CN102260653A - 一种peg化重组猪-人尿酸氧化酶融合蛋白的制备及应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了PEG化重组猪-人尿酸氧化酶融合蛋白的制备方法，用PEG化重组猪-人尿酸氧化酶制备注射液和冻干粉针剂的方法，及其降低血尿酸含量的应用。本发明还提供了重组猪-人尿酸氧化酶的核苷酸序列，包含核苷酸序列的载体，及包含该载体的宿主细胞。本发明提供的PEG化重组猪-人尿酸氧化酶融合蛋白基本上无免疫原性，且基本保持尿酸氧化酶PEG化之前的活性，具有较好的降低血液中尿酸含量的治疗效果。

Description

一种PEG化重组猪-人尿酸氧化酶融合蛋白的制备及应用方法

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种PEG化重组猪-人尿酸氧化酶融合蛋白的制备及其应用方法。 

背景技术

尿酸酶又称尿酸氧化酶(Uricase，Urate Oxidase，EC 1.7.3.3，UO)，能催化尿酸氧化生成尿囊素、CO₂和H₂O₂。大多数脊椎动物的肝脏、肾脏等组织中均发现有此酶的存在，但人类及一些灵长类动物由于基因突变失去合成有活性尿酸氧化酶的能力[1]。 

尿酸是人体内嘌呤分解代谢的最终产物，由肾脏排泄，随尿液排出体外。尿酸在体内主要以钠盐形式存在，自由形式的尿酸极其钠盐在水中溶解度很低。如果体内嘌呤代谢紊乱产生过量尿酸，或尿酸排泄受阻，都能使血液中尿酸浓度升高，从而引起高尿酸血症和痛风等疾病。恶性血液疾病和肿瘤化疗也会导致血液尿酸浓度升高。 

高尿酸血症和痛风不仅能引起关节肿胀，还可诱发和加重脂类代谢紊乱、糖尿病，增加心脑血管疾病、代谢紊乱综合症及肾脏疾病病人的死亡率。近些年来，随着我国人民生活方式和饮食结构的变化，痛风病患病者迅速增加，并呈现年轻化的趋势。患病率高达约4％，接近欧美等发达国家水平，已成为严重威胁我国人民健康的常见病、多发病。 

目前，对于痛风病的治疗，一般使用促进尿酸排泄或抑制尿酸合成的药物。排尿酸药有丙磺舒类药物，通过抑制肾小管对尿酸重吸收，增加其排泄。抑制尿酸合成的主要药物是别嘌呤醇。它是黄嘌呤氧化酶的竞争性抑制剂，能抑制 黄嘌呤氧化成尿酸，使得尿酸合成减少。但它可造成尿酸的前体物黄嘌呤浓度升高。而黄嘌呤的水溶性比尿酸更低，有些病人会发生黄嘌呤肾损伤和沉积。别嘌呤醇和丙磺舒类药物都有明显肝肾毒性，且疗效都不够理想[2]。 

尿酸氧化酶是治疗常规疗法无效的痛风病患者的理想药物。人体内尿酸氧化酶基因中存在2处致死性突变，它们分别位于尿酸氧化酶氨基酸序列的第33位和第187位氨基酸残基，由精氨酸残基变为终止密码(CGA→TGA)。为了得到一种适于人类使用的尿酸氧化酶制剂，本发明使用一段与人类基因比较相似且有较好活力的猪尿酸氧化酶的基因取代人类基因中的无功能部分，制备出猪-人尿酸氧化酶嵌合基因，使用该基因生产制备可用于临床的猪-人尿酸氧化酶融合蛋白。 

临床观察显示，如果蛋白类药物多次给药，其药效往往难以维持。其原因是蛋白质本身就是天然抗原，注射到体内后会刺激机体产生抗体，通过抗原抗体反应影响后期的治疗效果，严重时还会引起过敏反应。解决这一问题的有效途径之一就是对蛋白质进行聚乙二醇化(PEG化)修饰，以达到降低免疫原性，延长循环半衰期的目的。PEG是一种不带电荷的线性亲水分子，它可以与蛋白质的非必需基团共价结合形成空间构象上的屏障，避免外源蛋白的抗原决定簇诱导产生抗体。由于酶的底物多是小分子物质，可以穿过PEG屏障与活性部位结合，因此PEG化不会显著降低酶的活性。本发明涉及一种方法，能最大限度的屏蔽猪-人尿酸氧化酶的抗原性，并能很好的保存其酶活力，也有很高的生物安全性。 

发明内容

本发明的目的是提供PEG化重组猪-人尿酸氧化酶融合蛋白的制备方法，和用PEG化重组猪-人尿酸氧化酶制备注射液和冻干粉针剂的方法，以及该注射液或 粉针剂在降低血尿酸含量中的应用。 

本发明还提供重组猪-人尿酸氧化酶的核苷酸序列，包含该核苷酸序列的载体，及包含该载体的宿主细胞。 

本发明的技术方案： 

一种PEG化的重组猪-人尿酸氧化酶，其特征在于该结合物包括重组猪-人尿酸氧化酶和PEG的共价连接物，二者通过氨基甲酸酯键形式共价连接；所述的重组猪-人尿酸氧化酶可以为四聚体；每个重组猪-人尿酸氧化酶亚基上共价连接8-12个PEG链，比较优选为9-11个PEG链，更优选为9-10个PEG链；所述的PEG可以为线形或分枝形，PEG的分子量可以为2-50KD，比较优选为5-20KD，更优选为10KD；所述的重组猪-人尿酸氧化酶的核苷酸序列可以是序列表1中的序列，其氨基酸序列可以是序列表2中的序列。 

一种降低血浆尿酸含量的组合物，其特征在于包括所述的重组猪-人尿酸氧化酶与PEG的结合物和药学上可接受的载体。该组合物的给药途径包括肌肉注射，静脉注射，痛风红肿部位或痛风石所在部位局部注射等；该组合物可以以注射液或冻干粉针等制剂形式存在。 

所述的PEG化重组猪-人尿酸氧化酶以及包含该结合物的药物组合物可以在制备用于降低血浆尿酸含量的药物中应用，可用于临床上高尿酸血症的治疗和痛风病的全身和局部治疗。 

一种编码重组猪-人尿酸氧化酶蛋白的核酸分子，其核苷酸序列可以为序列表1中的序列；一种含有编码所述的重组猪-人尿酸氧化酶蛋白的质粒载体及含有该载体的宿主细胞；该载体可以为质粒载体，宿主细胞可以为大肠杆菌。 

下面对本发明做详细描述： 

本发明提供的重组猪-人尿酸氧化酶融合蛋白，尤其是PEG与重组猪-人尿酸氧化酶的结合物，基本上无免疫原性，且基本保持尿酸氧化酶活性，优选的可保留85％的酶活性，比较优选的可保留90％的酶活性，更优选的可保留95％，甚至为98％以上的酶活性。 

本发明提供的重组猪-人尿酸氧化酶是融合蛋白，自N端起第1-222个氨基酸残基由猪尿酸氧化酶基因序列编码，第223-305个氨基酸序列由人尿酸氧化酶基因编码。该融合蛋白的氨基酸全长序列见序列表2。N端优选为猪核苷酸序列N端的X-222核苷酸序列，其中X为1-10，比较优选的X为2-9，进一步优选的X为3-8，更进一步优选的X为4-7，最优选的X为7。本发明现用的猪尿酸氧化酶基因序列中，有3个部位与国外报道猪尿酸氧化酶序列有差异。它们分别是第111bp处由T变为C，第456bp处由C变为T，第669bp处由T变为G。本发明的猪尿酸氧化酶基因序列为附表3的序列。但其编码的氨基酸序列没有变化。融合蛋白第223-305个氨基酸序列由人尿酸氧化酶基因编码。人尿酸氧化酶全长序列见附表4。优选部分人尿酸氧化酶核苷酸序列为人尿酸氧化酶核苷酸序列的第223-305氨基酸残基的编码基因序列。为了方便基因操作，在重组猪-人尿酸氧化酶基因的5’端加上ACC使之能用限制性核酸内切酶Nco I切下基因片段；在3’端加上限制性核酸内切酶Xho I的序列ctc gag。 

猪-人重组尿酸氧化酶基因可采用全基因人工合成的方法，或采用RT-PCR的方法分别从猪和人的肝组织中克隆。如果人的新鲜肝组织不易获得也可用RT-PCR的方法克隆猪的尿酸氧化酶基因的N端序列，而用人工合成的方法获得人的尿酸氧化酶基因的C端序列。将N端序列和C端序列连接成重组猪-人尿酸氧化酶嵌合基因。将重组序列插入T载体中，转化大肠杆菌DH5α。从克隆质粒载体上获取重组基因插入到pET28a质粒载体中，构建成表达质粒，并转化大肠 杆菌BL21，得到表达工程菌E.coli BL21/pET28a-PHUO。 

用发酵培养的方法生产表达工程菌，待OD值达1.4左右时加入诱导剂α-乳糖至工作浓度为5-6mmol/L。诱导培养5小时。收菌后用超声波破碎或用高压均质机破碎至98％以上菌体破碎。分别用离子交换柱(DEAE Sepharose Fast Flow)，疏水柱(Phoenyl Sepharose 6 Fast Flow)，凝胶过滤柱(Sephacryl S 300HR)进行表达产物纯化。 

本申请所述的重组猪-人尿酸氧化酶可以为四聚体。四聚体表面的Lys侧链的游离氨基与mPEG-SC分子中带活性基团的PEG链进行偶联反应。本发明所述的每个重组猪-人尿酸氧化酶亚基上共价连接平均为8-12个PEG链，比较优选的为9-11个PEG链，更优选的为9-10个PEG链；所述的PEG可以为线形或分枝形，PEG的分子量可以为2-50KD，比较优选为5-20KD，更优选为10KD。每个猪-人尿酸氧化酶融合蛋白的亚基含有28个游离赖氨酸残基，加上末端氨基酸共有29个游离氨基。修饰12个赖氨酸残基以下其酶活性没有明显降低。 

本发明还包括一种降低尿酸含量的组合物，其特征在于包括以上所述的PEG化重组猪-人尿酸氧化酶和药学上可接受的载体。所述的药学上可接受的载体包括药学领域常规的稀释剂，赋形剂等。非肠道给药制剂包括注射剂等，也包括冻干粉针制剂。本发明比较优选剂型为注射剂，最优选为的冻干粉针制剂，其中冻干粉针制剂可以通过注射用水或者特定的溶液复溶，能保持原结合物的活性；优选的给药途径包括肌肉注射，静脉注射和痛风红肿部位局部注射等。上述各种剂型均可以按照药学领域的常规方法制备。 

根据动物实验结果，本发明的结合物适合在血尿酸含量高于正常值50％以上时使用，剂量一般控制在2-8单位/公斤体重。在血尿酸含量低于正常值后停止使用。二次给药的间隔时间在7天以上。每个治疗周期给药2-3次。 

本发明提供一种编码所述的重组猪-人尿酸氧化酶蛋白的核酸分子，其核苷酸序列可以为序列表1中的序列。 

一种含有编码所述的重组猪-人尿酸氧化酶蛋白的DNA分子载体，包括克隆载体和表达载体，优选载体为质粒载体，其中优选的克隆载体为pMD 18-T，优选的表达载体为pET28a。 

本发明提供一种包含这些载体的宿主细胞，包括细菌，真菌，植物细胞，动物细胞等，优选为大肠杆菌。 

本发明提供表达重组猪-人尿酸氧化酶的核酸分子的制备方法，所述方法包括根据核酸序列进行全基因人工合成方案，RT-PCR扩增方案和RT-PCR扩增猪尿酸氧化酶基因加人工合成人尿酸氧化酶基因部分片段三种方案。 

本发明提供扩增重组猪-人尿酸氧化酶的核酸分子的方法，所述方法包括PCR扩增方法。可采用常规的PCR扩增方法，包括根据该核酸分子的序列设计合成引物。在适量的靶核酸分子以及过量的核苷酸和聚合酶存在下，加入适量引物，通过将靶核酸分子反复变性，与引物退火以及与引物延伸至子链的多个循环，从而将靶核酸分子指数扩增。将扩增后的产物通过电泳回收，连接到载体上，再导入宿主细胞中。将扩增产物连接到质粒载体上，按照常规的转化方法将该质粒载体导入大肠杆菌DH5α或BL21中。挑选包含重组猪-人尿酸氧化酶的核苷酸序列的转化子，低温冷冻保存。 

本发明提供重组猪-人尿酸氧化酶融合蛋白的制备方法。所述方法包括用含有该蛋白的核酸序列的载体转化或转染宿主细胞，根据宿主细胞和表达载体的特性，选择合适的诱导表达条件，诱导基因高效表达该蛋白。所述方法包括采用本领域内常规提取纯化蛋白的方法提取纯化该蛋白。优选采用色谱技术纯化蛋白。本发明提供独特的重组猪-人尿酸氧化酶的沉淀方法。 

本发明提供制备PEG化重组猪-人尿酸氧化酶结合物的方法。将纯化重组猪-人尿酸氧化酶用北京凯正生物工程发展有限责任公司生产的活化PEG产品(mPEG-SC，分子量：10K)进行修饰。待重组猪-人尿酸氧化酶与PEG连接完成后用凝胶过滤层析方法或者超滤的方法，将PEG化重组猪-人尿酸氧化酶与其它小分子物质分离。 

本发明提供PEG化重组猪-人尿酸氧化酶注射剂和冻干粉针剂的制备方法。将纯化后的PEG化重组猪-人尿酸氧化酶用药物学上常规的蛋白类药物制剂的制备方法，制备成注射剂和冻干粉针剂。 

附图说明

图1纯化蛋白SDS-PAGE图 

图1：1、2、3、4、泳道为纯化蛋白的4个取样管分别命名为①②③④，上样的蛋白量为10μg；第5泳道为蛋白Marker；第6、7、8泳道，为③号取样管纯化蛋白，上样量分别为10μg、20μg、30μg。 

图2纯化猪-人尿酸氧化酶高效液相色谱纯度检测 

具体实施例

以下提供具体的实施例来阐述本发明，但不应被认作是限制本发明。 

实施例1、含有重组猪-人尿酸氧化酶核酸分子的克隆载体的构建 

方案一全基因合成方案 

按下述序列进行猪-人尿酸氧化酶嵌合基因的全基因合成： 

序列基本组成是N端1-222个氨基酸残基的基因序列是猪尿酸氧化酶基因序列。将N端2-6个氨基酸的基因序列删除，在基因序列的5’端加上ACC使之能用限制性核酸内切酶Nco I切下基因片段并回收。序列的第223-305氨基酸残基的编码基因序列是人尿酸氧化酶基因序列，末端加上限制性核酸内切酶Xho I的序列ctc gag，以便于基因操作。 

核酸序列为： 

1                      ACC ATG GAC TAC AAA AAG AAT GAT GAG GTA GAG TTT 

49     GTC CGA ACT GGC TAT GGG AAG GAT ATG ATA AAA GTT CTC CAT ATT CAG 

97     CGA GAT GGA AAA TAT CAC AGC ATT AAA GAG GTG GCA ACT TCA GTG CAA 

145    CTG ACT TTG AGC TCC AAA AAA GAT TAC CTG CAT GGA GAC AAT TCA GAT 

193    GTC ATC CCT ACA GAC ACC ATC AAG AAC ACA GTT AAT GTC CTG GCG AAG 

241    TTC AAC GGC ATC AAA AGC ATA GAA ACT TTT GCT GTG ACT ATC TGT GAG 

289    CAT TTC CTT TCT TCC TTC AAG CAT GTC ATC AGA GCT CAA GTC TAT GTG 

337    GAA GAA GTT CCT TGG AAG CGT TTT GAA AAG AAT GGA GTT AAG CAT GTC 

385    CAT GCA TTT ATT TAT ACT CCT ACT GGA ACG CAC TTC TGT GAG GTT GAA 

433    CAG ATA AGG AAT GGA CCT CCA GTT ATT CAT TCT GGA ATC AAA GAC CTA 

481    AAA GTC TTG AAA ACA ACC CAG TCT GGC TTT GAA GGA TTC ATC AAG GAC 

529    CAG TTC ACC ACC CTC CCT GAG GTG AAG GAC CGG TGC TTT GCC ACC CAA 

577    GTG TAC TGC AAA TGG CGC TAC CAC CAG GGC AGA GAT GTG GAC TTT GAG 

625    GCC ACC TGG GAC ACT GTT AGG AGC ATT GTC CTG CAG AAA TTT GCT GGG 

673    CCC TAT GAC AAA GGT GAA TAC TTG ACC TCT GTG CAG AAG ACC CTC TGT 

721    GAT ATC CAG GTG CTC TCC CTG AGC CGA GTT CCT GCG ATA GAA GAT ATG 

769    GAA ATC AGC CTG CCA AAC ATT CAC TAC TTC AAC ATA GAC ATG TCC AAA 

817    ATG GGT CTG ATC AAC AAG GAA GAG GTA TTG CTG CCA TTA GAC AAT CCA 

865    TAT GGA AAA ATT ACT GGT ACA GTC AAG AGG AAG TTG TCT TCA AGA CTG 

913    TGA CTC GAG 

2、PCR引物合成 

22-mer，UPPER PRIMER： 

5’ACC ATG GAC TAC AAA AAG AAT G 3’ 

5’端加限制性核酸内切酶Nco I酶切位点。 

22-mer，LOWER PRIMER： 

5’CTC GAG TCA CAG TCT TGA AGA C 3’ 

5’端加限制性核酸内切酶Xho I酶切位点。 

3、PCR扩增猪-人尿酸氧化酶嵌合基因 

4、将扩增产物连接到pMD18-T载体上，提取质粒DNA。 

方案二RT-PCR扩增方案 

1、取新鲜猪肝组织进行总RNA提取，合成引物，序列为： 

上游引物： 

5’ACC ATG GAC TAC AAA AAG AAT G 3’ 

下游引物： 

5’AAA TTT CTG CAG GAC AAT GCT CC 3’ 

以总RNA为模板，用RT-PCR的方法扩增猪尿酸氧化酶基因的N端序列。连接到T载体上。转化大肠杆菌DH5α，提取质粒DNA，用限制性核酸内切酶Nco I+Dra I回收目的基因。 

2、在人肝脏手术的过程中获取少许人肝组织，进行总RNA提取，合成引物，序 列为： 

上游引物： 

5’AAA TTT GCT GGG CCC TAT GAC AAA GG 3’ 

下游引物： 

5’CTC GAG TCA CAG TCT TGA AGA CAA C 3’ 

以总RNA为模板，用RT-PCR的方法扩增人尿酸氧化酶基因的C端序列。连接到T载体上。转化大肠杆菌DH5α，提取质粒DNA，用限制性核酸内切酶Dra I+Xho I回收目的基因。 

将N端DNA片段和C端DNA片段用连接酶进行连接。然后用下列引物扩增连接产物。 

上游引物： 

5’ACC ATG GAC TAC AAA AAG AAT G 3’ 

下游引物： 

5’CTC GAG TCA CAG TCT TGA AGA CAA C 3’ 

将扩增产物连接到T载体上。 

方案三RT-PCR扩增+基因合成 

1、取新鲜猪肝组织进行总RNA提取，合成引物，序列为： 

上游引物： 

5’ACC ATG GAC TAC AAA AAG AAT G 3’ 

下游引物： 

5’AAA TTT CTG CAG GAC AAT GCT CC 3’ 

以总RNA为模板，用RT-PCR的方法扩增猪尿酸氧化酶基因的N端序列。连 接到T载体上。转化大肠杆菌DH5α，提取质粒DNA，用限制性核酸内切酶Nco I+Dra I回收目的基因。 

2、按下面序列进行人尿酸氧化酶基因C端序列的合成。 

AAA TTT GCT GGG CCC TAT GAC AAA GGT GAA TAC TTG ACC TCT GTG CAG 

AAG ACC CTC TGT GAT ATC CAG GTG CTC TCC CTG AGC CGA GTT CCT GCG 

ATA GAA GAT ATG GAA ATC AGC CTG CCA AAC ATT CAC TAC TTC AAC ATA 

GAC ATG TCC AAA ATG GGT CTG ATC AAC AAG GAA GAG GTA TTG CTG CCA 

TTA GAC AAT CCA TAT GGA AAA ATT ACT GGT ACA GTC AAG AGG AAG TTG 

TCT TCA AGA CTG TGA CTC GAG 

PCR扩增人尿酸氧化酶基因C端序列。引物序列如下： 

上游引物： 

5’AAA TTT GCT GGG CCC TAT GAC AAA GG 3’ 

下游引物： 

5’CTC GAG TCA CAG TCT TGA AGA CAA C 3’ 

连接到T载体上。转化大肠杆菌DH5α，提取质粒DNA，用限制性核酸内切酶Dra I+Xho I回收目的基因。 

将N端DNA片段和C端DNA片段用连接酶进行连接。然后用下列引物扩增连接产物。 

上游引物： 

5’ACC ATG GAC TAC AAA AAG AAT G 3’ 

下游引物： 

5’CTC GAG TCA CAG TCT TGA AGA CAA C 3’ 

将扩增产物连接到T载体上。 

实施例2、含有重组猪-人尿酸氧化酶核酸分子的表达载体的构建 

选用表达载体质粒pET28a，表达宿主细胞为Escherichia coli BL21。构建过程如下： 

1)pET28a及pMD PHUO(pig-human urate oxidase)的双酶切，及酶切产物电泳，及回收片段： 

Nco I/Xho I双酶切pET28a，Nco I/Xho I双酶切pMD PHUO，双酶切产物进行凝胶电泳。回收带Nco I/Xho I切点的pET28a片段及带Nco I/Xho I切点的重组尿酸氧化酶嵌合基因片段。 

2)带Nco I/Xho I切点的pET28a片段及重组尿酸氧化酶嵌合基因片段的连接。 

3)连接产物的转化：用连接产物转化大肠杆菌BL21。转化菌命名为：Escherichia coli BL21/pET28a-PHUO(pig-human urate oxidase)。 

4)通过DNA测序，挑选含有重组猪-人尿酸氧化酶嵌合基因的宿主细胞，冷冻保存，并交由中国典型培养物保藏中心保藏。 

实施例3、重组猪-人尿酸氧化酶蛋白的诱导表达 

1.摇瓶小量培养 

挑取大肠杆菌BL21/pET28a-PHUO菌单菌落，接种于10ml的LB+Kan培养液中，培养过夜。取饱和菌液1ml于250mlLB+Kan培养液中，37℃振荡培养2.5h，至OD₆₀₀＝1.4～1.5，加入适量诱导剂α-乳糖。37℃再培养5h，离心收菌。对诱导剂乳糖的加入量进行多次优化，确定摇床发酵时乳糖浓度为1-10mmol/L，优选乳糖浓度为5-6mmol/L。1L培养液可得到5克左右湿菌，每克湿菌获得400U粗酶。蛋白电泳结果显示，目的蛋白约占菌体可溶蛋白总量的30％以上。 

2.150L发酵罐放大培养 

在小量培养的基础上，对培养基营养成分、发酵等参数进行优化。优选采用的培养基为改良后的LB配方，内含葡萄糖以及多种无机盐，α-乳糖为诱导剂，发酵时不加抗生素。每升可收湿菌50g，每克湿菌获得200U粗酶。发酵过程中应确保在加诱导剂之前培养基中的葡萄糖已完全耗尽。 

实施例4、重组猪-人尿酸氧化酶蛋白的分离纯化 

优选的纯化工艺流程如下： 

1.从菌体中提取粗酶 

取出培养液后离心收集菌体，用pH 6.8，0.02M磷酸缓冲液冲洗菌体。按1克湿菌加10ml的pH 6.8，0.1M磷酸缓冲液重悬。超声波细胞破碎器处理破碎细菌。置于高速冷冻离心机中，收集沉淀。向沉淀中加入原体积的pH 10.53，0.1M碳酸缓冲液，充分溶解沉淀后，离心，分离上清即为粗酶。 

2.将粗酶用离子交换柱DEAE Sepharose Fast Flow进行纯化。 

用pH 10.53，0.1M碳酸缓冲液做A液，用加含有0.5M氯化钠的pH 10.53，0.1M碳酸缓冲液做B液，进行梯度洗脱，分段收集，蛋白电泳分析，回收纯度较高的洗脱蛋白液，用于进一步纯化。 

3.用疏水柱Phoenyl Sepharose 6 Fast Flow(high.sub)进行纯化 

含有1.2M氯化钠的pH 10.53，0.1M碳酸缓冲液做A液，纯水做B液，梯度洗脱，分段收集蛋白峰。测定收集液的尿酸氧化酶活性，并进行蛋白电泳分析，回收纯度较高的洗脱液，用于进一步纯化。 

4.用3M乙酸加入疏水柱回收的酶液中，调节pH至6.8，置20000rpm下离心20分钟，收集沉淀。 

5.将上述沉淀物用适量体积pH 10.53，0.1M碳酸缓冲液充分溶解，尽量减少酶液体积。过滤后用Sephacryl S-300HR进行分子筛层析。收集含尿酸氧化酶的蛋白主峰。 

6.纯化蛋白的SDS-PAGE检测，结果见附图1。由图可见主带为单亚基猪-人尿酸氧化酶，分子量约为33KD，较大的蛋白带为猪-人尿酸氧化酶的未完全解聚的二聚体，分子量约为66KD。纯化蛋白的高效液相检测结果见附图2。 

7.使用SE-HPLC-多角度激光散射仪-示差折射仪，测定纯化未修饰猪-人尿酸氧化酶相对分子量结果为：Molar Mass Moments(g/mol) 

Mn：1.313e+05(0.7％) 

Mw：1.313e+05(0.7％) 

Mz：1.314e+05(1.6％) 

由此结果可知，纯化后的未修饰猪-人尿酸氧化酶相对分子量为：131.3KD。因为纯化蛋白SDS-PAGE变性电泳结果显示，酶蛋白单亚基的分子量约为33KD，由此推断纯化后的猪-人尿酸氧化酶主要以四聚体形式存在。 

实施例5、PEG化重组猪-人尿酸氧化酶结合物的制备 

将纯化的以四聚体形式存在的重组猪-人尿酸氧化酶用0.1M pH10.53的碳酸缓冲液配成5-10mg/ml的溶液。计算加入北京凯正生物工程发展有限责任公司生产的活化PEG产品(mPEG-SC，分子量：10K)。计算方法：mPEG-SC-10K(mg)＝(13.5×待修饰纯化重组猪-人尿酸氧化酶mg)/3.3 

按计算量称取mPEG-SC-10K，先取总量的1/2缓慢加入到纯化酶液中，加入过程中不断搅拌酶液，避免局部浓度过高。加完后在15-25℃条件下继续搅拌30分钟。再取计算量的1/4，按同样的方法加入到酶液中，搅拌30分钟后将剩 余的mPEG-SC-10K加入到酶液中搅拌30分钟。 

PEG化尿酸氧化酶的纯化，将Sephacryl S-300HR柱用0.1M，pH7.4磷酸缓冲液平衡，然后将PEG化重组猪-人尿酸氧化酶上柱，用0.1M，pH7.4磷酸缓冲液洗脱，收集含酶的蛋白峰。 

亚基Lys修饰个数的测定方法： 

使用SE-HPLC-多角度激光散射仪-示差折射仪，测定未修饰猪-人尿酸氧化酶和PEG修饰后的猪-人尿酸氧化酶的相对分子量。然后计算有多少PEG分子与四聚体猪-人尿酸氧化酶表面分布的Lys-ε-NH2形成共价键。进而计算每个亚基酶分子表面结合有多少PEG分子。几种不同修饰方法修饰后的结果见表1。 

表1.SE-HPLC多角度激光散射仪-示差折射仪检测修饰效果 

各种修饰方式PEG化后的猪-人尿酸氧化酶仍然以四聚体形式存在。 

PEG化重组猪-人尿酸氧化酶在二种不同pH的碳酸缓冲液中均可溶，在pH7.4的磷酸缓冲液中也可溶。这对于酶制剂的纯化制备和临床应用均有很大的帮助。重组猪-人尿酸氧化酶嵌合蛋白和猪尿酸氧化酶在pH10.2以上的碳酸缓冲液中溶解。PEG化的重组猪-人尿酸氧化酶的溶解特性见表2.

表2.PEG化重组猪-人尿酸氧化酶的溶解特性 

以下实施例中所述PEG化重组猪-人尿酸氧化酶以四聚体形式存在。 

实施例6、PEG化重组猪-人尿酸氧化酶与未PEG化重组猪-人尿酸氧化酶的酶活性比较 

将PEG化重组猪-人尿酸氧化酶与未PEG化重组猪-人尿酸氧化酶分别进行活力测定和残余活力计算。具体方法如下： 

酶活性测定及活力单位的定义参照Koyama等的方法[3]，在25℃，取3mL pH 8.4硼酸缓冲液中溶解的120μmol/L尿酸溶液，于1cm石英比色杯中，加入适量待测尿酸氧化酶溶液。充分混匀后置UV-1601PC紫外分光光度计，准确反应5min，以硼酸缓冲液做空白极零点，在293nm处测定吸光值的减少量。活力单位定义为，该条件下1min内催化1μmol尿酸成尿囊素所需要的酶量。其计算公式为： 

$U/\mathrm{ml}=\frac{\mathrm{\ΔA}\×\mathrm{Vt}\×\mathrm{df}}{12.2\×\mathrm{Ve}}$

式中：U＝每mL尿酸氧化酶活力单位数；ΔA＝每分钟293nm波长下的光密度下降值；Vt＝反应液总体积(mL)；df＝稀释倍数；12.2为尿酸在293nm波长下的微摩尔消光系数；Ve＝酶液体积(mL)。 

修饰酶残余活力测定 

按前述酶测活性的方法分别测定PEG修饰后的酶活力和未修饰的酶活力，然后按下面公式计算其残余活力。 

使用几种不同比例的mPEG-SC 10KD对纯化重组猪-人尿酸氧化酶进行修饰后，测定修饰前后酶活性结果见表3。 

表3.不同修饰方法前后重组猪-人尿酸氧化酶活性 

注：PEG/尿酸氧化酶(摩尔比)为13.5时，修饰后酶活力超过修饰前，其原因有二。其一，该浓度的PEG未能破坏猪-人尿酸氧化酶四聚体的空间结构，其活性未受影响；其二，PEG化后增加了酶的溶解性。 

实施例7、PEG化重组猪-人尿酸氧化酶与未PEG化的重组猪-人尿酸氧化酶的免疫原性比较 

1.PEG化重组猪-人尿酸氧化酶豚鼠过敏性实验 

1.过敏试验 

1.1试验方法 

取体重250-300g健康豚鼠18只，随机分为3组(13.5×10K PEG-PHUO组、15×10K PEG-PHUO组、16.5×10K PEG-PHUO组)每组6只。分别隔日腹腔注射供试品溶液(0.5mg/ml)0.5mL/只进行致敏，共3次。在末次注射后第14日、21日静脉注射供试品溶液(0.5mg/ml)1mL/只进行激发，在静脉注射后立刻至30分钟，按2010版中国药典附录ⅫG中描述症状仔细观察每只豚鼠的反应症状、症状出现及消失时间，最长观察3小时。并按2010版中国药典附录ⅫG中标准评价是否产生过敏反应。 

1.2试验结果 

13.5×10K PEG-PHUO组、15×10K PEG-PHUO组静脉给药后30分钟内所有豚 鼠均未出现过敏反应，16.5×10K PEG-PHUO组给药后1分钟内4只豚鼠出现连续抓鼻、1只豚鼠连续咳嗽3声及干呕和四肢发软。结果见表4。 

表4注射用PEG化重组猪尿酸氧化酶注射液过敏试验结果(n＝6)

结果表明：在上述试验条件下，注射用PEG化重组猪尿酸氧化酶13.5×10K PEG-PHUO组、15×10K PEG-PHUO组未出现全身过敏反应，16.5×10K PEG-PHUO出现过敏反应，过敏反应发生率为66.7％。3个实验组均使用同样剂量的酶蛋白，但使用了不同量的PEG。13.5×10K PEG-PHUO组、15×10K PEG-PHUO组未出现全身过敏反应，说明修饰后的蛋白本身并未引起明显的过敏反应。而16.5×10K PEG-PHUO出现过敏反应，推断是由于大量的修饰用PEG引起的过敏反应。 

2.PEG化重组猪-人尿酸氧化酶治疗鸡血清抗体ELISA检测实验 

2.1鸡抗重组猪-人尿酸氧化酶抗体测定及结果判断方法 

ELISA检测鸡血清抗猪-人尿酸氧化酶抗体 

实验鸡40只，分为4组，每组10只。分别为13.5×10K PEG-猪-人尿酸氧化酶治疗组，15×10K PEG-猪-人尿酸氧化酶治疗组，未修饰猪-人尿酸氧化酶治疗组和空白对照组。 

取纯化重组猪-人尿酸氧化酶的碳酸溶液(0.1M，pH 10.2)，蛋白含量为1.2mg/ml，每微孔中加100ul，置4℃冰箱过夜。次日，用PBS-T洗板3次。每孔加入200微升含5％脱脂奶粉的pH 9.6的碳酸缓冲液，封闭过夜。次日空干后用PBS-T洗3次，置37℃1h干燥固定。用铝箔纸密封后置4℃冰箱保存。测定 时每孔加入100微升经PBS稀释(1∶400)后的鸡血清，并用PBS做对照。37℃温浴30分钟。空干后用PBS-T洗3次。每孔加入1∶500稀释的兔抗鸡HRP酶标二抗100微升，37℃温浴30分钟。空干后用PBS-T洗3次。每孔各加显色底物A和B各1滴，置暗处10分钟后加入终止液1滴。用酶标仪在450nm波长处读取光吸收值。每个样品做3份，结果取平均值。判断标准以待检血清吸光度值与空白对照血清吸光度值的比值(P/N)表示：P/N≥2.1为阳性，P/N＜1.5为阴性，1.5≤P/N≤2.1为可疑。 

2.2鸡抗猪-人尿酸氧化酶抗体的ELISA检测结果见表5。 

表5.鸡抗猪-人尿酸氧化酶抗体的ELISA检测结果(n＝10) 

结果表明：猪-人尿酸氧化酶裸酶治疗组从第14天P/N值开始上升，第21天P/N值超过可凝阳性的标准，第28天超过抗体阳性的标准，第35天进一步升高。而13.5×10K PEG-PHUO组和15.0×10K PEG-PHUO组P/N值均未达到可疑标准。 

实施例8、PEG化重组猪-人尿酸氧化酶与未PEG化重组猪-人尿酸氧化酶的小鼠急性毒性实验 

试验方法 

取小鼠，雌雄各半，先进行预试验，根据预试验结果，分组进行正式试验。 各组均按50ml/kg体积，不同浓度静脉给药，给药速度0.1ml/秒，给药后观察动物即时反应并连续观察7日。记录各组死亡小鼠数，用Bliss法计算LD₅₀。测不出LD₅₀则进行最大给药量试验。 

试验结果 

16.5×10K PEG-PHUC预试验以最大给药浓度、最大给药体积(2.2mg/ml、50ml/kg)给药后5只小鼠全部死亡，正式试验分4组进行LD₅₀试验，正式试验给药后部分动物呼吸加快、抽搐、活动减少，死亡动物给药后6-10秒内死亡，存活动物在给药后3-4分钟恢复正常；记录各组死亡小鼠数，Bliss法计算得：小鼠静脉给药16.5×10K PEG-PHUC LD₅₀为69.8mg/kg，95％的可信限为66.6～73.1mg/kg。结果见表6。 

表6 16.5×10K PEG-PHUO小鼠静脉给药半数致死量 

15×10K PEG-PHUC预试验以最大给药浓度、最大给药体积(2.2mg/ml、50ml/kg)给药后5只小鼠全部死亡，正式试验分4组进行LD₅₀试验，正式试验给药后部分动物呼吸加快、抽搐、小便失禁、活动减少，死亡动物给药后4-10秒内死亡，存活动物在给药后1-3分钟恢复正常；记录各组死亡小鼠数，Bliss法计算得：小鼠静脉给药15×10K PEG-PHUO LD₅₀为96.7mg/kg，95％的可信限为92.4～101.4mg/kg。结果见表7。 

表7.15×10K PEG-PHUO小鼠静脉给药半数致死量 

13.5×10K PEG-PHUC预试验以最大给药浓度、最大给药体积(2.2mg/ml、50ml/kg)给药后5只小鼠全部存活，无明显毒性反应。正式试验进行最大给药量试验，正式试验取20只动物，给药后部分动物活动减少，1-2分钟恢复正常，无其他毒性反应，无动物死亡。其最大给药量为111mg/kg。 

实施例9、PEG化重组猪-人尿酸氧化酶结合物的注射剂制备 

纯化PEG化重组猪-人尿酸氧化酶用pH7.4磷酸缓冲液体配制成1mg/ml酶溶液。除菌过滤后分装至西林瓶中，每瓶1ml，真空封口。2-8℃保存。 

实施例10、PEG化重组猪-人尿酸氧化酶结合物的冻干粉针剂 

纯化PEG化重组猪-人尿酸氧化酶用pH7.4磷酸缓冲液体配制成1mg/ml酶溶液，加甘露醇至终浓度3％，加甘氨酸至终浓度2％。除菌过滤后分装至西林瓶中，每瓶1ml。冷冻干燥，2-8℃保存。 

实施例11 PEG化重组猪-人尿酸氧化酶降低实验动物血尿酸水平的效果 

血清尿酸含量测定方法 

采用中生北控生物技术有限公司的血尿酸检测试剂盒(酶比色法)测定。测定方法是：取5ml 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.8)，加到含有尿酸氧化酶(≥ 600U/L)，过氧化物酶(≥1800U/L)，4-氨基安替吡啉(0.3mmol/L)和TOOS(1.4mmol/L)的试剂瓶中，轻轻摇动至完全溶解，即为工作液。然后按下表操作： 

表8.血清尿酸含量测定加液操作 

分别混合均匀，在37℃保温10min，用自动生化分析仪检测血样中尿酸浓度，在550nm下以空白管调零分别读取A_标准和A_样品。 

计算： 

PEG化重组猪-人尿酸氧化酶的冻干粉针剂的有效作用时间试验 

24只成年美国王鸽，体重在500-580克/只之间。随机分为3组，每组8只，分别为PEG修饰酶实验组(实验1组)、裸酶实验组(实验2组)和空白对照组。实验1组按1mg(6U)/kg(体重)静脉注射15×10K PEG-PHUO。实验前将酶制剂加10％葡萄糖注射液至5毫升。实验2组按1mg(6U)/kg(体重)静脉注射纯化后的重组猪-人尿酸氧化酶裸酶，实验前加10％葡萄糖注射液至5毫升。空白对照组静脉注射10％葡萄糖注射液5毫升。每次注射前和注射后1、6、24、72、120、168、216小时分别采取静脉血分离血清后测定血清尿酸含量。间隔14天注射一次，共注射三次。血浆尿酸含量测定结果见表9。 

表9.第一次注射后血浆尿酸含量检测结果 

注：*表示血浆尿酸含量与对照组相比有显著性差异。 

由表可见，修饰酶注射组在给药后1小时血浆尿酸含量显著降低，维持显著低于对照组尿酸水平7天。纯化裸酶注射组，注射后1小时，6小时血尿酸含量显著低于对照组，24小时反弹超过对照组水平。以后恢复到对照组水平。 

表10.第二次注射后血浆尿酸含量检测结果 

注：*表示血浆尿酸含量与对照组相比有显著性差异。 

第二次注射后，实验鸽血尿酸含量显著低于对照组，能维持7天，与第一次注射相比没有很大差别，只是第7天血尿酸含量已明显回升，但仍然低于对照组，9天达注射前水平。纯化裸酶注射组仅在给药1小时使血尿酸含量显著降低，6小时就基本恢复到与对照组相当的水平。 

表11.第三次注射后血浆尿酸含量检测结果 

注：*表示血浆尿酸含量与对照组相比有显著性差异。 

第三次注射后，修饰酶组血尿酸含量在注射5天时间内能维持低于对照组水平，7天后恢复到正常水平。 

从整个实验结果来看，修饰后的猪-人尿酸氧化酶在血液中的有效作用时间明显延长，超过未经修饰的纯化酶。间隔2周重复给药时，有效作用时间有所缩短。第三次注射有效作用时间仍可达到5天。未经修饰的尿酸氧化酶实验组，仅在第一次注射后能维持6小时的低血尿酸含量。且在注射后24小时血尿酸含量反弹性升高超过注射前的血尿酸含量。第二次注射后，仅能维持1小时的低血尿酸含量。第三次注射后没有明显的作用。 

参考文献： 

[1]Friedman TB，Polanco GE，Appold JC，Mayle JE：On the loss of uricolytic activity during primate evolution-I.Silencing of urate oxidase in a hominoid ancestor.Comp Biochem Physiol 81B(3)：653-659，1985. 

[2]Amy C，Cannella，Ted R，Mikuls.Understanding treatments for gout.Am J Manag Care.2005；11：S451-S458. 

[3]Koyama Y，Ichikawa T，Nakano E.Cloning，sequence analysis and expression in Escherichia coli of the gene encoding the Candidaut ilisurate oxidase(uricase).Biochem，1996，120：969-973. 

Claims (12)

1.一种重组猪-人尿酸氧化酶融合蛋白，其特征在于该融合蛋白的N端第1-222个氨基酸残基由猪尿酸氧化酶基因序列编码，第223-305个氨基酸序列由人尿酸氧化酶基因编码。将该融合蛋白与聚乙二醇(PEG)共价连接形成结合物，即：PEG化重组猪-人尿酸氧化酶。

2.权利要求1所述的结合物，其特征在于重组猪-人尿酸氧化酶与单甲氧基聚乙二醇甲酸琥珀酰亚胺酯反应，mPEG上活化的PEG与重组猪-人尿酸氧化酶融合蛋白分子中的部分游离氨基通过共价键连接，形成PEG化重组猪-人尿酸氧化酶。

3.权利要求2所述的结合物，其特征在于每个重组猪-人尿酸氧化酶亚基上共价连接8-12个PEG链，PEG的平均分子量为2-50KD，PEG为线形或分枝形。

4.权利要求3所述的结合物，其特征在于每个重组猪-人尿酸氧化酶亚基上共价连接9-11个PEG链，PEG的平均分子量为5-20KD，PEG为线形或分枝形。

5.权利要求4所述的结合物，其特征在于每个重组猪-人尿酸氧化酶亚基上共价连接9-10个PEG链，PEG的平均分子量为10KD，PEG为线形或分枝形。

6.权利要求2所述的结合物，其特征在于重组猪-人尿酸氧化酶为四聚体，核苷酸序列见序列表1，氨基酸序列见序列表2。

7.一种核酸分子，编码权利要求1所述的重组猪-人尿酸氧化酶。

8.质粒载体，含有权利要求7所述的核苷酸序列。

9.宿主细胞，含有权利要求8所述的质粒载体，为大肠杆菌BL21，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2011161。

10.一种降低人和动物血液尿酸含量的组合物，其特征在于包括权利要求1所述的PEG化重组猪-人尿酸氧化酶和药学上可接受的载体。

11.权利要求10所述的组合物，其特征在于该组合物以注射液或冻干粉针制剂形式存在。

12.权利要求1-11所述的结合物在制备用于降低人和动物血液尿酸含量的药物中的应用。

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