SI21272A - Sintetski gen za humani granulocitne kolonije stimulirajoči dejavnik za ekspresijo v E. coli - Google Patents

Sintetski gen za humani granulocitne kolonije stimulirajoči dejavnik za ekspresijo v E. coli Download PDF

Info

Publication number
SI21272A
SI21272A SI200200188A SI200200188A SI21272A SI 21272 A SI21272 A SI 21272A SI 200200188 A SI200200188 A SI 200200188A SI 200200188 A SI200200188 A SI 200200188A SI 21272 A SI21272 A SI 21272A
Authority
SI
Slovenia
Prior art keywords
expression
coli
csf
gene
dna sequence
Prior art date
Application number
SI200200188A
Other languages
English (en)
Inventor
Simona Jev�evar
Viktor Menart
Original Assignee
LEK farmacevtska dru�ba d.d.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by LEK farmacevtska dru�ba d.d. filed Critical LEK farmacevtska dru�ba d.d.
Priority to SI200200188A priority Critical patent/SI21272A/sl
Priority to AU2003253344A priority patent/AU2003253344A1/en
Priority to JP2005506069A priority patent/JP4445466B2/ja
Priority to EP03766320A priority patent/EP1527095A1/en
Priority to US10/522,827 priority patent/US7655437B2/en
Priority to PCT/EP2003/008308 priority patent/WO2004013175A1/en
Priority to AR20030102715A priority patent/AR040521A1/es
Publication of SI21272A publication Critical patent/SI21272A/sl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Izum se nanaša na sintetski gen za hG-CSF, ki omogoča ekspresijo v E.coli z nivojem ekspresije več kot 52% rekombinantnega hG-CSF glede na celotne proteine po ekspresiji.ŕ

Description

Sintetski gen za humani granulocitne kolonije stimulirajoči dejavnik za ekspresijo v E. coli
Področje tehnike
Predloženi izum se nanaša na sintetski gen za humani granulocitne kolonije stimulirajoči dejavnik (hG-CSF), ki omogoča ekspresijo v E. coli z nivojem ekspresije, ki je enak ali višji od 52% rekombinantnega hG-CSF glede na celotne proteine po ekspresiji.
hG-CSF uvrščamo med kolonije stimulirajoče dejavnike, ki regulirajo diferenciacijo in proliferacijo hematopoetskih celic sesalcev. Imajo odločilno vlogo pri tvorbi nevtrofilcev, zato so primerni za uporabo v medicini na področju hematologije in onkologije.
Za klinično uporabo sta danes na trgu dve obliki: lenograstim, ki je glikoziliran, in ga pridobivajo z ekspresijo v sesalski celični liniji, ter filgrastim, ki je neglikoziliran, in ga pridobivajo z ekspresijo v bakteriji Escherichia coli (E. coli).
Bistvo predloženega izuma
Bistvo predloženega izuma je, da je mogoče s sintetskim genom, ki kodira za hG-CSF, doseči nivo ekspresije (akumulacijo) v E. coli, ki je enak ali višji od 52% rekombinantnega hG-CSF glede na celotne proteine v E. coli. Pri ekspresiji se uporabi ekspresijski plazmid z močnim T7 promotorjem. Sintetski gen za hG-CSF se pripravi s kompleksno kombinacijo dveh postopkov, ki omogočata pripravo optimiziranega sintetskega gena za hG-CSF za ekspresijo v E. cofi. Prvi postopek je ta, da se na nekaterih mestih zamenja neugodne kodone za ekspresijo v E. coli z bolj ugodnimi kodoni za E. coli. Drugi pa, da se na nekaterih mestih zamenja GC bogate regije z AT bogatimi regijami. Na nekaterih mestih se sintetski gen za G-CSF, ki je predmet izuma, pripravi tako, da se uporabi ena od obeh metod, na nekaterih mestih kombinacija obeh navedenih metod, nekatera mesta se pa ne spremenijo. Pri pripravi sintetskega gena za hG-CSF, ki je tudi predmet izuma, ne spreminjamo regij, ki so izven kodirajočega področja. Tako ne uvajamo sprememb v področju iniciacije translacije (TIR), v področju vezavnega mesta za ribosom (RBS) in v področju razdalje med start kodonom in RBS.
Stanje tehnike
Vpliv več zaporednih neugodnih kodonov, kot so argininiski (AGG/AGA; CGA), leucinski (CTA), izoleucinski (ATA) ali prolinski (CCC), na uspešnost translacije in s tem zmanjšanje količine ali kvalitete nastalega proteina izraženega v E coli, je opisan v Kane JF, Current Opinion in Biotechnology, 6:494-500 (1995). Podoben je vpliv posameznih neugodnih kodonov, če se pojavljajo na različnih mestih.
Vpliv na uspešnost translacije v E. coli imajo tudi GC bogate regije, če pride zaradi njih pri sekundarni strukturi mRNA do nastanka stabilne dvoverižne RNA. Vpliv je največji, kadar so GC bogate regije mRNA na mestu, kjer se veže ribosom, v neposredni bližini vezave ribosoma ali v neposredni bližini start kodona (Makrides SC, Microbiological Reviews, 60:512-538 (1996); Baneyx F, Current Opinion in Biotechnology, 10:411-421 (1999)). Znanih je več metod ocenjevanja sekundarne strukture in izračunavanja minimalne proste energije posamezne RNA molekule, kar naj bi bilo osnovno merilo za najbolj stabilno oziroma najbolj verjetno strukturo (SantaLucia J Jr in Turner DH, Biopolymers, 44:309-319 (1997)). Zanesljivi algoritmi za napoved prave sekundarne strukture, razen v nekaterih primerih še niso poznani; prav tako še ni možno dokazati kvantitativne relacije z nivojem ekspresije (Šmit MH in van Duin JJ. Mol. Biol., 244, 144-150 (1994)). Trodimenzionalnih struktur proteinov tudi še ni možno predvideti (Tinoco I in Bustamante C, J. Mol. biol, 293:271-281 (1999)).
Povečanje nivoja ekspresije z optimizacijo DNA zaporedja v TIR, RBS in razdalje med start kodonom in mestom RBS je opisano v McCarthy JEG in Brimacombe R, Trends Genet 10:402-407 (1994). Vzrok za povečanje nivoja ekspresije v tem primeru je bolj učinkovit pričetek translacije in tekočega nadaljevanja v kodirajoče področje mRNA.
Pridobitev dovolj velikih količin hG-CSF za in vitro biološke študije z ekspresijo v E. coli je opisana v Souza LM et al, Science 232:61-65 (1986) in v Zsebo KM et al, lmmunobiology 172:175-184 (1986). Dosežen nivo ekspresije hG-CSF je bil manjši od 1%.
V patentu US4810643 je opisana uporaba sintetskega gena za hG-CSF, ki je bil skonstruiran predvsem na osnovi zamenjave neugodnih kodonov s kodoni, ki so za E. coli optimalni. V kombinaciji s termoinducibilnim promotorjem iz lambda faga je bil dosežen nivo ekspresije hG-CSF od 3 do 5% glede na celotne celične proteine, kar ne omogoča ekonomične proizvodnje v industrijskem merilu.
8-10% akumulacijo hG-CSF glede na celotne celične proteine so dosegli s spremembo prvih štirih kodonov v 5' področju gena za hG-CSF, kot je opisano v VVingfield P et al, Biochem. J, 256:213-218 (1988).
Ekspresija hG-CSF v E. coli z izkoristkom do 17% hG-CSF glede na celotne bakterijske proteine je opisana v Devlin PE et al, Gene 65:13-22 (1988). Tak izkoristek so dosegli z delno optimizacijo DNA zaporedja na 5’ koncu gena (kodoni za prve štiri aminokisline), pri čemer so spremenili GC v AT bogato regijo in z uporabo relativno močnega promotorja iz faga lambda in optimizacije DNA zaporedja na 5' koncu gena (kodoni za prve štiri aminokisline). Nivo ekspresije ni zelo visok, kar prispeva k slabšim izkoristkom pridobivanja in manjšo ekonomičnost v industrijskem merilu.
Uporaba sintetskega gena in okoli 30% ekspresija sta opisani v Kang SH et al, Biotechnology letters, 17(7):687-692 (1995). Ta nivo so dosegli z uvedbo za E. coli ugodnih kodonov, z modifikacijami v TIR in z dodatnimi modifikacijami setov kodonov, pri tem da niso bistveno spreminjali 3' konca gena. Za dosego navedenega nivoja ekspresije so bile potrebne spremembe gena za hG-CSF tudi v TIR, pri tem da nivo ekspresije ni presegel 30%.
V patentu US5840543 je opisan sintetski gen za hG-CSF, ki je bil skonstruiran z uvajanjem AT bogatih regij na 5' konec gena in z zamenjavo neugodnih kodonov s kodoni, ugodnimi za E. coli. Pod kontrolo Trp promotorja so dosegli ekspresijo z izkoristkom 11 % hG-CSF glede na celotne celične proteine. Z dodatkom leucina in treonina ali njune kombinacije v fermentacijski medij, v katerem so bakterije gojene, pa so dosegli do 35% akumulacijo hG-CSF glede na celotne celične proteine. Nivo ekspresije so v tem primeru povečali z dodajanjem aminokislin v fermentacijski medij, kar predstavlja dodatni strošek v postopku pridobivanja hG-CSF in ni ekonomično v industrijskem merilu. Zgolj optimizacija gena za hG-CSF pa ni omogočala večjega nivoja ekpresije hG-CSF.
Do sedaj najvišja akumulacija hG-CSF glede na celotne celične proteine je opisana v Jeong et al, Protein Expression and Purification 23,:311-318 (2001) in je 48%. Dosegli so jo z spremembno N-terminalnega dela gena in z indukcijo z 1 mM IPTG.
V splošnem ne obstajajo zapisi, da bi bilo mogoče predvideti, kakšen bo nivo ekspresije nativnih humanih genov v prokariotskih organizmih, kot je npr. bakterija E. cofi. Opisani nivoji ekspresije so relativno nizki ali celo komaj zaznavni tudi pri uporabi ekspresijskih plazmidov z močnimi promotorji, kot je npr. promotor iz lambda ali T7 faga. Iz literature sledi, da na visoko akumulacijo humanega proteina v E. cofi vpliva mnogo parametrov (neugodni kodoni ali njihovo klastriranje; področja z velikim številom GC baznih parov, neugodne sekundarne strukture mRNA, nestabilna mRNA).
Zaenkrat ni nobenega povsem izdelanega pravila, kako kombinirati kodone, da bo imela rezultirajoča mRNA za ekspresijo optimalno sekundarno in terciarno strukturo. Matematični in strukturni modeli za napoved in termodinamsko stabilnost sekundarnih struktur so sicer dostopni, vendar še preveč nezanesljivi že pri sekundarnih strukturah, pri terciarnih pa jih sploh še ni. Ti trenutno izdelani modeli torej ne omogočajo napovedi, kakšen je vpliv različnih kombinacij kodonov na ekspresijo.
Ne v patentni ne v strokovni literaturi ni opisanih učinkovitejših načinov za rešitev problema nizkega nivoja ekspresije nalivnega gena za hG-CSF v E. coli.
Opis izuma
Ugotovili smo, da lahko problem nizkega nivoja ekspresije nativnega gena za hG-CSF v E. coli rešimo s pomočjo optimizacije nativnega gena za hG-CSF in s tem pripravo sintetskega gena za G-CSF. V primerjavi z do sedaj znanimi podatki na ta način presenetljivo dobimo bistveno višji nivo ekspresije.
Z izrazom 'hG-CSF' je mišljen humani granulocitne kolonije stimulirajoči dejavnik, ki zajema tudi rekombinantni hG-CSF, ki ga dobimo z ekspresijo v E. cofi.
Sintetski gen za hG-CSF, ki je predmet izuma, smo pripravili tako, da smo spremenili nukleotidno zaporedje gena za nativni hG-CSF, pri čemer se aminokislinsko zaporedje ni spremenilo in je ostalo identično nativnemu hG-CSF.
Predloženi izum nadalje zajema ekspresijo na tak način pridobljenega sintetskega gena v E. coli in nivo ekspresije na tak način pridobljenega sintetskega gena.
Z izrazom 'nivo ekspresije’ je mišljen delež hG-CSF, ki ga dobimo po heterologni ekspresiji gena za hG-CSF v E. coli, glede na celotne proteine, ki so prisotni po ekspresiji.
Z izrazom 'heterologna ekspresija' je mišljena ekspresija tistih genov, ki so tuji organizmu, v katerem poteka ekspresija.
Z izrazom 'homologna ekspresija' je mišljena ekspresija tistih genov, ki so lastni organizmu, v katerem poteka ekspresija.
Z izrazom 'ugodni kodoni' so mišljeni tisti kodoni, ki jih določen organizem (npr. E. coli) uporablja za produkcijo največ mRNA molekul. Te kod o ne organizem uporablja za gene z visoko homologno ekspresijo.
Z izrazom 'neugodni kodoni’ so mišljeni tisti kodoni, ki jih določen organizem (npr. E. coli) uporablja le za gene z nizko ekspresijo. Ti kodoni so v določenem organizmu redko uporabljeni (nizka homologna ekspresija).
Z izrazom 'GC bogate regije' so mišljena tista področja v genu, v katerih prevladujeta bazi gvanin (G) in citozin (C).
Z izrazom 'AT bogate regije' so mišljena tista področja v genu, v katerih prevladujeta bazi adenin (A) in timin (T).
Z izrazom 'sintetski gen' je mišljen gen, ki se od nativnega razlikuje po DNA zaporedju, aminokislinsko zaporedje pa ostane nespremenjeno. Pridobljen je s tehnikami rekombinantne tehnologije DNA.
Z izrazom 'nativni gen' je mišljen gen, ki ni spremenjen s tehnikami rekombinantne DNA tehnologije.
Z izrazom 'segment' so mišljeni posamezni deli gena, ki so na obeh straneh omejeni z enojnimi restrikcijskimi mesti, katera služijo za subkloniranje sintetsko pripravljenih delov gena.
Z izrazom 'segment I' je mišljen 5' konec gena za hG-CSF med restrikcijskima mestoma Nde I (3) in Sac I (194), t.j. 191 bp dolgo zaporedje, ki je bilo sintetizirano na novo.
Z izrazom 'segment II' je mišljen del gena za hG-CSF med restrikcijskima mestoma Sac I (194) in Apa I (309), t.j. 115 bp dolg osrednji dela gena, ki je bil sintetiziran na novo.
Z izrazom 'segment III' je mišljen del gena za hG-CSF med restrikcijskima mestoma Apa I (309) in Nhe I (467), t.j. 158 bp dolg dela gena, kjer je z izjemo Arg148 in Gly150 ohranjeno nativno DNA zaporedje za hG-CSF.
Z izrazom 'segment IV' je mišljen 3' konec gena za hG-CSF med restrikcijskima mestoma Nhe I (467) in BamH I (536), tj. 69 bp dolg končni del gena, ki je bil sintetiziran na novo.
Sintetski gen za hG-CSF, ki je predmet izuma, je pripravljen s kombinacijo naslednjih metod:
• zamenjavo za E coli neugodnih kodonov s kodoni, ki so za E coli ugodni: v segmentu II (med restrikcijskima mestoma Sac I (194) in Apa I (309)) in segmentu IV (med restrikcijskima mestoma Nhe I (467) in BamH 1(536)) • zamenjavo nekaterih GC bogatih regij z AT bogatimi regijami, s tem, da odpravimo tudi za E coli najbolj neugodne kodone, pri tem pa večinoma ne uporabimo za E coli najbolj optimalnih kodonov: v segmentu I (med restrikcijskima mestoma Nde I (3) in Sac I (194)).
• popolnoma nespremenjenega nativnega zaporedja 46 kodonov (med Pro102 in Arg147) znotraj segmenta III.
• odpravo dveh za E. coli neugodnih kodonov (Arg148 in Gly150) na koncu segmenta III.
Optimizacija gena za hG-CSF, ki je predmet izuma, ne vključuje sprememb področij TIR, področij RBS ter področij v razdalji med start kodonom in RBS.
Sintetski gen za hG-CSF, ki je predmet izuma, omogoča, da se ob ekpresiji pridobljenega sintetskega gena za hG-CSF doseže nivo ekspresije hG-CSF v E coli, ki je enak alt višji od 52%, omogočeno je tudi doseganje nivoja ekspresije okoli 55% ali celo okoli 60%. Visok nivo ekspresije sintetskega gena za hG-CSF, ki je predmet izuma, omogoča visoke izkoristke pri pridobivanju hG-CSF, hitrejšo in bolj enostavno čiščenje in izolacijo heterolognega hG-CSF, lažjo medprocesno kontrolo, boljšo ekonomičnost celotnega procesa in s tem omogoča učinkovito pridobivanje hG-CSF v industrijskem merilu. Tako pridobljen hG-CSF je primeren za klinično uporabo v medicini.
Priprava sintetskega gena za hG-CSF, ki je predmet izuma, se prične s predpripravo nativnega gena za hG-CSF in plazmidov. Gen za nativni hG-CSF je lahko humanega izvora, prav tako lahko uporabimo isti princip za vse gene, ki so homologni v tistih regijah, ki vsebujejo enojna restrikcijska mesta, katera uporabimo za subkloniranje na novo sintetiziranih segmentov gena. Plazmid za izvedbo mutageneze je bil izbran tako, da je omogočal zaporedno uvajanje točkovnih mutacij. Selekcija oziroma bistvena obogatitev plazmidov z želeno mutacijo je bila dosežena s hkratno spremembo restrikcijskega mesta, in sicer iz EcoRI v EcoRV aii obratno (Transformer™ Site-Directed Mutagenesis Kit (Clontech)). Gen in plazmid se pripravita tako, da je omogočeno tudi uvajanje mutacij s kasetno mutagenezo.
Po predpripravi nativnega gena za hG-CSF in plazmidov se izvede optimizacija nativnega gena za hG-CSF in s tem priprava sintetskega gena za hGCSF. Optimizacija se prične tako, da se gen za nativni hG-CSF razdeli v štiri (I, II, lil in IV) segmente, ki so ali bodo po izvedbi oligonukleotidne mutageneze ločeni z enojnimi restrikcijskimi mesti, in se v posameznih segmentih izvede spremembe. V posameznih segmentih se izvede spremembe zaporedja gena, v določenih segmentih se pa gena ne spreminja (Slika 1). Prednostno je tako pridobljen končni optimiran sintetski gen za hG-CSF sestavljen iz delno ohranjenega nativnega zaporedja (segment III) ter 5' in 3' kodirajočih področij, ki so sintetizirana na novo (segmenti I, II in IV).
Spremembe po posameznih segmentih:
Segment I: Zamenjava za E. coli neugodnih kodonov z E. coli ugodnimi kodoni ter zamenjava GC bogatih regij z AT bogatimi regijami
Thr2 (ACC->ACA), Pro3 (CCC^CCA), Gly5 (GGC-»GGT) Pro6 (CCT^CCA), Ala7 (GCC^GCT), Ser8 (AGC^TCT), Ser9 (TCC->TCT), Pro11 (CCC->CCG), Gln12 (CAG->CAA), Phe14 (TTC->TTT), Leu16 (CTC->TTG), Lys17 (AAG ->AAA), Cys18 (TGC-»TGT), Glu20 (GAG->GAA), Val22 (GTG ->GTT), Arg23 (AGG->CGT), Lys24 (AAG-»AAA) Ile25 (ATC->ATT), Gln26 (CAG-»CAA), Gly27 (GGC^GGT), Gly29 (GGC^GGT), Ala31 (GCG->GCT), Leu32 (CTC^TTA), Gln33 (CAG->CAA), Glu34 (GAG^GAA), Lys35 (AAG -^AAA), Ala38 (GCC-»GCA), Thr39 (ACC~>ACT), Tyr40 (TAC^TAT), Lys41 (AAG->AAA), Cys43 (TGC-»TGT), His44 (CAC->CAT), Pro45 (CCC-^CCA), Glu46 (GAG->GAA), Glu47 (GAG-»GAA), Val49 (GTG-»GTT), Leu51 (CTC->TTA), Gly52 (GGA^GGT), His53 (CAC->CAT), Gly56 (GGC-»GGT), Ile57 (ATC->ATT), Pro58 (CCC^CCG), Pro61 (CCC->CCT)
Segment il: Zamenjava za E. coli neugodnih kodonov z E. coli ugodnimi kodoni Cys65 (TGC^TGT), Pro66(CCC->CCG), Ala69 (GCC->GCG), Leu76 (TTG-»CTG), Leu79 (CTC-»CTG), Gly82 (GGC^GGT), Leu83 (CTT->CTG), Phe84 (TTC->TTT), Leu85 (CTC^CTG), Tyr86 (TAC^TAT), Gly88 (GGG^GGT), Leu89 (CTC->CTG), Ala92 (GCC^GCG), Gly95 (GGG^GGC), Ile96 (ATA^ATT), Pro98 (CCC->CCG), Glu99 (GAG-»GAA), Leu 100 (TTG->CTG), Gly101 (GGT-^GGG)
Segment III: Zamenjava dveh za E. coli neugodnih kodonov tik pred restrikcijskim mestom Nhel
Arg 148 (CGG ->CGT), Gly150 (GGA^GGT)
Segment IV: Zamenjava dolgega klastra za E. coli neugodnih kodonov ob koncu gena z za E. coli ugodnimi kodoni
Gln159 (CAG^CAA), Ser160 (AGC-»TCT), Phe161 (TTC^TTT), Glu163 (GAG->GAA), Val164 (GTG->GTT), Ser165 (TCG->AGC), Tyr166 (TAC^TAT), Arg167 (CGC^CGT), Leu169 (CTA->CTG), Arg170 (CGC->CGT), His171 (CAC-»CAT), Leu172 (CTT^CTG), Ala173 (GCG->GCT), Pro175 (CCC->CCG)
Po pripravi sintetskega gena za hG-CSF se optimiran sintetski gen subklonira v končni plazmidni vektor, ki je izbran iz skupine pET vektorjev (Novagen), ki vsebujejo močan T7 promotor. Prednostno se uporabi plazmidni vektor pET3a. Ekspresijski plazmid, ki ob tem nastane, se nato transformira v produkcijski sev, ki je izbran iz skupine sevov, ki nosijo v kromosomu zapis za T7 RNA polimerazo, prednostno v E. cofi BL21 (DE3).
Postopek se nadaljuje s pripravo inokuluma in fermentacijo. Fermentacijo se izvaja pri 37°C, prednostno pri 25°C.
Akumuliran heterologni hG-CSF se izloča v inkluzijskih telescih in je primeren za renaturacijo in za uporabo v izolacijskih postopkih.
Opis slik:
Slika 1: Shema stopenj optimizacije gena za hG-CSF
Slika 2: a) DNA zaporedje nativnega gena za hG-CSF (GenBank: NM_000759)
b) DNA zaporedje optimiranega (Fopt5) gena za hG-CSF. Poudarjeno so izpisane baze, ki se razlikujejo od nativnega gena
Slika 3: a) SDS-PAGE (4 % zgoščevalni, 15 % ločitveni; barvano s Coomassie brilliant blue) vzorcev proteinov neinducirane in inducirane kulture produkcijskih sevov E. coli BL21 (DE3) z ekspresijskim plazmidom pET3a pri 25° C in 42° C. Kulture so bile gojene v LBG10/amp100 mediju.
Legenda:
Nanos 1: BL21(DE3) pET3a-hG-CSF neinduciran pri 25°C (10 μΙ) (ni sledi hG-CSF) Nanos 2: BL21(DE3) pET3a-hG-CSF induciran z IPTG pri 25°C (10 μΙ) (rahla sled hG-CSF)
Nanos 3: BL21(DE3) pET3a-hG-CSF neinduciran pri 42°C (10 μΙ) (ni sledi hG-CSF) Nanos 4: BL21(DE3) pET3a-hG-CSF induciran z IPTG pri 42°C (10 μΙ) (pod 1 % hGCSF)
Nanos 5: standard filgrastim 0.3 pg za Coomassie brilliant blue
Nanos 6: BL21(DE3) pET3a-Fopt5 neinduciran pri 25°C (5 μΙ) (6 % hG-CSF)
Nanos 7: BL21(DE3) pET3a-Fopt5 induciran z IPTG pri 25°C (5 μΙ) (nad 50% hGCSF)
b) detekcija s protitelesi (VVestern blot); primarna zajčja protitelesa; sekundarna kozja protitelesa proti zajčjim IgG konjugirana s peroksidazo iz hrena, substrat β-naftol
Vzorci za detekcijo s protitelesi so naneseni v enakih količinah in enakem zaporedju kot pri SDS-PAGE (Slika 3a) z izjemo standarda, katerega nanos je bil 0.08 pg.
Slika 4: SDS-PAGE (4 % zgoščevalni, 15 % ločitveni; barvano s Coomassie brilliant blue) vzorcev proteinov inducirane kulture produkcijskega seva
-1010
E. coli BL21 (DE3) z ekspresijskim plazmidom pET3a pri 25° C. Kulture so bile gojene v GYSP/amp100 in LYSP/amp100 mediju.
Legenda:
Nanos 1: LMW (BioRad)
Nanos 2: BL21 (DE3) pET3a/P-Fopt5, kultura gojena v LYSP/amp100; (60% hGCSF)
Nanos 3: BL21 (DE3) pET3a/P-Fopt5, kultura gojena v LYSP/amp100; (nad 54% hGCSF)
Nanos 4: rhG-CSF (0.6 pg)
Nanos 5: rhG-CSF (1.5 pg)
Nanos 6: BL21 (DE3) pET3a/P-Fopt5, kultura gojena v GYSP/amp100 (4 pl); (55% hG-CSF)
Nanos 7: BL21 (DE3) pET3a/P-Fopt5, kultura gojena v GYSP/amp100 (Spl); (52% hG-CSF)
Primeri:
Primer 1: priprava optimalnega gena: Fopt5
Primer 1a: Predpriprava gena in plazmidov
Gen za hG-CSF gen smo namnožili iz BBG13 (R&D) z metodo PCR, s katero smo z začetnimi oligonukleotidi vnesli na začetek in konec gena tudi restrikcijski mesti Ndel in BamHI. Gen smo nato vključili v plazmid pCytexAH,H (glej opis v nadaljevanju) med restrikcijski mesti Ndel in BamHI, v katerem smo tudi izvedli vse stopnje optimizacije gena za ekspresijo v E. coli.
V predpripravi smo iz gena za hG-CSF odstranili EcoRV mesto (oligo M20z108) zato, da smo si zagotovili možnost uvajanja točkovnih (posameznih) mutacij z oligonukleotidno usmerjeno mutagenezo v plazmidu pCytexAH,H s kitom Transformer™ Site-Directed Mutagenesis Kit (Clontech). V plazmidu pCytexAH,H-GCSF je bilo tako mogoče uporabljati selekcijo mutant preko restrikcijskih mest EcoRI/EcoRV.
Izhodni plazmid pCYTEXP1 (Medac, Hamburg) smo preoblikovali tako, da je bila ekspresija konstitutivna, kar pomeni, da smo izrezali del gena za c!857 represor
-1111 med obema restrikcijskima mestoma Hindlll. Plazmid, ki smo ga tako dobili, smo imenovali pCytexAH,H.
Oligonukleotid za odstranitev EcoRV mesta iz nativnega gena za hG-CSF:
M20z108 5’ -CCT GGA AGG AAT ATC CCC CG-3'
Primer 1b: Optimizacija kodonov (Slika 1)
V prvi stopnji optimizacije smo pripravili sintetski del gena med restrikcijskima mestoma Ndel in Sacl z lepljenjem petih kaset (A, B, C, D,E), ki so bile sestavljene iz komplementarnih oligonukleotidov. Ta sintetski del gena predstavlja segment I. S segmentom I smo nato nadomestili del nativnega hG-CSF gena med restrikcijskima mestoma Ndel in Sacl. To smo naredili tako, da smo izrezali prvi del gena med restrikcijskima mestoma Nde I in Sacl in ga nadomestili s sintetsko pripravljeno kaseto. Postopek je potekal v dveh korakih. Najprej smo ligirali kaseto A, ki se je prilepila na Ndel mesto in kaseto E, ki se je prilepila na Sacl mesto. Po 16 urah na 16°C smo ligacijsko zmes oborili z etanolom, da smo odstranili presežek (nevezanih) oligonukleotidov ter nato v drugem koraku dodali srednji del celotne kasete (kaseta B, C in D) iz treh parov predhodno zlepljenih komplementarnih oligonukleotidov ter ponovno ligirali 16 ur na 16°C.
V drugi stopnji optimizacije smo z usmerjeno oligonukleotidno mutagenezo (TransformerTM Site-Directed Mutagenesis Kit (Clontech)) zamenjali dva, za E. coli najbolj kritična kodona, Arg148 in Gly150, ki se nahajata v segmentu lil.
V tretji stopnji optimizacije smo na podoben način kot v prvi, vendar brez vmesne etanolne precipitacije, pripravili segment IV, ki predstavlja zadnji del gena med restrikcijskima mestoma Nhel in BamHI iz dveh parov komplementarnih oligonukleotidov (kaseta F in G).
V četrti stopnji optimizacije smo z usmerjeno oligonukleotidno mutagenezo (TransformerTM Site-Directed Mutagenesis Kit (Clontech)) zamenjali neugoden kodon za Ile96 (ATA->ATT) (segment II) ter vnesli restrikcijsko mesto Apa I (Gly101 GGT_»GGG), ki se nahaja na 3' koncu segmenta II.
Apa I mesto smo nato uporabili v peti stopnji optimizacije zato, da smo nativni gen med Sac I in Apa I zamenjali s sintetsko DNA (segment II). Ta sintetska DNA je
-1212 sestavljena iz treh parov komplementarnih oiigonukleotidov (kaseta H, I in J), ki smo jo izvedli na podoben način kot v prvi stopnji s kasnejšim dodatkom kasete I.
.stopnja optimizacije:
komplementarni pari oiigonukleotidov (Nde I -Sac I; segment I na Sliki 1):
Kaseta A: sestavljena iz komplementarnih oiigonukleotidov zglosl in sp1os2: zglosl 5’ TAT GAC ACC ACT GGG TCC AGC TTC TTC TCT GCC GCA AAG 3' sp1os2 5’ GCA GAG AAG AAG CTG GAC CCA GTG GTG TCA 3'
Kaseta B: sestavljena iz komplementarnih oiigonukleotidov zg2os3 in sp2os4: zg2os3 5’ CTT TCT GTT GAA ATG TTT AGA ACA AGTTCG TAA AAT TCA AG 3’ sp2os4 5’ GAA CTT GTT CTA AAC ATT TCA ACA GAA AGC TTT GCG 3’
Kaseta C: sestavljena iz komplementarnih oiigonukleotidov zg3os5 in sp3os6: zg3os5 5’ GTG ATG GTG CAG CTT TAC AAG AAA AAC TGT GTG 3’ sp3os6 5’ GTT TTT CTT GTA AAG CTG CAC CAT CAC CTT GAA TTT TAC 3'
Kaseta D: sestavljena iz komplementarnih oiigonukleotidov zg4os7 in sp4os8: zg4os7 5’ CAA CTT ATA AAC TGT GTC ATC CAG AAG AAC TGG TTC TGT TAG 3' sp4os8 5’ CAG TTC TTC TGG ATG ACA CAG TTT ATA AGT TGC ACA CA 3'
Kaseta E: sestavljena iz komplementarnih oiigonukleotidov zg5os9 in sp5os10: zg5os9 5’ GTC ATT CTC TGG GTA TTC CGT GGG CTC CTC TGA GCT 3' sp5os10 5’ CAG AGG AGC CCA CGG AAT ACC CAG AGA ATG ACC TAA CAG AAC 3'
2. stopnja optimizacije: oiigonukieotidi za zamenjavo najbolj kritičnih kodonov z usmerjeno oligonukleotidno mutagenezo zamenjava Arg 148 (CGG - CGT) in Gly 150 (GGA - GGT) m38os16
5’ CTC TGC TTT CCA GCG CCG TGC AGG TGG GGT CCT GGT TG 3’
-1313
3. stopnja optimizacije: komplementarni pari oligonukleotidov (Nhe I - BamH I; segment IV na Sliki 1):
Kaseta F: sestavljena iz komplementarnih oligonukleotidov zg6os11 in sp6os12: zg6os11 5’ CTA GCC ATC TGC AAT CTT TTC TGG AAG TTA G 3’ sp6os12 5’ ACG ATA GCT AAC TTC CAG AAA AGA TTG CAG ATG G 3'
Kaseta G: sestavljena iz komplementarnih oligonukleotidov zg7os13 in sp7os14: zg7os13 5’ CTA TCG TGT TCT GCG TCA TCT GGC TCA GCC GTG ATA AG 3' sp7os14 5’ GAT CCT TAT CAC GGC TGA GCC AGA TGA CGC AGA AC 3'
4. stopnja optimizacije: oligonukleotidi za vpeljavo Apa I (Gly101 GGT ->GGG), in zamenjavo neugodnega kodona Ile96 z usmerjeno oligonukleotidno mutagenezo vpeljava Apa I (Gly101 GGT -hGGG), in zamenjava Ile 96 (ATA-ATT):
Apalosl 5
5' GCC CTG GAG GGG ATT TCC CCC GAG TTG GGG CCC ACC TTG GAC AC 3'
5. stopnja optimizacije: komplementarni pari oligonukleotidov (Sac I - Apa l;segment Ii na Sliki 1):
Kaseta H; sestavljena iz komplementarnih oligonukleotidov zg8os18 in sp8os19: zg8os18 5’ CCT GTC CGA GCC AGG CGC TGC AGC TGG CAG GCT GCC TGA G 3' sp8os19 5’ CCT GCC AGC TGC AGC GCC TGG CTC GGA CAG GAG CT 3'
Kaseta I: sestavljena iz komplementarnih oligonukleotidov zg9os20 in sp9os21: zg9os20 5’ CCA ACT GCA TAG CGG TCT GTT TCT GTA TCA GGG TCT GCT G 3’ sp9os21 5’ CTG ATA CAG AAA CAG ACC GCT ATG CAG TTG GCT CAG GCA G 3’
-1414
Kaseta J: sestavljena iz komplementarnih oligonukleotidov zg10os22 in sp10os23: zg10os22 5’ CAG GCG CTG GAA GGC ATT TCC CCG GAA CTG GGG CC 3' sp10os23 5’ CCA GTT CCG GGG AAA TGC CTT CCA GCG CCT GCA GCA GAC C 3'
Primer 2: Ekspresija sintetskega gena za hG-CSF v E. coli
Optimiran gen Fopt5 smo iz plazmida pCyAH,H izrezali s restrikcijskima encimoma Ndel in BamHI ter ga subklonirali v končni ekspresijski plazmid pET3a (Novagen, Madison USA) ter transformirali v produkcijski sev E. cofi BL21 (DE3). Kulture smo pripravili na stresalniku 24 ur na 160 rpm pri 25°C oziroma 15 ur42°C:
- v LBG10/amp100 mediju (10 g/l tripton, 5g/l kvasni ekstrakt, 10 g/l NaCI, 10 g/l glukoze, 100 mg/L ampicilina). Indukcijo smo izvedli z dodatkom IPTG v medij do končne koncentracije 0.4 mM.
Kulture smo pripravili na stresalniku 24 ur na 160 rpm pri 25°C:
- v GYSP/amp100 mediju (20 g/l fiton, 5g/l kvasni ekstrakt, 10 g/l NaCI, 10 g/l glukoze, kovine v sledovih, 100 mg/L ampicilina). Indukcijo smo izvedli z dodatkom IPTG v medij do končne koncentracije 0.4 mM.
- v LYSP/amp100 mediju (20 g/l fiton, 5g/l kvasni ekstrakt, 10 g/l NaCI, 6 g/l glicerola, 4 g/i laktoze, kovine v sledovih, 100 mg/L ampicilina). Indukcijo smo v tem primeru izvedli z dodatkom laktoze v medij.
Inokulum smo pripravili v LBG/amp100 mediju (10 g/L tripton, 5 g/L kvasni ekstrakt, 10 g/L NaCI, 2.5 g/L glukoze) in 100 mg/L ampicilina pri 25°C, 160 rpm prekonočno.
Za analizo smo centrifugirali po 8 ml kulture na 5000 rpm. Pelete smo nato resuspendirali v 10 mM TrisHCI/pH=8.0 tako, da smo dodali 0.66 ml pufra preračunano na 1 enoto OD60onm· Tako smo izenačili količino nanosov celokupnih proteinov, ker končni ODeoonm kultur v navedenih primerih niso bili enaki. Vzorce smo zmešali v razmerju 3:1 s 4x SDS - vzorčnim pufrom z DTT (pH=8.7) in segrevali 10 minut na 95°C, odcentrifugirali ter tako pripravljene nanesli na gel.
Deleži akumuliranega hG-CSF, ki se izloča v obliki inkluzijskih teles, so za nativni in optimirani gen opisani v Tabeli 1.
-1515
Tabela 1: Primerjava nivojev akumulacije hG-CSF pri nativnem in optimiranem genu (Fopt5)
delež (%) hG-CSF od celotnih proteinov
Ekspresijski sistem pogoji gojenja in indukcije nativen gen za hG- CSF optimiran gen Fopt5
temperatura gojenja 25° C 42° C 25° C
pET3a/ E. coli BL21 (DE3) gojišče LBG10/amp100 0.4 mM IPTG sled < 1 % > 40 %
pET3a i E. coli BL21 (DE3) gojišče GYSP/amp100 < 1 % < 1 % > 52 %
pET3a i E. coli BL21 (DE3) gojišče LYSP/amp100 < 1 % < 1 % > 52 %
Navedene vrednosti za vsebnost hG-CSF so pri Fopt5 dobljene z denzitometrično analizo SDS-PAGE gelov obarvanih s Coomassie brilliant blue (Slika 3a in Slika 4) oziroma v primeru neoptimiranega gena po detekciji s protitelesi (Slika 3b). Relativni delež je bil pri oceni ekspresije Fopt5 določen s profilno analizo (program Molecular analyst; BioRad) gelov na aparatu Imaging densitometer Model GS670 (BioRad).
-1616
Opis DNA zaporedij <110> Lek farmacevtska družba d. d.
<120> Sintetski gen za humani granulocitne kolonije stimulirajoči dejavnik za ekspresijo v E. coli <160> 2
<210> SEQ ID NO: 1
<211> 525 baznih parov
<212> DNA
<213> sintetsko zaporedje
<220> gen
<400> SEQ ID NO: 1
atgacaccac tgggtccagc ttcttctctg ccgcaaagct ttctgttgaa atgtttagaa 60
caagttcgta aaattcaagg tgatggtgca gctttacaag aaaaactgtg tgcaacttat 120
aaactgtgtc atccagaaga actggttctg ttaggtcatt ctctgggtat tccgtgggct 180
cctctgagct cctgtccgag ccaggcgctg cagctggcag gctgcctgag ccaactgcat 240
agcggtctgt ttctgtatca gggtctgctg caggcgctgg aaggcatttc cccggaactg 300
gggcccacct tggacacact gcagctggac gtcgccgact ttgccaccac catctggcag 360
cagatggaag aactgggaat ggcccctgcc ctgcagccca cccagggtgc catgccggcc 420
ttcgcctctg ctttccagcg ccgtgcaggt ggggtcctgg ttgctagcca tctgcaatct 480
tttctggaag ttagctatcg tgttctgcgt catctggctc agccg 525
-1717 <210>
<211>
<212>
<213>
SEQ ID NO: 2
528 baznih parov
DNA sintetsko zaporedje <220>
<400>
gen
SEQ ID NO: 2 atgacaccac tgggtccagc ttcttctctg ccgcaaagct ttctgttgaa atgtttagaa 60 caagttcgta aaattcaagg tgatggtgca gctttacaag aaaaactgtg tgcaacttat 120 aaactgtgtc atccagaaga actggttctg ttaggtcatt ctctgggtat tccgtgggct 180 cctctgagct cctgtccgag ccaggcgctg cagctggcag gctgcctgag ccaactgcat 240 agcggtctgt ttctgtatca gggtctgctg caggcgctgg aaggcatttc cccggaactg 300 gggcccacct tggacacact gcagctggac gtcgccgact ttgccaccac catctggcag 360 cagatggaag aactgggaat ggcccctgcc ctgcagccca cccagggtgc catgccggcc 420 ttcgcctctg ctttccagcg ccgtgcaggt ggggtcctgg ttgctagcca tctgcaatct 480 tttctggaag ttagctatcg tgttctgcgt catctggctc agccgtga 528
Lek farmacevtska &užba d. d.

Claims (13)

  1. Patentni zahtevki
    1. DNA zaporedje, ki kodira za hG-CSF, označeno s tem, da vsebuje zaporedje nukleotidov po SEQ ID NO: 1.
  2. 2. DNA zaporedje, označeno s tem, da vsebuje zaporedje nukleotidov iz skupine, ki zajema delno zaporedje SEQ ID NO: 1 in nukleinske kisline, ki hibridizirajo z zaporedjem po SEQ ID NO: 1 pri zaostrenih pogojih.
  3. 3. Ekspresijski plazmid, označen s tem, da vsebuje DNA zaporedje po zahtevku 1 in plazmidni vektor.
  4. 4. Ekspresijski plazmid, označen s tem, da vsebuje DNA zaporedje po zahtevku 2 in plazmidni vektor.
  5. 5. Ekspresijski plazmid po zahtevkih 3 in 4, označen s tem, da je plazmidni vektor izbran iz skupine pET vektorjev.
  6. 6. Ekspresijski sistem za ekspresijo DNA zaporedja po zahtevku 1, označen s tem, da vsebuje DNA zaporedje, plazmidni vektor in produkcijski sev E. coli.
  7. 7. Ekspresijski sistem za ekspresijo DNA zaporedja po zahtevku 2, označen s tem, da vsebuje DNA zaporedje, plazmidni vektor in produkcijski sev E. coli.
  8. 8. Ekspresijski sistem po zahtevkih 6 in 7, označen s tem, da je plazmidni vektor izbran iz skupine pET vektorjev.
  9. 9. Ekspresijski sistem po zahtevkih 6 in 7, označen s tem, da je produkcijski sev E coli BL21 (DE3).
  10. 10. Priprava DNA zaporedja po zahtevku 1, označena s tem, da vključuje postopke, ki so izbrani iz skupine, ki zajema:
    -zamenjavo nekaterih za E coli neugodnih kodonov s kodoni, ki so za E coli ugodni,
    -zamenjavo nekaterih GC bogatih regij z AT bogatimi regijami.
    in nadalje zajema popolnoma nespremenjen del nativnega zaporedja za hG-CSF.
  11. 11. Priprava DNA zaporedja po zahtevku 10, ki nadalje ne vključuje sprememb v področjih iz skupine, ki zajema: področja iniciacije translacije, področja vezavnega mesta za ribosom ter področja v razdalji med start kodonom in vezavnim mestom za ribosom.
  12. 12. Ekspresija DNA zaporedja po zahtevku 1 v E coli.
  13. 13. Ekspresija DNA zaporedja po zahtevku 2 v E coli.
    Lek farmacevtska družba d. d.
SI200200188A 2002-07-31 2002-07-31 Sintetski gen za humani granulocitne kolonije stimulirajoči dejavnik za ekspresijo v E. coli SI21272A (sl)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SI200200188A SI21272A (sl) 2002-07-31 2002-07-31 Sintetski gen za humani granulocitne kolonije stimulirajoči dejavnik za ekspresijo v E. coli
AU2003253344A AU2003253344A1 (en) 2002-07-31 2003-07-28 SYNTHETIC GENE CODING FOR HUMAN GRANULOCYTE-COLONY STIMULATING FACTOR FOR THE EXPRESSION IN E. coli
JP2005506069A JP4445466B2 (ja) 2002-07-31 2003-07-28 大腸菌で発現させるためのヒト顆粒球コロニー刺激因子をコードする合成遺伝子
EP03766320A EP1527095A1 (en) 2002-07-31 2003-07-28 SYNTHETIC GENE CODING FOR HUMAN GRANULOCYTE-COLONY STIMULATING FACTOR FOR THE EXPRESSION IN E. coli
US10/522,827 US7655437B2 (en) 2002-07-31 2003-07-28 Synthetic gene coding for human granulocyte-colony stimulating factor for the expression in E. coli
PCT/EP2003/008308 WO2004013175A1 (en) 2002-07-31 2003-07-28 SYNTHETIC GENE CODING FOR HUMAN GRANULOCYTE-COLONY STIMULATING FACTOR FOR THE EXPRESSION IN E. coli
AR20030102715A AR040521A1 (es) 2002-07-31 2003-07-29 Gen sisntetico que codifica al factor estimulante de colonias de granulocitos humano para la expresion e. coli

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SI200200188A SI21272A (sl) 2002-07-31 2002-07-31 Sintetski gen za humani granulocitne kolonije stimulirajoči dejavnik za ekspresijo v E. coli

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SI21272A true SI21272A (sl) 2004-02-29

Family

ID=31493133

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SI200200188A SI21272A (sl) 2002-07-31 2002-07-31 Sintetski gen za humani granulocitne kolonije stimulirajoči dejavnik za ekspresijo v E. coli

Country Status (7)

Country Link
US (1) US7655437B2 (sl)
EP (1) EP1527095A1 (sl)
JP (1) JP4445466B2 (sl)
AR (1) AR040521A1 (sl)
AU (1) AU2003253344A1 (sl)
SI (1) SI21272A (sl)
WO (1) WO2004013175A1 (sl)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100417414C (zh) 2003-04-30 2008-09-10 苏黎世大学 免疫毒素在制备治疗头颈鳞状上皮细胞癌或膀胱癌药物中的应用
US8263744B2 (en) * 2007-04-19 2012-09-11 Viventia Biotechnologies Inc. Binding proteins that bind to EpCAM linked to an effector molecule
WO2009039630A1 (en) * 2007-09-27 2009-04-02 Viventia Biotech Inc. Optimized nucleic acid sequences for the expression of vb4-845
RU2529363C2 (ru) * 2011-03-02 2014-09-27 Общество с ограниченной ответственностью "Научно-Технологический Центр "БиоИнвест" РЕКОМБИНАНТНАЯ ДНК, КОДИРУЮЩАЯ ГРАНУЛОЦИТАРНЫЙ КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩИЙ ФАКТОР ЧЕЛОВЕКА (G-CSF) И РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА рAS017, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ G-CSF В КЛЕТКАХ Escherichia coli
WO2015048901A1 (en) 2013-10-02 2015-04-09 Viventia Bio Inc. Anti-epcam antibodies and methods of use
JP6847846B2 (ja) 2015-03-12 2021-03-24 セセン バイオ，インコーポレイテッド Ｅｐｃａｍ陽性膀胱癌を標的とする投薬戦略
US10576163B2 (en) 2015-03-12 2020-03-03 Viventia Bio Inc. Methods of treatment for EpCAM positive bladder cancer

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9004390D0 (en) * 1990-02-27 1990-04-25 Ici Plc Process

Also Published As

Publication number Publication date
WO2004013175A1 (en) 2004-02-12
AR040521A1 (es) 2005-04-06
US20060228781A1 (en) 2006-10-12
JP2006512089A (ja) 2006-04-13
EP1527095A1 (en) 2005-05-04
US7655437B2 (en) 2010-02-02
JP4445466B2 (ja) 2010-04-07
AU2003253344A1 (en) 2004-02-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5710027A (en) Process and vector for expressing alpha-interferon in E. coli
US8148494B2 (en) Signal peptide for the production of recombinant proteins
Pal et al. Process optimization of constitutive human granulocyte–macrophage colony-stimulating factor (hGM-CSF) expression in Pichia pastoris fed-batch culture
US6773899B2 (en) Phage-dependent superproduction of biologically active protein and peptides
SI21272A (sl) Sintetski gen za humani granulocitne kolonije stimulirajoči dejavnik za ekspresijo v E. coli
EP1527188A1 (en) Process for the production of increased amounts of correctly folded heterologous protein in inclusion bodies
Mikiewicz et al. Novel expression vectors based on the pIGDM1 plasmid
JP5460660B2 (ja) ヒトｇ−ｃｓｆの調整方法
JP6188574B2 (ja) 発現プロセス
ES2281822T3 (es) Vectores de expresion, celulas huesped transformadas y procedimiento de fermentacion para la produccion de polipeptidos recombinantes.
JP2021531784A (ja) 新規細菌ｌｐｐ突然変異体及び組換えタンパク質の分泌産生のためのその使用
WO2008096368A2 (en) A novel process for production of recombinant human g-csf
RU2680886C1 (ru) Рекомбинантная плазмида pFM-GCSF5, обеспечивающая экспрессию синтетического гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, штамм бактерий Escherichia coli FM-GCSF - продуцент рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека и способ его получения
CN114561395B (zh) 无融合标签的rhIL-11及其突变体的可溶表达及高效纯化方法
SU1703690A1 (ru) Рекомбинантна плазмидна ДНК @ 22, кодирующа синтез интерферона @ -11 человека, и штамм бактерии РSеUDомоNаS Sp. -продуцент- интерферона @ -11 человека
RU2708556C1 (ru) Рекомбинантная плазмидная ДНК p280_2GM, кодирующая полипептид со свойствами гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека, штамм E.COLI SG 20050/ p280_2GM - продуцент полипептида со свойствами гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека и способ получения указанного полипептида
RU2271392C1 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pFGM17, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД ГРАНУЛОЦИТАРНО-МАКРОФАГАЛЬНОГО КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli BL21(DE3)/pFGM17 - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА ГРАНУЛОЦИТАРНО-МАКРОФАГАЛЬНОГО КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА ЧЕЛОВЕКА
US20040157290A1 (en) Process for preparing serine-rich protein employing cysteine synthase (cysK) gene
JPWO2004031243A1 (ja) タンパク質ポリマー及びその製造方法
KR100332359B1 (ko) 한우 유래 항균성 폴리펩타이드 유전자 발현용 재조합효모균주 및 이로부터 얻은 재조합 항균성 폴리펩타이드
US20090142804A1 (en) Process For Preparing Serine-Rich Protein Employing Cysteine Synthase (CYSK) Gene
Ghanbarian et al. The expression of human granulocyte macrophage colony stimulating factor by heat-induction in Escherichia coli
RU2333960C1 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pTrcTREN-IL-13, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД СО СВОЙСТВАМИ ИНТЕРЛЕЙКИНА-13 ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli BL21(ДЕЗ)/pTrcTREN-IL13-ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА СО СВОЙСТВАМИ ИНТЕРЛЕЙКИНА-13 ЧЕЛОВЕКА
CN113025591A (zh) 一种法尼基转移酶变体及其制备方法
RU2426787C2 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pET32M/mTrx-rhIL-11, КОДИРУЮЩАЯ ИНТЕРЛЕЙКИН -11 ЧЕЛОВЕКА, СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ И ШТАММ Escherichia coli BL21(DE3)/pET32M/mTrx-rhIL-11 - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРЛЕЙКИНА-11

Legal Events

Date Code Title Description
IF Valid on the event date
KO00 Lapse of patent

Effective date: 20120830