CN104630168A - 一种重组人猪嵌合尿酸酶的构建和表达 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种有酶活的人猪嵌合尿酸酶蛋白,以及编码该嵌合蛋白的DNA序列,含该DNA序列的载体,含该载体的宿主细胞,用基因工程制备该嵌合蛋白的方法。本发明的嵌合蛋白既保留了哺乳动物来源尿酸酶活性,又增加了与人体尿酸酶的同源性,从而降低了人体适用的免疫原性。同时增强或改善了哺乳动物来源尿酸酶蛋白的理化性质,更适用于高尿酸血症及其引起的痛风的治疗。
Description
技术领域
本发明涉及含有部分人源尿酸酶氨基酸序列的哺乳动物猪来源尿酸酶的嵌合蛋白,编码该嵌合蛋白的DNA序列,含该DNA序列的载体,含该载体的宿主细胞,用于基因工程制备该蛋白的方法,属于生物技术领域。
背景技术
痛风和高尿酸血症是目前危害人类健康的常见疾病,据统计高尿酸血症的发病率已经达到了人群的10%。痛风是由于血尿酸水平过高而造成尿酸盐结晶在关节中沉积而导致的一种急性关节炎。目前控制痛风的药物主要是别嘌呤醇和丙磺舒类药物。由于这两类药物均需要长期服用,加之该类药物都有明显的肝肾毒性以及过敏反应,尤其是别嘌呤醇,可以引起严重的剥脱性皮炎,甚至可危害患者的生命。导致目前这类疾病的控制不理想,而造成患者痛风石的形成和肾功能的障碍。目前,高尿酸血症已被列为心血管疾病的独立风险因素。因此,寻找有效的治疗手段势在必行。
在动物体内,其尿酸的水平仅为人类的1/10。因此痛风和高尿酸血症也被认为是人类独有的疾病。动物体内尿酸水平低的原因是由于其体内存在有能够把尿酸进一步分解为极易溶解的尿囊素的尿酸酶。通过对比发现,人类的基因组中也存在尿酸酶基因,但是在人类进化的过程中,由于该基因的突变,造成其不能表达有功能的蛋白质,从而成为一个假基因。由此可见尿酸酶是治疗痛风与高尿酸血症的理想药物。
具有活性的尿酸酶是一四聚体蛋白,由相同的亚基组成,每个亚基分子量在34kD左右,由301-304个氨基酸组成。每个溶液中尿酸酶的酶活力最高的pH值为8.0(BayolAetal.Biophys Chem.1995.54:229-235)。在目前所知的所有来源的尿酸酶中,活性最高的来源于黄曲霉,达到27IU/mg;其次是来源于苛求芽胞杆菌,它的活性保持在13IU/mg(HuangS H,Wu T K.Eur J Biochem.2004.271:517-523.)。另外,来源于豆类植物的尿酸酶,其活性只有2-6IU/mg;来源于哺乳动物的尿酸酶,经过重组表达以后,猪的尿酸酶活性可以达到5IU/mg,狒狒的尿酸酶酶活性只有1IU/mg(Michael H,Susan J.K.2006.US7056713B1),而人源尿酸酶无活性。
作为人体应用,微生物尿酸酶的高活性和哺乳动物尿酸酶的低免疫原性,使得这两大来源的尿酸酶成了目前开发应用的重组尿酸酶的研究热点。但黄曲霉来源的尿酸酶与推测出的人源尿酸酶的同源性不足40%(Lee C C,Wu X,Gibbs RA,Cook R G,Muzny D M,CaskeyC T.Science.1988.239:1288-1291.),人体易产生抗尿酸酶抗体,黄曲霉尿酸酶的功效迅速减弱,同时引发严重过敏性反应,无法用于长期治疗。20多年前,黄曲霉尿酸酶(Uricozyme)在法国和意大利批准。本世纪初,基因重组的酵母菌尿酸酶(Rasburicase)在美国和欧盟或批准。由于这两种尿酸酶均来自于细菌,有很强的免疫原性,Uricozyme和Rasburicase出现严重过敏反应的比例达5%以上,并且还有近半数的患者出现发热,恶心呕吐等不良反应。
目前在美国用于临床的尿酸酶蛋白(Pegloticase)是经过PEG化修饰的猪和狒狒的重组尿酸酶嵌合蛋白,商品名为KRYSTEXXA。虽然该尿酸酶来源于哺乳动物(猪和狒狒),但由于与人类的差异造成的排异反应,加之PEG化的影响,其免疫原性仍然较强。每两周一次静脉注射KRYSTEXXA的患者中92%产生了抗pegloticase的抗体。42%的患者产生了抗PEG抗体。输液反应的发生率达到26%。尽管如此,美国FDA于2010年批准了该药上市。由此可见对该类药物有着巨大的市场需求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供了一种全新的有高活性的人猪嵌合尿酸酶,并在得到高活性尿酸酶的同时,降低了在人体中的免疫原性。通过一系列的研究证实,该种形式哺乳动物尿酸酶具有更高的体内稳定性,适合作为治疗高尿酸血症等相关疾病的药物。
本发明的其它目的是:提供与上述人猪嵌合尿酸氧化酶相关的编码基因、表达载体及宿主细胞。
发明详述
狗、猪、牛、羊等哺乳动物尿酸酶氨基酸与人源尿酸酶氨基酸同一性均在88%以上,活性区域高度一致。利用嵌合的方法,在具有酶活的哺乳动物尿酸酶氨基酸序列中,通过替换引入部分不影响酶催化活性的人源尿酸酶氨基酸序列,可达到既保留非人源哺乳动物尿酸酶活性,又增强与推导出的无活性人源尿酸酶同源性,从而实现降低人体中免疫原性的目的。
本发明人经过系统的研究,发现推导出的人源尿酸酶1号、7号、8号外显子氨基酸对尿酸酶活性无明显影响,将该序列与猪来源尿酸酶的1、7、8号外显子氨基酸替换后,形成的嵌合形式的人源化尿酸酶,其活性与猪来源尿酸酶相比无酶催化活性降低,但嵌合蛋白氨基酸序列与人源尿酸酶氨基酸序列同一性可以提高至90%以上,将具有降低引起免疫原性的风险。
需要说明的是,人尿酸氧化酶与猪尿酸氧化酶具有相同的外显子数目,均为八个外显子,共304个氨基酸(人尿酸氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,猪尿酸氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示),且每个外显子对应的氨基酸数目也一致,H1、H2、......、H8分别表示1至8号人尿酸氧化酶外显子;P1、P2、......、P8分别表示1至8号猪尿酸氧化酶外显子第1至10位氨基酸为1号外显子,第11至83位氨基酸为2号外显子,第84至122位氨基酸为3号外显子,第123至148位氨基酸为4号外显子,第149至211位氨基酸5号外显子,第212至252位氨基酸为6号外显子,第253至280位氨基酸为7号外显子,第281至305位氨基酸为8号外显子。
至此,本发明提供新型尿酸酶嵌合蛋白,它包括含有人源尿酸酶氨基酸序列和猪哺乳动物来源尿酸酶氨基酸序列组成的嵌合蛋白。
如本文所用,术语“人源尿酸酶氨基酸序列”指所述嵌合蛋白基因中第1、7、8号外显子氨基酸序列来源于人(SEQ ID No:1),术语“哺乳动物尿酸酶序列”指所述嵌合蛋白基因中第2、3、4、5、6号外显子氨基酸序列来源于猪(SEQ ID No:2)尿酸酶氨基酸序列。
在本发明的一个优选实施方案中,提供了一种重组人猪嵌合尿酸酶(代号H1P2-6H7-8),该嵌合蛋白基因(SEQ ID No:3)的1、7、8号外显子氨基酸为人源尿酸酶蛋白基因的1、7、8号外显子氨基酸,2、3、4、5、6号外显子氨基酸为猪源尿酸酶基因的2、3、4、5、6号外显子氨基酸,该序列与人源尿酸酶蛋白氨基酸序列(SEQ ID No:1)同一性达到90.5%,同时催化活性为猪源尿酸酶蛋白的102%。
本发明也包括RNA形式或DNA形式的编码上述嵌合蛋白的多核苷酸形式,其中DNA包括cDNA、基因组DNA以及人工合成DNA。DNA可以为双链或单链。编码本发明嵌合蛋白的编码序列可由冗余或遗传密码的兼并而有所不同。
本发明的编码上述嵌合蛋白的多核苷酸序列可用本领域技术人员熟知的DNA重组、PCR等各种技术来获得,但不局限于本发明较佳实施方案中采用的两轮重叠延伸延伸PCR法。
编码本发明嵌合蛋白的多核苷酸可包括以下:仅该嵌合蛋白的编码序列、嵌合蛋白编码序列及额外的编码序列(如前导或分泌序列或前蛋白质序列);嵌合蛋白的编码序列及非编码序列(如内含子)。因此,术语“编码嵌合蛋白的多核苷酸”所指的多核苷酸可能不仅含有嵌合蛋白的编码序列,还含有包括额外编码序列和/或非编码序列的多核苷酸。
将本发明的多核苷酸与相应表达载体进行有效连接后,转化或转导入宿主细胞中表达。上述载体可以以附加体或整合到宿主染色体的形式在宿主生物中进行复制。在适当的启动子控制下,尿酸酶嵌合蛋白可以在哺乳动物细胞、昆虫、酵母、细菌或其它细胞中表达。优选的,选择大肠杆菌克隆本发明的多核苷酸。其他适用的微生物宿主包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilus)、沙雷氏菌属(Serratia)、假单胞菌属(Pseudomonas)和葡萄球菌属(Staphylococcus)等。也可以在这些原核宿主中制备表达载体,还可能具有众多公知启动子中的任一种,如乳糖启动子系统、色氨酸启动子系统、β内酰胺酶启动子系统或噬菌体λ或T7来源的启动子系统。通常这些启动子会控制表达,且具有核糖体结合位点序列等,以便起始和完成转录及翻译。
酵母或真菌等的其他微生物也可用于表达。优选的酵母宿主为毕赤酵母(Pichiapastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)以及嗜甲醇毕赤酵母(Pichia angusta)。真菌宿主包括黑曲霉(Aspergillus niger)、里氏木霉(Trichoderma reesei)及裂褶菌(Schizophyllumcommune),但也可选择使用其他真菌。
哺乳动物细胞培养也可用于表达生产本发明的蛋白。优选的细胞包括:CHO细胞系、多种COS细胞系、NSO细胞、叙利亚地鼠(Syrian Hamster)卵巢细胞系、Hela细胞或人胎肾细胞系(即HEK293、HEK293EBNA)。
可以通过公知的方法将含有目的多核苷酸序列(如尿酸酶嵌合蛋白及表达控制序列)的载体转移到宿主细胞内,所采用的方法取决于细胞宿主的类型。例如,对原核细胞通常采用氯化钙转染法,而对于其他细胞宿主可以使用磷酸钙处理或电穿孔法。
如前获得的本发明重组尿酸酶嵌合蛋白可以从宿主细胞内部或外部(如培养基)分离得到,且纯化为高纯度的均一蛋白。此种蛋白分离纯化的方法不限于任何特定方法。事实上,可用任何本领域已公知的方法,例如柱层析法、过滤法、超滤法、盐析法、等电点沉淀法、透析法等。对于层析,例如亲和层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析、反相层析、吸附层析等都可以应用。这些层析可用液相层析如HPLC和FPLC来操作。可用通用的蛋白检测方法检测蛋白浓度和纯度,例如HPLC法、SDS-聚丙烯酰胺电泳法、等电点电泳法、BCA法、Lowry法、Western Blot法等。因此,本发明可提供高纯度重组的尿酸酶嵌合蛋白。
至此已对本发明进行了详细描述,参照以下实例能够对之有更清楚的理解,所述实例仅为说明目的而并不旨在对本发明进行限制。
附图说明
图1:人、猪尿酸氧化酶基因琼脂糖凝胶电泳图。图中M为DNA分子质量标准Marker II;泳道1为猪尿酸酶全长基因(936bp);泳道2为人尿酸酶全长基因(936bp)
图2:人猪嵌合尿酸酶蛋白H1P2-6H7-8外显子片段与全长的琼脂糖凝胶电泳图。图中1,泳道1为H1P2-6外显子片段(780bp),泳道2为H7-8外显子片段(193bp);图中2为人猪嵌合尿酸酶蛋白H1P2-6H7-8全长基因片段(936bp)
具体实施方式
实例1重组人猪嵌合尿酸酶蛋白H1P2-6H7-8的构建
获得质粒模板:接种分别含有人尿酸氧化酶基因和猪尿酸氧化酶基因大肠杆菌工程菌甘油管,接种量为1%,过夜培养,提取质粒。
获得H1P2-6H7-8DNA:第一阶段PCR:模板序列为pET-22b(+)-PU,引物为引物1(与人的1号外显子氨基酸序列一致)和引物3,PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃1min 30s,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终获得产物H1P2-6片段;第二阶段PCR:模板序列为pET-22b(+)-HU,引物为引物4和引物2,PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃30s,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终获得H7-8片段;第三阶段PCR:模板为P1-6片段、H7-8片段1∶1的混合液,引物为引物1和引物4,PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃2min,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终获得产物H1P2-6H7-8DNA片段。各引物序列如下。
各实施例所用引物序列
实例2重组人猪嵌合尿酸酶蛋白在大肠杆菌BL21中重组表达
将H1P2-6H7-8DNA片段和pET-22b(+)同时使用Nde I和Hind III进行双酶切,回收酶切片段,使用T4DNA连接酶连接两个酶切片段,使用《分子克隆》(卢圣栋编)中所述的标准方法将连接混合物转入大肠杆菌表达宿主菌BL21。
在含有AMP抗性的LB平板上进行转化反应,经过12-16h小时的生长,挑取单克隆转化菌落,在AMP+的LB液体培养基过夜培养,进行菌落PCR初步筛选出阳性克隆,经测序确定含有H1P2-6H7-8DNADNA的阳性重组质粒中的尿酸氧化酶序列与理论完全一致。
使用大肠杆菌BL21(DE3)、BL21Star(DE3)或BL21Star(DE3)plysS、表达UHC嵌合蛋白。这些菌株仅是许多适用于表达嵌合蛋白中的一些,它们可以分别通过商业渠道自Novagen,Invitrogen及Stratagen获得。利用转化体在含有AMP的LB平板上的生长能力可将其鉴别出来。
将上述经过测序正确的BL21表达重组菌,按照1%的甘油管接种量接入LB培养基装液量为30ml的250ml的三角瓶中,且培养基中含有100μg/ml的AMP。37℃,220rpm摇床中培养至OD600约为1.7时,加入终浓度为0.2μM的IPTG进行尿酸氧化酶的诱导表达,诱导6h后收集菌体,离心得到湿菌体,并以SDS-PAGE监测。
将培养的发酵液4000rpm、20min离心,收集菌体,菌体再用pH8.6的0.05MTris-Hcl缓冲液铵1g菌体10ml体积的比例重悬,离心,洗涤两遍。取菌体,每1g菌体补入10ml缓冲液(pH8.6Tris-Hcl)悬浮菌体,搅拌均匀于-20℃冰柜中静置过夜,然后37℃水浴中迅速解冻,如此反复反复冻融4次。将上述破菌悬液融化后,超声(功率60%、40min、超5s、间隙5s),注意超声破壁时温度保持在10度以下;待破菌完全后,8000r/min,4℃离心30min,分别取上清、沉淀进行SDS-PAGE电泳分析和酶活性测定。
实例3重组人猪嵌合尿酸酶蛋白活性检测
尿酸氧化酶的活性测定:尿酸氧化酶催化尿酸降解,尿酸在293nm处具有特征吸收峰,但是尿酸降解后的产物在此波长无吸收峰,因此可以根据293nm处吸光值的减少量来确定尿酸被尿酸氧化酶降解的量,然后使用尿酸的摩尔消光系数算出尿酸浓度,根据尿酸浓度的变化可以计算出尿酸氧化酶的活性。将紫外分光光度计波长调至293nm处,预热30min,使用硼酸-硼酸钠缓冲液作为空白调零,取3ml于37℃预热30min的60uM的尿酸溶液加入石英比色皿中,补加0.5ml的上述粗酶液快速混匀,开始计时,每1min记一次吸光值读数,测量5min内293nm吸光度的变化值。
在37℃、pH8.5时,每分钟转化1μmol尿酸为尿囊素的酶量定义为一个国际单位(IU)。按照如下公式计算尿酸酶活性。
上式中:U=尿酸酶活力单位;A0为反应初始时的OD293吸光值,A为反应5min后OD293的吸光值;Vt=反应液总体积(ml);df=稀释倍数;12.6为尿酸在293nm波长下的微摩尔消光系数;Ve=酶液体积(ml)。
尿酸酶蛋白分离纯化后比活计算
尿酸酶蛋白 | 酶比活(IU/mg) |
猪尿酸酶 | 4.53 |
重组人猪嵌合尿酸酶 | 5.03 |
尿酸酶蛋白体外热稳定性检测
将1mg/ml的猪尿酸酶蛋白、重组人猪嵌合尿酸酶蛋白30度放置5天,取出测量酶活,比较酶活保留率。
尿酸酶蛋白 | 酶活保留率 |
猪尿酸酶 | 95.15% |
人猪嵌合尿酸酶 | 98.69% |
结果显示,重组人猪嵌合尿酸酶蛋白酶比活和热稳定性都比哺乳动物猪尿酸酶较高。
Claims (8)
1.一种重组人猪嵌合尿酸酶蛋白,其特征在于哺乳动物猪来源的尿酸酶中含有部分人来源的尿酸酶氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的重组人猪嵌合尿酸酶蛋白,其特征在于:猪尿酸酶蛋白基因的1号外显子被人尿酸酶蛋白基因的1号外显子替换。
3.如权利要求2所述的重组人猪嵌合尿酸酶蛋白,其特征在于:猪尿酸酶蛋白基因的7号外显子被人尿酸酶蛋白基因的7号外显子替换。
4.如权利要求3所述的重组人猪嵌合尿酸酶蛋白,其特征在于:猪尿酸酶蛋白基因的8号外显子被人尿酸酶蛋白基因的8号外显子替换。
5.DNA分子,其特征在于:它编码权利要求4中的重组人猪嵌合尿酸酶蛋白。
6.表达载体,其特征在于:它含有权利要求5中所述的DNA分子。
7.宿主细胞,其特征在于:它含有权利要求6中所述的表达载体,其中所述宿主细胞包括大肠杆菌细胞、酵母细胞、CHO细胞。
8.如权利要求1中所述的重组人猪嵌合尿酸酶蛋白,其特征在于:它具有高的尿酸酶活性。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105062987A (zh) * | 2015-09-01 | 2015-11-18 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白及其制备方法 |
CN109223707A (zh) * | 2018-09-13 | 2019-01-18 | 中国药科大学 | 一种尿酸酶外用凝胶制剂、其制备方法及用途 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102051348A (zh) * | 2009-10-27 | 2011-05-11 | 重庆富进生物医药有限公司 | 人源化重组尿酸酶及其突变体 |
CN103173471A (zh) * | 2013-01-21 | 2013-06-26 | 吉林修正药业新药开发有限公司 | 一种重组尿酸氧化酶的高效分泌表达及纯化方法 |
-
2015
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102051348A (zh) * | 2009-10-27 | 2011-05-11 | 重庆富进生物医药有限公司 | 人源化重组尿酸酶及其突变体 |
CN103173471A (zh) * | 2013-01-21 | 2013-06-26 | 吉林修正药业新药开发有限公司 | 一种重组尿酸氧化酶的高效分泌表达及纯化方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
薛璟: "人尿酸氧化酶1-2号外显子的替换及重组蛋白的表达", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105062987A (zh) * | 2015-09-01 | 2015-11-18 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白及其制备方法 |
CN105062987B (zh) * | 2015-09-01 | 2018-09-25 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白及其制备方法 |
CN109223707A (zh) * | 2018-09-13 | 2019-01-18 | 中国药科大学 | 一种尿酸酶外用凝胶制剂、其制备方法及用途 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20150520 |