy moczanowej.
cDNA urykazy z wątroby świni sensowny: 5'gcgcgaattccATGGCTCATTACCGTAATGACTACA 3' antysensowny: 5'gcgctctagaagcttccatggTCACAGCCTTGAAGTCAGC 3' cDNA dla urykazy z wątroby pawiana D3H sensowny: 5'gcgcgaattccATGGCCCACTACCATAACAACTAT 3' antysensowny kodująca; 5'gcgcccatggtctagaTCACAGTCTTGAAGACAACTTCCT
Sekwencje enzymów restrykcyjnych (małymi literami) wprowadzone na końcach starterów są sensowne (Świnia i pawian) EcoRI i Ncol; antysensowne (Świnia) Ncol, Hindlll, Xbal, antysensowne (pawian) Ncol. W przypadku startera sensownego dla pawiana trzeci kodon GAC (Asparaginian) występujący w oksydazie moczanowej pawiana (Wu i wsp., 1992) został zastąpiony przez CAC (Histydyna), kodon który występuje w tym miejscu w sekwencji kodującej pseudogenu oksydazy moczanowej
PL 207 369 B1 człowieka (Wu i wsp., 1992). Z tych przyczyn rekombinowana oksydaza moczanowa pawiana uzyskana przy pomocy tych starterów została nazwana oksydazą moczanową pawiana D3H.
Całkowitego komórkowego RNA z wątroby świni i pawiana użyto w reakcji odwrotnej transkrypcji przeprowadzonej przy pomocy zestawu 1st Strand Kit (Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ). Amplifikację PCR przy pomocy Taq polimerazy DNA (Gibco BRL, Life Technologies, Gaithersburg, MD) przeprowadzono w termocyklerze (Ericomp, San Diego, CA), stosując program [30 sek, 95°C;
sek 55°C; 60 sek. 70°C], 20 cykli, a następnie [30 sek. 95°C; 60 sek. 70°C] 10 cykli. Produkty PCR dla oksydazy moczanowej strawiono EcoRI i Hindlll i sklonowano w pUC18 (Świnia) i klonowano również bezpośrednio (świnia i pawian D3H) stosując system klonowania TA (Invitrogen, Carlsbad, CA). Klony cDNA wprowadzono przez transformację do E. coli szczepu XL1-Blue (Stratagene, La Jolla, CA). Wytworzono plazmidowy DNA zawierający sklonowany cDNA urykazy spreparowano i wstawkę sekwencji cDNA analizowano przy pomocy klasycznej techniki dideoksy. Skonstruowano klony, które mają opublikowaną sekwencję DNA kodującą oksydazę moczanową (z wyjątkiem dla podstawienia D3H w oksydazie moczanowej pawiana, co opisano w Tabeli Ι) i potwierdzono stosując szereg następujących po sobie etapów wykorzystujących standardową metodologię rekombinowania DNA.
cDNA świni i D3H pawiana niosące pełnej długości sekwencje kodujące wprowadzono do wektorów ekspresyjnych pET (Novagen, Madison, WI) w następujący sposób. cDNA dla urykazy D3H pawiana wycięto z plazmidu TA przy pomocy enzymów restrykcyjnych Ncol i BamHI i następnie subklonowano w miejsca dla klonowania Ncol i BamHI plazmidów ekspresyjnych pET3d i pET9d. Pełnej długości cDNA dla świńskiej urykazy wycięto z klonu na plazmidzie pUC przy pomocy enzymów restrykcyjnych EcoRI i HIndIII i subklonowano w miejsca EcoRI i HindIII pET28b. Region kodujący cDNA świni był również wprowadzony w miejsca NcoI i BlpI plazmidu ekspresyjnego pET9d po wycięciu z miejsc NcoI i BlpI pET28b.
Chimerowy cDNA świnia-pawian (PBC) skonstruowano przez wycięcie fragmentu restrykcyjnego NcoI-ApaI o długości 624 par zasad z cDNA urykazy D3H pawiana z klonu pawiana pET3d-D3H i zastąpienie tego fragmentu D3H pawiana odpowiadającym mu fragmentem restrykcyjnym NcoI-ApaI o długości 624 par zasad cDNA świni. Uzyskany cDNA oksydazy moczanowej PBC zawiera kodony 1-225 pochodzące ze świńskiej oksydazy moczanowej, połączone w ramce z kodonami 226-304 z oksydazy moczanowej pawiana.
cDNA dla świńskiej oksydazy moczanowej KS (PigKS) został skonstruowany przez wycięcie fragmentu restrykcyjnego NcoI-NdeI o długości 864 par zasad cDNA urykazy D3H pawiana z klonu pawiana pET3d-D3H i zastąpienie odcinka D3H pawiana odpowiadającym mu fragmentem restrykcyjnym NcoI-Ndel o długości 864 par zasad pochodzącym z cDNA świni. Uzyskany cDNA dla oksydazy moczanowej PKS zawiera pochodzące od świni kodony oksydazy moczanowej 1-288 połączone w ramce z kodonami 289-304 z oksydazy moczanowej pawiana.
Sekwencje aminokwasowe oksydaz moczanowych, pawiana D3H, świni PBC i PKS przedstawiono na Figurze 5 i w Liście Sekwencji. Do przygotowania zawiesiny podstawowej każdego z tych transformantów w 15% glicerolu, którą przechowywano w -70°C, stosowano standardowe techniki. Gdy każdy z tych gatunków został wytworzony przez ekspresję i wyizolowano zrekombinowane enzymy (Tabela 2), urykazy świńska, chimerowa PBC i PigKS miały podobną aktywność specyficzną która była około 4-5-krotnie wyższa niż aktywność specyficzna zrekombinowanej urykazy z pawiana. Taką kolejność potwierdzono w szeregu innych doświadczeń. Aktywność specyficzna urykazy PBC wytworzonej przy pomocy szeregu różnych procedur różniła się w zakresie 2-2,5 krotnym.
T a b e l a 2: Porównanie wyrażonych zrekombinowanych ssaczych urykaz
Konstrukt Aktywność specyficzna* (jednostki/mg) Względna aktywność (Chimera = 1)
PBC 7,02 1,00
PigKS 7,17 1,02
Świński 5,57 0,79
Z pawiana 1,36 0,19
*Bialko oznaczono metodą Lowry'ego. Aktywność urykazy określono spektrofotometrycznie (Priest i Pitts 1972). Oznaczenie przeprowadzono w 23-25°C w 1 cm kuwecie kwarcowej zawierającej 1 ml mieszaniny reakcyjnej (0,1 M boran sodu, pH 8,6), 0,1 mM kwas moczowy). Zanik kwasu moPL 207 369 B1 czowego monitorowano przez spadek absorbancji przy 292 nm. Jedna międzynarodowa jednostka (lU) urykazy katalizuje zanik jednego μmola kwasu moczowego na minutę.
Wyszczególnione w Tabeli 2 transformanty szczepu E. coli BL21(DE3)pLysS 4 konstruktami cDNA-pET, dla urykaz, wyszczepiono na szalki z agarem LB zawierającym antybiotyki stosowane do selekcji (karbenicylina i chloramfenikol dla pET3d (pigKS); kanamycyna i chloramfenikol dla pET9d (PBC, świnia, pawian) jak zalecano w pET System Manual (Novagen, Madison WI). 5-ml hodowle (LB plus antybiotyk) zaszczepiano pojedynczymi koloniami transformanta i hodowano przez 3 godziny w 37°C. Następnie 0,1 ml próbki przenoszono do 100 ml pożywki LB zawierającej stosowany do selekcji antybiotyk i 0,1% laktozy (dla indukcji ekspresji urykazy). Po całonocnej hodowli w 37°C, komórki bakteryjne z próbki hodowli o objętości 0,5 ml ekstrahowano buforem do nanoszenia na SDS-PAGE analizowano przez SDS-merkaptoetanol PAGE; to pokazało, że w każdej z 4 hodowli uzyskano porównywalny poziom ekspresji białka urykazy (wyniki nie pokazane). Pozostałe w 100 ml hodowli komórki zbierano przez wirowanie i płukano PBS. Następnie komórki ponownie zawieszano w 25 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem pH 7,4 (PBS) zawierających 1 mM inhibitor proteazy AEBSF (Calbiochem, Boston MA), a później lizowano na lodzie w Bacterial Cell Disruptor (Microfluidics, Boston, MA). Nierozpuszczalny materiał (zawierający urykazę) osadzano przez wirowanie (20, 190 X g, 4°C, 15 minut). Osady dwukrotnie płukano 10 ml PBS, a następnie ekstrahowano przez noc w 4°C ml 1 M Na2CO3, pH 10,2. Ekstrakty rozcieńczano w 10 ml wody i następnie wirowano (20, 190 x g, 4°C, 15 minut). Oznaczano aktywność urykazy i stężenie białka.
P r z y k ł a d 2
Ekspresja i izolacja zrekombinowanej urykazy PBC (preparatyka z 4 litrowego fermentora)
Transformant pET3d-PBC kodujący urykazę był wyszczepiany z podstawowej zawiesiny glicerolowej na płytkę z agarem LB zawierającym karbenicylinę i chloramfenikol, jak to zaleca Novagen pET System Manual. 200 ml inokulum zapoczątkowanego z pojedynczej kolonii uzyskano w zawierającym antybiotyk ciekłym podłożu LB, w wytrząsarce obrotowej (250 obr./min.) w 37°C, stosując procedury zalecane przez pET System Manual, dla maksymalizowania retencji plazmidu pET. Przy OD525 2,4 komórki z 200 ml hodowli zbierano przez wirowanie i zawieszano w 50 ml świeżej pożywki. Zawiesinę tę przenoszono do fermentora umożliwiającego uzyskanie hodowli o wysokiej gęstości, który zawierał 4 litry pożywki SLBH z karbenicyliną i chloramfenikolem (skład pożywki SLBH i sposób działania fermentora został opisany przez (Sadler i wsp. 1974). Po 20 godzinach hodowli pod O2 w 32°C (OD525 = 19) dodano izopropylotiogalaktozyd (IPTG) do 0,4 mM, indukując wytwarzanie urykazy. Po kolejnych 6 godzinach (OD525 = 37) komórki bakteryjne zbierano przez wirowanie (10,410 x g, 10 minut 4°C), płukano raz PBS i przechowywano zamrożone w -20°C.
Komórki bakterii (189 g) zawieszono ponownie w 200 ml PBS i lizowano, schładzając w kąpieli lodowo/solnej, rozbijając ultradźwiękami (Heat Systems Sonicator XL, sonda model CL, Farmingdale, NY) stosując 4 40-sekundowe uderzenia przy 100% natężeniu z 1 minutowymi przerwami między uderzeniami. Nierozpuszczalny w PBS materiał, zawierający urykazę, osadzano przez wirowanie (10, 410 x g, 10 minut, 4°C) i następnie 5-krotnie płukano 200 ml PBS. Urykazę ekstrahowano z nierozpuszczalnego w PBS osadu 80 ml 1 M Na2CO3, pH 10,2 zawierającego 1 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF) i 130 μg/ml aprotyniny. Nierozpuszczalne resztki usuwano przez wirowanie (20, 190 x g, 2 godziny, 4°C). Wszystkie dalsze etapy oczyszczania prowadzono w 4°C (wyniki podsumowano w Tabeli 3).
Ekstrakt o pH 10,2 rozcieńczano w 1800 ml 1 mM PMSF (w celu zmniejszenia stężenia Na2CO3 do 0,075 M). Taki ekstrakt nanoszono na kolumnę (2,6 x 9 cm) ze świeżą Q-Sepharose (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ), którą zrównoważono 0,075M Na2CO3 pH 10,2. Po naniesieniu, kolumnę kolejno płukano 1) 0,075 M Na2CO3, pH 10,2, aż do momentu, gdy absorbancja wycieku osiągnęła wartość tła; 2) 10 mM NaHCO3 pH 8,5, aż pH wycieku spadnie do 8,5; 3) 50 ml 10mM NaHCO3, pH 8,5, 0,15 M NaCl; 4) 100 ml gradientu 0,15 M do 1,5 M NaCl w 10 mM NaHCO3, pH 8,5; 5) 150 ml 10 mM NaHCO3, pH 8,5, 1,5 M NaCl; 6) 10 mM NaHCO3. pH 8,5; 7) 0,1 M Na2CO3, pH 11, aż do momentu, gdy pH wycieku wzrosło do 11. Ostatecznie urykaza była wymywana 500 ml gradientu od 0 do 0,6 M NaCl w 0,1 M Na2CO3, pH11. Aktywność wymywała się w dwóch frakcjach o maksymalnej absorbancji A280, które zbierano oddzielnie (Frakcja A i Frakcja B, Tabela 3). Urykaza, w każdej z tych pul była następnie wytrącona przez obniżenie pH do 7,1 w wyniku powolnego dodania 1 M kwasu octowego, a następnie wirowania (7000 x g, 10 minut). Uzyskany osad rozpuszczono w 50 ml 1 M Na2CO3, pH 10,2 i przechowywano w 4°C.
PL 207 369 B1
T a b e l a 3: Oczyszczanie zrekombinowanej urykazy świnia-pawian (PBC) Indukowana IPTG pasta komórkowa = 189,6 g
Frakcja Całkowite białko Aktywność urykazy Całkowita urykaza Aktywność specy-
mg U/ml jednostki ficzna U/mg
pH 7 rozbita ultradźwiękami + płukane pH 7 74,9
ekstrakt pH 10,2 4712 82,7 11170 2,4
Q-Sepharose Frakcja A 820 11,5 1081* 1,9
Frakcja B 1809 31,7 4080 2,3
pH 7,1 osad i rozpuszczona Frakcja A 598 35,0 1748 3,0
Frakcja B 1586 75,5 3773 2,4
Całkowity odzysk 2184 5521
*Urykaza obecna we frakcji A zaczęła spontanicznie się wytrącać, po wymyciu z kolumny. Zatem pomiar aktywności na tym stadium oczyszczania był zaniżony.
P r z y k ł a d 3. Sporządzanie na małą skalę i PEGyLacja zrekombinowanej urykazy PBC
Przykład ten pokazuje, że zrekombinowana PBC urykaza może być użyta do wytworzenia PEG pochodnej urykazy. W reakcji tej wszystkie podjednostki urykazy były zmodyfikowane (Figura 1, ścieżka 7) przy zachowaniu około 60% aktywności katalitycznej (Tabela 4).
A. Ekspresja i izolacja na małą skalę urykazy PBC (Tabela 4, Figura 1)
Czterolitrową hodowlę E. coli BL2(DL3)pLysS stransformowanych cDNA pET3d-PBC inkubowano na wytrząsarce obrotowej (250 obr./min.) w 37°C. Gdy hodowla osiągnęła OD525 0,7, była indukowana IPTG (0,4 mM, 6 godzin). Komórki zbierano i mrożono w -20°C. Komórki (15,3 g) rozbijano przez mrożenie i rozmrażanie, i ekstrahowano 1M Na2CO3, pH 10,2, 1mM PMSF. Po wirowaniu (12 000xg, 10 minut, 4°C) supernatant (85 ml) rozcieńczano 1:10 wodą i poddano chromatografii na Q-Sepharose w sposób podobny do opisanego w Przykładzie 1. Spulowane próbki o aktywności urykazy z tego etapu zatężano przez ciśnieniową ultrafiltrację przez błonę PM30 (Amicon, Beverly, MA). Koncentrat poddano chromatografii na kolumnie (2,5x100 cm) z Sephacryl S-200 (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), którą zrównoważono i płukano 0,1 M Na2CO3, pH 10,2. Spulowano frakcje zawierające aktywność urykazy i zatężano jak wyżej przez ciśnieniową ultrafiltrację
B. PEG-ylacja
100 mg zatężonej na Sephacryl S-200 PBC urykazy (5 mg/ml, 2,9 μmola enzymu; 84,1 μmola lizyny) w 0,1 M Na2CO3 pH 10,2 pozostawiono do przereagowania z 2-krotnym nadmiarem (mol PEG::mol lizyny w urykazie) z aktywowaną postacią PEG w 4°C przez 60 minut. PEG-ylowana urykaza została uwolniona od jakiejkolwiek nieprzereagowanej lub od zhydrolizowanej PEG przez filtrowanie w przeciwprądzie. Na tym etapie mieszaninę reakcyjną rozcieńczono 1:10 w 0,1M Na2CO3, pH 10,2 i dializowano wobec 3,5 objętości. 0,1 M Na2CO3, pH 10,2, a następnie wobec 3,5 objętości 0,05 M fosforanu sodu, 0,15 M NaCl, pH 7,2. Sterylizowany przez filtrowanie enzym był stabilny w 4°C przez co najmniej miesiąc.
T a b e l a 4
Podsumowanie oczyszczania i PEGylacji zrekombinowanej chimerowej urykazy świnia-pawian (PBC)
A. oczyszczona frakcja Białko całkowite mg Całkowita aktywność urykazy μmole/min. Aktywność specyficzna μmol/min./mg Odzysk aktywności %
surowy ekstrakt 1565 1010 0,6 100
Q-Sepharose 355 1051 3,0 104
Sephacryl S-200 215 1170 5,5 116
B. PEG-ylacja
S-200 urykaza 100 546 5,5 100
PEG-urykaza 97 336 3,5 62
PL 207 369 B1
Na Figurze 1 przedstawiono analizę SDS-merkaptoetanol PAGE (12% żel) frakcji otrzymanych podczas oczyszczania i PEG-ylacji zrekombinowanej chimerowej (PBC) urykazy świnia-pawian. Ścieżki: 1=marker masy cząsteczkowej; 2=ekstrakt SDS z nieindukowanych stransformowanych pET3d-PBC cDNA komórek (E. coli BL21 (DE3)pLysS); 3=ekstrakt SDS z indukowanych IPTG komórek stransformowanych pET-PBC cDNA; 4=surowy ekstrakt (patrz Tabela 5); 5=zatężona pula urykazy z Q-Sepharose; 6=zatężona pula urykazy z Sephacryl S-200; 7= PEG-ylowana zrekombinowana urykaza PBC oczyszczona na Sephacryl S-200.
Przedstawione w Tabeli 4 wyniki pokazują, że oczyszczona PBC urykaza może być modyfikowana z zachowaniem około 60% aktywności katalitycznej. W tej reakcji PEG-ylacji zmodyfikowane były wszystkie podjednostki urykazy (Figura 1, ścieżka 7). W badaniach tych nie pokazano, że PEG-ylowany enzym ma podobne właściwości kinetyczne co niezmodyfikowana PBC urykaza (KM 10-20 μΜ). Co ważne, zmodyfikowany enzym był znacznie bardziej rozpuszczalny w warunkach fizjologicznego pH niż enzym niezmodyfikowany (>5 mg/ml w PBS versus<1 mg/ml). Zmodyfikowany PEG enzym może również być zliofilizowany, a następnie rekonstytuowany w PBS, pH 7,2, z minimalną utratą aktywności. W innych doświadczeniach porównaliśmy aktywności tak przygotowanej PEG-PBC urykazy z klinicznymi preparatami urykazy z A. flavus. Przy pH 8,6 w buforze boranowym enzym z A. flavus miał 10-14 razy wyższy Vmax i dwukrotnie wyższą KM. Jednak, w PBS, pH 7,2, PEG-PBC i niezmodyfikowane enzymy grzybowe różniły się aktywnością enzymatyczną < niż dwukrotnie.
P r z y k ł a d 4
Czas krążenia w organizmie myszy niezmodyfikowanej i zmodyfikowanej PEG urykazy PBC
Na Figurze 2 pokazano czas krążenia natywnej i PEG-ylowanej urykazy PBC. Grupom myszy (trzy na punkt czasowy) wstrzykiwano IP z 1 jednostką natywnej (kółka) lub zmodyfikowanej PEG (kwadraty) zrekombinowanej urykazy PBC (preparatyka opisana w Przykład 3). W określonym czasie pobierano krew od grupy trzech myszy dla pomiaru w surowicy aktywności urykazy. PEG-ylowana urykaza (opisana w Przykładzie 3) wykazywała półokres krążenia około 48 godzin versus < niż 2 godziny dla niezmodyfikowanego enzymu (Figura 2).
P r z y k ł a d 5
Skuteczność PEG-ylowanej urykazy według wynalazku
Na Figurze 3 przedstawiono zależność aktywności urykazy w surowicy od stężenia kwasu moczowego w surowicy i moczu. W doświadczeniu tym homozygotyczne myszy pozbawione urykazy w wyniku nokautu genowego (Wu i wsp., 1994) otrzymały dwie injekcje, w godzinach 0 i 72, z 0,4 lU zrekombinowanej PBC urykazy, która była PEG-ylowana. Myszy pozbawione urykazy w wyniku nokautu genowego były użyte w doświadczeniu, ponieważ w odróżnieniu od normalnych myszy, które mają urykazę, myszy z nokautem genowym, podobnie jak ludzie, mają we krwi i płynach ustrojowych wysoki poziom kwasu moczowego i wydalają dużo kwasu moczowego w moczu. Te wysokie poziomy kwasu moczowego powodują poważne uszkodzenia nerek u tych myszy, które zazwyczaj mają śmiertelny skutek (Wu i wsp., 1994).
Doświadczenie przedstawione na Figurze 3 pokazuje, że dootrzewnowe iniekcje z PEGylowanego preparatu zrekombinowanej PBC urykazy powodują wzrost aktywności urykazy w surowicy, której towarzyszy znaczące zmniejszenie stężenia kwasu moczowego w surowicy i moczu u myszy pozbawionych aktywnego genu dla urykazy.
P r z y k ł a d 6
Nieimmunogenność kompleksu konstrukt-nośnik
PEG-ylowana PBC urykaza była wielokrotnie wstrzyknięta homozygotycznym myszom pozbawionym urykazy bez indukowania jej przyspieszonego usuwania, co jest zgodne z brakiem znaczącej immunogenności. Potwierdzono to testem ELISA. Na Figurze 4 przedstawiono zachowywanie poziomu krążącej aktywności urykazy (mierzonej w surowicy) po kolejnych iniekcjach. Modyfikowana PEG PBC urykaza była podawana w iniekcjach dootrzewnowych z 6-10- dniowymi przerwami. Aktywność urykazy w surowicy określano 24 godziny po iniekcji.
P r z y k ł a d 7
Kowalencyjne wiązanie do wprowadzonej przez mutację lizyny
PEG-ylowana oczyszczona, zrekombinowana PBC urykaza powinna doprowadzić do przyłączenia PEG do nowej lizyny (reszta 291). W doświadczeniu tym preparat PBC urykazy może być zmodyfikowany przez PEG-ylację. Sposobami znanymi w dziedzinie można określić, czy peptyd zawierający nową lizynę (reszta 291) został zmodyfikowany przez PEG-ylację.
PL 207 369 B1
Literatura
Abuchowski A, Kazo GM, Verhoest CR, Jr., van Es T, Kafkewitz D, Nucci ML, Viau AT i wsp., (1984) Cancer therapy with modified enzymes. I. Antitumor properties of polyethylene-glycolasparaginase conjugates. Cancer Biochem Biophys 7:175-186
Abuchowski A, McCoy JR, Palczuk NC, van Es T, Davis FF (I 977a) Effect of attachment of polyethylene-glycol on immunogenicity and circulating life of bovine liver catalase. J Biol Chem 252:3582-3586
Abuchowski A, van Es T, Palczuk NC, Davis FF (1977b) Alteration of immunological properties of bovine serum albumin by covalent attachment of polyethylene glycol J Biol Chem 252:3578-3581
Ausubel FM (1998) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &- Sons
Ahn KJ, Kim YS, Lee HC, Park K, Huh KB (1992) Cyclosporine-induced hyperuricemia after renal transplant: Clinical characteristics and mechanisms. Transplantation Proceedings 24:1391-1392
Arellano F, Sacristan JA (1993) Allopurinol hypersensitivity syndrome: A review. Ann Pharmacother 27:337-343
Becker MA (1988) Clinical aspects of monosodium urate monohydrate crystal deposition disease (gout). Rheumatic Disease Clinics of North America 14:377-394
Becker MA, Roessler BJ (1995) Hyperuricemia and gout. In: Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D (wyd.) The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, 7 e wyd. McGraw-Hill, Nowy Jork, str. 1655-1677
Brogard JM, Coumaros D, Frankhauser J, Stahi A, Stahl J (1972) Enzymatic uricolysis: A study of the effect of a fungal urate-oxydase. Eur J Clin Biol Res 17:890-895
Brogard IK, Stahl A, Stahl J (1978) Enzymatic uricolysis and its use in therapy. In: Kelley WN, Arnold WJ, Weiner IM (wyd.) Uric Acid, Springer Veriag, Nowy Jork, str. 515-524
Chaffee S, Mary A, Stiehm ER, Girauh D, Fischer A, Hershfield MS (1992) IgG antibody response to polyethylene-glycol-modified adenosine deaninase (PEG-ADA) in patients with adenosine deaminase deficiency. J Clin Invest 89:1643-1651
Chen RBL, Abuchowski A, van Es T, Paiczuk NC, Davis FF (1981) Properties of two urate oxidases modified by the covalent attachment of poly(ethylene glycol). Biochim Biophys Acta 660:293-298
Chua CC, Greenberg ML, Viau AT, Nucci M, Brenckman WD, Jr., Hershfiwld MS (1988) Use of polyethylene-glycol-modified uricase (PEG-uricase), to treat hyperuricemia in a patient with nonHodgkin lymphoma. Ann Int Med 109:114-117
Cohen LF, Balow JE, Magrath IT, Poplack DG, Ziegler JL (1980) Acute tumor lysis syndrome: A review of 37 patients with Burkitt's lymphoma. Am J Med 64:468-491
Conley TG, Priest DG (1979) Purification of uricase from mammalian tissue. Preparative Biochemistry 9:197-203
Davis FF, Kazo GM, Nucci ML, Abuchowski A (1991) Reduction of immunogenicity and extension of circulating life of peptides and proteins. In: Lee VHL (wyd.) Peptide and Protein Drug Delivery, Marcel Dekker, Nowy Jork, str. 831-864
Davis S, Abuchowski A, Park YK, Davis FF (1981a) Alteration of the circulating life and antigenic properties of bovine adenosine deaminase in mice by attachment of polyethylene glycol. Clin Exp Immunol 46:649-652
Davis S, Park YK, Abuchowski A, Davis FF (1981b) Hypouricaemic effect of polyethylene glycol modified urate oxidase. Lancet 1:281-283
Delaney V, Sumrani N, Daskalakis P, Hong JH, Sommer BG (1992) Hyperuricemia and gout in renal allograft recipients. Transplantarion Proceedings 24:1773-1774
Donadio D, Errera J, Navarro M, Izarn P (1981), Anaphylaxis-like manifestations after intravenous injection of urate oxidase in an asthmatic child with acute leukemia (letter). Nouv Presse Med 10:711-712
Erlich HA (1989) PCR Technology. Principles and applications for DNA amplification Stockton Press, Nowy Jork
Escudier B. Leclercq B, Tandonner F, Nitenberg G (1984) Hyperuricemia resistant to urate oxidase. Efficacy of high doses (letter). Presse Med 13: 1340
Fam AG (1990) Strategies and controversies in the treatment of gout and hyperuricaemia. Balliere's Clinical Rheumatology 4:177-192
George T, Mandell BF (1995) Gout in the transplant patient. J Clin Rheumatol 1:328-334
PL 207 369 B1
Gold GL, Fritz BD (1957) Hyperuricemia associated with the treatment of leukemia. Ann Int Med
47:428-434
Greenberg ML, Hershfield MS (1989) A radiochemical-high-performance liquid chromatographic assay for urate oxidase in human plasma. Anal Blochem 176:290-293
Harris JM, Zalipsky S (wyd.) (1997) Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications ACS, Waszyngton DC
Hershfield M, S. (1997) Biochemistry and immunology of poly(ethylene glycol)modified adenosine deaminase (PEG-ADA). w: Harris JM, Zalipsky S (wyd.) Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications, ACS, Waszyngton, DC, str. 145-154
Hershfield MS (1995) PEG-ADA replacement therapy for adenosine deaminase deficiency: An update after S.5 years. Clin Immunol Immunopathol 76:S228-S232
Hershfield MS (1996) Gout and uric acid metabolism. w: Bennett, JC, Plum F (wyd.) Cecil Textbook of Medicine, XX wyd. WB Saunders, Nowy Jork, str. 1508-1515
Hershfield MS, Buckley RH, Greenberg ML, Melton AL, Schiff R, Hatem C, Kurtzberg J i wsp. (1987) Treatment of adenosine deaminase deficiency with polyethylene-glycol-modified adenosine deaminase. N Engl J Med 316: 589-596
Hershfield MS, Chaffee S, Koro-Johnson L. Mary A, Smith AA, Short SA (1991)
Use of site-directed mutagenesis to enhance the epitope shielding effect of covalent modification of proteins with polyethylene glicol. Proc Natl Acad Sci USA 88:7185-7189
Hershfield MS, Mitchell BS (1995) Immunodeficiency diseases caused by adenosine deaminase deficiency and purine nucleoside phosphorylase deficiency. w: Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D (wyd.) The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, 7 me wyd. McGraw-Hill, Nowy Jork, str. 1725-1768
Hershfield MS, Seegmiller JE (1976) Gout and the regulation of purine biosynthesis. w: Quagliariello E (wyd.) Horizons in Biochemistry and Biophysics, Addison-Wesley, Reading, MA, str. 134-162
Jones DP, Stapleton FB, Kalwinsky D, McKay CP, Kellie SJ, Pui CH (1990) Renal dysfunction and hyperuricemia at presentation and relapse of acute lymphoblastic leukemia. Med Pediatr Oncol
18:283-286
Kelley WN, Fox IH Pallela TD (1989) Gout and related disorders of purine metabolism. w: Kelley WN, Harris ED, Ruddy S, Sledge CG (wyd.) Textbook of Rheumatology, 3cie wyd. WB Saunders,
Filadelfia, str. 1395-1448
Kissel P, Lamarche M, Royer R (1968) Modification of uricaemia and the excretion of uric acid nitrogen by an enzvme of fungal origin. Nature 217:72-74
Kissel P, Schmitt J, Streiff F, Makuary G, Schmidt C, Toussain P (1972) L'urate oxvdase:son interct dans la prevention des hyperuricemies theerapeutiques en hematologie.
Ann Med Nancy 111:519-535
Lee CC, Wu, X, Gibbs RA, Cook RG, Muzny DM, Caskey CT (1988) Generation of cDNA directed by amino acid sequence: Cloning of urate oxidase. Science 239:1288-1291
Legoux R. Delpech B, Dumont X, Guillemot JC, Ramond P, Shire D, Caput i wsp., (1992) Cloning and expression in Escherichia coli of the gene encoding Aspergillus flavus urate oxidase. J Biol
Chem 267:8565-8570
London M, Hudson PM (1957) Uricolytic activity of purified uricase in two human beings. Science 125:937-938
Masera G, Jankovic M, Zurlo MG, Locasciulli A, Rossi MR, Uderzo C, Recchia M (1982) Urateoxidase prophylaxis of uric acid-induced renal damage in childhood leukemia. J Pediatr 100: 152-155
Montagnac R, Schillinger F (1990) Anaphylactic complication tied to intravenous injection of urate oxidase. Nephrologie 11:259
Mourad G, Cristol JP, Chong G, Andary M, Mion C (1984) Role of precipitating anti-urate oxidase antibodies in urate oxidase-resistant hyperuricemia (letter) Presse Med 13:2585
Potaux L, Aparicio M, Maurel C, Ruedas ME, Martin-Dupont CL (1975) Uricolytic therapy. Value of urate oxidase in the treatment of hyperuricemias. Nouv Presse Med 4:1109-1112
Priest DG, Pitts OM (1972) Reaction intermediate effects on the spectrophotometric uricase assay. Analytical Biochemistry 50: 195-205
Pui C-H, Relling MV, Lascombes F, Harrison PL, Struxiano A. Mondesir J-M, Riberio RC i wsp. (1997) Urate oxidase in prevention and treatment of hyperuricemia associated with lymphoid malignancies. Leukemia 11: 1813-1816
PL 207 369 B1
Reddy PG, Nemali MR, Reddy MK, Reddy MN, Yuan PM, Yuen S, Laffler TG i wsp., (1988) Isolation and sequence determination of a cDNA clone for rat peroxisomal urate oxidase: Liver-specific expression in the rat. Proc Natl Acad Sci USA 85:9081-9085
Rosenthal AK, Ryan LM (1995) Treatment of refractory crystal-associated arthritis. Rheum Dis Clin North Amer 21:151-161
Roubenoff R (1990) Gout and hyperuricemia. Rheumatic Disease Clinics of North America 16:539-550
Sadler JR, Miwa J, Maas P, Smith T (1974) growth of high density bacterial cultures; simple device. Laboratory Practice 23:633-643
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular cloning. A laboratory manual 2-ie wyd. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Sprina Harbor, NY, Pages
Sandberg AA, Cartwriaht GB, Wintrobe MM (1956) Studies on leukemia. 1. Uric acid excretion. Blood 11:154-166
Savoca KV, Davis FF, Paiczuk NC (1984) Induction of tolerance in mice by uricase and monomethoxypolyethylene glycol-modified uricase. Int Arch Allergy Appl Immunol 75:58-67
Sibony G, North ML, Bergerat JP, Lang JM, Oberling F (1984) Hyperuricemia resistant to urate oxidasc. Role of anti-serum urate oxidase precipitating antibodies (letter). Presse Med 13:443
Singer JZ, Wallace SL (1986) The allopurinol hypersensitivity syndrome. Unnecessary morbidity and mortality. Arthritis Rheum 29:82-87
Tsuji J, Hirose K, Kasahara E, Naitoh M, Yamamoto I (1985) Studies on the antigenicity of the polyethylene glycol-modified uricase. Int J Immunopharmacol 7:725-730
Venkataseshan VS, Feingold R, Dikman S, Churc, J (1990) Acute hyperuricemic nephropathy and renal failure after transplantation. Nephron 56:317-321
Veronese FM, Caliceti P, Schiavon O (1997) New synthetic polymers for enzyme and liposome modification. w: Harris JM, Zalipsky S (wyd) Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications, ACS, Waszyngton, DC, str. 182-192
West C, Carpenter BJ, Hakala TR (1987) The incidence of cout in renal transplant recipients. Am J Kidney Dis 10:369-371
Wu X, Lee CC, Muzny DM, Caskey CT (1989) Urate oxidase: Primary structure and evolutionary implications. Proc. Ntl. Acad. Sci. USA 86:9412-9416.
Wu X, Lee CC, Muzny DM, Caskey CT (1992) Two independent mutational events in the loss of urate oxidase. J. Mol Evol 34:78-84
Wu X, Wakamiya M, Vaishnav S, Geske R, Montgomery CM, Jr., Jones P, Bradley A i wsp., (1994) Hyperuricemia and urate nephropathy in urate oxidase-deficient mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:742-746
Zittoun R, Dauchy F, Teillaud C, Barthelemy M, Bouchad (1976) Le traitement des hyperuricemies en hematologie par l'urate-oxydase et I'allopurinol. Ann Med Interne 127:479-482
Wszystkie cytowane powyżej dokumenty są włączone tu w całości przez odniesienie literaturowe.
PL 207 369 B1
Lista sekwencji
<110> HERSHFIELD, MICHAEL S.
KELLY, SUSAN J.
<120> Oksydaza moczanowa
<130> 1579-379
<140> PCT/US99/17678
<141> 1999-08-05
<160>13
<170> Patentln Wer. 2.0
<210> 1
<211> 915
<212> DNA
<213> Sekwencja sztuczna
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(915)
<220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: CHIMERA PBC
<400> 1
atg gct cat tac cgt aat gac tac aaa aag aat gat gag gta gag ttt 48
Met Ala His Tyr Arg Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe
1 5 10 15
gtc ega act ggc tat ggg aag gat atg ata aaa gtt ctc cat att cag 96
Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His Ile Gin
20 25 30
ega gat gga aaa tat cac agc att aaa gag gtg gca act tca gtg caa 144
Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gin
35 40 45
ctg act ttg agc tcc aaa aaa gat tac ctg cat gga gac aat tca gat 192
Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp
50 55 60
gtc atc cct aca gac acc atc aag aac aca gtt aat gtc ctg gcg aag 240
Val Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys
65 70 75 80
ttc aaa ggc atc aaa agc ata gaa act ttt gct gtg act atc tgt gag 288
Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu
85 90 95
cat ttc ctt tet tcc ttc aag cat gtc atc aga gct caa gtc tat gtg 336
His Phe Leu Ser Ser Phe Lys His Val Ile Arg Ala Gin Val Tyr Val
100 105 110
gaa gaa gtt cct tgg aag cgt ttt gaa aag aat gga gtt aag cat gtc 384
Glu Glu Val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val
115 120 125
cat gca ttt att tat act cct act gga acg cac ttc tgt gag gtt gaa 432
His Ala Phe Ile Tyr Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu
130 135 140
cag ata agg aat gga cct cca gtc att cat tet gga atc aaa gac eta 480
PL 207 369 B1
Gln 145 Ile Arg Asn Gly Pro 150 Pro Val Ile His Ser 155 Gly Ile Lys Asp Leu 160
aaa gtc ttg aaa aca acc cag tet ggc ttt gaa gga ttc atc aag gac 528
Lys Val Leu Lys Thr 165 Thr Gln Ser Gly Phe 170 Glu Gly Phe Ile Lys 175 Asp
cag ttc acc acc ctc cct gag gtg aag gac cgg tgc ttt gee acc caa 576
Gln Phe Thr Thr 180 Leu Pro Glu val Lys 185 Asp Arg Cys Phe Ala 190 Thr Gln
gtg tac tgc aaa tgg ege tac cac cag ggc aga gat gtg gac ttt gag 624
Val Tyr Cys 195 Lys Trp Arg Tyr His 200 Gln Gly Arg Asp Val 205 Asp Phe Glu
gee acc tgg gac act gtt agg age att gtc ctg cag aaa ttt get ggg 672
Ala Thr 210 Trp Asp Thr Val Arg 215 Ser Ile Val Leu Gln 220 Lys Phe Ala Gly
ccc tat gac aaa ggc gag tac tea ccc tet gtg cag aag acc ctc tat 720
Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr 225 230 235 240 gat atc cag gtg ctc tcc ctg age ega gtt cct gag ata gaa gat atg 7S8
Asp Ile Gln Val Leu Ser Leu Ser Arg Val Pro Glu Ile Glu Asp Met
245 250 255 gaa atc ago ctg cca aac att cac tac ttc aat ata gac atg tcc aaa 816
Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys
260 265 270
atg Met ggt Gly ctg Leu 275 atc Ile aac Asn aag Lys gaa Glu gag Glu 280 gtc Val ttg Leu ctg Leu cca Pro tta Leu 285 gac Asp aat Asn cca Pro 864
tat gga aaa att act ggt aca gtc aag agg aag ttg tet tea aga ctg 912
Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu
290 295 300
tga 915
<210> 2
<211> 304
<212> PRT
<213> Sekwencja sztuczna
<220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: CHIMERA PBC
<400> 2
Met Ala His Tyr Arg Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe
10 15
Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His Ile Gln 20 25 30
Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gln 35 40 45
Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp 50 55 60
Val Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys 65 70 75 80
PL 207 369 B1
Phe Lys Gly Ile Lys 85 Ser Ile Glu Thr Phe 90 Ala Val Thr Ile Cys 95 Glu
His Phe Leu Ser 100 Ser Phe Lys His Val 105 Ile Arg Ala Gin Val 110 Tyr Val
Glu Glu Val 115 Pro Trp Lys Arg Phe 120 Glu Lys Asn Gly Val 125 Lys His Val
His Ala 130 Phe Ile Tyr Thr Pro 135 Thr Gly Thr His Phe 14 0 Cys Glu Val Glu
Gin 145 Ile Arg Asn Gly Pro 150 Pro Val Ile His Ser 155 Gly Ile Lys Asp Leu 160
Lys Val Leu Lys Thr 165 Thr Gin Ser Gly Phe 170 Glu Gly Phe Ile Lys 175 Asp
Gin Phe Thr Thr 180 Leu Pro Glu Val Lys 185 Asp Arg Cys Phe Ala 190 Thr Gin
Val Tyr Cys 195 Lys Trp Arg Tyr His 200 Gin Gly Arg Asp Val 205 Asp Phe Glu
Ala Thr 210 Trp Asp Thr Val Arg 215 Ser Ile Val Leu Gin 220 Lys Phe Ala Gly
Pro 225 Tyr Asp Lys Gly Glu 230 Tyr Ser Pro Ser Val 235 Gin Lys Thr Leu Tyr 240
Asp Ile Gin Val Leu 245 Ser Leu Ser Arg Val 250 Pro Glu Ile Glu Asp 255 Met
Glu Ile Ser Leu 260 Pro Asn Ile His Tyr 265 Phe Asn Ile Asp Met 270 Ser Lys
Met Gly Leu 275 Ile Asn Lys Glu Glu 280 Val Leu Leu Pro Leu 285 Asp Asn Pro
Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu
290 295 300 <210> 3 <211> 915 <212> DNA
<213> Sekwencja sztuczna
<220> <221> CDS <222> (1).. (915)
<220>
<223> Opis i sekwencj i . sztucznej: chimera pks
<400> 3 atg gct cat tac cgt aat gac tac aaa aag aat gat gag gta gag ttt
Met Ala His Tyr Arg Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe
1 5 10 15
gtc ega act ggc tat ggg aag gat atg ata aaa gtt ctc cat att cag
Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His Ile Gin
20 25 30
ega gat gga aaa tat cac age att aaa gag gtg gca act tea gtg caa
PL 207 369 B1
Arg Asp Gly 35 Lys Tyr His Ser Ile 40 Lys Glu Val Ala Thr 45 Ser Val Gln
ctg act ttg agc tcc aaa aaa gat tac ctg cat gga gac aat tea gat 192
Leu Thr 50 Leu Ser Ser Lys Lys 55 Asp Tyr Leu His Gly 60 Asp Asn Ser Asp
gtc atc cct aca gac acc atc aag aac aca gtt aat gtc ctg gcg aag 240
Val 65 Ile Pro Thr Asp Thr 70 Ile Lys Asn Thr Val 75 Asn Val Leu Ala Lys 80
ttc aaa ggc atc aaa agc ata gaa act ttt gct gtg act atc tgt gag 288
Phe Lys Gly Ile Lys 85 Ser Ile Glu Thr Phe 90 Ala Val Thr Ile Cys 95 Glu
cat ttc ctt tct tcc ttc aag cat gtc atc aga gct caa gtc tat gtg 336
His Phe Leu Ser 100 Ser Phe Lys His Val 105 Ile Arg Ala Gln Val 110 Tyr Val
gaa gaa gtt cct tgg aag cgt ttt gaa aag aat gga gtt aag cat gtc 384
Glu Glu Val 115 Pro Trp Lys Arg Phe 120 Glu Lys Asn Gly Val 125 Lys His Val
cat gca ttt att tat act cct act gga acg cac ttc tgt gag gtt gaa 432
His Ala 130 Phe Ile Tyr Thr Pro 135 Thr Gly Thr His Phe 140 Cys Glu Val Glu
cag ata agg aat gga cct cca gtc att cat tct gga atc aaa gac eta 480
Gln 145 Ile Arg Asn Gly Pro 150 Pro Val Ile His Ser 155 Gly Ile Lys Asp Leu 160
aaa gtc ttg aaa aca acc cag tct ggc ttt gaa gga ttc atc aag gac 528
Lys Val Leu Lys Thr 165 Thr Gln Ser Gly Phe 170 Glu Gly Phe Ile Lys 175 Asp
cag ttc acc acc ctc cct gag gtg aag gac cgg tgc ttt gcc acc caa 576
Gln Phe Thr Thr 1B0 Leu Pro Glu Val Lys 185 Asp Arg Cys Phe Ala 190 Thr Gln
gtg tac tgc aaa tgg cgc tac cac cag ggc aga gat gtg gac ttt gag 624
Val Tyr Cys 195 Lys Trp Arg Tyr His 200 Gln Gly Arg Asp Val 205 Asp Phe Glu
gcc acc tgg gac act gtt agg agc att gtc ctg cag aaa ttt gct ggg 672
Ala Thr 210 Trp Asp Thr Val Arg 215 Ser Ile Val Leu Gln 220 Lys Phe Ala Gly
ccc tat gac aaa ggc gag tac tcg ccc tct gtc cag aag aca ctc tat 720
Pro 225 Tyr Asp Lys Gly Glu 230 Tyr Ser Pro Ser Val 235 Gln Lys Thr Leu Tyr 240
gac atc cag gtg ctc acc ctg ggc cag gtt cct gag ata gaa gat atg 768
Asp Ile Gln Val Leu 245 Thr Leu Gly Gln Val 250 Pro Glu Ile Glu Asp 255 Met
gaa atc agc ctg cca aat att cac tac tta aac ata gac atg tcc aaa 816
Glu Ile Ser Leu 260 Pro Asn Ile His Tyr 265 Leu Asn Ile Asp Met 270 Ser Lys
atg gga ctg atc aac aag gaa gag gtc ttg eta cct tta gac aat cca 864
Met Gly Leu 275 Ile Asn Lys Glu Glu 280 Val Leu Leu Pro Leu 285 Asp Asn Pro
tat gga aaa att act ggt aca gtc aag agg aag ttg tct tea aga ctg 912
Tyr Gly 290 Lys Ile Thr Gly Thr 295 Val Lys Arg Lys Leu 300 Ser Ser Arg Leu
PL 207 369 B1 tga g15 <210> 4 <211> 304 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencj i sztucznej: chimera pks
<400> 4
Met Ala His Tyr Arg Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe
1 5 10 15
Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His Ile Gin
20 25 30
Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gin
35 40 45
Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp
50 55 60
Val Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys
65 70 75 80
Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu
85 90 95
His Phe Leu Ser Ser Phe Lys His Val Ile Arg Ala Gin Val Tyr Val
100 105 110
Glu Glu Val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val
115 120 125
His Ala Phe Ile Tyr Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu
130 135 140
Gin Ile Arg Asn Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu
145 150 155 160
Lys Val Leu Lys Thr Thr Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp
165 170 175
Gin Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gin
180 185 190
Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gin Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu
195 200 205
Ala Thr Trp Asp Thr Val Arg Ser Ile Val Leu Gin Lys Phe Ala Gly
210 215 220
Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gin Lys Thr Leu Tyr
225 230 235 240
Asp Ile Gin Val Leu Thr Leu Gly Gin Val Pro Glu Ile Glu Asp Met
245 250 255
Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Leu Asn Ile Asp Met Ser Lys
260 265 270
Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro
PL 207 369 B1
275 280 285
Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu 290 295 300 <210> 5 <211> 304 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej:pawian D3H <400> 5
Met Ala 1 His Tyr His 5 Asn Asn Tyr Lys Lys 10 Asn Asp Glu Leu Glu 15 Phe
Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Val Lys Val Leu His Ile Gin
20 25 30
Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gin
35 40 45
Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp
50 55 60
Ile Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val His Val Leu Ala Lys
65 70 75 80
Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Ala Phe Gly Val Asn Ile Cys Glu
85 90 95
Tyr Phe Leu Ser Ser Phe Asn His Val Ile Arg Ala Gin Val Tyr Val
100 105 110
Glu Glu Ile Pro Trp Lys Arg Leu Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val
115 120 125
His Ala Phe Ile His Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu
130 135 140
Gin Leu Arg Ser Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu
145 150 155 160
Lys Val Leu Lys Thr Thr Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp
165 170 175
Gin Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gin
180 185 190
Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gin Cys Arg Asp Val Asp Phe Glu
195 200 205
Ala Thr Trp Gly Thr Ile Arg Asp Leu Val Leu Glu Lys Phe Ala Gly
210 215 220
Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gin Lys Thr Leu Tyr
225 230 235 240
Asp Ile Gin Val Leu Ser Leu Ser Arg Val Pro Glu Ile Glu Asp Met
245 250 255
Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys
260 265 270
PL 207 369 B1
Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro
275 280 285
Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu
290 295 300
<210> 6 <211> 304 <212> PRT <213> pawian
<400> 6
Met Ala Asp Tyr His Asn Asn Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Leu Glu Phe
1 5 10 15
Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Val Lys Val Leu His Ile Gin
20 25 30
Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gin
35 40 45
Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp
50 55 60
Ile Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val His Val Leu Ala Lys
65 70 75 80
Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Ala Phe Gly Val Asn Ile Cys Glu
85 90 95
Tyr Phe Leu Ser Ser Phe Asn His Val Ile Arg Ala Gin Val Tyr Val
100 105 110
Glu Glu Ile Pro Trp Lys Arg Leu Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val
115 12 0 125
His Ala Phe Ile His Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu
130 135 140
Gin Leu Arg Ser Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu
145 150 155 160
Lys Val Leu Lys Thr Thr Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp
165 170 175
Gin Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gin
180 185 190
Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gin Cys Arg Asp Val Asp Phe Glu
195 200 205
Ala Thr Trp Gly Thr Ile Arg Asp Leu Val Leu Glu Lys Phe Ala Gly
210 215 220
Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gin Lys Thr Leu Tyr
225 230 235 240
Asp Ile Gin Val Leu Ser Leu Ser Arg Val Pro Glu Ile Glu Asp Met
245 250 255
Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys
260 265 270
PL 207 369 B1
Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro 275 280 285
Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu 290 295 300 <210> 7 <211> 304 <212> PRT <213> Świnia <400> 7
Met Ala His Tyr Arg Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe 15 10 15
Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His Ile Gin 20 25 30
Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gin 35 40 45
Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp 50 55 60
Val Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys 65 70 75 80
Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu 85 90 95
His Phe Leu Ser Ser Phe Lys His Val Ile Arg Ala Gin Val Tyr Val 100 105 110
Glu Glu Val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val 115 120 125
His Ala Phe Ile Tyr Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu 130 135 140
Gin Ile Arg Asn Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu
145 150 155 160
Lys Val Leu Lys Thr Thr Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp
165 170 175
Gin Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gin 180 185 190
Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gin Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu 195 200 205
Ala Thr Trp Asp Thr Val Arg Ser Ile Val Leu Gin Lys Phe Ala Gly 210 215 220
Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gin Lys Thr Leu Tyr
225 230 235 240
Asp Ile Gin Val Leu Thr Leu Gly Gin Val Pro Glu Ile Glu Asp Met
245 250 255
Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Leu Asn Ile Asp Met Ser Lys
PL 207 369 B1
2S0 265 270
Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro
275 280 285
Tyr Gly Arg Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Thr Ser Arg Leu
290 295 300 <210> 8 <211> 298 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej:PBC skrócona na końcu aminowym <400> 8
Asp 1 Tyr Lys Lys Asn 5 Asp Glu Val Glu Phe 10 Val Arg Thr Gly Tyr 15 Gly
Lys Asp Met Ile 20 Lys Val Leu His Ile 25 Gln Arg Asp Gly Lys 30 Tyr His
Ser Ile Lys 35 Glu Val Ala Thr Ser 40 Val Gln Leu Thr Leu 45 Ser Ser Lys
Lys Asp 50 Tyr Leu His Gly Asp 55 Asn Ser Asp Val Ile 60 Pro Thr Asp Thr
Ile 65 Lys Asn Thr Val Asn 70 Val Leu Ala Lys Phe 75 Lys Gly Ile Lys Ser 80
Ile Glu Thr Phe Ala 85 Val Thr Ile Cys Glu 90 His Phe Leu Ser Ser 95 Phe
Lys His Val Ile 100 Arg Ala Gln Val Tyr 105 Val Glu Glu Val Pro 110 Trp Lys
Arg Phe Glu 115 Lys Asn Gly Val Lys 120 His Val His Ala Phe 125 Ile Tyr Thr
Pro Thr 130 Gly Thr His Phe Cys 135 Glu Val Glu Gln Ile 140 Arg Asn Gly Pro
Pro 145 val Ile His Ser Gly 150 Ile Lys Asp Leu Lys 155 val Leu Lys Thr Thr 160
Gln Ser Gly Phe Glu 165 Gly Phe Ile Lys Asp 170 Gln Phe Thr Thr Leu 175 Pro
Glu Val Lys Asp 180 Arg Cys Phe Ala Thr 185 Gln Val Tyr Cys Lys 190 Trp Arg
Tyr His Gln 195 Gly Arg Asp Val Asp 200 Phe Glu Ala Thr Trp 205 Asp Thr Val
Arg Ser 210 Ile Val Leu Gln Lys 215 Phe Ala Gly Pro Tyr 220 Asp Lys Gly Glu
Tyr 225 Ser Pro Ser Val Gln 230 Lys Thr Leu Tyr Asp 235 Ile Gln Val Leu Ser 240
PL 207 369 B1
Leu Ser Arg Val Pro 245 Glu Ile Glu Asp Met 250 Glu Ile Ser Leu Pro 255 Asn
Ile His Tyr Phe 260 Asn Ile Asp Met Ser 265 Lys Met Gly Leu Ile 270 Asn Lys
Glu Glu Val 275 Leu Leu Pro Leu Asp 280 Asn Pro Tyr Gly Lys 285 Ile Thr Gly
Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu
290 295 <210> 9 <211> 301 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej:PBC skrócona na końcu karboksylowym <400> 9
Met 1 Ala His Tyr Arg 5 Asn Asp Tyr Lys Lys 10 Asn Asp Glu Val Glu 15 Phe
Val Arg Thr Gly 20 Tyr Gly Lys Asp Met 25 Ile Lys Val Leu His 30 Ile Gin
Arg Asp Gly 35 Lys Tyr His Ser Ile 40 Lys Glu Val Ala Thr 45 Ser Val Gin
Leu Thr 50 Leu Ser Ser Lys Lys 55 Asp Tyr Leu His Gly 60 Asp Asn Ser Asp
Val 65 Ile Pro Thr Asp Thr 70 Ile Lys Asn Thr Val 75 Asn Val Leu Ala Lys 80
Phe Lys Gly Ile Lys 85 Ser Ile Glu Thr Phe 90 Ala Val Thr Ile Cys 95 Glu
His Phe Leu Ser 100 Ser Phe Lys His Val 105 Ile Arg Ala Gin Val 110 Tyr Val
Glu Glu Val 115 Pro Trp Lys Arg Phe 120 Glu Lys Asn Gly Val 125 Lys His Val
His Ala 130 Phe Ile Tyr Thr Pro 135 Thr Gly Thr His Phe 14 0 Cys Glu Val Glu
Gin 14 5 Ile Arg Asn Gly Pro 150 Pro Val Ile His Ser 155 Gly Ile Lys Asp Leu 160
Lys Val Leu Lys Thr 165 Thr Gin Ser Gly Phe 170 Glu Gly Phe Ile Lys 175 Asp
Gin Phe Thr Thr 180 Leu Pro Glu Val Lys 185 Asp Arg Cys Phe Ala 190 Thr Gin
Val Tyr Cys 195 Lys Trp Arg Tyr His 200 Gin Gly Arg Asp Val 205 Asp Phe Glu
Ala Thr Trp Asp Thr Val Arg Ser Ile Val Leu Gin Lys Phe Ala Gly
210 215 220
PL 207 369 B1
Pro 225 Tyr Asp Lys Gly Glu 230 Tyr Ser Pro Ser Val 235 Gin Lys Thr Leu Tyr 240
Asp Ile Gin Val Leu 245 Ser Leu Ser Arg Val 250 Pro Glu Ile Glu Asp 255 Met
Glu Ile Ser Leu 260 Pro Asn Ile His Tyir 265 Phe Asn Ile Asp Met 270 Ser Lys
Met Gly Leu 275 Ile Asn Lys Glu Glu 280 Val Leu Leu Pro Leu 285 Asp Asn Pro
Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser
290 295 300 <210> 10 <211> 298 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej:PKS skrócona na końcu aminowym
<400> 10 Asp Glu Val Glu Phe Val Arg Thr Gly Tyr Gly
Asp 1 Tyr Lys Lys Asn 5
10 15
Lys Asp Met Ile Lys 20 Val Leu His Ile 25 Gin Arg Asp Gly Lys 30 Tyr His
Ser Ile Lys 35 Glu Val Ala Thr Ser 40 Val Gin Leu Thr Leu Ser 45 Ser Lys
Lys Asp Tyr 50 Leu His Gly Asp 55 Asn Ser Asp Val Ile Pro Thr 60 Asp Thr
Ile 65 Lys Asn Thr Val Asn 70 Val Leu Ala Lys Phe Lys Gly Ile 75 Lys Ser 80
Ile Glu Thr Phe Ala 85 Val Thr Ile Cys Glu His Phe Leu Ser 90 Ser Phe 95
Lys His Val Ile Arg 100 Ala Gin Val Tyr 105 Val Glu Glu Val Pro 110 Trp Lys
Arg Phe Glu 115 Lys Asn Gly Val Lys 120 His Val His Ala Phe Ile 125 Tyr Thr
Pro Thr Gly 130 Thr His Phe Cys 135 Glu Val Glu Gin Ile Arg Asn 14 0 Gly Pro
Pro 14 5 val Ile His Ser Gly 150 Ile Lys Asp Leu Lys Val Leu Lys 155 Thr Thr 160
Gin Ser Gly Phe Glu 165 Gly Phe Ile Lys Asp Gin Phe Thr Thr 170 Leu Pro 175
Glu Val Lys Asp Arg 180 Cys Phe Ala Thr 185 Gin Val Tyr Cys Lys 190 Trp Arg
Tyr His Gin Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu Ala Thr Trp Asp Thr Val
195 200 205
PL 207 369 B1
Arg Ser Ile Val Leu Gin Lys Phe Ala Gly Pro Tyr Asp Lys Gly Glu 210 215 220
Tyr Ser Pro Ser Val Gin Lys Thr Leu Tyr Asp Ile Gin Val Leu Thr
225 230 235 240
Leu Gly Gin Val Pro Glu Ile Glu Asp Met Glu Ile Ser Leu Pro Asn
245 250 255
Ile His Tyr Leu Asn Ile Asp Met Ser Lys Met Gly Leu Ile Asn Lys 260 265 270
Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro Tyr Gly Lys Ile Thr Gly 275 280 285
Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu 290 295 c210> 11 <211> 301 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej:PKS skrócona na końcu karboksylowym <400> 11
Met Ala His Tyr Arg Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe 15 10 15
Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His Ile Gin 20 25 30
Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gin 35 40 45
Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp 50 55 60
Val Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys 65 70 75 80
Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu 85 90 95
His Phe Leu Ser Ser Phe Lys His Val Ile Arg Ala Gin Val Tyr Val 100 105 110
Glu Glu Val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val 115 120 125
His Ala Phe Ile Tyr Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu 130 135 140
Gin Ile Arg Asn Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu
145 150 155 160
Lys Val Leu Lys Thr Thr Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp
165 170 175
Gin Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gin 180 185 190
PL 207 369 B1
Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His 200 Gin Gly Arg Asp Val 205 Asp Phe Glu
195
Ala Thr Trp Asp Thr val Arg Ser Ile Val Leu Gin Lys Phe Ala Gly
210 215 220
Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gin Lys Thr Leu Tyr
225 230 235 240
Asp Ile Gin Val Leu Thr Leu Gly Gin Val Pro Glu Ile Glu Asp Met
245 250 255
Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Leu Asn Ile Asp Met Ser Lys
260 265 270
Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro
275 280 285
Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser
290 295 300
<210> 12 <211> 915 <212> DNA <213> ŚWINIA <400> 12 atggctcatt tatgggaagg aaagaggtgg gacaattcag ttcaaaggca tccttcaagc gaaaagaatg tgtgaggttg aaagtcttga ctccctgagg cagggcagag aaatttgctg gacatccagg ccaaatattc gtcttgctac acttcaaggc accgtaatga atatgataaa caacttcagt atgtcatccc tcaaaagcat atgtcatcag gagttaagca aacagataag aaacaaccca tgaaggaccg atgtggactt ggccctatga tgctcaccct actacttaaa ctttagacaa tgtga ctacaaaaag agttctccat gcaactgact tacagacacc agaaactttt agctcaagtc tgtccatgca gaatggacct gtctggcttt gtgctttgcc tgaggccacc caaaggcgag gggccaggtt catagacatg tccatatggc aatgatgagg attcagcgag ttgagctcca atcaagaaca gctgtgacta tatgtggaag tttatttata ccagtcattc gaaggattca acccaagtgt tgggacactg tactcgccct cctgagatag tccaaaatgg aggattactg tagagtttgt atggaaaata aaaaagatta cagttaatgt tctgtgagca aagttccttg ctcctactgg attctggaat tcaaggacca actgcaaatg ttaggagcat ctgtccagaa aagatatgga gactgatcaa gtacagtcaa ccgaactggc 60 tcacagcatt 120 cctgcatgga 190 cctggcgaag 240 tttcctttct 300 gaagcgtttt 360 aacgcacttc 420 caaagaccta 480 gttcaccacc 540 gcgctaccac 600 tgtcctgcag 660 gacactctat 720 aatcagcctg 780 caaggaagag 840 gaggaagctg 900
915 <210> 13 <211> 915 <212> DNA <213> PAWIAN <400> 13 atggccgact tatgggaagg aaagaggtgg gataattcag tttaagggaa tcttttaacc gaaaagaatg tgtgaagttg aaggtcttga ctccctgagg cagtgcaggg aaatttgctg gatatccagg accataacaa atatggtaaa caacttcagt atatcatccc tcaaaagcat atgtaatccg gagttaagca aacaactgag aaacaacaca tgaaggaccg atgtggactt ggccctatga tgctctccct ctataaaaag agttctccat gcaacttact tacagacacc agaagccttt agctcaagtc tgtccatgca aagtggaccc gtctggattt atgctttgcc cgaggctacc caaaggcgag gagccgagtt aatgatgaat attcagcgag ctgagttcca atcaagaaca ggtgtgaata tacgtggaag tttattcaca cccgtcattc gaaggtttca acccaagtgt tggggcacca tactcaccct cctgagatag tggagtttgt atggaaaata aaaaagatta cagttcatgt tttgtgagta aaatcccttg ctcccactgg attctggaat tcaaggacca actgcaagtg ttcgggacct ctgtgcagaa aagatatgga ccgaactggc 60 tcacagcatt 120 cctgcatgga 180 cttggcaaag 240 ttttctttct 300 gaagcgtctt 360 aacacacttc 420 caaagacctc 480 gttcaccacc 540 gcgctaccac 600 tgtcctggag 660 gaccctctat 720 aatcagcctg 780 ccaaacattc actacttcaa tatagacatg tccaaaatgg gtctgatcaa caaggaagag 840 gtcttgctgc cattagacaa tccatatgga aaaattactg gtacagtcaa gaggaagttg 900 tcttcaagac tgtga 915

Claims (19)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Zrekombinowane białko urykazy zawierające jedno lub więcej ssaczych białek urykazy, które zostało zmodyfikowane przez wprowadzenie od jednej do dziesięciu reszt lizynowych, przy czym modyfikująca reszta nie znajduje się pośród trzech C-końcowych aminokwasów.
  2. 2. Zrekombinowane białko urykazy według zastrz. 1, znamienne tym, że jest białkiem chimerowym zbudowanym z dwóch lub większej liczby ssaczych sekwencji aminokwasowych.
  3. 3. Zrekombinowane białko urykazy według zastrz. 2, znamienne tym, że chimerowe zrekombinowane białko urykazy zawiera 304 aminokwasy, pierwszą 225-aminokwasową N-końcową jego część stanowią aminokwasy 1-225 ze świńskiej urykazy, a pozostałe 79 aminokwasów w pozycjach 226-304 pochodzi z urykazy pawiana.
  4. 4. Zrekombinowane białko urykazy według zastrz. 2, znamienne tym, że chimerowe zrekombinowane białko urykazy zawiera 304 aminokwasy, pierwszą 288-aminokwasową N-końcową jego część stanowią aminokwasy 1-288 ze świńskiej urykazy, a pozostałe 16 aminokwasów w pozycjach 289-304 pochodzi z urykazy pawiana.
  5. 5. Zrekombinowane białko urykazy według zastrz. 1, znamienne tym, że ssacze białko urykazy zostało zmodyfikowane przez wprowadzenie jednej reszty lizyny.
  6. 6. Zrekombinowane białko urykazy według zastrz. 5, znamienne tym, że modyfikacja występuje w pozycji aminokwasowej 291 w Sekw. Id. Nr :7
  7. 7. Zrekombinowane białko urykazy, znamienne tym, że jest wybrane z grupy składającej się z Sek. Id. Nr: 2, 4, 8, 9, 10 i 11.
  8. 8. Wyizolowana i oczyszczona cząsteczka kwasu nukleinowego, znamienna tym, że koduje zrekombinowaną urykazę określoną w zastrz. 1.
  9. 9. Wyizolowana i oczyszczona cząsteczka kwasu nukleinowego, znamienna tym, że koduje zrekombinowaną urykazę określoną w zastrz. 3.
  10. 10. Wyizolowana i oczyszczona cząsteczka kwasu nukleinowego, znamienna tym, że koduje zrekombinowaną urykazę określoną w zastrz. 4.
  11. 11. Wyizolowana i oczyszczona cząsteczka kwasu nukleinowego, znamienna tym, że koduje zrekombinowaną urykazę określoną w zastrz. 7.
  12. 12. Wyizolowana i oczyszczona cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 11, znamienna tym, że ma sekwencję zasad Sek. Id. Nr: 1.
  13. 13. Wyizolowana i oczyszczona cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 11, znamienna tym, że ma sekwencję zasad Sek. Id. Nr: 3.
  14. 14. Wektor, znamienny tym, że niesie cząsteczkę kwasu nukleinowego określoną w zastrz. 8.
  15. 15. Wektor, znamienny tym, że niesie cząsteczkę kwasu nukleinowego określoną w zastrz. 11.
  16. 16. Komórka gospodarza wybrana z grupy składającej się z bakterii, drożdży, grzybów z filamentami, komórek roślinnych, komórek zwierzęcych i komórek owadzich, znamienna tym, że zawiera wektor określony w zastrz. 14.
  17. 17. Komórka gospodarza wybrana z grupy składającej się z bakterii, drożdży, grzybów z filamentami, komórek roślinnych, komórek zwierzęcych i komórek owadzich, znamienna tym, że zawiera wektor określony w zastrz. 15.
  18. 18. Sposób zwiększenia dostępności nieszkodliwych miejsc przyłączenia PEG do białka urykazy, znamienny tym, że obejmuje wprowadzenie przez mutację do białka urykazy z gatunków ssaczych od jednej do dziesięciu reszt lizynowych, przy czym modyfikująca reszta nie znajduje się pośród trzech C-końcowych aminokwasów.
  19. 19. Sposób zwiększenia dostępności nieszkodliwych miejsc przyłączenia PEG do białka urykazy, znamienny tym, że obejmuje wprowadzenie przez mutację do białka urykazy z gatunków ssaczych od jednej do dziesięciu reszt lizynowych w miejsce argininy, przy czym modyfikująca reszta nie znajduje się pośród trzech C-końcowych aminokwasów.
PL346222A 1998-08-06 1999-08-05 Zrekombinowane białko urykazy, wyizolowane i oczyszczone cząsteczki kwasu nukleinowego, wektory, komórki gospodarza, sposoby zwiększania dostępności nieszkodliwych miejsc przyłączenia PEG do białka urykazy PL207369B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US9548998P 1998-08-06 1998-08-06

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL346222A1 PL346222A1 (en) 2002-01-28
PL207369B1 true PL207369B1 (pl) 2010-12-31

Family

ID=22252247

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL346222A PL207369B1 (pl) 1998-08-06 1999-08-05 Zrekombinowane białko urykazy, wyizolowane i oczyszczone cząsteczki kwasu nukleinowego, wektory, komórki gospodarza, sposoby zwiększania dostępności nieszkodliwych miejsc przyłączenia PEG do białka urykazy

Country Status (23)

Country Link
US (1) US7056713B1 (pl)
EP (2) EP2277998B1 (pl)
JP (3) JP2002524053A (pl)
KR (1) KR100841634B1 (pl)
CN (2) CN101280293B (pl)
AT (1) ATE483797T1 (pl)
AU (1) AU766421B2 (pl)
BR (1) BRPI9913360B8 (pl)
CA (1) CA2337967C (pl)
CY (1) CY1111001T1 (pl)
CZ (1) CZ304223B6 (pl)
DE (1) DE69942834D1 (pl)
DK (1) DK1100880T3 (pl)
ES (1) ES2352451T3 (pl)
HK (3) HK1037214A1 (pl)
HU (1) HU229774B1 (pl)
IL (3) IL141221A0 (pl)
NZ (1) NZ509633A (pl)
PL (1) PL207369B1 (pl)
PT (1) PT1100880E (pl)
RU (1) RU2290439C2 (pl)
WO (1) WO2000008196A2 (pl)
ZA (1) ZA200100974B (pl)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69943205D1 (de) 1998-08-06 2011-03-31 Mountain View Pharmaceuticals Peg-uricase Konjugate und Verwendung davon
BRPI9912974B8 (pt) * 1998-08-06 2021-05-25 Univ Duke conjugados de peg-urato oxidase e seu uso
HU229774B1 (en) * 1998-08-06 2014-07-28 Univ Durham Urate oxidase
US6783965B1 (en) 2000-02-10 2004-08-31 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Aggregate-free urate oxidase for preparation of non-immunogenic polymer conjugates
US20060188971A1 (en) * 1998-08-06 2006-08-24 Duke University Urate oxidase
CN100371439C (zh) * 2003-04-07 2008-02-27 北京双鹭药业股份有限公司 一种重组假丝酵母尿酸氧化酶的制备方法
CN100334207C (zh) * 2004-04-27 2007-08-29 杭州北斗生物技术有限公司 一种黄曲霉尿酸氧化酶的制备方法
US9534013B2 (en) * 2006-04-12 2017-01-03 Horizon Pharma Rheumatology Llc Purification of proteins with cationic surfactant
US8148123B2 (en) 2005-04-11 2012-04-03 Savient Pharmaceuticals, Inc. Methods for lowering elevated uric acid levels using intravenous injections of PEG-uricase
CZ2007700A3 (cs) * 2005-04-11 2008-02-27 Savient Pharmaceuticals, Inc. Variantní forma urátoxidázy a její použití
AU2011257764B2 (en) * 2005-04-11 2012-04-05 Horizon Therapeutics Usa, Inc. A variant form of urate oxidase and use thereof
CA2604399A1 (en) * 2005-04-11 2006-10-19 Savient Pharmaceuticals, Inc. Variant forms of urate oxidase and use thereof
CN101402688B (zh) * 2008-11-18 2011-04-20 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 一种融合蛋白及其编码基因与应用
EP2411512B1 (en) 2009-03-24 2013-11-20 Meito Sangyo Co., Ltd. Improved type milk-clotting protease derived from a microorganism
KR101861547B1 (ko) 2009-06-25 2018-07-02 크레알타 파마슈티칼스 엘엘씨 페길화된 유리카아제 치료 중에 혈청 요산을 모니터링하여 주입 반응의 위험성 및 반응의 항체­매개 상실을 예측하는 방법 및 키트
CN102051348B (zh) * 2009-10-27 2012-10-03 重庆富进生物医药有限公司 人源化重组尿酸酶及其突变体
RU2460793C2 (ru) 2010-01-15 2012-09-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий семейства enterobacteriaceae
WO2011127393A2 (en) 2010-04-08 2011-10-13 Georgia Tech Research Corporation Variants of ancestral uricases and uses thereof
CN102634492B (zh) 2011-02-14 2015-06-10 重庆富进生物医药有限公司 聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物及其制备方法和应用
CN102757945B (zh) * 2011-04-28 2015-03-18 杭州俊丰生物工程有限公司 人尿酸氧化酶蛋白及其制备方法和其聚乙二醇结合物
CN102260653B (zh) * 2011-06-30 2013-04-03 荣俊 一种peg化重组猪-人尿酸氧化酶融合蛋白的制备及应用方法
EP2986720B1 (en) * 2013-04-17 2017-09-06 Council of Scientific & Industrial Research Uricase mutants
CN103834623B (zh) * 2014-02-11 2017-11-07 中国药科大学 具有催化活性的人源尿酸氧化酶
CN104388467A (zh) * 2014-10-27 2015-03-04 李长贵 一种构建自发性高尿酸血症小鼠模型的方法及其用途
WO2016187026A1 (en) 2015-05-15 2016-11-24 Medimmune, Llc Improved uricase sequences and methods of treatment
CN106554948B (zh) 2015-09-29 2019-06-25 上海生物制品研究所有限责任公司 突变型尿酸酶、peg修饰的突变型尿酸酶及其应用
CN108103079B (zh) * 2017-06-20 2021-07-13 北京锦篮基因科技有限公司 一种高尿酸血症的基因治疗药物
CN109554376B (zh) * 2018-11-13 2022-03-22 广西大学 一种碱性尿酸氧化酶及其在检测试剂盒和降低食品中尿酸的应用
CN111088268B (zh) * 2019-03-05 2022-08-02 北京锦篮基因科技有限公司 一种高尿酸血症的基因治疗药物
EP3967754A4 (en) 2019-05-10 2023-07-26 Peg-Bio Biopharm Co., Ltd. (Chongqing) URATE OXIDASE MODIFIED BY POLYETHYLENE GLYCOL
CN112646790A (zh) * 2019-10-11 2021-04-13 上海君实生物医药科技股份有限公司 改进的尿酸酶及其用于治疗高尿酸血症的方法
CN111920942A (zh) * 2020-08-24 2020-11-13 深圳前海鹰岗生物科技有限公司 一种用于快速溶解痛风石的聚合物微针及制备方法和应用
CN114438047A (zh) 2020-11-05 2022-05-06 重庆派金生物科技有限公司 制备聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶的方法
CN114438048A (zh) 2020-11-05 2022-05-06 重庆派金生物科技有限公司 尿酸氧化酶制剂及其应用
CN112852772A (zh) * 2021-01-19 2021-05-28 中国科学院过程工程研究所 一种基于分子内交联和聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶及其制备方法
CN112662640A (zh) * 2021-01-28 2021-04-16 中国药科大学 一种具有催化活性的尿酸氧化酶
CN113244412B (zh) * 2021-06-25 2021-10-26 深圳市瑞吉生物科技有限公司 一种基于mRNA剂型的治疗高尿酸血症或痛风的药物及其制备方法
AU2022340814A1 (en) * 2021-09-01 2024-02-15 Ginkgo Bioworks, Inc. Recombinant cells for treating diseases associated with uric acid and methods of use thereof

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE279486C (pl)
US3613231A (en) 1969-07-25 1971-10-19 Paul F Pugh Method for manufacturing high voltage cable systems
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
DE3126759A1 (de) 1981-07-07 1983-01-27 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Loesliche leber-uricase, verfahren zu ihrer herstellung und verwendung
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4917888A (en) * 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4847325A (en) 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
US5075216A (en) 1988-09-23 1991-12-24 Cetus Corporation Methods for dna sequencing with thermus aquaticus dna polymerase
US5349052A (en) 1988-10-20 1994-09-20 Royal Free Hospital School Of Medicine Process for fractionating polyethylene glycol (PEG)-protein adducts and an adduct for PEG and granulocyte-macrophage colony stimulating factor
US5324844A (en) 1989-04-19 1994-06-28 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
KR0159107B1 (ko) 1989-07-13 1998-11-16 쟝 르쌍드뢰 우레이트 산화효소 활성 단백질, 이 단백질을 암호화하는 재조합 유전자, 발현 벡터, 미생물 및 형질전환세포
US5286637A (en) 1989-08-07 1994-02-15 Debiopharm, S.A. Biologically active drug polymer derivatives and method for preparing same
US5653974A (en) 1990-10-18 1997-08-05 Board Of Regents,The University Of Texas System Preparation and characterization of liposomal formulations of tumor necrosis factor
AU6240494A (en) 1993-02-16 1994-09-14 Enzon, Inc. Ribosome inactivating protein compositions having reduced antigenicity
WO1995000162A1 (en) 1993-06-21 1995-01-05 Enzon, Inc. Site specific synthesis of conjugated peptides
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
CA2206852A1 (en) 1994-12-07 1996-06-13 Novo Nordisk A/S Polypeptide with reduced allergenicity
JPH09154581A (ja) 1995-12-05 1997-06-17 Asahi Chem Ind Co Ltd ウリカーゼを生産する実質上純粋な微生物
CA2279986A1 (en) 1997-02-06 1998-08-13 Novo Nordisk A/S Polypeptide-polymer conjugates having added and/or removed attachment groups
US6783965B1 (en) 2000-02-10 2004-08-31 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Aggregate-free urate oxidase for preparation of non-immunogenic polymer conjugates
DE69943205D1 (de) 1998-08-06 2011-03-31 Mountain View Pharmaceuticals Peg-uricase Konjugate und Verwendung davon
BRPI9912974B8 (pt) 1998-08-06 2021-05-25 Univ Duke conjugados de peg-urato oxidase e seu uso
HU229774B1 (en) * 1998-08-06 2014-07-28 Univ Durham Urate oxidase

Also Published As

Publication number Publication date
CN1322243A (zh) 2001-11-14
JP2010158244A (ja) 2010-07-22
HUP0103205A3 (en) 2006-01-30
JP2002524053A (ja) 2002-08-06
CA2337967C (en) 2011-11-01
NZ509633A (en) 2003-04-29
HK1125402A1 (en) 2009-08-07
DE69942834D1 (de) 2010-11-18
BR9913360A (pt) 2001-07-03
CZ2001466A3 (cs) 2001-07-11
IL197339A0 (en) 2011-07-31
DK1100880T3 (da) 2011-01-24
RU2290439C2 (ru) 2006-12-27
AU5336599A (en) 2000-02-28
IL141221A (en) 2010-06-16
JP5721954B2 (ja) 2015-05-20
HU229774B1 (en) 2014-07-28
BRPI9913360B8 (pt) 2021-05-25
ZA200100974B (en) 2002-06-26
EP1100880B1 (en) 2010-10-06
EP2277998A1 (en) 2011-01-26
WO2000008196A3 (en) 2000-03-30
HK1153508A1 (zh) 2012-03-30
PT1100880E (pt) 2011-01-13
CZ304223B6 (cs) 2014-01-15
PL346222A1 (en) 2002-01-28
EP2277998B1 (en) 2016-04-20
CY1111001T1 (el) 2015-06-11
EP1100880A2 (en) 2001-05-23
KR100841634B1 (ko) 2008-06-26
CN101280293A (zh) 2008-10-08
ATE483797T1 (de) 2010-10-15
HUP0103205A2 (hu) 2001-12-28
IL141221A0 (en) 2002-03-10
WO2000008196A9 (en) 2000-07-13
JP2013215199A (ja) 2013-10-24
CA2337967A1 (en) 2000-02-17
HK1037214A1 (en) 2002-02-01
IL197339A (en) 2015-02-26
EP1100880A4 (en) 2002-04-17
ES2352451T3 (es) 2011-02-18
CN101280293B (zh) 2013-09-11
US7056713B1 (en) 2006-06-06
KR20010053633A (ko) 2001-06-25
AU766421B2 (en) 2003-10-16
WO2000008196A2 (en) 2000-02-17
BR9913360B1 (pt) 2013-09-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2337967C (en) Recombinant uricase protein
US8586535B2 (en) Humanized recombinant uricase and mutants thereof
KR101054247B1 (ko) 정제된 요산산화효소 제제 및 이를 포함한 조성물, 그리고 그 정제법
RU2610680C9 (ru) Вариантные формы уратоксидазы и их применение
PL215157B1 (pl) Wyizolowana urykaza, zawierajaca ja kompozycja farmaceutyczna, kodujacy ja wyizolowany kwas nukleinowy, zawierajacy go wektor i obejmujaca ten wektor komórka gospodarza oraz sposoby wytwarzania urykazy oraz zawierajacej urykaze kompozycji farmaceutycznej
PL202799B1 (pl) Sposób izolowania urykazy w postaci tetramerycznej oraz wyizolowana tetrameryczna urykaza
US20060188971A1 (en) Urate oxidase
MXPA01001342A (en) Urate oxidase

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification