CH676997A5

CH676997A5 -

Info

Publication number: CH676997A5
Application number: CH381688A
Authority: CH
Inventors: Vladimir Georgievich Debabov; Elmar Yanovich Gren; Jury Ivanovich Kozlov; Sergei Vladimirovich Mashko; Alexandr Yakovlevich Strongin; Viktor Emilievich Sterkin; Vitaly Lvovich Jurin; Sergei Viktorovich Kostrov; Alexandr Jurievich Tsimanis; Andris Yanovich Avot; Nadezhda Viktorov Romanchikova
Original assignee: Vnii Genetiki Selek; Inst Organicheskogo Sinteza Ak
Priority date: 1987-02-09
Filing date: 1988-02-08
Publication date: 1991-03-28
Also published as: FI884557A0; JPH01502639A; FI884557A; DE3890052T1; GB2210373A; SE8803566L; NL8820102A; GB8823729D0; WO1988005818A1; SU1703693A1; HUT50873A; SE8803566D0

Description


  
 


 Technisches Gebiet 
 



  Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Rekombination-Plasmid-DNS pPR-IL2-19, die die Synthese des menschlichen Interleukin-2 kodiert, ein Verfahren zu ihrem Konstruieren und einen Stamm der Bakterien Escherichia coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IL2-I9)-Produzent des menschlichen Interleukin-2. 


 Stand der Technik 
 



  Natürliches menschliches Interleukin-2 oder Wachstumsfaktor von T-Zellen ist Glykoprotein mit einer Molekularmasse der Polypeptidkette von etwa 15 000 Dalton und es wird durch die T-Zellen bei ihrer Aktivierung mit dem Leptin beziehungsweise mit einem entsprechenden Antigen produziert. Das Interleukin-2 ist Immunomodulator mit komplexem Wirkungsmechanismus, es stimuliert insbesondere die Immun-Antwort auf Kosten der Aktivierung der T-Lymphozyte, der Verstärkung der Mitogenese der Thymozyte, der Induktion der zytotoxischen Aktivität der T-Zellen und anderes mehr. Das Interleukin-2 hat entsprechend eine grössere potentielle Bedeutung für die Therapie immunologischer Störungen, solcher wie bösartige Degenerationen, bakterielle oder virusartige Infektionen, Erkrankungen, die mit dem Immunodefizit verbunden sind, autoimmune Erkrankungen und anderes mehr.

  Das natürliche Interleukin-2, das unmittelbar aus dem menschlichen Serum beziehungsweise aus einem Kulturnährboden der Zellen der Jurkat-Linie ausgeschieden wird, ist in äusserst geringen Mengen zugänglich, die für die Untersuchung seiner Eigenschaften und des klinischen Potentials unzureichend sind. Als alternative Quelle des Interleukin-2 können die gentechnisch konstruierten Stämme der Mikroorganismen dienen, die die Rekombination-Plasmide mit einem Gen des Interleukin-2 tragen und die eine  effektive Expression dieses Gens bewirken 



  Bekannt sind Rekombination-Plasmid-DNS, die das menschliche Interleukin-2 kodieren, beispielsweise die Rekombination-Plasmid-DNS pPLcMuHil 201 und Stamm E.coli KI2  DELTA  HI  DELTA  trp (pPLcMuHil 201), der dieselbe enthält, (Devos R., Plaetinck G., Cheroutre H., Simons G., Degrave W., Tavernier J., Remaut E., Fiers W., 1983, Nucl. Acid. Res., 11, 4307-4323). 



  In der Zusammensetzung des genannten Rekombinationmoleküls der DNS wird die Transkription des Gens des Interleukin -2 durch ein Regulator-Element PLOL der  lambda  Bakteriophage kontrolliert und die Einleitung der Translation des Eiweissproduktes des Gens wird auf Kosten des Konstruierens eines Hybridabschnitts der Verknüpfung der Ribosome auf der Grundlage der SD-Sequenz der Mu-Phage bewirkt. Die maximale Ausbeute an menschlichem Interleukin-2, die durch die Kultivierung des Produzenten-Stammes E.coli KI2  DELTA  Hi  DELTA  trp (pPLcMuHil 201) gewährleistet wird, beträgt 5 bis 10%, bezogen auf die Gesamtmenge des Eiweissstoffes der Zellen. 



  Die genannten Rekombination-Plasmid-DNS und der Stamm, der dieselbe enthält, weisen eine Reihe von Nachteilen auf, die darauf zurückzuführen sind, dass die regulierbare Expression des IL2-Gens, die vom PL-Promotor bewirkt wird, entweder ein Resident-Plasmid mit einem Gen des temperaturempfindlichen cI-Repressors (cIts857) oder die Verwendung als Rezipient eines Stammes verlangt, der eine defekte Prophage mit einem Mutanten-Allel des cI-Gens enthält. All das führt zur Einengung des Stammkreises der Rezipienten und zur potentiellen Instabilität der Rekombination-Plasmide unter den Bedingungen der Kultivierung bei der grosstechnischen Produktion infolge der reCa-abhängigen Rekombination zwischen einem Plasmid, das das Gen des Interleukin-2 enthält, mit einem Kompatiblen Plasmid oder mit den entsprechenden Bereichen der defekten Prophage. 



  Die Verwendung für die Organisation eines Hybridabschnitts für die Verknüpfung der Ribosome einer relativ nicht langen SD-Sequenz ermöglicht es ausserdem nicht, in  einem vollen Masse die potentielle Leistung des Translationsapparates von E.coli zu realisieren, was zu einem relativ niedrigen Niveau der Synthese des menschlichen Interleukin-2 in den Zellen des Produzenten-Stammes führt. 



  All das kann zu einer bedeutenden Verringerung des Gehaltes an Interleukin-2 in der Biomasse des Produzenten-Stammes bei seiner grosstechnischen Kultivierung führen, was letzten Endes die anschliessende Ausscheidung des reinen Eiweisses verkompliziert und die Ausbeute ein Endprodukt herabsetzt. 


 Darstellung der Erfindung 
 



  Die erfindungsgemässe Rekombination-Plasmid-DNS pPR-IL2-19, die die Synthese des menschlichen Interleukin-2 kodiert, das Verfahren zu ihrem Konstruieren und der Stamm der Bakterien Escherichia coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IL2-19), der dieselbe enthält, sind neu und wurden in der Literatur beschrieben. 



  Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine neue Rekombination-Plasmid-DNS, die die Synthese des menschlichen Interleukin-2 kodiert, ein Verfahren zu ihrem Konstruieren und einen hochproduktiven Produzenten-Stamm des Interleukin-2 zu entwickeln, der dieselbe enthält und die Erzeugung des Interleukin-2 in einer hohen Ausbeute bewirkt. 



  Die Aufgabe wurde durch die kennzeichnenden Merkmale von Anspruch 1 gelöst. 



  Das Verfahren zum Konstruieren der erfindungsgemässen Rekombination-Plasmid-DNS ist durch die Merkmale von Anspruch 2 gekennzeichnet. 



  Das erfindungsgemässe Plasmid ist u.a. dadurch gekennzeichnet, dass das Gen cIts857, Regulator der Einleitung der Transkription, angefangen von den früheren Promotoren der  lambda -Bakteriophage, in seiner Zusammensetzung angeordnet ist und die Expression des Gens vom Interleukin-2 unter der Kontrolle des PR-Promotors sich befindet. Dieser Umstand ermöglicht es, die potentielle recA-abhängige Rekom bination zwischen einem Plasmid, das ein Gen des Interleukin-2 kodiert, mit einem kompatiblen Residenten-Plasmid oder mit einer defekten Prophage zu vemeiden.

  Das erfindungsgemässe Verfahren zum Konstruieren des Rekombination-Plasmids pPR-IL2-19, bei dem die SD-Sequenz und das AUG-Kodon des cro-Gens der  lambda -Bakteriophage mit dem kodierenden Bereich eines Gens des menschlichen Interleukin-2 gekoppelt werden, gewährleistet die Herstellung eines Hybridabschnitts für die Verknüpfung der Ribosome eines Gens des Interleukin-2 mit optimaler primärer und räumlicher Struktur des 5 min -Endbereiches der Matrix-RNS bewirkt. 



   Zur Erfindung gehört auch ein Stamm E.coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IL2-19) Produzent des menschlichen Interleukin-2, der die Rekombination-Plasmid-DNS pPRIL2-19 enthält, der gentechnisch durch Einführung der Rekombination-Plasmid-DNS pPR-IL2-19 in die Bakterien Escherichia coli erzeugt wurde. Der erfindungsgemässe Stamm ist am 12.01.1987 in der Kollektion der Kulturen der Mikroorganismen des Allunions-Forschungsinstituts für Antibiotika UdSSR, Moskau, Nagatiskaya ulitsa, 3a deponiert und unter N. VNIIA1869 registriert. Der erfindungsgemässe Stamm ermöglicht es, eine stabile Speicherung des menschlichen Interleukin-2 unter Verhältnissen der grosstechnischen Kultivierung zu gewährleisten und eine Ausbeute an Endprodukt (von 8 bis 10).10<7> ME/l zu erreichen, was 8 bis 12%, bezogen auf die Gesamtmenge des Zelleneiweissstoffes, entspricht. 


 Bester Weg zur Ausführung der Erfindung 
 



  Das Verfahren zum Konstruieren der erfindungsgemässen Rekombination-Plasmid-DNS pPR-IL2-19 wird in mehreren Etappen durchgeführt. 



  Das Plasmid pAA1213-23 mit einer Grösse von 5,4 kb, das auf der Grundlage des Plasmids pBR-322 konstruiert wurde und das ein ColEI-Replikon, ein Gen der Resistenz gegen Ampizillin und eine kDNS-Kopie eines Gens des Interleukin-2 enthält, dessen Expression durch einen Promotor und die SD-Sequenz des Tryptophan-Operons E-coli bewirkt wird, wird durch Substitution  des Abschnittes der Restriktion für Stu I durch den Abschnitt der Restriktion Bgl II modifiziert und man erhält das Plasmid pAA1213-23B, das man mit der Restriktase Cfr13 behandelt und die entstehenden Einstrang-Enden der DNS-Moleküle mit dem Klenowschen Fragment der DNS-Polymerase I E.coli vervollständigt. Dann wird das Cfr13-Fragment des Plasmids pAA1213-23B, das ein Gen des Interleukin-2 enthält, durch präparative Elektrophorese im Gel der leichtschmelzenden Agarose ausgeschieden. 



  Man führt das Konstruieren des Vektor-Plasmids pPR124B durch. Hierfür wird in der DNS des Plasmids pPR40 am Abschnitt des Wiedererkennens der Restriktase Bgl II die Deletion mit Hilfe der Exonuklease Bal31 vorgenommen, hierdurch erhält man das Plasmid pPR100, in dem der Abschnitt der Wiedererkennung BamHI unmittelbar hinter dem Bereich der Kopplung der Ribosome der  lambda -Phage liegt, wobei im Bereich des iniziierenden AUG-Kodons folgende Sequenz entsteht: 
EMI7.1
 



  Im weiteren wird das kleinere PstI-BamHI-Fragment des Plasmids pPR100 mit dem grösseren PstI-BamHI-Fragment des Plasmids pML24 mit Hilfe der konventionellen gentechnischen Methodiken vereinigt und man erhält das Plasmid pPR124, in das man mit Hilfe eines Oligonukleotid-Linkers einen Abschnitt des Wiedererkennens der Restriktase Bgl II anstelle XbaI einführt und man das Plasmid pPR124B erhält. 



  Dann wird das Cfr13-Fragment des Plasmids pAA1213-23B mit einem Gen des Interleukin-2 mit Hilfe der DNS-Ligase der T4-Phage in die Zusammensetzung des Vektor-Moleküls pPR124 integriert, das mit der Restriktase BamHI gespaltet ist, und bei dem mit der SI-Endonuklease Einfaden-Enden der DNS entfernt sind, dann wird das Präparat mit der Restriktase Bgl II behandelt, wodurch die Zyklisierung der linearen DNS-Moleküle mit der DNS-Ligase T4 bewirkt wird. Mit dem hergestellten Gemisch werden die Zellen E.coli C600 transformiert, die Transformanten  werden in einen Nährboden mit Ampizillin inokuliert und bei einer Temperatur von 28 DEG C mit anschliessender Selektion auf verringerte Wachstumsgeschwindigkeit bei einer Temperatur von 42 DEG C kultiviert.

  Aus den dadurch ausgewählten Klonen wird die Plasmid-DNS, die als pPR-IL2-19 bezeichnet wird, ausgeschieden, in der die Genauigkeit der Wiedervereinigung der Fragmente durch Wiederherstellung der früher fehlenden Sequenz des Wiedererkennens der Restriktase BspRI an der Stossstelle der Ausgangsabschnitte der DNS geprüft wird. 



  Der erfindungsgemässe Stamm E.coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IL2-19) erhält man durch Transformation eines Rezipienten-Stammes der Bakterien Escherichia coli mit der Rekombination-Plasmid-DNS pPR-IL2-19. Als Rezipienten-Stamm können die Stämme E.coli C600, E.coli VNIIGENETIKA VL-903 (deponiert in der Allunionskollektion der industriellen Mikroorganismen des Unions-Forschungsinstitutes für Genetik und Selektion industrieller Mikroorganismen und registriert unter Nr. BKIIMB-3546) und andere Derivate E.coli K12 verwendet werden. Nach der Transformation erfolgt die Auswahl von Rekombination-Klonen am Nährboden mit Ampizillin bei einer Temperatur von 28 DEG C. 



  Der erfindungsgemässe Stamm wird durch die Synthese des menschlichen Interleukin-2 unter Verhältnissen der Depression des PR-Promotors, durch die Resistenz gegen Ampizillin sowie durch eine verringerte Wachstumsgeschwindigkeit bei der Kultivierung der Zellen bei einer Temperatur von 42 DEG C gekennzeichnet. 



  Der erfindungsgemässe Stamm gestattet es, eine stabile Speicherung des menschlichen Interleukin-2 unter Bedingungen der grosstechnischen Kultivierung zu gewährleisten, und führt zu einer erhöhten Synthese desselben in den Zellen E.coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IL2-19), die bis (8-10).10<7> Einheiten/l beträgt, was 8 bis 12%, bezogen auf die Gesamtmenge des Zelleneiweissstoffes, entspricht. 



  Der Stamm E.coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IL2-19) wird durch folgende Merkmale gekennzeichnet. 



  Morphologische Merkmale. Die Zellen sind gerade,  stäbchenförmig, schwachbeweglich, sind fähig zur Bildung von fadenförmigen Formen, gramm-negativ, nichtsporentragend, die Grösse der einzelnen Zellen beträgt von 3 bis 5  mu m. 



  Kulturmerkmale. Die Zellen wachsen gut an festen und flüssigen, einfachen, synthetischen, halbsynthetischen und komplexen Nährböden. Beim Wachsen an dem agarisierten Hottinger-Bouillon beziehungsweise dem L-Bouillon, bilden sie glatte, runde, schwachmattierte, verschleimte Kolonien. Bei der Züchtung an flüssigen Nährböden vom Typ des L-Bouillons oder M9 bilden sie mit den Kasaminsäuren eine homogene Suspension. 



  Physiologisch-biochemische Merkmale. Die Zellen sind zum Wachstum in einem Temperaturenbereich von 5 bis 40 DEG C (Optimum beträgt 37 DEG C) bei einem pH-Wert von 6,7 bis 7,5 fähig. Als Kohlenstoffquelle verwendet man Kohlenhydrate (beispielsweise Saccharose) und Aminosäuren. Die Zellen besitzen Auxotrophie nach Methionin. Als Stickstoffquelle können Mineralsalze in Ammoniumform sowie organische Verbindungen in Form von Pepton, Trypton, Hefeextrakt und Aminosäuren dienen. 



   Resistenz gegenüber Antibiotika. Der Stamm ist resistent gegen Ampizillin in einer Konzentration von höchstens 100 mg/l bei Züchtung an flüssigen und agarisierten Nährböden. 



  Stabilität des Plasmids. Bei der Aufbewahrung der Zellen am agarisierten Nährboden, bei einer Reihe von hintereinander folgenden Überimpfungen und während einer Submerskultivierung am flüssigen Nährboden mit einem Antibiotikum erfolgt kein Verlust und keine Umgestaltung des Plasmids. 



  Nachstehend wird die Erfindung anhand von Beispielen der Durchführung des Verfahrens zum Konstruieren des erfindungsgemässen Plasmids, des Verfahrens zur Erzeugung eines Stammes, seiner Kultivierung erläutert und durch folgende Figuren veranschaulicht, in denen es zeigen: 
 
   Fig. 1 physikalisch-genetische Karte des Rekombination-Plasmids pPR-IL2-19; 
   Fig. 2 Schema der Erzeugung des erfindungsgemässen Rekombination-Plasmids pPR-IL2-19. 
 


 Beispiel 1 
 



  Das Konstruieren des erfindungsgemässen Rekombination-Plasmids pPR-IL2-19 führt man in mehreren Etappen durch. Zunächst konstruiert man das Vektor-Plasmid pBR124B. 



  3  mu g DNS-Plasmid pPR40 spaltet man mit der Restriktase Bgl II in 60  mu l Pufferlösung für Restriktion-1, die 10 mMol tris-HCl (pH-Wert = 8,0), 6 mMol MgCl2, 6 mMol 2-Merkaptoäthanol, 150 mMol NaCl enthält. Die DNS wird mit zwei Volumina Äthanols umgefällt. Den Niederschlag löst man in 20  mu l H2O auf. Die Behandlung der DNS mit der Exonuklease Bal31 führt man innerhalb von 3 min bei einer Temperatur von 30 DEG C in 30  mu l Pufferlösung durch, die 3 Mol NaCl, 60 mMol CaCl2, 60 mMol MgCl2, 100 mMol tris-HCl, (pH-Wert beträgt 8,0) und 5 mMol Äthylendiamintetraessigsäure enthält. Die DNS wird mit 2 Volumina Äthylalkohols umgefällt. Den Niederschlag löst man in 10  mu l H2O auf. Die Behandlung mit der Restriktase BamHI führt man in einer Probe mit einem Volumen von 30  mu l durch, die die genannte Pufferlösung für Restriktion-1 enthält.

  Das Nachbauen der Einketten-3 min -Endabschnitte der DNS führt man durch Behandlung mit dem Klenowschen Fragment der DNS-Polymerase I E.coli in einer Probe mit 20  mu l Volumen durch, die 10 mMol tris-HCl, (pH-Wert beträgt 8,0), 10 mMol MgCl2, 2  mu g DNS-Präparat, je 30  mu Mol jedes der Desoxyribonukleosidtriphosphate enthält, 5 Einheiten des DNS-Fermentes werden aus dem Reaktionsgemisch mit Äthanol umgefällt und in 100  mu l H2O aufgelöst. Die Wiedervereinigung der linearisierten Plasmid-DNS führt man bei einer Temperatur von 16 DEG C während 12 h mit Hilfe der DNS-Ligase der T4-Phage in einer Probe durch, die eine Pufferlösung für Ligierung (60 mMol tris-HCl, (pH-Wert = 7,6), 10 mMol MgCl2, 10 mMol 2-Merkaptoäthanol, 0,4 mMol Adenosintriphosphat) und 1  mu g DNS enthält.

  Mit dem hergestellten Gemisch werden die Zellen E.coli C600 transformiert, die Effektivität der Transformation beträgt bis 5.10<6> Kolonien je 1  mu g des nativen Plasmids pPR40. Es werden die gegen Ampizillin re sistenten Klone (100 g/ml) gewählt, aus ihnen wird die Plasmid-DNS nach dem modifizierten Birnboim- und Doly-Verfahren ausgeschieden und für die Restriktionsanalyse verwendet. Im Ergebnis erhält man das Plasmid pPR100, das einen unikalen Abschnitt der Spaltung von BamHI enthält. Danach konstruiert man das Plasmid pPR124. Hierfür spaltet man 2  mu g DNS-Plasmid pML24 zusammen mit den Restriktasen BamHi und PstI in 40  mu l Pufferlösung für Restriktion-1 und vereinigt man mit Hilfe der DNS-Ligase der T4-Phage bei einer Temperatur von 0 DEG C mit Fragmenten, die bei der Hydrolyse des DNS-Plasmids pPR100 mit den Restriktasen BamHI und PstI erhalten wurden.

  Mit dem hergestellten DNS-Präparat transformiert man die Zellen E.coli C600 mit Auswahl der Transformanten an einem Nährboden mit Ampizillin mit anschliessender Selektion der Cm<r>-Klone an einem Nährboden mit 300  mu g/ml Chloramphenikol bei der Kultivierung der Zellen bei einer Temperatur von 42 DEG C. Aus den dadurch ausgewählten Klonen scheidet man die Plasmid-DNS und untersucht man mit Hilfe der Restriktionsanalyse. Im Ergebnis erhält man das Plasmid pPR124, das einen Abschnitt der Spaltung mit der Restriktase BamHI enthält. 



  Dann werden 3  mu g DNS-Plasmid pPR124 mit der Restriktase XbaI in 70  mu l Pufferlösung für Restriktion-1 gespaltet, die 10 mMol tris-HCl (pH-Wert beträgt 7,9), 6 mMol MgCl2, 6 mMol 2-Merkaptoäthanol und 150 mMol NaCl enthält, die DNS wird mit zwei Volumina Äthanol umgefällt. Den Niederschlag löst man in 15  mu l H2O auf. Das Nachbauen der Einketten-3 min -Endabschnitte der DNS führt man durch Behandlung mit dem Klenowschen Fragment der DNS-Polymerase I E.coli in einer Probe mit 20  mu l-Volumen durch, die 10 mMol tris-HCl (pH-Wert = 8,0), 10  mu Mol MgCl2, 2  mu g DNS-Präparat je 30  mu Mol jedes der Desoxyribonukleosidtriphosphate und 5 Einheiten des Fermentes enthält. Die DNS wird aus dem Reaktionsgemisch mit Äthanol umgefällt und in 100  mu l H2O aufgelöst.

  Die Wiedervereinigung der linearisierten Plasmid-DNS mit den Bgl-Linkern führt man bei einer Temperatur von 16 DEG C innerhalb von 12 h mit Hilfe der DNS-Ligase der T4-Phage in einer Probe durch,  die eine Pufferlösung für Ligierung (60 mMol tris-HCl, (pH-Wert = 7,6), 10 mMol MgCl2, 10 mMol 2-Merkaptoäthanol und 0,4 mMol Adenosintriphosphat), 2  mu g der Plasmid-DNS und 0,5  mu g Linker enthält. Nach der Ligierung wird die DNS aus dem Reaktionsgemisch mit Äthanol gefällt, aufgelöst und der fermentativen Hydrolyse mit der Restriktase Bgl II in einer Probe mit 40  mu l-Volumen ausgesetzt, die eine Pufferlösung für Restriktion-2 (6 mMol tris-HCl, pH-Wert beträgt 7,6), 6 mMol MgCl2, 6 mMol 2-Merkaptoäthanol, 50 mMol NaCl) enthält.

  Die DNS wird erneut mit Äthanol gefällt, aufgelöst und der Zyklisierung ausgesetzt, wofür man 1  mu g Präparat der Plasmid-DNS in 240  mu l Pufferlösung für Ligierung mit der DNS-Ligase der T4-Phage behandelt. Mit dem hergestellten Gemisch transformiert man die Zellen E.coli C600. 



  Die Effektivität der Transformation beträgt höchstens 5.10<6> Kolonien je 1  mu g des nativen Plasmids pPR124. Man wählt Klone, die gegen Ampizillin (100  mu g/ml) resistent sind, aus, aus ihnen schneidet man die Plasmid-DNS aus und verwendet man dieselbe für die Restriktionsanalyse. Im Ergebnis erhält man das Plasmid pPR124B, das im Unterschied zum Ausgangsvektor-Molekül pPR124 einen unikalen Abschnitt der Spaltung von Bgl II anstelle der vorhandenen Sequenz der Wiedererkennung Xbal (Fig. 2) enthält. 



   Dann werden 3  mu g des DNS-Plasmids pPR124B mit der Restriktase BamHI in einer Probe mit 12  mu l-Volumen gespaltet, die eine Pufferlösung für Restriktion-1 enthält. Die Reaktion wird durch die Phenol-Deproteinisierung der DNS und durch die Umfällung der Nukleinsäure mit Äthanol zum Stillstand gebracht. Den Niederschlag löst man in 20  mu l H2O auf. Die Entfernung der bei der Spaltng der DNS mit der Restriktase entstehenden Einstrang-Enden erfolgt unter Zuhilfenahme der SI-Endonuklease. Hierfür wird die DNS mit 30 Einheiten der SI-Endonuklease in einer Probe mit 50  mu l-Volumen, die 30 mMol CH3COONa, (pH-Wert = 4,4), 4,5 mMol ZnSO4, 250 mMol NaCl enthält, innerhalb von 20 min bei einer Temperatur von 20 DEG C hydrolysiert. Die Reaktion wird durch die Behandlung mit Phenol zum Stillstand  gebracht, und die DNS wird mit Äthanol umgefällt. Den Niederschlag löst man in 15  mu l H2O auf.

  



  Dann erhält man das Plasmid pAA1213-23B. Hierfür werden 3  mu g des DNS-Plasmids pAA1213-23 mit einer Grösse von 5,4 Tausend Basenpaaren, das auf der Grundlage des Plasmids pBR-322 konstruiert ist und die ein ColEI-Replikon, ein Gen der Resistenz gegen Ampizillin und eine kDNS-Kopie eines Gens des menschlichen Interleukin-2 enthält, dessen Expression durch einen Promotor und durch die SD-Sequenz des Tryptophanoperrons E.coli bewirkt wird, in 10 Einheiten der Restriktase Stu I in einer Probe mit 30  mu l-Volumen gespaltet, die eine Pufferlösung für Restriktion-1 [10 mMol tris-HCl (pH-Wert beträgt 7,9), 6 mMol MgCl2, 6 mMol 2-Merkaptoäthanol und 150 mMol NaCl] enthält, dann wird die DNS aus dem Reaktionsgemisch durch den Äthanolzusatz gefällt. Der Niederschlag wird mittels Zentrifugierens in 20  mu l H2O ausgeschieden.

  Die Wiedervereinigung der linearisierten Plasmid-DNS mit den Bgl-II-Linkern führt man mit Hilfe von 20 Einheiten der DNS-Ligase der T4-Phage in einer Probe mit 30  mu l-Volumen durch, die eine Pufferlösung für Ligierung [60 mMol tris-HCl, (pH-Wert beträgt 7,6), 10 mMol MgCl2, 10 mMol 2-Merkaptoäthanol und 0,4 mMol Adenosintriphosphat], 2  mu g der Plasmid-DNS und 0,5  mu g Linker enthält. Nach der Ligierung wird die DNS aus dem Reaktionsgemisch mit Äthanol gefällt, aufgelöst und der fermentativen Hydrolyse mit der Restriktase Bgl II in einer Probe mit 40  mu l-Volumen ausgesetzt, die eine Pufferlösung für Restriktion-2 [6 mMol tris-HCl (pH-Wert beträgt 7,7), 6 mMol MgCl2, 6 mMol 2-Merkaptoäthanol und 50 mMol NaCl] enthält.

  Die DNS wird erneut mit Äthanol gefällt, aufgelöst, und man gewährleistet die Zyklisierung der DNS-Moleküle, wofür man 1  mu g Präparat der Plasmid-DNS in 240  mu l einer Pufferlösung für Ligierung mit 2 Eineiten der DNS-Ligase der T4-Phage behandelt. Mit dem hergestellten Gemisch transformiert man die Zellen E.coli C600. Die Effektivität der Transformation beträgt bis 5.10<6> Kolonien je 1  mu g des nativen Plasmids pAA1213-23. Es werden die gegen Ampizillin (100  mu g/ml)  Klone ausgewählt, aus ihnen wird die Plasmid-DNS nach dem modifizierten Birnboim- und Doly-Verfahren ausgeschieden, und man verwendet dieselbe für die Restriktionsanalyse. Das dadurch erzeugte Plasmid pAA1213-23B enthält im Unterschied zum Ausgangs-Rekombination-Molekül pAA1213-23 einen unikalen Abschnitt der Spaltung von Bgl II anstelle der vorhandenen Sequenz der Wiedererkennung Stu I (Fig. 2). 



  Man spaltet 30  mu g DNS-Plasmid pAA1213-23B mit der Restriktase Cfr13 (200 Aktivitätseinheiten) in einer Probe mit 100  mu l-Volumen, die eine Pufferlösung für Restriktion-1 enthält. Die Produkte der fermentativen Hydrolyse werden der Elektrophorese in 1,1%igem Gel der leichtschmelzenden Agarose in einem tris-Azetat-Puffer-System bei einer Feldspannung von 5 V/cm ausgesetzt. Die Gel-Zone, die ein DNS-Fragment mit einem Gen des Interleukin-2 mit einer Länge von 750 Basenpaaren enthält, wird ausgeschnitten, und man führt die Elution der DNS durch. Zum Nachbauen der Einstrang-Enden der DNS mit Hilfe des Klenowschen Fragmentes der DNS-Polymerase I E.coli wird das aus dem Gel ausgeschiedene Fragment in einer Probe mit einem Volumen von 20  mu l behandelt, die 10 mMol tris-HCl, (pH-Wert beträgt 8,0), 10 mMol MgCl2, je 30  mu Mol jedes der Desoxyribonukleosidphosphate enthält.

  Die Reaktion wird mittels Durchwärmung zum Stillstand gebracht, die DNS wird aus dem Gemisch mit Äthanol umgefällt und in 20  mu l H2O aufgelöst. 



  Dann wird das vorher erzeugte Präparat des linearisierten Plasmids pBR124B mit einem Fragment des Plasmids pAA1213-23B wiedervereinigt. Hierfür behandelt man 1  mu g DNS-Plasmid und 2  mu g Fragment mit der DNS-Ligase der T4-Phage in einer Pufferlösung für Ligierung in einem Volumen des Reaktionsgemisches von 30  mu l. Nach der Umfällung der DNS und der Auflösung des Niederschlags in 20  mu l H2O wird das Präparat mit der Restriktase Bgl II, wie oben beschrieben, behandelt, man fällt die DNS nochmals mit Äthanol um, man löst und gewährleistet die Wiedervereinigung der linearen DNS-Moleküle zu Ringformen mit Hilfe der  DNS-Ligase der T4-Phage bei der Behandlung des Fermentenpräparates in einem Volumen des Reaktionsgemisches von 300  mu l.

  Das hergestellte Präparat verwendet man für die Transformation der Zellen E.coli C600 mit anschliessender Selektion der Transformanten an einem Nährboden mit Ampizillin bei der Kultivierung der Zellen innerhalb von 24 h bei einer Temperatur von 28 DEG C. Aus den angefallenen Transformanten wählt man Varianten aus, die eine verringerte Fähigkeit zum Wachstum bei einer Temperatur von 42 DEG C aufweisen. Aus den genannten Klonen scheidet man die Plasmid-DNS, wie oben beschrieben, aus und setzt man der Restriktionsanalyse aus. In dem erzeugten Plasmid pPR-IL2-19 (Fig. 2) entsteht an der Stossstelle der zu vereinigenden DNS-Abschnitte, die das erste Kodon des Cro-Gens der  lambda -Phage und das Ala-Kodon des menschlichen Interleukin-2 kodieren, ein Abschnitt der Spaltung der Restriktionsendonuklease BspRI. 


 Beispiel 2 
 



  Die Erzeugung des Stammes E.coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IL2-19)-Produzenten des menschlichen Interleukin-2 erfolgt wie folgt: Das Plasmid pPR-IL2-19, das die Synthese des menschlichen Interleukin-2 kodiert, führt man durch Transformation in die Zellen des Besipienten-Stammes E.coli VNIIGENETIKA VL 903 ein, der in der Allunionskollektion der industriemässigen Mikroorganismen des Unionsforschungsinstitutes für Genetik und Selektion der industriemässigen Mikroorganismen deponiert und unter Nr. BKIIM B-3546 registriert ist. Die Effektivität der Transformation der Zellen E.coli VNIIGENETIKA VL 903 beträgt etwa 10<6> Klone je 1  mu g des nativen Plasmids pPR-IL2-19. Die Transformanten werden an einem Nährboden gewählt, der Ampizillin (100  mu g/ml) nach der Kultivierung der Zellen innerhalb von 24 h bei einer Temperatur von 28 DEG C enthält.

   Aus den ausgewählten Klonen scheidet man die Plasmid-DNS aus und weist man ihre Identität mit dem Präparat pPR-IL2-19 mit Hilfe der Restriktionsanalyse nach. Man erhält den Stamm E.coli VL 903 (pPR-IL2-19)-Produizent des menschlichen Interleukin-2. 


 Beispiel 3 
 



  Den Stamm E.coli VL 903 (pPR-IL2-19) züchtet man bei einer Temperatur von 28 DEG C an einem abgeschrägten agarisierten Hottinger-Nährboden, der 50  mu g/ml Ampizillin enthält, innerhalb von 14 h. Die an den Abschrägungen gewachsene Biomasse verwendet man für die Gewinnung des Inokulums. Hierfür werden die Zellen in die Erlenmeyerkolben mit einem Volumen von 750 ml mit 100 ml Hottinger-Nährboden übertragen, der 100  mu g/ml Ampizillin enthält, und bei einer Temperatur von 28 DEG C in einer Schüttelvorrichtung bei 240 U/min innerhalb von 6 h gezüchtet. Die optische Dichte des Inokulums beträgt 1,5 bis 2,5 Einheiten. 



  Die Fermentierung führt man in einem Fermentationsapparat durch, der mit Systemen der Regelung des pH-Wertes, der Temperatur, der Geschwindigkeit des Vermischens und der Aeration ausgerüstet ist. Für die Fermentierung verwendet man den Hottinger-Nährboden mit 100  mu g/ml Ampizillin und 10 g/l Glykose. Das Inokulum trägt man in einer Menge von 5 bis 10 Masse-% ein. Die Kultivierung erfolgt bei einem pH-Wert von 6,6 bis 6,8, wobei dieser Stand mittels Zuführung von Ammoniakwasser unterhalten wird. Den ersten Teil der Fermentierung führt man bis zu einer optischen Dichte gleich 3,5 bei 550 nm und einer Temperatur von 28 DEG C durch, danach wird die thermische Induktion vorgenommen, indem man die Temperatur innerhalb von 5 min von 42 auf 45 DEG C erhöht, wonach man die Fermentierung weitere 2 h fortsetzt. 



  Nach der Beendigung der Prozessführung werden die Zellen zwecks Ermittlung der Aktivität des menschlichen Interleukin-2 aus 1 ml Kulturflüssigkeit durch Zentrifugieren ausgefällt, der Niederschlag wird in 1 ml einer 8 molaren Lösung des Guanidinchlorids bei einer Temperatur von 20 DEG C innerhalb von 40 min resuspendiert. Danach wird der Niederschlag durch Zentrifugieren dekantiert, und man ermittelt die Aktivität der überstehenden Flüssigkeit einer Fraktion des Interleukin-2. Biologische Aktivität des hergestellten Interleukin-2 beträgt (8-10).10<7> ME/l. 



  Zur Ermittlung des Anteils des synthetisierten menschlichen Interleukin-2, bezogen auf die Gesamtmenge des Zelleneiweisses, werden die Zellen aus 1 ml Kulturflüssigkeit durch Zentrifugieren ausgefällt und, wie oben beschrieben, behandelt. Das Präparat analysiert man mittels Elektrophorese im 15%igen Polyakrylamid-Gel in Gegenwart des 0,1%igen Natriumdodezylsulfats. Die im Gel getrennten Eiweissstoffe werden in der Kumassi-Lösung R-250 "Serva" (BRD) nach einer Standard-Methodik durchgefärbt. Der quantitative Gehalt an Eiweissstoffen in den Zonen ermittelt man nach der Abtastung des durchgefärbten Gels in einem Densitometer.

  Die Identifizierung der Zone, die dem in den Zellen synthetisierten reifen menschlichen Interleukin-2 entspricht, führt man aufgrund des Vergleichs mit der elektrophoretischen Beweglichkeit der Markierungseiweissstoffe sowie der mit Hilfe des Blottings getrennten Eiweissstoffe auf Nitrozellulose-Filter unter anschliessender Entwicklung der Interleukin-Zonen mittels Bearbeitung in Lösungen durch, die Monoklonal-Mäuseantikörper gegen Interleukin-2 und Antimäuse-Kaninchen-Antikörper, die mit der Peroxydase aus Meerrettich konjugiert sind, enthalten. Nach dem entsprechenden Färbungsvorgang entwickelt sich die Interleukin-Zone in Form eines braunen Streifens an dem ungefärbten Hintergrund des Nitrozellulose-Filters.

   Der Anteil des in den Zellen des Eiweissproduktes synthetisierten Gens des Interleukin-2 beträgt höchstens 12%, bezogen auf die Gesamtmenge des Zelleneiweissstoffes. 


 Gewerbliche Verwertbarkeit 
 



  Die erfindungsgemässe Rekombination-Plasmid-DNS pPR-IL2-19, die die Synthese des menschlichen Interleukin-2 kodiert, findet Anwendung bei der Erzeugung von Produzenten-Stämmen des menschlichen Interleukin-2 von hoher Aktivität. Der erfindungsgemässe Stamm E.coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IL2-19)-Produzent des menschlichen Interleukin-2 findet Anwendung in der mikrobiologischen und medizinischen Industrie bei der Herstellung des menschlichen Interleukin-2, der in der medizinischen Praxis angewendet werden kann.

Claims

1. Rekombination-Plasmid-DNS pPR-IL2-19, die die Synthese des menschlichen Interleukin-2 kodiert, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Grösse von 3,85 kb hat und sich aus folgenden Elementen zusammensetzt: - einem BamHI - Bgl II-Fragment mit einer Grösse von 3,4 kb des Vektor-Plasmids pPR124B mit der Restriktionskarte nach Fig. 2, - einem Cfr13 - Bgl II-Fragment mit einer Grösse von 0,45 kb des Plasmids pAA1213-23B, das ein durch einen Bgl II-Linker anstelle des Stu I-Linkers modifiziertes Plasmid pAA1213-23 mit einer Grösse von 5,4 kb, dem ColEI-Replikon des Plasmids pBR-322, einem Gen der Resistenz gegen Ampizillin und einer kDNS-Kopie des Gens des menschlichen Interleukin-2 darstellt, dessen Expression durch einen Promotor und die SD-Sequenz eines Tryptophan-Operons E.coli bewirkt wird, und durch folgende Merkmale charakterisiert wird:

: - sie enthält einen Abschnitt zur Einleitung der Replikation, ColEI-Replikon, ein Gen des temperaturempfindlichen Repressors cIts857 der lambda -Phage, ein Gen der Resistenz gegen Ampizillin, ein Tandem von rho -unabhängigen Terminatoren der Transkription der fd-Phage, einen Regulator-Bereich PROR, eine SD-Sequenz und ein initiierendes ATG-Kodon des cro-Gens der lambda -Phage, welches die Sequenz des reifen menschlichen Interleukin-2 kodiert;

- die Lage des Regulator-Bereiches PROR, des ATG-Kodons des cro-Gens mit der Sequenz des Gens des Interleukin-2 und den Terminatoren der Transkription fd ist derart, dass vor dem IL-2-Gen ein Hybridabschnitt der Verknüpfung von Ribosomen vorliegt, der folgende Nukleotid-Sequenz aufweist: 5 &tilde& -...TAAGGAGGTTGTATGGCC...-3 min , worin TAAGGAGGT und ATG die SD-Sequenz bzw. das induzierende Kodon des cro-Gens, GCC das erste Ala-Kodon des Interleukin-2 ist und hinter dem terminierenden Kodon des Gens des Interleukin-2 liegt das Tandem der rho -unabhängigen Terminatoren der Transkription fd; - sie enthält einzelne Abschnitte des Wiedererkennens der Restriktasen ClaI, wobei die Koordinate von ClaI den Beginn der Ablesung (0) ist, XbaI ( &tilde& 990), Bgl II ( &tilde& 1250), PstI( &tilde& 3070);

sie ist am 12.01.1987 in der Kollektion der Kulturen der Mikroorganismen des Allunionsforschungsinstitutes für Antibiotika in E.coli deponiert und unter Nr. VNIIA 1869 registriert.

2. Verfahren zum Konstruieren der Rekombination-Plasmid-DNS pPR-IL2-19 nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Plasmid pAA1213-23 mit einer Grösse von 5,4 kb, welches ein mit einem ColEI-Replikon, einem Gen der Resistenz gegen Ampizillin und einer kDNS-Kopie eines Gens des menschlichen Interleukin-2 versehenes Plasmid pBR 322 darstellt, dessen Expression durch einen Promotor und durch die SD-Sequenz eines Tryptophanoperons E.coli bewirkt wird, mittels Substitution eines Abschnittes der Restriktion für StuI gegen einen Abschnitt der Restriktion Bgl II modifiziert,

das hergestellte Plasmid pAA1213-23B mit der Restriktase Cfr-13 behandelt wird und die entstehenden Einzelstrang-Enden der DNS-Moleküle mit dem Klenowschen Fragment der DNS-Polymerase I E.coli vervollständigt werden, wonach man das entstandene Cfr-13-Fragment des Plasmids pAA1213-23B, enthaltend ein Gen des Interleukin-2, mittels präparativer Elektrophorese im Agarose-Gel ausscheidet und mit Hilfe der DNS-Ligase der T4-Phage in die Zusammensetzung des Vektormoleküls pPR124B mit der Restriktionskarte nach Fig.

2 integriert, das man vorher mit BamHI spaltet und die erhaltenen Einstrang-Enden der DNS am Abschnitt der Restriktion mit der SI-Endonuklease entfernt, dass man das angefallene Gemisch mit der Restriktase Bgl II behandelt und die DNS-Moleküle zu Ringformen mit der DNS-Ligase der T4-Phage vereinigt, man mit dem entstehenden Gemisch die Zellen E.coli C600 transformiert, man die Transformanten in einen Nährboden mit Ampizillin inokuliert und bei einer Temperatur von 28 DEG C mit anschliessender Selektion auf eine verringerte Wachstumsgeschwindigkeit bei einer Temperatur von 42 DEG C kultiviert, man aus den gewählten Klonen das Plasmid pPR-IL2-19 ausscheidet, in dem die Genauigkeit der Wiedervereinigung der Fragmente durch die Wiederherstellung an der Stossstelle der Ausgangsabschnitte der DNS der früher fehlenden Sequenz der Wiedererkennung der Restriktase BspRI geprüft wird.

3.

Stamm E.coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IL2-19) als Produzent des menschlichen Interleukin-2, der die Rekombination-Plasmid-DNS pPR-IL2-19 nach Anspruch 1 enthält, der am 12.01.1987 in der Kollektion der Kulturen der Mikroorganismen des Allunions-Forschungsinstitutes für Antibiotika deponiert und unter Nr. VNIIA 1869 registriert wurde. 1. Rekombination-Plasmid-DNS pPR-IL2-19, die die Synthese des menschlichen Interleukin-2 kodiert, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Grösse von 3,85 kb hat und sich aus folgenden Elementen zusammensetzt: - einem BamHI - Bgl II-Fragment mit einer Grösse von 3,4 kb des Vektor-Plasmids pPR124B mit der Restriktionskarte nach Fig. 2, - einem Cfr13 - Bgl II-Fragment mit einer Grösse von 0,45 kb des Plasmids pAA1213-23B, das ein durch einen Bgl II-Linker anstelle des Stu I-Linkers modifiziertes Plasmid pAA1213-23 mit einer Grösse von 5,4 kb, dem ColEI-Replikon des Plasmids pBR-322, einem Gen der Resistenz gegen Ampizillin und einer kDNS-Kopie des Gens des menschlichen Interleukin-2 darstellt, dessen Expression durch einen Promotor und die SD-Sequenz eines Tryptophan-Operons E.coli bewirkt wird, und durch folgende Merkmale charakterisiert wird:

sie ist am 12.01.1987 in der Kollektion der Kulturen der Mikroorganismen des Allunionsforschungsinstitutes für Antibiotika in E.coli deponiert und unter Nr. VNIIA 1869 registriert. 2. Verfahren zum Konstruieren der Rekombination-Plasmid-DNS pPR-IL2-19 nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Plasmid pAA1213-23 mit einer Grösse von 5,4 kb, welches ein mit einem ColEI-Replikon, einem Gen der Resistenz gegen Ampizillin und einer kDNS-Kopie eines Gens des menschlichen Interleukin-2 versehenes Plasmid pBR 322 darstellt, dessen Expression durch einen Promotor und durch die SD-Sequenz eines Tryptophanoperons E.coli bewirkt wird, mittels Substitution eines Abschnittes der Restriktion für StuI gegen einen Abschnitt der Restriktion Bgl II modifiziert,

2 integriert, das man vorher mit BamHI spaltet und die erhaltenen Einstrang-Enden der DNS am Abschnitt der Restriktion mit der SI-Endonuklease entfernt, dass man das angefallene Gemisch mit der Restriktase Bgl II behandelt und die DNS-Moleküle zu Ringformen mit der DNS-Ligase der T4-Phage vereinigt, man mit dem entstehenden Gemisch die Zellen E.coli C600 transformiert, man die Transformanten in einen Nährboden mit Ampizillin inokuliert und bei einer Temperatur von 28 DEG C mit anschliessender Selektion auf eine verringerte Wachstumsgeschwindigkeit bei einer Temperatur von 42 DEG C kultiviert, man aus den gewählten Klonen das Plasmid pPR-IL2-19 ausscheidet, in dem die Genauigkeit der Wiedervereinigung der Fragmente durch die Wiederherstellung an der Stossstelle der Ausgangsabschnitte der DNS der früher fehlenden Sequenz der Wiedererkennung der Restriktase BspRI geprüft wird. 3.

Stamm E.coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IL2-19) als Produzent des menschlichen Interleukin-2, der die Rekombination-Plasmid-DNS pPR-IL2-19 nach Anspruch 1 enthält, der am 12.01.1987 in der Kollektion der Kulturen der Mikroorganismen des Allunions-Forschungsinstitutes für Antibiotika deponiert und unter Nr. VNIIA 1869 registriert wurde.