SU1703693A1 - Рекомбинантна плазмидна ДНК @ - @ 2-19, кодирующа синтез интерлейкина-2 человека, способ ее конструировани @ штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент интерлейкина-2 человека - Google Patents

Рекомбинантна плазмидна ДНК @ - @ 2-19, кодирующа синтез интерлейкина-2 человека, способ ее конструировани @ штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент интерлейкина-2 человека Download PDF

Info

Publication number
SU1703693A1
SU1703693A1 SU874191353A SU4191353A SU1703693A1 SU 1703693 A1 SU1703693 A1 SU 1703693A1 SU 874191353 A SU874191353 A SU 874191353A SU 4191353 A SU4191353 A SU 4191353A SU 1703693 A1 SU1703693 A1 SU 1703693A1
Authority
SU
USSR - Soviet Union
Prior art keywords
plasmid
dna
ppr
gene
coli
Prior art date
Application number
SU874191353A
Other languages
English (en)
Inventor
Владимир Георгиевич Дебабов
Элмар Янович Грен
Юрий Иванович Козлов
Сергей Владимирович Машко
Александр Яковлевич Стронгин
Виктор Эмильевич Стеркин
Виталий Львович Юрин
Сергей Викторович Костров
Александр Юрьевич Циманис
Андрис Янович Авот
Надежда Викторовна Романчикова
Александр Иванович Косиков
Максим Эдуардович Трухан
Андрей Владимирович Мочульский
Татьяна Вениаминовна Черновская
Елена Алексеевна Носовская
Марина Алексеевна Скворцова
Светлана Менделеевна Мазель
Original Assignee
Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to SU874191353A priority Critical patent/SU1703693A1/ru
Application filed by Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов filed Critical Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов
Priority to JP88502088A priority patent/JPH01502639A/ja
Priority to DE883890052T priority patent/DE3890052T1/de
Priority to CH381688A priority patent/CH676997A5/de
Priority to NL8820102A priority patent/NL8820102A/nl
Priority to HU881691A priority patent/HUT50873A/hu
Priority to PCT/SU1988/000032 priority patent/WO1988005818A1/ru
Priority to FI884557A priority patent/FI884557A0/fi
Priority to SE8803566A priority patent/SE8803566L/
Priority to GB8823729A priority patent/GB2210373A/en
Application granted granted Critical
Publication of SU1703693A1 publication Critical patent/SU1703693A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C12N15/73—Expression systems using phage (lambda) regulatory sequences

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Изобретение относитс  к микробиологической и медицинской промышленности. молекул рной биологии и генно-инженерной биотехнологии. Целью изобретени   вл етс  повышение уровн  накоплени  интерлейки- на-2(ИЛ-2) человека в клетках штамма-продуцента . Методами генной инженерии получена рекомбинантна  плазмида pPR-IL2-19, котора  обеспечивает регулируемый высокоэффективный синтез интерлейкина-2 человека в клетках E.coli под контролем промоторно- операторной области PROR бактериофага /.. Разработан способ конструировани  этой плазмиды. Отобран штамм E.coli ВНИИге- нетика VL 903 (pPR-IL2-19) (регистрационный номер ВКПМ В-3866 во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов ), содержащий плазмиду pPR-IL2-19 и продуцирующий интерлейкин-2 человека в количестве 8-10 х 107 международных ед. на 1 л бактериальной культуры, что составл ет 12% от суммарного клеточного белка. 3 с.п. ф-лы. 1 ил., 1 табл. На чертеже изображена физическа  карта предлагаемой рекомбинантной плаз- мидной ДНК, Сконструирована нова  рекомбинантна  плазмида pPR-IL2-19 размером ,85 т.п.н. обеспечивающа  экспрессию гена IL2 под контролем регул торной области PROR . бактериофага А состо ща  из большого 1-3,4 т.п.н.) BamHI-Bgfll-фрагмента векторной плазмиды pPR124B и малого (0,45 т.п.н.) С 13-ВдШ-фрагмента плазмиды рАА 1213- 23 (модифицированной введением Bgtll- линкера) и характеризующа с  следующими признаками: содержит участок иници (/) С VJ о со о ю со

Description

ации репликации (Ori) (ColEI-репликон), ген температурочувствительного реп рессора cits 857 фага А, ген устойчивости к ампи- циллину (Арг), тандем р -независимых терминаторов транскрипции фага fd (tfd). регул рную область PROR . SD-последова- тельность (SDcro) и ATG-инициирующий ко- дон (f-Met) гена его фага Я, кодирующую последовательность зрелого интерлейкина- 2 человека; соединение регул торной обла- сти PROR и ATG-кодона ; f-Met гена его с последовательностью гена IL2 и терминаторами транскрипции fd (tfd) осуществлено так, что образован гибридный участок св зывани  рибосом, имеющий следующую нуклеотидную последовательность 5 - ...TAAGGAGGTTGTATGGCC...-3 . где TAAGGAGGT и ATG-SD-последовательность и инициирующий кодом гена его соответственно , GCC - первый (Ala) кодон интерлей- кина-2, а за терминирующим кодоном гена IL2 расположен тандем р-независимых терминаторов транскрипции fd (tfd); имеет уникальные участки узнавани  рестриктаз Clal, координата которого  вл етс  началом отсчета (0) на чертеже, Xbal ( 990), BgtH (1250), Pst( 3070).
Способ конструировани  рекомбинант- ной плазмиды pPR-IL2-19 заключаетс  в том, что в состав плазмиды рАА1213-23 вво- д т с помощью олигонуклеотидного линкера уникальный участок расщеплени  дл  стриктазы Bgfll в З1 -нетранслируемую |Сть гена IL2, затем полученную таким образом плазмиду рАА1213-23В обрабатыва- ют рестриктазой Cfr 13 и достраивают образующиес  однонитевые концы молекул ДНК Кленовским фрагментом ДНК-поли- меразы I Е.соП, после чего фрагмент с геном интерлейкина интегрируют с помощью ДНК-лигазы фага Т4 в состав векторной молекулы pPR 1 24В, расщепленной рестриктазой BamHI и с удаленными 51-эндонуклеазой однонитевыми концами ДНК, затем препарат обрабатывают рестриктазой Bgfll и обеспечивают циклизацию линейных молекул ДНК ДНК-лигазой Т4. полученной смесью трансформируют клетки E.coli C600, трансформанты высевают на среду с ампи- циллином и культивируют при 28°С с после- дующей селекцией на пониженную скорость роста при 42°С. Из отобранных таким образом клонов выдел ют плазмид- ную ДНК, обозначенную как pPR-IL2-19, в которой точность воссоединени  фрагмен- тов провер ют восстановлением на стыке исходных участков ДНК ранее отсутствующей последовательности узнавани  ре- стриктазы BspRI.
Выбор метода селекции рекомбинант- ных клонов основываетс  на известных данных о возможном токсическом действии некоторых белков эукариотического происхождени  при их суперпродукции в бактериальных клетках в услови х дерепрессии промотора, регулирующего транскрипцию чужеродного гена.
Штамм E.coli ВНИИгенетика VL 903 (pPR-IL2-19) (регистрационный номер ВКПМ В-3866 во Всесоюзной коллекции примышленных микроорганизмов) - продуцент ин- терлейкина-2 человека.
Штамм получают трансформацией ре- ципиентного штамма E.coli ВНИИгенетика VL903 рекомбинантной плазмидой pPR-IL2- 19 с последующим отбором рекомбинант- ных клонов на среде с ампициллином при 28°С и определением активности интерлей- кина-2. Активность определ ют стандартными методами по поддержанию роста интерлей- кин-2-зависимолкультуры CTL2 цитотоксиче- ских лимфоцитов мыши. В качестве стандарта используют природный интерлейкин-2 человека с активностью 11 международных ед. на 1 мл в экстрактах клеток трансформантов после дерепрессии рк промотора, достигаемой культивированием штамма в течение 1-2 ч при 42°С. В качестве реципиента могут быть также использованы штаммы E.coli СбОО, НВ101, TGI, VL902 и другие производные E.coli K12.
Штамм E.coli ВНИИгенетика VL 903 (pPR-IL2-19) характеризуетс  следующими признаками.
Морфологические признаки; клетки пр мые, палочковидные, слабоподвижные, способны к образованию нитевидных форм, грамотрицательные, неспоронорные, размер отдельных клеток 3-5 мкм.
Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на плотных и жидких простых синтетических, полусинтетических и комплексных средах. При росте на агаризозан- ном бульоне Хоттингера или 1 -бульоне образуют гладкие, круглые, слабоматовые ослизненные колонии. При выращивании в жидких средах типа L бупьона или М9 с ка- заминовыми кислотами образуют разно- мерную взвесь.
Ф из полого-биохимические признаки. Клетки способны к росту в диапазоне 5- 40°С (оптимум 37°С) при рН 6,7-7,5. В качестве источника углерода используют углеводы (например, сахарозу) и аминокислоты . Обладают ауксотрофностью по метио- нину. Источником азота могут служить минеральные соли в аммонийной форме, а также органические соединени  в виде пептона , тритона, дрожжевого экстракта и аминокислот.
Устойчивость к антибиотикам. Штамм устойчив к ампициллину в концентрации до 100 мг/л при выращивании в жидких и на агаризованных питательных средах.
Стабильность плазмиды. При хранении клеток на агаризованной среде, при серии последовательных пересевов и в процессе глубинного культивировани  в жидкой среде с антибиотиком не происход т потери и перестройки плазмиды,
П р и м е р 1. Конструирование рекомби- нантной плазмиды pPR-IL2-19.
Получение целевой плазмиды, обеспечивающей синтез интерлейкина-2 человека , провод т в несколько этапов, заключающихс  в создании промежуточной плазмиды рАА1213-23В и последующего конструировани  рекомбинантной плазмиды pPR-IL2-19.
3 мкг ДНК плазмиды рАА 1213-23 расщепл ют в-10 ед. рестриктазы Stul в пробе объема 30 мкл, содержащей буфер дл  рестрикции- (10 мМ трис-HCi рН 7,9, 6 мМ MgCl2, 6 мМ 2-меркаптоэтанол, 150 мМ NaCI), далее ДНК осаждают из реакционной смеси добавлением этанола. Осадок отдел ют центрифугированием в 20 мкл Н20. Воссоединение линеаризованной плазмидной ДНК с Bgfll-линкерами Collaborative Research провод т с помощью 20 ед. ДНК- лигазы Т4 в пробе объемом 30 мкл, содержащей буфер дл  лигировани  (60 мМ трис-HCI, рН 7,6. 10 мМ MgCl2, Ю мМ 2- меркаптоэтанол, 0.4 мМ (АТФ), 2 мкг плазмидной ДНК и 0,5 мкг линкеров.
После лигировани  ДНК из реакционной смеси осаждают этанолом, раствор ют и подвергают ферментативному гидролизу рестриктазой Bglll в пробе объемом 40 мкл. содержащей буфер дл  рестрикции-2 (6 мМ трис-HCI, рН 7,6, 6 мМ MgCl2. 6 мМ 2-меркаптоэтанол , 50 мМ NaCI). ДНК вновь осаждают этанолом, раствор ют и обеспечивают циклизацию молекул ДНК. дл  чего 1 мкг препарата плазмидной ДНК в 240 мкл буфера дл  лигировани  обрабатывают 2 ед. ДНК-лигазы Т4. Полученной смесью трансформируют клетки E.coli C600. Эффектив; ность трансформации составл ет до 5 -10° колоний на 1 мкг нативной плазмиды рАА1213-23. Отбирают клоны, устойчивые к ампициллину (100 мкг/мл). из них выдел ют плазмидную ДНК по модифицированному методу Бирнбойма и Доли, используют ее дл  рестрикционного анализа . Полученна  таким образом плазмида рАА1213-23В в отличие от исходной рекомбинантной молекулы рАА1213-23 содержит
уникальный участок расщеплени  Bglll вместо имевшейс  последователь .с 1 /знаьз ни  Stul.
30 мкг ДНК плазм иды рАА 12 i l -2 JB рзсщепл ют рестриктазой Cfr 13 ..0° ед активности ) в пробе объемом 1 мкл содержащей буфер дл  рестр - ,:.ч, 1 Продукты ферментативного гидролиза п&деер- гают электрофорезу в 1,1%-ном геле
0 легкоплавкой агарозы в трис-ацетатной буферной системе при напр женности пол  5 В/см. Зону гел , содержащую фрагмент ДНК длиной «750 п.н., вырезает и привод т элюцию ДНК. Дл  достройки одноцепо5 чечных концов ДНК с помощью Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I F со, выделенный из гел  фрагмент обрабатывают в пробе объемом 20 мкл, соде ржа .чей 10 мМ трис-HCI, рН 8,0, 10 мМ MgCi2. по 30 мкМ
0 дезоксирибонуклеозидтрифосфатов. Реакцию останавливают прогреванием. ДНК из смеси переосаждают этанолом и раствор ют в 20 мкл.
Полученный препарат фрагмента плаз5 миды рАА1213-23В используют на дальнейших этапах конструировани  дл  интеграции кодирующей части интерлейкина-2 человека в векторную плазмиду PBR124B.
03 мкг ДНК плазмиды pBR124B расщепл ют рестриктазой BamHI в пробе объеме.и 12 мкл, содержащей буфер дл  рестрикцми- I. Реакцию останавливают фенольной де- протеинизацией ДНК и переосаждением
5 нуклеиновой кислоты этанолом. Осадок раствор ют в 20 мкл Н20. Удаление образующихс  при расщеплении ДНК рестриктазой одноцепочечных концов осуществл ют при помощи 51-эндонуклеазы. Дл  этого ДНК
0 гидролизуют 30 ед. 51-эндонуклеазы в пробе объемом 50 мкл. содержащей 30 мМ СНзСОО№, рН 4,4. 4,5 мМ ZnSO-1. 250 мМ NaCI в течение 20 мин при 20°С Реакцию останавливают обработкой фенолом и ДНК
5 переосаждают этанолом. Осадок раствор ют в 15 мкл Н20.
Полученный таким способом препарат линеаризованной плазмиды pBR124B воссоедин ют с фрагментом плазмиды
0 рАА1213-23В, выделение которого указано Дл  этого 1 мкг плазмидной ДНК и 2 мкг фрагмента обрабатывают ДНК-лигазой фаза Т4 в буфере дл  лигировани  при обьеме реакционной смеси 30 мкл. После пере5 осаждени  ДНК и растворени  осадка в 20 мкл Н20 препарат обрабатывают ре- стриктэзой Bgfll указанным образом. ДНК еще раз осаждают этанолом. раствор ют и обеспечивают воссоединение линейных молекул ДНК в кольцевые формы с помощью
ДНК-лигэзы Т4 при обработке препарата ферментом в объеме реакционной смеси 300 мкл. Полученный препарат используют дл  трансформации клеток E.coli C600 с последующей селекцией трансформантов на среде с ампициллином при культивировании клеток в течение суток при 28°С. Среди полученных трансформантов отбирают варианты , обладающие пониженной способностью к росту при 42°С. Из указанных клонов выдел ют плазмидную ДНК и подвергают рестрикционному анализу. В полученной плазмиде pPR-IL2-19 на стыке соедин емых участков ДНК, кодирующих первый кодом гена его фага А и Ala-кодон интерлейкина-2 человека, образуетс  участок расщеплени  рестрикционной эндо- нуклеазы BspR,
П р и м е р 2. Получение штамма E.coli ВНИИгенетика VL 903 (pPR-IL2-19j - проду- цента интерлейкина-2 человека.
Плазмиду pPR-IL2-19. кодирующую синтез интерлейкина-2 человека, трансформацией (пример 1) ввод т в клетки штамма реципиентного E.coli ВНИИгенетика VL 903 из коллекции ВНИИгенетики (регистрационный номер ВКПМ В-3546 во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов ). Эффективность трансформации клеток Е.coli ВНИИгенетика VL 903 составл ет около 10 клонов на 1 мкг нативной плазмиды pPR- IL2-19. Трансформанты отбирают на среде, содержащей ампициллин (100 мкг/мл) после культивировани  клеток в течение суток при 28°С. Из отобранных клонов вы- дел ют плазмидную ДНК и подтверждают ее идентичность препарату pPR-IL2-19 с помощью рестрикционного анализа. Полученный штамм E.coli ВНИИгенетика VL 903 (pPR-IL2-19) депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов и имеет регистрационный номер ВКПМ- В-3761.
П р и м е р 3. Получение штамма E.coli ВНИИгенетика VL 903 (pPR-IL2-19).
Все операции осуществл ют в соответствии с примером 2. Отличие состоит в том, что в качестве реципиента при трансформации используют штамм E.coli ВНИИгенетика VL 902 и в результате трансформации клеток этого реципиента плазмидой pPR- IL2-19 получают штамм E.coli ВНИИгенетика VL 902 (pPR-IL2-19) - продуцент интерлейкина-2 человека.
П р и м е р 4. Получение штамма E.coli C600-htpR(pPR-IL2-19).
Все операции осуществл ют в соответствии с примером 2. Отличие состоит в том, что в качестве реципиента используют штамм E.coli СбОО-thpR, несущий дополнительно хромосомальную мутацию в гене htpR. В результате трансформации клеток этого реципиента плазмидой pPR-IL2-19 получают штамм E.coli СбОО-htpR (pPR-IL2- 19) (ВКПМ В-3828) - продуцент интерлейкина-2 человека.
П р и м е р 5. Определение продуктивности штаммов E.coli (pPR- L2-19) - продуцентов интерлейкина-2 человека.
Дл  определени  продуктивности штаммов плазмидсодержащие клетки выращивают при 28°С на скошенной агаризозан- ной среде Хоттингера, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, в течение 14 ч. Выросшую на кос ках биомассу используют дл  получени  посевного материала. Дл  этого клетки перенос т в колбы Эрленмейера объемом 750 мл со 100 мл среды Хоттингера , со 100 мкг/мл ампициллина и выращивают при 28°С на качалке при 240 об/мин в течение б ч. Оптическа  плотность посеЕ.ной культуры составл ет 1,5-2,5 ед.
Ферментацию провод т в ферментере. оснащенном системами регулировани  рН, температуры, скорости перемешивани  и аэрации. Дл  ферментации используют среду Хоттингера со 100 мкг/мл ампициллина и 10 г/л глюкозы. Посевную культуру внос т в количестве 5-10%. Культивирование осуществл ют при рН 6,б-6,8, поддержива  этот уровень подачей аммиачной воды. Первую часть ферментации до 0. Д550 3,5 провод т при 28°С, а затем осуществл ют термоиндукцию , повыша  температуру до 42-45°С в течение 5 мин, после чего продолжают ферментацию еще 2 ч.
После окончани  процесса дл  определени  активности интерлейкина-2 челоиека
ИЗ 1 МЛ КуЛЬТурЭЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ КЛС. ТКИ
осаждают центрифугированием и осадок ресуспендируют в 1 мл 8 М раствора гу.эни- динхлорида при 20°С в течение 40 мин или 1 %-ном растворе додецилсульфата натри  в 0,02 М фосфатном буфере рН 7,2, содержащем 1% 2-меркаптоэтанола. В последнем случае образцы прогревают 2-4 мин при 100°С. Осадок отбрасывают центрифугированием и определ ют активность содержащегос  в надосадочной жидкости фракции интерлейкина-2.
Дл  определени  доли синтезированного интерлейкина-2 человека от суммарного клеточного белка клетки из 1 мл культураль- ной жидкости осаждают центрифугированием и обрабатывают указанным образом. Препарат анализируют электрофорезом в 15%-ном полиакриламидном геле в присутствии 0,1 % додецилсульфата натри . Белки, разделенные в геле, прокрашивают в растворе Кумасси R-250. Количественное содержание белюв в зонах определ ют после сканировани  прокрашенного гел  на автоматическом лазерном денситометре. Идентификацию зоны, соответствующей синтезированному в клетках зрелому интер- лейкину-2 человека, провод т на основе сравнени  с электрофоретической подвижностью маркерных белков, а также с помощью блоттинга разделенных белков на нитро- целлюлозные фильтры с последующим про-  влением зон интерлейкина обработкой в растворах, содержащих мышиные монокло- нальные антитела против интерлейкина-2 t-v антимышиные кроличьи антитела, конъюги- рованные с пероксидазой из хрена. После соответствующей процедуры окрашивани  зона интерлейкина про вл етс  в виде коричневой полосы на неокрашенном фоне нитроцеллюлозного фильтра.
Биологическа  активность интерлейки- на-2 человека в различных плазмидных штаммах E.coli - продуцентах интерлейкина, а также дол  синтезированного в клетках белкового продукта гена IL2 от суммарного белка представлены в таблице.
Таким образом, изобретение позвол ет повысить продукцию интерлейкина-2 до 8- 10 х 107 международных ед. на 1 л бактериальной культуры, что составл ет 12% от суммарного клеточного белка.

Claims (3)

  1. Формула изобретени  1. Рекомбинантна  плазмидна  ДНК pPR-IL2-19, кодирующа  синтез интерлейкина-2 человека, размером 3.85 т.п.н., содер- жаща  BamHI-Bgfii-фрагмент векторной плазмиды pPR 124B размером 3,4 т.п.н., Cfr 13-ВдгЬ-фрагмент размером 0,45 т.п.н. плазмиды рАА1213-23, модифицированный введением Bgflj -линкера, ColEI-pe- пликон. ген температурочувствительного репрессора с Its 857 фага А, ген устойчивости к ампициллину. тандем р -независимых терминаторов транскрипции фага fd, регул рную область PROR , SD-последователь- ность, ATG-инициирующий кодон гена его фага Я, кодирующую последовательность зрелого интерлейкина-2 человека гибридный участок св зывани  рибосом, имеющий следующую нуклеотидную последовательность: SVTAACCACCTTCTATCCCC..1. где TAAGGAGGT и АТС - SD-последовательность и индуцирующий кодон гена его соответственно , GCC-первый (Ala) кодон интерлейкина-2 , а за терминирующим кодоном гена IL2 расположен тандем р -независимых терминаторов транскрипции fd, уникальные участки узнавани  рестриктаз: Clal. координата которого  вл етс  началом отсчета -0, Xbal -990 т.п.н., Bgfil - 1250 т.п.н., Pst-3070 т.п.н.
  2. 2. Способ конструировани  рекомби- нантной плазмидной ДНК pPR-IL2-19. заключающийс  в том, что введение уникального участка расщеплени  ВдШ в 3 -концевую нетранслируемую часть гена IL2 в составе плазмиды рАА1213-23 осуществл ют с помощью олигонуклеотидного линкера , полученную плазмиду расщепл ют рестриктазой Cfr 13 и достраивают образующиес  однонитевые концы молекул ДНК фрагментом Кленова ДНК-полимерэзы 1 Escherichia coll, образованный фрагмент плазмиды рАА1213-23В с геном IL2 интегрируют с помощью ДНК-лигазы фага Т4 в состав векторной молекулы pPR124B. предварительно расщепленной BamHI и обработанный 51-эндонуклеазой, Затем препарат ДНК обрабатывают рестриктазой Bgfl и соедин ют молекулу ДНК в кольцевую форму ДНК-лигазой, полученной смесью трансформируют клетки E.coli C600, трансформанты высевают на среду с ампи- циллином и культивируют при 28°С с последующей селекцией на пониженную скорость роста при температуре 42°С, из отобранных клонов выдел ют плазмиду pPR-IL2-19, в которой точность воссоединени  фрагментов провер ют восстановлением на стыке исходных участков ДНК, ранее отсутствовавшей последовательности узнавани  рестриктазы BspRI.
  3. 3. Штамм бактерий Escherichia coli ВКПМ В-3866 - продуцент интерлейкина-2 человека.
    Штамм реципиент плаэмиды Биологическа  активность
    PPR-IL2- 19
    E.coli C600 E.coli ВНИИгенетика
    VL902 E.coli ВНИИгенетика
    VL903
    Дол  интерлейкина от синтезируемого в клетках белка,%
    8
    9
    12
    TAAGGAGGTTG7A TGGCC
    Clal
    PstI
    Ар
    SVcro
    f-met
    Accl
SU874191353A 1987-02-09 1987-02-09 Рекомбинантна плазмидна ДНК @ - @ 2-19, кодирующа синтез интерлейкина-2 человека, способ ее конструировани @ штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент интерлейкина-2 человека SU1703693A1 (ru)

Priority Applications (10)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SU874191353A SU1703693A1 (ru) 1987-02-09 1987-02-09 Рекомбинантна плазмидна ДНК @ - @ 2-19, кодирующа синтез интерлейкина-2 человека, способ ее конструировани @ штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент интерлейкина-2 человека
DE883890052T DE3890052T1 (de) 1987-02-09 1988-02-08 Rekombination-plasmid-dns ppr-il2-i9, die die synthese des menschlichen interleukin-2 kodiert, verfahren zu ihrem konstruieren und stamm der bakterien escherichia coli vniigenetika vl 903 (ppr-il2-i9)-produzent des menschlichen interleukin-2, der dieselbe enthaelt
CH381688A CH676997A5 (ru) 1987-02-09 1988-02-08
NL8820102A NL8820102A (nl) 1987-02-09 1988-02-08 Recombinant plasmide-dna ppr-il2-19 dat de synthese van menselijk interleukine-2 codeert, werkwijze voor de bereiding daarvan en bacteriestam escherichia coli vniigenetika vl 903 (ppr-il2-19) die menselijk interleukine-2 produceert en het plasmide-dna bevat.
JP88502088A JPH01502639A (ja) 1987-02-09 1988-02-08 ヒトインターロイキン―２の合成についてコードする組換えプラスミドＤＮＡｐＰＲ―１Ｌ２―１９、その工学的作出方法及びそれを含有するヒトインターロイキン―２産生細菌大腸菌ＶＮ２ジェネティカＶＬ９０３（ｐＰＲ―１Ｌ２―１９）株
HU881691A HUT50873A (en) 1987-02-09 1988-02-08 Process for producing recombinant plasmid dna encoding human interleukin-2 and escherichia coli comprising same
PCT/SU1988/000032 WO1988005818A1 (en) 1987-02-09 1988-02-08 RECOMBINANT PLASMID DNA pPR-IL2-19, CODING FOR SYNTHESIS OF HUMAN INTERLEUKIN-2, METHOD OF ITS CONSTRUCTION AND STRAIN OF BACTERIA ESCHERICHIA COLI VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IL2-19) AS PRODUCER OF HUMAN INTERLEUKIN-2, CONTAINING IT
FI884557A FI884557A0 (fi) 1987-02-09 1988-10-04 Rekombinantplasmid-dna ppr-il2-19, som kodas foer syntes av maenniskans interleukin-2, foerfarande foer framstaellning daerav och stammen bacteria escherichia coli vniigenetika vl 903 (ppr-19) producerande maenniskans interleukin-2 och innehaollande detta dna.
SE8803566A SE8803566L (sv) 1987-02-09 1988-10-07 Rekombinantisk, maenniskointerleukin-2-syntesen kodande plasmid-dna av ppr-il2-19-typ, foerfarande foer konstruering av denna plasmid-dna och maenniskointerleukin-2-producerande, naemnda plasmid-dna innehaallande bakteriestam av kulturen escherichia coli vniigenetika vl 903 (ppr-il2-19)
GB8823729A GB2210373A (en) 1987-02-09 1988-10-10 Recombinant plasmid dna ppr-il2-19,coding for synthsis of human interleukin-2 and strain of bacteria escherichia coli vniigenetika vl 903 (ppr-il2-19)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SU874191353A SU1703693A1 (ru) 1987-02-09 1987-02-09 Рекомбинантна плазмидна ДНК @ - @ 2-19, кодирующа синтез интерлейкина-2 человека, способ ее конструировани @ штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент интерлейкина-2 человека

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SU1703693A1 true SU1703693A1 (ru) 1992-01-07

Family

ID=21284358

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SU874191353A SU1703693A1 (ru) 1987-02-09 1987-02-09 Рекомбинантна плазмидна ДНК @ - @ 2-19, кодирующа синтез интерлейкина-2 человека, способ ее конструировани @ штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент интерлейкина-2 человека

Country Status (10)

Country Link
JP (1) JPH01502639A (ru)
CH (1) CH676997A5 (ru)
DE (1) DE3890052T1 (ru)
FI (1) FI884557A0 (ru)
GB (1) GB2210373A (ru)
HU (1) HUT50873A (ru)
NL (1) NL8820102A (ru)
SE (1) SE8803566L (ru)
SU (1) SU1703693A1 (ru)
WO (1) WO1988005818A1 (ru)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6068993A (en) * 1997-07-02 2000-05-30 Biobras Sa Vector for expression of heterologous protein and methods for extracting recombinant protein and for purifying isolated recombinant insulin

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS58116498A (ja) * 1981-12-28 1983-07-11 Takeda Chem Ind Ltd Ｉｌ‐２をコードする新規伝令ｒｎａの製造法
JPH0646957B2 (ja) * 1985-03-11 1994-06-22 武田薬品工業株式会社 インタ−ロイキン−２の製造方法
WO1986006410A1 (en) * 1985-04-30 1986-11-06 Takeda Chemical Industries, Ltd. Process for increasing yield of interleukin-2

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Nucl. Acid. Res., 1983. 11. p. 4307-4323. *

Also Published As

Publication number Publication date
NL8820102A (nl) 1989-01-02
JPH01502639A (ja) 1989-09-14
GB8823729D0 (en) 1988-12-07
DE3890052T1 (de) 1989-04-13
SE8803566D0 (sv) 1988-10-07
FI884557A (fi) 1988-10-04
FI884557A0 (fi) 1988-10-04
CH676997A5 (ru) 1991-03-28
WO1988005818A1 (en) 1988-08-11
HUT50873A (en) 1990-03-28
GB2210373A (en) 1989-06-07
SE8803566L (sv) 1988-10-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1309604B1 (en) Phage-dependent superproduction of biologically active protein and peptides
WO1987001391A1 (en) System for biotin synthesis
SU1703693A1 (ru) Рекомбинантна плазмидна ДНК @ - @ 2-19, кодирующа синтез интерлейкина-2 человека, способ ее конструировани @ штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент интерлейкина-2 человека
RU2610173C1 (ru) Рекомбинантная плазмида pFM-IFN-17, обеспечивающая экспрессию интерферона альфа-2b человека, рекомбинантная плазмида pFM-АР, обеспечивающая экспрессию фермента метионинаминопептидазы E. coli, биплазмидный штамм Escherichia coli FM-IFN-АР (pFM-IFN-17, pFM-АР) - продуцент (Met-) рекомбинантного интерферона альфа-2b человека
SU1479005A3 (ru) Способ получени интерлейкина-2 человека
JP4445466B2 (ja) 大腸菌で発現させるためのヒト顆粒球コロニー刺激因子をコードする合成遺伝子
SU1703692A1 (ru) Рекомбинантна плазмидна ДНК @ -1 @ 1-13, кодирующа синтез фибробластного интерферона ( @ I) человека, способ ее конструировани , штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент @ I-интерферона человека
RU2153535C1 (ru) Рекомбинантная плазмидная днк psav27, кодирующая синтез растворимого стрептавидина из streptomyces avidinii, и бактериальный штамм escherichia coli - продуцент растворимого стрептавидина из streptomyces avidinii
SU1703690A1 (ru) Рекомбинантна плазмидна ДНК @ 22, кодирующа синтез интерферона @ -11 человека, и штамм бактерии РSеUDомоNаS Sp. -продуцент- интерферона @ -11 человека
RU2260049C2 (ru) Рекомбинантная плазмидная днк pes3-7, кодирующая полипептид с последовательностью гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, и штамм escherichia coli bl21(de3)/pes3-7 - продуцент рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека
RU2091488C1 (ru) Рекомбинатная плазмидная днк р 280 gm, кодирующая полипептид со свойствами гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека. штамм escherichia coli sg20050/р 280 gm - продуцент полипептида со свойствами гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека
RU2619170C2 (ru) Рекомбинантная плазмидная ДНК pER-APHC3, кодирующая гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием APHC3, штамм Escherichia coli C3030/pER-APHC3 продуцент указанных белков и способ получения рекомбинантного APCH3
WO1992019737A1 (en) Process for producing a monocyte chemotactic factor polypeptide and a strain for the production thereof
RU2233879C1 (ru) Рекомбинантная плазмидная днк pes1-6, кодирующая полипептид соматотропин, и штамм escherichia coli bl 21(de3)/pes1-6-продуцент рекомбинантного соматотропина
RU2680886C1 (ru) Рекомбинантная плазмида pFM-GCSF5, обеспечивающая экспрессию синтетического гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, штамм бактерий Escherichia coli FM-GCSF - продуцент рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека и способ его получения
RU2809355C1 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pET32a-TNF-Thy, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ ГИБРИДНОГО БЕЛКА α-ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ - ТИМОЗИН АЛЬФА 1, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI BL21 (DE3)/pET32A-TNF-Thy - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TNF-Thy, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TNF-Thy И ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО
EP0279664A2 (en) A method of regulating expression of a foreign gene by controlling the sugar concentration in a medium and a process of producing a foreign gene product thereby
RU2099421C1 (ru) Способ получения рекомбинантного интерлейкина-3 человека, рекомбинантная плазмидная днк p3pteil3, кодирующая рекомбинантный интерлейкин-3 человека, штамм бактерий escherichia coli - продуцент рекомбинантного интерлейкина-3 человека
RU2302465C2 (ru) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОГО ГЛЮКАГОНА ЧЕЛОВЕКА, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pER-Gl, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, СПОСОБНЫЙ К АВТОКАТАЛИТИЧЕСКОМУ РАСЩЕПЛЕНИЮ С ОБРАЗОВАНИЕМ ГЛЮКАГОНА ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ Escherichia coli ER-2566/pER-Gl - ПРОДУЦЕНТ УКАЗАННОГО БЕЛКА
RU2787531C1 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА PET32a-TNF-Thy, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ ГИБРИДНОГО БЕЛКА α-ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ - ТИМОЗИН АЛЬФА 1, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI BL21(DE3)/PET32A-THF-Thy - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TNF-Thy И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TNF-Thy
US5139935A (en) Method of regulating expression of a foreign gene by controlling the sugar concentration in a medium and a process of producing a foreign product thereby
RU2426787C2 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pET32M/mTrx-rhIL-11, КОДИРУЮЩАЯ ИНТЕРЛЕЙКИН -11 ЧЕЛОВЕКА, СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ И ШТАММ Escherichia coli BL21(DE3)/pET32M/mTrx-rhIL-11 - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРЛЕЙКИНА-11
RU2326169C1 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pA3GF, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД ГРАНУЛОЦИТАРНОГО КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА ГРАНУЛОЦИТАРНОГО КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА ЧЕЛОВЕКА
RU2045575C1 (ru) Рекомбинатная плазмидная днк ppr - tgatg - hil - 1 beta - tsr, обеспечивающая синтез рекомбинантного интерлейкина-1 и штамм escherichia coli - продуцент рекомбинантного интерлейкина-1 бета человека
RU2113483C1 (ru) Рекомбинантная плазмидная днк pggf 8, кодирующая полипептид со свойствами гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека и штамм бактерий escherichia coli - продуцент полипептида со свойствами гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека