JP4445466B2 - 大腸菌で発現させるためのヒト顆粒球コロニー刺激因子をコードする合成遺伝子 - Google Patents
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Description
・(制限部位のSacI(194)とApaI(309)との間の)セグメントIIおよび(制限部位のNheI(467)とBamHI(536)との間の)セグメントIVにおいて:大腸菌の希有コドンを大腸菌の優先的コドンで置換すること。
・(制限部位のNdeI(3)とSacI(194)との間の)セグメントIにおいて:GCに富む領域をATに富む領域で置換すること。これによって、最も使用頻度が小さい大腸菌のコドンが交換されるが、たいていの場合、大腸菌の優先的コドンに代替されることはない。
セグメントI:大腸菌の希有コドンの大腸菌の優先的コドンによる置換と、GCに富む領域のATに富む領域による置換
イタリック体:GCに富む領域/ATに富む領域の置換;下線付きイタリック体:希有コドン/優先的コドンの置換とGCに富む領域/ATに富む領域の置換;下線:希有コドン/優先的コドンの置換;Gly101(GGT→GGG)はApaI(309)制限部位の導入。
実施例1a:遺伝子およびプラスミドの最初の調製品
hG−CSFをコードする遺伝子を、PCR法を用いてBBG13(R and D)から増幅した。また、開始オリゴヌクレオチドを用いることによって、制限部位NdeIとBamHIを遺伝子の開始末端と終止末端に導入することにも用いた。次いで、遺伝子をプラスミドpCytexΔH,H(詳細は下記を参照すること)の制限部位NdeIとBamHIとの間に組み込んだ。大腸菌中での遺伝子発現のためのその他のすべての最適化工程も、このプラスミド内で実施した。
最初の最適化工程において、相補性オリゴヌクレオチドからなる五つのカセット(A、B、C、D、E)を連結することによって、制限部位NdeIとSacIとの間の合成遺伝子を構築した。遺伝子のこの合成部分はセグメントIに相当する。セグメントIを用いて、hG−CSFについての天然の遺伝子の、制限部位NdeIおよびSacIの間の部分を置換した。制限部位NdeIおよびSacIの間の遺伝子の第一の部分を切断することによって、このことを実施し、そして合成的に調製したカセットで置換した。二工程で方法を実施した。第一の工程において、カセットAをNdeI部位と連結し、そしてカセットEをSacI部位と連結した。16℃にて16時間後、連結混合物をエタノールで沈殿させて、余分の(結合していない)オリゴヌクレオチドを除去した。第二の工程において、既に連結した三つの相補的オリゴヌクレオチドに由来するカセット全体(カセットB、CおよびD)の中央部分を添加し、16℃で16時間、ライゲーションを行った。
オリゴヌクレオチドの相補性対(NdeI−SacI;図1のセグメントI):
カセットA:sp1os2における相補性オリゴヌクレオチドzg1os1からなるもの:
CGG→CGT(Arg148)およびGGA→GGT(Gly150)の置換
カセットF:sp6os12における相補性ヌクレオチドzg6os11からなるもの:
ApaI(309)(GGT→GGG(Gly101))の挿入とATA→ATT(Ile96)の置換:
カセットH:sp8os19における相補性オリゴヌクレオチドzg8os18からなるもの:
最適化された遺伝子Fopt5を、制限酵素NdeIとBamHIを用いてプラスミドpCyΔH,Hから切り出した。次いで、遺伝子を最終の発現プラスミドpET3a(Novagen、アメリカ合衆国マディソン)(このプラスミドはアンピシリン耐性遺伝子を有する)内にサブクローニングし、次いで生産株の大腸菌BL21(DE3)に形質転換させた。
−LBG10/amp100培地(10g/Lのトリプトン、5g/Lの酵母エキス、10g/LのNaCl、10g/Lのグルコース、100mg/Lのアンピシリン)において。IPTGを終濃度が0.4mMとなるように添加して誘導を行った。
−GYSP/amp100培地(20g/Lのフィトン、5g/Lの酵母エキス、10g/LのNaCl、10g/Lのグルコース、微量の金属、100mg/Lのアンピシリン)において。IPTGを終濃度が0.4mMとなるように添加して誘導を行った。
添加例1:BL21(DE3)pET3a−hG−CSF・25℃で非誘導(10μL)(hG−CSFの痕跡量はなし)
添加例2:BL21(DE3)pET3a−hG−CSF・25℃でIPTGにて誘導(10μL)(hG−CSFのわずかな痕跡)
添加例3:BL21(DE3)pET3a−hG−CSF・42℃で非誘導(10μL)(hG−CSFの痕跡量はなし)
添加例4:BL21(DE3)pET3a−hG−CSF・42℃でIPTGにて誘導(10μL)(1%未満のhG−CSF)
添加例5:クーマシーブリリアントブルーのための標準としての0.3μgのフィルグラスチム
添加例6:BL21(DE3)pET3a−Fopt5・25℃で非誘導(5μL)(6%のhG−CSF)
添加例7:BL21(DE3)pET3a−Fopt5・25℃でIPTGにて誘導(5μL)(50%を超えるhG−CSF)
図3B:抗体による検出(ウェスタンブロット);一次抗体はウサギ抗体;二次抗体は西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギIgG抗体、基質はβ−ナフトール。
添加例1:LMW(BioRad)
添加例2:BL21(DE3)pET3a/P−Fopt5、LYSP/amp100で培養した培養液;(60%のhG−CSF)
添加例3:BL21(DE3)pET3a/P−FOPT5、LYSP/amp100で培養した培養液;(54%を超えるhG−CSF)
添加例4:rhG−CSF(0.6μg)
添加例5:rhG−CSF(1.5μg)
添加例6:BL21(DE3)pET3a/P−Fopt5、GYSP/amp100で培養した培養液(4μL);(55%のhG−CSF)
添加例7:BL21(DE3)pET3a/P−Fopt5、GYSP/amp100で培養した培養液(5μL);(52%のhG−CSF)
天然の遺伝子および最適化された遺伝子について封入体の形態で見られたhG−CSFの累積含有量(%)を、表1に示す。
最適化された遺伝子Fopt5を、制限酵素NdeIとBamHIを用いてアンピシリン耐性を有するプラスミドpET3a/P−Fopt5から切り出した。次いで、遺伝子をカナマイシン耐性を有する最終の発現プラスミドpET9a(Novagen、アメリカ合衆国マディソン)内にサブクローニングし、次いで生産株の大腸菌BL21(DE3)に形質転換させた。
レーン1:LMW(BioRad)
レーン2:GYSP/kan30培地でのBL21(DE3)pET9a−Fopt5・25℃でIPTGにて誘導(5μL)(52%を超えるhG−CSF)
レーン3:LMW(BioRad)
レーン4:GYSP/kan15培地でのBL21(DE3)pET9a−Fopt5・25℃でIPTGにて誘導(5μL)(54%を超えるhG−CSF)
レーン5:GYSP培地でのBL21(DE3)pET9a−Fopt5・25℃でIPTGにて誘導(5μL)(53%を超えるhG−CSF)
レーン6:hG−CSFの標準
レーン7:LMW(BioRad)
hG−CSFの上記の含有量は、クーマシーブリリアントブルーで染色したSDS−PAGEゲルの濃度分析によってによって得られる。発現レベルの評価のために、hG−CSFの相対量を、イメージングデンシトメーター装置Model GS670(BioRad)を利用するプロフィール分析(分子分析者のプログラム;BioRad)によって測定した。
Claims (23)
- 配列番号1のヌクレオチド配列を含む配列であることを特徴とする、hG−CSFをコードするDNA。
- 天然のhG−CSF遺伝子に対して変更されていないhG−CSF遺伝子の5’−非翻訳領域をさらに含む、請求項1に記載のDNA。
- プラスミドが請求項1または2に記載のDNAとプラスミドベクターとを含むことを特徴とする、発現プラスミド。
- プラスミドベクターがT7プロモーター配列を含むことを特徴とする、請求項3に記載の発現プラスミド。
- プラスミドベクターがpETベクター類の群から選択されることを特徴とする、請求項3に記載の発現プラスミド。
- プラスミドベクターが耐性遺伝子を含むことを特徴とする、請求項3から5のいずれか1項に記載の発現プラスミド。
- 該耐性遺伝子が、アンピシリン耐性遺伝子またはカナマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする、請求項6に記載の発現プラスミド。
- システムが請求項3から7のいずれか1項に記載の発現プラスミドと生産株の大腸菌とを含むことを特徴とする、請求項1に記載のDNAを発現させるための発現システム。
- 生産株が大腸菌BL21(DE3)であることを特徴とする、請求項8に記載の発現システム。
- 抗生物質無しで用いることを特徴とする、請求項8または9のいずれか1項に記載の発現システム。
- 請求項1に記載のDNAを構築する方法であって、
(i)hG−CSFをコードする天然の配列に対して:
−幾つかの大腸菌の希有コドンを大腸菌の優先的コドンで置換すること、および/または
−幾つかのGCに富む領域をATに富む領域で置換すること、
によって変更されたDNAを提供する方法を行う工程;ならびに
(ii)hG−CSFをコードする天然の配列のヌクレオチドの309位と467位の間の部分において全く非変更部分を維持する工程、
を含むことを特徴とする方法。 - DNAがhG−CSF遺伝子の5’非翻訳領域をさらに含み、次の部分的な領域:翻訳開始領域、リボゾーム結合部位および開始コドンとリボゾーム結合部位との間の領域の一つ以上における5’−非翻訳領域内には変更を含まないことを特徴とする、請求項11に記載のDNAを構築する方法。
- 構築された該DNAを、T7プロモーター配列を含むプラスミドベクター内に挿入する工程をさらに含む、請求項11または12に記載のDNAを構築する方法。
- 構築されたDNAが、適切な発現システムにおいて少なくとも50%の発現後の全タンパク質に対する発現レベルを与えることができる、請求項11から13のいずれか1項に記載のDNAを構築する方法。
- 発現レベルが少なくとも52%である、請求項14に記載の方法。
- 請求項1または2に記載のDNAまたは請求項3から7のいずれか1項に記載の発現プラスミドを大腸菌で発現させる工程を含み、該発現を誘導するためにIPTGを用いる、hG−CSFを発現させる方法。
- 少なくとも0.1mMから1mM未満の範囲の濃度のIPTGを用いる、請求項16に記載のhG−CSFを発現させる方法。
- IPTGの濃度が0.3から0.6mMの範囲である、請求項17に記載の方法。
- 20℃から30℃の温度で行う発酵工程を含む、請求項16または17に記載の方法。
- 温度が25℃である、請求項19に記載の方法。
- 発現後の全タンパク質に対する発現レベルが少なくとも50%である、請求項16または17に記載の方法。
- 発現レベルが、少なくとも52%である、請求項21に記載の方法。
- 有効成分としてhG−CSFまたは生物学的に活性なG−CSFを含有する医薬組成物を製造する方法であって:
(a)請求項16から21のいずれか1項に記載の方法を実施する工程、
(b)工程(a)によって得られるhG−CSFまたは生物学的に活性なG−CSFを単離および/または精製する工程、ならびに
(c)単離および/または精製されたhG−CSFまたは生物学的に活性なG−CSFを、医薬適合性の担体または助剤と混合する工程、
を含む方法。
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