CN102051348A

CN102051348A - 人源化重组尿酸酶及其突变体

Info

Publication number: CN102051348A
Application number: CN2009101912403A
Authority: CN
Inventors: 范开; 张淳; 马雪丰; 梅翔; 胡春兰
Original assignee: Fujin Bio-Medicine Co Ltd Chongqing
Current assignee: Shandong New Time Pharmaceutical Co Ltd; Lunan Pharmaceutical Group Corp
Priority date: 2009-10-27
Filing date: 2009-10-27
Publication date: 2011-05-11
Anticipated expiration: 2029-10-27
Also published as: EP2495315A1; US8586535B2; US20120269795A1; EP2495315B1; WO2011050599A1; CN102051348B; EP2495315A4

Abstract

本发明提供了含有部分人源尿酸酶氨基酸序列的具有酶活的哺乳动物来源尿酸酶的嵌合蛋白及其突变体蛋白，以及编码该嵌合蛋白的DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞，用基因工程制备该嵌合蛋白及其突变体蛋白的方法和药物组合物。本发明的嵌合蛋白及其突变体蛋白保留了哺乳动物来源尿酸酶活性，能降低人体适用的免疫原性。同时增强或改善了哺乳动物来源尿酸酶蛋白的理化性质，更适用于高尿酸血症及其引起的痛风的治疗。

Description

人源化重组尿酸酶及其突变体

技术领域

本发明涉及DNA重组技术和药物领域。更具体地，本发明涉及含有部分人源尿酸酶氨基酸序列的具有酶活的哺乳动物来源尿酸酶的嵌合蛋白及其突变体蛋白，编码该嵌合蛋白及其突变体的DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞，用于基因工程制备该蛋白的方法，以及该蛋白在高尿酸血症及其引起的通风的治疗的应用。

背景技术

痛风是一种由嘌呤代谢紊乱所引起的疾病，早在公元前5世纪，希腊名医希波克拉底就已记载了它的症状(Emmerson B T.N Engl J Med.1996；334；445-451.)，其临床特点为高尿酸血症，并因尿酸盐沉积在皮下、关节、肾脏而形成痛风石。人体内的嘌呤经过一系列变化，最终形成的产物为尿酸，人体内血液尿酸浓度超过70mg/L时，便可引起高尿酸血症，5％-12％的高尿酸患者可发展为痛风。在血液或滑囊液中，当尿酸钠浓度达到饱和状态，即可形成尿酸钠盐的微晶体，导致痛风性关节炎(Nancy J G，Susan J K，Edna S，John S S etal.Arthritis Res Ther.2005；8(1)，R12)。随着时间的增长，慢性高尿酸血症也能在关节周围、软组织中以及在某些器官里沉积产生破坏性的结晶尿酸沉积物，即可导致痛风性急性关节炎、痛风石性慢性关节炎和关节畸形。而肾脏损害被认为是痛风的第二常见临床表现。由慢性高尿酸血症渐进性，导致髓质、肾小管及肾间质内尿酸盐沉积，刺激局部，引起炎症反应，称为慢性尿酸盐肾病；严重的高尿酸血症病人(如某些恶性肿瘤，特别是白血病和淋巴瘤患者)，在短期内可有大量尿酸沉积于肾脏集合管、肾盂、肾盏及输尿管，造成管腔阻塞、尿闭而引起急性肾功能衰竭(又称尿酸肾病)(Hershfield M S.Cecil Textbook of Medicine(20th).1508-1515.)。如果对于上述症状的治疗不彻底还可导致并发痛风性冠心病、高血脂等疾病。

近几十年来，随着人们饮食和生活习惯的改变，高蛋白和高嘌呤食物摄取增加，痛风患者的数量逐年增加。在欧洲，痛风患者的数量在过去的20年中增长了一倍(Jones D P，Staphleton F B，Kalwinsky D et al.Med Pediatr Oncol.1990.18：283-286)。在1998年的关于黄浦江流域的痛风病调查中，高尿酸血症发病率上升为10.1％，通风发病率为0.34％，介于美国20世纪80年代到20世纪90年代通风发病率(0.275％-1.000％)之间(Chen S，Du H，Wang Y et al.Clin Med J.1998.111(3)：228-230)。如果高尿酸血症没有出现临床症状，控制饮食即可；当出现了由其引起的临床症状时，则需要进行药物治疗。目前临床使用的常规治疗手段包括：镇痛消炎类药物，如秋水仙碱(colchicine)、布洛芬(buprofen)、萘普生(naproxen)等，它们主要用于控制痛风性关节炎的急性发作症状，消除关节局部疼痛、肿胀及炎症；促进尿酸排泄的促尿酸尿剂(如果肾功能降低则无效)，如羧苯磺胺(probenicid)、苯磺唑酮(sulfinpyrazone)、苯溴马龙(benzbromarone)等；抑制尿酸合成药物，如别嘌呤醇(allopurinol)。在患有痛风石性痛风、肾功能不全、白血病和某些遗传病的病人方面，别嘌呤醇是主要的治疗药物，它能抑制黄嘌呤氧化酶，使次黄嘌呤及黄嘌呤不能转换为尿酸，其本身则在人体内逐渐氧化，生成易溶于水的异黄嘌呤(oxipurinol)经尿排出。然而，所有的常规疗法很难治愈已形成痛风石的慢性痛风的患者。此外，在长期服用上述药物以后，患者不可避免出现：白细胞减少、心脏功能受损、肝肾功能受损、刺激肠胃系统、再生障碍性贫血导致糖尿、痛风等并发症。

人高尿酸血症与人在进化过程中尿酸酶基因突变失活有关，突变在人尿酸酶基因编码序列中引入了提前终止密码子(Wu X，Lee C C，Muzny D M，Caskey C T.Proc Natl Acad SciUSA.1989.86：9412-9416.)，人类因此不能自身合成活性尿酸酶，使得人的嘌呤分解代谢终止于尿酸(Wu X，Muzny D M，Lee C C，Caskey C T.J Mol Evol.1992.34：78-84.)。在非人类灵长目动物和其他哺乳动物的肝过氧化物酶体中的活性尿酸酶可将溶解性较低的尿酸盐(～11mg/100ml水)转变为更易溶的尿囊素(～147mg/100ml水)，并能由肾更有效的排泄(Wortmann R L，Kelley W N.Kelley’s textbook of rheumatology(6th).2001：1339-1376)。在欧美，由黄曲霉(Aspergillus flavus)制备的尿酸酶(Uricozyme)在治疗与肿瘤化疗有关的严重高尿酸血症方面的时间已达10年以上(Zittoun R，Dauchy F，Teilaud C，Barthelemy M，Bouchard P.Ann Med Interne.1978.127：479-482.)；由法国Sanofi公司研制的由啤酒酵母发酵生产的重组黄曲霉尿酸酶药物ELITEK已于2002年通过FDA认证并用于由肿瘤化疗引起的严重高尿酸血症的短期治疗(Pui C H，Relling M V，Lascombes F，HarrisonP L，Struxiano A et al.Leukemia.1997.11：1813-1816.)，同时，证明ELITEK的输注还可以减小痛风石的体积(Potaux L，Aparicio M，Maurel C，Ruedas M E，Mart in C L.Nouv PresseMed.1975.4：1109-1112.)。

尿酸酶(E C 1.7.3.3)广泛存在于微生物(苛求芽孢杆菌、单假丝酵母、黄曲霉)、植物(大豆、鹰嘴豆)、动物(猪、牛、狗、狒狒)中(Suzuki K，Sakasegawa S，Misaki H，SugiyamaM.J Biosci Bioeng.2004.98：153-158)，在氧气存在的情况下它能催化尿酸氧化尿囊素并放出二氧化碳(Retailleau P，Colloc’h，Denis V，Francoise B.Acta Cryst D.2004.60：453-462.)。

具有活性的尿酸酶是一四聚体蛋白，由相同的亚基组成，每个亚基分子量在34kD左右，由301-304个氨基酸组成。每个溶液中尿酸酶的酶活力最高的pH值为8.0(Bayol A etal.Biophys Chem.1995.54：229-235.)。在目前所知的所有来源的尿酸酶中，活性最高的来源于黄曲霉，达到27IU/mg；其次是来源于苛求芽胞杆菌，它的活性保持在13IU/mg(HuangS H，Wu T K.Eur J Biochem.2004.271：517-523.)。另外，来源于豆类植物的尿酸酶，其活性只有2-6IU/mg；来源于哺乳动物的尿酸酶，经过重组表达以后，猪的尿酸酶活性可以达到5IU/mg，狒狒的尿酸酶酶活性只有1IU/mg(Michael H，Susan J.K.2006.US7056713B1)，而人源尿酸酶无活性。

作为人体应用，微生物尿酸酶的高活性和哺乳动物尿酸酶的低免疫原性，使得这两大来源的尿酸酶成了目前开发应用的重组尿酸酶的研究热点。但黄曲霉来源的尿酸酶与推测出的人源尿酸酶的同源性不足40％(Lee C C，Wu X，Gibbs R A，Cook R G，Muzny D M，CaskeyC T.Science.1988.239：1288-1291.)，人体易产生抗尿酸酶抗体，黄曲霉尿酸酶的功效迅速减弱，同时引发严重过敏性反应，无法用于长期治疗。人类尿酸酶基因因突变而失去活性，成为假基因。如果将其改造，恢复其降解尿酸的酶活性，必能降低酶的免疫原性，但人源尿酸酶基因在进化过程中，由于缺乏选择压力，累积了部分错义突变，本发明人进行了多种氨基酸的突变以恢复其尿酸酶活性，均未成功。

在有关哺乳动物尿酸酶的公开专利和文献中，杜克大学(Duke University)和山景公司(Savient)进行了猪来源和狒狒来源嵌合尿酸酶研究(Michael H，Susan J.K.2006.US7056713B1)。该研究的方法是在保证酶活性不明显减少的情况下，将猪全长尿酸酶序列中的1-9个精氨酸置换为赖氨酸，从而有利于随后的PEG修饰，PEG化的猪狒狒尿酸酶嵌合蛋白实现了在人体适用中降低免疫原性的目标。

本发明提供了另一全新的哺乳动物来源尿酸酶的C末端通过引入部分人源尿酸酶氨基酸序列后，在不影响其酶催化活性的同时，降低了在人体中的免疫原性。通过一系列的研究证实，该种形式哺乳动物尿酸酶及其突变体具有更高的体内稳定性，适合作为治疗高尿酸血症等相关疾病的药物或药物组合物。

发明目的

本发明的目的就是提供新型的哺乳动物尿酸酶蛋白，即含有部分人源尿酸酶氨基酸序列的具有酶活的哺乳动物来源尿酸酶的嵌合蛋白及其突变体蛋白。

本发明的另一目的是提供编码所述嵌合蛋白及其突变体蛋白的DNA分子、含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞。

本发明的另一目的是提供一种成本低廉和/或步骤简便的生产所述有部分人源尿酸酶氨基酸序列的具有酶活的哺乳动物来源尿酸酶的嵌合蛋白及其突变体蛋白。

本发明的另一目的是提供一种可以降低血液尿酸浓度的蛋白药物，可用于高尿酸血症及其引起的通风的治疗。

发明概述

在本发明的第一方面，提供了一种嵌合蛋白，它包括：含有部分人源尿酸酶氨基酸序列的具有酶活的哺乳动物来源尿酸酶的嵌合蛋白及其突变体蛋白。更具体的，该嵌合蛋白的N端前240个氨基酸为猪、狗、牛、等哺乳动物来源尿酸酶蛋白第1-240位氨基酸，剩下的64个氨基酸为人源尿酸酶的第241-304位氨基酸。所述嵌合蛋白的突变体蛋白包含以下至少一种突变：第245位亮氨酸被组氨酸取代，第246位丝氨酸被苏氨酸取代，第248位丝氨酸被甘氨酸取代，第249位精氨酸被谷氨酰胺取代，第252位丙氨酸被谷氨酸取代，第253位异亮氨酸被甲硫氨酸取代，第266位苯丙氨酸被亮氨酸取代。更优的，突变体蛋白选自下述具有2-5种突变的序列：S246T-S248G-R249Q；L245H-A252E-I253M；S246T-S2486-R249Q-F266L；L245H-A252E-I253M-F266L(突变用三联体表示：字母-数字-字母，其中的数字表示突变氨基酸的位置，数字前的字母对应突变设计的氨基酸，数字后的字母表示用于置换数字前氨基酸的氨基酸，其中L代表亮氨酸、S代表丝氨酸、T代表苏氨酸、G代表甘氨酸、Q代表谷氨酰胺、A代表丙氨酸、E代表谷氨酸、I代表异亮氨酸、M代表甲硫氨酸、F代表苯丙氨酸、R代表精氨酸)。本发明同样提供了上述嵌合蛋白及其突变体蛋白的C末端或/和N末端截断的形式。更优的，N末端截断1-7个氨基酸，C末端截断1-3个氨基酸，这种缺失截短形式具有更好的不易降解的稳定性。

在本发明的第二方面，提供了一种DNA分子，它编码本发明上述的嵌合蛋白及其突变体蛋白。

在本发明的第三方面，提供了含有上述DNA分子的表达载体，以及构建该表达载体的方法。

在本发明的第四方面，提供了包含上述表达载体的宿主细胞以及可能的转化或转染的方法。

在本发明的第五方面，提供了一种重组产生本发明嵌合蛋白及其突变体蛋白的方法，它包括以下步骤：在合适表达所述融合蛋白的条件下，培养上述的宿主细胞，表达出所述的融合蛋白；分离纯化所述的融合蛋白的方法。

在本发明的第六方面，提供了一种该重组人源性尿酸酶嵌合蛋白及其突变体蛋白的药物组合物，它包括药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂，以及有效剂量的本发明的嵌合蛋白。

发明详述

狗、猪、牛、羊等哺乳动物尿酸酶氨基酸与人源尿酸酶氨基酸同一性均在88％以上，活性区域高度一致(附图1)。利用嵌合的方法，在具有酶活的哺乳动物尿酸酶氨基酸序列中，通过替换引入部分不影响酶催化活性的人源尿酸酶氨基酸序列，可达到既保留非人源哺乳动物尿酸酶活性，又增强与推导出的无活性人源尿酸酶同源性，从而实现降低人体中免疫原性的目的。

本发明人经过系统的研究，发现推导出的人源尿酸酶第241-304位氨基酸对尿酸酶活性无明显影响，将该序列与狗、猪、牛、羊等来源尿酸酶N端第1-240位氨基酸嵌合后，形成的嵌合形式的人源化尿酸酶，其活性与狗、猪、牛、羊来源尿酸酶相比无酶催化活性降低，但嵌合蛋白氨基酸序列与人源尿酸酶氨基酸序列同一性可以提高至91％以上，将具有降低引起免疫原性的风险。

本领域众所周知，在研制重组蛋白质药物中需尽量克服蛋白的物理和化学不稳定性。尿酸酶蛋白的高疏水性等生物物理性质决定了相对高浓度的蛋白质溶液(＞5mg/ml)处于非生理条件下(如高温或弱酸性pH值)时会加速其交联和聚集(即较差的物理稳定性和不利于制备成生物制品的特性)。本发明人经研究发现，在本发明前述的人源化尿酸酶氨基酸序列的基础上，经过2-5个氨基酸的突变，在保留原蛋白的高酶活性和低免疫原性时，增强或改善了嵌合蛋白的理化性质(减少了疏水介导的聚集、提高了与溶剂的相容性、增加了体外热稳定性、延长了体内代谢半衰期等)。

已知哺乳动物尿酸酶蛋白C末端后三个氨基酸(SKL或SRL)为过氧化物酶体识别位点(Satoshi MIURA，Toshiaki ODA，Tsuneyoshi FUNAI.Eur.J.Biochem.1994.223：141-146)，主要用于蛋白定位(在过氧化物酶体中)，对维持酶活性无贡献，目前的尿酸酶结构研究发现，上述三个氨基酸突出在三维结构表面，容易被免疫系统识别，可能引起免疫反应。因此，本发明通过重组技术缺失C末端三个氨基酸序列可以进一步降低蛋白的免疫原性。位于N末端的前7个氨基酸在哺乳动物来源尿酸酶序列间同源性低，对维持酶活性无影响，同理，本发明通过重组技术缺失N末端1-7个氨基酸序列同样实现降低该蛋白的免疫原性。

至此，本发明提供新型尿酸酶嵌合蛋白，它包括含有人源尿酸酶氨基酸序列和其他哺乳动物来源尿酸酶氨基酸序列组成的嵌合蛋白及其突变体蛋白。

如本文所用，术语“人源尿酸酶氨基酸序列”指所述嵌合蛋白中第241-304位氨基酸序列来源于人(SEQ ID No：1)，术语“哺乳动物尿酸酶序列”指所述嵌合蛋白中第1-240位氨基酸序列来源于猪(SEQ ID No：2)、狗(SEQ ID No：3)、牛(SEQ ID No：4)尿酸酶氨基酸序列。优选的哺乳动物尿酸酶序列为狗源尿酸酶序列。

如本文所用，术语“突变体蛋白”指在上述嵌合体蛋白氨基酸序列基础上经过一个或几个氨基酸的置换、N末端或/和C末端截短而成具有相同生物活性的蛋白。

突变体蛋白包含以下至少一种置换：第245位亮氨酸被组氨酸取代，第246位丝氨酸被苏氨酸取代，第248位丝氨酸被甘氨酸取代，第249位精氨酸被谷氨酰胺取代，第252位丙氨酸被谷氨酸取代，第253位异亮氨酸被甲硫氨酸取代，第266位苯丙氨酸被亮氨酸取代。更优的，突变体蛋白选自下述具有2-5种突变的序列：S246T-S248G-R249Q；L245H-A252E-I253M；S246T-S248G-R249Q-F266L；L245H-A252E-I253M-F266L(突变用三联体表示：字母-数字-字母，其中的数字表示突变氨基酸的位置，数字前的字母对应突变设计的氨基酸，数字后的字母表示用于置换数字前氨基酸的氨基酸)。本发明同样提供了上述嵌合蛋白及其突变体蛋白的C末端或/和N末端截短的形式。更优的，N末端截短1至7个氨基酸，C末端截短1至3个氨基酸。

在本发明的一个优选实施方案中，提供了一种重组狗和人嵌合尿酸酶(代号UHC)，该嵌合蛋白(SEQ ID No：5)的N端前240个氨基酸为狗源尿酸酶蛋白第1-240位氨基酸，随后的64个氨基酸为人源尿酸酶的第241-304位氨基酸，该序列与人源尿酸酶蛋白氨基酸序列(SEQ ID No：1)同一性达到91.4％，同时催化活性为狗源尿酸酶蛋白的112％。

在本发明的另一个优选实施方案中，突变体蛋白是指在嵌合蛋白UHC的基础上，进行了以下至少一个氨基酸置换：即第245位亮氨酸被组氨酸取代，第246位丝氨酸被苏氨酸取代，第248位丝氨酸被甘氨酸取代，第249位精氨酸被谷氨酰胺取代，第252位丙氨酸被谷氨酸取代，第253位异亮氨酸被甲硫氨酸取代，第266位苯丙氨酸被亮氨酸取代。更优的，突变体蛋白选自下述具有2-5种突变的序列：S246T-S248G-R249Q(SEQ ID No：6)；L245H-A252E-I253M(SEQ ID No：7)；S246T-S248G-R249Q-F266L(SEQ ID No：8)；L245H-A252E-I253M-F266L(SEQ ID No：9)(突变用三联体表示：字母-数字-字母，其中的数字表示突变氨基酸的位置，数字前的字母对应突变设计的氨基酸，数字后的字母表示用于置换数字前氨基酸的氨基酸)，上述突变体蛋白的物理化学性质与突变前相比均得到增强(如减少疏水介导的聚集、提高与溶剂的相容性、增加体外热稳定性、延长体内代谢半衰期等)。

本发明也包括RNA形式或DNA形式的编码上述嵌合蛋白及其突变体蛋白的多核苷酸形式，其中DNA包括cDNA、基因组DNA以及人工合成DNA。DNA可以为双链或单链。编码本发明嵌合蛋白及其突变体蛋白的编码序列可由冗余或遗传密码的兼并而有所不同。

本发明的编码上述嵌合蛋白突变体的多核苷酸序列可用本领域技术人员熟知的DNA重组、PCR等各种技术来获得，例如包括，但不局限于本发明较佳实施方案中采用的两轮交错延伸PCR法以及Strantagene的quick change中描述的定点突变方法。

编码本发明嵌合蛋白及其突变体蛋白的多核苷酸可包括以下：仅该嵌合蛋白及其突变体蛋白的编码序列、嵌合蛋白及其突变体蛋白编码序列及额外的编码序列(如前导或分泌序列或前蛋白质序列)；嵌合蛋白及其突变体蛋白的编码序列及非编码序列(如内含子，或突变蛋白编码序列5’和/或3’端的非编码序列)。因此，术语“编码嵌合蛋白及其突变体蛋白的多核苷酸”所指的多核苷酸可能不仅含有嵌合蛋白及其突变体蛋白的编码序列，还含有包括额外编码序列和/或非编码序列的多核苷酸。

将本发明的多核苷酸与相应表达载体进行有效连接后，转化或转导入宿主细胞中表达。上述载体可以以附加体或整合到宿主染色体的形式在宿主生物中进行复制。在适当的启动子控制下，尿酸酶嵌合蛋白及其突变体蛋白可以在哺乳动物细胞、昆虫、酵母、细菌或其它细胞中表达，也可以利用本发明DNA构建体衍生的RNA、通过无细胞翻译系统产生所述蛋白质。优选的，选择大肠杆菌克隆本发明的多核苷酸。其他适用的微生物宿主包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilus)、沙雷氏菌属(Serratia)、假单胞菌属(Pseudomonas)和葡萄球菌属(Staphylococcus)等。也可以在这些原核宿主中制备表达载体，还可能具有众多公知启动子中的任一种，如乳糖启动子系统、色氨酸启动子系统、β内酰胺酶启动子系统或噬菌体λ或T7来源的启动子系统。通常这些启动子会控制表达，且具有核糖体结合位点序列等，以便起始和完成转录及翻译。

酵母或真菌等的其他微生物也可用于表达。优选的酵母宿主为毕赤酵母(Pichiapastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)以及嗜甲醇毕赤酵母(Pichia angusta)。真菌宿主包括黑曲霉(Aspergillus niger)、里氏木霉(Trichoderma reesei)及裂褶菌(Schizophyllum commune)，但也可选择使用其他真菌。

哺乳动物细胞培养也可用于表达生产本发明的蛋白。优选的细胞包括：CHO细胞系、多种COS细胞系、NSO细胞、叙利亚地鼠(Syrian Hamster)卵巢细胞系、Hela细胞或人胎肾细胞系(即HEK293、HEK293EBNA)。

可以通过公知的方法将含有目的多核苷酸序列(如尿酸酶嵌合蛋白及其突变体蛋白以及表达控制序列)的载体转移到宿主细胞内，所采用的方法取决于细胞宿主的类型。例如，对原核细胞通常采用氯化钙转染法，而对于其他细胞宿主可以使用磷酸钙处理或电穿孔法。

如前获得的本发明重组尿酸酶嵌合蛋白及其突变体蛋白可以从宿主细胞内部或外部(如培养基)分离得到，且纯化为高纯度的均一蛋白。此种蛋白分离纯化的方法不限于任何特定方法。事实上，可用任何本领域已公知的方法，例如柱层析法、过滤法、超滤法、盐析法、等电点沉淀法、透析法等。对于层析，例如亲和层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析、反相层析、吸附层析等都可以应用。这些层析可用液相层析如HPLC和FPLC来操作。可用通用的蛋白检测方法检测蛋白浓度和纯度，例如HPLC法、SDS-聚丙烯酰胺电泳法、等电点电泳法、BCA法、Lowry法、Western Blot法等。因此，本发明可提供高纯度重组的尿酸酶嵌合蛋白及其突变体蛋白。

至此已对本发明进行了详细描述，参照以下实例能够对之有更清楚的理解，所述实例仅为说明目的而并不旨在对本发明进行限制。

说明书附图说明

附图1：不同哺乳动物来源尿酸酶氨基酸序列比对图

附图2：UHC嵌合蛋白重组表达SDS-PAGE电泳图谱(从左起，条带1：marker，条带2：诱导前对照，条带3：诱导4小时)

附图3：交错延伸PCR示意图

附图4：纯化后UHC嵌合蛋白SDS-PAGE电泳图谱(A，从左起，条带1：marker，条带2：UHC纯化后蛋白)和反相HPLC图谱(B)

附图5：纯化后UHC嵌合蛋白质谱分子量图

具体实施方式

实例1人狗嵌合尿酸酶蛋白UHC在大肠杆菌中重组表达

在本实施例中，所涉及的嵌合蛋白N端前240个氨基酸为狗来源尿酸酶序列，第241-304为人源尿酸酶氨基酸序列。根据上述氨基酸序列，并按照大肠杆菌偏爱的密码子，委托宝生物(大连)有限公司进行全基因合成，其核苷酸序列分别为(Seq ID No：10)：CAT ATG GCC CAT TATCAT AAT GAT TAT AAA AAA AAT GAT GAA GTT GAA TTT GTT CGT ACC GGT TAT GGTAAA GAT ATG GTT AAA GTT CTG CAT ATT CAG CGT GAT GGT AAA TAT CAT TCT ATT AAA GAA GTT GCC ACCTCT GTT CAG CTG ACC CTG TCT TCT AAA AAA GAT TAT GTT TAT GGT GAT AAT TCT GAT ATT ATT CCA ACCGAT ACC ATT AAA AAT ACC GTT CAT GTT CTG GCC AAA TTTAAA GGT ATT AAA TCT ATT GAA ACC TTT GCCATG AAT ATT TGT GAA CAT TTT CTG TCTTCT TTT AAT CAT GTT ATT CGT GCC CAG GTT TAT GTT GAA GAAGTT CCA TGG AAA CGT TTT GAA AAA AAT GGT GTT AAA CAT GTT CAT GCC TTT ATT CAT AAT CCA ACC GGTACC CAT TTT TGT GAA GTT GAA CAG ATG CGT TCT GGT CCA CCA GTT ATT CAT TCT GGT ATT AAA GAT CTGAAA GTT CTG AAA ACC ACC CAG TCT GGT TTT GAA GGT TTT ATT AAA GAT CAGTTT ACC ACC CTG CCA GAAGTT AAA GAT CGT TGT TTT GCC ACC AAA GTT TAT TGT AAATGG CGT TAT CAT CAG GGT CGT GAT GTT GATTTT GAA GCC ACC TGG GAT ACC GTT CGT GAT ATT GTT CTG GAA AAA TTT GCC GGT CCT TAT GAT AAA GGTGAA TAT TCT CCA TCT GTT CAG AAA ACC CTG TAT GAT ATT CAG GTT CTG TCT CTG TCT CGT GTT CCA GCCATT GAAGAT ATG GAA ATT TCT CTG CCA AAT ATT CAT TAT TTT AAT ATT GAT ATG TCT AAA ATGGGT CTGATT AAT AAA GAA GAA GTT CTG CTG CCA CTG GAT AAT CCT TAT GGT AAA ATTACC GGT ACC GTT AAA CGTAAA CTG TCT TCT CGT CTG TGA TAA GGA TCC

将全基因合成的重组质粒扩增后，用Nde I和BamH I双酶切，回收目的片段，用T4DNA连接酶与同样经Nde I和BamH I酶切回收的质粒pET-3C(Invitrogen)连接，利用如《CurrentProtocols in Molecular Biology》中所述的标准方法将连接混合物转入大肠杆菌克隆宿主菌DH5α。

在LB/AMP平板上进行转化反应，过夜生长转化体后，挑取转化后单克隆菌落以制备质粒用酶切和PCR验证的方法筛选重组质粒pET-3C-UHC，经DNA测序(TAKARA，大连)后确定含有所需嵌合蛋白UHC cDNA的阳性重组质粒中尿酸酶序列与理论序列完全一致。将上述测序正确的重组质粒转化大肠杆菌表达宿主菌并进行表达。

使用大肠杆菌BL21(DE3)、BL21 Star(DE3)或BL21 Star(DE3)plysS、表达UHC嵌合蛋白。这些菌株仅是许多适用于表达嵌合蛋白中的一些，它们可以分别通过商业渠道自Novagen，Invitrogen及Stratagen获得。利用转化体在含有AMP的LB平板上的生长能力可将其鉴别出来。

使含有UHC重组质粒的大肠杆菌表达重组菌在含有50um/ml的AMP的液体LB培养基中培养过夜，将上述培养液接种大型的培养物，接种比例为1∶25-1∶200。待这些细胞生长至600nm处光密度为一定值后，加入IPTG使其终浓度为0.4mM诱导表达目标蛋白，继续培养细胞3至12个小时。随后通过离心收获细胞，用50mM Tris缓冲液洗涤沉淀，离心放置-20度保存，并进行SDS-PAGE检测(附图2)。

实例2人狗嵌合尿酸酶蛋白UHC突变体DNA构建以及在大肠杆菌中重组表达

以UHC蛋白DNA序列为原始模板，用交错延伸PCR法突变制备含有目标突变的DNA(附图3)。下面以制备S246T-S248G-R249Q和S246T-S248G-R249Q-F266L为例进行说明：

引物编号	DNA序列
		引物1(Seq ID No：11)	5′CACGACATATGGCCCATTATCATA 3′
引物2(Seq ID No：12)	5′GGATCCTTATCACAGACGAGAA 3′
		引物3(Seq ID No：13)	5′ACCCTGGGTCAGGTTCCAGAAATTGAAGATATGGAAATT 3′
引物4(Seq ID No：14)	5′TTCTGGAACCTGACCCAGGGTCAGAACCTGAATATCATA3′
		引物5(Seq ID No：15)	5′TTCATTATCTGAATATTGATATGTCTAAAA 3′
引物6(Seq ID No：16)	5′ATCAATATTCAGATAATGAATATTTGGCAG 3′

制备UHC_246/248/249：第一阶段PCR：模板序列为实例1中全基因合成序列(Seq ID No：8)，引物为表2中引物1和引物3，PCR反应体系和方法均采用PCR反应试剂盒(TAKARA，大连)，按商家的说明书设置。PCR反应条件为：94℃1min，56℃1min，72℃1min，共30个循环，第一个循环94℃变性10min，最后一个循环72℃延伸10min。按上述PCR条件扩增得到产物UHC_246/248/249-a片段；第二阶段PCR：模板序列同第一阶段PCR，引物为引物2和引物4，按上述PCR条件扩增得到UHC_246/248/249-b片段；第三阶段PCR：模板为UHC_246/248/249-a片段和UHC_246/248/249-b片段的1∶1混合溶液，引物为引物1和引物2，按上述PCR条件扩增得到产物UHC_246/248/249(SEQID No：6)

制备UHC_{246/248/249/266}：第一阶段PCR：模板序列为UHC_246/248/249序列(Seq ID No：8)，引物为表2中引物1和引物5，按上述PCR条件扩增得到产物UHC_{246/248/249/266}-a片段；第二阶段PCR：模板序列同第一阶段PCR，引物为引物2和引物4，按上述PCR条件扩增得到UHC_{246/248/249/266}-b片段；第三阶段PCR：模板为UHC_{246/248/249/266}-a片段和UHC_{246/248/249/266}-b片段的1∶1混合溶液，引物为引物1和引物2，按上述PCR条件扩增得到产物UHC_{246/248/249/266}(SEQ ID No：8)。

引物1和引物2的5’末端分别含有Nde I和BamH I酶切序列，将含各突变序列的DNA序列用Nde I和BamH I进行双酶切，连接、转化、筛选、表达方法同实例1。

实例3UHC嵌合蛋白及其突变体蛋白大肠杆菌表达产物纯化

取50g菌体沉淀加入500ml破菌液，破菌液pH为8.2，含有25mM Tris-HCl，0.1mg/ml溶菌酶中，37℃搅拌2小时，将上述菌液超声破菌(500W 4S，间隔6S，30次)；离心弃去上清，沉淀用2L pH 10.20.1M Na₂CO₃溶解，室温搅拌过夜；离心弃去沉淀，在上清中补入15％饱和硫酸铵，4度沉淀2小时；离心弃去上清，沉淀用2L pH 10.20.1M Na₂CO₃溶解，室温搅拌过夜；离心弃去沉淀，上清进行QAE琼脂糖阴离子交换层析柱(GE)纯化，目标蛋白全部挂柱后，用线性梯度为0至0.5M的NaCl(pH 10.20.1M Na₂CO₃)进行洗脱，目标蛋白在0.3M NaCl时被洗脱；将上述洗脱组分进行Sephacryl S 200分子筛纯化，收集主峰，即为目标蛋白峰；将上述组分进行黄嘌呤亲和层析(Sigma)纯化，将上述组分用pH 10.20.1M Na₂CO₃稀释至0.5mg/ml后上样，用含有60um黄嘌呤的pH 10.20.1M Na₂CO₃洗脱液洗脱目标蛋白。此时进行SDS-PAGE和HPLC检测纯度，均可达到95％以上(附图4)。

实例4UHC嵌合蛋白及其突变体蛋白活性检测

在25℃、pH8.5时，每分钟转化1μmol尿酸为尿囊素的酶量定义为一个国际单位(IU)。尿酸在293nm处有特征吸收峰，当其被尿酸酶降解后，产物在此波长范围内无吸收峰，定时检测293nm处吸光度的变化来确定尿酸的减少量，然后利用尿酸的摩尔消光系数(1.23×104M-1·CM-1)算出尿酸浓度，根据尿酸浓度的变化可计算尿酸酶活性。将紫外分光光度计调至293nm，待机器稳定后，用0.1M四硼酸钠溶液作为空白调零，取3ml 0.1mM尿酸溶液反应溶解加入石英比色杯中，补入10ul-50ul UHC嵌合蛋白及其突变体蛋白活性，每30秒进行一次读数，测量3min内OD293变化值。根据公式C＝A/Kb(C为溶液尿酸浓度，A为293nm吸光值，K为摩尔消光系数-1.23×104M^-1·CM^-1，b为比色杯的内径)，计算不同时间点OD₂₉₃对应的尿酸浓度；根据ΔM＝ΔCV(ΔM为尿酸减少的摩尔数，ΔC为尿酸浓度变化，C为反应液体积)计算减少的尿酸物质的量；根据U＝ΔM/TV1(U为每毫升血浆含有的尿酸酶活性单位，T为反应分钟，V1为加入反应体系的UHC嵌合蛋白及其突变体蛋白体积)计算尿酸酶活性。

蛋白	酶比活(IU/mg)
		UHC	6.3
UHC_246/248/249	7.1
		UHC_{246/248/249/266}	7.3
UHC_245/252/253	6.9
		UHC_{245/252/253/266}	6.8

实例5UHC嵌合蛋白及其突变体蛋白体外稳定性检测

抗疏水介导的聚集能力：将1mg/ml的UHC蛋白、UHC_246/248/249蛋白、UHC_{246/248/249/266}蛋白、UHC_245/252/253蛋白、UHC_{245/252/253/266}蛋白4度放置12小时，分别测量280nm处和350nm处吸光值，根据公式AI＝100×OD₃₅₀/(OD₂₈₀-OD₃₅₀)计算不同蛋白的聚集度(表3)，并计算比活保留率

蛋白	聚集度(aggregation index)	比活保留率
			UHC	20.5	79.5％
UHC_246/248/249	11.3	91.2％
			UHC_{246/248/249/266}	10.2	90.5％
UHC_245/252/253	15.7	85.3％
			UHC_{245/252/253/266}	16.2	83.9％

热稳定性：将1mg/ml的UHC蛋白、UHC_246/248/249蛋白、UHC_{246/248/249/266}蛋白、UHC_245/252/253蛋白、UHC_{245/252/253/266}蛋白30度放置5天，取出测量酶活，比较酶活保留率。

蛋白	酶比活保留率
		UHC	60.3％
UHC_246/248/249	65.5％
		UHC_{246/248/249/266}	67.8％
UHC_245/252/253	71.2％
		UHC_{245/252/253/266}	69.8％

实例6UHC嵌合蛋白及其突变体蛋白体内稳定性检测

取2.0-2.5kg新西兰长耳兔20只，随机分为5组，每组分别静脉注射不同类型UHC嵌合蛋白及其突变体蛋白，注射剂量为1.0mg/kg，分别在1h、3h、6h、12h、24小时取血，用3.2％柠檬酸三钠抗凝，混匀后12000转离心10分钟，取出上层血浆测量酶活，进行药代动力学分析，计算不同组的AUC，结果见下表

蛋白	AUC(酶活×小时)
		UHC	3.26
UHC_246/248/249	4.11

UHC_{246/248/249/266}	4.53
		UHC_245/252/253	4.78
UHC_{245/252/253/266}	3.99

实例7体内药效学实验

取100日龄“罗曼蛋鸡”70只，随机抽取15只作为空白对照组(常规饲料，自由饮水)，其余55只喂食造模饲料(造模饲料底料为玉米粉、补充鱼粉、骨粉，蛋白质含量大于20％、含钙量大于4％)，每日控制进水100ml内，造模2-3周将血液尿酸浓度大于480umol/L的蛋鸡作为高尿酸血症模型筛选出来(45只)，随机分为3组，每组15只：尿酸酶UHC组，皮下注射UHC蛋白，剂量为1mg/kg，每天注射一次；阳性对照药物苯溴马隆组，灌喂苯溴马隆，剂量为5mg/kg，每天灌喂一次；模型对照组，继续喂食造模饲料。给药三周后，从鸡翅静脉取血用尿酸测定试剂盒测量血液尿酸浓度，结果如下：

组别	给药0天血液尿酸浓度(um/L)	给药10天血液尿酸浓度(um/L)	给药21天血液尿酸浓度(um/L)
				正常组	234±15	241±29	220±34
UHC组	529±123	411±78	266±69
				苯溴马隆组	527±109	455±67	416±98
模型对照组	534±136	551±121	520±131

结果显示，UHC蛋白注射高尿酸血症动物后，可显著降低血液尿酸水平。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110>重庆富进生物医药有限公司

<120>人源化重组尿酸酶及其突变体

<160>16

<210>SEQ ID NO：1

<211>304

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>1

Met Ala His Tyr His Asn Asn Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe

1 5 10 15

Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Glu Met Val Lys Val Leu His Ile Gln

20 25 30

Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gln

35 40 45

Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp

50 55 60

Ile Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val His Val Leu Ala Lys

65 70 75 80

Phe Lys Glu Ile Lys Ser Ile Glu Ala Phe Gly Val Asn Ile Cys Glu

85 90 95

His Phe Leu Ser Ser Phe Asn His Val Ile Arg Ala Gln Val Tyr Met

100 105 110

Glu Glu Ile Pro Trp Lys His Leu Glu Lys Asn Glu Val Lys His Val

115 120 125

His Ala Phe Ile His Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu

130 135 140

Gln Leu Arg Ser Gly Pro Gln Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu

145 150 155 160

Lys Val Leu Lys Thr Thr Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp

165 170 175

Gln Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gln

180 185 190

Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gln Cys Arg Asp Val Asp Phe Lys

195 200 205

Ala Thr Trp Asp Thr Ile Arg Asp Leu Val Met Glu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Leu Thr Ser Val Gln Lys Thr Leu Cys

225 230 235 240

Asp Ile Gln Val Leu Ser Leu Ser Arg Val Pro Ala Ile Glu Asp Met

245 250 255

Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys

260 265 270

Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro

275 280 285

Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu

290 295 300

<210>SEQ ID NO：2

<211>304

<212>PRT

<213>Sus scrofa

<400>2

Met Ala His Tyr Arg Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe

1 5 10 15

Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His Ile Gln

20 25 30

Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gln

35 40 45

Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp

50 55 60

Val Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys

65 70 75 80

Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu

85 90 95

His Phe Leu Ser Ser Phe Lys His Val Ile Arg Ala Gln Val Tyr Val

100 105 110

Glu Glu Val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val

115 120 125

His Ala Phe Ile Tyr Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu

130 135 140

Gln Ile Arg Asn Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu

145 150 155 160

Lys Val Leu Lys Thr Thr Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp

165 170 175

Gln Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gln

180 185 190

Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gln Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu

195 200 205

Ala Thr Trp Asp Thr Val Arg Ser Ile Val Leu Gln Lys Phe Ala Gly

210 215 220

Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Asp Ile Gln Val Leu Thr Leu Gly Gln Val Pro Glu Ile Glu Asp Met

245 250 255

Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Leu Asn Ile Asp Met Ser Lys

260 265 270

Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro

275 280 285

Tyr Gly Arg Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Thr Ser Arg Leu

290 295 300

<210>SEQ ID NO：3

<211>304

<212>PRT

<213>Canis familiaris

<400>3

Met Ala His Tyr His Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe

1 5 10 15

Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Val Lys Val Leu His Ile Gln

20 25 30

Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gln

35 40 45

Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Val Tyr Gly Asp Asn Ser Asp

50 55 60

Ile Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val His Val Leu Ala Lys

65 70 75 80

Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Thr Phe Ala Met Asn Ile Cys Glu

85 90 95

His Phe Leu Ser Ser Phe Asn His Val Ile Arg Ala Gln Val Tyr Val

100 105 110

Glu Glu Val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val

115 120 125

His Ala Phe Ile His Asn Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu

130 135 140

Gln Met Arg Ser Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu

145 150 155 160

Lys Val Leu Lys Thr Thr Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp

165 170 175

Gln Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Lys

180 185 190

Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gln Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu

195 200 205

Ala Thr Trp Asp Thr Val Arg Asp Ile Val Leu Glu Lys Phe Ala Gly

210 215 220

Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Asp Ile Gln Val His Ser Leu Ser Arg Val Pro Glu Met Glu Asp Met

245 250 255

Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys

260 265 270

Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro

275 280 285

Tyr Gly Arg Ile Thr Gly Thr Ala Lys Arg Lys Leu Ala Ser Lys Leu

290 295 300

<210>SEQ ID NO：4

<211>304

<212>PRT

<213>Bos taurus

<400>4

Met Ala His Tyr His Asn Asp Tyr Gln Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe

1 5 10 15

Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Val Lys Val Leu His Ile Gln

20 25 30

Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gln

35 40 45

Leu Thr Leu Asn Ser Arg Arg Glu Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp

50 55 60

Ile Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val Gln Val Leu Ala Lys

65 70 75 80

Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Thr Phe Ala Met Asn Ile Cys Glu

85 90 95

His Phe Leu Ser Ser Phe Asn His Val Ile Arg Val Gln Val Tyr Val

100 105 110

Glu Glu Val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val

115 120 125

His Ala Phe Ile His Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu

130 135 140

Gln Leu Arg Ser Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu

145 150 155 160

Lys Val Leu Lys Thr Thr Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Leu Lys Asp

165 170 175

Gln Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gln

180 185 190

Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gln Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu

195 200 205

Ala Thr Trp Glu Ala Val Arg Gly Ile Val Leu Lys Lys Phe Ala Gly

210 215 220

Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Asp Ile Gln Val Leu Ser Leu Ser Gln Leu Pro Glu Ile Glu Asp Met

245 250 255

Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys

260 265 270

Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro

275 280 285

Tyr Gly Arg Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Thr Ser Arg Leu

290 295 300

<210>SEQ ID NO：5

<211>304

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<400>5

Met Ala His Tyr His Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe

1 5 10 15

Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Val Lys Val Leu His Ile Gln

20 25 30

Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gln

35 40 45

Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Val Tyr Gly Asp Asn Ser Asp

50 55 60

Ile Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val His Val Leu Ala Lys

65 70 75 80

Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Thr Phe Ala Met Asn Ile Cys Glu

85 90 95

His Phe Leu Ser Ser Phe Asn His Val Ile Arg Ala Gln Val Tyr Val

100 105 110

Glu Glu Val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val

115 120 125

His Ala Phe Ile His Asn Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu

130 135 140

Gln Met Arg Ser Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu

145 150 155 160

Lys Val Leu Lys Thr Thr Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp

165 170 175

Gln Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Lys

180 185 190

Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gln Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu

195 200 205

Ala Thr Trp Asp Thr Val Arg Asp Ile Val Leu Glu Lys Phe Ala Gly

210 215 220

Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Asp Ile Gln Val Leu Ser Leu Ser Arg Val Pro Ala Ile Glu Asp Met

245 250 255

Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys

260 265 270

Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro

275 280 285

Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu

290 295 300

<210>SEQ ID NO：6

<2ll>304

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<400>6

Met Ala His Tyr His Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe

1 5 10 15

Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Val Lys Val Leu His Ile Gln

20 25 30

Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gln

35 40 45

Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Val Tyr Gly Asp Asn Ser Asp

50 55 60

Ile Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val His Val Leu Ala Lys

65 70 75 80

Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Thr Phe Ala Met Asn Ile Cys Glu

85 90 95

His Phe Leu Ser Ser Phe Asn His Val Ile Arg Ala Gln Val Tyr Val

100 105 110

Glu Glu Val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val

115 120 125

His Ala Phe Ile His Asn Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu

130 135 140

Gln Met Arg Ser Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu

145 150 155 160

Lys Val Leu Lys Thr Thr Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp

165 170 175

Gln Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Lys

180 185 190

Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gln Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu

195 200 205

Ala Thr Trp Asp Thr Val Arg Asp Ile Val Leu Glu Lys Phe Ala Gly

210 215 220

Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Asp Ile Gln Val Leu Thr Leu Gly Gln Val Pro Ala Ile Glu Asp Met

245 250 255

Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys

260 265 270

Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro

275 280 285

Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu

290 295 300

<210>SEQ ID NO：7

<211>304

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<400>7

Met Ala His Tyr His Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe

1 5 10 15

Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Val Lys Val Leu His Ile Gln

20 25 30

Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gln

35 40 45

Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Val Tyr Gly Asp Asn Ser Asp

50 55 60

Ile Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val His Val Leu Ala Lys

65 70 75 80

Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Thr Phe Ala Met Asn Ile Cys Glu

85 90 95

His Phe Leu Ser Ser Phe Asn His Val Ile Arg Ala Gln Val Tyr Val

100 105 110

Glu Glu Val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val

115 120 125

His Ala Phe Ile His Asn Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu

130 135 140

Gln Met Arg Ser Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu

145 150 155 160

Lys Val Leu Lys Thr Thr Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp

165 170 175

Gln Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Lys

180 185 190

Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gln Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu

195 200 205

Ala Thr Trp Asp Thr Val Arg Asp Ile Val Leu Glu Lys Phe Ala Gly

210 215 220

Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Asp Ile Gln Val His Ser Leu Ser Arg Val Pro Glu Met Glu Asp Met

245 250 255

Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys

260 265 270

Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro

275 280 285

Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu

290 295 300

<210>SEQ ID NO：8

<211>304

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<400>8

Met Ala His Tyr His Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe

1 5 10 15

Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Val Lys Val Leu His Ile Gln

20 25 30

Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gln

35 40 45

Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Val Tyr Gly Asp Asn Ser Asp

50 55 60

Ile Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val His Val Leu Ala Lys

65 70 75 80

Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Thr Phe Ala Met Asn Ile Cys Glu

85 90 95

His Phe Leu Ser Ser Phe Asn His Val Ile Arg Ala Gln Val Tyr Val

100 105 110

Glu Glu Val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val

115 120 125

His Ala Phe Ile His Asn Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu

130 135 140

Gln Met Arg Ser Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu

145 150 155 160

Lys Val Leu Lys Thr Thr Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp

165 170 175

Gln Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Lys

180 185 190

Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gln Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu

195 200 205

Ala Thr Trp Asp Thr Val Arg Asp Ile Val Leu Glu Lys Phe Ala Gly

210 215 220

Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Asp Ile Gln Val Leu Thr Leu Gly Gln Val Pro Ala Ile Glu Asp Met

245 250 255

Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Leu Asn Ile Asp Met Ser Lys

260 265 270

Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro

275 280 285

Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu

290 295 300

<210>SEQ ID NO：9

<211>304

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<400>9

Met Ala His Tyr His Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe

1 5 10 15

Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Val Lys Val Leu His Ile Gln

20 25 30

Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gln

35 40 45

Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Val Tyr Gly Asp Asn Ser Asp

50 55 60

Ile Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val His Val Leu Ala Lys

65 70 75 80

Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Thr Phe Ala Met Asn Ile Cys Glu

85 90 95

His Phe Leu Ser Ser Phe Asn His Val Ile Arg Ala Gln Val Tyr Val

100 105 110

Glu Glu Val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val

115 120 125

His Ala Phe Ile His Asn Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu

130 135 140

Gln Met Arg Ser Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu

145 150 155 160

Lys Val Leu Lys Thr Thr Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp

165 170 175

Gln Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Lys

180 185 190

Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gln Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu

195 200 205

Ala Thr Trp Asp Thr Val Arg Asp Ile Val Leu Glu Lys Phe Ala Gly

210 215 220

Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Asp Ile Gln Val His Ser Leu Ser Arg Val Pro Glu Met Glu Asp Met

245 250 255

Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Leu Asn Ile Asp Met Ser Lys

260 265 270

Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro

275 280 285

Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu

290 295 300

<210>SEQ ID NO：10

<211>927

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<223>Synthetic Primer

<400>10

catatggccc attatcataa tgattataaa aaaaatgatg aagttgaatt tgttcgtacc 60

ggttatggta aagatatggt taaagttctg catattcagc gtgatggtaa atatcattct 120

attaaagaag ttgccacctc tgttcagctg accctgtctt ctaaaaaaga ttatgtttat 180

ggtgataatt ctgatattat tccaaccgat accattaaaa ataccgttca tgttctggcc 240

aaatttaaag gtattaaatc tattgaaacc tttgccatga atatttgtga acattttctg 300

tcttctttta atcatgttat tcgtgcccag gtttatgttg aagaagttcc atggaaacgt 360

tttgaaaaaa atggtgttaa acatgttcat gcctttattc ataatccaac cggtacccat 420

ttttgtgaag ttgaacagat gcgttctggt ccaccagtta ttcattctgg tattaaagat 480

ctgaaagttc tgaaaaccac ccagtctggt tttgaaggtt ttattaaaga tcagtttacc 540

accctgccag aagttaaaga tcgttgtttt gccaccaaag tttattgtaa atggcgttat 600

catcagggtc gtgatgttga ttttgaagcc acctgggata ccgttcgtga tattgttctg 660

gaaaaatttg ccggtcctta tgataaaggt gaatattctc catctgttca gaaaaccctg 720

tatgatattc aggttctgtc tctgtctcgt gttccagcca ttgaagatat ggaaatttct 780

ctgccaaata ttcattattt taatattgat atgtctaaaa tgggtctgat taataaagaa 840

gaagttctgc tgccactgga taatccttat ggtaaaatta ccggtaccgt taaacgtaaa 900

ctgtcttctc gtctgtgata aggatcc 927

<210>SEQ ID NO：11

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<223>Synthetic Primer

<400>11

cacgacatat ggcccattat cata 24

<210>SEQ ID NO：12

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<223>Synthetic Primer

<400>12

ggatccttat cacagacgag aa 22

<210>SEQ ID NO：13

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<223>Synthetic Primer

<400>13

accctgggtc aggttccaga aattgaagat atggaaatt 39

<210>SEQ ID NO：14

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<223>Synthetic Primer

<400>14

ttctggaacc tgacccaggg tcagaacctg aatatcata 39

<210>SEQ ID NO：15

<211>30

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<223>Synthetic Primer

<400>15

ttcattatct gaatattgat atgtctaaaa 30

<210>SEQ ID NO：16

<211>30

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<223>Synthetic Primer

<400>16

atcaatattc agataatgaa tatttggcag 30

Claims

1.一种人源化重组尿酸酶蛋白，其特征在于哺乳动物来源尿酸酶中含有部分人源尿酸酶氨基酸序列的嵌合蛋白及其突变体蛋白。

2.如权利要求1所述的嵌合蛋白，其特征在于：N端前240个氨基酸为哺乳动物来源尿酸酶蛋白第1-240位氨基酸，剩下的64个氨基酸为人源尿酸酶的第241-304位氨基酸。

3.如权利要求2所述的嵌合蛋白，其特征在于：所述的哺乳动物包括狗、猪、牛。

4.如权利要求3所述的嵌合蛋白，其特征在于：优选的哺乳动物为狗。

5.如权利要求1所述的嵌合蛋白突变体蛋白，其特征在于：将权利要求2所述的嵌合蛋白经一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有相同活性的突变蛋白。

6.如权利要求5所述的突变体蛋白，其特征在于它包含以下至少一种突变：

-第245位亮氨酸被组氨酸取代。

-第246位丝氨酸被苏氨酸取代。

-第248位丝氨酸被甘氨酸取代。

-第249位精氨酸被谷氨酰胺取代。

-第252位丙氨酸被谷氨酸取代。

-第253位异亮氨酸被甲硫氨酸取代。

-第266位苯丙氨酸被亮氨酸取代。

7.如权利要求5所述的突变体蛋白，其特征在于它选自下述具有2-5种突变的突变体蛋白，各突变用三联体表示：字母-数字-字母，其中的数字表示突变氨基酸的位置，数字前的字母对应突变设计的氨基酸，数字后的字母表示用于置换数字前氨基酸的氨基酸：

S246T-S248G-R249Q

L245H-A252E-I253M

S246T-S248G-R249Q-F266L

L245H-A252E-I253M-F266L

8.如权利要求5所述的突变体蛋白，其N端可截短1至7个氨基酸序列。

9.如权利要求5所述的突变体蛋白，其C端可截短1至3个氨基酸序列。

10.DNA分子，其特征在于，它编码权利要求1-8中任一项尿酸酶蛋白。

11.表达载体，其特征在于，它含有权利要求10中所述的DNA分子。

12.宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求11中所述的表达载体。

13.如权利要求12中所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包括大肠杆菌细胞、酵母细胞、CHO细胞。

14.产生权利要求1中所述的融合蛋白的方法，其特征在于，它包括步骤：

在权利要求12的宿主细胞中表达所述蛋白；分离、纯化所述蛋白。

15.药物组合物，其特征在于，包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂，以及有效剂量的权利要求1的蛋白。

16.如权利要求15中所述的药物组合物，其特征在于，用于治疗具有高尿酸血症及其引发的通风的病人。