HU229774B1 - Urate oxidase - Google Patents

Description

A jelen találmány tárgyát urát oxidáz (uríkáz) fehérjék és az ezeket, kódoló nukleinsav molekulák képezik. Pontosabban, a jelen találmány tárgyát azok az uríkáz fehérjék képezik, amik különösen jól használhatók például intermedierként, javított, módosított uríkáz fehérjék előállítására, amiknek csökkent az immunogenításuk és megnőtt a biológiai hozzáférhetőségük. A jelen, találmány szerinti előnyben részesített, módosított uríkáz fehérjék közé tartoznak a kovalens kötéssel puliéulénglíkolokhoz vagy polietilénoxidokhoz kötött uríkáz fehérjék. Tehát a jelen találmány tárgyát képezik az uríkáz fehérjék, a fehérjékhez spécinkusan kötődő ellenanyagok, az uríkáz fehérjéket kódoló nukleinsav molekulák, valamint azok hasznos fragmensek a nukleinsav molekulákat tartalmazó vektorok, a vektorokat hordozó gazdasejtek, valamint az uríkáz fehérjék és nukleinsav molekulák előállítására szolgáló eljárások.

A 40 évnél idősebb férfiak körében a legelterjedtebb gyulladásos izületi betegség a köszvény (Roubenoff, Ra „Gout and hyperuricemia*, Rheuraatic Disease Cliníes of North America 16, 539-550 (19901b A fájdalmas Részvényes arthritis akkor alakul ki, amikor a húgysav szintjének a vérben való megnövekedése íh?pemnA;ánn<h az ízületekben a mononáirium-urát monohidrát mikroszkópos kristá lyainak epizód szerű képződését okozza. Idő * «· * * vei a krónikus hiperurikémia roncsoló kristályos urát lerakódásokat (tophi) okoz az Ízületek kórül, a lágyszővetekben és néhány szervezetben (Hershfield,. M.S.: ^Biochemistiy and immunology of poly(ethylene glycol)-modified adenosine deaminase (PEG-ADA)*, In: „Polyfethylene glycol) Chemistry and. Bioiogícal Applications”, 145-154, oldal, szerk.; Harrís, JM, Zalipsky, S., ÁCS Washington DC (1997)}'. A húgysavn&k korlátozott az oldhatósága a vizeletben, és ha túl nagy mennyiségben választódik ki (hppemncosuna)^ akkor veseköveket okozhat (uncoKthiosis). Bizonyos, például rosszindulatú betegségekben, úgymint leukémia··; bari és íímfómában szenvedő betegekben, az erős hiperurikémia és hiperuriközuria (a kemoterápia során a tokozott tumorsejt metabolizmus és lízis miatt) az akut, súlyos vesekárosodás kockázatával jár |Sandberg, AA,, Cartwríght GB, Wintrobe MM.; „Stúdiós on leukémia I, Urie acíd and exeretion”, Blood 11, 154 166 (.1956); Gold GL, Friiz BD.; „Hyperuricemia associated with the tréatment of leukémia” Ann. Int. Med. 47, 428-434 (1957); Cohen, LF., Balow, 3E,, Magrath, IT., Poplack, DG., Ziegler, 3L.; „Aeute tumor lysis syndrome; A review of 37 patients with Surfcitt's lymphoma”, Am. J, Med. 64, 468-491 (1980); Jones, DP._S Stapleton, PB., Kalwinsky, D.„ McKay, CP, Kellíe, SJ., Púi, CB.: „Renal dysfunction and hyperuricemia at presentation and relapse of aeute lymphofolastíc leukémia*, Med. Pédiatr, Oneol.

18, 283 28o (P>90). A súlyos hiperurikémia és köszvény a különböző okokból (beleértve az átültetett szervek kilökődésének megakadályozására alkalmazott ciklosporin terápiát is) kialakuló «ί « * rossz vesemúködéshez kapcsolódik Hakala, TR.: „The incidence oí [West, C gout in , Carpenter, BJ., renal transplant recipients” Ara.. J. Kidney Dis. 10, 369-371

Venkataseshari, VS., Feingold, R., Dikman, S., Churg, J.

„Acute hyperuricemic nephropathy and renal failure after tra.nsportat.íon^í?, Nephron 56, 317-321 (1.99Ö); Ahn, KJ., Kim, YS., Lee, HC., Park, K._s Huh, KB.; „Cyclosporine-induced hyperuricemia after renal transplant: CHnieal characieristies and Mechanisms” Transplantatíon Proceedings 24, 1391-1392 (1992); Delaney, V., Sumrani, N'., Daskalakis, P., Hong, JH,, Sommer, BG.: „Hyperuricemia and gout in renal allograft recipients” Tra.nspla.nta.tion Proceedings 24, 1773-1774 (1992); George T., Mandell, BPz „Gout in the transplant patient”, J. Clin,

Rhenmatol, _1, 328-334 (1995)).

A hiperurikémía. mind az urát túltermeléséből, mind gyengébb kiválasztásából származhat [Hershfield, MS», Seegmiiler. JE.: „Goul and the regulatioxi of purine biosynthesis”, In; Horizons in Bioehenusm and Biophysícs, 134-162. oldal, szerk,;

Quagliariello, E., Addison-Wesley, Readíng, MA (1976); Kelley, WN., Pox, ΙΗ», Pallela, TD.: „Gout and related disorders of purine metaholism”, In; Textbook of Rhenmatology, 3. kiadás, 13951448, oldal, szerk.; Kelley, WN., Ha.rr.is, ED,, Ruddy, S., Sledge, CG., WB Saunders, Philadelphia (1989); Becker, MA.·, Roessler, BJ.: „Hyperuricemia and gout”, ín: The Metabolic and Molecular

Bo.ses of Inheríted Dísease, 7. Seriver, CR., Beaudet, AL., Sly, dadás, 1655-1677, oldal, szerk.: WS, Valié, D», McGraw-Hill, New <e «

York (1995)]. Ha gyenge, akkor a hiperurikémia szabályozható az étrenddel» de ha. erős, és súlyos klinikai következményei is vannak, akkor gyógyszerrel kell kezelni, akár a húgysav kiválasztását elősegítő ágenssel (ami nem hatékony, ha a veseműködés lecsökkent), vagy az aliopurinol xantinoxidáz inhibitorral, ami gá tolja a hűgysav képződését. Az aliopurinol a terápia íö eszköze a köszvénves csomóktól szenvedő, elégtelen veseműködésben szenvedő, leukémiás, valamint néhány örökölt betegségben, szenvedő betegek esetében. A hiperurikémia. kezelése általában hatékony és jól tolerált. Azonban néhány beteg, akik Lorziló, munkaképtelenné tevő köszvénves csomóktól szenvednek, ellenállnak minden hagyományos terápiának {Becker, MAu „Giínioal aspects of monosodíum uráte monohydrate erysta.1 depösition disease (goul)”. Rheumatic Disease Clinics of North America, 14, 377-394 (1988); Fám, ÁG.: „Strategies and eontroversies in the treatment of gout and hyperaricemia*, Ballíere''s Clinical Rheumatology 4, 177-192 (1990); Rosenthal, AK., Ryan, LM: „Treatment of refractory crystal-associated. arthritis”, Rheumatic Disease Clinics of North America, 16, 539-550 (1990)). Emellett az allopurinollal kezelt betegek 2%-ában allergiás reakciók keletkeznek, és körülbelül 0,4%-u.kban súlyos hiperérzékenységí tünet lép fel (Sínger, JZ, Wallace, SL.: „'Fhe aliopurinol hypersensitivity syndrome. Unnecessary morfoidity and mortality”, Arthritis Rheum. 29, 82-87 (1986); Arellano, F., Sacristan, JA.: ^Aliopurinol .hypersensitivity syndrome: A review*, Ann. Pharmaeother. 27, 337-348 (1993)1. Ez, a gyakran az életet is veszéiyeztető tünet akut vese- és májproblémákat okozhat, valamint súlyos htaérüMsekot (toxikus epidermális uekrolizis, exíoHahv dermatitisz» eryt.hemx multíforme, Stevens-Johnson szindróma). Az aliopurinol emellett zavara a leukémia kezelésében és az átültetett szervek kilökődésének gátlásában használt axatiopirin éa a 6-xnorkaptopuri.u metabdlizmusát Az említett állapotokban jelentős hipemrikémia. lép fel, és súlyos kőszvényt okoz» vagy veszélyezteti a veseműködést.

Végezetül a hipemrikémia a humán urát-oxídáz (urikáz) gén mutációs inaktiválódásának az eredménye a fejlődés során (Wu, X, Lee, CC.» Muzny» DM., Caskey, C'T.: „Urate oxidsse: Primary strueture and evolutionary implications*, Proceedíngs of the National Academy of Sciences» VSA 8b, 9412-9416 (1989); Wu, X, Muzny, DM,, Lee, CC., Caskey, CT.: ₈Tro independent mutotkmal events in the lese of urate oxidase**, J. Mól. VvoL 34, 78-84 (1992)).. A legtöbb nem-humán főemlős és más emlős májának aktív px?roxiszömájábo.n lévé aktív urikáz a húgysavat aiiantoinná <*€Oa és H3Ö4 alakítja át, ami 80-100-szor jobban oldbdlk, mint a húgysav, és a vese sokkal hatékonyabban kezeli. Franciaorzxágban és Olaszországban 20 eve az Azpznp&m /kuxm-ből készített. kiindulási urikázt (Uricozyme, CJrn-Midy, Párizs) használják a leukémia kemoterápiához kötődő súlyos hipemrikémia kezelésére ^London, kL, Hudson, FMx Jhioolytle aetivüy of puriíled uricase ín tw humán beingok Science 129, 987-938 (i987|; kissel, P_x» Lamarche, M,_s Rover, Rx „Míxiihoatíon of urioaemia and the ezcretion oíurio acid nitrogén by a© enayme af iiingal erigm% Natúré 217, 72-74 {1988^ Brogard., JM,., Coumaroa, D,» Frankhauser, J>> Sfc&hl, A., Stabl, Ja «Enzymatic nneoiysia; A study ©f effect of a fuagal ur&teamdaseL Bar, J, Ch©, Biot Bee. 17, 890-895 (1972|; Kissel, R, Schmitt, J., Sfreiff, F,, Makuary, G>, Schmidt, C,, Idusáéin, Pa „Muraié uaydase: són internt dana la prévention des byperuricemíes therapeutigues en bemaiotegleÁ .Ann.. Med, Nancy UL 519-535 (1972); Fotaw, b,, Aparido, M., Meurel, C,_t Ruedas, ME., Martín-Dnpcmt, CLa „Oriaolytie iherapy. Valuc af uraié cnddase in the treatment of hypernncemiaa\ Noov. .Presse Med, 4, 1109-1112 (I975|; Zitioun, B, Dauaby, P,, TelB&nd, C„, Barthelemy, M,, Bonehard, Pa „Fe traitement des hypemrfernies en hemaialagie pár Furaté-oxydase et FallepurmalL Ann, Med. Inteme 127, 479-482 (1978); Bragsad, JM,., Bfahl, A., Btald, Ja „Ensymatie nrioolyais and its ©se in therapyL In: Bnc Aeid, 515524. oldal, sserka Kelley, W., Arnold WJ., Weiner IM,, SpringerVerlag, New York (1978); Masera, G,, Jankovio, M., Karín, MG,, Loenaaiuffi, A., Eassí, MR., üdersa, CL, Recebía, Ma' „Uraiéaaidase prapkylaxia of urie amd-mdueed renal damage ín chUdbood leukémia*’, d, Fedlatr. 1CX), 152-155 (1932) j és nemrég se Amerikai Bgyesult Államokban leukémiás betegeken vegseü klinikai kísérletekben feassnAhák (Μ, C-H«, Rellmg, MV., Laaoambes, P,, Barrisou, FM, Straaiana, A., Mandeair, J-M,, Rifeeire, RC. és mtsai: ^Grate eaidase in the prevenfion and treatment af hyperurieemia assaeiated adtb lysttphaid maMgaaneiesÁ Leukémia n, 1313-1318 (1997)). As ©rikás feata« φ * * χ<« β>'

ΦΧΧ φ

< X $ « Φ φ sa sokkal gyorsabban lép fel, mint az allopurinolé [Masera, G., Jankovic. M., Zurlo, MG., Locaseiulh, A., Rossi, MR., Udetzo, €., Recchia, M,: „U.rate-oxidase prophylaxis of uric acid-induced renal damage in childhood leukémia*, J. Pediatr. 100, 152-155 (1982); Púi, Rellíng, MV., Lascombes, F., Hamson, PL,,

5tmxia.no, A., Mondesir, J-M., Ribeiro, RC, és mtsai; „Urate oxidase ín the preventioii. and treatment of hypemricemía associated with lymphoid maiignanci.es”, Leukémia .11, 18ISIS 16 (.1997)], A kőszvényes betegekben az urikáz infúziók képesek megszakítani az akut rohamokat és csökkentik a kőszvényes csomók mereter [Kissel, P., Lamarché, M., Royer, R.: ^Modification of uricaemia and the excretion of uric acid nitrogén by an enzyme of fungal origin*, Natúré 217, 72-74 (1968); Potaux, L,, Aparicio, M.,., Maurel, C,, Rueda.s, ME., MartinDupont, CL,.: „Vricolytie therapy. Value of urate oxidase in the treatment of hyperuricemias\ Nouv, Presse Med, 4, 1109-111.2 (1.975); Brogard, JM., Stahi, A., Stahi, J.; „Enzymatie urícolysis and íts use ín therapy⁵⁵, In: Uric Add, 515-524, oldal, szerk:.: Kslley, WN., Arnold WJ., Weiner ÍM., Springer-Verlag, New York (1978)].

Bár egy rövid kemoterápia során az- akut hiperurikétnia ke¹zelésében hatásos, az ÁsperpiÓus /Innus urikáz napi infúziójának súlyos hátrányai, vannak az újra felbukkanó- vagy csomós koszvény kezelésében. Emellett az /IsporpiOws /Inuus urikáz hatékonysága gyorsan eltűnik azokban, a betegekben, akikben antiurikáz ellenanyagok fejlődnek ki (Kissel. P., Lamarché, M., Royer, * φ

R.: „Modification of uricaemia and the exeretion of uric add nitrogén hy an etizyme of fungal origin”, Natúré 217, 72-74 (1968); Brogard, J.M., Stáb), A., Stahl, J,: „Enzymatíc uricolysis and its use ín therapy”, Jn: Uric Acíd, 515-524. oldal, szerk.: Kelley, WN,, Amold WJ._S Weiner ÍM.,. Springer-Verlag, New York (1978); Escudier, B., Lecierq,. B., Tandemnek F., Nítenberg, G.; „Hyperuneemia resistant to urate oxidase. Effieacy of high doses {lettet}”, Presse Med. 18. 1340 (1984); Mourad, G., Cristol, JP., Chong, G., Andary, M., Mion, C.: ^Roíe of precipitatiíig anti-urate oxidase antibodíes ín urate oxidase-resistant hyperuricerriia (lettér}”, Presse Med. 13, 2585 {1984}; Sibonv, G., North, ML., Bergerat, JP., Láng, JM., Oberíing, F.: •„Hyperuricemia resistaní to urate oxidase, Roíe of an ti-serum urate oxidase preeipitatmg antibodíes {letter}”, Presse Med, 13, 443 (1984}}. Súlyos allergiás reakciók léptek fel. beleértve az anafilaxist is |Donadio, D._; Errera, J., Navarro, M., Izarn, P.: „Anaphyíaxis-like manifestations after intravenous injection of urate oxidase in an asthmatie child with aeute leukémia {letter}”, Nouv. Presse Med . 10, 711-712 (1981); Montagnac, R., Schillinger, F„: „Anaphylactie complication tied to intravenous injection of urate oxidase”, Nephrologie 1_1, 259 (1990}; Púi, C-IL, Relling, MV. , Laseombes, F., Hamson, PL., Struxiano, A., Mondesir, J-M., Ribeiro, RC. és mtsai; „Urate oxidase in the prevention and treatment of hyperuricemia associated with lymphoid malignancies”, Leukémia .1.1., 1813-1816 ()997)). Világos, hogy a krónikus terápiához egy feos«bb ideig ható, kevésbé immunogén unkáé ké~ •sMtményre van szükség.

Áz exogén enzimek proteázoktél és az immunrendszertől való megvédésének egyik módja, hogy kovalens kötéssel egy mert, atomkus pulimért, azaz például monometoxlpolietdénglikoh (FEG) kapcsolunk a fehérjék felszínéhez (Hams, JM_<S Z&lipsky, S. (szerk,); Folyfetbylene glycol) Chemístry and Biologíeai Applications, ÁCS, Washington DC (1997)], A fcórnlbelöl 1000» 10000-es tnulekulasúly polieiiiénglíkolokrói mutatták ki eldazóty hogy állatokban számos idegen fehérjének meghosszabbítják a keringési idejét és csökkentik as ímmnnogenitását (Ábuehowski, A,_? M'eCoy Falasuk, Wh, van Ds, T,, Davis, FF.; _wBSeet of attaehment of polyethyiene glyce.1 on immunogenieity and cirodatíng Bfe of bovme Kver catatase», Journal of Btotogical Chemíshy 2¾ 3592-3586 (197?); Ábuehowski, Á._$ van Es, T„, Fsüczuk, BCt, Davis FF.: _sAlteration of immunotoglmd properties of bovlne semm albumin by eovalent attaehment of polyethyiene ghvolt Journal of Biologíc&l Chemistry 252, 3573-3581 (I977g Davis, S,, AbuchowsM, A>, Fark, YX, Davis, FF,; jyteratkm of the drcuiaiíng iífe and the antigenie ptoperbes of hovine adenosine deamiuase ín miee by attaehment of polyethyiene glycoF, Clin. Bvp. Immunot 4b, 649-652 (1961); Ahnehowski, A,, Kazo, GM,, Verhoest, CR,> Jr._s van Es, T,, Kaíkewits D,_s Nued, Mt._s Vian, AT. és mtsaidCanoer therapy with modiiied enzymesd, Anbtumor ropertiea of polyethyiene glyoolasparagino.se eonjugs.tesD Cancer Bioehem,. Biophya.. 7, 175-166 »Λ«« (1984}; Davis, FF., Kazo, GM., Noéd, ML, Abuchowski, A.: „Reduction of imiminogenicity and extension of arculatúig lífe of peptides and proteins”, ín: Peptide and Protein Drug Delivery, 831-864. oldal, szerk.: Lee, VH'L, Marcel Dekker, New York (1991}|. 1990-ben az 5000-es molekulasűlyü PEG-gél módosított szarvasmarha adenozin-dezamináz (ADA) lett az első PEGilezett fehérje (PEG-ADA, ADAGÉN, előállította az Enzon, Inc.}, amit az amerikai egészségügyi hatóság (FDA, azaz United States Food and Drog Administration) jóváhagyott, hogy használható az ADA deficiencia miatt fellepő kombinált súlyos immundeficieneia. betegség kezelésére (Hershfield, MS., Buckley, EH, Greenberg, ML, Méltón. AL, Schiff, R, Hárem, C, Kurtzberg, J. és mtsai: „Treatment of ^: adenosine deficíeney with polyethyleneglycolmodiíied adenosine deaminase”, The New England Journal of Medicine 3 16, 589-596 (1987}}. Az elmúlt 12 év gyakorlata igazolta, hogy a legtöbb, PEG-ADA-val krónikusan kezelt betegben érzékeny BUSA-val anti-ADA ellenanyagok mutathatók ki, de nincsenek allergiás vagy túlérzékenységi reakciók; néhány antiADA ellenanyagot termelő betegben fordul elő a PEG-ADA felgyorsult kiürülése, de ez általában csak ideiglenes hatás IChafíee, S, Mary, A, Stiébm, ER, Girault, D, Fischer, S, Hershfield, MS.: ,,IgG antibody response to polyethylene glycol moúiíied adenosine deaminase (PEG-ADA} in patients with adenosine deaminase defieiency”, J. Clinic. hívest, 89, 16431651 (1992); Hershfield, M.S.: »Biochemistry and immunology of polyfc? hylene glyeoh-modiíkd adenosine deaminase (PEG- ADAG, & ^Ptdytetbylene glyeol) Chemístry and Riofogfeal Applications’*» 145-154. oldal, szerk.: Harris, Jbh Zahpsky, S., ÁCS Washington DC (1997)), Az nyilvánvaló, hogy aa ADA deddemdáhan szenvedd betegek immunfunkciója általában nem lese normális a. PEGAOA-val való kezelés hatására (Bershíield, MS.: „PEG-ADA replaeement therapy far adenoelne deamma.se defieleney: An update altér 8,5 yearsb Clin, Immunot Immunopathol. 76, 5SS-S28E (1991; Bemhield, Minbell, MC

Jmnmndenefeney dieeases eaused by adeoosíne deaminase deOemney and purine nueleoslde phósphoxylase defideneyC fe: The Met&boMc and Molecular Baees of Inherited Dfeease, 7. kiadás 1725-1768. oldal, szerkó Seriver, CR,, Bcandet, AL., Siy WB„ Valié» D,_$ McGramM, New York (19951). Tehát aa immunogenitás jelentősebb probléma lehet a, PBGIlezett enzim kifejlesztése normális immunfunkcíóval rendelkező betegek krónikus kezeléséhez,

A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy az immunogenltás egy antigén (azaz például FEG-gcl módosított fehérje vagy mődoshfekm fehérje) injekdőzott készítménye által indukált immunválaszhoz kapcsolódik, míg az antigenitás egy antigénnek egy már létező ellenanyaggal való reakciójára vonatkozik, összességében, az anügenitást és immunogenitási innonnreaktivitáznak nevezik. A PRGmrlkázzal korábban végzett vizsgálatokban az imnnmreaküvitást különböze módszerekkel vizsgálták, beleértve a FBG-nrikáz már meglevő ellenanyagokkal való m c?tm reakciója v, az mdukáh ellenanyag szintézis mérését:

éa az ismételt injekciózások után. a felgyorsult kiürülés! sebességetet

A PBGilesésröl kimutatták, hogy csökkenti az immunogenitást, és meghosszabbítja a gomba és sertés urikázok keringési idejét állatokban (Vfeen,. BHL.» Abuchowld, A., van Es, T._s Palczuk, NO., Davis, FPn „properiies of two urate oxídases modified by the covalent attaohment of poly(cthylene glyeolf, Biochimica et Biophysiea Aota 660, 293-298 (1931); Savooa, KV,, Fa vis, FF., telezők, NCx „Induction of tolerance in mice by uriease and monometbo^polyediyieue glyeol-mmiihed uriease®, Int, Arch, Allergy AppL bnmunoi, 75, 53-67 (1934); Tsuji, J„ Hírese, K,, Kasahara, E,_f Naitoh, N., Yamamoto, In „Stúdiós on the antigcnicity of the polyethylene glyeok-modified uncase**» Int, J, Immnnpharmacnk 7, 725-730 (1985); Yesonese, PM,, Caliceti, R, Sohiavnn, On „New synthctic pelymers for enzyme and liposome modiümtíon®, M Poly(ethylene glyeol) Chemiatry and BioiogleaJ Applications, 182-192, oldal, axerk.: Harrts, J JM, Zalípsky, S„ ÁCS, Washington DC (1997)), A PEGgel módosított Candidu úri kos 5 normábs hűgysav-samtü onterhesben gyorsan kimutathatatlan szintre csökkentette a szérum hűgysav-szmtjét |Davis, 8., Abnobowski, A., Fark, YR., Davis, FFz „Akaration of the drentóiag bfe and the antigenio -properüea of bwine adenoteie desndnaw in mice by- atiaehmenf of polyethylene glyeoF, Clin, Exp, Immunok 46, 649-682 (1981)|, RIvetelességi alapon an Enson, Inc. által elöáffitott, PEGÜezett Adhrobocfer urikázt használták aüopurinol tüiérzékenységbeu

Λ * * *

Φ *

Φ

S* * ·*:*

Φ*»Φ

Φ *

Φ szenvedő limfómás betegek kezelésére, akiknek veseműködés! problémáik és erős hipernrikérniájuk volt [Chna, CC., Gmenherg, Mk, Vlau, AY>> Wned Μ», Brenokman, WD.» Jr., Hershfield, MSn ^Uee of poiyethylene glyeol-modihed urioase (FBG-uriease) to treat hyperuricexnia in a pattent with non-Hodgkin lymphoma’f Ann, Int,, Med, 109, 1,14-07 (1988); Greenberg, ML·, Hershfield, MS..' sA radiochemical-feigh-performanee líquíd ehromatographic assay tőr nrate mddase in humán plasma\ Anaíytícal Bioehemísínr m, 290-293 (1989)), Körülbelül két hét alatt négy intramuszkuiáris injekciót adtak be. Ez alatt a ródd idő alatt a hiperorikémls ellenőrzés alatt volt, és a betegek plazmájában BUSA-val nem lehetett antí-urikáz ellenanyagot kimutatni. Ennek a készítménynek további használatát és klinikai fejlesztését nem folytatták.,

A mai napig nem fejlesztették ki az unkáénak vagy FEGurikáznak olyan formáját, aminek elég hosszú a keringési ideje, és elég alacsony az lommnogenimsa a krónikus terápiában való biztonságos és megbízható használathoz,, A jelen találmány tárgya az uríkáz javított, formájának biztosítása, ami a FEGllezéssel. kombinálva megfelelhet ezeknek a követelményeknek, A találmány egy egyedi, emlős eredetű rekombináns uríkáz, amit mutációval módosítottunk, oly módon, boo^f fokozza a PBGilezésnek aM a. képessegét, hogy maszkosa a poteomáhsao imnmnogen epitopokm,

A jelen találmány tárgyat, üj arikáz fehérjék és az ezeket kódoló nukleinsav szekvenciák képezik.

» χ χ « <· <· * ψ *'·** χ· * * s\ Φ Φ λ'*·*Χ

A. jelen találmány tár^a továbbá eljárás a rekombínáns módszerekkel előállított (például az alábbiakban ismertetett) urikáz fehérjék tisztítására,

A jelen találmány tárgya továbbá eljárás a hügysav mennyiségének csökkentésére egy emlős testfolys.déká'bsn_s oly módon, hogy a jelen találmány szerinti urikáz fehérjét tartalmazó készítményt adunk be az emlősnek,

A jelen találmány tárgya továbbá a leírásban, ismertetett urikáz fehérjék elleni ellenanyagok biztosítása..

Á jelen találmány tárgyát képezik továbbá a leírásban szereplő nukleinsav szekvenciákat tartalmazó vektorok és gszdasejtek, valamint ezek alkalmazási eljárásai az általuk kódolt urikáz fehérjék előállításában,

A jelen találmány tárgyát képezik továbbá azok az urikáz fehérjék, amiket egy lényegében aem-immimogén PBG-urikáz előállításában lehet használni., ami a módosítatlan enzim összes, vagy majdnem összes högysavnldé hatását megtartja, A hügysavoldó hatást a továbbiakban Nemzetközi Egység (NB) per mg fehérje dimenzióban fejezzük ki, aholis az 1 NE urikáz aktivitást az enzim olyan mennyiségeként definiáljuk, ami percenként egy müsromol hugysavat hant. et

A jelen találmány tárgyát egy emlős fej rekombínáns urikáz fehérjéje képezi, amit úgy módosítottunk hogy egy vagy több li&inesoportoi építettünk be, Á rekombínáns fehérje szakkifejezés a. továbbiakban bármiben mesterségen előállított fehérjét jelent, ami megkülnnbőztetbeié a ferméazetes fehérjéktől (azaz azoktól, amik egy állatnak olyan szöveteiben keletkeznek, amik a számunkra érdekes fehérjének csak a természetes géniét t&rtal· mazzákb A fehérje szakkifejezés jelenthet peptideket és aminosav szekvenciákat is- Λ jelen találmány szerinti rekombináns urikáz fehérje lehet két vagy emlős fehérje* peptid va^ aminosav szék vencia hibridje vagy klméráfa, Az egyik megvalósítási mód szerint a jelen találmány használható egy emlős fajhői származó rekombináns urikáz fehérje előállítására, amely fehérjét úgy módosítoftunk, hogy megnöveltük benne a. lízin csoportok számát, egészen addig, hogy a rekombináns urikáz fehérje PEGilezése után a PEG-ilozett urikáz termék enzlntsiikiman lényegében ugyanolyan aktív, mint a módosítatlan urikáz, és a PEGílezett urikáz forrnék nem elfogadhatatlanul immunogém A jelen találmány szerinti urikázok csonkított formáit is megfontoltuk, amikben az urikáz FGterminális és/vagy C~ terminális végei nincsenek jelen. Az urikáz előnyösen nem csonkított* addig a szintig, hogy a lízineket ^távolítsuk,

A szakterületen jártas szakember számára, nyilvánvaló, hogy a konjugált urikáz-hordozó komplex nem tartalmazhat anynyl kötést, hogy az lényegesen lecsökkentse az urikáz enzimaktivitását, vagy nem tartalmazhat olyan kevés kötést, hogy attól elfogadhatatlanul immunugén maradjon, A konjugátum a. módosítatlan urikáz fehérje bngysavoidö aktivitásának előnyösen legalább 70-90%-ái megtartja, miközben stahdahb lesz, oly módon, hogy támlás közben, emlős plazmában és/vagy szérumban fiziológiás hőmérsékleten megtartja az aktivitását, a mödositaüan xxx* xxxx

X X

X XX X

X X

XXX* xx

XXX XX* urikáz fehérjével összehasonhtva. Az elfogadható, ha a húgys&voldó aktivitásnak legalább körülbelül 8ö-85%~át megtartja. Emellett, egy előnyös megvalósítási mód szerint a konjugátum a módosítatlan urikáz fehérjével ősszebasonlitva lényegesen leesőkként immunogenkáet és/vagy immunreaktivitást mutat. As egyik megvalósítási mód szerint a jelen találmány tárgyát egy, a leírásban szereplő urikáz fehérje képezi, ami úgy módosítható, hogy egy atoxíkus, nemunnnnnogén, gyógyászatilag elfogadható .herdnzéhoz, azaz például FBG-hez kapcsoljuk, az urikáz fehérjében levő Ifoinesoportök közöl legalább egyhez kovalens kötéssel hozzákapcsolva. Egy másik változat szerint az urikáz fehérjét úgy módosítjuk, hogy az aminosav szekvenciájában fcw ham aminosav csoportok kozni Mrülbelúi löméi kevesebben keresztül kovalens kötéssel egy hordozöhoz kapcsoljuk. A 2, 3, 4, ó, ü, 7, 8, vagy 9 liziuea keresztül való kapcsolást is megfontoljuk alternatív megvalósítási míklként.

A jelen találmány szerinti urikáz fehérje egy rekombináns molekula, ami sertés és pávián máj urikáz fehérjék szegmensek tartalmazza. A találmány tárgyát képezi továbbá egy módosított pávián szekvencia is. Az egyik megvalósítási mód szerint a jelen találmány tárgyát egy kiméra sertés-pávián urikáz képezi (BBC urikáz, 2. számú szekvenciái, aminek az 1-225-os annnosavai a sertés urikázból (X számú szekvenciái száonaznak, ez a .22 ú304-os aminosavai a pávián urikázból (ó. számú ezekveacso) származnak (lásd még az 5. ábrát). Egy másik megvalósítási mód szerint a jelen találmány tárgyát egy kiméra sertés-pávián urikáz ,χ φ **S* * φ * « Φ Φ Φ « * φ ΦΦΦ Φ Φ * νΦΦ* Φ φ φ φφ**

Φ ΦΦΦ ΦΦΦ Φ * (PKS urikáz) 'képezi, ami tartalmazza a sertés urikáz 1-288-as aminosavait, és a pávián urikáz- 289-304-es aminosavait (4.. számú szekvencia). A PBC és PKS urikáz csonkított, származékait is megfontoljuk. ÁZ' előnyben .részesített csonkított formák azok a PBC -és PKS fehérjék, amit úgy csonkítottunk, hogy vagy 6 N-terminális aminosavat vagy 3 C-terminális aminosavat, vagy mindkettőt. levágjuk, A reprezentatív szekvenciákat, a 8. számú szekvenciavázlaton (csonkított PBC amínosav), a 9. számú szekvenciavázlaton (PBC C--terminálison csonkított), a 10. számú szekveneiavázlaton (PKS N-terminálison csonkított) és a 11. számú szekvenciavázlaton (PKS C-terminálison csonkított.} mutatjuk be. Mind a- PBC urikáz, mind a. PKS -urikáz és ezek csonkított formát is egy-négy lizmcsoporttdl többet tartalmaznak, mint az eddig klónozott más emlős urikázök.

A jelen, találmány tárgyát olyan nukieinsav (DNS és RNS) molekulák, (szekvenciák) képezik, beleértve a nukieinsav molekulák izolált, tisztított és/vagy klónozott formált, amik az itt ismertetett urikáz fehérjéket és csonkított fehérjéket kódolják. Az előnyben részesített megvalósítási módokat az 1. számú szekvenciavázlaton (PBC urikáz) és a 3. számú szekveneiavázlaton (PKS urikáz) mutatjuk he.

Az ezeket a nukieinsav molekulákat tartalmazó vektorok (expressziós- és klónozó vektorok) is. a. jelen találmány tárgyát képezik.

Emellett a jelen találmány tárgyát képezik az- ezeket a vektorokat tartalmazd gazdasejtek.

A· ϊ,}.

*> * A

A *** *

X A * *«·* XíO A s

***♦ *

A jelen találmány tárgyát képeri továbbá a specifikusan a jelen találmány szerinti urikáz fehérjékhez kőtődö ellexianyagok, A sertés urikáz M'-terminális részt elleni ellenanyagok és a pávián urikáz C-termmáhs része elleni clfenanyagok, ha együtt használjuk okét, akkor jói használhatók a PBC, vagy más hasonló kimére. fehérje kúnutatásáhan. A kanéra urikáz M-terramaife része elleni ellenanyag előnyösen nem ismeri fel a pávián urikáz ri-terminállsát, és hasonló módon, a kiméra urikáz C-terminálisa ellem ellenanyag előnyösen nem ismeri fel a sertés urikáz C-terminálisák Még előnyösebben, a jelen találmány tárgyát olyan ellenanyagok képezik, amik specifikusan kötődnek a PSC-hez vagy PKS-hez, de nem kötődnek a természetes fehérjékhez, azaz például a sertés és/vagy pávián urikázhoz.

Egy másik megvalósítási mód szerint a jelen találmány tárgya egy gyógyászati készítmény előállítása, amivel a húgysav mennyiséit lehet csökkenteni a testfolyadékokban, azaz például a vizeletben és/vagy szérumban vagy plazmában, és ezek a készítmények legalább e^r, az alábbiakban ismertetett urikáz fehérjét vagy urikáz konjugálumot és egy gyógyászatilag elfogadható hordozót, higitószert vagy töltőanyagot tartalmaz,

A jelen találmány tárgyát képest továbbá, egy eljárás, amivel a húgysav .mennyiségét lehet csökkenteni egy emlős testiblyadékaiban. Az eljárás részét képezd, hogy egy emlősnek hügysavszint csökkentő hatással rendelkező mennyiséget adunk be egy készítményből, ami tartalmaz egy, a jelen találmány szerinti urikáz fehérjét vagy urikáz konjugátumot, valamint egy higitószert, bor«♦Φ ««* φ dozőt vagy töltőanyagot, ami előnyösen egy gyógyászatilag elfogadható hordozó, hígítőszer vagy töltőanyag. A kezelendő emlős yösen az em

A. beadási lépés lehet például intravénás, intradertnális, szubkután, Íntramuszkuláris vagy intraperitoneális injekció. A megemelt húgysav szintek lehetnek a vérben vagy a vizeletben,, és kapcsolódhatnak a kószvényhez, a köszvényes csomókhoz,, a vese-elégtelenséghez, a szervátültetéshez vagy á rosszindulatú betegségekhez.

Egy másik megvalósítási mód szerint a jelen találmány tárgya eljárás egy urikáz izolálására és/vagy tisztítására. egy urikáz oldatból, ami például celluláns -és szubcelluláris törmeléket tartalmaz például egy rekombináns előállítási eljárásból. Á tisztítási eljárás előnyösen kihasználja az emlős urikáz korlátozott oldhatóságát alacsony pH-η [Conley, TG., Priest, DG.: „Purificaíion of uricase from mammalian tissueh Preparaíive Siochemistry 9, 197-203 (.1979)), a nyers rekombináns kivonatot körülbelül 78,5-ös pH-η mosva, hogy ezzel eltávolitsuk a legtöbb olyan fehérjét, amik ezen az alacsony pH-η oldódnak, majd az aktív urikázt szolubilizáljuk egy púderben, előnyösen nátriumkarbonát puííerben, pH-10-12, előnyösen 10,2 -es pH mellett. A szolubilizált aktív urikázt azután anioncserélő oszlopra, azaz például egy Q Sepharose oszlopra vihetjük, amit alacsony-magas sótartalmú gradienssel mosunk, körülbelül 8,5-ös pH-η, majd a tisztított urikázt úgy kapjuk meg, hogy egy nátrium-karbonát pufferben .készített nátrium-klorid gradienssel eluáijuk, pH =10* <·*

11, előnyösen körülbelül 10,2, Az enzimet tovább tisztíthatjuk gélszüréses kromatográfiával, körülbelül 10-1 l~es pH mellett. Ebben a lépésben az enzimet tovább tisztíthatjuk, oly módon, hogy a pH-t 8,5-re, vagy alacsonyabb értékre állítjuk be, hogy szelektíven kiesapjuk az urikázt, miközben az oldhatóbb szennyezők oldatban maradnak, Alacsony pH~n (7-8) végzett mosás után az urikázt körülbelül 10,2-es pH-η szoluhílízáljuk. Az urikáz készítményt azután a gyógy szerkészítés során használt eljárásokkal elemezzük, azaz például nagynyomású folyadékkromatográfiával (HPLC)» más kromatográfiás módszerekkel, fényszórással, centrifugálássai és / vagy gélelektroforézíssel.

Az alábbiakban röviden ismertetjük az ábrákat.

1, ábra; SDS-merkaptoet.an.ol PAGE (12%-os gél) elemzése.

2. ábra: A természetes és PEGílezett PBC urikáz életideje a kermgesben.

3. ábra: Összefüggés a szérum urikáz aktivitása, valamint, a húgysav szérumban és vizeletben való koncentrációja között.

4. ábra: Az urikáz aktivitás keringési szintjének (szérumban mérve) fenntartása, ismételt ínjekciózás után,

5. ábra: A sertés-pávián, kiméra urikáz (PBC urikáz) (2. sz. szekvencia) és az R291K és T3Ö1 mutációkat tartalmazó sertés urikáz (PKS urikáz) (4, sz. szekvencia) kikövetkeztetett aminosav szekvenciája, a sertés (7. sz. szekvencia) és pávián (6. sz, szekvencia.) szekvenciákkal összehasonlítva.

6, ábra: Á PKS (4, sz. szekvencia) és a sertés (7, sz. szekvencia) urikáz aminosav szekvenciáinak összehasonlítása.

7, ábra: A PBC (2, sz. szekvencia) és a PKS (4. sz. szekvencia) aminosav szekvenciáinak összehasonlítása.

« »·*·*· '7 Ί

S. ábra: A PBC (2. sz. szekvencia) és a sertés urikáz (7. sz. szekvencia) aminosav szekvenciáinak összehasonlítása.

9, ábra: A sertés urikáz (7. sz. szekvencia) és a D3H (5. sz. szekvencia) aminosav szekvenciák összehasonlítása.

10, ábra. A PBC (2. sz. szekvencia) és a D3H (5. sz. szekvena.

ciaj aminosav sze

11- 1, és 11-2. ábra: A PKS (3. sz. szekvencia) és sertés urikáz cDNS-ek kódoló szekvenciáinak. Bestfit (GCG szoftver) öszszehasonhtása.

12- 1, és 12-2. ábra: A PKS (3. sz. szekvencia) és pávián urikáz (13, sz. szekvencia) cDNS-ek kódoló szekvenciáinak Bestfit (GCG szoftver) összehasonlítása.

13- 1. és 13-2. ábra: A PBC (1. sz. szekvencia) és sertés urikáz (12, sz. szekvencia) cDNS-ek kódoló szekvenciáinak Bestfit (GCG szoftver) összehasonlítása.

14- 1, és 14-2. ábra: A PBC (1. sz. szekvencia) és pávián urikáz (13. sz. szekvencia) cDNS-ek kódoló szekvenciáinak Bestfit

A jelen találmány tárgyát olyan urikáz fehérjék képezik, amik jól használható intermedierek az urikázok vízoldható polimerekkel, előnyösen a polietilénglíkolokkal vagy polietilénoxidokkal készített, javított urikáz konjugátumok készítésében. Az urikáz szakkifejezés a továbbiakban vonatkozik az egyedi alegységekre, valamint a természetes tetramerre is. hacsak külön nem említjük.

Bár az emberek nem termelnek aktív enzimet, az urikáz mRNS transzkriptumokat humán máj RNS-bői amplifikálták [Wu,

X., Muzny, DM., Lee, CC,. Caskey, CT.: „Two independent

ΦΦ* Φ # φ Κ φ Φ

Λ S » ♦ 4

ΦΦ ** mutational events in the loss of urate oxidase”, J. Mól. EvoL 84, 78-84 (1992)), Elméletileg lehetséges, hogy valamennyi humán urikáz transzkriptum lefordítódik; még akkor is, ha. a peptid-termékek nem teljes hosszúságúak, vagy instabilak·, ezek proceszszálhatók antigént prezentáló sejtekkel, és szerepet játszanak a. kezelésre használt exogén urikázra adott immunológiai válasz meghatározásában. Elméletileg lehetséges lehet a humán urikáz cDNS rekonstruálása és expresszálása, két nonszensz mutáció eliminálásával. Azonban a szelekciós nyomás hiányában nagyon valószínű, hogy az első nonszensz mutációk, bevitele óta eltelt évmilliók alatt káros értelmetlen mutációk akkumulálódtak a humán, génben (Wu, X., Lee, CC,, Muzny, DM·., Caskey, CTx „Urate oxida.se: Primary structure and evolutionary implications*, Proeeedings of the National Academy of Sciences, USA 86, 94129416 (1989); Wu, X.» Muzny, DM·.» Lee, CC., Caskey, CT.; „Two independent mutational events in the loss of urate oxidase”, J. Mól. Evői. 34» 78--84 (199.2)}, Nagyon nehéz lenne az összes mutáció azonosítása és ^kijavítása*, hogy megkapjuk a maximális katalitikus aktivitást és fehérje-stabilitást.

A jelen találmány szerzői tisztában vannak azzal, hogy erős homológra {hasonlóság} van a humán urikáz 'kikövetkeztetett aminosav szekvenciája és a sertés urikáz (körülbelül 86%) valamint a pávián urikáz .(92%) aminosav szekvenciája, között (a hasonlóság mértékére lásd például a 6-14. ábrát), míg a humán és az Asporpdám /luuus urikáz közötti homológia {hasonlóság} <40% [Lee, CC., Wu, X., Gihbs, RÁ., Cook, RG., Muzny, DM., Casket,

A $

: <

A *** ·# « m*

ΦϊΦ. φί V

CT.; „Generálion of cDNA dírected by amino acid sequence: Cloning of urate oxidase*» Bdenee 239, 1288-1291 (1988); Reddy, PCT, Nemali, MR,, Reddy, MK., Reddy. MN, Yuan_? PM., Yuen> Sx, Lafíler, TG. és mtsai; Jsolation and sequenee determinabon of a oDNA clone fór rat peroxisomal urate oxidase; Liver-specihe expression in the rat*_f Proceedíngs of the National Academy of Sdencea, USA 85, 9081-9085 (1988); Wu, X.» Lee, CC., Muzny, DM., Caskey, CT.; „Urate oxidase; Primary atruetuw and evolutionary implícations*» Proceedings of the National Academy of Sciences, USA BŐ, 9412-9416 (1989); Legpux» R., Delpech, Β.» Dumonl, X.» Guillemot, JC.> Rámond, P., Shire, D., Caput, D. és mtsai; „Cloning and expression ín Eseheriohío coli of the gene encoding Aepergddm /kuw urate oxidase*, Journal of Bíological Chemístry 267, 8565-8570 (1992); W«, X., Muzny, DM., Lee, CC., Caskev, CT,: „Two independeni mutációnál events in the foss of urate oxidase*, J. Mot Bwb 34, 78-84 (19152)). A jelen találmány tárgyát képezik a különböző emlősökből származó, rekombináns DNS technikával előállított Iáméra urikáz fehérfék, amiket úgy terveztünk meg, hogy az emberekben kevésbé tmmnnogének legyenek, mint a távolabbi kapesolafban levó gomba- vagy bakteriális enzim. Egy emlős urikáz származék használatától az várható, hogy betegek, mind orvosaik «•.ίΚίΦ.ί.;5χ·.<,Λχ iás JfxzA-xfr 4χ«$Χ&·λ.

A tapasztalai azt mulatja, hogy az aktíváit PBG-ek, azaz például antikét a FEG~ADÁ elfeOhtására» éa más fehérjék módosítására használtunk, az N-terminális csoport primer aminosav

U4 . Μ* ί '**♦ Μ csoportján keresztül (ha jelen van éz nincs blokkolva), valamint a lizinek epssálon-aminócsoportíam keresetül kapcsolódik. Bs a stratégia jól használható, mivel enyhe reakelokérülmények; alkalmazhatók, és mivel a pozitív töltésű felnek hajlamosak arra, hogy a fehérjék; felszínén foglaljanak helyet. Bz utóbbi fontos tény, mivel bármelyik terápiás fehérje esetében a PEGOezéz kívánt hatásai részben a PEG polimer jellemsöitói (azaz például tömeg, elágazó vagy nem elágazó struktúra, stfe»}, részben a fehérjében a PEG kapcsolódási pontjainak a fehérje fenkoiőját és kiürülését meghatároz eprtopokhoz és szerkezeti elemekhez viszonyított számától, és eloszláoátol függnek. Stratégiát tervestek ahhoz, hogy átkozzák a PEGilesésnek azt a .képességét, hogy „masskolja* az epitopokat és csökkentse az immunogenitást, a potenciális PEG hozzáadáshoz való új fein csoportok félig-saelektív bevitelével (Hershfíeld, MS., Chadee, S., Boro-dohnson, L», Mary, A., Santh, ΑΑ», Short, SAz „Use of site-directed nmtagenesis to enfeance tho epitope shieiüing elfed of novaiéul modifícaüon of proteiné with polyethyleue gíycol\ Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 88, 7185-7189 (1991)|.

Ez a stratégia mutagsuesűst használ a kiválasztott arginin kodonok fem totonnal való helyettesítésére, ami egy olyan helyettesítés, .ami megtartja a postüv töltést, és mudmáMs hatással vau a számítógéppel elére jelzett felszíni wlőszmüségte és antigenltásra (ami akkor hasznos,, ha csak az aminosav szekvencia ismert).

*$·

**** *** * * A »«« A

Érnek a stratégiának kísérleti vizsgálatához rekombináns kschehohin coli purin nufcleozid foszíorilázt h&onált&k p-lershbeld, MS,, Chafibe, S,_? K'oro-Johneon, L., Mary, A,, Smith, AA,, Short, SAo ^Use of síie-dlreeted mutagenesis to enhance the epltnpe shíelding efíect of covaleat moáificabon of proteins vdtb poiyetbylene glyeofi, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA BS, 7185-7189 (1991))» pontban hajtottak végre Arg-lya helyettesítést, o. halnék sietségenként! számát 14-ről 17-re növelve, anélkül hogy megváltoztatták volna a katalitikus aktMttst. A tía«Htott háromsoros mutáns megtartotta a teljes aktivitását, ha a. hozzáférhető NH§ csoportoknak kőntllmlnl 7Ö%~ át diszuktínlbFEGööOO-rel módosították, A reakeiöképez aininocaoportok PEöilezés előtt és után való titrálása art sugallta, hogy a. tripla mutáns alegységenként eggyel több FBG-et tud befogadni, mint a vad-típusú enzim. A FEGilczcs egerekben mind a vad-tipusú, mind a mutáns BFNF enzimek keringési idejét .kőrúlbeini 4 éráról több mint ú napra növelte. Egy sorozat intraperttoneálís injekció hetenkénti/kéthetenkénti beadása után az összes módosítatlan EFNF-vel kezelt egérben, a ! 6_S FBGilezett vad-tipusú EFNF-vel kezelt egérből 10-ben (60%) magas EPNP ellenanyag szint alakult kp és a. keringési életidő jelentősen leesőkként, Ezzel ellentétben a 12, mutáns PBG-EPNP-vel kezelt egérből, csak 2-ben (17%) lehetett, gyors kiürülést magágyéin!; az ezekben az egerekben megfigyelt alacsony ellenanyag szint nem korrelált a. keringési idővel Tehát ez a. stratégia sikeres abban, hogy lényegesen csökkenti az mtmuongenuusp még akkor is, amikor a 3 új lizlnhöl csak az egyik módosul az· aktivált FBG-gel való kezelés után.

A pávián és sertés urikáz alegységek 304 annnosavhő! áll nak, ezek közül 29 (azaz 10 csoportból körülbelül 1} Üzim A kezded kísérletek, amik során 2 Arg-Lys helyettesítést akartak bevinni a párián urikáz klónozott cDhS-ébe, valamint egy Lys-Glu helyettesítést a 206-as kodon pozícióban, amiről iámért, hogy a humán urikáz génben ez Lys-t kódok olyan expresszák pávián fehérjét eredményeztek, aminek nagyon erősen lecsökkent az urikáz katalitikus aktivitása, Bőből a kísérletből nyilvánvaló, hogy az emlős DNS szekvenciában az orgiáin lizinre való mutáltatása után az urikáz enzimaktivitás megtartanának képessége nem volt előre látható.

Ezt. kővetően, az nyilvánvaló volt, hogy a pávián urikázban a 291-ez aminosav csoport lízm, de a sertés urikázban az epitop csoport az arginim A mindkét cDNS-ben meglevő Apai restrikciós hasítási helyet használjuk ki olyan kiméra urikáz készítésére, amiben az elsó 225 aminosav a sertés eDNS-böi származik, es a 79 C-terminális aminosav csoport a pávián cDNS-ból származik. A kapott sertés -pávián kiméra (FBC) urikáz (2. számú szekvencia} 30 lizánt tartalmaz, eggyel többet, mint akármelyik „kiindulási” enzim. A FBC etikáznak egy további tulajdonsága, hegy «párián* része a. 79 aminosav csoportból négyben eltér a humán urikáztőh mig a sertés és a. humán urikáz ugyanannak a régiónak a 10~es pozíciójában tér el egymástők Ezután. a FBC módosított verzióját állítjuk elő, ami megtartja az extra hzi.o csőφ X * portot a 291-es pozícióban, és másképpen, csak annyiban tér el a sertés urikáztoi, hogy a 301-es pozícióban szerin helyett treonint tartalmaz („pigKS* urikáz, 4. számú szekvencia). Az előző fejezetben ismertetett eredmények fényében, aholis számos lizín inszerciónak káros volt a hatása az aktivitásra, az váratlan volt, hogy a PBC és PKS kiméra urikáz teljesen aktív, a mutálatlan természetes sertés urikázzal összehasonlítva, és körülbelül több mint négyszer aktívabb volt. mint. a nem-mutált természetes pávián un&az.

A jelen találmány tárgyát rekombináns sertés-pávián urikáz képezi, ami a sertés és pávián máj urikáz szekvenciák részeiből áll. Az ilyen kiméra urikázök egyik példája tartalmazza a -sertés urikáz szekvencia első 225 aminosavát (7. számú szekvencia), valamint a pávián urikáz szekvencia utolsó 79 aminosavat (6. számú szekvencia) (sertés-pávián urikáz, vagy PBC urikáz; 6. ábra és 2. számú szekvencia). Az ilyen kiméra urikáz egy másik példája tartalmazza a sertés szekvencia első 288 aminosavát (7. számú szekvencia), valamint a pávián szekvencia utolsó 16 aminosavát (6. számú szekvencia). Mivel az utóbbi szekvencia csak két pozícióban tér el a sertés szekvenciától, azaz a 291. es pozíció lizint (K) tartalmaz az argínin helyett, és a 3öl-es pozícióban szerint (S) tartalmaz treonin helyett, ezt. a mutánst sertés-KAS vagy PKS urikáz néven említjük.

A jelen találmány tárgyát képezik továbbá a jelen találmány szerinti fehérjéket kódoló nukieinsav molekulákat tartalmazó vektorok is (expressziós és klónozó vektorok). Az előnyben részesített vektorok közé tartoznak az alábbiakban példaként megadott vektorok ís. A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy a nukleinsav molekulák beépíthetők egy expressziós vektorba, azaz például egy plazmidha, az expressziéhez megfelelő orientációban és helyes leolvasási fázisban. Ha szükséges, akkor a nukleinsav (DNS) a kiválasztott gazdaszervezet által, felismert, megfelelő transzkripciós és transzlációs szabályozó··szekvenciákhoz kapcsolható, bár az ilyen szabályozó elemek általánosan hozzáférhetők a szakterületen használt és ismert expressziős vektorokban. Á vektort azután standard technikákkal juttathatjuk be a gazdasejtekhe. A vektor általában nem transzformálja az összes gazdasejtet. Ezért szükséges lehet a transzformált gazdasejtek kiválasztása. A szakterületen ismert egyik ilyen szelekciós eljárás abból áll, hogy az expressziós vektorba egy olyan. DNS szekvenciát építünk be, bármilyen szükséges szabályozó elemmel, ami a transzformált sejtben egy szelekciós markert, azaz például antibiotikum rezisztenciát kódok Egy másik változat szerint egy ilyen szelekcióra alkalmas tulajdonság génje lehet egy másik vektorban, amit. a kiválasztott gazdasejtek ko~transzformálására használunk. A vektorok tartalmazhatnak emellett egy megfelelő promotert, azaz például egy prokarióta promotert, ami képes a DNS expresszálására (transzkripció és transzláció), a vele transzformált bakteriális· gazdasejtben, azaz például Eschénchfo eoli-ban. A szakterületen számos expressziós rendszer ismert és beszerezhető, beleértve a. bakteriális (például SschericAtn eok és Boeidu.s snhdásh élesztő (például * »*«

-29 A * V

0 X «

X X

XXX x 0 0 X

Vp

Saccharompces corewésiae), fonalas gomba (például Aspergfi/kzs), növénysejt, állati sejt és rovarsejt expressziös rendszereket,

A megfelelő vektorok tartalmazhatnak egy prokariőta replikont, azaz például a ColE 1 ori-t, hogy egy prokariótában lehessen szaporítani. Tipikus prokariőta vektorplazmid például a pUC18, a pUC19, a pUC322 és a pBR322, amik beszerezhetők a Biorad Láboratories-tó) (Richmond, CA) és a pTer99 valamint a pKK223-3, amik. a Pharmacia-től szerezhetők be (Piscataway, NJ), Egy tipikus emlős sejt vektorplazmid a pSVL, ami a Pharmacia-től szerezhető be (Piscataway, NJ). Ez a vektor az SV4Ö késői promotert használja a klónozott gének meghajtására, és az expresszié legmagasabb szintje aT antigént termelő sejtekben, azaz például a COS-'l sejtekben található meg. Az indukálható emlős expressziős vektor egyik példája a pMSCk ami szintén a Pharmacia-tól szerezhető be. Ez a vektor az egér emlőtumor vírus hosszéi terminális ismétlődő szakaszának glükokoriikoiddal indukálható promoterét használja a klónozott gén expressziójának meghajtására. A jól használható élesztő plazmid vektor a pRS403-4Ö6 és a pRS413-416, ezek általában a Stratagene Cloning Systems-tői (LaJolla, CA) szerezhetők be. A pRS403, a pRS4Ö4, pRS405 és pRS406 plazmid integrálódó élesztő plazmidok (Yíp-k), és tartalmazzák az élesztő HXS3, TRPI, LEU2 és L/KA3 szelekciósmarkereket. A pR'S413-416 plazmidok élesztő centroméra plazmidok (Ycp-k).

Emellett a jelen találmány tárgy az ezeket a. vektorokat tartalmazó gazdasejtek képezik. Az előnyben részesített, gazdasejtek ♦ ** •30

-Φ **«* ·»«4Χ » » « ΐ Φ» X «· ♦ ΐ * *:φ:«< Φ ν St *Φ»«

Φ » χ Φ X « Φ X φ közé tartoznak az alábbiakban ismertetett és példaként megadott gazdasejtek.

A jelen találmány szerinti urikáz fehérjéket egy biológiailagstabil, atoxikus, kovalens kötéssel konjugáltathatjuk viszonylag kisszámú PEG szálhoz, hogy ezzel javítsuk a fehérje biológiai féléletidejét és oldhatóságát, és csökkentsük .immunreaktivitását. Az ilyen kötés lehet uretán (karbamid) kötés, szekunder aminkőtés és amidkőtés. Az ilyen konjugációhoz alkalmas különböző aktivált PEG-ek kereskedelmi forgalomban beszerezhetők a Shearwater Polymers-töl (Huntsyille, AL).

A jelen találmány tárgyát képezi továbbá az urikáz fehérjéket konjugátumokként tartalmazó gyógyászati készítmények előállítása, Ezek a konjugátumok lényegében nem-immunogének, és a módosítatlan enzim húgysavoldó aktivitásának legalább 70%-át, előnyösen. 80%-át, és még előnyösebben legalább körülbelül 90%-á.t megtartják. A jelen találmányban használható vízoldbató polimerek lehetnek lineáris és elágazd poiíetiiénglikolok vagy pohetílénoxidok, amik mind PEG néven ismertek. Az 5,643,575 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban ismertetnek egy példát az elágazó láncú PEG-re,

A jelen találmány egyik megvalósítási módja szerint az urikáz alegységekbe bevitt lizinek átlagos száma 1 és· lö között van. Egy előnyben részesített megvalósítási mód szerint az urikáz alegységekbe pluszként bevitt lizinek száma 2 és 8 között van. Az nyilvánvaló, hogy a pluszként bevitt lizinek száma nem lehet

-U annyi, hogy az elrontsa az urikáz katalitikus .aktivitását. A konjugátum PEG molekulái előnyösen az urikáz fehérje lizinjein keresztül konjugálódnak, még előnyösebben egy nemtermészetes Uzinen, vagy lizineken keresztül, amiket: egy tervezett fehérjének egy olyan részébe juttatunk be, ami természetes állapotában nem tartalmaz· lizint az adott pozícióban. A jelen találmány tárgya eljárás a hozzáférhető, nem káros PEG kapcsolódási helyeknek egy urikáz fehérjéhez való kapcsolódására, amely természetes urikáz fehérje úgy van elmutáltatva, hogy legalább egy lizíncsoportot juttattunk be. Ez az eljárás előnyösen magában foglalja az argininek lizinnel való helyettesítését.

A jelen, találmány szerinti PEG-urikáz konjugátumok jól használhatók a húgysav szintjének (azaz mennyiségének) csökkentésére emlősök, előnyösen emberek vérében és/vagy vizeletében, ezért tehát, használható az olyan állapotokhoz, mint például a kőszvény, köszvényes csomók, vese-elégtelenség, szervátültetés, és rosszindulatú betegségekhez kötődő megemelkedett hügysavs zi n t ke ze 1 é sere.

A PEG-urikáz konjugátumokat túl magas húgysav szinttel rendelkező emlősökbe számos különböző módon juttathatjuk be, beleértve az orális, heöntéses vagy kúpos, intravénás, szubkután, intradermálís, mtramuszkuláris és intraperitoneális módokat patton dS. és mtsai: Adv. Drug Delivery Rév. 8, 179-228 (1992)i.

A PEG -uríkáz hatékony dózisának nagysága függ a húgysav szintjétől, valamint az alany méretétől. A jelen találmány egyik megvalósítási módja szerint a PEG-urikázt egy gyógyászatilag el•52 ·

Φ Φ ΦΦΦΛ Φφ*φ «

Φ ΦΨ φ χ φ * Φ « Φ X Φ φ φ χ

ΧΦΦΧ X * χ «»»(

Φ XXΦ ΦΦΦ φ φ fogadható hordozóban vagy töltőanyagban adjuk be, 10 gg-töl körülbelül 1 g-ig terjedő .mennyiségben. Egy előnyben részesített megvalósítási mód szerint a beadott mennyiség körülbelül 1Ö0 gg és 500 mg között van. Még előnyösebben,, a konjugált urikázt. 1löö mg közötti mennyiségben adjuk be, azaz például 5, 2’ vagy 50 mg-ot. A megvalósítási módokban megadott dózisméretek a konjugátumokban levő fehéjje mennyiségét jelentik.

A PEG-urikázt tartalmazó készítményeket hagyományos technikákkal állíthatjuk elő, azaz példáid a Remingtonh Pharmaceutical Sciences 1985 -Ös kiadásában '(Easton, PA, Mark Pnhiishing Co.) ismertetett technikákkal. Az injekciózható oldatokhoz használható töltőanyag lehet például a foszfáttal puffereit sőoldat, a laktőzos Ringer oldat, a víz, a poliplök és a. glicerin. A parenterális injekciőzáshoz használható gyógyászati készítmények tartalmaznak gyógyászatilag elfogadható steril vizes vagy nem-vizes folyadékokat, diszperziókat, sznszpenzíókat vagy emulziókat, valamint felhasználás előtt steril injekciózható oldatokká vagy diszperziókká alakítható steril porokat. Ezek a kiszerelési formák tartatmo.zhat.nak további komponenseket is, azaz például konzerválószereket, oldatba, vivő anyagokat, stabilizálöszereket, emulgeálószereket, puffereket, antloxidánsőkat és higítószereket.

A PEG-urikázt biztosíthatjuk, szabályozott felszabadulásit készítmények formájában is, egy egyedbe beültetve, hogy folyamatosan szabályozzuk a megnőtt hügysav-szintet a vérben és a vizeletben. Például a polítejsav, poliglikoisav, regenerált hollaφ χ '· — _: * φ *»*******

-ο - Μ- 1::> / Μ>

gém pGli-t-lizm, nátrium-alginát, gellanguml, Idtozán, agaróz, mnldlamelláris liposxőmák és számos más, hagyományos depó készítmény tartalmaz biológiailag elpusztítható vagy lebontható anyagokat, amiket a biológiailag akhv készítményekkel formuiázhatunk. Ezek az anyagok, ha beültetjük, vagy injekciózzuk őket, akkor fokozatosan lehomlana, és a hatóanyagot a környező szövetekbe bocsátják fch A PEG-urikáz komplexek kapszulázására az egyik módszert például az 5,653,974 számú Amerikai Egyesült AUrnnok-beü szabadalmi leírásban ismertetik, amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk, A biológiailag elpusztítható, biológiailag lebontható és más depó készítmények kifejezetten a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak, A PBGuríkáz bejuttatására használt infúziós pumpák és más mátrixcsapda rendszerek is a. jelen találmány oltalmi kóréhe tartoznak.

A PEG-urikázt emellett mieellákba vagy Oposzómákba zárhatjuk,

A szakterületen jól Ismeri a liposzőmába zárás technikája (Basic,

D, és munkatársai (szerk,): Stealtb hiposontes, Boea Raton, Eh,

CRC Press (19956

Az itt ismertetett PBG-nrikáz gyógyászati készítmények csökkentik a hemodializis iránti igényt az urát által indukált vese-elégtelenzéghen (például szemátültetéses betegek esetéhon) szenvedő betegekben (Venkataseshan, VB, és mtsai: Rephron 56,

317-321 (1990)), valamint néhány rosszindulaté betegségben, szenvedő betegekben, A nagymennyiségű kristályos búgysavai felhalmozó betegekben (Részvényes csomók), az ilyen, gyo^úszsri *> «4* * **** * * « * * •χ Ψ χ ,$· χ.

*»** >ί * * $ ❖ **$ * <** * készítmények gyorsabban javítják az étet minőségét, mint a jelenleg hozzáférhető készítmények.

Az alábbi példák csak a. jelen találmány különbőzé aspektusait illusztrálják» és semmiképpen nem korlátozzák a találmány oltalmi körét

1. Példa

A;_APBC^PKSJsmtourtteOíMLtemtfee

Az ossz-eellnláris RH8 készítéséhez, az urábonidás cDNB poitmerás lánoreakclós ampbfikMásboz standard módszereket, és ahol ez elfogadható volt, ott a reagensek előállítóinak utasításait használtuk (a 4,683,195 és a 4,6BB,502, 4,965, 136 valamint 5,075.,316 számű Amerikai Egyesült Ákamok-beb szabadalmi leÍrás), valamint, ezeknek a. szekvenciáknak a klónozásához ez seekvenálásához (EHieh, HA.: PCR Technology, Principtes and applieahons for DNA amphfemticn, Stoefcton Press, New York (1989); Smnbrook és mtsai: Molecular Cloning: Ά laborafory Manuah 2. kiadás, Cold Spring Harbor Press, Coki Spring Harbor, KY. (1989); Current Protocois in Molecular Biology, sserk.: Ausubel és mtsai, Greene Pnblishing és Wileylutersdenee; New York (1957))« A sertés és párián urátoaidázokboz (1, táblázat) a polimeráz láncreateö prím ereket, a publikált· kódoló szekvenciák alapján |Wn, X,, Lee, CC,, Muzoy, DM., Caskoy, CT.: ^Urate onldase: Prbnary structure and evolutíonary Impíieabonsh Proceedíngs of the National Academy of Sciences, USA 66, 9413-9416 (1959)), a PRIMB számitógépes kp *»»*

-Λ program segítségével (Geneücs Computer Group, Inc.) terveztük meg.

1. Táblásat

Prímetek as utáforoddáz cDNS axnpUfíkálázáhez értelmez szál: 5 'gcgcgaattecÁTGGC'fCATFACCGTAATGACT ACA3' antíszensz szab

Sge^tntagnngmtoeM<CACAÖCClTGAACTCAGC3^x

1Ü5^ értelmi aotízzenzz szab

SgcgeeeatwtctagaTCACACrrCTrGAAGACAACTrCCT

A primerek végére bevitt restrikciós enzim hasítási helyek (kisbetűs rész) értelmes (sertés és pávián) BeoRí és Néni; antiazensz (sertés) Néni, Hindui, Xfeal; anbszensz (pávián) BcoL. Az értelmes pávián primer esetében a pávián urát-oxidáz szekvenciában ^Wu, X, Muzny, DM-, Lee, CC., Caskey, CT.; „Two independent mntatienal events in the foss of urate usddase% d; Mot Bvob 34, 70-04 (i992)| a harmadik, GAC (aazpartát) kodont CAC Radonnal (hisztidín) helyettesítjük, ami egy olyan kodon, ami a humán urái-roádáz |»Bud<^rI^n található ebben a póztdóban (Wn, X-, Muzny, DM., Lee, CC., Cazkey, C?.; Jw mdependent mutationnl events in the foss of urate wddase®, d. Meb Bvób 34, 70-04 (1992)). Bonnit az ezekkel a primerek hasanálatával előállított, pávián urát-oxidázokat D3H pávián urátoaádáznak neveztük .

A -sertés- ás páviánmájból származó össz-eellulárís RNS-t reverz transzkripcióba vittük, egy 1. szál kit alkalmazásával (Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, Ndj. A Taq DNS polimerázzal (GibcoBRL, Life Technologies, Gaithersburg, MD) végzett polimeráz Iánereakciós amplifíkálást egy PCR berendezésben hajtottuk végre (Ericomp, San Diego, GA), az alábbi program szerint:. 30 másodperc 95 °C, 30 másodperc 55 °C, 60 másodperc 70 °C, 20 ciklusban, majd 10 ciklusban az alábbi programot alkalmaztuk: 30 másodpere 95 °C, 60 másodperc, 70 °C. Az urátoxidáz polimeráz- Iánereakciós termékeket EcoRI és Hindin -restrikciós enzimekkel emésztjük, majd pVC 18-ba. klónozzuk .(sertés), majd szintén közvetlenül klónozzuk (sertés és D3H pávián), a TA klónozó rendszer alkalmazásával (Invitrogen, Carlsbad, CA). A cDNS klőnokat BscAerichta coS XLIBlue törzsbe transzformáljuk (Stratagene, ba .Jolla, CA)> Klónozott urikáz cDNS-t tartalmazó plazmid DNS-t készítünk, és a cDNS inszertet standard didezoxi technikával elemezzük. A publikált urá.t oxidáz DNS kódoló szekvenciát tartalmazó klőnokat (kivéve a pávián urá't-oxídázban az· 1. táblázatban ismertetett D3H helyettesítést) állítunk elő, majd egy sor további lépésben igazoljuk, standard rekombináns DNS módszerek alkalmazásával,·

A teljes hosszúságú kódoló szekvenciákat tartalmazó sertés és D3H pávián cDNS-ekef pET expressziós vektorokba juttatjuk be (Novagen, Madison, WI), az alábbiak szerint. A D3H pávián » *·» ’»* »»»»

Ö B* Φ * 5f <· X Φ * Φ

ΦΜΦ * Φ Φ φ4»φ » ♦«»«»« « 9 urikáz eDNS~t NcóI és BamHI restrikciós enzimekkel kivágjuk a TA plazmidböl, majd a pET3d és a pET9d expressziós plazmidok Ncol és BamHI restrikciós hasítási helyére szubklőnozzuk. A teljes hosszúságú sertés urikáz cDNSt EeoRJ és Hindin restrikciós enzimekkel kivágjuk a pUC plazmid klódból, majd a pET28b pl&zmid EcoRí és Hindii! restrikciós hasítási helyeire szubklónozzuk. A sertés cDNS kódoló régiót is bejuttatjuk a pET9d expressziós plazmid Ncoí és Blpi restrikciós hasítási helyeire, a pET28h plazmid Ncoí és Blpl restrikciós enzimekkel való emésztése után,

A sertés-pávián kiméra (PBC) cDN-S-t úgy állítjuk elő, hogy a D3H pávián urikáz 624 házispár méretű Ncoí-Apai restrikciós íragmensét kivágjuk a pET3d-D3H-pávián klánból, majd ezt a pávián szegmens! a sertés cDNS megfelelő 624 bázispár méretű Ncol-Apal restrikciós fragmensével helyettesítjük, A kapott PBC urát-oxidáz cDNS tartalmazza a sertés urát-oxidáz 1-225-ös kodonjait, leolvasási keretben a pávián urát-oxidáz 226-304 es kodonjaíhoz kapcsolva.

A sertés-KS urát-oxidáz (PigKS) eDNS-t úgy állítjuk, elő, hogy a D3H pávián urikáz 864 bázispár méretű Ncoí-Ndeí restrikciós íragmensét kivágjuk a p.ET3d~D3H pávián klánból, majd ezt a D3H pávián szegmens! a sertés cDNS megfelelő 864 bázispár méretű Ncol -Ndel restrikciós fragmensével helyettesítjük. A kapott PKS urát-oxidáz cDNS tartalmazza a sertés urátoxidáz 1-288-as kodonjait. leolvasási keretben a pávián urátoxidáz 289-304-es kodonjaíhoz- kapcsolva., ” *«

X

X

X

X

X

X X

XXX X

-38 X Χχ xxx

X XXX# «ΐ*4 X XX X X <.

X ΨΧΧ w χ χ

X χ # «XXX

XXX xxx * χ

A D3H pávián, a sertés, a PBC és PKS urát-oxidáz aminosav szekvenciáit az 5> ábrán., és a szekvencia-listában, mutatjuk be. Standard technikákat használtunk ezeknek a transzformánsoknak 15%-os glicerinben készített törzstenyészete előállítására, majd ezeket -70 °C-on tároltuk. Amikor mindegyik fajtái expresszá.liuk, és a rekombináns enzimeket izoláltuk (2. táblázat), a sertés, a PBC kiméra és Píg&S uríkázok nagyon hasonló specifikus aktivitással rendelkeztek, ami körülbelül 4-5szőr magasabb, mint a rekombináns pávián urikáz specifikus aktivitása. Ezt a megfigyelést számos más kísérletben igazoltuk. A különböző eljárásokkal készített PBC urikáz specifikus aktivitása 2-2,5-szeres tartományban változott.

2. Táblázat

*A fel	férjét a Lowry módszerrel határozzuk meg. Az urikáz aktív! -
tást	spektrofotometriásán határozzuk, meg [Priest, DG, Pitts,
OM.;	^Reactio.n íntermediate effeets on the spectrophotometric
urica	se assayAnalytical. Biochemístry 59. 195-205 (1972)/ A

« φφ

Φ Φ χ ΦΦ vizsgálatot 23-25 °C~on hajtjuk végre, 1 ml reakcióelegyet ~·0, 1 mol./l nátrium-bórát, pH^::::8,6, ö, 1 mmol/1 hűgysav) tartalmazó 1 cm-es kvarc követ tában. A hágysáv eltűnését azzal követjük, hogy figyeljük az elnyelés csökkenését 292 nm-en. Egy nemzetközi egység (NE) urikáz egy mikrontól húgysav eltűnését katalizálja percenként.

A 2. táblázatban bemutatott 4 urikáz cDNS-pET konstrukció Esehen'dna coli BL21 (DE3)pLys transzíbrmánsait szelektív antibiotikumokat (karbenicillint és kloramfenikolt a pET3d (pigKS); 'kanamicint és kloramfenikolt a pET9d; (PBC, sertés, pávián)) tartalmazó LB agaira szélesztjűk, a pET System Manna! szerint (Novagen, Madison, Wl), 5 ml-es tenyészeteket (Lö· plusz antibiotikumok) oltunk be egyes transzformált telepekkel, majd 3 óra hosszat 37 °C~pn szaporítjuk. Ezután 0,1 ml-es alikvot részeket viszünk át 108 ml, szelektív antibiotikumokat és 0,1% Íaktózt (az urikáz expressziőjának jelzésére) tartalmazó LB táptalajra. Éjszakán át 37 ^eC-on szaporítjuk, majd a tenyészet 0,5 ml-es alikvot részéből származó hakté Hámsejteket SDS-PAGE íelvivö pufferrel kivonatoljuk, és SDS-p-merkaptoetanol PAGE-val elemezzük; ezzel megállapíthattuk, hogy az urikáz fehérje összehasonlítható szintjei expresszálódtak mind a 4 tenyészetben (nem közölt eredmények), A 100' ml-es tenyészetekben megmaradt sejteket centrifugáljuk, majd foszfáttal púdereit sőoldattal mossuk. A sejteket azután reszuszpendáljuk 25 ml 1 mmol/1 AEBSE proteáz inhibitort (Calbiochem, San Diego, CA) tartalmazó, foszfáttal púdereit 'sóoldatban (ρΗ^Τ,Λ), majd jégen lizáltatjuk egy *** *

Bacterial Ceö Diaruptorfoan (MioroOuidícs, Boston, MA). Ás oldhatatlan anyagot (beleértve az urikázt) centrifugáival ülepítjük (2019O*g, 4 °C, 15 perc). As üledékeket kétszer mossuk 10 ml foszfáttal pnfferelt söoldattal, majd éjszakán át 4 ^C-on 2 ml 1 mol/i RmCOs-tal eztratiáljuk (pH -10,2). Á kivonatokat 10 ml-re hígítjuk viszek majd újra centrifugáljuk <2öl9Og, 4 Ál, 15 pere). Ezután meghatározzuk az urikáz aktivitást és a fehésje-koncentráeíét

2. »fe

Rekom bioén s P.BCurikáz . ezpreessióia.....és izolálása.....(4 literes

A pET3d-FBC urikáz transsformánst karbenielllmt és kioramfotnfcolt tartalmasé glicerines térzstenyészetbdl LB ag&riemezre szélesstjük, a. Novagen pBT System Manual szerint Egyetlen telepből kiindulva 200 ml-es oltóanyagéi készítünk LBantiblotíknm táptalajban, forgó rásbn (250 per pere fordulatszámmal), 37 ®€-on, a pBT System Mannákban ismertetett módón, hogy maximalizáljuk a pET piasmld retenciöját. 2,4-es ÖDau értéknél ebből a 200 mhes tenyészetből centrifugalással Összegyűjtjük a sejteket, majd 50 ml friss közegben szuszpendőljük. Ezt a zzuszpenzíót nagysűn'teégú fennentorha. visszük át, ami 4 liter, ksrixmieifont és kloramfonikolt tartalmasé SFBH táptalajt tartalmaz (az SEBB táptalaj összetételéi, és a fermentor tervezését valamint működtetését a szakirodalomban ismertették) jSadler, JP., Mává, J., Maas, O., Smiih, T.; „Growth of high « φ·..>

S Φ Φ ίί«« Φ * χ ¢- * φ X •ί » * *«« Φ Φ <

<ΨΦ'« * * #' ·' «#«« φ »»<Φ φφ* (ί density baeteríal cultures; a simple device”, Lahoratory Practice 23, 632-643· (1974)). Hűszőrás, oxigénatmoszférában, 32 °C-on végzett növesztés után (ODsss-lS), 0,4 mmol/l izopropil-βtiogalaktopiranoxidot (IPTG) adónk hozzá, az urikáz termelésének indukálására. További 6 óra elteltével (0Dsas~37)> & baktériumsejteket centrifugálással összegyűjtjük (lG41Ö*g, lö perc, 4 ^eC), egyszer mossuk foszfáttal pufíerelt sóoidattal, majd -20 °C-ra le hűtve tároljuk.

A baktériumsejteket (189 g) 2ÖÖ ml PBS-ben reszuszpendáljuk, majd jeges/sós fürdőbe bebütve ultrahangos besugárzással lizáltatjuk (Heat Systems Sonicator XL., prohe model CL, Farmingdale, NY), 4x40- másodperces impulzusokat használva 100%-os intenzitással, az impulzusok között egyperces szüneteket tartva, A foszfáttal puffereit sóoldattoan oldhatatlananyagot (amibe beleértjük az urikázt is) centrifugálással összegyűjtjük (10410xg, lö perc, 4 °C), ötször mossuk 200 ml foszfáttal puffereit sóoidattal. A foszfáttal puffereit sóoldatban oldhatatlan urikázt 80 ml 1 mól/Ι NaaCOs-toa extraháljuk (pH™ 10,2, ami 1 mmol/l fenílmetilszulíonílfluoridot (PMSF) és 130 pg/ml aprotinint tartalmaz). Az oldhatatlan törmeléket centrifugálással eltávolítjuk (2019Ö*g, 2 óra, 4 °C)t A tisztítás összes további lépe sét 4 °C-on hajtjuk végre (az eredményeket a 3, táblázatban foglaljuk össze).

A pH~lÖ,2-es kivonatot 1800 ml-re hígítjuk 1 mmol/l fenilmetilszulfonilfluoridot (PMSF) tartalmaző oldattak hogy a N&2CO3 koncentrációiát 0,075 rnol/l-re csökkentsük. Ezt 'visszük * ·* « $4 ¥· « *# ÍC ί $ ·» Φ 4 *Κ·3Ϊ φ ¢- φ **»* Φ φ 4 4« »4 * Χ'ΦΦ Φφφ « egy friss Q-Sepharose (Pharmacia Bioteeh, Inc., Piscataway, .AU) oszlopra (2,6* 9 cm), amit Ö.Q75 mol/1 NaaCXA-tal (ρΗ= 10,2) hoztunk egyensúlyba, A felvitel után az oszlopot egymás után mossuk a következő oldatokkal: 1) 0,075 mol/1 N&aCOs, pH™ 10,2, ameddig az elfolyó oldat Aaso értéke visszaáll az- alapszintre; 2} .1.0 mmol/.l NaHCÖa, ρΗ^:-8,5_? ameddig az elfolyó oldat pH-ja 3,5-re esik vissza; 3) 50 ml 10 mmol/1 NaHCOg, pH™8,5, 0,15 mol/1 nátriúm-klorid; 4) 100 ml-es gradiens, aminek az őszszetétele 0,15 möl/.l. nátrium-kíoridtől 1,5 mol/1 nátrium-kíoridig változik, 10 mmol/1 NaHCOa oldatban, pH«8,5; .5) 150 ml 10 mol/1 NaHCOí, pH~8,5, 1,5 mol/1 nátrium-klorid; 6) 10 mmol/1 PlaHGOs-, pH™8-,5; 7) 0,1 mol/1 NaaCCA, pH~l.l , ameddig az-elfolyó oldat- pH-ja 11-re emelkedik. Végezetül az urikázt eluáljuk -egy 50Ö ml-es gradienssel, aminek az összetétele O-tól 0,6 mol/1 nátrium-kíoridig változik, 0,1 mol/1 MaaCOa-ban, pH™ 11. Az aktivitás két Aaso abszorpciós csúcsban eluálódik, amiket külön gyújtunk (A és B frakció, 3. táblázat). Az urikázt mindkét pool-ból kicsapjuk, a. pH 7,1 -re csökkentésével, amit. úgy érünk, el, hogy lassan 1 mol/1 eeetsavat adunk hozzá, majd centrifugáljuk (7000 *g, 10 perc). A kapott üledéket 50 -ml 1 mol/1 Na^C-Os oldatban (pH^:::10.2) oldjuk, majd 4 ^;'C-on tároljuk.

j '^ **» *w* •Φ *

*

3. Táblázat

Rekombináns sertés-párián kiméra (PBC) urikáz tisztítás

Az IFTG-vel indukált sejtpaszta súlya 139,6

Frakció	1 H	Urikáz aktivitás B/ml	össz- urikáz egység	Specifikus aktivitás E/mg
pH-7 szonikátum rpH7~ez mosás			74,9
pH-10,2 kivonat.	4712	82/7	ÍÍ,17Ö	2,4
Q-Sepharose A frakció B frakció	820 18Ö9	11,5 31,7	1081* 4000	í> 2,4
pH-7,lCxi ki- csapva és újra oldva A frakció B frakció	598 1586	: 35,0 75,5	1743 3778	8,0 2,4
Telje kinyerés	2184		5521

*As A frakcióban levő urikáz spontán elkezdett kicsapódni, az oszlopról való leoldódás- után. Ennek következtében a tiaztitáZ nak ebben a lépésében a. méri aktivitást alábecsültük.

A rnkombmáns.,PB€...urikáz előállítása és dsztitása kis roeonylségben

Ebben a példában azt íantatjuk be, hogy a tisztított rekombináns PBC urikáz használható PBGilezett urikáz előállítására. Ebben a reakcióban mindegyik urikáz alegységet .módosítottuk (1. ábra, 7-es sáv), a katalitikus aktivitás körülbelül 6Ö%ának visszatartásával (4. táblázat) .

ASC

...h .ablhl

Az Edeharicbfo coS Bb21(DE3)plys pETSd-PBÜ ckWS-sci transzformált törzsének négyliteres tenyészetét forgó rázón inkubáljuk (230 per perc fordulatszám), 37 ⁰C-on. OD^s^t),? értéknél a tenyészetet 6 éra hosszat 0,4 rámol/1 i.zopropi!~fk tiogalaktopíranoziddal (IPTG) indukáljuk. A sejteket begyújtjuk, majd -20 Árion lefagyasztjuk. A sejteket (15,3 g) lefagyasztás-felolvasztás váltogatásával tárjuk fel, majd 1 mol/i AkicCCfo pH*» .10,1, 1 mmol/l fenihnetilszulfoniiSuorid összetételű oldattal extrabáljnk. Ceráriíugálás után (12000^xg, 10 pere, 4 °C) a SS ml felülűszót IriO arányban hígítjuk vízzel, majd Q-Sepharose oszlopon kromatograíoljnk, ahhoz hasonlóan, mint amit az 1. példában leírtunk. Az abból a lépésből származó egyesített urikáz aktivitást túlnyomásos ultraszüréseel töményitjük, egy PM30 membránt használva (Amieon, Beverley, MA). A koneent.rátxnnot Sephaeryl S-200 oszlopon (2,5^χ 100 cm) (Pharmacia Biotech, Inc.., ♦«* * S « -S « φ » * «*«-.«' * φ *

**·* φ

í

Pfec&taway, NJ) kromatografáljuk, amit előzőleg 0,1 mol/l

Na^COs-tal (pH^ 10,2) hoztunk egyensúlyba. Az urikáz aktivitást tartalmazó frakciókat egyesítjük, majd az előzőkben ismertetett ϊ,ϊ,

ΨΫ φφφ módon túlnyomásos ultraszűréssel töményítjük,

B. PEGÍfezés

100 mg töményített Seph&cryl S-2ÖÖ PBC urikáz 0,1 mol/l NagCOs, plfelü_s2 oldatban készített oldatát (5 mg/ml, 2,9 mikrontól enzim, 84,1 mikromol bán) hagyjuk reagálni FBG egy aktíváit formájának kétszeres feleslegével (mól PEGtmŐl urikáz Ibinek), 4 *C~on, 60 percig. A PEGtaett urikázt tangendális áramlású ultmszüréssel megtisztítjuk minden reagálaöan, vagy hidrolbált PBG-től. Ebben a lépésben a reakcióeiegyet 1:10 arányban hintjük 0,1 mol/l NaaCCh, pH** 10,2 oldattal, magi diafiltráljuk 3,5 térfogat 0,1 mol/l HagCOs, pH»⁸10,2, majd 3,5 térfogat 0,05 mol/.l nátriumfoszfát, 0,15 mol/l nátrium-klorid, pHösszetételű oldattal szemben, A szűréssel sterilezőit enzim legalább egy hónapig stabil 4 *C~om

ΧΦΦΦ φ φ * φ φ · # φ φ

Φ tf

Φ

5ϊ φ Φ'φ X φ ΦΧ* XΦΦ

Φ Φ ΦΦΦΧ

Az L ábrán a rekombínáns sertés-pávián kiméra (FBC) un kéz tisztítása és FBGkezése során kapott frakciók SlAS-pmerkaptoetanoíoe PAGE (12%-os gél) elemzését láthatjuk. Sávok: l™ molekulasúly markerek; Ősz mdukákitlsn, pETSd-PBÜ cDNS-sel transzformált Bsekeneám eoá BL21 (DE3}ptysS sejtek

S'^v'· *

··* ?

«0X0 X-S0 0 X * 0 X *00 0 0 «

X * 0 0 0 0' X

SDS extraktuma; 3^::::az izopropil~(bl:iogalaktopiranoriddal indukált pET-PBC cDNS-sel transzformált aejtek SDS extraktuma; 4~ nyers kivonat (lásd 5. táblázat) SDS eztraktuma; 4^:::- nyers kivonat (lásd 5, táblázat); SKöménylieit Q-Sepharose urikáz poci; 6~ tömény? tett Sephacryl S-200 urikáz pno.1; 7«PEGüezett Sephaeryl S-200 rekombináns PBC urikáz.

A 4. táblázatban bemutatott eredmények azt mutatuk. hogy a tisztított PBC urikáz módosítható a katalitikus aktivitás körülbelül SÖ%-ának megtartásával. Bbben. a PBQSezési reakoiöban mindegyik urikáz alegység módosítva van (L ábra, 7. sáv), A nem közölt vizsgálatokban a PEGílezett enzim hasonló kinetikai tula|donságokkal rendelkezik mint a módoskuilan PBC urikáz (Ma 10-20 mikroM), Lényeges, hogy fiziológiás pl 1-n a módosított enzim sokkal oldhatóbb mint a módosítatlan enzim (>5 mg/ml foszfáttal puffereit sóoldatban» vs. <lmg/ml). A PEGílezett enzim is koffiezhetö, majd foszíáftal puffereit sőoklaftal (plK7,2) belyreálStha.tó, as aktivitás minimális csökkenésével. Más kísérletekben összehasonlítottuk ennek a PEO-PBC urikáz készítménynek az aktivitását az Asy.wpiáas /laana klinikai kéaritmény aknvrimmvu; pH oSnri Kmu pufim Km a? hmvoplW fán na enzim 10-14-szer magasabb Vmáx értékkel és kétszer magasabb Km értékkel rendelkezik. Azonban foszfáttal pu (Terelt söoldathan (pBv7,2k a FBG-PBC és a módosítatlan gomba eredetű, enzim tnikáz aktivitása <2 mértékben fért el.

***« *

* φ φ.

•φψ» ί.

< « » ί*

4. Példa

A módosítatlan és PEGilezett PBC nnkázjtéObgési Ideje

A 2, ábrán látható a természetes és PBGílezett PBC urikáz keringési ideje. Egéresoportokat (időpontonkánt 3 egeret) injekciózunk intmperitoneáiisan 1 egység természetes (körök) vagy PEG-get módosított (oé^szögek) rekombináns PBC urikázzal (a 3. példában ismerteteti készítmény), A jelzett Időpontokban a szérum urikáz aktivitásának mérésére a bárom, egérbal álló csoportokból vért veszünk. A PBÍGilezett urikáz (a 3, példában Ismertettük) keringési tét-életideje körülbelül 43 óra., míg a módosítatlan enzimé <2 óra. (2. ábra).

OO

A 3, ábrán a szérum urikáz aktivitása és a szérum valamim vizelet húgysav koncentrációja közötti összefüggés látható. Ebben a kísérletben egy homozigóta urlkáz-defeleus knockout egérnek |Wu, X., Wakamlyn, M., Vuishrmv, S., Geske, ft, Montgomexy, CM. Jr., Jones, Ρ», Bradley, A. és mtsai: ^Hyperuricemia and urate nephropathy ín urate omdase-defícient miee*y Proceedings of the National. Academy af Sciences, USA 91._s 742 -746 (1994)1 a 0, és 72, órában két. 0,4 NE PEGilezett rekombináns PBC urikázt tartalmazó injekciót adunk. be. Az urikáz deficiens knoekout egeret használjuk ebben a kísérletben, mivel a normális, urikáz aktivitással rendelkező egerekkel ellentétben ezek a knocout egerek, az emberekhez hasonlóan vérükben. és χ χ ΧΆΦ X Αφφ χ χ

A *Α S Κ Φ

Φ ¥ A ΑΦΧ A A φ

A A AX A A A AAA

A χ χ A A Ο χ A tóstfolyadékeikhan magas koncentrációban tartalmaznak húgy·· savat, és nagymennyiségű hügysavat választanak ki a vizeletükben, Bz a nag>w.cnnyiségü húgysav ezekben az egerekben súlyos vesekárosodásokat okoz, ami gyakran halálos Wu, X.._? Wakamiya, M., Vaishnav, S«, Geske, IC, Montgomery, CM. Jr>, Jones, P._? Bradley, A, és mtsai: ^Hyperurieemia and uráte nephrop&thy in urate oxtdase-defícienf miee*, Prooeedmgs of the National Academy of Sciences, USA 91, 742-746 (1994)].

A 3. ábrán bemutatott kísérlet demonstrálja, hogy a rekombináns PBC urikáz PBGdezett készítményének intraperitoneális injekciói a szérum urikáz aktivitásának: növekedését eredményezik, amit urikáz-defídens egérben a húgysav· szérumban és vizeletben való koncentrációjának jelentés csökkenése ideér.

bJPgtóa

A.konstri^ció-hordo.zó..komp1ex.nem-immunpgenit.ása

PBGilezett rekombináns PBC urikázt injekciózunk ismételten homozigóta, urikáz-deficiens egerekbe, anélkül hogy felgyorsítanánk a kiürülést, ami összhangban van a srignibkáns bmnunogenitás hiányával, Ezt ΒΠΒΑ-vaí lehet igazolni A 4. ábrán látható az urikáz aktivitás keringést szintjének (a szérumban mérve) a fennmaradása ismételt injeketózás után, A PBGÜezett PBC urikázt intmperitoneális injekcióval adjuk be 6-10 naponként. A szérum urikáz aktivitását az mjekeiózaa után 24 órával határozza k meg.

φ X X

Φ X φ Φ X X φ φ φ φ φ ·ί

7,PéIda kötés múl ációval bevitt lizinhez A tisztított rekombínáns PBC urtkáz PBGilezése a PEG űj bemhez (291. csoport) való kapcsolódását eredményezheti. Ebben a kísérletben a PBC urikáz egy készítményét PBGilezéssel módosíthatjuk. A szakterületen ismert módszerekkel meglmtanozbotb, hogy az áj Jizint (.291, csoport) tartalmazó peptld PEGllezéssel módosult-e.

Az alábbiakban Ismertetjük a leírásban említett szekvenciákat <110> HEBSHFIELD. M1CHAELS.

KELLY. SUBÁN J.

<120> URÁT OX1DÁ2 <130> 1579-267 <140 <141» «1.601!

<170> Patentín Ver. 2,0 <210 1 <2íl> 915 <212> DNS <2I3> mesterséges szekvencia «220» <221> CDS «222» (1)..(915) <220>

«223> A mesterséges szekvencia leírása; PBC kamera <400> 1

a tfJ Met I

get Als

est Hl a

tac Tyr

cet Atg 5

a á that;

gae Asg

tac aaa

aag Lys 10

aa·; Asn

gal; gag

gta Val

gag Gla 15

ttt Phe

48

Tyr

Lys

Asp

Gle

gfce

CC3

3Ct

vgc

tat

000

aag

gat

atg

sta

aaa

gtt

etc

tat

afc.fc:

ceg-

0 fc

Val

Arg

Thr

Gly .20

Tyr

Gly

Lye

Asp

Get 25

lle

Lys·

Val

Lee

Si s 30

lle

Gle

cys

gat

gga

asa

tat

CSC

age

sfcfc

aaa

gag

gtg

gca

aet

tea

Őré

eaa

144

Ara

A.ap

Gly 35

Lys

Tyr

His;

Ser

lle 40

Lys

Gl e

Vari

Als

Thr 45

Ae.r

Var

Gltí

efcy

aet

t tg

aec

tce

aaa

?at

tac

C3 fc

gga

gae

aat

tea

gat

102

Lee

Thr 50

Lee

Sár

Ser

Lys

Lys

isp

Tyr

Lea

Kis

G1 y §6

Asp

Asn

Ser

Asp

gfcc

ate

cet

aca

gae

sJCC.

ate

aag

a se

sea

gtt

aat

etc

ctg

ycg

aag

240

vai 35

lle

P te

Thr

A.s?p

Tat 70

lle

Lys

Asn

Thr

Var 75

Aaa

Val

Lea

Als

Lys 80

:fc c.

aaa

00«

áté-

aaa

aga

ats

gaa

set

ttt

get

gtg

act

ate

tgfc

gag

288

PlC:

Lys

Gly

rés

Lys 05

Ser

1 le

G.le

Thr

Phe 50

Aia

Val

Thr

lle

Cys 85

Gle

cafc

tte

ctfc

tét

r. r.-ré

t : c

ase

cár.

etc

ate

SO3

•get

CS 3

gfce

tar.

O'ré

33fc

His

Phe

Lee

Sár 100

Ser

Phe

Lys

Kis

Val 105

lle

Arg

Alá

Gla

Va 1 1.10

Tyr

Val

gaa

gaa

gtt

cet

tgg

aag

cet

ttt

gaa

asg

aat

gga

gtt

aag

cafc.

etc

584

Gla

Vei •15

Pro

T.rc

Lys;

Arg

Phe ISO

Gle

Lys

Ase

Gly

Val 125

Lys

Hl a

Val

cafc

gea

fcfcfc.

att

tat

act

cet

3í.-t

gga

a cg

cac

tte

tat

ggo

gfct

gaa

432

His

Als. 150

Phe

rée

Tyr:

Tat

Pro 155

Th.r

Gly

Thr

His

Phe 140

Cys

Gla

Val

Gle

cag

a te

agg

a 3fc

oo«

cet

ec3

gtfc:

at fc

est

Let

gga

st c

aaa

gae

eta

480

Gin 145

Tle

Asg

Asn

Gly

Pro 150

Píré

Val

rée

Pia

Aet 135

O í. y

rés

Lys

Asp

Lee 130

333

gtc

tte

sas

aca

eag

tét

gye.

ttt

gaa

00«

rée

ate

aag

gae

528

Lys

Vei

Lse

Lys

Thr Íré

Thr

Gin

Ser

Gly

Phe 170

Gle

Gly

Phe

Tle

Lys 175

Asp

C3g

tte

acc

aec

etc

cet

gag

gtg

aag

gac

«00

tgc

t fc. fc.

gce

578

Gle

phe

Th.r

Thr 180

Lh«

Pro

Gle

val

Lys 185

Ase

Arg

Cys

Phe

Aia 100

Thr

Gle

gtg

t-SC

tge

3 33

tgg

ege

Í3C

cae

cae

00«

aga

gat

gtg

gae

t fcfc

Őré

824

Val

let

Gye 155

Lys:

Trp

Arg

Tyr

hs 200

Gl?a

Gly Atg

Áep

val 205

.Asp

Phe

Gle

gc.s Ál a

ace Thr 210

tgo Trp

geo act

gtt Vei

Arg 215

ege Ser

art ile

g te Vei

ctg Lee

oag Gin arc Λ e, o

ess Lys

tt1 Phe

get Ala

000 Giy

672

Asp

Thr

ccc

tat

cos

aaa

W-

gas

tao

tea

cet

tót

gtg

c-íig

aeg

aee

ctc

tat

720

Prc 225

Tyr

Asp

Lys

Gry

Glu 230

Tyr

Ser

Pro

Sert

Val 235

Gin

Lys

Thr

Les

Tyr 240

gat

atc

cag

gtg

ctc

t cc

ctg

ege

ege

gtt

cet

geg

ate

ga a

gat:

a tg

7 68

Asp

Ile

Gin

Vei

Les 245

Ser

Lea

3er

Arg

Vei 250

Pro

Gie

Ile

Gi e

Asp e ..'

Met

gae

atc

agc

ctg

CSC

íí <$. u

ett

sec

tar:

11 c

aet

sta

get:

atg

tcc

aaa

816

Glu

Ile

Ser

Lse 250

Pro

Asr

Ila

Lys

Tyr 265

Phs

Ásta.

I le

Asp

hat 270

Ser

Lys;

etg

qyt

c L g

a te

áss

aag

gea

Oag

gtc

ttg

ctg

cca

t ta

esc

eat

cos

864

Met

G i y

Lsu 27S

Ile

A.S.C

Lys

Glu

Gla £00

Val

Lse

Los

Pro

Lee 285

Asp

Asn

Pro

tat

00^

Sitt

act

ggfc

sca

gtc

íí

sgg

aeg

ttg

hot.

tea

a se

ctg

312

Tyr

Giy

Lys

ile

Thr

Oly

Thr

Val

Lyí;

Arg

Lys

Lee

3 rtt

Ssr

Arg

Leu

290 295 300 tea

309 <21Ö>2 <2 Π > 304 <212» fehérje <21.3» mesterséges szekvencia <400>2

Mer Aie 1

His Tyr

Arg 3

Asn Asp

Tyr

Lvs Lys Asn 18

Asp

Gi e

Vei

Glu 15

Phe

Vei

Ars

Thr

Gly

Tyr

Oly

Lys

Aap

Met

lie

Lys

Val.

Leu

His

Lie

Gin

20

25

30

Ars

Asp

Gly

Lys

Tyr

His

Ser

lie

Lys

Gin

Vei.

Ara

Thr

Strr

Vei

Gin

35

40

45

Leu

Thr

Lee.

Ser

Gsr

Lys

Lys;

Asp

Tyr

Leu

His

Gly

Asp

Asn

Ser

Asp

55

55

60

Va.l

Tie

Pro

Thr

Asp

Thr

üs

Lys

Asr;

Thr

Vei

Asn

Val

Leu

Aie

Lys

65

70

?5

80

Phe

Lys

Giy

Ile

Lys

Ser

lie

Glu

Thr

Phe

Aie

Vei

Thr

Us

Cys

Glu

85

30

95

His Oh© Lse Ser Ser Phe Lys His Vei 2 is Arq A is Gin Vei Tyr Val

100 ' 1G5 ' ii

Glu

Gin

Val II5

Pro

Trp Lys

Arg Pha Gin 120

Lys

Aao

Giy

Vei 125

lys Pia Vei

Gi :s

Alá

Pha

lle

Tyr

Thr

Pro

T hr-

Giy

Thr

Pis

Phe

Gys

Gin

Val

Gin

130

135

145

Gin

iie

Arg

Asn

Giy

Pro

Pro

Va 1

lle

His

Ser

Giy

iie

Lya

Asn

Len

145

ISO

155

160

Lys

Vei

lan

Lys

Thr

Thr

min

Se r

Giy

Phe

Gin

61 y

Pha

iie

Lya

Aap

165

170

175

Gin

Pha

Thr

Thr

Aaa

Pro

Glu

Val

Lye

Aap

Arg

Gys

Phe

Aie

Thr

Gin

130

18 5

130

Val

Tyr

Cys

Lys

Trp

Ars

Tyr

Pia

Gin

Giy Arg

Aap

Vei

Aap

Phe

Glu

195

200

255

Ars

Thr

Trp

Asp

Thr

Ver

Arq

Ser

iie

Vai.

lóra

Gin

lys

Pha

Aie

Giy

310

215

220

Pro

Tyr

Asp

Lys

ciy

Sin

Tyr

Ser

Pre

Ser

Vai

Gin

lys

Thr

Len

Tvr

225

230

235

240

Asp

Ue

Gin

Vs.l

len

Ser

len

Sár

Arg

Va r

p ro

Gin

iie

Glu

Asp

Ser

245

250

255

Gin

iie

Ser

Len

Pro

Asn

Üa

Kis

Tyr

Pha

Asn

üe

Asp

Met

Ger

Lys

265

265

270

Aer

ml y

Les

Iie

Asn

Lye

Gin

Gin

Val

les

Lea

Pre

Len

Asp

Asn

Pro

275

280

285

Tyr

G.ly

lys

na

Thr

Giy

Thr

Vai

lya

Arg

lys

len

Sor-

Ger

Arg

lan

2 88

255

305

«2Κ)> 3 <211» 915 <212» DNS «213» mesterséges szekvencia <220» <221» CDS <222» (1).,(915) <22Β» <223» A mesterséges szekvencia leírása: pks tömére. «400» 3

atc

get

est

has

egt

aat

gae

t. <5-·.„<

aaa

aag

aat

gat

0*0

gt a

0*0

ttt

48

tet 1

Alá

His

Tyr

Arg 5

Asn

Asp

Tyr

Lys

Lys 10

Aaa

Asp

Gin

Va 1

Gie 15

Phe

gtc

ege

act

ggc

t a t

000

aag

gat

atg

a La

aaa

g t .

cte

eat

art

cag

56

Val

Arg

Thr

G1 y 20

Tyr

Giy

Lys

Asp

tet 25

11«

Lys

Vai

Leu

His 30

I le

Gin

cg a

gat

gga

aaa

tat

CSC

acc

art

aaa

gag

gtg

gca

act

t ca

ctg

caa

14 4

Arg

Asp

Giy 85

Lys

Tyr

His

Ser

iie 40

Lys

Gin

Vai

Aia

Thr 4 5

Ser

Val

Gin

ctg

act

ttg

age

téC

sas

aaa

ga t

Lse

ctg

cat

00«

gae

aat

tea

gat

152

Leu

Thr Sö

Lee

Se r

Ser

Lys

Lys 56

Asp

Tyr

Lee

His

Giy SÖ

Asp

Asn

Sex?

Asp

ytc

a te

cet

ács

CSC

ace.

atc

aag'

aae

aoa

gtt

aat.

gtc

ctg

geg

aag

240

vai 6S

üe

Pro

Thr

Asp

Thr 7(5

Ii©

Lys

Asn

Thr

Val 75

Asn

Val

Lee

A1.&

Lys 00

ttc

aaa

00«

atc

aaa

ata

act

ttt

get

Víg

act

a t c

tgt

cag

208

Hhe

?Ly:s

Giy

lle

Lys 85

Ser

Lle

Gin

Thr

Phe 30

Alá

Vai

Thr

lle

Gye 25

G1 u

cet

ttc

et t

tet

tcc

tte

aag

cet

gtc

atc

aga

get

caa

gtc

tat

gtc

830

His

Ph©

Len

.Ser 100

Ser

The

Lys

His

Vei 105

iie

Arg

Aia

Gi n

Vai 110

Tyr

Vai

gaa

gaa

get

cet

t gg

aag

cet

1t1

gaa

aag

aat

gga

gtt

aag

eat

gtc

384

Giu

··..·.· a

Vai 115

Pro

Trp

Lys

Arg

Per? 120

Gin

Lys

Asn

Giy

Val 125

Lys

His

Vai

cár

ece

ttt

att

tat

ser

cet

act

00A

a cg

cae

i-tc

tet

gye

et t

gaa

432

Kis

AI a 130

The

lle

Tyr

Thr

Pro 135

Thr

Giy

Thr

8 rs

Phe 140

Cys

Cte.

Vai

Gin

cag

ata

*00

aat

gga

cet

cea

gtc

att

cat

tet

gga

atc

aaa

gae

cte

4 80

Gin 145

He

Arg

Asn

Giy

Tre ISO

Pro

Var

Iie

His

Ser 155

Giy

iie

Lys

Acc

Lse ISO

aaa

gtc

t tg

sas

aca

β is C

eag

tet

00«

ttt

gaa

gga

tte

atc

aag

gae

528

Lys

Val

Lee

Lys

Thr 1.65

Thr

Gin

Ser

Giy

Phe 170

Giy

Phe

Ii©

Lvs 175

Asp

eag

tt e

acc

sec

cte

•cet

0*0

ctg

aag

g a c

<-02

tgc

ttt

gcc

<3 OC

caa

576

Gin

Phc

Th r

Thr ISO

teu

Pro

Gin

Val

Lys 105

.Asp

Arg

Cys

Phe

A.I a 1.00

Thr

Gin

gtc

tae

tgc

a a a

tgc

ege

tat:

CSC

eag:

00*

aga

gat

2 2 0

gae

ttt

ga g

624

Val

Tyr

Cys 1.55

Lys

Trp

A. tg

Tyr

Pia 200

Gin

Gl.y

Arg

Asp

Vai 205

Asp

Phe

Gle

gcc

SCO

tgg

gac

act

gtt

agg

agc

att

gtc

ctg

eag

aaa

ttt

get:

OOG

072

Als

Thr £10

Trp

Asp

Thr

Vai

Arg 215

Ser

11©

Vai

Lee

Gin 220

Lys

Phe

Alá

Giy

ccc

tat

esc

aaa

gga

0*0

t.ac

top

ccc

tor

cr.c

cag

aag

aca

cte

tat

720

Pro *\ ···.<: .-:1.:1 ..·.·

Tyr

Asp

Lys

Giy

Gin 230

Tyr

Ser

Pro

Ser

Val 235

Gin

Lys

Thr

Lse

Tyr 240

atc

cag

ctg

et e

sec

ctg

gge

cag

Ott.

cet

0«0

ata

gaa

gat

atg

7 03

Asp

11©

Gl..n

Val

.Lee 245

Thr

Lee

Giy

lila

Val £50

Pro

Gin

I1©

Gle

Asp 255

tet

; 4 ?*'*»**$$

gaa ci©

©te n©

sg© 9a r

stg La© 250

CCS Áré

ast. hsa

a tt. Hé

este His

tse Tye .2 SS

tts Lat

sas Aae

ata ©se ség tec. aaa

SIS

Ma

As©

Mát MO

Ser

Lys

afcg

TG

ctg

©te

as©

sag

gss

gag

gts

tte

ets

aet;

ti a

gae

ast

aea

9M

Met

Gly

La©

Π©

Asn

Lys

Glu

Gin

Var.

Lat

Lau

P.kc

Le©

Mag

hsa

Pr©

2íS

200

20 S

tat

gg<

aaa

art

aet

LM

ses

et c

asg

agg

©S<!

ttg

tat

tea

<3Q'<k

ctg

912

Tyr

Gly

Lys

1 la

Thr

Oly

The

Par

Lys

Arg

Lys

La©

He í:

Hat

Arg

La©

MO 290 200 <210»4 <211» 304 <212» fehérje <213» Ártificiai Sequenee <400> 4

itat 1

Al©

His

Tyr

Áá í<5

Arat

Asa

Tyr

Lys

Lys 10

As©

Asr

Gi©

Val

Gi© IS

Aha

Val

Arg

TM

Gly 2G

Ty.K

Gr y

Lys

As©

Mer 2S

Ma

Lys

Val

La©

His 20

I la

Gi©.

Ara

Asp

Gry M

Lys

Tyr

His

Per

M© 40

Lys

Gla

Tál

Alá

Thr M

Hat

Psi

GI.©

Lse

Thr 00

Le©

Hat

Ser

Lys

Lys SS

Asp

Tyr

Lea

His

GI y SO

As©

As©.

Asr

Asp

Pai SS

Ma

©r©

Thr

Asp

Thr TO

.i a

Lys

As©

Thr

Val OS

As©

Val

La©

Aia

Ly.s 00

Phe

Lys

Gi y

Ma

Lys 00

Lat

11 a

Gla

Thr

Phe 90

AI 3

Val

Thr

Ma

Cys 0©

Gi©

His

Phe

Lat

Ger 100

Óar

Aha

Lys

hia

Val MS

Ma

Ara

Ai 3

Gi©

Psi MO

Tyr

Psi

Gi©

Gi©

Pál 11S

Őre

Trp

Lys

Arg

Phe MO

Gla

Lys

Asa

Gly

Psi MS

Lys

His

Val

His

Alá 13Ö

PH©

Ír a

Tyr

Thr

Pr© MS

Thr

Gly

Thr

His

Aha MO

Gys

Gi©

Pál

Gl©

Gls M©

Ma

Arg

As©

Gly

Pra ISO

hro

Psi

Ma

his

ΰ .©? s·' <4>íM ISO

Gly

Ma

Lys

Asp

La© MO

Lys

Vei

La©

Lys

Thr MS

Thr

Gla

Ser

Gly

Phe MO

Gl©

Gry

Phe

I I a

Lys LM

Asp

	-56 -	* **« ΦΦΛ'
Gin Phe Th.t Thr Len Pro	Gis Val. Lys Asp Arg Cys Phe Aia	Thr Gin
ISO	1S5 100
Vai Tyr Cys Lys Trp Axp	Tyr 'His Gin Giy Arg Asp Val. Asp	Phe Gla
105	200 205
Alá Thr Trp Asp Thr Vaj,	Arg Ser Tie Val Lee Gin Lys Phe	Aia Giy
2 1 0	215 220
Sre Tyr Asp Lys Giy Glu	Tyr Sár Org Ser Val Gin Lya Thr	Lee Tyr
225 250	r a e	240
Ase He Gin Val Lee Thr	Laa Giy Gin Val Pre Gin Tie Cl a	.Asp Mer
240	250	255
Gis lla Ser Les Pro Asn	Tie His Tyr Lee Aan Tie Asp Met	Ser Lys
250	205 ' 230
Mát Giy Lee lla Asn Lys	Gin Gla Vei Lee Len Pro Lee Asp	Aán Pro
225	2S0 235
Tyr Giv Lys Xie Thr Giy	Th?; Val Lya Arp Lys Lee. Ser Ser;	Arg Les
200	205 ' 300
<210» 5
<211» 304
«212» fehérje
<213» Mesterséges	skveneia
«220»
<223» A mesterséges;	szekvencia leírása: pávián D3'f	í
<400» 5
he;: Alá 8ia Tyr His. Aan	Asn Tyr Lys; Lya Apn Asp Gis Lee	S.Í. S ;??*':·
1 5	10	15
Val Ara Thr Oly Tyr Giy	Lya Aap Mát Vai Lys Vai Len his;	lie Gin
20	2 3 2 0
Arg -Asp Giy Lys Tyr Lés	Ser lie Lys Gla Val Alá Thr’ Sár	Val Gin
35	30 55
Les Thr Lee Ser Ser Lys	Lys Asp Tyr Len his Oly Aap Aa···	Ser Asp
30	53 60
11® lla Pro Tar Asp Thr	lie: Lys Aa.a Thr Val his Vai Les	Aia Lys
85 30	3 5	80

Phe

Lys

3.1 y

lis

Lys

Ser

He

Gia

A1 a

Phe

Gi y

Vei.

Asn

I ie

Cys

Girt

§5

90

95

Tyr

Phe

Tört

Ser

Ser

Phe

Asn

Kis

Vai

lle

Arg

Aia

Girt

Vei

Tyr

Vai

100

105

110

Girt

Gl π

i.1 e

Pro

Trp

Lys

Arg

Leu

Gia

Lys

Asn.

Giy

Vai

Lys

Pis

Vai.

115

120

125

Hís

Alá

The

lis

Pis

Thr

Pro

Thr

Giy

Thr

Pis

Phe

Cys

Gia

Vai

Gin

130

135

H0

G.l«

Lee

Arg

Ser

Giy

Pro

Pro

Vai

Iie

Ars

Ser

Giy

Iie

Lys

Asp

LSrt

145

150

155

150

Lys

Vai

Lea

Lys

Thr

Thr

Gin

Ser

Oly

Phe

Gia

Giy

Phe

He

'Ly.s

Asa

105

170

175

Gin

Phe

Thr

Thr

Leu

Sre

Sir;

Tel

Lys

Asp

Arg

Cys

Phe

Aia

Thr'

Gin

1.00

185

190

Vai

Tyr

Cys

Lys

Trp

Arg

Tyr

Mis

Girt

Cys

Arg

Asp

Vei

Asp

Phe

Girt

195

2 00

205

Aga

Thr

Trp

Giy

Thr

T le

Arg

Asp

Lea

Vei

Lea

Gia

Lys

Phe

Alá

Giy

21.0

215

S ..:0)

Pro

Tyr

Asp

Lys

Giy

o re

Tyr

Ser'

Pro

Ser'

Vei

Gia

L-ys

Thr

Lee

Tyr

y>:;

230

J í.

240

Asp

iie

Gin

Vsi

Len.

Sár

Lea

Ser

Arg

Vei

Pro

G.la

I le

G1 rt

Asp

Get

24 5

250

255

Girt

iie

Sex·

Lesr

Pro

Asn

iie

Pis

Tyr

Phe

Asa

I ie

Asp

her

Ser

Lys

250

205

270

Vet

Giy

Len.

lis

Asn

Lys

Girt

Gia

Vei

Len

Lea

Pro

Lea

Asp

Asn

Pro

y ·? r A. · s.‘

200

285

Tyr

G1 y

Lys

1 le

Thr

Giy

Thr

Vei

Lys?

Arg

Lys

Lea

Per

Ser

Arg

Lee

280 295 300' «210»6 <211» 304 <212» fehérje «213» pávián < 4QÖ>6

Met I	Alá Asp Tyr	his s	Áss Ash Tyr	Lys	Lys Aso Asp Gls Les Glu	Phe
10	15
val	Arg Thr elv	Tyr	Gly Lys Asp	Két	Val	Lvs Val Leu Via iie	Gi!·;
	20			25		30
Arg	.Asp Gly Lvs	Tyr	his Ser TI®	Lys	Glu	Val Alá Thr Ser Vai	Giu
	35		4 0			15
0551.;	Thr Leu Ser	Ser	Lvs Lys Asp	Tyr	Lea	his Gly Asp Asn Ser	.Asp
	50		55			60
Πβ	Iie Pro Thr	Asp	Thr 11« Lys	Aso	Thr	Val his Vei Leu Alá	Lys
63			70			75	00
Ph®	Lys Gly Iie	Lys	Ser Iie Gls	Aia	Phe	Gly Val. Asn Tle Cva	G.:. U
		05			00	35
Tyr	Phe Les Ser	Ser	Phe Ase his	Vei	11«	Arg Aia Gin Var Tyr	Val
	LÖÖ			105		IIÖ
Glu	Gls Iie Pro	T rp	Lys Ars Les	Glu	Lys	Ars Glu Vai Les his	Val
	115		120			125
L s. ss	Aia Lse Iie	his	Thr Pro Thr	Gly	Thr	Lrs Phe Cys Giu Vai	Glu
	130		135			140
GI;'Í	Les Arg Sár	G1V	Pro- Pro Vai	Iie	His	Ser Gly Iie Lya Asp	Lén
145			150			155	léö
Lys	Vai Les Lys	Thr	Thr Giu Ser	Gly	Phe	Glu Gly Phe Iie Lys	Asp
		105			170	17 5
Glu	Phe Thr Túr	Les	Pro Glu Vai	Lys;	Asp	Arg Cys Phe Aia Thr	Glu
	180			185		100
Val	Tyr Cys Lys	Trp	Ar® Tyr his	Glu	Cys	Arg Asp Vai .Asp Phe	Gls
	1ÖS		200			205
Alá	Thr Trp Gly	Trr	iie Arg Asp	Leu	Vai	Leu Gls Lys; Ph?5 Aia.	Gly
	210		215			220
Pro	Tyr Asp Lys	Gly	Glu Tyr Sor	Pro	Ser	Val Gin. Lys Thr Χ.·®υ	Tyr
			230			233	240
Asp	11<5 Gin Val	Les	Ser· Leu Ser	Arg	Val	Pro Giu Tle Gls;; Asp	Get
		245			250	255
Glu	iie Ser les	Pro	Áss II® Li;?	Tyr	Phe	Asa He Asp Met Ser	Lys
	2 L 0			255		270
Met	GIv Les He	Asn	Lys Glu Glu	Val	Leu	Leu Pro Les Asp Ash	Pro
	275		.28 ö			265
Tyr	Gly Lys 11e	Thr	Gly Thr Vgl	Lys	Arg	Lys Leu Ser Ser Arg	Leu
	200		2 05			300

<210» 7

<211» 304 «212» fehérje «213» sertés <400» '7

Cet. 1

Al®

KÍS

Tyr

Ar® S

Asn

Asp

Tyr

Lys

Lys 10

Asn

Asp

Gl®

Val

Gl® 15

Phe

Vsi

Arg

Thr

Gly 20

Tyr

Gly

Ly®

Asp

heh 25

He

Lys

Val

Len

01® 30

He

Gin

Arg

Asp

Gi.v 35

Lva

Tyr

Kis

Ser

He 50

Lys

Gin

Val

Aia

Thr 45

Se r

Var

Gin

Le®

Thr 50

Lee

Sor

8er

Lys

Lys SS

Asp

Tyr

Les

Kis

Gly 50

Asp

Asn

Ser

Asp

Vei 65

11®

Pr®

Thr

A®p

Thr 50

He

Lys

Asn

Thr

Val 75

Asn

Val

Len

Al®

Ly® 80

Ph®

Lys

Gly

11®

Lys 85

Ser

ile

Gin

Thr

Ph® 50

Aia

Val.

Thr

11®

Gys ví

Gin

ílis

Phe

La®

Ser 100

Ver

Ph®

Lys

his

Vei 105

11«

Ary

Aia

Gin

Val 110

Tyr

Val

Gl®

Gin

Val. 115

Pro

Trp

Lys

Ary

Ph® 120

Gin

Lys

Asn

Gly

Val 125

Ly®

Oi.s

Vei

Kis

Als 130

Phe

11®

Tyr

Thr

Pro 135

Thr

Gly

Thr

Pis

Ph® 110

Cys

Gin

Vei

Gl.®

Gin US

He

Arg

Asn

'::.:. V

Pro ISO

Pr e

Vei.

11«

Kis

Ser 155

Gly

11«

Lys

Asp

Lan 180

Lys

Val

Les

Lys

Thr 18 8

Thr

Gl®

Ser

Gly

Ph® 170

GT®

Gly

Phe

II.®

Lys 17 5

Asp

Gin

Phe

Thr

Thr 180

Lee

Pro

Gin

Val

Lys 105

Asp

Arg

Cys

Phe

Aia 1.50

Thr

Gin

Vei

Tyr

Cys 1.55

Lys

Trp

Arg

Tyr

Kis 2G0

Gin

Gly Ary

Asp

Val. 205

Asp

Phe

Gl.®

: Als

Thr Trp Asp no

Thr

Vei

Ary 215

Ser-

He

Vél

le®.

Gin .«5;

Lys

Phe

Ara

Giy

PrÖ 225

Ty í: Asp

Lys

Gly

Gl® 230

Tvv

í3<Hy··

Pre

Ver

y«i 2 05

Gin

Lys

rh r

Len

Tyr 250

Asp

11®

Gin

Var

Les VAS

Thr

Gly

Gin

Vei 250

Prp

Gin

He

Gin

Asp 255

Get

Gin

Ile

Sor

Len 2 60

Pro

Asn

Pl®

Ki a

Tyr 205

A®n

He

A®p

Get 270

0®s?

Lys

Mot Glv b-'5'.i	X la	Asn	Lys	Glu Gin Val Las Las. Pro Los
	275	280	285
Tyr	Gly	Arg	1 le	Thr	Gly	Thr	val	Lys Arg Lys	Lsu	Thr
	260					205			380

Asp As-n Pro

Sár Arg Lan <210» 8 «211» 298 «212» fehérje <213» Mesterséges szekvencia <220» <223» A mesterséges szekvencia leírása: N--terminálison esőn kitett PBC <400» 8

Asp 1

Tyr .Lys

Lys Asn 5

Asp G.l» Val Gin Pha VaX Arg Thr: Gly Tyr Gly

10

15

Lys

Asp

Pét

11a

Lys

Val

hsa

Hls

11a

Gm

Arg

Asn

Gly

Lys

Tyr

hls

r »

25

30

Sár

líe

Lys

Gla

Val

Alá

Thr'

Sár

Val

Gls

Lan

Thr

Lan

Sár

Sár

Lys

35

40

55

Lys

As»

Tyr

Lsn

Hls

Gly

Asp

Asn

Per

Asp

Val

11¾

Pro

Thr

Asp

Thr

50

55

00

Ue

Lys

Áss

Thr

Val

Asn

Val

Laa

Alá

Lys

Pha

Lys

Gly

Illa

Lys

Ser

85

70

75

80

11¾

Gin

Thr

Phe

A λ a

Val

Thr

11a

Cys

Lés

51 s

Pha

Lan

Sex-

Om

Pha

85

90

05

Lys

hls

Vsi

11»

Arg

Alá

Gin

Val

Tyr

Val

01»

Gin

Val

Pro

Trp

Lys

100

105

110

Arg

Phe

Gls

Lys

Ash

Gly

Val

Lvs

51«

Val

Hls

Als

Hsa

11¾

Tyr

Thr

US

•20

125

Pxr>

Thr

Gly

Thr

Hls

Phe

Cvs

Gin

Val

Gin

Gin

11¾

Arg

Asm

Gly

Pro

130

135

140

Pm

Val

Lls

Hls

Sár

Gly

111

Lys

Asp

Les

hys

Val

Leu

Lys?

Thr

Thr

145

150

1.55

100

Glh

Ssr

Sly

Pha

Gin

Gly

Pha

Tls

Lys

Asn

•-.η a

Pha

Thr

Thr

LSh

Pro

155

17 0

175

<“ * ·* *χ·«

Slxx Val Lys Asp

Arg Sya

2h® AJ a Thr á:>

áls Val Tar Cvs Lys mo

Trp

Arg

IgÖ

Tyr

his

om

S2y

Arg

Aap

Va X

Aap

Thr

srn

Ma

Thr

Trp

Asp

Thr

Val

1SS

200

205

Arg

Sár

X'Ia

Val

tóv

GXa

Cys

v:ha

Air

át y

Örs

Tyr

Asp

Lys

Gly

G X a

a::

2X5

220

Tyr

Sas

Pro

Sár

v«x

Óla

Lys

Thr

tóv

Tyr

Asp

im

Giv

mi

tóv

S«r

225

230

2 35

240

tóv

5ar

Arg

Val

Ara

Glv

ás

Glv

Aap

Wt

Clv

tm

Sár

tóv

Ars

As?a

25 5

250

255

xi«

XXX s

Tyr

Aha

Asm

1 Is

Asp

Ssr

Ssr

X,ys

tót

•v

tóv

Xtó

Asa

Lys

2 SS

205

270

sxa

01 v

Val

Lsa

tóv

Vra

tóv

Áss

Ars

érv

Tyr

Oly

Sva

XX a

Thr

Oly

27 S

230

255

Thr

Val.

Lys

ars

Lya

Sav

Sár

3sr

Ars

tóv

2 SS

225

«219» 9 «211» 3Ö1 «212» teteje «2Ι3> Mesterséges szekvencia «220» «223> A mesterséges szekvencia leírása: C-terminálison csonkított PBC

tót

AXa

hív

Tyr

Arg

Ars

Asp

Tyr

sys

Lys

Asa

Asp

Glv

Val

GIv

Fhs

1

5

io

15

VaX

Arg

Thr

Gry

Tyr

SX y

Lys

Asp

tót

xm

Lys

Val

tóv

hx.s

xm

om.

20

25

30

Arg

Aap

GI y

Lys

Tyr

his

Tar

Us

Lys

Glv

Val

Ara

Thr

Sár

Val

XXI a

35

50

55

tóv

Thr

tóv

Sár

Orr

Lys

Lys

Asp

Tyr

>.r

His

Sry

Asp

Asa

Sár

Asp

50

5>5

50

val.

xm

;’T a

Thr

Asp

Thr

XXs

Lys

Áss

Thr

Var

Asa

tóX

LAS

AXa

Lys

55

30'

75

00

Aha

Lys

Oly

XXa

tós

Ssr

Us

áio

Thr

Shs

AXa

Val

TXT

x m

Cm

S X a

35

30

-vá

Als

Fhe

Les Ser IÖÖ

Ser

Ahe

Lys his Val Iie Arg Ars Gla hal Tyr Fai

Tör

ÜG

gi»

»· ::.»

Val

Aro

Trp

Lys

Arp

Fhe

Gla

Lys

A,s»

Gly

Val

Lys

hi.s

Val

11S

1A0

1SS

his

Aia

Ahe

lle

Tyr

Thr

Fre

Thr

Gly

Thr

his

Ahe

Gye

Gla

Val

Giu

130

13S

110

Gie.

Ue

Sry

Ssu

Gly

Fro

Ara

Val

lle

Fis

Ser

Gly

11 e

Lys

Asp

Lea

1«

ISO

15S

100

Lys

Val

lea

Lys

Thr

Thr

Gla

Ser

Gi y

Aha

Gla

Gly

Fhe

lle

Lys

Sáp

1SS

iíÖ

170

Gla

Ahe

Thr

Thr

La»

Aro

Gla

Val

Lys

Ssa Ary

Cys

Aha

Aia

Thr

Gla

mo

ÍSS

ISO

Vei

vr

Cys

Lys

Τκ»

hry

Tyr

his

Gla

Gly

Arg

A ép

Ve 1

Sép

Fáé

Gla

ÍAS

200

AOa

.A.·%

Ths

Trp

As»

Thr

Val

Arp

Ser

lle

Val

lea

Gla

lys

Ahe

Ars

Gly

210

Gla

Alá

Ar»

Tyr

Se»

Lys

Gly

Gi»

Tyr

Ser

Ara

Ser

Val

GI»

lye

Tar

Lea

Tyr

aai

GGÖ

ÁSS

STA

Asp

lle

Gl»

Val

Le»

Ser

le»

Ser

Arp

Var

Ara

Gla

lle

Gla

Asp

Get

145

ISO

Aha

Gál

r ie

Ser

Lee

őre

Ss»

lle

öle

Tvr

Fhe

Sas

Iie

Sáp

Vet

Ser

Ov

AGG

SÖS

SVA

Met

Gly

1»»

iie

Se»

Lys

Gla

Gle

Vei

hsa

lea

Ara

le»

Se»

Aee

Ara

FIS

FOG

no o ο o

Tyr

Gly

Lys

lle

Thr

Gly

'Thr

Vei

ive

Aay

Lys

lea

Ser

200

SAS

AÖÖ

<210» W <20 >293 <212» fehérje <2I3> Mesterséges szekvencia <220» <223»- A mesterséges ssekvencsa leírása: C-térmmálisen csonkáén PES <400» 10

Asn í

Tyr

Lys

Lys

Asn 5

Asp

01a

Vai

Gla

Phe 10

Vai

Arg

Thr

Gly

Tyr 15

Gly

Lys

Asp

Met

Xle 20

Lys

Val

Lee

H

lie 25

Gin

Arg

Asp

Oly

Lys 30

Tyr

Pia

Ser

Le

Lys 35

Gla

Vei

Ara

Thr

Ser 40

Val

Oln

Le a

Thr

Leu 45

Ser

Ser

Lys

Lys

.Asp SO

Tyr

Lse

Hls

Gly

As» SS

Asx)

Osr

Asp

Vai

He 00

.Pro

Thr

Ase

Thr

Ha 8S

Lys

Asn

Thr

Vei

Asn 70

Val

Lse

Aia

Lys

Phe 78

Lys

Gly

He

Lys

Ser 00

Lle

Glu

Phe

Alá 25

Vei

Thr

11 s

Gye

Gla 90

Als

Pás

Les

Ser

Ser 95

Phe

Lys

Hí 8

Val

Tle 100

Arg

Ara

·.:?. s

Val.

Tyr 105

Var

Gla

01«

Vai

Pro 110

Trp

Lys

Arg

Phe

01« Π5

Lys

.Asn

Gly

Vei

Lys 120

his

Vei

His

A,i,a

Phe 125

He

Tyr

Thr

Pre

Thr 130

Oly

Thr

His

Phs

Cys 135

Gla

Val

01«

Oln

1 le 140

Ara

Asn

Gly

Őre

Pro 1.45

Val

íle

Hls

Ser

Gly ISO

T la

Lys

Asp

Lee

Lys 155

Vei

Leu

Lys

Thr

Thr 160

Gin

Ser

Oly

Phe

Gla 155

Oly

Phe

He

Lys

A.sp 170

Gla

Phe

Thr

Thr

Lan TV 5

Pre

01«

Vai

Lys

Asp 190

Arg

Gys

Aha

:··'..·:. S

Thr 185

Gla

Val

Tyr

Cys

Lys 190

Trp

Arg

Tyr

Hí S

Oln 185

Oly

Ara

Asp

Víi r

Asn 200

Phe

Oíu

Ara

Thr

Tar- lOS

Asp

Thr

Vei

Arg

Ssr 210

He

Vsl

Lse

Gin

Lys 215

Phe

Als

01 ly

Pro

Tyr 220

Asp

Lys

Gly

Oiu

Tyr uu; v. cl D

Ser

Pro

Ser

Vei

Gla 2 30

Lys

Thr

Le a

Tyr

Asp

Gin

Vei

Leu

Thr 240

Les

Oly

G.:n

Vei.

Pre 245

Gin

21«

Gla

Asp

Mát 250

e re

He

Ser

Leu

Őre '•v 'Ó v.

Ase

He

hls

Tyr

Leu 260

Asn

He

Asp

Aat

Ser 285

Lys

Mai;

Gly

Len

He 270

As r

Lys

Gin

O.le

Val U

Lee

Lee

Pre

Lee

Asn 280

.Ase

Pre

Tyr

Oly

Lys 2 SS

Ha

Thr

Oly

Thr Vaj. Lys Arg .Lys Leu Ser 5sr Arg Tea evő ' ' 29s

-64 ~ *

«· * » »Η·* ♦? ί^βχ* Μ » » »», ί J « m ,»,· ( *”· <2i0> il <21 i> 301 <212» fehérje <213» Mesterséges szekvencia <220» <223» A mesterséges szekvencia leírása.: C-termmálison csonkított ?KS <400» 11

Met 1	Alá Ms	Tyr Arq	Asn	Asp	Tyr	Lys Lys Asa Asp Gin Vsi ölu	Pha
10	15
Vai	Arq Thr	Giy Tyr	Giy	Lys	Asp	Met Us Lys Val Leu	Ms lis	Gin
		20				.2 5	30
Arq	Asp öly	Lys; Tyr	Ms	Mr	Ma	Lys Gla Vai Alá Thr	Ser Vai	Gla
	35				40	45
Leu	Thr Leu	Ser Sex	Lys	Lys	Asq	Tyr L-éa Ms Gly Asp	Asa Ser	Asp
	50			55		50
Val	Ils Pro	Thr As»	Tht		Lys	Asxi Thr Vsi Asa Vai.	Leu Alá	Lys
OS			7(			75		80
Ara	Lys Giy	11e Lys	Mr	lis	Gin	Thr Phe Alá Val Thr	He Cys
		35				50	05
Ms	Phe Len	Mr Oer	Phe	Lys	Ms	Vai. Ms Arq Alá Gin	Vai Tyr	Vsi
		•00				105	110
Gia	ΐ;:3ΛΪ V<3t'&.	»ro Trp	Lys	Ars?	Phe	Gl.a Lys Asa Giy Val	Lys Ms	Vai
	115				120	123
Ms	Alá Phe	Tie Tyr	Thr	Pro	Thr	Gly Tar Ms 'Phe Gys	Gla Vai	Gin
	130			135		140
(ii	11e Arq	As» Gly	Pro	Pro	Vs.i	Xle Ms Ser Giy Ha	i.-y.s Asq	Lea
145			150			155		105
Lys	Val Leu	Lys Thr	Thr	Gin	Ser	Giy Phé Gla Giy Phe	Tie Lys	Asp
		105				170	175
Öl»	Phe Thr	Thr Asa	Pro	6,1 u	Val.	Lys Asa Arq Gys Phe	Alá Thr	Gla
		180				105	130
Vei	Tvr Cys	Lys Trp	Arq	Tyr	Ms	Gla Gly Arq Asp Val.	Asp Phe	Gin
	195				200	/ KM.'
Al \	Thr Trp	Asp Thr	Val	Arq	Mr	He Val Leu Gla Lys	Phe Alá	Gly
	210			215		220
Pm	Tyr Asp	Lys Gly	Gin	Tyr	Sor	Pm Ser Val Gin Lvs	Tar Lea	Tyr
sC -J L			230			235		240

··

4XÍ «

Asp	Ile	O te	Val	te 23 2	Tííc	Laci	Gly
Olt	21«	7 ci-	i.'Ca 200	Lee		He	0 fc s
Xtfc.	Gly	cát 203	He	As:!		Ck	Gia. 230
C;C	Gly 2 0Ö	Lys	lie	The	οι i y	Tér 2 33	Val

Öle	Val 2 30	Pro	Gla	11«	Gl a	Í-D: :p 20 2	Pfcsfc:
Tv·: 20«	La a	ASO	11 a	Aag	Ga·: 270	Se fc-	fc:VS5
Val	Laa	Le·;;	Ptc	Leó 2 00	Asp	lat.	S:te
Ovo	arg	.Lys	La a	Ser

300 <2.10'.? 12 <211> SIS <212> PPG <211* SSSTÉG^: <0 00> 1.2 áfc:ggfcfctéatt fc: a fc: ggga ^a'S9 aaagaggtgg gscaattcsg ttcaaaggfc;a tcetteaagc gaaaagaacg fcigtgaggtcg saegcetega ctccctgagg 'ceg^sc&gsg aaatttgctg gacstcfcfcagg CCasatatLS giettgctao fc: t C « « C'C c accgtaatga atatgatssa easícttgagt.

a.S:gtcafc.ccfc;

fc.fc:a:.as.agcst atgtcafc.cfcjg:

gagttaagca ascsga£;sag tgaaggacíig atgtggactt ggcccta'fega tyCtt&CCCt actaettaaa <::eetsgacaa tg: cga ctaeaaaaay agttetetat ge&setcAct· tacsgae&cc ag&aectttt. agcfc: caagt c 'fegtceatgea •yafcttggacc·: gfcrLggcfcOCt. gttgccttgee 'fegaí.jg-cfc:afc;c' caaaggcgsg gggccaggt·: tittagaciKtg fc; cfc;atafc:ggc aa'fegatgagc at'fecagfcfegag ttgagclcca at c a ag .cac a gctgCgacta tatgfcggaag· tttetttata ecsgteattt gaaggattea acccaagtgí: Cgggacactg tactcgecct ccfc:g:agatag tccsaaatgg aggató, a ctg taga.gfc.ttgt atggaaaata sasa agat te. cagtoaatgt tecgtgagca aagttcctfc:g etet tas; tgg attetggaat títaaggacca. actgeaaatg rcaggageat ctgttcagaa •tagat .< t cga gaeteateaa gcacagteaa ecgasctggc ccacagcatt cetgeatgga •cct-ggcg&eg etteeettet gaagcgtttt aacgöacttc caasgaccta. g fc. fc: e a c ·::: a c c gcgcfcaccac tgtcctgcag yataerrtat aafc:cagcctg eaaggaagag gaggaagíctg

120 100 210 300 300 •420 400 34 0 300 300 220 700 340 300 310

<22.3 >	12
<211;·'	SÍ:
<2:12 >	PH
<2:13 >	PÁ
<4 00 >	12

afcggcegacfc: tafc.gggaagg aaagaggtgg gataabtcag t fc. fc: á a ggga a tcttttaacc «aaaagaafeg tgtgaagttg aaggccttga ctccctgagg cagtgeaggg aaatttgctg gatatecagg eca a a fc:«c t c gfc:c ::;:«··:: fc:gc tefc fccaagae aeca fc: aacaa at afc:ggfc:aaa caacttcagfc: atatca tccc t caaaagcaí: atgta.atcsíg g:agCfc:aagcs aacaacfcgag aaacaacaca fc.gaaggaccg atgeggaetófe ggceec.acga tettetecet actaettcaa cattagacaa fc.gtga ctataaaaag agttctccat gcaact taet ta.cagacacc agaágecctt a:gstcaag£:c fc:gS.fc.'ca tgea aag'feggaccc gfc.efc:gga.'::£:fc: atgfc;t ttgcc fc; gagg í ; t acfc; caaaggcgag gagccgagfctfe tatagacatg tccatacgga aacgatgaac atcaagcgag ctgagttcca atcaagsaca ggCgtgsata tsegtggaag creatteaca cccgtcafcfc.c gaaggtttea acetaagtgt tggggcacca Ca.ctfcrafcfccct: cctgagatag tccaaaa tgg aaastcacfeg fcggsgtttgfc:

atgg.aaaa.ca aaaaagafcfca fctag'fetcatgfc:

tt.fc:gfc:gag::.a aaatcecttg cfc < fc-cacfcgc attctggaafc: tcaaggacca actgeaagtg ttcgggaccfc ctgtgcaeaa aagstafcgea gietgatcas gtafcfcags.caa cegasetgge teseagcact cctgcatgga cttggcsaag ttttetttet gsfcfcgegtett aacacacttc caaagacctc gtCcaccaec gcgcfc:sceac tgtcctggag gafc;cctfc;tafc aatcagcetg caaggafcigay gaggaagttg

Claims (13)

1. któdosltoit rekombmáns emlős uhkáz tehene. amely egy pav-án urikáz ammosav-szekvencb egy részéből és egy sebes uhkáz aminosav-szekvsncía agy rászéböí ál, és «melynél s módosítás-az alábbiakat foglalja magéban; egy lyincscnort a 5. számú szekvencia szennti pávián urikáz 291-es aminosav-halyén.

2, Az 1, igénypont szerint; fehérje, amelyben az andíiert rekombináns unkáé kimére fehége 304 aminosavat tartalmaz, és az említett 304 smínosavbót az első 225 N~ terminális rész a sertés urikáz 1-225-ös aminosava, az említeti 304 amlnosavból pedig a többi 79 aminosav a pávián urikáz 228-354-es aminosava.

3. Az 1. igénypont szerinti fehérje, amelyben az említett rekombináns urikáz kimára fehéne 304 aminosavat. tartalmaz., és ez. említett 304 amléosavböl ez első 288: ék terminális rész a sertés urikáz ί-288-as aminosava, ez említett 304 amieosavbol pedig a többi 16 aminosava pávián urikáz 239-304~es aminosava.,

4. Rekombináns urikáz fehérje, amelyet az alábbi csoportból választhatunk, ki; 2.. szemű szekvencia, 4. számú szekvencia, 8. számú szekvencia, 8. számé szekvencia, 10. számú szekvanole és 1:1. számú szekvencia,

5, izolált as tisztított nukleinsav molekula, amely az 1. Igénypont szerinti rekombí-náns ankézt kódolja;

6, izolált és tisztított nukleinsav molekula, amely a z, igénypont szerinti mkomblnáns urikázt kódolja, ?, Izolált ás bs,u mú nukleinsav molekula, amely a 3. Igénypont szerinti rekomblnáns unkázi kódolja.

3. Izolált és tisztított nukleinsav molekula, amely a 4. igénypont, szerinti rekombínáns urikázt kódolja.

9, A 8, Igénypont szennti izolált: es tisztított nukleinsav molekula, amelynek az aíapszekvencíála megegyezik az l ezárna szekvencia szerinti nukleotid szekvenciával.

ssy ' s-r << ; _{s s} o << ::..... y/s·· ϊ

10. A S. Igénypont szerinti Izalélt és tisztított nukteirtsav molekula, .amelynek az alapszekvenciája megegyezik a 3. számú szek'/enca szenny rmkleotio szekvenciával.

11. Vektor, amely ez 5-7. Igénypont szerinti nnklalnsav molekulát tartalmazza,

12. Vektor amely a 5, Igénypont szehnii nvklaínsav molekulát tartalmazza.

13. Gazdasejl amely all. Igénypont szerinti vektort tartalmazza,

14. GazOasejt, amely a 12. igénypont szerinti vektort tartalmazza.

15. Az 1, Igénypont szénné fehérje. amelynél a tehene: első hat amlnosaya esen-