JPS6326993B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はIL―２をコードする伝令RNAに関す
る。 本発明は、ヒトIL―２をコードする伝令RNA
の製造方法である。 ヒトIL―２は、ヒトＴ細胞の増殖に必須な因
子である。〔イムノロジカル レビユー，第51巻
257頁（1980年）〕即ち、種々の免疫反応において
中心的な役割を果たしているヒトＴ細胞をインビ
トロで、その機能を保持したまゝ、増殖させ継代
維持して行く上に必須の因子である。ヒト末梢血
リンパ球をレクチンで刺激した培養上清中にＴ細
胞の増殖を促進する因子の存在することが見出さ
れ、TCGF（Ｔ細胞増殖因子）と名付けられた
〔サイエンス，第193巻1007頁（1976年）〕。その
後、このTCGF活性を示す因子と、胸線細胞の分
裂を促進する因子や、ヌードマウスの抗体産生を
促進する因子と同じものであることが示唆され、
これらリンホカイン類を一活してIL―２（インタ
ーロイキン２）とよぶことになつた〔ジヤーナル
オブ イムノロジー，第123巻2928頁（1979
年）〕。各因子の実体は現在まだ充分明らかでな
く、同一因子が異なる検定法で検定された結果、
異なつた名称で呼ばれている可能性も強い。IL
―２発見により、正常Ｔ細胞をその機能を保持し
たまま、いつまでも継代出来る様になつた結果、
Ｔ細胞のうちのキラーＴ細胞やナチユラル キラ
ー細胞、ときにはヘルパーＴ細胞などのクローン
が得られてきている〔例えばネイチヤー，第268
巻154頁（1977年）〕。この様にIL―２を用いて正
常Ｔ細胞をインビトロで継代したり、クローン化
するという直接的用途の他にIL―２には次の様
な用途がある。すなわちIL―２を用いることに
よりある特殊な抗原、例えば腫瘍抗原を認識し、
破壊する、抗原特異的キラーＴ細胞をインビトロ
で増殖させることが出来る〔ネイチヤー，第280
巻658頁（1979年）〕。実際に動物実験ではこの様
にして増殖したキラーＴ細胞を動物に戻すと、腫
瘍の増殖を抑えることが知られている〔ジヤーナ
ル オブ イムノロジー，第125巻1904頁（1980
年）〕。さらに例えばIL―２をリンパ球培養系に
加えることにより、インターフエロン―γに産生
が誘導されること〔ジヤーナル オブ イムノロ
ジー，第126巻1120頁（1981年）〕や、ナチユラル
キラー細胞の活性化が起こること〔ジヤーナル
オブ イムノロジー，第126巻2321頁（1981年）〕
も知られており、これらの事実はIL―２の抗腫
瘍剤としての有用性の可能性をも示すものであ
る。IL―２はまた、胸線機能を欠如していると
いわれるヌードマウスのヘルパーＴ細胞機能を回
復させること〔ヨーロピアン ジヤーナル オブ
イムノロジー，第10巻719頁（1980年）〕や、同
種腫瘍細胞に対するキラーＴ細胞の誘導を回復さ
せることが知られており〔ネイチヤー，第284巻
278頁（1980年）〕、免疫機能低下疾患への応用も
期待できる。 しかしながら、この様に広範な領域での有用性
が期待されるヒトIL―２をヒト生体から取り出
すことは、生体中の存在量があまりにも微量であ
るためにきわめて困難である。現在ヒトIL―２
を得るためにはヒトのリンパ球を培養し、レクチ
ン等の誘導剤で処理した培養上清が使われている
が、ヒトの血液等のリンパ球材量は供給が限られ
ている上に、リンホカインの通性にもれず、この
様な培養液からの産生量もまた極めて微量である
ために大量の純化IL―２を供給出来る製造法の
開発が強く要望されていた。 ヒトIL―２を大量に得る方法としては、いわ
ゆる遺伝子操作の手法を用いることが考えられる
が、これまでその基本となるヒトIL―２をコー
ドする伝令RNAについては、全く情報もなく実
体も不明なため、その端緒すら閉されていた。 本発明者らは、今回初めてヒトIL―２をコー
ドする伝令RNAを、ヒト細胞から分離すること
に成功し、この伝令RNAをインビトロの蛋白合
成系に導入したのち、該系をインキユベートし
て、ヒトIL―２を生成蓄積せしめ、これを採取
することによるヒトIL―２の製造法を確立した。 本発明は、ヒト末梢血から分離されたヒトIL
―２産生能を有するリンパ球系細胞を、誘導剤と
してコンカナバリンＡ（ConA）を約40μg／mlお
よび12―０―テトラデカノイルホルボール―13―
アセテート（TPA）を約15ng／ml含む動物細胞
培養用培地に約30〜40℃で約24〜48時間スピナー
カルチヤーを行ない、該細胞中にヒトIL―２を
コードする伝令RNAを生成蓄積せしめ、該培養
細胞を遠心して集め、チオシアネートおよびメル
カプトアルカノールを含む緩衝液の存在下該細胞
をすりつぶし、塩化セシウムの存在下に該ホモジ
ネートを遠心し、得られた上清から、食塩および
低級アルカノールを添加することにより当該伝令
RNAを沈澱させ、次いで、オリゴ（dT）―セル
ロースカラムクロマトグラフイーおよび蔗糖密度
勾配遠心法を組合せて用いて当該伝令RNAを分
離採取することを特徴とするヒト細胞から分離さ
れ8S〜15Sの沈降定数を示す、ヒトIL―２をコー
ドする伝令RNAの製造法である。 こゝで当該伝令RNAを分離するための細胞と
しては、ヒトIL―２産生能を有する細胞のいず
れを用いてもよいが、採取可能な量が比較的多い
点から、ヒトリンパ球細胞，白血球系細胞などが
用いられ、とりわけ末梢血由来のリンパ球が有利
に用いられる。 該細胞の分離、例えば末梢血からのリンパ球の
分離法としては、デキストランを用いる方法、あ
るいはフイコールバイパークを用いる比重遠心法
〔スカンジナビア ジヤーナル オブ クリニカ
ル ラボラトリー インベステイゲーシヨン 第
21巻サプリメント，第97巻77頁（1968年）〕など
を適用することが出来る。 本発明のヒトIL―２をコードする伝令RNA
は、ヒトIL―２産生能を有する細胞を誘導剤の
存在下培養し、該細胞中にヒトIL―２をコード
する伝令RNAを生成蓄積せしめ、これを分離，
採取することにより製造することができる。 ヒトIL―２産生能を有する細胞の培養に際し
て用いられる培地は、該細胞がヒトIL―２を蓄
積し得るものであればどのようなものでもよい
が、培養に適した動物細胞培養用培地、例えば市
販のRPMI―1640〔ジヤーナル オブ アメリカ
ン メデイカル アソシエーシヨン，第199巻519
頁（1967年）〕などが有利に用いられる。かかる
培地には動物血清，抗生物質などを添加するのが
好ましい。動物血清としては、牛胎児血清または
子牛血清が好ましく、通常0.1〜50％、好ましく
は２〜20％となるように培地に添加する。抗生物
質としては、例えばカナマイシン，ペニシリン，
ストレプトマイシンが挙げられ、これらを通常
0.05〜１mg／mlの濃度となるように加える。 誘導剤としては、IL―２の生成を誘導しうる
物質が用いられ、たとえばレクチン（例、コンカ
ナバリンＡ（ConA），フイトヘマグルチニン
（PHA）など）または／および各種の抗原やホル
ボールエステル（例、12―０―テトラデカノイル
ホルボール―13―アセテート（TPA）など）が
挙げられ、これらを組合せて使用することにより
効率よくIL―２を誘導することができるが、そ
れぞれ単独で使用することもできる。好ましくは
レクチンとホルボールエステルを組合せて使用す
る。例えば、具体的にはレクチンとしてConA，
ホルボールエステルとしてTPAを使用するとき
はそれぞれ５〜80μg／ml，１〜50ng／mlの濃度
で添加する。 培養は、静置培養，スピナーカルチヤーなどに
よつてなされるが、大量に培養するためにはスピ
ナーカルチヤーが好ましく、通常、0.1〜50×10⁶
細胞／ml、好ましくは１〜５×10⁶細胞／mlの細
胞濃度で接種し、30〜40℃で培養する。 培養時間は例えばIL―２自体の誘導，産生量
を指標にして決められるが、一般にIL―２産生
量が最大となる時間の約半分、通常約５〜80時間
とりわけ約20〜40時間の培養で目的とする伝令
RNAの生成蓄積量が最高に達するので、この時
点で細胞から当該伝令RNAを分離，採取するの
が好ましい。 本発明の伝令RNAを含有するRNAの細胞から
の分離は、通常、細胞を化学的，物理的に破壊し
たのち、自体公知の抽出方法（カプラン法：バイ
オケミカル ジヤーナル，第183巻181頁（1979
年），バーガー法：バイオケミストリー，第18巻
5143頁（1979））を適用して行なうことができる。 例えば、上記培養細胞を遠心して集め、チオシ
アネート（例えば、グアニジンチオシアネートな
ど）とメルカプトアルカノール（例えば、２―メ
ルカプトエタノールなど）を含む緩衝液を遠沈細
胞の２〜10倍量加えてすりつぶす。得られたホモ
ジネートに、好ましくは、塩化セシウムなどを加
えた後、遠心チユーブなどを用いて、塩化セシウ
ム上に重層し、15000〜30000回転で10〜30時間遠
心してRNAを沈殿させる。上清を除去し、RNA
の沈殿を緩衝液に溶解し、これに食塩さらに低級
アルカノール（例えば、エタノールなど）を加
え、冷却下（0゜〜−40℃）でRNAを沈殿させる
ことによりRNAの抽出がなされる。 こゝで得られた各種RNAの混合物からの目的
とする伝令RNAの分離は、庶糖密度勾配遠心法，
ゲル過法，電気泳動法，メンブレンフイルター
法，オリゴ（dT）カラムを用いる方法など、を
適宜組合せることにより実施出来る。なかでも、
オリゴ（dT）セルロースカラムクロマトグラフ
イーによる分画の後、庶糖密度勾配遠心法によつ
て該伝令RNAを分離することが好ましい。 すなわち、例えば、アルカノール沈殿した
RNAを遠心分離により集め、緩衝液に溶解し、
オリゴ（dT）カラムに吸着させ、SDS（ソデイウ
ムドデシルサルフエート）含有緩衝液で溶出す
る。得られたポリアデニル酸結合RNAをSDS含
有緩衝液に溶解し、通常10〜30％の庶糖の密度勾
配溶液上に重層し、遠心分離により分画し、本発
明の伝令RNAを得ることができる。 本発明により、細胞から分離されたヒトIL―
２をコードする伝令RNAは下記の性状を有する。 (1) 8S〜15Sの沈降定数を示す。 (2) 3′末端にポリアデニル酸構造を有する。 (3) ポリペプチドとして、ヒトIL―２をコード
する。 本発明の伝令RNAを用いてヒトIL―２を製造
するには、これを公知の手法により10ng〜
500ng／cellを好ましくは緩衝液にて溶解したの
ちインビトロの蛋白質合成系に導入し、20℃〜40
℃で、通常１〜48時間インキユベートする。イン
ビトロの蛋白質合成系としては、本発明によつて
得られた伝令RNAを導入することによりヒトIL
―２を産生せしめるものであればどのような系で
もよく、たとえばアフリカツメガエルの卵母細
胞，ウサギの網状赤血球，コムギの胚芽，哺乳類
の培養細胞由来の蛋白合成系などが挙げられる
が、とりわけ生産効率の高いアフリカツメガエル
卵母細胞が好都合である。 産生されたIL―２の活性測定には、TCGF：コ
ステイミユレーテイングフアクター（CoS），Ｔ
細胞レプレーシングフアクター，サイモサイトス
テイミユレーテイングフアクター，キラーヘルパ
ーフアクター，サイモサイトマイトジエニツクフ
アクター等の〔イムノロジカル レビユー，第51
巻257頁（1980年）〕IL―２の公知の測定法を使
うことが出来るが、IL―２の最も代表的な活性
としての、Ｔ細胞増殖促進作用の測定法である
TCGF活性の測定を行うことが望ましい。さら
に、TCGF活性以外の少なくとも１種のIL―２活
性について、例えばCoS活性の測定を加えれば、
なお望ましい。ヒトTCGFはヒト細胞のみなら
ず、マウス細胞に対しても有効であることが知ら
れているのでヒトTCGFの測定には、TCGF依存
性ヒト細胞以外に、TCGF依存性マウス細胞を使
うことも出来る〔イムノロジカル レビユー，第
51巻257頁（1980年）〕。 ヒトIL―２をコードする伝令RNAは、前述の
様に適当な蛋白質合成系に導入することにより、
ヒトIL―２を製造出来る。また、逆転写酵素に
より当該伝令RNAからIL―２の全構造遺伝子
（DNA）をインビトロで合成し、クローン化した
後、例えば適当なプラスミドのDNAに組み入れ、
適当な宿主例えば、大腸菌x1776に導入し、これ
を培養することにより高純度のヒトIL―２を大
量に製造するのに用いることが出来る。この場
合、伝令RNAを出発材料とするゆえに、遺伝子
内には高等動物ゲノム遺伝子において見出される
介在配列が存在しない。このことは、IL―２構
造遺伝子が、細菌内においてそのまま転写され、
IL―２伝令RNAとして形質発現しうることを意
味する。従つてこのIL―２遺伝子を適当な調節
遺伝子と結合し、プラスミドDNAに組込んで細
菌内へ導入することにより、安価に多量のヒト
IL―２を生産することが可能になる。 ヒトIL―２は分子量約12000〜13000の比較的
安定性の高い蛋白で、糖鎖はない〔プロシーデイ
ング オブ ナシヨナル アカデミーオブ サイ
エンス，第77巻6134頁（1980年）〕か、あつたと
しても活性自体には影響が少ないと推察されてお
り〔ブラツド第57巻379頁（1980年）〕、遺伝子組
み換えにより製造する蛋白として格好の条件を備
えている。 以下に本発明を、実施例によりさらに具体的に
説明する。 実施例１ ヒトIL―２をコードする伝令RNAの
誘導と分離 (1) ヒト末梢血リンパ球の調製，培養とヒトIL
―２の誘導 健康人10〜15人分の血液（１人当り約300ml血
液）から集めたバフイーコート（血液を遠心し、
下部赤血球層の上にみられる淡黄色の白血球層）
細胞を出発材料とした。採血後、一夜４℃に保存
したバフイーコート細胞をこれと等量のRPMI―
1640培地（マイクロ バイオロジカル アソシエ
ート社製）と混合した後、３％のデキストラン
（名糖産業社製、分子量30万〜50万）を含む生理
食塩水を半量加え、室温で30分〜40分放置した。
上清を集め、2000回転で５分遠心し、遠沈細胞に
再びRPMI―1640培地を加え遠心する方法によ
り、細胞を２回洗浄した。遠沈細胞に10％牛胎児
血清（F.C.S.）及び抗生物質（ペニシリン100単
位／mlとストレプトマイシン100μg／ml）を含む
RPMI―1640培地を加え細胞濃度を５×10⁶細
胞／mlとした後、スピナーフラスコ（１〜３）
に移し、１分間に50回転のスピードで撹拌しなが
ら37℃で培養した。次に15ng／mlのTPAを加え、
３時間培養後、さらに40μg／mlのConA（PL社
製）を上記培養系に加え、24時間培養を行つて
IL―２を誘導した。 (2) IL―２誘導リンパ球からのRNAの抽出 IL―２誘導リンパ球からの全RNAの抽出は、
主にカプラン等の方法〔バイオケミカル ジヤー
ナル、第183巻181頁（1979年）〕に従つた。すな
わち、IL―２誘導後24時間〜48時間の細胞を、
2000回転、10分の遠心沈殿により集め、5Mグア
ニジンチオシアネート，0.01Mトリス塩酸PH7.6，
５％の２―メルカプトエタノールからなる溶液を
細胞容積の５倍量加え、200mlのテフロンホモゲ
ナイザーで15〜20回すりつぶした。得られた１ml
のホモジエネートに対し、0.5ｇの塩化セシウム
を加えた後、スピコンSW27ローター用の遠心チ
ユーブ中の5.7M塩化セシウム溶液７ml上に重層
し、24000回転で20時間遠心してRNAを沈殿させ
た。チユーブ中の上清を吸引除去した後、チユー
ブの下方２cm程度を残して上部を切り取り、
RNAの沈殿を0.4％のＮ―ラウリルサルコシン，
２mg／mlのヘパリン，0.2％のジエチルピロカル
ボネートを含む0.01Mトリス塩酸PH7.6緩衝液に
溶解した。この溶液に食塩および冷エタノールを
それぞれの最終濃度が0.2Mおよび70％とする様
に加えて、−20℃に保ちRNAを沈殿させた。 (3) オリゴ（dT）セルロースカラムクロマトグ
ラフイーによる、ポリアデニル酸結合RNAの
調製 エタノール沈殿したRNAを、スピンコSW27.1
ローターで、20000回転，20分間遠心して集めた
後、10mlの0.5M食塩，0.0001MEDTA，0.5％
SDSを含むトリス塩酸，PH7.6緩衝液に溶解した。
次にこれと同じ緩衝液に溶解したオリゴ（dT）
セルロース（PL社製）を10mlの注射筒に高さ４
cm（４ml）に詰め、上記のRNA試料をこのカラ
ムに流し、素通りした部分を再度カラムに流し
て、ポリアデニル酸結合RNAを吸着させた。さ
らに、同じ緩衝液で紫外線260nmの吸収がなくな
るまでカラムを洗浄して、未吸着のRNAを洗い
流した後、0.001MEDTA，0.3％SDSを含む
10mMトリス塩酸PH7.6緩衝液で、ポリアデニル
酸結合RNAをカラムから溶出し（１ml／画分）、
260nmの吸光度を測定し、RNAを追跡した。
RNA分画を集め、実施例１(2)で示した様にエタ
ノール沈殿した。 (4) 庶糖密度勾配遠心法による分画 前記操作で得たポリアデニル酸結合RNA約0.5
〜１mgを、0.05M食塩，0.01MEDTA，0.2％SDS
を含む0.01Mトリス塩酸PH7.6緩衝液に溶解した
10〜30％の庶糖の密度勾配溶液上に重層し、
SW27ローターを使用して、25000回転で21時間
20℃で遠心した。この後、内容物を18本に分画
し、260nmの吸光度を測定した後、11S付近を中
心に１分画ごとにエタノール沈殿を行い、沈殿物
として伝令RNAを得た。なおＳ値の測定用標準
RNAとして、E.Coliの23S，16S，4S RNA（マ
イル社製）を別の遠心チユーブで、同様に遠心し
た。 この様にして得られた8S〜15Sに分画されるIL
―２活性をもつ伝令RNAの収量は160μgであつ
た。 実施例２ ヒトIL―２の製造 体長約10cmのメスのアフリカツメガエル
（Xenopus laevis）を氷水中につけて麻酔した
後、解剖して卵母細胞を取り出し、バース
（Barth′s）培養液〔エンブリオロジカル エクス
ペリメンタル モルホロジー，第７巻210頁
（1959年）〕中で、ステンレス線を使用して卵を１
個ずつに分離した。実施例１(4)で得た伝令RNA
を緩衝液（88mM食塩，1.0M塩化カリウム，
15mMトリス塩酸PH7.6）に１mg／mlとなる様に
溶解し、その100nl（100ng）ずつを個々の卵にキ
ヤピラリーとマイクロマニピユレーターを使用し
て実体顕微鏡下に注入した。RNAの一試料につ
き20〜30個の卵を使用し、これを0.3mlのバース
培養液中で24℃，24時間培養した。この後、培養
上清をサーバル遠心機で15000回転，30分間遠心
して上清を得た。この上清中にヒトIL―２が産
生されていることを実施例３(3)記載の方法で確認
した。 実施例３ ヒトIL―２の検定 (1) 培養上清のヒトIL―２活性（IL―２産生に
及ぼすレクチンの種類，濃度の効果とIL―２
産生の経時変化） 実施例１(1)で示た培養上清のIL―２活性と誘
導に用いるレクチン濃度との関係を表１に示し
た。ヒトIL―２活性の測定は、マウスのTCGF依
存性細胞株NKC3〔日本免疫学会総会記録，第11
巻277頁（1981年）〕を用いて行つた。即ち、まず
２段階稀釈により稀釈された種々の濃度のサンプ
ル50μlをとり、平底マイクロプレート（フアルコ
ン社製）に入れた。次いで３×10⁴個のNKC3細
胞を含む、10％牛胎児血清（10％FCS）含有
RPMI―1640液50μlを加え、炭酸ガスふ卵器内で
37℃，20時間培養した。さらに ³H―チミジン
1μCiを加えて、４時間培養したのち、セルハー
ベスター（和研薬工業社製）を用いて、細胞をガ
ラスフイルターにトラツプし、洗浄，過，乾燥
の後、シンチレーシヨンカウンターにより放射活
性を測定した。サンプルの活性の強さは次の様な
方法で標準サンプルの活性の強さと比較値として
示し（単位／ml）た。すなわち標準サンプルとし
て、実施例１(1)と同じ方法で作つた一定の培養上
清、ただしこの場合誘導後120時間に集めた培養
上清の示す活性を１単位／mlとした。まず測定し
たいサンプル、および標準サンプルを数段階に稀
釈し、各々について得られた ³H―チミジンとり
こみの値をプロビツト表にプロツトすることによ
り、サンプル濃度と ³H―チミジンとり込み量の
間に直線関係を得た。次いで得られた図から最高
のとりこみを100％としたときの50％とりこみ量
を示す稀釈濃度を読みとつた。この濃度を標準サ
ンプルの50％とりこみを示す濃度で割ることによ
り、サンプルの単位／mlを算出した。表１は、実
施例１(1)において、誘導剤として15ng／mlの
TPAと各濃度のConAまたは15ng／mlのTPAと
各濃度のPHAを用い、誘導後48時間の培養上清
について、TCGF活性を測定し、上記の方法で単
位数／mlを計算したものである。

【表】

【表】 また表２は、実施例１(1)において、40μg／ml
のConAと15ng／mlのTPAを用いるか、あるい
は0.5％のPHAと15ng／mlのTPAを用いたとき
のTCGF産生の経時変化を示したものである。

【表】 表１，２に示される様に、ConAは40μg／ml前
後の濃度で、PHAは0.125％以上の濃度で、ほゞ
同程度の最高のTCGF活性を示すこと、何れの場
合も誘導後72時間後に、培養上清のTCGF活性は
最高値を示すことが明らかである。 (2) オリゴ（dT）カラム分画ヒトIL―２伝令
RNAを用いたヒトIL―２の製造（TCGFと
Cos） 実施例１(1)における誘導剤として、0.5％の
PHAと5ng／mlのTPAを用いて、誘導後24時間
に実施例１(2)に従いRNAを抽出した。得られた
RNAを実施例１(3)によるオリゴ（dT）カラムに
かけて得られたヒトIL―２伝令RNA分画を、直
接実施例２に示した方法でアフリカツメガエル卵
母細胞に注入、培養した。得られた遠心上清の
IL―２活性を実施例３(1)で示したTCGF活性およ
びTCGF活性以外の活性測定の一例として、CoS
活性で測定した。CoS活性測定は以下の様に行つ
た。BALB／Ｃマウス（８〜10週令）の胸線細
胞2.5×10⁵を、ConA5μg／mlおよび適当に稀釈し
たサンプルとともに、100μlの10％FCS，１×
10^-5Mメルカプトエタノール、抗生物質を含む
RPMI―1640溶液に浮遊させ、平底マイクロプレ
ートにて72時間培養した。培養終了４時間前に
³H―チミジン1μCiを加え、TCGF活性測定の場
合と同様、セルハーベスターを使用して、細胞へ
のとりこみを測定した。活性の強さは ³H―チミ
ジンとりこみ促進の効果として、すなわちサンプ
ルを加えない場合の対照群のとりこみの値の差と
して表現した。表３に伝令RNA注入アフリカツ
メガエル卵母細胞培養遠心上清のTCGF活性（こ
の場合、CoS活性との比較をし易くするため単
位／mlでなく、直接 ³H―チミジンのとりこみ値
で示した）、およびCoS活性を示した。

【表】 測定は各点２サンプルについて行い、平均
値で示した。
表３に示される様に、オリゴ（dT）カラムで
分画されたポリアデニル酸構造を有する伝令
RNAをアフリカツメガエル卵母細胞に注入する
ことにより、TCGF活性のみならずCoS活性とし
ても検出出来るIL―２を製造出来ることが明ら
かである。 (3) 庶糖密度勾配遠心分画ヒトIL―２伝令RNA
を用いたIL―２の製造 実施例１において、40μg／mlのConAと15ng／
mlのTPAで誘導し、24時間後に抽出したRNAを
用い、実施例２に従つて製造された上清50μlにつ
いて、２倍に稀釈した後、実施例３(1)に示した方
法でTCGF活性を測定した結果を第１図に示し
た。この場合、TCGF活性は ³H―チミジンのと
りこみ値で示した。図からみられる様に、IL―
２伝令RNAは、分画ナンバー13にピークを有し、
Ｓ値測定標準RNAの分画位置から計算すると、
8S〜15Sに相当する部分に、IL―２の合成を指令
する活性が認められた。 実施例４ ヒトIL―２の検定 培養上清のヒトIL―２活性（IL―２産生に及
ぼすホルボールエステルの濃度の効果とIL―２
産生の経時変化） 実施例１(1)の方法において、誘導剤として表４
に示す各濃度のTPAを加え、３時間培養後、さ
らに40μg／mlのConAを培養系に加え、72時間培
養し、誘導した。誘導後の培養上清について、マ
ウスのTCGF依存性細胞株NKC3を用いてIL―２
活性を測定した。 結果を表４に示す。

【表】 【図面の簡単な説明】

第１図は実施例３(3)において得られたIL―２
のTCGF活性を示す。 図中〓：260nmにおける吸光度、〓：TCGF活
性。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ヒト末梢血から分離されたヒトIL―２産生
   能を有するリンパ球系細胞を、誘導剤としてコン
   カナバリンＡを約40μｇ／mlおよび12―０―テト
   ラデカノイルホルボール―13―アセテートを約
   15ng／ml含む動物細胞培養用培地に約30〜40℃
   で約24〜48時間スピナーカルチヤーを行ない、該
   細胞中にヒトIL―２をコードする伝令RNAを生
   成蓄積せしめ、該培養細胞を遠心して集め、チオ
   シアネートおよびメルカプトアルカノールを含む
   緩衝液の存在下該細胞をすりつぶし、塩化セシウ
   ムの存在下に該ホモジネートを遠心し、得られた
   上清から、食塩および低級アルカノールを添加す
   ることにより当該伝令RNAを沈澱させ、次いで、
   オリゴ（dT）―セルロースカラムクロマトグラ
   フイーおよび蔗糖密度勾配遠心法を組合せて用い
   て当該伝令RNAを分離採取することを特徴とす
   るヒト細胞から分離され8S〜15Sの沈降定数を示
   す、ヒトIL―２をコードする伝令RNAの製造
   法。