CN108103079A - 一种高尿酸血症的基因治疗药物 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种重组腺相关病毒介导的高尿酸血症治疗药物。重组腺相关病毒载体携带包含人miR‑142‑3p靶序列的人为设计尿酸氧化酶（artificial urate oxidase，简称AUO）基因表达框。体内实验表明，该重组腺相关病毒载体能够高效地导入体内，持续稳定地表达尿酸氧化酶，降低尿酸含量，有效地缓解因血液中尿酸过高导致的痛风症状。结果提示，该重组腺相关病毒载体有希望开发成为一种新的高尿酸血症治疗药物。

Description

一种高尿酸血症的基因治疗药物

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重组腺相关病毒载体携带人为设计尿酸氧化酶（AUO）基因表达框的高尿酸血症基因治疗药物。

背景技术

随着经济水平的提高和人们生活方式及膳食结构的改变，痛风和高尿酸血症的发病率在世界范围内呈逐年上升趋势（郭立新.药品评价. 2014; 11(1): 21-23. WeaverAL. Cleve Clin J Med. 2008; 75(s5): s9-s12.）。高尿酸血症是由嘌呤代谢紊乱导致尿酸生成增多和（或）排泄减少，使血液中尿酸浓度高出正常范围所致，是痛风发病的生化基础（张玉梅，等. 医学综述. 2012; 18(15): 2441-2444.），临床诊断标准为正常嘌呤饮食状态下，男性血液尿酸含量＞420 μmol/L，女性血液尿酸含量＞360 μmol /L（Prasad SahOS, et al. Nephrourol Mon. 2015; 7(3): e27233.）。高尿酸血症通常与高脂血症、高血压病、2型糖尿病、肥胖症、动脉粥样硬化、冠心病等疾病伴发，且与血管、心脏、肾脏不良预后密切相关，严重危害人类健康（Susic D, et al. Cardiorenal Med. 2015; 5(3): 175-182.）。

尿酸（uric acid，UA）是一种弱酸（pKa = 5.8），是嘌呤代谢的最终氧化产物，在生理pH条件下，主要以尿酸盐离子形式存在。在正常状态，体内的尿酸60%～70% 经肾脏排泄，约30%被肠道内细菌分解或经胆道排泄，约1%经汗液排出。研究证明，尿酸在肌体内有双重作用，既是肌体内最重要的一种抗氧化剂，具有抗氧化应激的作用，又可损害血管内皮功能，诱发血管炎症（Lioté F, et al. Rheum Dis Clin North Am. 2006; 32(2): 295-311. Lippi G, et al. Clin Chim Acta. 2008; 392(1-2): 1-7.）。

尿酸氧化酶（urate oxidase）可以催化尿酸氧化成尿素囊。研究发现，许多物种体内均存在这种酶，然而在人类和猿类等高等动物体内却缺乏这种有生物活性的尿酸氧化酶（朱献军，等. 生物工程学报. 2001; 17(1): 68-72.）。肝脏是尿酸形成的重要器官，肾脏是尿酸排泄的重要器官，如果肝脏尿酸产生过多或肾脏尿酸排泄量过少，可使体内血尿酸水平升高，从而导致高尿酸血症。血液中98%的尿酸以钠盐形式存在，当血中尿酸浓度超过其在血液中的最大溶解度时，尿酸盐会析出针状结晶，沉积在肾脏、皮下软组织、关节滑膜、滑囊、软骨等酸度较高的组织或温度较低的远侧端肢体，引起一系列病理反应尿酸盐呈结节状硬结，称痛风石。在肾脏排泄尿酸的过程中，若尿酸盐沉积在肾间质中，可引起间质纤维化、尿酸性肾病，甚至可导致肾小管萎缩。

经循证医学研究证实，肾脏对尿酸的清除率下降使得血尿酸水平升高，与高血压、高血脂、胰岛素抵抗、动脉粥样硬化及冠心病等疾病的发生和进展密切相关。因此控制体内的尿酸浓度，使其维持在正常水平具有重要的生理意义。

高尿酸血症是一种复合性的代谢综合征，其发病机制涉及多种基因遗传，如某些酶基因突变，使其活性在嘌呤的分解代谢过程中发生改变，致使体内血尿酸浓度升高，导致高尿酸血症的发生。按照发病机制的不同，可以分为原发性高尿酸血症和继发性高尿酸血症。原发性高尿酸血症属于遗传性疾病，常由基因缺陷引起。血清尿酸浓度以及肾脏对尿酸的调节都具有显著遗传性，是由多个基因和环境因素共同调控的。继发性高尿酸血症的病发原因有很多，主要由血液病、肾脏病和药物治疗等因素引起。

在高尿酸血症的患者中，由于酶缺陷而导致嘌呤合成代谢过程中产生过多尿酸的比例不足10%。主要的相关酶有次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）、磷酸核糖焦磷酸合成酶（PRS）、葡萄糖6磷酸酶（G-6-P）等。次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶因基因突变导致其酶活性降低，使鸟嘌呤变为鸟嘌呤核苷酸和次黄嘌呤转变为次黄嘌呤核苷酸减少，两种嘌呤不能被再利用合成核酸或被清除，使终末产物尿酸升高，如Lesch-Nyhan综合征，HGPRT基因突变，致使酶活性完全丧失，从而导致患者智力发育低下，有强迫性自残行为并伴有痛风和高尿酸血症；HGPRT活性部分缺乏患者神经系统症状较轻或无，只伴有痛风和高尿酸血症（Mak BS, et al. Pediatr Neurol. 2000; 23(4): 332-335.）。PRPP合成酶活性增加，引起磷酸核糖焦磷酸（PRPP）合成过多，而PRPP是嘌呤合成的关键性调节因子，最终使尿酸产生过多（Liu XZ, et al. Int J Audiol. 2013; 52(1): 23-28.）。葡萄糖6磷酸酶基因缺陷，会使合成PRPP的5’-磷酸核糖途径代偿性增强，尿酸产生过多，肾脏尿酸清除减少（Chou JY, et al. Curr Mol Med. 2002; 2(2): 121-143.）。

肾小管尿酸分泌重吸收功能障碍，使尿酸排泄减少，是引发高尿酸血症的原因之一。该功能障碍与多基因遗传缺陷相关。Kudo等（Kudo E, et al. Kidney Int. 2004; 65(5): 1589-1597.） 研究发现，家族性青少年高尿酸血症肾病（familial juvenilehyperuricemic nephropathy，FJHN）的主要机制是近段肾小管腔内阴离子交换获得性功能突变，尿酸分级排泄显著减少，或近段肾小管上皮细胞凋亡，肾血流动力学改变，尿酸分泌率降低。研究发现，编码亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）的基因多态性与痛风和高尿酸血症相关。在对MTHFR与血清尿酸水平的相关性的研究中发现，导致高尿酸血症的独立危险因素是MTHFR基因C677T突变（Stibůrková B, et al. PLoS One. 2014; 9(5): e97646.）。

肾小球滤过尿酸减少和（或）重吸收增加，可导致尿酸排泄减少，引发高尿酸血症。由于尿酸带负电荷，不能自由通过细胞磷脂双分子层，所以在肾小管中尿酸依赖离子通道进行排泄。其相关蛋白有尿酸盐转运蛋白1、有机阴离子转运1和葡萄糖转运蛋白9等。尿酸盐转运蛋白 1（urate transporter 1，URAT1），由SCL22A12基因编码，在肾皮质近端小管上皮细胞刷状缘表达，通过与有机阴离子的交换完成对尿酸盐的重吸收，调节肾小管对尿酸的重吸收功能，在维持血清尿酸的动态平衡中发挥重要的作用。研究证明，SCL22A12基因突变影响血尿酸水平，SCL22A12基因是促尿酸排泄药物的重要靶点之一（Enomoto A, et al.Clin Exp Nephrol. 2005; 9(3): 195-205. Kim YH, et al. J Korean Med Sci. 2011;26(9): 1238-1240.）。Graessler等（Graessler J, et al. Arthitis Rheum. 2006; 54(1): 292-300.）研究编码URAT1的基因多态性与原发高尿酸血症有关。URAT1转运尿酸的方式为肾小管管腔内尿酸与细胞内有机阴离子进行交换，细胞内有机阴离子与URAT1有很高的亲和力，在阴离子交换过程中尿酸重吸收增加，肾小管管腔的电化学梯度下降，而细胞内阴离子可由管腔膜肾小球滤过液重吸收以及通过基底外侧的转运体由小管周的毛细血管重吸收。有机阴离子转运1（organic anion transporter 1，OAT1）和有机阴离子转运体3（organic anion transporter 3，OAT3）都属于OATs家族，主要在肾小管上皮细胞基底侧膜表达，OAT1负责将尿酸从管周毛细血管间隙转运到肾小管上皮细胞内，一些无机阴离子和有机阴离子会影响OAT1对尿酸盐的转运，且具有时间和剂量依赖性；OAT3与OAT1的作用相似，参与尿酸盐的转运，但具体机制仍不清楚（Kojima R, et al. J Am Soc Nephrol.2002; 13(4): 848-857.）。葡萄糖转运蛋白9（glucose transporter 9，GLUT9），由SCL2A9基因编码，研究表明，除与糖代谢相关外，其在尿酸重吸收中也发挥重要作用，多项基因筛查证明GLUT9基因表达异常与尿酸代谢异常、痛风、肾结石和急慢性肾衰等疾病相关。

其他疾病如肾脏疾病、血液病、恶性肿瘤或药物治疗亦可引起血尿酸异常升高。如肾盂肾炎、慢性肾小球肾炎、多囊肾等各种肾脏疾病会导致肾小球滤过率降低、近曲肾小管对尿酸重吸收增多、尿酸分泌功能下降，尿酸的排出量减少，引起血尿酸浓度的升高。肿瘤的放化疗后由于细胞核破坏增多，核酸分解增加，尿酸随之增多；多发性骨髓瘤、淋巴瘤等血液病均可引起细胞快速增殖，核酸分解增强，造成尿酸来源增多。利尿剂（如呋塞米、氢氯噻嗪）、抗结核药（如吡嗪酰胺、乙胺丁醇）、免疫抑制剂（如环孢素）、大剂量阿司匹林（或长期小剂量服用阿司匹林）、磺脲类降糖药等可抑制尿酸排泄，胰酶制剂、部分抗生素（如氧氟沙星、加替沙星）、降脂药（如烟酸）、维生素C等可导致内源性尿酸来源增多。

针对高尿酸血症的发病机制，目前市场上也存在多种治疗药物可供选择。治疗药物分为降尿酸药物与控制急性炎症发作的抗炎药物两大类。降尿酸药按作用机制又可分为减少尿酸生成的黄嘌呤氧化酶抑制剂、增加尿酸排泄的促尿酸排泄药及分解尿酸的尿酸酶三类 。

黄嘌呤氧化酶抑制剂（xanthine oxidase inhibitor，XOI）是降尿酸一线药物，现临床多用别嘌醇和非布司他，另有2013年日本上市的托匹司他（topiroxostat）。别嘌醇（allopurinol）通过竞争性抑制黄嘌呤氧化酶（XO）的Mo-Pt催化位点起效（Truglio JJ, et al. Structure. 2002; 10(1): 115-125.）。其优势是高效低价，但也有多种不良反应与药物相互作用。不良反应包括肝肾损伤、胃肠道反应、S-J综合征（Stevens-JohnsonSyndrome）与严重超敏反应综合征（AHS）等（Saokaew S, et al. PLoS ONE. 2014; 9(4):e94294.）。在白细胞具有HLA-B* 5801抗原基因表型的人群（包括中国汉族人）中，AHS导致的患者死亡率约为27%（Ryu HJ, et al. J Clin Pharm. 2013; 53(2): 211-216.）。另外，别嘌醇与阿莫西林、茶碱等药物相互作用会增加不良反应发生的风险（Jick H, et al. JClin Pharm. 1981; 21(10): 456-458.）。

非布司他（febuxostat）通过结合疏水空腔从而可以非竞争性抑制XO（Okamoto K,et al. J Biol Chem. 2003; 278(3): 1848-1855.）。研究表明非布司他比别嘌醇降尿酸效果更好（Richette P, et al. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2015; 19(4): 630-639.），对肾损伤及药物相互作用更少，对老年患者、AHS反应患者以及患有其他并发症患者效果好（Chohan S, et al. J Rheumatol. 2011; 38(9): 1957-1959.）。不过相比别嘌醇其对肝药酶活性增强更明显（Becker MA, et al. Arthritis Res Ther. 2010; 12(2):R63.）、心血管不良事件更多（Keenan RT. Rheumatic Disease Clinics of NorthAmerica. 2012; 38(4): 663-680.）。

美国风湿病协会治疗指南将促尿酸排泄药（Uricosuric）作为XOI不耐受或使用禁忌时的选择。该类药物既可单用，也可联合使用。指南推荐一线单用药物为丙磺舒。联合用药则推荐联用兼有促尿酸排泄作用的非诺贝特与氯沙坦。促尿酸排泄药通过抑制肾小管对尿酸的重吸收来促进尿酸排泄。临床多用磺胺类药物，如丙磺舒、苯磺唑酮、苯溴马隆等。苯溴马隆由于损伤肝/肾功能的不良反应已退出美国和欧盟市场（Azevedo VF, et al. IntJ Rheumatol. 2014; 2014: 263720.）。当尿酸重吸收过程被抑制，大量尿酸会进入肾脏。弱酸性的尿酸在pH较低的尿液中溶解度更低，更易在肾脏中析出晶体，引发损伤。因此该类药物对患者肾功能有一定要求。为减少尿酸在尿液中析出，应用该类药物前常需碱化尿液碱化尿液药物包括碳酸氢钠、枸橼酸钾钠合剂（如Uralyt）等 。

灵长类以外哺乳动物体内均存在尿酸氧化酶（urate oxidase），可将尿酸氧化为水溶性更强的尿囊素排出体外。pegloticase是聚乙二醇衍生化重组尿酸氧化酶注射液，商品名为普瑞凯希，2010年FDA批准用于治疗顽固性痛风。但该药价格昂贵且应答率相对较低（Sundy JS, et al. JAMA. 2011; 306(7): 711-720.）。另约40%患者会产生抗体。并且有皮疹等注射反应， 葡糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺失患者与末期肾病患者也禁止使用。拉布立酶（rasburicase）是重组黄曲霉菌尿酸氧化酶制注射剂，用于癌症化疗伴随的高尿酸血症。该药为非聚乙二醇化制剂，故半衰期对较短。另一不足是G6PD缺失患者中有着较高的注射反应发生率，表现为过敏性反应、高铁血红蛋白血症与溶血（Sonbol MB, et al. Am JHematol. 2013; 88(2): 152-154.）。

抗炎药在高尿酸血症与痛风病程中的作用之一是控制痛风或痛风性关节炎急性炎症发作; 二是用于痛风预防治疗（Khanna D, et al. Arthritis Care Res. 2012; 64(10): 1447-1461.）。常用药物有肾上腺糖皮质激素、非甾体抗炎药（NSAIDs）及秋水仙碱。肾上腺皮质激素对急性痛风作用明显，但其免疫抑制作用会增加再次感染的风险。非甾体类抗炎药物尤其是COX-2特异性抑制剂是痛风性关节炎的一线药物，但仅能缓解急性痛风症状。秋水仙碱为NSAIDs不耐受的急性痛风发作的孤儿药，但会引起肠胃不适、骨髓抑制等不良反应，并且中毒后缺乏有效解毒剂。虽然抗炎药能够在一定程度上缓解痛风症状，但不能够有效地降低血液中尿酸含量，对高尿酸血症带来的其他影响无法消除。

综上所述，高尿酸血症最有效的治疗途径还是降低血液中的尿酸浓度。通过降低血液中的尿酸浓度不仅能够有效地缓解痛风症状，还能够改善因血液中尿酸浓度过高带来的其他负面影响。最理想的方式是，利用尿酸氧化酶将血液中尿酸氧化成更溶于水的尿囊素，通过尿液排出体外。遗憾的是，由于进化过程的基因突变，人类自身不能够合成尿酸氧化酶。普瑞凯希和拉布立酶的开发成功说明了外源表达的尿酸氧化酶能够催化血液中的尿酸转化为尿囊素，有效地降低血液中的尿酸含量，从原理上证明了尿酸氧化酶治疗高尿酸血症的可能性。但是两种药物高昂的价格、较强的副作用和需要反复给药带来的不便性限制了其应用于更多的患者。

为此，我们在本发明中设计了一种用于高尿酸血症的基因治疗药物rAAV-CAM-AUO-142T。首先我们人为设计了可分泌的尿酸氧化酶基因AUO，选择人Cystatin S蛋白的分泌信号肽，保证表达蛋白高效分泌入血；设计的尿酸氧化酶为猪尿酸氧化酶和狒狒尿酸氧化酶的融合蛋白，既保证了表达产生尿酸氧化酶的活性，又降低了表达得到尿酸氧化酶的免疫原性。其次，采用人为设计的高效表达启动子CAM调控AUO基因表达，并在基因的3’UTR（untranslated region）区加入miR-142-3p靶序列，最大限度地抑制AUO基因在免疫相关细胞（如抗原呈递细胞）中表达，显著降低针对Auo蛋白免疫反应的产生概率（Boisgerault F,et al.Hum Gene Ther. 2013; 24(4): 393-405.）。选择安全、不致病的重组AAV载体（Dismuke DJ, et al. Curr Gene Ther. 2013; 13(6): 434-452.）携带AUO基因表达框。进一步提高了药物开发成功的可能性。

腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）因在腺病毒制品中发现而得名（Atchison RW, et al. Science. 1965; 149: 754-756. Hoggan MD, et al. Proc NatlSci USA. 1966; 55: 1467-1474.）。AAV是微小病毒科（Parvovirus）成员，包含多种血清型，其基因组为单链DNA（Rose JA, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1969; 64: 863-869.），其中AAV2的基因组大小为4682个核苷酸。AAV是依赖性病毒，需要其它病毒如腺病毒、单纯疱疹病毒和人乳头瘤病毒（Geoffroy MC, et al. Curr Gene Ther. 2005; 5(3):265-271.），或辅助因素提供辅助功能才能复制。在没有辅助病毒存在时，AAV感染细胞后其基因组将整合到细胞染色体中成为潜伏状态（Chiorini JA, et al. Curr Top MicrobiolImmunol. 1996; 218: 25-33.），而不产生子代病毒。

最早分离到的AAV病毒是血清型2型AAV（AAV2）（Atchison RW, et al. Science.1965; 149: 754-756.）。AAV2基因组长约4.7kb，基因组两端为长度145bp的 “反向末端重复序列”（inverted terminal repeat, ITR），呈回文-发卡结构（Lusby E, et al. JVirol. 1980; 34: 402-409.）。基因组中有两个大开放阅读框（ORF），分别编码rep和cap基因。AAV2的全长基因组已克隆至大肠杆菌质粒中（Samulski RJ, et al. Proc Natl AcadSci USA. 1982; 79: 2077-2081. Laughlin CA, et al. Gene. 1983; 23: 65-73.）。

ITR是AAV载体基因组的顺式作用元件，在AAV病毒的整合、拯救、复制和基因组包装中发挥重要作用（Xiao X, et al. J Virol. 1997; 71(2): 941-948.）。ITR序列中包含Rep蛋白结合位点（Rep binding site，RBS）和末端解链位点trs（terminal resolutionsite），能够被Rep蛋白结合识别并在trs处产生切口（Linden RM, et al. Proc Natl AcadSci USA. 1996; 93(15): 7966-7972.）。ITR序列还可形成独特的“T”字母型二级结构，在AAV病毒的生活周期中发挥重要作用（Ashktorab H, et al. J Virol. 1989; 63(7):3034-3039.）。

AAV2基因组其余部分可分为2个功能区，rep基因区和cap基因区（Srivastava A,et al. J Virol. 1983; 45(2): 555-564.）。rep基因区编码Rep78、Rep68、Rep52和Rep40四种Rep蛋白。Rep蛋白对于AAV病毒的复制、整合、拯救和包装都具有重要作用。其中Rep78和Rep68与ITR中的末端解链位点trs（terminal resolution site）和GAGY重复基序（repeat motif）特异性结合（Hüser D, et al. PLoS Pathog. 2010; 6(7): e1000985.），启动AAV基因组由单链向双链的复制过程。ITR中trs和GAGC重复基序是AAV基因组复制的中心，因此虽然在各种血清型的AAV病毒中ITR序列都不尽相同，但是都能形成发卡结构和存在Rep结合位点。在AAV2基因组图谱位置19处有p19启动子，分别表达Rep52和Rep40。Rep52和Rep40没有结合DNA的功能，而有ATP依赖的DNA解旋酶活性。cap基因编码AAV病毒的衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。其中，VP3分子量最小，但数量最多，在成熟的AAV颗粒中VP1、VP2、VP3的比例大致为1:1:10。VP1是形成有感染性的AAV所必需的；VP2协助VP3进入细胞核；VP3是组成AAV颗粒的主要蛋白。

随着对AAV病毒生活周期及其相关分子生物学机制的了解，AAV病毒被改造成了一种高效的外源基因转移工具，即AAV载体。改造后的AAV载体基因组中只包含AAV病毒的ITR序列和携带转运的外源基因表达框，病毒包装需要的Rep和Cap蛋白通过外源质粒反式提供，降低了rep和cap基因包装入AAV载体可能带来的危害。加之，AAV病毒本身不具有致病性，使AAV载体成为公认的最安全的病毒载体之一。删除AAV病毒的一侧ITR序列中的D序列和trs（terminal resolution site）序列还能够使包装得到的重组AAV病毒载体携带基因组自我互补，形成双链，显著提高AAV载体的体内外转导效率（Wang Z, et al. Gene Ther.2003; 10(26): 2105-2111. McCarty DM, et al. Gene Ther. 2003; 10(26): 2112-2118.）。包装得到的病毒成为scAAV（self-complementary AAV）病毒，即所谓的双链AAV病毒。不同于双侧ITR均未突变的ssAAV（single-stranded AAV），即传统的AAV病毒。scAAV病毒的包装容量更小，仅为ssAAV包装容量的一半，约为2.2kb-2.5kb，但感染细胞后转导效率更高。AAV病毒血清型众多，不同的血清型具有不同的组织感染嗜性，因此应用AAV载体能够将外源基因转运至特定的器官和组织（Wu Z, et al. Mol Ther. 2006; 14(3): 316-327.）。某些血清型AAV载体还可穿越血脑屏障，将外源基因导致大脑神经元中，为靶向大脑的基因转导提供了可能（Samaranch L, et al. Hum Gene Ther. 2012; 23(4): 382-389.）。此外，AAV载体的理化性质稳定，对酸碱和高温体现出较强的耐受性（Gruntman AM,et al. Hum Gene Ther Methods. 2015; 26(2): 71-76.），容易开发出稳定性较高的生物制品。

AAV载体还具有相对成熟的包装系统，便于规模化生产。目前国内外常用的AAV载体包装系统主要包括三质粒共转染系统、腺病毒为辅助病毒系统、单纯疱疹病毒（Herpessimplex virus type 1，HSV1）为辅助病毒的包装系统以及基于杆状病毒的包装系统。其中，三质粒转染包装系统因无需辅助病毒，安全性高，是应用最为广泛的AAV载体包装系统，也是目前国际上主流的生产系统。略显不足的是，高效大规模转染方法的缺失限制了三质粒转染系统在AAV载体大规模制备中的应用。Yuan等建立以腺病毒为辅助病毒的AAV大规模包装系统（Yuan Z, et al. Hum Gene Ther. 2011; 22(5): 613-624.），该系统生产效率高，但包装系统中腺病毒在最后AAV成品中的痕量存在，影响了AAV成品的安全性。HSV1作为辅助病毒的包装系统是另一类应用较为广泛的AAV载体包装系统。伍志坚和Conway等几乎同时在国际上提出了以HSV1为辅助病毒的AAV2载体包装策略（伍志坚，等. 科学通报.1999, 44(5): 506-509。Conway JE, et al. Gene Ther. 1999; 6: 986-993.）。随后Wustner等提出了以HSV1为辅助病毒的AAV5载体包装策略（Wustner JT, et al. MolTher. 2002; 6(4): 510-518.）。在此基础上，Booth等利用两个HSV1分别携带AAV的rep/cap基因和AAV的反向末端序列（Inverted terminal repeat，ITR）/外源基因表达框，然后两个重组HSV1病毒共同感染生产细胞，包装产生AAV病毒（Booth MJ, et al. Gene Ther,2004,11:829-837.）。Thomas等进一步建立双HSV1病毒AAV生产的悬浮细胞系统（ThomasDL, et al. Gene Ther. 2009; 20: 861-870.），使更大规模的AAV病毒生产成为可能。另外，Urabe等利用三个杆状病毒分别携带AAV的结构、非结构和ITR/外源基因表达框，构建了AAV载体的杆状病毒包装系统。考虑到杆状病毒携带外源基因的不稳定性，随后减少了生产系统中所需杆状病毒的个数，逐渐从最开始的需要三个杆状病毒到需要两或一个杆状病毒（Chen H. Mol Ther. 2008; 16(5): 924-930. Galibert L, et al. J InvertebrPathol. 2011; 107 Suppl: S80-93.）以及一个杆状病毒加一株诱导细胞株策略（Mietzsch M, et al. Hum Gene Ther. 2014; 25: 212-222. Mietzsch M, et al. HumGene Ther. 2015; 26(10): 688-697.）。每种包装系统都各具特点，可根据需要做出合适的选择。

由于上述特点，AAV载体逐渐成为一种广泛应用于基因治疗，特别是遗传病的基因治疗的外源基因转运工具。截至2016年8月，世界上批准的机遇AAV载体的基因治疗临床试验方案有173项（http://www.abedia.com/wiley/vectors.php）。更为重要的是，基于AAV载体的脂蛋白脂酶基因治疗药物Glybera已于2012年被欧洲药监局批准上市，成为西方世界批准的第一个基因治疗药物（Ylä-Herttuala S. Mol Ther. 2012; 20(10): 1831-1832.）；血友病B（Kay MA, et al. Nat Genet. 2000; 24(3): 257-261.）和先天性黑蒙症（RPE65基因突变引起）（Jacobson SG, et al. Arch Ophthalmol. 2012; 130(1): 9-24.）的AAV载体基因治疗药物均取得不错的临床试验效果，预期在不久的将来会上市销售，造福广大患者。

本发明中，我们选择AAV载体来携带AUO基因表达框，主要是基于AAV载体的以下特点。其一，AAV载体仅保留野生型病毒中包装需要的两个ITR序列，不含有野生型病毒基因组中的蛋白编码基因（Salgenik M, et al. Microbiol Spectr. 2015; 3(4).），免疫原性低。其二，AAV通常以不整合的染色体外遗传物质形式实现携带基因读框的持续稳定表达（Chen ZY, et al. Mol Ther. 2001; 3(3): 403-410.），避免引导入基因随机整合而带来的安全性问题。其三，AAV载体通过静脉注射、肌肉注射都具有较高的转导效率（Wang Z, et al. Nat Biotechnol. 2005; 23: 321-328. Bish LT, et al. Hum Gene Ther. 2008;19: 1359-1368. Zincarelli C, et al. Mol Ther. 2008; 16: 1073-1080. Prasad KM,et al. Gene Ther. 2011; 18: 43-52. Rebuffat A, et al. Hum Gene Ther. 2010; 21(4): 463-477.），保证AUO基因表达框能够在体内高效地表达Auo蛋白。其四，AAV载体通过口服能够感染肠上皮细胞（Ma H, et al. Hepatology. 2005; 42(6): 1355-1363.），使口服给药就可能表达产生尿酸氧化酶，从而降低血液中的尿酸含量，达到治疗高尿酸血症的目的。

为了降低机体产生针对Auo蛋白免疫反应的概率，延长Auo基因持续稳定表达的时间。我们人为设计了高效表达的CAM启动子，让导入的Auo基因在体内高效表达。进一步，我们在AUO基因表达框的3’UTR区克隆入4个miR-142-3p靶序列。由于miR-142-3p在造血干细胞系来源细胞中高表达（Chen CZ, et al. Science. 2004; 303(5654): 83-86.），免疫细胞均分化来源于造血干细胞系，因此利用miRNA抑制基因表达的原理（Kim VN. Nat RevMol Cell Biol. 2005; 6(5): 376-385.），携带miR-142-3p靶序列的基因表达会在免疫细胞中受到明显抑制，从而降低机体产生针对基因表达产物免疫反应的概率（BoisgeraultF, et al.Hum Gene Ther. 2013; 24 (4): 393-405.）。

miRNAs（microRNAs）是广泛存在于人类和动物体内的长度为18至25个核苷酸（nucleotide，nt）的单链非编码RNA（Bartel DP. Cell. 2004; 116: 281-297. Kim VN.Nat Rev Mol Cell Biol. 2005; 6: 376-385.）。1993年miRNA首先在秀丽线虫（C.elegans）中发现（Lee RC, et al. Cell. 1993; 75: 843-854. Wightman B, et al.Cell. 1993; 75: 855-862.）。C.elegans中lin-4基因能够下调lin-14基因的表达，但lin-4基因的编码产物不是蛋白质，而是一种小RNA分子，表明自身编码小RNA分子能够调节基因的表达。随后，多种类似的小RNA分子在不同的物种和细胞中相继发现（Lagos-Quintana M,et al. Science. 2001; 294: 853-858. Lau NC, et al. Science. 2001; 294: 858-862. Lee RC, et al. Science. 2001; 294: 862-864.），miRNA开始成为该类小RNA 的统称。miRNA调节人类大约60%基因的表达（Lewis BP, et al. Cell. 2005; 120: 15-20.Friedman RC, et al. Genome Res. 2009; 19: 92-105.），在多种生理和病理过程中发挥重要作用（Careton M, et al. Cell Cycle. 2007; 6: 2127-2132. Ambros V. Cell.2003; 113: 673-676. Schichel R, et al. Oncogene. 2008; 27: 5959-5974.）。

miRNA基因通常位于基因组的外显子、内含子和基因间区中（Olena AF, et al. JCell Physiol. 2010; 222: 540-545. Kim VN, et al. Trends Genet. 2006; 22: 165-173.）。在细胞内，miRNA的产生过程如下述（Winter J, et al. Nat Cell Biol. 2009;11: 228-234.）。首先在细胞核中，miRNA基因由RNA聚合酶II或III启动转录产生初始产物pri-microRNA；pri-microRNA自我折叠部分序列形成茎环结构。随后，由核糖核酸酶IIIDrosha和DGCR8分子组成的加工复合体作用pri-microRNA，切去多余序列，留下60nt左右的茎环结构，即前体miRNA分子pre-microRNA（Lee Y, et al. Nature. 2003; 425: 415-419. Denli AM, et al. Nature. 2004; 432: 231-235. Gregory RI, et al. Nature.2004; 432: 235-240. Han J, et al. Genes Dev. 2004; 18: 3016-3027. LandthalerM, et al. Curr Biol. 2004; 14: 2162-2167.）。然后在转运蛋白Exportin-5的协助下，pre-microRNA从细胞核进入细胞质中（Lund E, et al. Science. 2003; 303: 95-98. YiR, et al. Genes Dev. 2003; 17: 3011-3016. Bohnsack MT, et al. RNA. 2004; 10:185-191.），经Dicer酶加工去掉其茎环结构中的环形部分，变为双链RNA分子（Jiang F, et al. Genes Dev. 2005; 19: 1674-1679. Saito K, et al. PLoS Biol. 2005; 3:e235.）。最后，双链RNA分子被AGO2等蛋白因子结合，其中一条链发生降解，另一条链和蛋白因子形成RNA诱导沉默复合物（RNA induced silencing complex，RISC）。RISC识别mRNA中靶序列，通过降解mRNA分子、促进mRNA分子3’端去腺苷化和抑制翻译来降低mRNA的表达水平，在转录后水平调节基因的表达（Storz G, et al. Curr Opin Microbiol. 2004; 7:140-144. Fabian MR, et al. Annu Rev Biochem. 2010; 79: 351-379. Valencia-Sanchez MA, et al. Genes Dev. 2006; 20: 515-524.）。因此利用细胞内高表达的miRNA，在外源基因的3’UTR（untranslated region）插入该miRNA的靶序列，能够有效地抑制外源基因在导入细胞中的表达。

根据以上设计思路，我们制备得到rAAV-CAM-AUO-142T病毒，并设计制备得到无miR-142-3p靶序列的rAAV-CAM-AUO对照病毒。将这些病毒分别等剂量口服或注射至高尿酸血症小鼠模型体内，评价设计rAAV-CAM-AUO-142T有效性。结果显示，相比对照病毒，rAAV-CAM-AUO-142T和rAAV-CAM-AUO都能够在高尿酸血症小鼠模型体内表达Auo蛋白，显著降低高尿酸血症小鼠模型体内的尿酸含量，有效缓解或治疗因血液中尿酸浓度偏高带来的痛风等症状。而且相比于rAAV-CAM-AUO病毒，rAAV-CAM-AUO-142T病毒在模型体内的稳定持续表达时间更长，一次口服或注射就能够长时间地降低模型体内的尿酸含量，有效缓解高尿酸血症及其带来的相关症状，为高尿酸血症患者提供了新的治疗选择。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种基于AAV载体的新型的高尿酸血症基因治疗药物。该药物由AAV载体携带AUO基因表达框。人为设计的AUO基因由人Cystatin S蛋白的分泌信号肽（Barash S, et al. Biochem Biophys Res Commun. 2002; 294(4): 835-842.），来源于猪的尿酸氧化酶和狒狒尿酸氧化酶的融合序列组成。采用认为设计的高效表达启动子CAM调控AUO基因表达，在基因的3’UTR（untranslated region）区加入miR-142-3p靶序列。基于上述设计，预期该药物通过口服、静脉注射或者肌肉注射后能够在高尿酸血症小鼠体内高效分泌表达尿酸氧化酶，催化血液中的尿酸为尿囊素，显著降低血液中的尿酸浓度，预防和治疗因血液中尿酸浓度过高带来的痛风等症状。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种治疗高尿酸血症的基因治疗药物，其特征在于，该药物基于重组AAV载体，利用AAV载体通过口服、静脉注射或者肌肉注射能高效地把药物效应元件导入体内，实现药物效应元件表达产物治疗作用蛋白尿酸氧化酶的高效表达。为了实现尿酸氧化酶的高效表达，根据不同血清型AAV的转导特点，不同的给药方式选择相应的血清型AAV，如静脉注射主要选择AAV2、AAV3B、AAV6、AAV8和AAV9等，肌肉注射则主要选择AAV1、AAV8和AAV9等，口服主要选择AAV1、AAV2、AAV5、AAV8和AAVrh.10等。

本发明提供的高尿酸血症基因治疗药物，其特征在于，使用的AAV载体为ssAAV载体和scAAV载体。优先选择为scAAV载体，scAAV载体能够自身互补形成双链，避免了ssAAV进入细胞后需要通过DNA修复、复制等合成互补链才能转录表达携带外源基因的过程，因此scAAV载体转导效率更高，表达更为迅速。

本发明提供的治疗高脂血症的基因治疗药物，其特征还在于，人为设计的分泌性尿酸氧化酶序列Auo。Auo蛋白的分泌信号肽来源于人Cystatin S蛋白（SEQ ID No.1），该信号肽具有序列短小、分泌作用强的特点，保证了表达产生的Auo蛋白能够高效地分泌至细胞外，进入血液循环，使血液中尿酸的降解成为可能。由于人类进化过程中尿酸氧化酶基因发生突变，不能表达产生尿酸氧化酶蛋白，因此我们设计的尿酸氧化酶为猪尿酸氧化酶和狒狒尿酸氧化酶的融合序列。我们选择猪尿酸氧化酶（GenBank：AAA31141.1）的1-252位氨基酸序列（SEQ ID No.2）和狒狒尿酸氧化酶（GenBank：AAA35395.1）的253-304位氨基酸序列（SEQ ID No.3）组成融合蛋白，既保证了表达产生尿酸氧化酶的活性，又降低了表达得到尿酸氧化酶的免疫原性。我们将融合得到的尿酸氧化酶加上人Cystatin S蛋白分泌信号肽的蛋白命名为Auo蛋白（SEQ ID No.4）。进一步设计了Auo蛋白的基因表达框。基于设计的Auo基因表达框能够实现Auo蛋白的高效表达。首先根据密码子偏爱性、GC含量、CpG二聚体含量、mRNA二级结构、消除隐蔽剪接位点、消除让转录提前终止的polyA加尾信号、消除内部chi位点和核糖体结合位点、CpG岛、消除ARE序列等RNA不稳定基序和RNA重复序列（正向重复、反向重复和二重复等）等原则优化合成Auo蛋白的编码区序列，得到CS SP-AUO序列（SEQID No.5）。接下来，在优化后的CS SP-AUO序列的翻译起始密码子前添加Kozak序列5’-GCCACC-3’，提高蛋白翻译时的准确起始效率。采用人为设计的CAM启动子调控Auo基因转录，CAM启动子（SEQ ID No.6）由人CMV病毒的增强子序列、鸡β-actin蛋白的基础启动子和MVM内含子组成，使Auo基因能够在多种细胞中高效转录。最后，在Auo基因的3’UTR区插入4个串联的完全互补的miR-142-3p靶序列（SEQ ID No.7），抑制Auo蛋白在抗原呈递细胞中表达，降低针对Auo蛋白产生免疫反应的概率，使Auo蛋白在体内持续稳定高效表达。

本发明提供的高尿酸血症基因治疗药物，其特征在于，将该药物经静脉注射注射至高尿酸血症模型小鼠体内后，能在小鼠体内高效稳定持续地分泌表达Auo蛋白，表达产生的Auo蛋白将血液中或细胞内的尿酸转化为尿囊素，显著降低血液中的尿酸含量，消除因血液中尿酸过高带来的痛风等不良影响，从而达到治疗高尿酸血症的目的。

本发明提供的高尿酸血症基因治疗药物，其特征在于，该药物经肌肉注射至高尿酸血症小鼠体内后呈现出同静脉注射相似的治疗效果。但需要采用不同于静脉注射方式的血清型AAV来携带Auo基因表达框，且需要改变药物的注射剂量。

本发明提供的高尿酸血症基因治疗药物，其特征在于，该药物经口灌服至高尿酸血症体内后呈现出同静脉和肌肉注射相似的治疗效果。但需要采用不同于静脉或肌肉注射方式的血清型AAV来携带Auo基因表达框，且需要改变药物的使用剂量。

本发明提供的高尿酸血症基因治疗药物，其特征还在于，经口服、静脉或肌肉注射一次给药就能够长期持续地降低高尿酸血症患者体内的尿酸含量，消除因尿酸过高带来的痛风等不良影响，从而达到长时间的治疗效果。

本发明用到的重要原始实验材料如下所示：

pHelper质粒，来源于AAV Helper Free System（Agilent Technologies，美国），由本公司购自AgilentTechnologies公司并保存。该质粒包含三质粒共转染HEK293细胞制备重组AAV病毒所需要的腺病毒来源辅助功能基因E2A、E4和VA RNA等。

pAAV-RC质粒，来源于AAV Helper Free System（Agilent Technologies，美国），由本公司购自AgilentTechnologies公司并保存。pAAV-RC质粒包含完整的AAV2的rep和cap基因，在三质粒共转染包装制备重组AAV2病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）和AAV2外壳蛋白。

pAAV-R2C1质粒，由本公司构建保存。以AAV Helper Free System（AgilentTechnologies，美国）中的pAAV-RC质粒为基本骨架，用AAV1基因组（GenBank ID：NC_002077）中外壳蛋白编码序列Cap1（基因组中第2223至4433位序列）替换pAAV-RC质粒中第2013至4220位序列，即得pAAV-R2C1质粒。简要的构建过程为，根据前述思路获得pAAV-R2C1质粒序列信息，人工合成pAAV-R2C1质粒中Hind III至Pme I酶切位点之间序列，采用标准的分子克隆方法，用合成序列替换pAAV-RC质粒Hind III至Pme I酶切位点之间序列，获得pAAV-R2C1质粒。pAAV-R2C1质粒包含完整的AAV1的cap基因和AAV2的rep基因，在三质粒共转染包装制备重组AAV1病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）和AAV1外壳蛋白。

pAAV-R2C8质粒，由本公司构建保存。以AAV Helper Free System（AgilentTechnologies，美国）中的pAAV-RC质粒为基本骨架，用AAV8基因组（GenBank ID：AF513852）中外壳蛋白编码序列Cap8（基因组中第2121至4337位序列）替换pAAV-RC质粒中第2013至4220位序列，即得pAAV-R2C8质粒。简要的构建过程为，根据前述思路获得pAAV-R2C8质粒序列信息，人工合成pAAV-R2C8质粒中HindIII至PmeI酶切位点之间序列，采用标准的分子克隆方法，用合成序列替换pAAV-RC质粒Hind III至Pme I酶切位点之间序列，获得pAAV-R2C8质粒。pAAV-R2C8质粒包含完整的AAV8的cap基因和AAV2的rep基因，在三质粒共转染包装制备重组AAV1病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）和AAV8外壳蛋白。

pAAV-R2C9质粒，由本公司构建保存。以AAV Helper Free System（AgilentTechnologies，美国）中的pAAV-RC质粒为基本骨架，用AAV9外壳蛋白编码序列（GenBankID：AY530579）替换pAAV-RC质粒中第2013至4220位序列，即得pAAV-R2C9质粒。简要的构建过程为，根据前述思路获得pAAV-R2C9质粒序列信息，人工合成pAAV-R2C9质粒中HindIII至PmeI酶切位点之间序列，采用标准的分子克隆方法，用合成序列替换pAAV-RC质粒Hind III至Pme I酶切位点之间序列，获得pAAV-R2C9质粒。pAAV-R2C9质粒包含完整的AAV9的cap基因和AAV2的rep基因，在三质粒共转染包装制备重组AAV1病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）和AAV9外壳蛋白。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1pAAV2neo载体结构示意图。本公司保存的两侧ITR均为145bp野生型ITR的AAV载体pAAV2neo（Dong X, et al. PLoS ONE. 2010; 5(10): e13479.）。ITR，invertedterminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。CMV promoter，人巨细胞病毒早期启动子。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。

图2 pscAAV-CAM载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。CAM promoter，人为设计合成的启动子，由人巨细胞病毒早期增强子、鸡β-actin基础启动子和小鼠细小病毒（minute parvovirus of mice，MVM）内含子组成。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。

图3 pscAAV-CAM-AUO载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。CAM promoter，人为设计合成的启动子，由人巨细胞病毒早期增强子、鸡β-actin基础启动子和小鼠细小病毒（minute parvovirus of mice，MVM）内含子组成。CS SP，优化合成的人Cystatin S蛋白分泌信号肽。AUO，优化合成的融合尿酸酶基因序列。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。

图4 pscAAV-CAM-AUO-142T载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。CAM promoter，人为设计合成的启动子，由人巨细胞病毒早期增强子、鸡β-actin基础启动子和小鼠细小病毒（minute parvovirus of mice，MVM）内含子组成。CS SP，优化合成的人Cystatin S蛋白分泌信号肽。AUO，优化合成的融合尿酸酶基因序列。4×miR-142-3pT，4个串联的完全互补的人miR-142-3p靶序列。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。

图5 静脉注射重组病毒后血清中尿酸浓度。 4种不同的重组AAV病毒（scAAV9-CAM-AUO、scAAV9-CAM-AUO-142T、scAAV8-CAM-AUO、scAAV8-CAM-AUO-142T）以2×10¹¹vg/只（viral genome，vg）的剂量经尾静脉注射高尿酸血症模型小鼠。注射后不同的时间点（0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w），眼眶采血，分离血清，测定血清中尿酸含量。

图6静脉注射重组病毒后尿液中尿酸浓度。 4种不同的重组AAV病毒（scAAV9-CAM-AUO、scAAV9-CAM-AUO-142T、scAAV8-CAM-AUO、scAAV8-CAM-AUO-142T）以2×10¹¹vg/只（viral genome，vg）的剂量经尾静脉注射高尿酸血症模型小鼠。注射后不同的时间点（0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w），采集小鼠尿液，测定尿液中尿酸含量。

图7静脉注射重组病毒后血清中尿酸氧化酶浓度。 4种不同的重组AAV病毒（scAAV9-CAM-AUO、scAAV9-CAM-AUO-142T、scAAV8-CAM-AUO、scAAV8-CAM-AUO-142T）以2×10¹¹vg/只（viral genome，vg）的剂量经尾静脉注射高尿酸血症模型小鼠。注射后不同的时间点（0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w），眼眶采血，分离血清，测定血清中尿酸氧化酶含量。

图8 肌肉注射重组病毒后血清中尿酸浓度。 4种不同的重组AAV病毒（scAAV1-CAM-AUO、scAAV1-CAM-AUO-142T、scAAV8-CAM-AUO、scAAV8-CAM-AUO-142T）以4×10¹¹vg/只（viral genome，vg）的剂量经肌肉注射高尿酸血症模型小鼠。注射后不同的时间点（0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w），眼眶采血，分离血清，测定血清中尿酸含量。

图9 肌肉注射重组病毒后尿液中尿酸浓度。 4种不同的重组AAV病毒（scAAV1-CAM-AUO、scAAV1-CAM-AUO-142T、scAAV8-CAM-AUO、scAAV8-CAM-AUO-142T）以4×10¹¹vg/只（viral genome，vg）的剂量经肌肉注射高尿酸血症模型小鼠。注射后不同的时间点（0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w），采集小鼠尿液，测定尿液中尿酸含量。

图10 肌肉注射重组病毒后血清中尿酸氧化酶浓度。 4种不同的重组AAV病毒（scAAV1-CAM-AUO、scAAV1-CAM-AUO-142T、scAAV8-CAM-AUO、scAAV8-CAM-AUO-142T）以4×10¹¹vg/只（viral genome，vg）的剂量经肌肉注射高尿酸血症模型小鼠。注射后不同的时间点（0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w），眼眶采血，分离血清，测定血清中尿酸氧化酶含量。

图11 口服重组病毒后血清中尿酸浓度。 4种不同的重组AAV病毒（scAAV2-CAM-AUO、scAAV2-CAM-AUO-142T、scAAV8-CAM-AUO、scAAV8-CAM-AUO-142T）以4×10¹¹vg/只（viral genome，vg）的剂量口服至高尿酸血症模型小鼠中。口服后不同的时间点（0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w），眼眶采血，分离血清，测定血清中尿酸含量。

图12 口服重组病毒后尿液中尿酸浓度。 4种不同的重组AAV病毒（scAAV2-CAM-AUO、scAAV2-CAM-AUO-142T、scAAV8-CAM-AUO、scAAV8-CAM-AUO-142T）以4×10¹¹vg/只（viral genome，vg）的剂量口服至高尿酸血症模型小鼠。口服后不同的时间点（0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w），采集小鼠尿液，测定尿液中尿酸含量。

图13 口服重组病毒后血清中尿酸氧化酶浓度。 4种不同的重组AAV病毒（scAAV1-CAM-AUO、scAAV1-CAM-AUO-142T、scAAV8-CAM-AUO、scAAV8-CAM-AUO-142T）以4×10¹¹vg/只（viral genome，vg）的剂量口服至高尿酸血症模型小鼠。口服后不同的时间点（0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w），眼眶采血，分离血清，测定血清中尿酸氧化酶含量。

具体实施方式

本发明公开了一种高尿酸血症的基因治疗药物，包含药物的设计、小量制备及功能验证，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。其中，如无特殊说明，实施例中涉及的各种反应试剂均可以通过商业渠道购买得到。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1 质粒载体构建

为了构建获得包装重组AAV病毒需要的pscAAV-CAM-AUO和pscAAV-CAM-AUO-142T质粒，我们首先以公司保存的pAAV2neo为基础，用自主设计得到的CAM启动子（SEQ ID No.6）替换pAAV2neo载体中的CMV启动子，用人工合成的缺失AAV2的ITR中trs(terminal resolutionsite)和D序列的突变ITR序列（命名为ΔITR）（SEQ ID No.8）替换pAAV2neo载体中的一侧ITR序列，得到pscAAV-CAM载体。接下来，将人工合成的CS SP-AUO（SEQ ID No.5）和CS SP-AUO-142T（SEQ ID No.9）（CS SP-AUO加上4个串联的miR-142-3p靶序列，两者之间通过EcoRI酶切位点连接）序列分别克隆入pscAAV-CAM载体的KpnI和EcoRI以及KpnI和BglII酶切位点之间，得到pscAAV-CAM-AUO和pscAAV-CAM-AUO-142T载体。

（1）pscAAV-CAM载体构建

将人巨细胞病毒早期基因增强子序列、鸡β-actin启动子序列和小鼠细小病毒内含子序列拼接，得到CAM启动子序列，序列信息见SEQ ID No.6。在CAM启动子序列的两端分别添加XhoI和KpnI酶切位点。添加酶切位点后序列由金斯瑞生物科技有限公司合成，合成序列克隆入金斯瑞生物科技有限公司的pUC57 simple载体（金斯瑞生物科技，南京），得到pUC57-CAM。用XhoI和KpnI分别双酶切消化pUC57-CAM载体和pAAV2neo载体，回收CAM片段和切去CMV启动子的pAAV2neo载体片段（约6.3kb），两片段连接后转化E.coli JM109感受态细胞（宝生物，大连），筛选、鉴定后得到含有CAM启动子的AAV质粒载体pAAV2neo-CAM。以AAV2基因组（GenBank No. AF043303）中的左侧ITR序列为基础，根据文献报道删除ITR序列中的trs序列和D序列（ Wang Z, et al. Gene Ther. 2003; 10: 2105-2111.），得到ΔITR序列。为了便于克隆操作，将pAAV2neo载体中1392-1668bp之间序列（靠近BGH polyA的ITR和ApaI酶切位点之间序列）同ΔITR序列融合，得到融合序列。在融合序列两端分别添加BamHI和ApaI酶切位点后，由金斯瑞生物科技有限公司合成，克隆入pUC57 simple载体，获得pUC57-ΔITR。BamHI和ApaI分别双酶切消化pUC57-ΔITR载体和pAAV2neo-CAM载体，回收含有ΔITR片段和切去ITR序列的pAAV2neo-CAM载体片段。两片段连接后，转化E.coli JM109感受态细胞（宝生物，大连），筛选、鉴定获得pscAAV-CAM载体（附图2）。

（2）pscAAV-CAM-OFat-1载体构建

人为设计的分泌性尿酸氧化酶序列Auo。Auo蛋白的分泌信号肽来源于人Cystatin S蛋白（SEQ ID No.1）。选择猪尿酸氧化酶（GenBank：AAA31141.1）的1-252位氨基酸序列（SEQID No.2）和狒狒尿酸氧化酶（GenBank：AAA35395.1）的253-304位氨基酸序列（SEQ IDNo.3）组成融合蛋白。我们将融合得到的尿酸氧化酶加上人Cystatin S蛋白分泌信号肽的蛋白命名为Auo蛋白（SEQ ID No.4）。由金斯瑞生物科技有限公司根据人密码子偏爱性等原则优化合成Auo蛋白的编码序列CS SP-AUO基因（SEQ ID No.5）。将优化合成的CS SP-AUO基因克隆入pUC57 simple载体，得到pUC57-AUO载体。KpnI和EcoRI分别双酶切消化pUC57-AUO载体和pscAAV-CAM载体，回收CS SP-AUO片段和线性化的pscAAV-CAM载体片段，两片段连接后转化E.coli JM109感受态细胞（宝生物，大连），筛选、鉴定得到pscAAV-CAM-AUO载体。

（3）pscAAV-CAM-AUO-142T载体构建

将4个串联重复的人miR-142-3p的完全互补的靶序列同优化得到的CS SP-AUO基因序列拼接，得到CS SP-AUO-142T序列（SEQ ID No.9）。由金斯瑞生物科技有限公司合成CS SP-AUO-142T序列。将合成的CS SP-AUO-142T序列克隆入pUC57 simple载体，得到pUC57-AUO-142T载体。KpnI和BglII分别双酶切消化pUC57-AUO-142T载体和pscAAV-CAM载体，回收CSSP-AUO-142T片段和线性化的pscAAV-CAM载体片段，两片段连接后转化E.coli JM109感受态细胞（宝生物，大连），筛选、鉴定得到pscAAV-CAM-AUO-142T载体。

实施例2 重组AAV病毒制备及检定

参照文献（Xiao X, et al. J Virol. 1998; 72(3): 2224-2232.），应用三质粒包装系统包装重组AAV病毒，采用氯化铯密度梯度离心法分离纯化包装得到AAV病毒。简要地，AAV载体质粒（pscAAV-CAM-AUO或pscAAV-CAM-AUO-142T）、辅助质粒（pHelper）和AAV的Rep及Cap蛋白表达质粒（pAAV-R2C1、pAAV-RC、pAAV-R2C8或pAAV-R2C9）按照1:1:1的摩尔比混匀后，采用磷酸钙方法转染HEK293细胞，转染48h后，收获细胞和培养上清，应用氯化铯密度梯度离心法分离纯化重组AAV病毒。包装纯化得到scAAV1-CAM-AUO、scAAV1-CAM-AUO-142T、scAAV2-CAM-AUO、scAAV2-CAM-AUO-142T、scAAV8-CAM-AUO、scAAV8-CAM-AUO-142T、scAAV9-CAM-AUO和scAAV9-CAM-AUO-142T等8种重组病毒。

采用定量PCR方法测定制备得到AAV病毒的基因组滴度。具体过程如下：

在CAM启动子中设计两条引物CAM-Q-F和CAM-Q-R：

CAM-Q-F：5’-CCCATAAGGTCATGTACTGGGCAT-3’ (SEQ ID NO.10)

CAM-Q-R：5’-GTTCCCATAGTAACGCCAATAGGG-3’ (SEQ ID NO.11)

以CAM-Q-F和CAM-Q-R为引物特异性地扩增CAM启动子长度为175bp片段，采用SYBRGreen染料结合法，以1μg/μl的pscAAV-CAM-AUO质粒及其10倍梯度稀释的样品为标准品，应用SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)试剂（Takara，大连，中国），使用荧光定量PCR仪（型号：ABI 7500 fast，ABI）检测病毒基因组滴度。操作过程参见SYBR Premix ExTaq II (Tli RNaseH Plus)试剂说明书。病毒的处理方法参见文献（Ulrich-Peter R, et al. J Virol Methods. 2002; 106: 81-88.）。

实施例3 小鼠高尿酸血症模型的建立

参考文献（Wu X，et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1994; 91(2): 742-746.），构建小鼠高尿酸血症模型。采用同源重组的方法敲除小鼠胚胎干细胞中的尿酸氧化酶基因，制备得到尿酸氧化酶基因杂合的转基因小鼠。转基因小鼠的制备操作由北京百奥赛图基因生物技术有限公司完成。北京百奥赛图基因生物技术有限公司将制备得到的尿酸氧化酶基因杂合小鼠C57BL/6J^+/-转移至北京五加和分子医学研究所有限公司。尿酸氧化酶基因杂合小鼠表现正常。将尿酸氧化酶基因杂合的雄性和雌性C57BL/6J^+/-交配，得到缺失尿酸氧化酶基因的纯合小鼠C57BL/6J^-/-，作为高尿酸血症模型。通过测定小鼠表型来筛选确定雄性和雌性C57BL/6J^+/-交配得到的纯合小鼠C57BL/6J^-/-。具体方法为，交配产生子代小鼠出生2周后，眼眶采血，分离血清，采用尿酸检测试剂盒Amplex Red Uric Acid/Uricase Assay Kit(Life technologies)测定血清中尿酸含量，操作过程参见试剂盒说明书。尿酸浓度大于500μM可判定为高尿酸血症。根据此标准，筛选得到80只高尿酸血症模型。所有动物实验操作均在SPF级条件下进行，下同。

实施例4 静脉注射给药治疗高尿酸血症

从实施例3中获得的高尿酸血症小鼠模型中选择体重接近的25只小鼠，随机分为5组，每组5只小鼠。5组小鼠中，其中4组小鼠分别经尾静脉注射scAAV9-CAM-AUO、scAAV9-CAM-AUO-142T、scAAV8-CAM-AUO或scAAV8-CAM-AUO-142T重组病毒，注射剂量为2×10¹¹vg/只，剩余1组小鼠注射等体积的磷酸盐缓冲液（PBS），作为注射scAAV9-CAM-AUO或scAAV9-CAM-AUO-142T的对照以及注射scAAV8-CAM-AUO或scAAV8-CAM-AUO-142T的对照。

在注射后不同的时间点（0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w）监测小鼠血清中的尿酸含量。具体为，在每个对应的时间点，眼眶采血，分离血清，采用尿酸检测试剂盒Amplex RedUric Acid/Uricase Assay Kit (Life technologies)测定血清中尿酸含量，操作过程参见试剂盒说明书。检测结果如图5所示。

从图5的结果可知，相比于未注射病毒的对照组高尿酸血症模型小鼠，所有的注射病毒组小鼠的血清中尿酸含量下降，注射scAAV8-CAM-AUO-142T和scAAV9-CAM-AUO-142T病毒组高尿酸血症模型小鼠的尿酸含量呈现出先快后慢的下降趋势，最终血清中尿酸浓度稳定在80μM以下，同正常小鼠血清中尿酸水平无明显差异（Wu X，et al. Proc Natl AcadSci USA. 1994; 91(2): 742-746.）。相反注射scAAV8-CAM-AUO和scAAV9-CAM-AUO病毒组高尿酸血症模型小鼠的血清中尿酸则先下降后升高，直至同未注射病毒对照组无明显差异。结果提示4种病毒经尾静脉注射高尿酸血症模型小鼠后，均能够有效地降低血清中尿酸含量，但注射scAAV8-CAM-AUO-142T和scAAV9-CAM-AUO-142T病毒组持续作用时间更长，效果更加明显。

我们还在从在注射后不同的时间点（0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w）监测小鼠尿液中的尿酸含量。具体为，在每个对应的时间点，收集小鼠尿液，采用尿酸检测试剂盒AmplexRed Uric Acid/Uricase Assay Kit (Life technologies)测定尿液中尿酸含量，操作过程参见试剂盒说明书。检测结果如图6所示。

从图6的结果可知，尿液中尿酸的含量变化趋势同血清中尿酸含量变化一致。即相比于未注射病毒的对照组高尿酸血症模型小鼠，所有的注射病毒组小鼠的尿液中尿酸含量下降，注射scAAV8-CAM-AUO-142T和scAAV9-CAM-AUO-142T病毒组高尿酸血症模型小鼠的尿酸含量呈现出先快后慢的下降趋势，最终尿液中尿酸浓度稳定在400μM以下。相反注射scAAV8-CAM-AUO和scAAV9-CAM-AUO病毒组高尿酸血症模型小鼠的尿液中尿酸则先下降后升高，直至同对照组无明显差异。结果提示4种病毒经尾静脉注射高尿酸血症模型小鼠后，均能够有效地降低尿液中尿酸含量，但注射scAAV8-CAM-AUO-142T和scAAV9-CAM-AUO-142T病毒组持续作用时间更长，效果更加明显。

与此同时，我们还在注射病毒后不同的时间点，眼眶采血，分离血清，采用尿酸氧化酶检测试剂盒Amplex Red Uric Acid/Uricase Assay Kit (Life technologies)测定血清中尿酸氧化酶含量，操作过程参见试剂盒说明书。从图7的结果可以看到，相比于未注射病毒的对照组高尿酸血症模型小鼠，注射scAAV8-CAM-AUO-142T和scAAV9-CAM-AUO-142T病毒组高尿酸血症模型小鼠血清中尿酸氧化酶含量随时间逐渐升高，然后不再随时间变化而变化。相反注射scAAV8-CAM-AUO和scAAV9-CAM-AUO病毒组高尿酸血症模型小鼠血清中尿酸氧化酶含量则出现先升高，后下降，直至检测不到尿酸氧化酶的表达，同未注射病毒组一样。结果提示4种病毒经尾静脉注射高尿酸血症模型小鼠后，均能够有效地表达产生尿酸氧化酶，但scAAV8-CAM-AUO-142T和scAAV9-CAM-AUO-142T病毒表达尿酸氧化酶的持续时间更长，而scAAV8-CAM-AUO和scAAV9-CAM-AUO病毒则表达时间较短。四种病毒在高尿酸血症小鼠体内尿酸氧化酶表达规律的差异有效地解释了注射不同病毒后小鼠血清和尿液中的尿酸含量变化。

总之，4种病毒静脉注射高尿酸血症模型小鼠后，均能够有效地表达产生尿酸氧化酶，降低小鼠血清和尿液中的尿酸含量，缓解高尿酸血症带来的症状。而且携带miR-142-3p靶序列病毒（scAAV8-CAM-AUO-142T和scAAV9-CAM-AUO-142T）能够在小鼠体内持续高效地表达产生尿酸氧化酶，长时间地降低血清和尿液中的尿酸含量，进而缓解高尿酸血症带来的危害，具有开发成为高尿酸血症治疗药物的潜力。

实施例5肌肉注射给药治疗高尿酸血症

从实施例3中获得的高尿酸血症小鼠模型中选择体重接近的25只小鼠，随机分为5组，每组5只小鼠。5组小鼠中，其中4组小鼠分别经骨骼肌注射scAAV1-CAM-AUO、scAAV1-CAM-AUO-142T、scAAV8-CAM-AUO或scAAV8-CAM-AUO-142T重组病毒，注射剂量为4×10¹¹vg/只，剩余1组小鼠注射等体积的磷酸盐缓冲液（PBS），作为注射scAAV1-CAM-AUO或scAAV1-CAM-AUO-142T的对照以及注射scAAV8-CAM-AUO或scAAV8-CAM-AUO-142T的对照。

在注射后不同的时间点（0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w）监测小鼠血清中的尿酸含量。具体为，在每个对应的时间点，眼眶采血，分离血清，采用尿酸检测试剂盒Amplex RedUric Acid/Uricase Assay Kit (Life technologies)测定血清中尿酸含量，操作过程参见试剂盒说明书。检测结果如图8所示。

从图8的结果可知，同静脉注射类似，相比于未注射病毒的对照组高尿酸血症模型小鼠，所有的注射病毒组小鼠的血清中尿酸含量下降，注射scAAV1-CAM-AUO-142T和scAAV8-CAM-AUO-142T病毒组高尿酸血症模型小鼠的尿酸含量呈现出先快后慢的下降趋势，最终血清中尿酸浓度稳定在100μM以下，略高于静脉注射病毒小鼠。相反注射scAAV1-CAM-AUO和scAAV8-CAM-AUO病毒组高尿酸血症模型小鼠的血清中尿酸则先下降后升高，直至同对照组无明显差异。结果提示4种病毒经肌肉注射高尿酸血症模型小鼠后，均能够有效地降低血清中尿酸含量，但注射scAAV1-CAM-AUO-142T和scAAV8-CAM-AUO-142T病毒组持续作用时间更长，效果更加明显。

我们还在注射后不同的时间点（0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w）监测小鼠尿液中的尿酸含量。具体为，在每个对应的时间点，收集小鼠尿液，采用尿酸检测试剂盒Amplex RedUric Acid/Uricase Assay Kit (Life technologies)测定尿液中尿酸含量，操作过程参见试剂盒说明书。检测结果如图9所示。

从图9的结果可知，尿液中尿酸的含量变化趋势同血清中尿酸含量变化一致。即相比于未注射病毒的对照组高尿酸血症模型小鼠，所有的注射病毒组小鼠的尿液中尿酸含量下降，注射scAAV1-CAM-AUO-142T和scAAV8-CAM-AUO-142T病毒组高尿酸血症模型小鼠的尿酸含量呈现出先快后慢的下降趋势，最终尿液中尿酸浓度稳定在700μM以下，高于静脉注射小鼠，但仍低于未注射病毒对照小鼠。相反注射scAAV1-CAM-AUO和scAAV8-CAM-AUO病毒组高尿酸血症模型小鼠的尿液中尿酸则先下降后升高，直至同对照组无明显差异。结果提示4种病毒经肌肉注射高尿酸血症模型小鼠后，均能够有效地降低尿液中尿酸含量，但注射scAAV1-CAM-AUO-142T和scAAV8-CAM-AUO-142T病毒组持续作用时间更长，效果更加明显。

与此同时，我们还在注射病毒后不同的时间点，眼眶采血，分离血清，采用尿酸氧化酶检测试剂盒Amplex Red Uric Acid/Uricase Assay Kit (Life technologies)测定血清中尿酸氧化酶含量，操作过程参见试剂盒说明书。从图10的结果可以看到，相比于未注射病毒的对照组高尿酸血症模型小鼠，注射scAAV1-CAM-AUO-142T和scAAV8-CAM-AUO-142T病毒组高尿酸血症模型小鼠血清中尿酸氧化酶含量随时间逐渐升高，然后不再随时间变化而变化。相反注射scAAV1-CAM-AUO和scAAV8-CAM-AUO病毒组高尿酸血症模型小鼠血清中尿酸氧化酶含量则出现先升高，后下降，直至检测不到尿酸氧化酶的表达，同未注射病毒组一样。结果提示4种病毒经肌肉注射高尿酸血症模型小鼠后，均能够有效地表达产生尿酸氧化酶，但scAAV1-CAM-AUO-142T和scAAV8-CAM-AUO-142T病毒表达尿酸氧化酶的持续时间更长，而scAAV1-CAM-AUO和scAAV8-CAM-AUO病毒则表达时间较短。四种病毒在高尿酸血症小鼠体内尿酸氧化酶表达规律的差异有效地解释了注射不同病毒后小鼠血清和尿液中的尿酸含量变化。

总之，4种病毒肌肉注射高尿酸血症模型小鼠后，均能够有效地表达产生尿酸氧化酶，降低小鼠血清和尿液中的尿酸含量，缓解高尿酸血症带来的症状。而且携带miR-142-3p靶序列病毒（scAAV1-CAM-AUO-142T和scAAV8-CAM-AUO-142T）能够在小鼠体内持续高效地表达产生尿酸氧化酶，长时间地降低血清和尿液中的尿酸含量，进而缓解高尿酸血症带来的危害，具有开发成为高尿酸血症治疗药物的潜力。

相比于静脉注射给药，我们对高尿酸血症模型小鼠经肌肉注射加倍剂量的重组病毒，但高尿酸血症模型小鼠的尿酸氧化酶表达水皮还相对偏低，对血液和尿液中（即体内）尿酸的降低作用更弱，这可能与肌肉注射感染的组织更少，对骨骼肌以外的组织转导效率较弱相关。但肌肉注射仍然能够将高尿酸血症小鼠模型中的尿酸浓度控制到较低的水平，表现出明显的治疗作用，提示肌肉注射也可以作用一种候选的给药方式，用于高尿酸血症疾病的治疗。

实施例6口服给药治疗高尿酸血症

从实施例3中获得的高尿酸血症小鼠模型中选择体重接近的25只小鼠，随机分为5组，每组5只小鼠。5组小鼠中，其中4组小鼠分别口服scAAV2-CAM-AUO、scAAV2-CAM-AUO-142T、scAAV8-CAM-AUO或scAAV8-CAM-AUO-142T重组病毒，剂量为4×10¹¹vg/只，剩余1组小鼠口服等体积的磷酸盐缓冲液（PBS），作为口服scAAV2-CAM-AUO或scAAV2-CAM-AUO-142T的对照以及口服scAAV8-CAM-AUO或scAAV8-CAM-AUO-142T的对照。

在口服后不同的时间点（0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w）监测小鼠血清中的尿酸含量。具体为，在每个对应的时间点，眼眶采血，分离血清，采用尿酸检测试剂盒Amplex RedUric Acid/Uricase Assay Kit (Life technologies)测定血清中尿酸含量，操作过程参见试剂盒说明书。检测结果如图11所示。

从图11的结果可知，同静脉注射和肌肉注射类似，相比于未注射病毒的对照组高尿酸血症模型小鼠，所有的口服病毒组小鼠的血清中尿酸含量下降，口服scAAV2-CAM-AUO-142T和scAAV8-CAM-AUO-142T病毒组小鼠的尿酸含量呈现出先快后慢的下降趋势，最终血清中尿酸浓度稳定在300μM以下，高于静脉注射和肌肉注射病毒小鼠，但仍低于未注射或口服病毒对照组。相反口服scAAV2-CAM-AUO和scAAV8-CAM-AUO病毒组小鼠的血清中尿酸则先下降后升高，直至同对照组无明显差异。结果提示4种病毒经口服至高尿酸血症模型小鼠后，均能够有效地降低血清中尿酸含量，但口服scAAV8-CAM-AUO-142T和scAAV9-CAM-AUO-142T病毒组持续作用时间更长，效果更加明显。

我们还在口服后不同的时间点（0w、2w、4w、8w、12w、20w和28w）监测小鼠尿液中的尿酸含量。具体为，在每个对应的时间点，收集小鼠尿液，采用尿酸检测试剂盒Amplex RedUric Acid/Uricase Assay Kit (Life technologies)测定尿液中尿酸含量，操作过程参见试剂盒说明书。检测结果如图12所示。

从图12的结果可知，尿液中尿酸的含量变化趋势同血清中尿酸含量变化一致。即相比于未口服病毒的对照组高尿酸血症模型小鼠，所有的口服病毒组小鼠的尿液中尿酸含量下降，口服scAAV2-CAM-AUO-142T和scAAV8-CAM-AUO-142T病毒组高尿酸血症模型小鼠的尿酸含量呈现出先快后慢的下降趋势，最终尿液中尿酸浓度稳定在1500μM以下，高于静脉注射和肌肉注射小鼠，但仍低于未注射病毒对照小鼠。相反口服scAAV2-CAM-AUO和scAAV8-CAM-AUO病毒组高尿酸血症模型小鼠的尿液中尿酸含量则先下降后升高，直至同未口服病毒对照组无明显差异。结果提示4种病毒经口服至高尿酸血症模型小鼠后，均能够有效地降低尿液中尿酸含量，但口服scAAV2-CAM-AUO-142T或scAAV8-CAM-AUO-142T病毒组持续作用时间更长，效果更加明显。

与此同时，我们还在口服病毒后不同的时间点，眼眶采血，分离血清，采用尿酸氧化酶检测试剂盒Amplex Red Uric Acid/Uricase Assay Kit (Life technologies)测定血清中尿酸氧化酶含量，操作过程参见试剂盒说明书。从图13的结果可以看到，相比于未口服病毒的对照组高尿酸血症模型小鼠，口服scAAV2-CAM-AUO-142T或scAAV8-CAM-AUO-142T病毒组高尿酸血症模型小鼠血清中尿酸氧化酶含量随时间逐渐升高，然后不再随时间变化而变化。相反口服scAAV2-CAM-AUO或scAAV8-CAM-AUO病毒组高尿酸血症模型小鼠血清中尿酸氧化酶含量则出现先升高，后下降，直至检测不到尿酸氧化酶的表达，同未口服病毒组一样。结果提示4种病毒经口服至高尿酸血症模型小鼠后，均能够有效地表达产生尿酸氧化酶，但scAAV2-CAM-AUO-142T和scAAV8-CAM-AUO-142T病毒表达尿酸氧化酶的持续时间更长，而scAAV2-CAM-AUO和scAAV8-CAM-AUO病毒则表达时间较短。四种病毒在高尿酸血症小鼠体内尿酸氧化酶表达规律的差异有效地解释了口服不同病毒后小鼠血清和尿液中的尿酸含量变化。

总之，4种病毒口服至高尿酸血症模型小鼠后，均能够有效地表达产生尿酸氧化酶，降低小鼠血清和尿液中的尿酸含量，缓解高尿酸血症带来的症状。而且携带miR-142-3p靶序列病毒（scAAV8-CAM-AUO-142T和scAAV9-CAM-AUO-142T）能够在小鼠体内持续高效地表达产生尿酸氧化酶，长时间地降低血清和尿液中的尿酸含量，进而缓解高尿酸血症带来的危害，具有开发成为高尿酸血症治疗药物的潜力。

相比于静脉注射和肌肉注射给药，我们对高尿酸血症模型小鼠口服重组病毒后，高尿酸血症模型小鼠的尿酸氧化酶表达水平更低，对血液和尿液中（即体内）尿酸的降低作用更弱，这可能与口服感染的组织更少，对肠道以外的组织转导效率较弱相关。但口服给药仍然能够将高尿酸血症小鼠模型中的尿酸浓度控制到较低的水平，表现出明显的治疗作用，提示口服给药也可以作用一种候选的给药方式，用于高尿酸血症疾病的治疗。

SEQ ID

No.1

MARPLCTLLLLMATLAGALA

No.2

MAHYRNDYKKNDEVEFVRTGYGKDMIKVLHIQRDGKYHSIKEVATSVQLTLSSKKDYLHGDNSDVIPTDTIKNTVNVLAKFKGIKSIETFAVTICEHFLSSFKHVIRAQVYVEEVPWKRFEKNGVKHVHAFIYTPTGTHFCEVEQIRNGPPVIHSGIKDLKVLKTTQSGFEGFIKDQFTTLPEVKDRCFATQVYCKWRYHQGRDVDFEATWDTVRSIVLQKFAGPYDKGEYSPSVQKTLYDIQVLTLGQVPE

No.3

IEDMEISLPNIHYFNIDMSKMGLINKEEVLLPLDNPYGKITGTVKRKLSSRL

No.4

MARPLCTLLLLMATLAGALAMAHYRNDYKKNDEVEFVRTGYGKDMIKVLHIQRDGKYHSIKEVATSVQLTLSSKKDYLHGDNSDVIPTDTIKNTVNVLAKFKGIKSIETFAVTICEHFLSSFKHVIRAQVYVEEVPWKRFEKNGVKHVHAFIYTPTGTHFCEVEQIRNGPPVIHSGIKDLKVLKTTQSGFEGFIKDQFTTLPEVKDRCFATQVYCKWRYHQGRDVDFEATWDTVRSIVLQKFAGPYDKGEYSPSVQKTLYDIQVLTLGQVPEIEDMEISLPNIHYFNIDMSKMGLINKEEVLLPLDNPYGKITGTVKRKLSSRL

No.5

5'-ATGGCCAGGCCTCTGTGCACACTGCTGCTGCTGATGGCCACCCTGGCAGGCGCCCTGGCAATGGCCCACTACAGGAACGACTATAAGAAGAATGATGAGGTGGAGTTCGTGCGCACAGGCTACGGCAAGGACATGATCAAGGTGCTGCACATCCAGCGCGATGGCAAGTATCACTCTATCAAGGAGGTGGCCACAAGCGTGCAGCTGACCCTGAGCTCCAAGAAGGACTACCTGCACGGCGACAACTCTGATGTGATCCCAACCGATACAATCAAGAACACCGTGAATGTGCTGGCCAAGTTCAAGGGCATCAAGTCCATCGAGACATTTGCCGTGACCATCTGCGAGCACTTCCTGTCTAGCTTTAAGCACGTGATCAGGGCACAGGTGTACGTGGAGGAGGTGCCATGGAAGAGATTTGAGAAGAACGGCGTGAAGCACGTGCACGCCTTCATCTATACCCCCACAGGCACCCACTTTTGTGAGGTGGAGCAGATCCGGAATGGCCCCCCTGTGATCCACAGCGGCATCAAGGACCTGAAGGTGCTGAAGACCACACAGTCCGGCTTCGAGGGCTTTATCAAGGACCAGTTCACCACACTGCCCGAGGTGAAGGATCGGTGCTTTGCCACCCAGGTGTACTGTAAGTGGCGGTATCACCAGGGCAGAGACGTGGATTTCGAGGCCACATGGGATACCGTGAGAAGCATCGTGCTGCAGAAGTTTGCCGGCCCTTACGACAAGGGCGAGTATAGCCCATCCGTGCAGAAGACACTGTATGATATCCAGGTGCTGACCCTGGGACAGGTGCCCGAGATCGAGGACATGGAGATCAGCCTGCCTAACATCCACTACTTCAATATCGATATGTCTAAGATGGGCCTGATCAACAAGGAGGAGGTGCTGCTGCCACTGGACAATCCCTATGGCAAGATCACAGGCACCGTGAAGAGGAAGCTGTCCTCTCGCCTGTGA-3'

No.6

5'-ATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGACGCGTGTAAGTTGGCGCCGTTTAAGGGATGGTTGGTTGGTGGGGTATTAATGTTTAATTACCTTTTTTACAG-3'

No.7

5'-TCCATAAAGTAGGAAACACTACGATCTCCATAAAGTAGGAAACACTACAGTATCTCCATAAAGTAGGAAACACTACGCTATCCATAAAGTAGGAAACACTAC-3'

No.8

5'-CCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGACAGATCCC-3'

NO.9

5'-ATGGCCAGGCCTCTGTGCACACTGCTGCTGCTGATGGCCACCCTGGCAGGCGCCCTGGCAATGGCCCACTACAGGAACGACTATAAGAAGAATGATGAGGTGGAGTTCGTGCGCACAGGCTACGGCAAGGACATGATCAAGGTGCTGCACATCCAGCGCGATGGCAAGTATCACTCTATCAAGGAGGTGGCCACAAGCGTGCAGCTGACCCTGAGCTCCAAGAAGGACTACCTGCACGGCGACAACTCTGATGTGATCCCAACCGATACAATCAAGAACACCGTGAATGTGCTGGCCAAGTTCAAGGGCATCAAGTCCATCGAGACATTTGCCGTGACCATCTGCGAGCACTTCCTGTCTAGCTTTAAGCACGTGATCAGGGCACAGGTGTACGTGGAGGAGGTGCCATGGAAGAGATTTGAGAAGAACGGCGTGAAGCACGTGCACGCCTTCATCTATACCCCCACAGGCACCCACTTTTGTGAGGTGGAGCAGATCCGGAATGGCCCCCCTGTGATCCACAGCGGCATCAAGGACCTGAAGGTGCTGAAGACCACACAGTCCGGCTTCGAGGGCTTTATCAAGGACCAGTTCACCACACTGCCCGAGGTGAAGGATCGGTGCTTTGCCACCCAGGTGTACTGTAAGTGGCGGTATCACCAGGGCAGAGACGTGGATTTCGAGGCCACATGGGATACCGTGAGAAGCATCGTGCTGCAGAAGTTTGCCGGCCCTTACGACAAGGGCGAGTATAGCCCATCCGTGCAGAAGACACTGTATGATATCCAGGTGCTGACCCTGGGACAGGTGCCCGAGATCGAGGACATGGAGATCAGCCTGCCTAACATCCACTACTTCAATATCGATATGTCTAAGATGGGCCTGATCAACAAGGAGGAGGTGCTGCTGCCACTGGACAATCCCTATGGCAAGATCACAGGCACCGTGAAGAGGAAGCTGTCCTCTCGCCTGTGATAAGAATTCTCCATAAAGTAGGAAACACTACGATCTCCATAAAGTAGGAAACACTACAGTATCTCCATAAAGTAGGAAACACTACGCTATCCATAAAGTAGGAAACACTAC-3'

No.10

5'-CCCATAAGGTCATGTACTGGGCAT-3'

No.11

5'-GTTCCCATAGTAACGCCAATAGGG-3'

Claims (6)

1.一种尿酸氧化酶酶基因表达框，其特征在于，

（Ⅰ）表达产生氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的蛋白；

（Ⅱ）包含SEQ ID No.6和SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；或包含SEQ ID No.6和SEQID No.9所示的核苷酸序列；

（Ⅲ）表达框表达产物能够分泌至细胞外，将尿酸转化为尿囊素。

2.一种重组腺相关病毒载体，其特征在于携带如权利要求1所述的基因表达框。

3.权利要求2所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，包括：

（Ⅰ）携带基因组可自我互补形成双链DNA分子；和/或

（Ⅱ）重组腺相关病毒载体血清型包括AAV1、AAV2、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.10，其中优选的血清型为AAV1、AAV2、AAV8和AAV9。

4.一种基因药物，其特征在于，包括权利要求1所述的基因表达框和权利要求2、3所述的重组腺相关病毒载体。

5.权利要求4所述的基因药物，其特征在于，给药方式为静脉注射和/或肌肉注射和/或口服。

6.权利要求4所述的基因药物，其特征在于，一次给药可持续表达产生尿酸氧化酶，降低体内的尿酸浓度，缓解因体内尿酸过高带来的不良影响。