JPS58116498A - Ｉｌ‐２をコードする新規伝令ｒｎａの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、Ｉ　Ｌ−２をコードする伝令ＲＮＡに関する
。

さら忙詳しくは、本発明は、とトエＬ−２をコードする
新規伝令ＲＮＡ　、その製造方法およびそれを用いるヒ
）ＩＬ−２の製造法である。

ヒトＩＬ−１は、七Ｆ！細胞の増殖に４ＩＰ須な因子で
ある。〔イムノロジカル　レビュー、第Ｓ１巻２５７頁
（１９８０年）〕　即ち、種々の免疫反応において中心
的な役割を果たしているヒト！細胞をインビ）口で、そ
の機能を保持したｆ−１増殖させ継代維持して行く上に
必須の因子である。

ヒト末梢血９ンバ球をレクチンで刺激した培養上清中に
Ｔ細胞の増殖を促進する因子の存在することが見出され
、ＴＣＧＦ’（Ｔ細胞増殖因子）と名付叶られ九〔サイ
エンス、第１９３１１１００７頁（１９７６年）〕。そ
の後、このＴＣＧＦ活性を示す因子と、胸ｓｍ胞の分裂
を促進する因子や、ヌードマウスの抗体産生を促進する
因子と同じものであることが示唆され、これらリンホカ
イン類を一括してＩＬ−２（インターロイキン２）とよ
ぶことになつ九〔シマーナル　オプ　イムノロジー、第
１２３巻２９２８頁（１９７９年）〕。各因子の実体は
現在まだ充分明らかでなく、間−因子が異なる検定法で
検定された結果、異なっ九名称で呼ばれている可能性も
強いつＸＬ−２発見にのキラーＴｌｌＩ４胞やナチュラ
ル　キフー細胞、トキている（例えばネイチャー、第２
６８巻１５４頁（１９７７年）〕。ｊ０１１ＫＩＬ−２
に用いて正常！細胞をインヒトｐで継代し九夛、クロー
ン化するという直接的用造の１１ｋＫＩＬ−２には次の
様な用途がある。すなわちＩＬ−２を用いることによ〕
ある特殊な抗原、例えば腫瘍抗原を認識し、破壊する、
抗原特異的キラー〒細胞をインビトロで増幅させること
が出来る〔ネイチャー、第２８０巻６８５頁（１９７９
年）〕、＊際に動物実験ではこの様にして増幅したキラ
ー〒細胞を動物に戻すと、腫瘍の増殖を抑えることが知
られている〔ジャーナル　オプ　イムノロジ−４１２５
１１９０４頁（１９８０年）〕。さら（例えばＩＬ−２
をリンパ球培養系に加えることにより、インターフェロ
ン−ｒの産生が誘導されること〔ジャーナル　オプ　イ
ムノロジー［１２６１１１１２０頁（１０００年）〕や
、ナチュフルキヲー細胞の活性化が起こること〔ジャー
ナル　オグ　イムツリジー、第１２６巻２３２１頁（１
９８１年）〕も知られてお）、これらの事実はＩＬ−２
の抗腫瘍剤としての有用性の可能性をも示すものである
。ＩＬ−２はまた、胸腺機能を欠如しているといわれる
メートマウスのヘルパーＴ細胞機能を回復させること〔
ヨーロピアン　ジャーナル　オプイムノロジー、第１０
巻７１９頁（１９８０年）〕や、同種腫瘍細胞に対する
キラーＴ細胞の誘導を回復させることが知られており〔
ネイチャー。

第２８４巻２７８頁（１９８０年）〕、免疫機能低下疾
患への応用も期待できる。

しかしながら、との様に広範な領域での有用性が期待さ
れるヒトエＬ−２をヒト生体から取り出すことは、生体
中の存在量があまりに４微量であるためにきわめて困難
である。現在と）ＩＬ−２を得るためにはヒトのリンパ
球を培養し、レクチン等の誘導剤で処理した培養上清が
使われているが、ヒトの血液等のリンパ球材量は供給が
限られている上に、リンホカインの通性に４れす、この
様な培養液からの産生量もまた極めて微量であるために
大量の純化ＸＬ−２を供給出来る製造法Ｏ開発が強く要
望されていえ。

と）ＩＬ−２を大量に得る方法としては、いわゆる遺伝
子操作の手法を用いることが考えられるが、ヒれまでそ
Ｏ基本となるヒトＩＬ−２をコードする伝令ＲＩＩＡに
ついて社、全く情報もなく実体も不明なため、その端緒
すら閉されてい丸。

本発明者らは、今回初めてと）ＩＬ−２をコードする伝
令ＲＮムを、ヒト細胞から分離する仁とに成功し、この
伝令Ｒ１１Ａをインビトロの蛋白合成系に導入したのち
、該第をインキュベートして、ヒトＩＬ−２を生成蓄積
せしめ、これを採取することによるヒトＩＬ−２の製造
法を確立した。

ζ−で当該伝令ＲＷムを分離する丸めの細胞としては、
と）ＩＬ−２産生能を有する細胞のいずれを用いてもよ
いが、採取可能な量が比較的多い点から、ヒトリンパ球
系細胞、白血球系細胞などが用いられ、と郵わけ末梢ム
Ａ−、、、バ球が有利に用いられる。

該細胞の分離、例えば末梢血からのリンパ球の分離法と
しては、デキストランを用いる方法、あるいはフイコー
ルハイパータを用いる比重遠心法〔スカンジナビア　ジ
ャーナル　オプ　クリニカル　フポットリー　インベス
テイゲー￥覆ン　第２１１１サブリメンＦ、第９７巻７
７頁（１９６８年）〕などを適用する仁とが出来る。

本発明のと）ＩＬ−２をコードする伝令１１ｒＡは、と
）ＩＬ−２産生能を有する細胞を誘導剤の存在下培養し
、該細胞中にヒ）ＩＬ−２をコードする伝令ＲＮＡを生
成蓄積せしめ、これを分離。

採取することによル製造することができる。

ヒトエＬ−２産生能を有する細胞の培養に際して用いら
れる培地は、該細胞がと）ＭＬ−２を蓄積し得るもので
あればどのようなものでもよいが、培養に適した動物細
胞培養用培地、例えば市販のＲＰＭニー１６４０（ジャ
ーナル　オプ　アメリカン　メディカル　アソシエーシ
目ン４１９９巻５１９頁（１９６７年）〕などが有利に
用いられる。かかる培地には動物血清、抗生物質などを
添加するのが好ましい。動物血清としては、牛胎児血清
または子牛血清が好ましく、通常０．１〜５０％、好ま
しくは２〜２０Ｘとなるように培地に添加する。抗生物
質としては、例えばカナマイシン、ペニシリン、ストレ
プトマイシンが挙ケラれ、これらを通常０．０５〜Ｉ　
Ｔｌ１ｌ／ｄの濃度となるように加え：ｂ６ 誘導剤としては、ＫＬ−２の生成を誘導しうる物質が用
いられ、九とえはレクチン（例、コンヵナパ苧ンム（Ｃ
ｏｎＡ）、フィトヘマグルチニン（ＰＨム）など）また
は／および各種の抗原やホルボールエステル（例、１２
−０−テトヲデヵノイル＊ルポー〃−１３−アセデー）
（ＴＰＡ）など）が挙けられ、これらを組合せて使用す
ることによ）効率よ＜ＩＬ−２を誘導することができる
が、それぞれ単独で使用することもできる。好ましくは
レクチンとホルボールエステルを組合せて使用する。例
えば、具体的にはレクチンとしてＣｏｎＡ、ホルボール
エステルと□し゛てＴＰＡを使用するときはそれぞれ５
〜８０μｇ／ｍｔ、　１〜５０　ｎ　ｇ／ｗｌの濃度で
添加する。

培養は、静置培費、スピナーカルチャーなどＫよってな
されるが、大量に培養する丸めにはスピナーカルチャー
が好ましく、通常、０．１〜５０×１０６細胞／ｄ、好
まＬ＜ハｌ　〜５ｘｌＯ’ｌｌ胞／ｇＩｔＯ細胞濃度で
接種し、３０〜４０℃で培養する。

培養時間は例えばＩＬ−２自体の誘導、産生量を指標に
して決められるが、一般にＸＬ−２ｇ生量が最大となる
時間の約半分、通常約Ｓ〜８０時間とシわけ約２０〜４
０時間の培養で目的とする伝令′ＲＮムの生成蓄積量が
最高に達するので、この時点で細胞から当該伝令ＲＩＩ
Ａを分離、採取するのが好ましい。

本発明の伝令Ｒ）ｉムを含有するＲＩＩＡの細胞からの
分離は、通常、細胞を化学的、物理的に破壊１９７９年
）、バーガー法：バイオケミストリー、第１８巻５１４
３頁（１９７９年））を適用して行なうことができる。

例えば、上紀培曹細胞を遠心して集め、チオシアネート
（例えば、グアニジンチオシアネートなど）とメルカプ
トアルカノール（例えば、２−メルカプトエタノールな
ど）を含む緩衝液を遠沈細胞０２〜１０倍量加えてすり
つぶす。得られたホモジネートに、好ましくＬ１塩化セ
シウムなどを加えた後、遠心チューブなどを用いて、塩
化七シウム上（重層し、１５，０００〜３０，０００回
転で１０〜３０時間遠心してＲＮＡを沈殿させる。上清
を除去し、ＲＮｋ（Ｄ沈殿を緩衝液に溶解し、これに食
塩さらに低級アルカノール（例えば、エタノールなど）
を加え、冷却下（０’−−４（１）でＲＮＡを沈殿させ
る仁とによりＲＮＡの抽出がなされる。

ζ＼で得られた各種ＲＮｋの混合物からの目的とする伝
令ＲＮＡの分離は、蔗糖密度勾配遠心法、ゲル濾過法、
電気泳動法、メングレンフィルター法、オリゴ（ｄＴ）
カラふを用いる方法など、を適宜組介せること忙よ１寮
施出来る。なかでも、オリゴ（ＩＴ）セルロースカヲム
クロマトダフフイーによる分Ｈの後、蔗糖密度勾配遠心
法によって該伝令ＲＮムを分離することが好ましい。

すなわち、例えば、アルカノール沈殿し九ＲＩＡを遠心
分離により集め、緩衝液に溶解し、オリゴ（ｄＴ）カッ
五に吸着させ、ＢＤＢ（ソディウムドデ￥ルサルフエー
ト）含有緩衝液で溶出する。

得られたポリアデニル酸結合ＲＮムをＳＤ８含有緩衝液
に溶解し、通常１０〜３０ＸＯ庶糖の密度勾配溶液上に
重層し、遠心分離によ）分閾し、本発明の伝令ＲＮムを
得ることができる。

本発明により、細胞から分離され九と）ＩＬ−２をコー
′ドする伝令ＲＮムは下記の性状を有する。

ｈ）ｓｓ〜１５Ｂの沈降定数を示す。

（２）　　３’末端にポリアデニル酸構造を有する。

（３）ポリペプチドとして、ヒトＩＬ−２をコードする
。

本発明の伝令Ｒ１１ムを用いてヒトＩ　Ｉ、−２を製造
するには、これを公知の手法によｊ　１０　ｎｇ〜５０
０　ｎｇ／ｃｅｌｌを好ましくは緩衝液にて溶解したの
ちインビトロの蛋白質合成系に導入し、２０℃〜４０℃
で、通常１〜４８時間イ時間インキュチー、インビトロ
の蛋白質合成系としては、本発明によって得られた伝令
ＲＮムを導入する仁とによりヒ＋工Ｌ−２を産生せしめ
るものであればどのようｔ；ｉでもよく、たとえばアフ
リカッメガエルＯ卵母細胞、ウサギの綱状赤血球、コム
ギの胚芽、哺乳類の培養細胞由来の蛋白合成系などが挙
げられるが、とシわけ生産効率の高いアフリカッメダエ
ル卵母細胞が好部会である。

産生されたＩ　Ｌ−２の活性測定には、ＴＣＧ）’：コ
ステイミュレーテインダファクター（Ｃｏ８）、丁細胞
ＶデレーＶンダファクター、サイモｆイトステイミュレ
ーテイングファクター、キラーヘルパーファクター、サ
イモナイトマイＦジェニツタファクター等の〔イムノロ
ジカル　レビュー。

第５１巻２５７頁（１９８０年））ＩＬｉの公知の測定
法を使うことが出来るが、工Ｌ−２の最も代表的な活性
としての、Ｔ細胞増殖促進作用の測定法であるＴＣＧＦ
活性の測定を行うことが望ましい。さらに、ＴＣＧＦ活
性以外の少なくとも１種０ＸＬ−２活性について、例え
ばＣｏ３活性の測定を加えれば、なお望ましい、ヒ）’
ｒＣＧＦはヒト細胞のみならず、マウス細胞に対しても
有効であることが知られているのでとトＴＣＧＦの測定
に社、〒ＣＧｒ依存性ヒト細胞以外に、ＴＣＧＦ依存性
マウス細胞を使うことも出来る〔イムノロジカル　レビ
ュー、第５１巻２５７頁（１９８０年）〕。

ヒトＩＬ−２をコードする伝令ＲＭＡは、前述の様に適
当な蛋白質合成系に導入することによプ、と）ＩＬ−２
を製造出来る。また、逆転写酵素により当該伝令ＲＮム
からＩＩ、−２の全構造遺伝子（ＤｆＡ）をインビ）田
で金成し、クローン化した後、例えば適当なデフスミド
のＤ頁ＡＫ組み入れ、適当な宿主例えば、大腸菌χ１７
７８に導入し、これを培養することにより高純度のと）
ＩＬ−２を大量に製造するのに用いることが出来る。

この場合、伝令ＲＮＡを出発材料とするゆえに、遺伝子
内には高等動物ゲノム遺伝子において見出される介在配
列が存在しない。この仁とは、工り一２構造遺伝子が、
細菌内に訃いてそのまま転写され、ＸＬ−２伝令Ｒ頁Ａ
として形質発現しうるヒとを意味する。従ってζ０ＸＬ
−２遺伝子を適当な調節遺伝子と結合し、デプスミド９
頁ムに＃ｌ込んで細菌内へ導入することにより、安価に
今量すし）■Ｌ−２を生産することが可能になる。

ヒトＭＬ−２は分子量約１２，０００〜１３，０００の
比較的安定性の高い蛋白で、糖鎖はない〔ゾロシーディ
ング　オプ　すＹＨカナルアカデミーオプ　ナイエンス
、第７７巻６１３４頁（１９８０年）〕か、ありたとし
て４活性自体には影響が少ないと推察されてお参〔ブラ
ッド第５７巻３７９頁（１９８１年）〕、遺伝子組み換
えにより製造する蛋白として格好の条件を備えている。

胤下に本発明を、実施例によシさらに具体的に説明する
。

実施例１　ヒトＩＬ−２をコードする伝令Ｒ１ムの誘導
と分離 （１）ヒト末梢血リンパ球の調製、培養とと）ＩＬ−２
の誘導 健康人１０〜１５人分の血液（１人当り約３０Ｏｗ／血
液）から集めたバフィーコート（血液を遠心し、下部赤
血球層の上にみられる淡黄色の白血球層）細胞を出発材
料とした。採血後、−夜４℃に保存したバフィーコート
細胞をこれと等量のＲＰＭＩ−１６４０培地（マイクロ
　バイオロジカル　アソシエート社製）と混合した後、
３％のデキストラン（６糖産業社製、分子量３０万〜５
゜万）を含む生理食塩水を半量加え、室温で３０分〜４
０分放置した。上清を集め、２，０００回転で５分遠心
し、遠沈細胞に再びＲＰＭＩ−１６４０培地を加え遠心
する方法により、細胞を２回洗浄し九。遠沈細胞に１０
％牛脂児血清（Ｆ、Ｃ，８，）及び抗生物質（ペニシリ
ン１００単位／ｌｌＩ／とストレプトマイシン１００μ
ｇ／ｓｇ）を含むＲＰＭＩ−１６４０塙地を加え細胞濃
度をｓ　ｘ　ｉ　ｏ’細胞、鷹とした後、スピナーフラ
スコ（１〜３１）に移し、１分間に５０回転のスピード
で攪拌しながら３７℃で培警した。次に１５　ｎｇ／＊
／　　のＴＰＡを加え、３時間＃！ＩＩ後、さらに４０
μｔｚ／ｄのＣｏｎＡ（Ｐ工、社？！りを上記培曹系に
加え、２４時間培養を行つてＸＬ−２を誘導した。

（２）　　Ｘ　Ｌ　−２＠導すンパ球からのＲＮＡの抽
出ＸＬ−７．誘導リンパ球からの全ＲＷＡの抽出は、主
にカブラン等の方法〔バイオケミカル　ジャーナル、第
１８３巻１８１頁（１９７９年）〕に従った。すなわち
、ＩＬ−２！ｌ導後２４時間〜４８時間の細胞を、２．
Ｇｏｏ回転、１ｏ分の遠心流−によ〕集め、５Ｍグアニ
ジンチオシアネート、０、ＯＩＭ）９ス堆酸ｐＨ７，６
，５％の２−メルカプトエタノールからなる溶液を細胞
宣積の５倍量加、ｔ、２４）Ｏｓ（のテフロンホモゲナ
イｆ’−テ１５〜２０回すりつぶした。得られた１ｍの
ホそジエネートに対し、０．５ｇの堆化セシウムを加え
九後、スピンコ８１２７０−ター用の遠心チューブ中の
５．７Ｍ樵化セシウム溶液７ｇＩｔ上に重層し７．２４
．０００回転で２０時間遠心してＲＮＡを沈殿させた。

チューブ中の上清を吸引除去した後、チューブの下方２
Ｃ１＋程度を残して上部を切りやり、ＲＮＡの沈ｊｌを
０．４％のＮ−フウリルサルコシ船２１１１７ｄのヘパ
リン、０．２％のジエチルピロカルボネートを含む０．
０１Ｍ）リス塩酸ｐＩ！７゜６緩衝液に溶解し九。この
溶液に食塩および冷エタノールをそれぞれの最終濃度が
０．２Ｍおよび７０％となる様に加えて、−２０℃に保
ちＲＩＡを沈殿させた。

（３）オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムクロマトグラフ
ィーによる、ポリアデニル酸結合ＲＮＡの調製 エタノール沈殿し九ＲＮｋを、スビンコ５Ｗ２７．１０
−ターで、２０，０００回転、２０分間遠心して集めた
後、１０ｄのｏ、ｓＭ＊填、０，０００１ＭＥＤＴＡ、
０．５％８Ｄ８を含むトラス塩酸　ｐＦＩ７．６緩衝液
に溶解した。次にこれと同じ緩衝液に溶解したオリゴ（
（ＩＴ）セルロース（ＰＬ社製）をｌＯ−の注射筒に高
さ４ａｓ（４ｇｇ）Ｋ詰め、上記の１１１Ａ試料をこの
カラムに流し、素通りした部分を再度カラ五に流して、
ポリアデニル酸結合ＲＩＡを吸着させ九。さらに、同じ
緩衝液で紫外線２６０　ｎｍの吸収がなくなるまでカラ
五を洗浄して、未吸着のＲＮＡを洗い流した後、０、Ｏ
ＯＩＭＥＤＴＡ、０．３％ＳＤＳを含む１０謙輩トヅス
堆酸ｐＨ７，６緩衝液で、ポリアデニル酸結合ＲＩＡを
カラムから溶出しくｌｓｒ／Ｍ分）、２６０　ｎ！ｌの
吸光度を測定し、ＲＮＡを追跡した。ＲＮＡ分画を集め
、実施例／（２）で示し九様にエタノール沈殿した。

（４）蔗糖密度勾配遠心法による分画 前記操作で得たｌリアデニル酸結合Ｒ１ｆＡ約０．５〜
１”Ｆを、０．０５Ｍ食堆、０．０ＩＭＥＩ）ＴＡ、０
．２％’１３Ｄ８を含む０．ＯＩＭ）Ｑｘ４酸ｐＨ７，
６緩衝液に溶解した１０〜３０％の蔗糖の密度勾配溶液
上に重層し、５ｗ２７０−ターを使用して、２５，００
０回転で２１時間２０υで遠心した。この後、内春物を
１８本に分画し、２６０ｎ＊０吸光度を測定した後、１
１８付近を中心に１分画ととにエタノール沈殿を行い、
沈殿物として伝令ＲｔｔＡを得た。なおＳ値の測定用榛
準Ｒ１ｒムとして、ＬＣｏｌｌの２３８，１６！”（，
４Ｓ　　ＲＩＩＡ（マイルズ社１ｌＩＩＩ）を別の遠心
チューブで、同様に遠心した。

この様にして得られた８８〜１５３に分画されるＩＬ−
２活性をもつ伝令ＲＮｋの収量は１６０μｇであった。

実施例二　ヒトＩＬ−２の製造 体長約１０ｃｍ１１＋のメスのアフリカツメガニ／ｋ（
Ｘｓｎｏｐｕｓ　ｌａｅマ１８）を氷水中につけて麻酔
した後、解剖して卵母細胞をヤシ出し、パース（Ｂａｒ
ｔｈ’８）培１［（エンフリオロジカル　エクスベリメ
ンタル　モルホロジー、第７巻２１０頁（１９５９年）
〕中で、メデンレス線を使用して卵を１個ずつに分離し
た。実施例／（４）で得た伝令８頁Ａを緩衝液（８８璽
Ｍ食塩、１．０Ｍ塩化カリウム、１５！！ＬＭ　）リス
塩酸ｐＦＩ７．６）に１　”ｆ／ｓ／となる様に溶解し
、その１００ｎ（ｉ’　（１００ｍｇ）ずつを個々の卵
にギヤビヲリーとマイクロマニピュレーター７を使用し
て実体顕微鏡下に注入した。ＲＩＡの一試料につき２０
〜３？個の卵を使用し、これを０．３ぎｌのパース培養
液中で２４℃、２４時間培曹した。この燐、、−養上清
をサーパル遠心機で１５．０００回転、３０分間遠心し
て上清を得九。

とＯ上清中にヒ）ＩＬ−２が産生されていることを実施
例３（３）記載の方法でｍ認した。

実施例３　ヒトＩＬ−２の検室 （１）培養上清のヒトＩＬ−２活性（ＩＬ−２産牛に員
ぼすレクチンの種類、濃度の効果とＩＬ−２産生の経時
変化） 実施例／（１）で示した培養上清のＩＬ−２活性と誘導
に用いるレクチン濃度との関係を表１に示した。ヒ）Ｉ
Ｌ−２活性の測定は、マウスのＴＣＧｒ依存性ＩＩＩ胞
株ａＫｃｇ（ａ本免疫学会総会記録、第１１巻２７７頁
（１９８１年）〕を用いて行った。即ち、まず２！！階
稀釈（よシ稀釈された種々の濃度のサンプル５０μｇを
とヤ、平底マイクロデレー）（ファルコン社製）に入れ
た。次いで３Ｘ１０’＠の１ｆＫＣ３細胞を含む、１０
％牛脂兇血清（１０％ＦＣ８）含有ＲＰＭＩ−１６４０
液５０Ｐｌ　を加え、炭酸ガスふ卵器内で３７℃、２０
時間培費し九。さらに３Ｈ−チミジンｌ声Ｃ１を加えて
、４時間培費したのち、セルハーベスタ−（和研薬工業
社製）を用いて、＃？Ｉｍをガラスフィルグーにトヲブ
デし、洗浄、ＦＩ過、乾燥の後、シンチレーシ豆ンカウ
ンターにより放射活性を測定した。サンプルの活性の強
さ社次の様な方法で標準サンプルの活性の強さとの比較
値として示しく単位／−）た。すなわち標準サンプルと
して、実施例／（１）と同じ方法で作った一定の培養上
清、ただしこの場合誘導後１２０時間に集めた培養上清
の示す活性を１単位／ｄとした。まず測定したいサンプ
ル、および標準すンプルを数段階に両駅し、各々につい
て得られた　Ｈ−チミジンとりこみの値をプルビット表
にプロットするとキにより、ナンプル濃度と３Ｈ−チミ
ジンとり込み量の間に直線関係を得喪。次いで得られた
図から最高のと夛こみを１００％としたときの５０％と
夛こみ量を示す両駅濃度を読みとった。この濃度を標準
サンプルの５０％と夛ζみを示す濃度で割ることにより
、サンプルの単位／ｗｔを算出した。表１は、実施例１
（１）において、誘導剤として１５ｎｇ／ｓｆ　のＴＰ
Ａと各濃度のＣｏｎＡｔたは１５ｎｇ／ｓ／　のＴＰＡ
と各濃度のｐｕ＾を用い、誘導後４８時間の培養上清に
ついて、ＴＣＧＦ活性を測定し、上記の方法で単位数／
ｄを計算したものである。

また表２は、実施例／（１）において、４０＊ｇ／ｓｆ
のＣｏｎＡと、１５ｎｇ／ｄ　のすＡを用いるか、ある
いは０．５％のＰＨＡと１５ｎｇ／−のＴＰＡを用いた
ときのＴＣＧＦ’産生の経時変化を示したものである。

８２　　ＣｏｎＡｔたはＰＨＡを用いた場合のＴＣＧＦ
産生の経時変化 表１．２に示される様に、ＣｏｎＡは４０　ｓＪｗ１前
後の濃度で、ＰＦ！ＡＦｉ０．１２５％以上の濃度で、
はソ同程度の最高のＴＣＧＦ活性を示すこと、何れの場
合も誘導後７２時間後に、培養上清のＴＣＧＦ活性は最
高値を示すことが明らかである。

（２）オリゴ（ｄＴ）カラ五分画ヒトＩＬ−２伝令ＲＮ
Ａを用いたヒ）ＩＩ、−２の製造（ＴＣＧＦとＣｏｇ）
′９！施例１（１）における誘導剤として、０．５％の
ＰＩ（Ａと１５　ｎｇ／ｍｌ　のＴＰＡを用いて、誘導
後２４時間に実施例／（２）に従いＲＮＡを抽出した。

得られたＲ）ｉＡを実施例／：（３）Ｋよるオリゴ（ｄ
Ｔ）カラムにかけて得られたと）　Ｉ　Ｌ−２伝令ＲＮ
Ａ分画を、直接実施例λに示した方法でアワ１１カツメ
ガエル卵母細胞に注入、培養した。得られた遠心上清の
ＩＬ−２活性を実施例３（１）で示したＴＣＧＦ’活性
およびＴ　ＣＧ　ｒ活性以外の活性測定の一例として、
ＣｏＳ　活性で測定した〇　Ｃｃ＋８活性測定は以下の
様に行った。ＢＡＬＢ／Ｃマウス（８〜１０週令）の胸
腺細胞２．５Ｘ１０５を、Ｔ　Ｏｎ＾５μｇ／ｍｌ　お
よび適当に稀釈したサンプルとと本に、１００４ｅ（７
）１０％ＦＣ８，ｔｘｌＯＭ７１ルカプトエタノール、
抗生物質を含むＲＰＭＩ−１６４Ｏｆ！＃液に浮遊させ
、平底ｉイクロプレートにて７２時間培養し九。培養終
了４時間前に殆−チミジン１μＣ１を加え、ＴＣＧＦ’
活性測定の場合と同様、セルハーベスタ−を使用して、
ｍ＃ｆＪへのとシζみを測定した。活性の強さけ　ト４
ミジンとシこみ促進の効果として、すなわちサンデー・
を加えない場合の対照群のとりこみの値の−と１゜て表
現し九。表３に伝令ＲＮＡ注入アフリカッメガエル卵母
細胞培養遠心上清のＴＣＧＦ活性（との場合、ＣｏＳ活
性との比較をし易くする丸め単位／ｄでなく、直接３ト
チミジンのとりこみ値で示した）、およびＣｏ８　活性
を示し丸。

！！３　　ヒトＩ　Ｉ、−２伝令ＲＮＡ（オリゴ（ｄＴ
）カラム分画〕によるＴＣＧＦおよびＣｏＳの製造側Ｉ
ｊｉ！け各点２サンプルについて行い、平均値で示した
。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　り表３に示される様に、オリゴ（ｄＴ）カ
ラムで分画され九ポリアデニル酸構造を有する伝令ＲＮ
Ａをアフリカッメガエル卵母細胞に注入するととＫより
、ＴＣＧＦ活性のみならずＣｏＳ活性としても検出出来
る工Ｌ−２を製造出来ることが明らかである。

（３）大箱密度勾配遠心分画と）ＩＬ−２伝令ＲＮムを
用い九ＩＬ−２の製造 実施例／において、４０μｇ／ｍｌのＣｏｎＡと１５ｎ
ｇ／ＩＩｔのＴＰＡで誘導し、２４時間後に抽出し九′
ＲＮムを用い、実施例−に従って製造された上溝５０μ
Ｅについて、２倍に稀釈した後、実施例３（１）に示し
た方法でＴＣＧＦ活性を測定した結果を第１図に示した
。この場合、ＴＣＧＦ’活性は殆−チミシンのとりζみ
値で示した。図からみちれる様に、ＩＬ−２伝令ＲＮＡ
は、分画ナンバー、１３にビータを有し、Ｓ値測定標準
ＩＮＡの分鋼位置から計算すると、８８〜１５８に相当
する部分に、ＩＬ−２の合成を指令する活性が認められ
たう

【図面の簡単な説明】

第１図Ｆｉ突施例３（３）において得られたＩＬ−２の
ＴＣＧＦ活性を示す。 図中△：２６０ｎｍｌ（シける吸光度

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）細胞から分離された、と）ＩＬ−２をコードする
   伝令ＲＷＡ０ （２）ＳＳ−１５Ｓの沈降室数を示す特許請求の範囲第
   （１）項記載の伝令Ｒ）ＩＡ。 （３）ヒトＩＬ−２がヒト’ＩＣＧＦｔたはヒトＣＯ８
   である特許請求の範囲第（１）項または第（２）項記載
   の伝令ＲＩＩＡ。 （４）ヒ）ＩＬ−２産生能を有する細胞を誘導剤の存在
   下槽％し、該細胞中にと）ＩＬ−２をコードする伝令Ｒ
   ＮＡを生成蓄積せしめ、これを分離。 採取することを特徴とするヒトＩＬ−２をコードする伝
   令ＲＮＡの製造法。 （５）ヒトＩ　Ｔ、　−２産生能を有する細胞がヒトリ
   ンパ球系細胞であることを特徴とする特許請求の範囲第
   （４）項記載の？！！造法う （８）　　誘導剤としてＶクチンおよび中ルボールエス
   テルを用いることを特徴とする特許請求の籟ＷＩＡ第（
   ４）項また紘第（５）項記載ＯＩＩ造法。 け）ヒトＩＬ−２をコードする伝令ＲＮ＾をインビトロ
   の蛋白質金成系に導入し、該第をインキュベージしてと
   トエＬ−２を生成蓄積せしめ、これをＩｌ＊する仁とを
   特徴とすると）ＩＬ−２の１１！造法。 （８）インビトロの蛋白質台底系がアフリカッメガエル
   卵母細胞である特許請求の範囲＠（７）項記載の製造法
   。