CN111088268B - 一种高尿酸血症的基因治疗药物 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种重组腺相关病毒介导的高尿酸血症治疗药物。重组腺相关病毒载体携带人为设计的尿酸氧化酶基因表达框。体内实验表明，该重组腺相关病毒载体能够高效地导入体内，持续稳定地表达尿酸氧化酶，降低尿酸含量，有效地缓解因血液中尿酸过高导致的痛风症状。结果提示，该重组腺相关病毒载体有希望开发成为一种新的高尿酸血症治疗药物。

Description

一种高尿酸血症的基因治疗药物

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重组腺相关病毒载体携带人为设计尿酸氧化酶基因表达框的高尿酸血症基因治疗药物。

背景技术

随着经济水平的提高和人们生活方式及膳食结构的改变，痛风和高尿酸血症的发病率在世界范围内呈逐年上升趋势（郭立新.药品评价.2014; 11(1): 21-23. Weaver AL.Cleve Clin J Med. 2008;75(s5):s9-s12.）。高尿酸血症是由嘌呤代谢紊乱导致尿酸生成增多和（或）排泄减少，使血液中尿酸浓度高出正常范围所致，是痛风发病的生化基础（张玉梅，等. 医学综述. 2012;18(15):2441-2444.），临床诊断标准为正常嘌呤饮食状态下，男性血液尿酸含量＞420μmol/L，女性血液尿酸含量＞360μmol/L（Prasad Sah OS, et al.Nephrourol Mon.2015;7(3):e27233.）。高尿酸血症通常与高脂血症、高血压病、2型糖尿病、肥胖症、动脉粥样硬化、冠心病等疾病伴发，且与血管、心脏、肾脏不良预后密切相关，严重危害人类健康（Susic D, et al. Cardiorenal Med. 2015; 5(3):175-182.）。

尿酸（uric acid，UA）是一种弱酸（pKa = 5.8），是嘌呤代谢的最终氧化产物，在生理pH条件下，主要以尿酸盐离子形式存在。在正常状态，体内的尿酸60%～70% 经肾脏排泄，约30%被肠道内细菌分解或经胆道排泄，约1%经汗液排出。研究证明，尿酸在机体内有双重作用，既是机体内最重要的一种抗氧化剂，具有抗氧化应激的作用，又可损害血管内皮功能，诱发血管炎症（Lioté F, et al. Rheum Dis Clin North Am.2006;32(2):295-311.Lippi G, et al. Clin Chim Acta. 2008;392(1-2):1-7.）。

尿酸氧化酶（urate oxidase）可以催化尿酸氧化成尿素囊。研究发现，许多物种体内均存在这种酶，然而在人类和猿类等高等动物体内却缺乏这种有生物活性的尿酸氧化酶（朱献军，等. 生物工程学报. 2001;17(1):68-72.）。肝脏是尿酸形成的重要器官，肾脏是尿酸排泄的重要器官，如果肝脏尿酸产生过多或肾脏尿酸排泄量过少，可使体内血尿酸水平升高，从而导致高尿酸血症。血液中98%的尿酸以钠盐形式存在，当血中尿酸浓度超过其在血液中的最大溶解度时，尿酸盐会析出针状结晶，沉积在肾脏、皮下软组织、关节滑膜、滑囊、软骨等酸度较高的组织或温度较低的远侧端肢体，引起一系列病理反应尿酸盐呈结节状硬结，称痛风石。在肾脏排泄尿酸的过程中，若尿酸盐沉积在肾间质中，可引起间质纤维化、尿酸性肾病，甚至可导致肾小管萎缩。

经循证医学研究证实，肾脏对尿酸的清除率下降使得血尿酸水平升高，与高血压、高血脂、胰岛素抵抗、动脉粥样硬化及冠心病等疾病的发生和进展密切相关。因此控制体内的尿酸浓度，使其维持在正常水平具有重要的生理意义。

高尿酸血症是一种复合性的代谢综合征，其发病机制涉及多种基因遗传，如某些酶基因突变，使其活性在嘌呤的分解代谢过程中发生改变，致使体内血尿酸浓度升高，导致高尿酸血症的发生。按照发病机制的不同，可以分为原发性高尿酸血症和继发性高尿酸血症。原发性高尿酸血症属于遗传性疾病，常由基因缺陷引起。血清尿酸浓度以及肾脏对尿酸的调节都具有显著遗传性，是由多个基因和环境因素共同调控的。继发性高尿酸血症的病发原因有很多，主要由血液病、肾脏病和药物治疗等因素引起。

在高尿酸血症的患者中，由于酶缺陷而导致嘌呤合成代谢过程中产生过多尿酸的比例不足10%。主要的相关酶有次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）、磷酸核糖焦磷酸合成酶（PRS）、葡萄糖6磷酸酶（G-6-P）等。次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶因基因突变导致其酶活性降低，使鸟嘌呤变为鸟嘌呤核苷酸和次黄嘌呤转变为次黄嘌呤核苷酸减少，两种嘌呤不能被再利用合成核酸或被清除，使终末产物尿酸升高，如Lesch-Nyhan综合征，是HGPRT基因突变，致使酶活性完全丧失，从而导致患者智力发育低下，有强迫性自残行为并伴有痛风和高尿酸血症；HGPRT活性部分缺乏患者的神经系统症状较轻或无，只伴有痛风和高尿酸血症（Mak BS, et al. Pediatr Neurol. 2000;23(4):332-335.）。PRPP合成酶活性增加，引起磷酸核糖焦磷酸（PRPP）合成过多，而PRPP是嘌呤合成的关键性调节因子，最终使尿酸产生过多（Liu XZ, et al. Int J Audiol. 2013; 52(1):23-28.）。葡萄糖6磷酸酶基因缺陷，会使合成PRPP的5’-磷酸核糖途径代偿性增强，尿酸产生过多，肾脏尿酸清除减少（Chou JY, et al. Curr Mol Med. 2002; 2(2): 121-143.）。

肾小管尿酸分泌重吸收功能障碍，使尿酸排泄减少，是引发高尿酸血症的原因之一。该功能障碍与多基因遗传缺陷相关。Kudo等（Kudo E, et al. Kidney Int. 2004; 65(5): 1589-1597.） 研究发现，家族性青少年高尿酸血症肾病（familial juvenilehyperuricemic nephropathy，FJHN）的主要机制是近段肾小管腔内阴离子交换获得性功能突变，尿酸分级排泄显著减少，或近段肾小管上皮细胞凋亡，肾血流动力学改变，尿酸分泌率降低。研究发现，编码亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）的基因多态性与痛风和高尿酸血症相关。在对MTHFR与血清尿酸水平的相关性的研究中发现，导致高尿酸血症的独立危险因素是MTHFR基因C677T突变（Stibůrková B, et al. PLoS One. 2014; 9(5): e97646.）。

肾小球滤过尿酸减少和（或）重吸收增加，可导致尿酸排泄减少，引发高尿酸血症。由于尿酸带负电荷，不能自由通过细胞磷脂双分子层，所以在肾小管中尿酸依赖离子通道进行排泄。其相关蛋白有尿酸盐转运蛋白1、有机阴离子转运1和葡萄糖转运蛋白9等。尿酸盐转运蛋白 1（urate transporter 1，URAT1），由SCL22A12基因编码，在肾皮质近端小管上皮细胞刷状缘表达，通过与有机阴离子的交换完成对尿酸盐的重吸收，调节肾小管对尿酸的重吸收功能，在维持血清尿酸的动态平衡中发挥重要的作用。研究证明，SCL22A12基因突变影响血尿酸水平，SCL22A12基因是促尿酸排泄药物的重要靶点之一（Enomoto A, et al.Clin Exp Nephrol. 2005; 9(3):195-205. Kim YH, et al. J Korean Med Sci. 2011;26(9):1238-1240.）。Graessler等（Graessler J, et al. Arthitis Rheum. 2006; 54(1):292-300.）研究编码URAT1的基因多态性与原发高尿酸血症有关。URAT1转运尿酸的方式为肾小管管腔内尿酸与细胞内有机阴离子进行交换，细胞内有机阴离子与URAT1有很高的亲和力，在阴离子交换过程中尿酸重吸收增加，肾小管管腔的电化学梯度下降，而细胞内阴离子可由管腔膜肾小球滤过液重吸收以及通过基底外侧的转运体由小管周的毛细血管重吸收。有机阴离子转运1（organic anion transporter 1，OAT1）和有机阴离子转运体3（organic anion transporter 3，OAT3）都属于OATs家族，主要在肾小管上皮细胞基底侧膜表达，OAT1负责将尿酸从管周毛细血管间隙转运到肾小管上皮细胞内，一些无机阴离子和有机阴离子会影响OAT1对尿酸盐的转运，且具有时间和剂量依赖性；OAT3与OAT1的作用相似，参与尿酸盐的转运，但具体机制仍不清楚（Kojima R, et al. J Am Soc Nephrol.2002; 13(4): 848-857.）。葡萄糖转运蛋白9（glucose transporter 9，GLUT9），由SCL2A9基因编码，研究表明，除与糖代谢相关外，其在尿酸重吸收中也发挥重要作用，多项基因筛查证明GLUT9基因表达异常与尿酸代谢异常、痛风、肾结石和急慢性肾衰等疾病相关。

其他疾病如肾脏疾病、血液病、恶性肿瘤或药物治疗亦可引起血尿酸异常升高。如肾盂肾炎、慢性肾小球肾炎、多囊肾等各种肾脏疾病会导致肾小球滤过率降低、近曲肾小管对尿酸重吸收增多、尿酸分泌功能下降，尿酸的排出量减少，引起血尿酸浓度的升高。肿瘤的放化疗后由于细胞核破坏增多，核酸分解增加，尿酸随之增多；多发性骨髓瘤、淋巴瘤等血液病均可引起细胞快速增殖，核酸分解增强，造成尿酸来源增多。利尿剂（如呋塞米、氢氯噻嗪）、抗结核药（如吡嗪酰胺、乙胺丁醇）、免疫抑制剂（如环孢素）、大剂量阿司匹林（或长期小剂量服用阿司匹林）、磺脲类降糖药等可抑制尿酸排泄，胰酶制剂、部分抗生素（如氧氟沙星、加替沙星）、降脂药（如烟酸）、维生素C等可导致内源性尿酸来源增多。

针对高尿酸血症的发病机制，目前市场上也存在多种治疗药物可供选择。治疗药物分为降尿酸药物与控制急性炎症发作的抗炎药物两大类。降尿酸药按作用机制又可分为减少尿酸生成的黄嘌呤氧化酶抑制剂、增加尿酸排泄的促尿酸排泄药及分解尿酸的尿酸酶三类 。

黄嘌呤氧化酶抑制剂（xanthine oxidase inhibitor，XOI）是降尿酸一线药物，现临床多用别嘌醇和非布司他，另有2013年日本上市的托匹司他（topiroxostat）。别嘌醇（allopurinol）通过竞争性抑制黄嘌呤氧化酶（XO）的Mo-Pt催化位点起效（Truglio JJ, et al. Structure. 2002; 10(1): 115-125.）。其优势是高效低价，但也有多种不良反应与药物相互作用。不良反应包括肝肾损伤、胃肠道反应、S-J综合征（Stevens-JohnsonSyndrome）与严重超敏反应综合征（AHS）等（Saokaew S, et al. PLoS ONE.2014;9(4):e94294.）。在白细胞具有HLA-B* 5801抗原基因表型的人群（包括中国汉族人）中，AHS导致的患者死亡率约为27%（Ryu HJ, et al. J Clin Pharm. 2013;53(2):211-216.）。另外，别嘌醇与阿莫西林、茶碱等药物相互作用会增加不良反应发生的风险（Jick H, et al. JClin Pharm. 1981;21(10):456-458.）。

非布司他（febuxostat）通过结合疏水空腔从而可以非竞争性抑制XO（Okamoto K,et al. J Biol Chem. 2003; 278(3): 1848-1855.）。研究表明非布司他比别嘌醇降尿酸效果更好（Richette P, et al. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2015; 19(4):630-639.），对肾损伤及药物相互作用更少，对老年患者、AHS反应患者以及患有其他并发症患者效果好（Chohan S, et al. J Rheumatol. 2011; 38(9): 1957-1959.）。不过相比别嘌醇其对肝药酶活性增强更明显（Becker MA, et al. Arthritis Res Ther. 2010; 12(2): R63.）、心血管不良事件更多（Keenan RT. Rheumatic Disease Clinics of North America.2012; 38(4):663-680.）。

美国风湿病协会治疗指南将促尿酸排泄药（Uricosuric）作为XOI不耐受或使用禁忌时的选择。该类药物既可单用，也可联合使用。指南推荐一线单用药物为丙磺舒。联合用药则推荐联用兼有促尿酸排泄作用的非诺贝特与氯沙坦。促尿酸排泄药通过抑制肾小管对尿酸的重吸收来促进尿酸排泄。临床多用磺胺类药物，如丙磺舒、苯磺唑酮、苯溴马隆等。苯溴马隆由于损伤肝/肾功能的不良反应已退出美国和欧盟市场（Azevedo VF, et al. IntJ Rheumatol. 2014; 2014:263720.）。当尿酸重吸收过程被抑制，大量尿酸会进入肾脏。弱酸性的尿酸在pH较低的尿液中溶解度更低，更易在肾脏中析出晶体，引发损伤。因此该类药物对患者肾功能有一定要求。为减少尿酸在尿液中析出，应用该类药物前常需碱化尿液，碱化尿液药物包括碳酸氢钠、枸橼酸钾钠合剂（如Uralyt）等 。

灵长类以外哺乳动物体内均存在尿酸氧化酶（urate oxidase），可将尿酸氧化为水溶性更强的尿囊素排出体外。pegloticase是聚乙二醇衍生化重组尿酸氧化酶注射液，商品名为普瑞凯希，2010年FDA批准用于治疗顽固性痛风。但该药价格昂贵且应答率相对较低（Sundy JS, et al. JAMA. 2011; 306(7): 711-720.）。另约40%患者会产生抗体。并且有皮疹等注射反应， 葡糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺失患者与末期肾病患者也禁止使用。拉布立酶（rasburicase）是重组黄曲霉菌尿酸氧化酶制注射剂，用于癌症化疗伴随的高尿酸血症。该药为非聚乙二醇化制剂，故半衰期相对较短。另一不足是G6PD缺失患者中有着较高的注射反应发生率，表现为过敏性反应、高铁血红蛋白血症与溶血（Sonbol MB, et al. Am JHematol. 2013; 88(2): 152-154.）。

抗炎药在高尿酸血症与痛风病程中的作用之一是控制痛风或痛风性关节炎急性炎症发作； 二是用于痛风预防治疗（Khanna D, et al. Arthritis Care Res. 2012; 64(10): 1447-1461.）。常用药物有肾上腺糖皮质激素、非甾体抗炎药（NSAIDs）及秋水仙碱。肾上腺皮质激素对急性痛风作用明显，但其免疫抑制作用会增加再次感染的风险。非甾体类抗炎药物尤其是COX-2特异性抑制剂是痛风性关节炎的一线药物，但仅能缓解急性痛风症状。秋水仙碱为NSAIDs不耐受的急性痛风发作的孤儿药，但会引起肠胃不适、骨髓抑制等不良反应，并且中毒后缺乏有效解毒剂。虽然抗炎药能够在一定程度上缓解痛风症状，但不能够有效地降低血液中尿酸含量，对高尿酸血症带来的其他影响无法消除。

综上所述，高尿酸血症最有效的治疗途径还是降低血液中的尿酸浓度。降低血液中的尿酸浓度不仅能够有效地缓解痛风症状，还能够改善因血液中尿酸浓度过高带来的其他负面影响。最理想的方式是，利用尿酸氧化酶将血液中尿酸氧化成更溶于水的尿囊素，通过尿液排出体外。遗憾的是，由于进化过程的基因突变，人类自身不能够合成尿酸氧化酶。普瑞凯希和拉布立酶的开发成功说明了外源表达的尿酸氧化酶能够催化血液中的尿酸转化为尿囊素，有效地降低血液中的尿酸含量，从原理上证明了尿酸氧化酶治疗高尿酸血症的可能性。但是两种药物高昂的价格、较强的副作用和需要反复给药带来的不便性限制了其应用于更多的患者。

为此，我们在本发明中设计了用于高尿酸血症的基因治疗药物pscAAV-CAG-SUO和pscAAV-CAG-SPEG。首先人为设计了可分泌的尿酸氧化酶基因SUO和SPEG，选择人CystatinS蛋白的分泌信号肽，保证表达蛋白高效分泌入血；设计的SUO尿酸氧化酶为猪尿酸氧化酶和狒狒尿酸氧化酶的融合蛋白，既保证了表达产生尿酸氧化酶的活性，又降低了表达得到尿酸氧化酶的免疫原性；设计的SPEG尿酸氧化酶为Pegloticase，一种聚乙二醇化尿酸特异性酶，可催化尿酸氧化为尿囊素。其次，采用人为设计的高效表达启动子CAG调控SUO基因表达。选择安全、不致病的重组AAV载体（Dismuke DJ, et al. Curr Gene Ther. 2013; 13(6): 434-452.）携带SUO基因表达框。进一步提高了药物开发成功的可能性。

腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）因在腺病毒制品中发现而得名（Atchison RW, et al. Science. 1965; 149: 754-756.Hoggan MD, et al. Proc NatlSci USA. 1966; 55: 1467-1474.）。AAV是微小病毒科（Parvovirus）成员，包含多种血清型，其基因组为单链DNA（Rose JA, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1969; 64: 863-869.），其中AAV2的基因组大小为4682个核苷酸。AAV是依赖性病毒，需要其它病毒如腺病毒、单纯疱疹病毒和人乳头瘤病毒（Geoffroy MC, et al. Curr Gene Ther. 2005; 5(3):265-271.），或辅助因素提供辅助功能才能复制。在没有辅助病毒存在时，AAV感染细胞后其基因组将以附加体的形式潜伏到染色体中（Chiorini JA, et al. Curr Top MicrobiolImmunol. 1996; 218:25-33.），而不产生子代病毒。

最早分离到的AAV病毒是血清型2型AAV（AAV2）（Atchison RW, et al. Science.1965; 149: 754-756.）。AAV2基因组长约4.7kb，基因组两端为长度145bp的 “反向末端重复序列”（inverted terminal repeat，ITR），呈回文-发卡结构（Lusby E, et al. JVirol. 1980; 34: 402-409.）。基因组中有两个大开放阅读框（ORF），分别编码rep和cap基因。AAV2的全长基因组已克隆至大肠杆菌质粒中（Samulski RJ, et al. Proc Natl AcadSci USA. 1982; 79: 2077-2081. Laughlin CA, et al. Gene. 1983; 23: 65-73.）。

ITR是AAV载体基因组的顺式作用元件，在AAV病毒的整合、拯救、复制和基因组包装中发挥重要作用（Xiao X, et al. J Virol. 1997; 71(2): 941-948.）。ITR序列中包含Rep蛋白结合位点（Rep binding site，RBS）和末端解链位点trs（terminal resolutionsite），能够被Rep蛋白结合识别并在trs处产生切口（Linden RM, et al. Proc Natl AcadSci USA. 1996; 93(15): 7966-7972.）。ITR序列还可形成独特的“T”字母型二级结构，在AAV病毒的生活周期中发挥重要作用（Ashktorab H, et al. J Virol. 1989; 63(7):3034-3039.）。

AAV2基因组其余部分可分为2个功能区，rep基因区和cap基因区（Srivastava A,et al. J Virol. 1983; 45(2): 555-564.）。rep基因区编码Rep78、Rep68、Rep52和Rep40四种Rep蛋白。Rep蛋白对于AAV病毒的复制、整合、拯救和包装都具有重要作用。其中Rep78和Rep68与ITR中的末端解链位点trs（terminal resolution site）和GAGY重复基序（repeat motif）特异性结合（Hüser D, et al. PLoS Pathog. 2010; 6(7): e1000985.），启动AAV基因组由单链向双链的复制过程。ITR中trs和GAGY重复基序是AAV基因组复制的中心，因此虽然在各种血清型的AAV病毒中ITR序列都不尽相同，但是都能形成发卡结构和都存在Rep结合位点。在AAV2基因组图谱位置19处有p19启动子，分别表达Rep52和Rep40。Rep52和Rep40没有结合DNA的功能，而有ATP依赖的DNA解旋酶活性。cap基因编码AAV病毒的衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。其中，VP3分子量最小，但数量最多，在成熟的AAV颗粒中VP1、VP2、VP3的比例大致为1:1:10。VP1是形成有感染性的AAV所必需的；VP2协助VP3进入细胞核；VP3是组成AAV颗粒的主要蛋白。

随着对AAV病毒生活周期及其相关分子生物学机制的了解，AAV病毒被改造成了一种高效的外源基因转移工具，即AAV载体。改造后的AAV载体基因组中只包含AAV病毒的ITR序列和携带转运的外源基因表达框，病毒包装需要的Rep和Cap蛋白通过外源质粒反式提供，降低了rep和cap基因包装入AAV载体可能带来的危害。加之，AAV病毒本身不具有致病性，使AAV载体成为公认的最安全的病毒载体之一。删除AAV病毒的一侧ITR序列中的D序列和trs（terminal resolution site）序列还能够使包装得到的重组AAV病毒载体携带基因组自我互补，形成双链，显著提高AAV载体的体内外转导效率（Wang Z, et al. Gene Ther.2003;10(26):2105-2111. McCarty DM, et al. Gene Ther. 2003;10(26):2112-2118.）。包装得到的病毒成为scAAV（self-complementary AAV）病毒，即所谓的双链AAV病毒。不同于双侧ITR均未突变的ssAAV（single-stranded AAV），即传统的AAV病毒。scAAV病毒的包装容量更小，仅为ssAAV包装容量的一半，约为2.2kb-2.5kb，但感染细胞后转导效率更高。AAV病毒血清型众多，不同的血清型具有不同的组织感染嗜性，因此应用AAV载体能够将外源基因转运至特定的器官和组织（Wu Z, et al. Mol Ther. 2006; 14(3): 316-327.）。某些血清型AAV载体还可穿越血脑屏障，将外源基因导至大脑神经元中，为靶向大脑的基因转导提供了可能（Samaranch L, et al. Hum Gene Ther. 2012; 23(4): 382-389.）。此外，AAV载体的理化性质稳定，对酸碱和高温体现出较强的耐受性（Gruntman AM, et al. Hum GeneTher Methods. 2015; 26(2): 71-76.），容易开发出稳定性较高的生物制品。

AAV载体还具有相对成熟的包装系统，便于规模化生产。目前国内外常用的AAV载体包装系统主要包括三质粒共转染系统、腺病毒为辅助病毒系统、单纯疱疹病毒（Herpessimplex virus type 1，HSV1）为辅助病毒的包装系统以及基于杆状病毒的包装系统。其中，三质粒转染包装系统因无需辅助病毒，安全性高，是应用最为广泛的AAV载体包装系统，也是目前国际上主流的生产系统。略显不足的是，高效大规模转染方法的缺失限制了三质粒转染系统在AAV载体大规模制备中的应用。Yuan等建立以腺病毒为辅助病毒的AAV大规模包装系统（Yuan Z, et al. Hum Gene Ther. 2011; 22(5):613-624.），该系统生产效率高，但包装系统中腺病毒在最后AAV成品中的痕量存在，影响了AAV成品的安全性。HSV1作为辅助病毒的包装系统是另一类应用较为广泛的AAV载体包装系统。伍志坚和Conway等几乎同时在国际上提出了以HSV1为辅助病毒的AAV2载体包装策略（伍志坚，等. 科学通报.1999, 44(5): 506-509。Conway JE, et al. Gene Ther. 1999; 6:986-993.）。随后Wustner等提出了以HSV1为辅助病毒的AAV5载体包装策略（Wustner JT, et al. MolTher. 2002; 6(4):510-518.）。在此基础上，Booth等利用两个HSV1分别携带AAV的rep/cap基因和AAV的反向末端序列（Inverted terminal repeat，ITR）/外源基因表达框，然后两个重组HSV1病毒共同感染生产细胞，包装产生AAV病毒（Booth MJ, et al. Gene Ther,2004,11:829-837.）。Thomas等进一步建立双HSV1病毒AAV生产的悬浮细胞系统（Thomas DL, et al. Gene Ther. 2009; 20:861-870.），使更大规模的AAV病毒生产成为可能。另外，Urabe等利用三个杆状病毒分别携带AAV的结构、非结构和ITR/外源基因表达框，构建了AAV载体的杆状病毒包装系统。考虑到杆状病毒携带外源基因的不稳定性，随后减少了生产系统中所需杆状病毒的个数，逐渐从最开始的需要三个杆状病毒到需要两或一个杆状病毒（ChenH. Mol Ther.2008;16(5):924-930. Galibert L,et al.J Invertebr Pathol. 2011;107 Suppl:S80-93.）以及一个杆状病毒加一株诱导细胞株策略（Mietzsch M, et al. HumGene Ther. 2014;25:212-222. Mietzsch M, et al. Hum Gene Ther. 2015;26(10):688-697.）。每种包装系统都各具特点，可根据需要做出合适的选择。

由于上述特点，AAV载体逐渐成为一种广泛应用于基因治疗，特别是遗传病的基因治疗的外源基因转运工具。截至2016年8月，世界上批准的机遇AAV载体的基因治疗临床试验方案有173项（http://www.abedia.com/wiley/vectors.php）。更为重要的是，基于AAV载体的脂蛋白脂酶基因治疗药物Glybera已于2012年被欧洲药监局批准上市，成为西方世界批准的第一个基因治疗药物（Ylä-Herttuala S. Mol Ther. 2012; 20(10): 1831-1832.）；血友病B（Kay MA, et al. Nat Genet. 2000; 24(3): 257-261.）和先天性黑蒙症（RPE65基因突变引起）（Jacobson SG, et al. Arch Ophthalmol. 2012; 130(1): 9-24.）的AAV载体基因治疗药物均取得不错的临床试验效果，预期在不久的将来会上市销售，造福广大患者。

本发明中，我们选择AAV载体来携带SUO基因和SPEG基因的表达框，主要是基于AAV载体的以下特点。其一，AAV载体仅保留野生型病毒中包装需要的两个ITR序列，不含有野生型病毒基因组中的蛋白编码基因（Salgenik M, et al. Microbiol Spectr. 2015; 3(4).），免疫原性低。其二，AAV通常以不整合的染色体外遗传物质形式实现携带基因读框的持续稳定表达（Chen ZY, et al. Mol Ther. 2001; 3(3): 403-410.），避免引导入基因随机整合而带来的安全性问题。其三，AAV载体通过静脉注射、肌肉注射都具有较高的转导效率（Wang Z, et al. Nat Biotechnol. 2005; 23: 321-328. Bish LT, et al. Hum GeneTher. 2008; 19: 1359-1368. Zincarelli C, et al. Mol Ther. 2008; 16: 1073-1080. Prasad KM, et al. Gene Ther. 2011; 18: 43-52. Rebuffat A, et al. HumGene Ther. 2010; 21(4): 463-477.），保证SUO基因表达框能够在体内高效地表达SUO蛋白。其四，AAV载体通过口服能够感染肠上皮细胞（Ma H, et al. Hepatology. 2005; 42(6): 1355-1363.），使口服给药就可能表达产生尿酸氧化酶，从而降低血液中的尿酸含量，达到治疗高尿酸血症的目的。

为了提高机体内SUO基因和SPEG基因的表达水平，延长SUO基因和SPEG基因持续稳定表达的时间，我们人为设计了高效表达的CAG启动子，让导入的SUO基因和SPEG基因在体内高效表达。

根据以上设计思路，我们制备得到scAAV-CAG-SUO和scAAV-CAG-SPEG病毒。将该病毒与对照病毒分别等剂量口服或注射至高尿酸血症小鼠模型体内，评价所设计scAAV-CAG-SUO和scAAV-CAG-SPEG的有效性。结果显示，scAAV-CAG-SUO和scAAV-CAG-SPEG能够在高尿酸血症小鼠模型体内表达SUO蛋白和SPEG蛋白，显著降低高尿酸血症小鼠模型体内的尿酸含量，有效缓解或治疗因血液中尿酸浓度偏高带来的痛风等症状。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种基于AAV载体的新型的高尿酸血症基因治疗药物。该药物由AAV载体携带SUO基因或SPEG基因表达框。人为设计的SUO基因由人Cystatin S蛋白的分泌信号肽（Barash S, et al. Biochem Biophys Res Commun. 2002; 294(4): 835-842.），来源于猪的尿酸氧化酶和狒狒尿酸氧化酶的融合序列组成。人为设计的SPEG基因由人Cystatin S蛋白的分泌信号肽（Barash S, et al. Biochem Biophys Res Commun.2002; 294(4): 835-842.）和Pegloticase序列（一种聚乙二醇化尿酸特异性酶）组成。采用人为设计的高效表达启动子CAG调控SUO基因或SPEG基因的表达。基于上述设计，预期该药物通过口服、静脉注射或者肌肉注射后能够在高尿酸血症小鼠体内高效分泌表达尿酸氧化酶，催化血液中的尿酸转化为尿囊素，显著降低血液中的尿酸浓度，预防和治疗因血液中尿酸浓度过高带来的痛风等症状。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种治疗高尿酸血症的基因治疗药物，其特征在于，该药物基于重组AAV载体，利用AAV载体通过口服、静脉注射或者肌肉注射能高效地把药物效应元件导入体内，实现药物效应元件表达产物治疗作用蛋白——尿酸氧化酶的高效表达。为了实现尿酸氧化酶的高效表达，根据不同血清型AAV的转导特点，不同的给药方式选择相应的血清型AAV，如静脉注射主要选择AAV2、AAV3B、AAV6、AAV8和AAV9等，肌肉注射则主要选择AAV1、AAV8和AAV9等，口服主要选择AAV1、AAV2、AAV5、AAV8和AAVrh.10等。

本发明提供的高尿酸血症基因治疗药物，其特征在于，使用的AAV载体为ssAAV载体和scAAV载体。优先选择为scAAV载体，scAAV载体能够自身互补形成双链，避免了ssAAV进入细胞后需要通过DNA修复、复制等合成互补链才能转录表达携带外源基因的过程，因此scAAV载体转导效率更高，表达更为迅速。

本发明提供的治疗高尿酸血症的基因治疗药物，其特征还在于，含人为设计的分泌性尿酸氧化酶序列SUO或SPEG。参考文献(Barash S, et al. Biochem Biophys ResCommun. 2002;294(4):835-42.)，选择人Cystatin S蛋白（PI：AAH74953.1）信号肽序列（SEQ ID No.1），该信号肽具有序列短小、分泌作用强的特点，保证了表达产生的SUO蛋白或SPEG蛋白能够高效地分泌至细胞外，进入血液循环，使血液中尿酸的降解成为可能。由于人类进化过程中尿酸氧化酶基因发生突变，不能表达产生尿酸氧化酶蛋白，因此我们设计的尿酸氧化酶为猪尿酸氧化酶和狒狒尿酸氧化酶的融合序列。我们选择猪尿酸氧化酶（GenBank：AAA31141.1）的1-252位氨基酸序列（SEQ ID No.2）和狒狒尿酸氧化酶（GenBank：AAA35395.1）的253-304位氨基酸序列（SEQ ID No.3）组成融合蛋白，既保证了表达产生尿酸氧化酶的活性，又降低了表达得到尿酸氧化酶的免疫原性。我们将融合得到的尿酸氧化酶加上人Cystatin S蛋白分泌信号肽的蛋白命名为SUO蛋白（SEQ ID No.5）。根据专利US8178334推测出Pegloticase的氨基酸序列（SEQ ID No.4），SPEG蛋白是由人Cystatin S蛋白的信号肽和Pegloticase序列融合而成的，将融合得到的Pegloticase尿酸氧化酶加上人Cystatin S蛋白分泌信号肽的蛋白命名为SPEG蛋白（SEQ ID No.6）。进一步设计了SPEG蛋白的基因表达框。基于设计的 SPEG基因表达框能够实现 SPEG蛋白的高效表达。进一步设计了SUO蛋白和SPEG蛋白的基因表达框。基于设计的SUO基因和SPEG基因表达框能够实现SUO蛋白和SPEG蛋白的高效表达。首先根据密码子偏爱性、GC含量、CpG二聚体含量、mRNA二级结构、消除隐蔽剪接位点、消除让转录提前终止的polyA加尾信号、消除内部chi位点和核糖体结合位点、CpG岛、消除ARE序列等RNA不稳定基序和RNA重复序列（正向重复、反向重复和二重复等）等原则优化合成SUO蛋白的编码区序列（SEQ ID No.7）和SPEG蛋白的编码区序列（SEQ ID No.8）。采用人为设计的CAG启动子调控SUO基因和SPEG基因转录，CAG启动子（SEQ ID No.9）由人CMV病毒的增强子序列和鸡β-actin蛋白的基础启动子组成，使SUO基因和SPEG基因能够在多种细胞中高效转录。

本发明提供的高尿酸血症基因治疗药物，其特征在于，将该药物经静脉注射至高尿酸血症模型小鼠体内后，能在小鼠体内高效稳定持续地分泌表达SUO蛋白和SPEG蛋白，表达产生的SUO蛋白和SPEG蛋白将血液中或细胞内的尿酸转化为尿囊素，显著降低血液中的尿酸含量，消除因血液中尿酸过高带来的痛风等不良影响，从而达到治疗高尿酸血症的目的。

本发明提供的高尿酸血症基因治疗药物，其特征在于，该药物经肌肉注射至高尿酸血症小鼠体内后呈现出同静脉注射相似的治疗效果。但需要采用不同于静脉注射方式的血清型AAV来携带SUO基因和SPEG基因表达框，且需要改变药物的注射剂量。

本发明提供的高尿酸血症基因治疗药物，其特征在于，该药物经口服灌至高尿酸血症小鼠体内后呈现出同静脉和肌肉注射相似的治疗效果。但需要采用不同于静脉或肌肉注射方式的血清型AAV来携带SUO基因和SPEG基因表达框，且需要改变药物的使用剂量。

本发明提供的高尿酸血症基因治疗药物，其特征还在于，经口服、静脉或肌肉注射一次给药就能够长期持续地降低高尿酸血症患者体内的尿酸含量，消除因尿酸过高带来的痛风等不良影响，从而达到长时间的治疗效果。

本发明用到的重要原始实验材料如下所示：

pHelper质粒，来源于AAV Helper Free System（Agilent Technologies，美国），由本公司购自AgilentTechnologies公司并保存。该质粒包含三质粒共转染HEK293细胞制备重组AAV病毒所需要的腺病毒来源辅助功能基因E2A、E4和VA RNA等。

pAAV-RC质粒，来源于AAV Helper Free System（Agilent Technologies，美国），由本公司购自AgilentTechnologies公司并保存。pAAV-RC质粒包含完整的AAV2的rep和cap基因，在三质粒共转染包装制备重组AAV2病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）和AAV2外壳蛋白。

pAAV-R2C1质粒，由本公司构建保存。以AAV Helper Free System（AgilentTechnologies，美国）中的pAAV-RC质粒为基本骨架，用AAV1基因组（GenBank ID：NC_002077）中外壳蛋白编码序列Cap1（基因组中第2223至4433位序列）替换pAAV-RC质粒中第2013至4220位序列，即得pAAV-R2C1质粒。简要的构建过程为，根据前述思路获得pAAV-R2C1质粒序列信息，人工合成pAAV-R2C1质粒中HindIII至PmeI酶切位点之间序列，采用标准的分子克隆方法，用合成序列替换pAAV-RC质粒HindIII至PmeI酶切位点之间序列，获得pAAV-R2C1质粒。pAAV-R2C1质粒包含完整的AAV1的cap基因和AAV2的rep基因，在三质粒共转染包装制备重组AAV1病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）和AAV1外壳蛋白。

pAAV-R2C6质粒，由本公司构建保存。以AAV Helper Free System（AgilentTechnologies，美国）中的pAAV-RC质粒为基本骨架，用AAV基因组（GenBank ID：AF028704.1）中外壳蛋白编码序列Cap6（基因组中第2208至4418位序列）替换pAAV-RC质粒中第2013至4220位序列，即得pAAV-R2C6质粒序列。简要的构建过程为，根据前述思路获得pAAV-R2C6质粒序列信息，人工合成pAAV-R2C6质粒中HindIII至PmeI酶切位点之间序列，采用标准的分子克隆方法，用合成序列替换pAAV-RC质粒HindIII至PmeI之间序列，获得pAAV-R2C6质粒。pAAV-R2C6质粒包含完整的AAV6的cap基因和AAV2的rep基因，在三质粒共转染包装制备重组AAV6病毒中提供病毒包装所必须的4种Rep蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）和AAV6外壳蛋白。

pAAV-R2C8质粒，由本公司构建保存。以AAV Helper Free System（AgilentTechnologies，美国）中的pAAV-RC质粒为基本骨架，用AAV8基因组（GenBank ID：AF513852）中外壳蛋白编码序列Cap8（基因组中第2121至4337位序列）替换pAAV-RC质粒中第2013至4220位序列，即得pAAV-R2C8质粒。简要的构建过程为，根据前述思路获得pAAV-R2C8质粒序列信息，人工合成pAAV-R2C8质粒中HindIII至PmeI酶切位点之间序列，采用标准的分子克隆方法，用合成序列替换pAAV-RC质粒HindIII至PmeI酶切位点之间序列，获得pAAV-R2C8质粒。pAAV-R2C8质粒包含完整的AAV8的cap基因和AAV2的rep基因，在三质粒共转染包装制备重组AAV1病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）和AAV8外壳蛋白。

pAAV-R2C9质粒，由本公司构建保存。以AAV Helper Free System（AgilentTechnologies，美国）中的pAAV-RC质粒为基本骨架，用AAV9外壳蛋白编码序列（GenBankID：AY530579）替换pAAV-RC质粒中第2013至4220位序列，即得pAAV-R2C9质粒。简要的构建过程为，根据前述思路获得pAAV-R2C9质粒序列信息，人工合成pAAV-R2C9质粒中HindIII至PmeI酶切位点之间序列，采用标准的分子克隆方法，用合成序列替换pAAV-RC质粒HindIII至PmeI酶切位点之间序列，获得pAAV-R2C9质粒。pAAV-R2C9质粒包含完整的AAV9的cap基因和AAV2的rep基因，在三质粒共转染包装制备重组AAV1病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）和AAV9外壳蛋白。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1 pAAV2neo载体结构示意图。本公司保存的两侧ITR均为145bp野生型ITR的AAV载体pAAV2neo（Dong X, et al. PLoS ONE. 2010; 5(10):e13479.）。ITR，invertedterminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。CMV promoter，人巨细胞病毒早期启动子。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。

图2 pscAAV-CAG-EGFP载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。CAG promoter，人为设计合成的启动子，由人巨细胞病毒早期增强子和鸡β-actin基础启动子组成。EGFP，增强型绿色荧光蛋白。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Neo，新霉素抗性基因读框。NotI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。

图3 pscAAV-CAG-SUO载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。CAG promoter，人为设计合成的启动子，由人巨细胞病毒早期增强子和鸡β-actin基础启动子组成。SUO，优化合成的融合尿酸酶基因序列。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Neo，新霉素抗性基因读框。NotI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。

图4 pscAAV-CAG-SPEG载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。CAG promoter，人为设计合成的启动子，由人巨细胞病毒早期增强子和鸡β-actin基础启动子组成。SPEG，优化合成的融合尿酸酶基因序列。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Neo，新霉素抗性基因读框。NotI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。

图5 重组病毒感染细胞后上清中尿酸氧化酶浓度。4种不同的重组AAV病毒（scAAV2-CAG-EGFP、scAAV2-CAM-AUO、scAAV2-CAG-SUO、scAAV2-CAG-SPEG）以MOI=10⁵感染293T细胞、原代肝细胞和MSC细胞。感染后72h收集上清，测定上清中尿酸氧化酶的含量。

图6 静脉注射重组病毒后血清中尿酸浓度。图6A示 4种不同的重组AAV病毒（scAAV9-CAG-EGFP、scAAV9-CAM-AUO、scAAV9-CAG-SUO、scAAV9-CAG-SPEG）以2×10¹¹vg/只（viral genome，vg）的剂量经尾静脉注射高尿酸血症模型小鼠。注射后不同的时间点（0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w），眼眶采血，分离血清，测定血清中尿酸含量。图6B示4种不同的重组AAV病毒（scAAV6-CAG-EGFP、scAAV6-CAM-AUO、scAAV6-CAG-SUO、scAAV6-CAG-SPEG）以2×10¹¹vg/只（viral genome，vg）的剂量经尾静脉注射高尿酸血症模型小鼠。注射后不同的时间点（0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w），眼眶采血，分离血清，测定血清中尿酸含量。

图7静脉注射重组病毒后尿液中尿酸浓度。图7A示4种不同的重组AAV病毒（scAAV9-CAG-EGFP、scAAV9-CAM-AUO、scAAV9-CAG-SUO、scAAV9-CAG-SPEG）以2×10¹¹vg/只（viral genome，vg）的剂量经尾静脉注射高尿酸血症模型小鼠。注射后不同的时间点（0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w），采集小鼠尿液，测定尿液中尿酸含量。图7B示4种不同的重组AAV病毒（scAAV6-CAG-EGFP、scAAV6-CAM-AUO、scAAV6-CAG-SUO、scAAV6-CAG-SPEG）以2×10¹¹vg/只（viral genome，vg）的剂量经尾静脉注射高尿酸血症模型小鼠。注射后不同的时间点（0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w），采集小鼠尿液，测定尿液中尿酸含量。

图8静脉注射重组病毒后血清中尿酸氧化酶浓度。图8A示4种不同的重组AAV病毒（scAAV9-CAG-EGFP、scAAV9-CAM-AUO、scAAV9-CAG-SUO、scAAV9-CAG-SPEG）以2×10¹¹vg/只（viral genome，vg）的剂量经尾静脉注射高尿酸血症模型小鼠。注射后不同的时间点（0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w），眼眶采血，分离血清，测定血清中尿酸氧化酶含量。图8B示4种不同的重组AAV病毒（scAAV6-CAG-EGFP、scAAV6-CAM-AUO、scAAV6-CAG-SUO、scAAV6-CAG-SPEG）以2×10¹¹vg/只（viral genome，vg）的剂量经尾静脉注射高尿酸血症模型小鼠。注射后不同的时间点（0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w），眼眶采血，分离血清，测定血清中尿酸氧化酶含量。

图9肌肉注射重组病毒后血清中尿酸浓度。图9A示4种不同的重组AAV病毒（scAAV1-CAG-EGFP、scAAV1-CAM-AUO、scAAV1-CAG-SUO、scAAV1-CAG-SPEG）以4×10¹¹vg/只（viral genome，vg）的剂量经肌肉注射高尿酸血症模型小鼠。注射后不同的时间点（0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w），眼眶采血，分离血清，测定血清中尿酸含量。图9B示4种不同的重组AAV病毒（scAAV8-CAG-EGFP、scAAV8-CAM-AUO、scAAV8-CAG-SUO、scAAV8-CAG-SPEG）以4×10¹¹vg/只（viral genome，vg）的剂量经肌肉注射高尿酸血症模型小鼠。注射后不同的时间点（0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w），眼眶采血，分离血清，测定血清中尿酸含量。

图10肌肉注射重组病毒后尿液中尿酸浓度。图10A示4种不同的重组AAV病毒（scAAV1-CAG-EGFP、scAAV1-CAM-AUO、scAAV1-CAG-SUO、scAAV1-CAG-SPEG）以4×10¹¹vg/只（viral genome，vg）的剂量经肌肉注射高尿酸血症模型小鼠。注射后不同的时间点（0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w），采集小鼠尿液，测定尿液中尿酸含量。图10B示4种不同的重组AAV病毒（scAAV8-CAG-EGFP、scAAV8-CAM-AUO、scAAV8-CAG-SUO、scAAV8-CAG-SPEG）以4×10¹¹vg/只（viral genome，vg）的剂量经肌肉注射高尿酸血症模型小鼠。注射后不同的时间点（0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w），采集小鼠尿液，测定尿液中尿酸含量。

图11肌肉注射重组病毒后血清中尿酸氧化酶浓度。图11A示4种不同的重组AAV病毒（scAAV1-CAG-EGFP、scAAV1-CAM-AUO、scAAV1-CAG-SUO、scAAV1-CAG-SPEG）以4×10¹¹vg/只（viral genome，vg）的剂量经肌肉注射高尿酸血症模型小鼠。注射后不同的时间点（0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w），眼眶采血，分离血清，测定血清中尿酸氧化酶含量。图11B示4种不同的重组AAV病毒（scAAV8-CAG-EGFP、scAAV8-CAM-AUO、scAAV8-CAG-SUO、scAAV8-CAG-SPEG）以4×10¹¹vg/只（viral genome，vg）的剂量经肌肉注射高尿酸血症模型小鼠。注射后不同的时间点（0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w），眼眶采血，分离血清，测定血清中尿酸氧化酶含量。

图12口服重组病毒后血清中尿酸浓度。图12A示4种不同的重组AAV病毒（scAAV2-CAG-EGFP、scAAV2-CAM-AUO、scAAV2-CAG-SUO、scAAV2-CAG-SPEG）以4×10¹¹vg/只（viralgenome，vg）的剂量口服至高尿酸血症模型小鼠中。口服后不同的时间点（0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w），眼眶采血，分离血清，测定血清中尿酸含量。图12B示4种不同的重组AAV病毒（scAAV8-CAG-EGFP、scAAV8-CAM-AUO、scAAV8-CAG-SUO、scAAV8-CAG-SPEG）以4×10¹¹vg/只（viral genome，vg）的剂量口服至高尿酸血症模型小鼠中。口服后不同的时间点（0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w），眼眶采血，分离血清，测定血清中尿酸含量。

图13口服重组病毒后尿液中尿酸浓度。图13A示4种不同的重组AAV病毒（scAAV2-CAG-EGFP、scAAV2-CAM-AUO、scAAV2-CAG-SUO、scAAV2-CAG-SPEG）以4×10¹¹vg/只（viralgenome，vg）的剂量口服至高尿酸血症模型小鼠。口服后不同的时间点（0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w），采集小鼠尿液，测定尿液中尿酸含量。图13B示4种不同的重组AAV病毒（scAAV8-CAG-EGFP、scAAV8-CAM-AUO、scAAV8-CAG-SUO、scAAV8-CAG-SPEG）以4×10¹¹vg/只（viralgenome，vg）的剂量口服至高尿酸血症模型小鼠。口服后不同的时间点（0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w），采集小鼠尿液，测定尿液中尿酸含量。

图14口服重组病毒后血清中尿酸氧化酶浓度。图14A示4种不同的重组AAV病毒（scAAV2-CAG-EGFP、scAAV2-CAM-AUO、scAAV2-CAG-SUO、scAAV2-CAG-SPEG）以4×10¹¹vg/只（viral genome，vg）的剂量口服至高尿酸血症模型小鼠。口服后不同的时间点（0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w），眼眶采血，分离血清，测定血清中尿酸氧化酶含量。图14B示4种不同的重组AAV病毒（scAAV8-CAG-EGFP、scAAV8-CAM-AUO、scAAV8-CAG-SUO、scAAV8-CAG-SPEG）以4×10¹¹vg/只（viral genome，vg）的剂量口服至高尿酸血症模型小鼠。口服后不同的时间点（0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w），眼眶采血，分离血清，测定血清中尿酸氧化酶含量。

具体实施方式

本发明公开了一种高尿酸血症的基因治疗药物，包含药物的设计、小量制备及功能验证，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。其中，如无特殊说明，实施例中涉及的各种反应试剂均可以通过商业渠道购买得到。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1 质粒载体构建

为了构建获得包装重组AAV病毒需要的pscAAV-CAG-SUO和pscAAV-CAG-SPEG质粒，我们首先以公司保存的pAAV2neo为基础，用自主设计得到的CAG启动子（SEQ ID No.9）替换pAAV2neo载体中的CMV启动子，用人工合成的缺失AAV2的ITR中trs(terminal resolutionsite)和D序列的突变ITR序列（命名为ΔITR）（SEQ ID No.13）替换pAAV2neo载体中的一侧ITR序列，得到pscAAV-CAG载体。接下来，将人工合成的SUO序列和SPEG序列克隆入pscAAV-CAG载体的KpnI和EcoRI双酶切位点之间，得到pscAAV-CAG-SUO载体和pscAAV-CAG-SPEG载体。

（1）pscAAV-CAG-SUO载体构建

人为设计的分泌性尿酸氧化酶序列SUO。SUO蛋白的分泌信号肽来源于人CystatinS蛋白（SEQ ID No.1）。选择猪尿酸氧化酶（GenBank：AAA31141.1）的1-252位氨基酸序列（SEQ ID No.2）和狒狒尿酸氧化酶（GenBank：AAA35395.1）的253-304位氨基酸序列（SEQ IDNo.3）组成融合蛋白。我们将融合得到的尿酸氧化酶加上人Cystatin S蛋白分泌信号肽的蛋白命名为SUO蛋白（SEQ ID No.5）。KpnI和EcoRI双酶切消化pscAAV-CAG-EGFP载体，产生5921bp和748bp两个片段，回收长度为5921bp片段备用。将两个回收片段连接后，转化E.coliJM109感受态细胞，挑取克隆，提取质粒，酶切鉴定（XbaI单酶切，线性化；SmaI，3581bp/2345bp/959bp），得到pscAAV-CAG-SUO载体。

（2）pscAAV-CAG-SPFG载体构建

将SPEG氨基酸序列对应的基因序列发送南京金斯瑞生物科技有限公司合成。序列合成时，按人源表达优化，同时在合成序列的5'端添加Kozak序列“5'GCCACC3'”，在终止密码子添加“5'TAA3'”。进一步在合成序列的两端分别添加KpnI和EcoRI酶切位点，得到SPEG序列。将SPEG序列克隆入pUC57-1.8K载体，得到pUC57-1.8K-SPEG载体。将Pegloticas（SEQID No.4）加上人Cystatin S蛋白分泌信号肽的蛋白命名为SPEG蛋白（SEQ ID No.6）。KpnI和EcoRI双酶切消化pUC57-1.8K-AUO-SPEG载体（合成基因克隆载体），产生1.8kb和1.0kb两个片段，回收长度为1.0kb的片段备用。KpnI和EcoRI双酶切消化pscAAV-CAG-EGFP载体，产生5921bp和748bp两个片段，回收长度为5921bp片段备用。将两个回收片段连接后，转化E.coli JM109感受态细胞，挑取克隆，提取质粒，酶切鉴定（XbaI单酶切，线性化；SmaI，3581bp/2345bp/959bp）。得到pscAAV-CAG-SPFG载体。

实施例2 重组AAV病毒制备及检定

参照文献（Xiao X, et al. J Virol. 1998;72(3):2224-2232.），应用三质粒包装系统包装重组AAV病毒，采用氯化铯密度梯度离心法分离纯化包装得到AAV病毒。简要地，AAV载体质粒（pscAAV-CAG-EGFP、pscAAV-CAM-AUO、pscAAV-CAG-SUO、pscAAV-CAG-SPEG）、辅助质粒（pHelper）和AAV的Rep及Cap蛋白表达质粒（pAAV-R2C1、pAAV-RC、pAAV-R2C6、pAAV-R2C8或pAAV-R2C9）按照1:1:1的摩尔比混匀后，采用磷酸钙方法转染HEK293细胞，转染48h后，收获细胞和培养上清，应用氯化铯密度梯度离心法分离纯化重组AAV病毒。包装纯化得到scAAV1-CAG-EGFP、scAAV1-CAM-AUO、scAAV1-CAG-SUO、scAAV1-CAG-SPEG、scAAV2-CAG-EGFP、scAAV2-CAM-AUO、scAAV2-CAG-SUO、scAAV2-CAG-SPEG、scAAV6-CAG-EGFP、scAAV6-CAM-AUO、scAAV6-CAG-SUO、scAAV6-CAG-SPEG、scAAV8-CAG-EGFP、scAAV8-CAM-AUO、scAAV8-CAG-SUO、scAAV8-CAG-SPEG、scAAV9-CAG-EGFP、scAAV9-CAM-AUO、scAAV9-CAG-SUO、scAAV9-CAG- SPEG等20种重组病毒。

采用定量PCR方法测定制备得到AAV病毒的基因组滴度。具体过程如下：

在CAG启动子中设计两条引物CAG-Q-F和CAG-Q-R：

CAG-Q-F：5’-CCCATAAGGTCATGTACTGGGCAT-3’ (SEQ ID NO.14)

CAG-Q-R：5’-GTTCCCATAGTAACGCCAATAGGG-3’ (SEQ ID NO.15)

以CAG-Q-F和CAG-Q-R为引物特异性地扩增CAG启动子长度为175bp片段，采用SYBRGreen染料结合法，以1μg/μl的pscAAV-CAG-EGFP、pscAAV-CAM-AUO、pscAAV-CAG-SUO、pscAAV-CAG-SPEG质粒及其10倍梯度稀释的样品为标准品，应用SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)试剂（Takara，大连，中国），使用荧光定量PCR仪（型号：ABI 7500 fast，ABI）检测病毒基因组滴度。操作过程参见SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)试剂说明书。病毒的处理方法参见文献（Ulrich-Peter R, et al. J Virol Methods. 2002;106: 81-88.）

实施例3 重组病毒感染细胞检测上清中尿酸氧化酶浓度

将293T细胞、原代肝细胞和MSC细胞以1×10⁶个/孔铺于6孔板中，用4种不同的重组AAV病毒scAAV2-CAG-EGFP、scAAV2-CAM-AUO、scAAV2-CAG-SUO、scAAV2-CAG-SPEG以MOI=10⁵感染细胞。感染72h后收集上清，采用尿酸氧化酶检测试剂盒Amplex Red Uric Acid/Uricase Assay Kit (Life technologies)测定血清中尿酸氧化酶含量，操作过程参见试剂盒说明书。从图5的结果可以看到，相比于感染scAAV2-CAG-EGFP病毒的细胞，感染scAAV2-CAM-AUO、scAAV2-CAG-SUO、scAAV2-CAG-SPEG病毒的细胞上清中均有尿酸氧化酶的表达，且scAAV2-CAG-SUO和scAAV2-CAG-SPEG组的表达要优于前期设计的scAAV2-CAM-AUO（专利申请号：201710466521.X）。结果提示，scAAV2-CAG-SUO和scAAV2-CAG-SPEG病毒感染永生化细胞系、原代细胞和干细胞三种不同类型的细胞（即293T细胞、原代肝细胞和MSC细胞）后，均能够有效地表达产生尿酸氧化酶，且具有更优化的表达设计。

实施例4 小鼠高尿酸血症模型的建立

参考文献（Wu X, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1994; 91(2): 742-746.），构建小鼠高尿酸血症模型。采用同源重组的方法敲除小鼠胚胎干细胞中的尿酸氧化酶基因，制备得到尿酸氧化酶基因杂合的转基因小鼠。转基因小鼠的制备操作由北京百奥赛图基因生物技术有限公司完成。北京百奥赛图基因生物技术有限公司将制备得到的尿酸氧化酶基因杂合小鼠C57BL/6J^+/-转移至北京五加和分子医学研究所有限公司。尿酸氧化酶基因杂合小鼠表现正常。将尿酸氧化酶基因杂合的雄性和雌性C57BL/6J^+/-交配，得到缺失尿酸氧化酶基因的纯合小鼠C57BL/6J^-/-，作为高尿酸血症模型。通过测定小鼠表型来筛选确定雄性和雌性C57BL/6J^+/-交配得到的纯合小鼠C57BL/6J^-/-。具体方法为，交配产生子代小鼠出生2周后，眼眶采血，分离血清，采用尿酸检测试剂盒Amplex Red Uric Acid/UricaseAssay Kit (Life technologies)测定血清中尿酸含量，操作过程参见试剂盒说明书。尿酸浓度大于500μM可判定为高尿酸血症。根据此标准，筛选得到80只高尿酸血症模型。所有动物实验操作均在SPF级条件下进行，下同。

实施例5 静脉注射给药治疗高尿酸血症

从实施例4中获得的高尿酸血症小鼠模型中选择体重接近的40只小鼠，随机分为8组，每组5只小鼠。8组小鼠中，其中4组小鼠分别经尾静脉注射scAAV9-CAG-SUO、scAAV9-CAG-SPEG、scAAV6-CAG-SUO、scAAV6-CAG-SPEG重组病毒，注射剂量为2×10¹¹vg/只，其余4组小鼠分别注射等剂量的scAAV9-CAG-EGFP、scAAV9-CAM-AUO、scAAV6-CAG-EGFP、scAAV6-CAM-AUO重组病毒，作为注射scAAV9-CAG-SUO、scAAV9-CAG-SPEG、scAAV6-CAG-SUO、scAAV6-CAG-SPEG重组病毒的对照。

在注射后不同的时间点（0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w）监测小鼠血清中的尿酸含量。具体为，在每个对应的时间点，眼眶采血，分离血清，采用尿酸检测试剂盒Amplex RedUric Acid/Uricase Assay Kit (Life technologies)测定血清中尿酸含量，操作过程参见试剂盒说明书。检测结果如图6所示。

从图6的结果可知，相比于注射scAAV9-CAG-EGFP和scAAV6-CAG-EGFP病毒的高尿酸血症模型小鼠，注射scAAV9-CAM-AUO、scAAV9-CAG-SUO、scAAV9-CAG-SPEG、scAAV6-CAM-AUO、scAAV6-CAG-SUO、scAAV6-CAG-SPEG组小鼠血清中的尿酸含量均下降，注射scAAV9-CAG-SUO、scAAV9-CAG-SPEG、scAAV6-CAG-SUO、scAAV6-CAG-SPEG病毒组高尿酸血症模型小鼠的尿酸含量呈现出先下降后升高直至平稳的趋势，最终血清中尿酸浓度稳定在80μM以下，同正常小鼠血清中尿酸水平无明显差异（Wu X, et al. Proc Natl Acad Sci USA.1994; 91(2): 742-746.）。相反注射scAAV9-CAM-AUO和scAAV6-CAM-AUO病毒组高尿酸血症模型小鼠的血清中尿酸则先下降后升高，直至同注射scAAV9-CAG-EGFP和scAAV6-CAG-EGFP病毒对照组无明显差异。结果提示scAAV9-CAG-SUO、scAAV9-CAG-SPEG、scAAV6-CAG-SUO、scAAV6-CAG-SPEG治疗病毒经尾静脉注射高尿酸血症模型小鼠后，均能够有效地降低血清中尿酸含量，且较前期结构scAAV9-CAM-AUO和scAAV6-CAM-AUO具有更优化的表达设计，病毒持续作用时间更长，效果更加明显。

在注射后不同的时间点（0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w）监测小鼠尿液中的尿酸含量。具体为，在每个对应的时间点，收集小鼠尿液，采用尿酸检测试剂盒Amplex Red UricAcid/Uricase Assay Kit (Life technologies)测定尿液中尿酸含量，操作过程参见试剂盒说明书。检测结果如图7所示。

从图7的结果可知，尿液中尿酸的含量变化趋势同血清中尿酸含量变化一致。即相比于注射对照病毒的高尿酸血症模型小鼠，所有治疗组小鼠的尿液中尿酸含量下降，注射scAAV9-CAG-SUO、scAAV9-CAG-SPEG、scAAV6-CAG-SUO、scAAV6-CAG-SPEG病毒组高尿酸血症模型小鼠的尿酸含量呈现出先下降后升高直至平稳的趋势，最终尿液中尿酸浓度稳定在400μM以下。相反注射scAAV9-CAM-AUO和scAAV6-CAM-AUO病毒组高尿酸血症模型小鼠的尿液中尿酸则先下降后升高，直至同scAAV9-CAG-EGFP和scAAV6-CAG-EGFP组无明显差异。结果提示4种病毒经尾静脉注射高尿酸血症模型小鼠后，均能够有效地降低尿液中尿酸含量，且较前期结构具有更优化的表达设计，病毒持续作用时间更长，效果更加明显。

与此同时，在注射病毒后不同的时间点，眼眶采血，分离血清，采用尿酸氧化酶检测试剂盒Amplex Red Uric Acid/Uricase Assay Kit (Life technologies)测定血清中尿酸氧化酶含量，操作过程参见试剂盒说明书。从图8的结果可以看到，相比于注射对照病毒的高尿酸血症模型小鼠，注射scAAV9-CAG-SUO、scAAV9-CAG-SPEG、scAAV6-CAG-SUO、scAAV6-CAG-SPEG病毒组高尿酸血症模型小鼠血清中尿酸氧化酶含量随时间先逐渐升高，后略有降低，然后不再随时间变化而变化。相反注射scAAV9-CAM-AUO和scAAV6-CAM-AUO病毒组高尿酸血症模型小鼠血清中尿酸氧化酶含量则出现先升高，后下降，直至检测不到尿酸氧化酶的表达，同注射scAAV9-CAG-EGFP和scAAV6-CAG-EGFP病毒组一样。结果提示4种病毒经尾静脉注射高尿酸血症模型小鼠后，均能够有效地表达产生尿酸氧化酶，且较前期结构scAAV9-CAM-AUO和scAAV6-CAM-AUO具有更优化的表达设计，病毒持续作用时间更长，效果更加明显。病毒在高尿酸血症小鼠体内尿酸氧化酶表达规律的差异有效地解释了注射不同病毒后小鼠血清和尿液中的尿酸含量变化。

总之，4种治疗病毒静脉注射高尿酸血症模型小鼠后，均能够有效地表达产生尿酸氧化酶，降低小鼠血清和尿液中的尿酸含量，缓解高尿酸血症带来的症状，具有开发成为高尿酸血症治疗药物的潜力。

实施例6 肌肉注射给药治疗高尿酸血症

从实施例4中获得的高尿酸血症小鼠模型中选择体重接近的40只小鼠，随机分为8组，每组5只小鼠。8组小鼠中，其中4组小鼠分别经骨骼肌注射scAAV1-CAG-SUO、scAAV1-CAG-SPEG、scAAV8-CAG-SUO、scAAV8-CAG-SPEG重组病毒，注射剂量为4×10¹¹vg/只，其余4组小鼠分别注射等剂量的scAAV1-CAG-EGFP、scAAV1-CAM-AUO、scAAV8-CAG-EGFP、scAAV8-CAM-AUO重组病毒，作为注射scAAV1-CAG-SUO、scAAV1-CAG-SPEG、scAAV8-CAG-SUO、scAAV8-CAG-SPEG的对照。

在注射后不同的时间点（0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w）监测小鼠血清中的尿酸含量。具体为，在每个对应的时间点，眼眶采血，分离血清，采用尿酸检测试剂盒Amplex RedUric Acid/Uricase Assay Kit (Life technologies)测定血清中尿酸含量，操作过程参见试剂盒说明书。检测结果如图9所示。

从图9的结果可知，同静脉注射类似，相比于注射对照病毒的高尿酸血症模型小鼠，所有治疗组小鼠的血清中的尿酸含量均下降，注射scAAV1-CAG-SUO、scAAV1-CAG-SPEG、scAAV8-CAG-SUO、scAAV8-CAG-SPEG病毒组高尿酸血症模型小鼠的尿酸含量呈现出先下降后升高直至平稳的趋势，最终血清中尿酸浓度稳定在100μM以下，略高于静脉注射病毒小鼠。相反注射scAAV1-CAM-AUO和scAAV8-CAM-AUO病毒组高尿酸血症模型小鼠的血清中尿酸则先下降后升高，直至同scAAV1-CAG-EGFP和scAAV8-CAG-EGFP组无明显差异。结果提示4种治疗病毒经肌肉注射高尿酸血症模型小鼠后，均能够有效地降低血清中尿酸含量，但scAAV1-CAG-SUO、scAAV1-CAG-SPEG、scAAV8-CAG-SUO、scAAV8-CAG-SPEG病毒组持续作用时间更长，效果更加明显，较前期结构scAAV1-CAM-AUO和scAAV8-CAM-AUO具有更优化的表达设计。

在注射后不同的时间点（0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w）监测小鼠尿液中的尿酸含量。具体为，在每个对应的时间点，收集小鼠尿液，采用尿酸检测试剂盒Amplex Red UricAcid/Uricase Assay Kit (Life technologies)测定尿液中尿酸含量，操作过程参见试剂盒说明书。检测结果如图10所示。

从图10的结果可知，尿液中尿酸的含量变化趋势同血清中尿酸含量变化一致。即相比于注射对照病毒的高尿酸血症模型小鼠，所有治疗组小鼠的尿液中尿酸含量下降，注射scAAV1-CAG-SUO、scAAV1-CAG-SPEG、scAAV8-CAG-SUO、scAAV8-CAG-SPEG病毒组高尿酸血症模型小鼠的尿酸含量呈现出先下降后升高直至平稳的趋势，最终尿液中尿酸浓度稳定在700μM以下，高于静脉注射小鼠，但仍低于注射对照病毒的小鼠。相反注射scAAV1-CAM-AUO和scAAV8-CAM-AUO病毒组高尿酸血症模型小鼠的尿液中尿酸则先下降后升高，直至同scAAV1-CAG-EGFP和scAAV8-CAG-EGFP组无明显差异。结果提示4种病毒经肌肉注射高尿酸血症模型小鼠后，均能够有效地降低尿液中尿酸含量，但scAAV1-CAG-SUO、scAAV1-CAG-SPEG、scAAV8-CAG-SUO、scAAV8-CAG-SPEG病毒组持续作用时间更长，效果更加明显，较前期结构scAAV1-CAM-AUO和scAAV8-CAM-AUO具有更优化的表达设计。

与此同时，在注射病毒后不同的时间点，眼眶采血，分离血清，采用尿酸氧化酶检测试剂盒Amplex Red Uric Acid/Uricase Assay Kit (Life technologies)测定血清中尿酸氧化酶含量，操作过程参见试剂盒说明书。从图11的结果可以看到，相比于注射对照病毒的高尿酸血症模型小鼠，注射scAAV1-CAG-SUO、scAAV1-CAG-SPEG、scAAV8-CAG-SUO、scAAV8-CAG-SPEG病毒组高尿酸血症模型小鼠血清中尿酸氧化酶含量随时间先逐渐升高，后略有降低，然后不再随时间变化而变化。相反注射scAAV1-CAM-AUO和scAAV8-CAM-AUO病毒组高尿酸血症模型小鼠血清中尿酸氧化酶含量则出现先升高，后下降，直至检测不到尿酸氧化酶的表达，同注射scAAV1-CAG-EGFP和scAAV8-CAG-EGFP病毒组一样。结果提示4种病毒经肌肉注射高尿酸血症模型小鼠后，均能够有效地表达产生尿酸氧化酶，且较前期结构scAAV1-CAM-AUO和scAAV8-CAM-AUO具有更优化的表达设计，病毒持续作用时间更长，效果更加明显。病毒在高尿酸血症小鼠体内尿酸氧化酶表达规律的差异有效地解释了注射不同病毒后小鼠血清和尿液中的尿酸含量变化。

总之，4种治疗病毒肌肉注射高尿酸血症模型小鼠后，均能够有效地表达产生尿酸氧化酶，降低小鼠血清和尿液中的尿酸含量，缓解高尿酸血症带来的症状，具有开发成为高尿酸血症治疗药物的潜力。

相比于静脉注射给药，对高尿酸血症模型小鼠经肌肉注射加倍剂量的重组病毒，但高尿酸血症模型小鼠的尿酸氧化酶表达水平还相对偏低，对血液和尿液中（即体内）尿酸的降低作用更弱，这可能与肌肉注射感染的组织更少，对骨骼肌以外的组织转导效率较弱相关。但肌肉注射仍然能够将高尿酸血症小鼠模型中的尿酸浓度控制到较低的水平，表现出明显的治疗作用，提示肌肉注射也可以作用一种候选的给药方式，用于高尿酸血症疾病的治疗。

实施例7 口服给药治疗高尿酸血症

从实施例4中获得的高尿酸血症小鼠模型中选择体重接近的40只小鼠，随机分为8组，每组5只小鼠。8组小鼠中，其中4组小鼠分别口服scAAV2-CAG-SUO、scAAV2-CAG-SPEG、scAAV8-CAG-SUO、scAAV8-CAG-SPEG重组病毒，剂量为4×10¹¹vg/只，其余4组小鼠分别口服等剂量的scAAV2-CAG-EGFP、scAAV2-CAM-AUO、scAAV8-CAG-EGFP、scAAV8-CAM-AUO重组病毒，作为口服scAAV2-CAG-SUO、scAAV2-CAG-SPEG、scAAV8-CAG-SUO、scAAV8-CAG-SPEG的对照。

在口服后不同的时间点（0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w）监测小鼠血清中的尿酸含量。具体为，在每个对应的时间点，眼眶采血，分离血清，采用尿酸检测试剂盒Amplex RedUric Acid/Uricase Assay Kit (Life technologies)测定血清中尿酸含量，操作过程参见试剂盒说明书。检测结果如图12所示。

从图12的结果可知，同静脉注射和肌肉注射类似，相比于注射对照病毒的高尿酸血症模型小鼠，所有治疗组小鼠的血清中的尿酸含量均下降，口服scAAV2-CAG-SUO、scAAV2-CAG-SPEG、scAAV8-CAG-SUO、scAAV8-CAG-SPEG病毒组高尿酸血症模型小鼠的尿酸含量呈现出先下降后升高直至平稳的趋势，最终血清中尿酸浓度稳定在300μM以下，高于静脉注射和肌肉注射病毒小鼠，但仍低于口服对照病毒组。相反口服scAAV2-CAM-AUO和scAAV8-CAM-AUO病毒组小鼠的血清中尿酸则先下降后升高，直至同scAAV2-CAG-EGFP和scAAV8-CAG-EGFP对照组无明显差异。结果提示4种治疗病毒经口服至高尿酸血症模型小鼠后，均能够有效地降低血清中尿酸含量，且较前期结构scAAV2-CAM-AUO和scAAV8-CAM-AUO具有更优化的表达设计，病毒持续作用时间更长，效果更加明显。。

在口服后不同的时间点（0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w）监测小鼠尿液中的尿酸含量。具体为，在每个对应的时间点，收集小鼠尿液，采用尿酸检测试剂盒Amplex Red UricAcid/Uricase Assay Kit (Life technologies)测定尿液中尿酸含量，操作过程参见试剂盒说明书。检测结果如图13所示。

从图13的结果可知，尿液中尿酸的含量变化趋势同血清中尿酸含量变化一致。即相比于口服对照病毒的高尿酸血症模型小鼠，所有治疗组小鼠的尿液中尿酸含量下降，口服scAAV2-CAG-SUO、scAAV2-CAG-SPEG、scAAV8-CAG-SUO、scAAV8-CAG-SPEG病毒组高尿酸血症模型小鼠的尿酸含量呈现出先下降后升高直至平稳的趋势，最终尿液中尿酸浓度稳定在1500μM以下，高于静脉注射和肌肉注射小鼠，但仍低于口服对照病毒的小鼠。相反口服scAAV2-CAM-AUO和scAAV8-CAM-AUO病毒组高尿酸血症模型小鼠的尿液中尿酸含量则先下降后升高，直至同scAAV2-CAG-EGFP和scAAV8-CAG-EGFP对照组无明显差异。结果提示4种病毒经口服至高尿酸血症模型小鼠后，均能够有效地降低尿液中尿酸含量，且较前期结构scAAV2-CAM-AUO和scAAV8-CAM-AUO具有更优化的表达设计，病毒持续作用时间更长，效果更加明显。

与此同时，在口服病毒后不同的时间点，眼眶采血，分离血清，采用尿酸氧化酶检测试剂盒Amplex Red Uric Acid/Uricase Assay Kit (Life technologies)测定血清中尿酸氧化酶含量，操作过程参见试剂盒说明书。从图14的结果可以看到，相比于口服对照病毒的高尿酸血症模型小鼠，口服scAAV2-CAG-SUO、scAAV2-CAG-SPEG、scAAV8-CAG-SUO、scAAV8-CAG-SPEG病毒组高尿酸血症模型小鼠血清中尿酸氧化酶含量随时间先逐渐升高，后略有降低，然后不再随时间变化而变化。相反口服scAAV2-CAM-AUO或scAAV8-CAM-AUO病毒组高尿酸血症模型小鼠血清中尿酸氧化酶含量则出现先升高，后下降，直至检测不到尿酸氧化酶的表达，同scAAV2-CAG-EGFP和scAAV8-CAG-EGFP病毒组一样。结果提示4种病毒经口服至高尿酸血症模型小鼠后，均能够有效地表达产生尿酸氧化酶，且较前期结构scAAV2-CAM-AUO和scAAV8-CAM-AUO具有更优化的表达设计，病毒持续作用时间更长，效果更加明显。病毒在高尿酸血症小鼠体内尿酸氧化酶表达规律的差异有效地解释了口服不同病毒后小鼠血清和尿液中的尿酸含量变化。

总之，4种治疗病毒高尿酸血症模型小鼠口服后，均能够有效地表达产生尿酸氧化酶，降低小鼠血清和尿液中的尿酸含量，缓解高尿酸血症带来的症状，具有开发成为高尿酸血症治疗药物的潜力。

相比于静脉注射和肌肉注射给药，高尿酸血症模型小鼠口服重组病毒后，尿酸氧化酶表达水平更低，对血液和尿液中（即体内）尿酸的降低作用更弱，这可能与口服感染的组织更少，对肠道以外的组织转导效率较弱相关。但口服给药仍然能够将高尿酸血症小鼠模型中的尿酸浓度控制到较低的水平，表现出明显的治疗作用，提示口服给药也可以作用一种候选的给药方式，用于高尿酸血症疾病的治疗。

序列表

<110> 北京五加和分子医学研究所有限公司

<120> 一种高尿酸血症的基因治疗药物

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

Met Ala Arg Pro Leu Cys Thr Leu Leu Leu Leu Met Ala Thr Leu Ala

1 5 10 15

Gly Ala Leu Ala

20

<210> 2

<211> 252

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

Met Ala His Tyr Arg Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe

1 5 10 15

Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His Ile Gln

20 25 30

Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gln

35 40 45

Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp

50 55 60

Val Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys

65 70 75 80

Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu

85 90 95

His Phe Leu Ser Ser Phe Lys His Val Ile Arg Ala Gln Val Tyr Val

100 105 110

Glu Glu Val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val

115 120 125

His Ala Phe Ile Tyr Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu

130 135 140

Gln Ile Arg Asn Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu

145 150 155 160

Lys Val Leu Lys Thr Thr Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp

165 170 175

Gln Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gln

180 185 190

Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gln Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu

195 200 205

Ala Thr Trp Asp Thr Val Arg Ser Ile Val Leu Gln Lys Phe Ala Gly

210 215 220

Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Asp Ile Gln Val Leu Thr Leu Gly Gln Val Pro Glu

245 250

<210> 3

<211> 52

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 3

Ile Glu Asp Met Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile

1 5 10 15

Asp Met Ser Lys Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro

20 25 30

Leu Asp Asn Pro Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu

35 40 45

Ser Ser Arg Leu

50

<210> 4

<211> 298

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 4

Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe Val Arg Thr Gly Tyr Gly

1 5 10 15

Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His Ile Gln Arg Asp Gly Lys Tyr His

20 25 30

Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Thr Val Gln Leu Thr Leu Ser Ser Lys

35 40 45

Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp Val Ile Pro Thr Asp Thr

50 55 60

Ile Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys Phe Lys Gly Ile Lys Ser

65 70 75 80

Ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu His Phe Leu Ser Ser Phe

85 90 95

Lys His Val Ile Arg Ala Gln Val Tyr Val Glu Glu Val Pro Trp Lys

100 105 110

Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val His Ala Phe Ile Tyr Thr

115 120 125

Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu Gln Ile Arg Asn Gly Pro

130 135 140

Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu Lys Val Leu Lys Thr Thr

145 150 155 160

Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp Gln Phe Thr Thr Leu Pro

165 170 175

Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gln Val Tyr Cys Lys Trp Arg

180 185 190

Tyr His Gln Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu Ala Thr Trp Asp Thr Val

195 200 205

Arg Ser Ile Val Leu Gln Lys Phe Ala Gly Pro Tyr Asp Lys Gly Glu

210 215 220

Tyr Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr Asp Ile Gln Val Leu Thr

225 230 235 240

Leu Gly Gln Val Pro Glu Ile Glu Asp Met Glu Ile Ser Leu Pro Asn

245 250 255

Ile His Tyr Leu Asn Ile Asp Met Ser Lys Met Gly Leu Ile Asn Lys

260 265 270

Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro Tyr Gly Lys Ile Thr Gly

275 280 285

Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu

290 295

<210> 5

<211> 324

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 5

Met Ala Arg Pro Leu Cys Thr Leu Leu Leu Leu Met Ala Thr Leu Ala

1 5 10 15

Gly Ala Leu Ala Met Ala His Tyr Arg Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp

20 25 30

Glu Val Glu Phe Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Ile Lys Val

35 40 45

Leu His Ile Gln Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala

50 55 60

Thr Ser Val Gln Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly

65 70 75 80

Asp Asn Ser Asp Val Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val Asn

85 90 95

Val Leu Ala Lys Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Thr Phe Ala Val

100 105 110

Thr Ile Cys Glu His Phe Leu Ser Ser Phe Lys His Val Ile Arg Ala

115 120 125

Gln Val Tyr Val Glu Glu Val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly

130 135 140

Val Lys His Val His Ala Phe Ile Tyr Thr Pro Thr Gly Thr His Phe

145 150 155 160

Cys Glu Val Glu Gln Ile Arg Asn Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly

165 170 175

Ile Lys Asp Leu Lys Val Leu Lys Thr Thr Gln Ser Gly Phe Glu Gly

180 185 190

Phe Ile Lys Asp Gln Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys

195 200 205

Phe Ala Thr Gln Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gln Gly Arg Asp

210 215 220

Val Asp Phe Glu Ala Thr Trp Asp Thr Val Arg Ser Ile Val Leu Gln

225 230 235 240

Lys Phe Ala Gly Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gln

245 250 255

Lys Thr Leu Tyr Asp Ile Gln Val Leu Thr Leu Gly Gln Val Pro Glu

260 265 270

Ile Glu Asp Met Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile

275 280 285

Asp Met Ser Lys Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro

290 295 300

Leu Asp Asn Pro Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu

305 310 315 320

Ser Ser Arg Leu

<210> 6

<211> 318

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 6

Met Ala Arg Pro Leu Cys Thr Leu Leu Leu Leu Met Ala Thr Leu Ala

1 5 10 15

Gly Ala Leu Ala Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe Val Arg

20 25 30

Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His Ile Gln Arg Asp

35 40 45

Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Thr Val Gln Leu Thr

50 55 60

Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp Val Ile

65 70 75 80

Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys Phe Lys

85 90 95

Gly Ile Lys Ser Ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu His Phe

100 105 110

Leu Ser Ser Phe Lys His Val Ile Arg Ala Gln Val Tyr Val Glu Glu

115 120 125

Val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val His Ala

130 135 140

Phe Ile Tyr Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu Gln Ile

145 150 155 160

Arg Asn Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu Lys Val

165 170 175

Leu Lys Thr Thr Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp Gln Phe

180 185 190

Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gln Val Tyr

195 200 205

Cys Lys Trp Arg Tyr His Gln Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu Ala Thr

210 215 220

Trp Asp Thr Val Arg Ser Ile Val Leu Gln Lys Phe Ala Gly Pro Tyr

225 230 235 240

Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr Asp Ile

245 250 255

Gln Val Leu Thr Leu Gly Gln Val Pro Glu Ile Glu Asp Met Glu Ile

260 265 270

Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Leu Asn Ile Asp Met Ser Lys Met Gly

275 280 285

Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro Tyr Gly

290 295 300

Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu

305 310 315

<210> 7

<211> 972

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 7

atggccaggc ctctgtgcac actgctgctg ctgatggcca ccctggcagg cgccctggca 60

atggcccact acaggaacga ctataagaag aatgatgagg tggagttcgt gcgcacaggc 120

tacggcaagg acatgatcaa ggtgctgcac atccagcgcg atggcaagta tcactctatc 180

aaggaggtgg ccacaagcgt gcagctgacc ctgagctcca agaaggacta cctgcacggc 240

gacaactctg atgtgatccc aaccgataca atcaagaaca ccgtgaatgt gctggccaag 300

ttcaagggca tcaagtccat cgagacattt gccgtgacca tctgcgagca cttcctgtct 360

agctttaagc acgtgatcag ggcacaggtg tacgtggagg aggtgccatg gaagagattt 420

gagaagaacg gcgtgaagca cgtgcacgcc ttcatctata cccccacagg cacccacttt 480

tgtgaggtgg agcagatccg gaatggcccc cctgtgatcc acagcggcat caaggacctg 540

aaggtgctga agaccacaca gtccggcttc gagggcttta tcaaggacca gttcaccaca 600

ctgcccgagg tgaaggatcg gtgctttgcc acccaggtgt actgtaagtg gcggtatcac 660

cagggcagag acgtggattt cgaggccaca tgggataccg tgagaagcat cgtgctgcag 720

aagtttgccg gcccttacga caagggcgag tatagcccat ccgtgcagaa gacactgtat 780

gatatccagg tgctgaccct gggacaggtg cccgagatcg aggacatgga gatcagcctg 840

cctaacatcc actacttcaa tatcgatatg tctaagatgg gcctgatcaa caaggaggag 900

gtgctgctgc cactggacaa tccctatggc aagatcacag gcaccgtgaa gaggaagctg 960

tcctctcgcc tg 972

<210> 8

<211> 954

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 8

atggccaggc ctctgtgcac actgctgctg ctgatggcca ccctggcagg cgccctggcc 60

gactacaaga agaacgatga ggtggagttc gtgaggaccg gctatggcaa ggacatgatc 120

aaggtgctgc acatccagcg cgatggcaag taccactcta tcaaggaggt ggccaccaca 180

gtgcagctga cactgagctc caagaaggac tatctgcacg gcgacaatag cgatgtgatc 240

ccaaccgata caatcaagaa caccgtgaat gtgctggcca agttcaaggg catcaagtcc 300

atcgagacat ttgccgtgac catctgcgag cacttcctgt ctagctttaa gcacgtgatc 360

agggcacagg tgtacgtgga ggaggtgcca tggaagagat ttgagaagaa cggcgtgaag 420

cacgtgcacg ccttcatcta tacccccaca ggcacccact tttgtgaggt ggagcagatc 480

cggaatggcc cccctgtgat ccactccggc atcaaggacc tgaaggtgct gaagaccaca 540

cagtctggct tcgagggctt tatcaaggac cagttcacca cactgcccga ggtgaaggat 600

cggtgctttg ccacccaggt gtactgtaag tggcggtatc accagggcag agacgtggat 660

ttcgaggcca catgggatac cgtgagatcc atcgtgctgc agaagtttgc cggcccttac 720

gacaagggcg agtatagccc atccgtgcag aagacactgt acgatatcca ggtgctgacc 780

ctgggacagg tgcccgagat cgaggacatg gagatctctc tgcctaacat ccactacctg 840

aatatcgata tgagcaagat gggcctgatc aacaaggagg aggtgctgct gccactggac 900

aatccctatg gcaagatcac aggcaccgtg aagaggaagc tgtcctctcg cctg 954

<210> 9

<211> 960

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 9

gcggccgccg taccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg 60

actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat 120

caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc 180

tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta 240

ttagtcatcg ctattaccat ggtcgaggtg agccccacgt tctgcttcac tctccccatc 300

tcccccccct ccccaccccc aattttgtat ttatttattt tttaattatt ttgtgcagcg 360

atgggggcgg gggggggggg ggggcgcgcg ccaggcgggg cggggcgggg cgaggggcgg 420

ggcggggcga ggcggagagg tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct ccgaaagttt 480

ccttttatgg cgaggcggcg gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc gcggcgggcg 540

ggagtcgctg cgcgctgcct tcgccccgtg ccccgctccg ccgccgcctc gcgccgcccg 600

ccccggctct gactgaccgc gttactccca caggtgagcg ggcgggacgg cccttctcct 660

ccgggctgta attagcgctt ggtttaatga cggcttgttt cttttctgtg gctgcgtgaa 720

agccttgagg ggctccggga gggccctttg tgcgggggga gcggctcggg gctgtccgcg 780

gggggacggc tgccttcggg ggggacgggg cagggcgggg ttcggcttct ggcgtgtgac 840

cggcggctct agagcctctg ctaaccatgt tcatgccttc ttctttttcc tacagctcct 900

gggcaacgtg ctggttattg tgctgtctca tcattttggc aaagaattgg atcggctagc 960

<210> 10

<211> 237

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 10

cagatctgcc tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt 60

gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat 120

tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag 180

caagggggag gattgggaag acaatagcag gcatgctggg gatgcggtgg gctctat 237

<210> 11

<211> 2198

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 11

gcggccgccg taccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg 60

actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat 120

caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc 180

tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta 240

ttagtcatcg ctattaccat ggtcgaggtg agccccacgt tctgcttcac tctccccatc 300

tcccccccct ccccaccccc aattttgtat ttatttattt tttaattatt ttgtgcagcg 360

atgggggcgg gggggggggg ggggcgcgcg ccaggcgggg cggggcgggg cgaggggcgg 420

ggcggggcga ggcggagagg tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct ccgaaagttt 480

ccttttatgg cgaggcggcg gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc gcggcgggcg 540

ggagtcgctg cgcgctgcct tcgccccgtg ccccgctccg ccgccgcctc gcgccgcccg 600

ccccggctct gactgaccgc gttactccca caggtgagcg ggcgggacgg cccttctcct 660

ccgggctgta attagcgctt ggtttaatga cggcttgttt cttttctgtg gctgcgtgaa 720

agccttgagg ggctccggga gggccctttg tgcgggggga gcggctcggg gctgtccgcg 780

gggggacggc tgccttcggg ggggacgggg cagggcgggg ttcggcttct ggcgtgtgac 840

cggcggctct agagcctctg ctaaccatgt tcatgccttc ttctttttcc tacagctcct 900

gggcaacgtg ctggttattg tgctgtctca tcattttggc aaagaattgg atcggctagc 960

ggtaccgcca ccatggccag gcctctgtgc acactgctgc tgctgatggc caccctggca 1020

ggcgccctgg caatggccca ctacaggaac gactataaga agaatgatga ggtggagttc 1080

gtgcgcacag gctacggcaa ggacatgatc aaggtgctgc acatccagcg cgatggcaag 1140

tatcactcta tcaaggaggt ggccacaagc gtgcagctga ccctgagctc caagaaggac 1200

tacctgcacg gcgacaactc tgatgtgatc ccaaccgata caatcaagaa caccgtgaat 1260

gtgctggcca agttcaaggg catcaagtcc atcgagacat ttgccgtgac catctgcgag 1320

cacttcctgt ctagctttaa gcacgtgatc agggcacagg tgtacgtgga ggaggtgcca 1380

tggaagagat ttgagaagaa cggcgtgaag cacgtgcacg ccttcatcta tacccccaca 1440

ggcacccact tttgtgaggt ggagcagatc cggaatggcc cccctgtgat ccacagcggc 1500

atcaaggacc tgaaggtgct gaagaccaca cagtccggct tcgagggctt tatcaaggac 1560

cagttcacca cactgcccga ggtgaaggat cggtgctttg ccacccaggt gtactgtaag 1620

tggcggtatc accagggcag agacgtggat ttcgaggcca catgggatac cgtgagaagc 1680

atcgtgctgc agaagtttgc cggcccttac gacaagggcg agtatagccc atccgtgcag 1740

aagacactgt atgatatcca ggtgctgacc ctgggacagg tgcccgagat cgaggacatg 1800

gagatcagcc tgcctaacat ccactacttc aatatcgata tgtctaagat gggcctgatc 1860

aacaaggagg aggtgctgct gccactggac aatccctatg gcaagatcac aggcaccgtg 1920

aagaggaagc tgtcctctcg cctgtgataa gaattcgtcg acagatctgc ctcgactgtg 1980

ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa 2040

ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt 2100

aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa 2160

gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctat 2198

<210> 12

<211> 2180

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 12

gcggccgccg taccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg 60

actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat 120

caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc 180

tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta 240

ttagtcatcg ctattaccat ggtcgaggtg agccccacgt tctgcttcac tctccccatc 300

tcccccccct ccccaccccc aattttgtat ttatttattt tttaattatt ttgtgcagcg 360

atgggggcgg gggggggggg ggggcgcgcg ccaggcgggg cggggcgggg cgaggggcgg 420

ggcggggcga ggcggagagg tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct ccgaaagttt 480

ccttttatgg cgaggcggcg gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc gcggcgggcg 540

ggagtcgctg cgcgctgcct tcgccccgtg ccccgctccg ccgccgcctc gcgccgcccg 600

ccccggctct gactgaccgc gttactccca caggtgagcg ggcgggacgg cccttctcct 660

ccgggctgta attagcgctt ggtttaatga cggcttgttt cttttctgtg gctgcgtgaa 720

agccttgagg ggctccggga gggccctttg tgcgggggga gcggctcggg gctgtccgcg 780

gggggacggc tgccttcggg ggggacgggg cagggcgggg ttcggcttct ggcgtgtgac 840

cggcggctct agagcctctg ctaaccatgt tcatgccttc ttctttttcc tacagctcct 900

gggcaacgtg ctggttattg tgctgtctca tcattttggc aaagaattgg atcggctagc 960

ggtaccgcca ccatggccag gcctctgtgc acactgctgc tgctgatggc caccctggca 1020

ggcgccctgg ccgactacaa gaagaacgat gaggtggagt tcgtgaggac cggctatggc 1080

aaggacatga tcaaggtgct gcacatccag cgcgatggca agtaccactc tatcaaggag 1140

gtggccacca cagtgcagct gacactgagc tccaagaagg actatctgca cggcgacaat 1200

agcgatgtga tcccaaccga tacaatcaag aacaccgtga atgtgctggc caagttcaag 1260

ggcatcaagt ccatcgagac atttgccgtg accatctgcg agcacttcct gtctagcttt 1320

aagcacgtga tcagggcaca ggtgtacgtg gaggaggtgc catggaagag atttgagaag 1380

aacggcgtga agcacgtgca cgccttcatc tataccccca caggcaccca cttttgtgag 1440

gtggagcaga tccggaatgg cccccctgtg atccactccg gcatcaagga cctgaaggtg 1500

ctgaagacca cacagtctgg cttcgagggc tttatcaagg accagttcac cacactgccc 1560

gaggtgaagg atcggtgctt tgccacccag gtgtactgta agtggcggta tcaccagggc 1620

agagacgtgg atttcgaggc cacatgggat accgtgagat ccatcgtgct gcagaagttt 1680

gccggccctt acgacaaggg cgagtatagc ccatccgtgc agaagacact gtacgatatc 1740

caggtgctga ccctgggaca ggtgcccgag atcgaggaca tggagatctc tctgcctaac 1800

atccactacc tgaatatcga tatgagcaag atgggcctga tcaacaagga ggaggtgctg 1860

ctgccactgg acaatcccta tggcaagatc acaggcaccg tgaagaggaa gctgtcctct 1920

cgcctgtgat aagaattcgt cgacagatct gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca 1980

tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc 2040

ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg 2100

gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct 2160

ggggatgcgg tgggctctat 2180

<210> 13

<211> 121

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 13

ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac 60

gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggacagatcc 120

c 121

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 14

cccataaggt catgtactgg gcat 24

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 15

gttcccatag taacgccaat aggg 24

Claims (12)

1.一种尿酸氧化酶酶基因表达框，其特征在于，包含：

(1)如SEQ ID No.9所示的启动子核苷酸序列；和

(2)编码如SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示的信号肽与尿酸氧化酶融合蛋白的核苷酸序列；

所述表达框表达产物能够分泌至细胞外，将尿酸转化为尿囊素。

2.根据权利要求1所述的基因表达框，其中所述(2)是如SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的基因表达框，其还包含如SEQ ID No.10所示的polyA序列。

4.根据权利要求3所述的基因表达框，其碱基全序列如SEQ ID No.11或SEQ ID No.12所示，所述表达框表达产物能够分泌至细胞外，将尿酸转化为尿囊素。

5.一种重组腺相关病毒载体，其特征在于，携带如权利要求1－4中任一项所述的基因表达框。

6.根据权利要求5所述的重组腺相关病毒载体，特征在于，

(1)所述重组腺相关病毒载体的基因组DNA自我互补形成双链DNA分子；和

(2)所述重组腺相关病毒载体血清型选自AAV1、AAV2、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和AAVrh.10。

7.根据权利要求6所述的重组腺相关病毒载体，其中所述重组腺相关病毒载体血清型是AAV6、AAV1、AAV2、AAV8或AAV9。

8.一种基因药物，其特征在于，包含权利要求1－4中任一项所述的基因表达框或权利要求5－7中任一项所述的重组腺相关病毒载体。

9.一种基因治疗剂，其特征在于，包含如权利要求1－4中任一项所述的基因表达框、权利要求5－7中任一项所述的重组腺相关病毒载体或权利要求8所述的基因药物。

10.根据权利要求9所述的基因治疗剂，其特征在于，给药方式为静脉注射和/或肌肉注射和/或口服。

11.根据权利要求1－4中任一项所述的基因表达框、权利要求5－7中任一项所述的重组腺相关病毒载体、权利要求8所述的基因药物、权利要求9或10所述的基因治疗剂在制备治疗高尿酸血症的药物中的用途。

12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，一次给药可持续表达产生尿酸氧化酶，降低体内的尿酸浓度，缓解因体内尿酸过高带来的不良影响。

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