DK165412B - Fremgangsmaade til fremstilling af humant interleukin - Google Patents

Description

i

DK 165412 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af homogent interleukin 2 (IL-2), som stammer fra inducerede humanmaligne celler, og som er renset til homogenicitet under anvendelse af flere reversfasevæskechromatografitrin. IL-2 fremstillet ved 5 fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremviser en højere grad af homogenicitet og aktivitet samt et højere udbytte sammenlignet med IL-2 fremstillet ifølge kendt teknik.

IL-2 er et opløseligt protein, som er i stand til at modulere lym-focytreaktivitet, og som tidligere er blevet fremstillet ved at 10 stimulere muse-, rotte- eller menneskelymfocytceller med et mitogen såsom phytohæmagglutinin (PHA) og concanavalin A (Con A), jfr. fx Gillis et al., Nature 268, 1977, s. 154; J. Immunol. 120, 1978, s.

2027; ibid. 124, 1980, s. 1954; ibid. 125, 1980, s. 2570.

IL-2 renset fra muse-, rotte- og humane normale T-lymfocyter har vist 15 sig at bevare forskellige typer biologisk aktivitet, herunder: 1) udtalt forøgelse af thymocytmitogenese; 2) fremmelse af langtidsformering in vitro af antigenspecifikke hjælper- eller dræber-T-celle-linier og 3) induktion af cytotoxisk T-lymfocyt (CTL) reaktivitet og plaque-dannende cellereaktioner i kulturer af nøgne musemiltceller. I 20 overensstemmelse hermed viser disse identificerede biologiske aktiviteter af IL-2, at IL-2 er nyttigt til forhøjelse af immunresponser og til at gengive immundeficiente T-cellepopulationer (nøgne musemiltceller) normale niveauer af celle- og humoral immunitet. Endvidere antyder disse resultater, at IL-2-dannelse og -respons er vigtige 25 parametre i immunologiske funktioner, der kan være nyttige i den kliniske diagnose af afvigende immunitet. Endvidere understreger det forhold, at humant IL-2 muliggør in vitro formeringen af antigenspecifikke humane, muse- og rotte-dræber-T-celler vigtigheden af humant IL-2 som forskningsreagens.

30 Selv om fremstillingen af humant IL-2 ud fra lectinstimulerede, humane milt- og perifert blodlymfocytkonditionerede medier er beskrevet af flere forfattere, medfører disse produktionskilder og -teknikker imidlertid svage koncentrationer af IL-2, idet rensning af IL-2 kræver fraktionering af store mængder konditionerede medier, som 35 indeholder IL-2 for at opnå kun meget små mængder human IL-2-aktivi-

DK 165412B

2 tet. Som følge heraf har tilstrækkelige mængder koncentreret humant IL-2 ikke været tilgængelige til in vivo forsøg eller til effektiv undersøgelse af den endelige molekylkarakterisering deraf.

Gillis og Watson (J. Exp. Med. 152, 1980, s.1709-19) beskriver frem-5 stillingen af humant IL-2 ved induktion af en malign neoplastisk cellelinie såsom Jurkat-FHCRC-linien med T-cellemitogen såsom PHA eventuelt i nærværelse af en phorbolester såsom phorbolmyristinacetat (PMA). Delvis rensning af IL-2 opnåedes ved en fremgangsmåde, som omfattede ammoniumsulfatudfældning/dialyse, gelfiltreringschromato-10 grafi (Sephadex® G-100) , ionbytningschromatografi (DEAE-cellulose) , fladleje-isoelektrisk fokusering og analytisk natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE). Størsteparten af IL-2's biologiske aktivitet blev elueret elektrophoretisk fra det proteinbånd (1 af 9-16 separate bånd, som iagttages på gelen), der har en 15 molekylvægt på ca. 14.000 dalton. Se også Frank et al., J. Immunol.

127, 1981, s. 2361 og Watson et al., Lymphokines 6, 1982, s. 95, for en tilsvarende beskrivelse.

Mier og Gallo (J. Immunol. 128, 1982, s. 1122; Lymphokines 6, 1982, s. 137) beskriver rensningen af IL-2 ud fra normale lymfocyter, 20 hvorved fås "et næsten homogent materiale" under anvendelse af præparativ SDS-gelelektrophorese som det sidste trin efter en række anioribytningschromatografi- og gelfiltreringsprocedurer. Deres produkt havde en molekylvægt på 13.000 ved SDS-PAGE og 20-25.000 ved gelfiltrering og et isoelektrisk punkt på 6,8. Dette materiale var 25 meget ustabilt selv ved -70°C og krævede tilsætning af bovint serumalbumin (BSA) eller polyethylenglycol for at bevare sin aktivitet.

Stadier og Oppenheim (Lymphokines 6, 1982, s.117) beskriver IL-2, der er renset ud fra mononucleare perifere blodceller, mandel- og miltceller, der udviste ladningsheterogenitet efter rensning ved søjle-30 chromatografi, gelfiltrering og elektrofokusering. Der fandtes 3 ladningsarter med et isoelektrisk punkt på 6,5, 7,2 og 8,2, og heterogeniteten kan muligvis tilskrives forskelle i graden af glycosy-lering.

DK 165412 B

3 I Journal of Experimental Medicine, 156, 2, 1982, 454-64 er beskrevet en fremgangsmåde til oprensning af humant Interleukin-2 ved ammonium-sulfatfældning efterfulgt af ionbytningschromatografi, gelfiltrering og chromatografi på blue agarose og procion agarose. Det rensede 5 interleukin-2 havde en specifik aktivitet på 10® U pr. mg protein.

Imidlertid er dette oprensede interleukin ikke homogent med hensyn til molekylær struktur, idet op til tre biologisk aktive proteinkomponenter kunne identificeres afhængig af de forhold, hvorunder IL-2-produktionen foregik.

10 I Journal of Immunological Methods, 55, 1982, 243-51 er beskrevet en fremgangsmåde til oprensning af humant Interleukin-2 ved ammoniumsul-fatfældning evt. efterfulgt af neuraminidase behandling og ionbytningschromatografi på PBE og gelfiltrering. Imidlertid er dette IL-2 ikke homogent, og forfatterne anfører tillige (side 151, sidste af-15 snit), at humant IL-2 vil være vanskeligt at oprense til homogenici-tet.

Endelig har Robb og Smith (Mol. Immunol. 18, 1981, s. 1087-94) isoleret TCGF (-IL-2) fra den humane T-leukæraicellelinie JURKAT, der var ensartet i ladning og størrelse. Det samme resultat er også 20 beskrevet af Robb et al. i J. Exp. Med. 184, 1981, s. 1455-74.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er kendetegnet ved, at en opløsning af råt humant interleukin 2 lades passere gennem en reversfase højt-ryksvæskechromatografisøj le, der indeholder methyl- eller octylgrup-per, som er covalent bundet til silicagel, idet det humane inter-25 leukin 2 holdes tilbage på søjlen, søjlen elueres under HPLC-betin-gelser med en konventionel gradient af et med vand blandbart solvent, og fraktioner, som udviser humant interleukin 2-aktivitet samles i pulje, kombineret med, at de i pulje samlede aktive fraktioner fra trin A lades passere gennem en reversfasehøjtryksvæskechromatografi-30 søjle, der indeholder diphenylgrupper covalent bundet til silicagel, idet det humane interleukin 2 holdes tilbage på søjlen, søjlen elueres under HPLC-betingelser med en konventionel gradient af et med vand blandbart solvent, og fraktioner, der udviser humant interleukin 2-aktivitet samles i pulje. I de tilfælde, hvor det anvendte råpræ-

DK 165412B

4 parat har et relativt lavt titer, kan det vare nødvendigt at gentage ét eller flere af HPLC-trinene for at opnå rensning til homogenitet.

Rå IL-2-præparater fremstilles nemt ved at dyrke maligne humane neoplastiske celler såsom humane leukæmi- og lymphomaceller in vitro 5 i et serumholdigt medium, som er beriget med forskellige tilsætningsstoffer. Kulturen stimuleres med et T-cellemitogen såsom PHA, hvorved der dannes en supernatant, som indeholder IL-2. Efter et vist tidsrum, dvs. ca. 24 timer efter inkubation, indsamles supematanten og oparbejdes til rensning af IL-2 til en mere koncentreret form. Det er 10 også ønskeligt at anvende en phorbolester såsom PMA som induktions-middel enten alene eller sammen med et T-cellemitogen såsom PHA eller Con A for at forøge dannelsen af IL-2, jfr. Gillis et al., J. Exp.

Hed. 152, 1980, s. 1709.

Cellelinier, der kan anvendes til fremstilling af råt humant IL-2 15 omfatter forskellige T- og B-cellelinier samt forskellige T-lymphoma-cellelinier. Cellelinierne blev dannet enten ved spontan opståen, virusinfektion eller med et kemisk carcinogen. En foretrukken cellelinie til dette formål er identificeret af Gillis et al. som den Jurkat-FHCRC humane T-leukæmicellelinie, og fortrinsvis anvendes en 20 subklon af denne linie med betegnelsen H33HJ-JAI. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan også anvendes til at rense IL-2, som stammer fra perifere blodlymfocyter.

Det dyrkningsmedium, som anvendes til at fremstille råt, humant IL-2 sammen med de ovennævnte cellelinier, kan bestå af kommercielt til-25 gængelige medier såsom Dulbecco's modificerede eagle-medium, RPMI-medium og Click's medium. Tilsætningsstoffer, som kan sættes til dyrkningsmediet hver for sig eller sammen, omfatter penicillin, streptomycin, gentamycin, frisk L-glutamin, HEPES-puffer, NaHC03, fetalt kalveserum (FCS) eller normalt humant serum. Den indledende 30 celledensitet af cellerne, især når der anvendes Jurkat-FHCRC-celler, vil være i området fra 5 x 10^ celler/ml til 1 x 10^ celler/ml, fortrinsvis ca. 1 x 10^ celler/ml.

Dyrkningsbetingelserne omfatter en temperatur i området ca. 35-38°C, en pH-værdi i området 7,0-7,4 og en fugtig atmosfære med ca, 5-10%

DK 165412 B

5 carbondioxid i luften. En PHA-mitogenkoncentration i området 0,5-2,0 volumenprocent, fortrinsvis 1 volumenprocent, kan anvendes.

Den mængde IL-2, der dannes ved at stimulere maligne, humane celler med et plantemitogen, varierer med tiden. Spidsniveauer af IL-2 nås 5 ca. 16-24 timer efter stimulering med PHA. Assay af IL-2 til overvågning af celledyrkningsfremstillingsproceduren eller rensningsprocedurerne omfatter bedømmelse af prøvens evne til at inducere T-celleli-nieformering. T-celleformering bestemmes ved at måle inkorporeringen af tritieret thymidin. Én aktivitetsenhed defineres som det antal 10 mikroliter, der findes i en T-cellekulturbrønd, som inducerer 50% af den maksimale thymidininkorporering. Specifikke detaljer ved assay-fremgangsmåden er beskrevet i Gillis et al., J. Immunol. 120, 1978, s. 2027.

Fremstilling af et hensigtsmæssigt udgangsmateriale til udførelse af 15 HPLC-rensningstrinene ifølge opfindelsen omfatter udfældning af IL-2-holdige supernatanter, som fås ved centrifugering af høstede inducerede celler, ved tilsætning af ammoniumsulfat til 85%'s mætning. En sådan tilsætning udføres ved gradvis tilsætning af tørt ammoniumsulfat til supernatanten under nænsom omrøring. Tilsætning af ammo-20 niumsulfat til udfældning udføres over en længere periode, fx en periode på 12 timer. Når der nås en mætning på 85%, fortsættes den nænsomme omrøring i yderligere et tidsrum i kulde. Det udfældede protein pelleteres ved centrifugering, og pellets gensuspenderes i sterilt 2 gange destilleret vand.

25 I et alternativt fremgangsmådeaspekt udsættes det gensuspenderede rå IL-2 for ionbytningschromatografi. En hensigtsmæssig søjle til dette formål er CM Biogel A-harpiks (LKB-Produkter, Bromma, Sverige).

Søjlen forbehandles fortrinsvis med en opløsning af fetalt kalveserum for at blokere ikke-specifikke bindesteder på harpiksen før påføring 30 af den IL-2-holdige prøve. Eluering fra søjlen udføres med en pufret saltgradient. En hensigtsmæssig gradient til dette formål er 50 mM-0,5M NaCl i HEPES, pH-værdi 5,5. En endelig vask med 0,5M NaCl-HEPES, pH-værdi 5,5, anvendes for at sikre, at al IL-2-aktivitet elueres.

DK 165412B

6 I pulje samlede aktive fraktioner fra det ovennævnte ioribytningschro-matografitrin giver et foretrukket udgangsmateriale til HPLC-procedurerne, som udgør fremgangsmådeaspektet af den foreliggende opfindelse. I en alternativ udførelsesform er det muligt, når der 5 foreligger en supernatant fra ammoniumsulfattrinet med et tilstrækkeligt højt titer, at anvende dette materiale direkte i det første HPLC-søjletrin. I et sådant aspekt kan det imidlertid være nødvendigt at gentage ét eller begge HPLC-trin for at opnå essentiel homogenitet i IL-2-produktet.

10 De HPLC-trin, der anvendes i den her omhandlede fremgangsmåde, gør brug af en reversfase, methyl-, octyl- eller diphenylbundet silicium-dioxidsøjle med en porestørrelse på mindst ca. 150 Å. Hensigtsmæssige reversfase HPLC-søjler til anvendelse ved udøvelse af opfindelsen findes i handelen. Særlig foretrukne søjler til dette formål er 15 søjler af Protesil-typen, som er kommercielt tilgængelige fra Whatman Separations Inc., Clifton, New Jersey, USA.

Således er fx Whatman Protesil 300 Methyl en søjle, som består af trimethylsilylgrupper, som er covalent bundet ved hjælp af en silicium-oxygen-siliciumbinding til overfladen af en silicagel med en pore-20 diameter på 300 Å, som er klassificeret til en gennemsnitlig partikelstørrelse på 8 μη. Tilsvarende har Whatman Protesil Magnum 9 Octyl- søjlen octylgrupper, som er covalent bundet til en silicagel med en porediameter på 150 Å, medens Whatman Protesil Diphenyl-søjlen har diphenylgrupper covalent bundet til overfladen af en silicagel 25 med en porediameter på 300 Å.

Eluering af proteiner fra HPLC-søjlerne kan udføres på i og for sig kendt måde. En hensigtsmæssig elueringsfremgangsmåde til fjernelse af bundne proteiner fra methyl- eller octylsøjlerne, som anvendes i det første HPLC-trin i fremgangsmåden ifølge opfindelsen, omfatter an-30 vendelse af en gradient med en gradvist stigende koncentration af en med vand blandbar lavere alkanol, fortrins n-propanol. En foretrukken gradient til dette formål er 0-60% v/v gradient i pyridin/eddikesyre, pH-værdi 4,0.

DK 165412B

7

Tilsvarende elueringsbetingelser kan anvendes i forbindelse med diphenylsøjlen, som anvendes i det andet trin med undtagelse af, at alkanolgradienten er 20-60% v/v. Elueret protein kan hensigtsmæssigt overvåges med detektionssystemer, som er kendte inden for fagområdet, 5 såsom anvendelse af et automatisk fluorescensdetektionssystem beskrevet af Kenny et al., Methods Enzymol. 78, 1981, s. 435.

Efter udføring af HPLC-fremgangsmådetrinene, enten i 2 trin eller, hvor der anvendes et råprodukt med et lavt titer, med én eller to gentagelser af det første og/eller andet trin, fås IL-2, som er 10 renset til homogenitet som en enkelt symmetrisk spids af bioaktivitet i et godt udbytte.

Det forhold, at man er i stand til at fremstille homogent IL-2, gør det for første gang muligt at bestemme dette molekyles aminosyresam-mensætning. Denne oplysning kan på sin side føre til bestemmelsen af 15 aminosyresekvensen, som igen er vigtig som hjælp til kloning af det humane IL-2-gen og den endelige fremstilling af store mængder rent rekombinant IL-2 til kliniske afprøvninger og i sidste instans til udbredt medicinsk anvendelse af dette stof. Endvidere muliggør tilgængeligheden af homogent IL-2 nøjagtige biologiske studier af dets 20 aktivitet fri for forurening med de talrige lymphokinarter, der vides at blive dannet samtidig med IL-2 under induktionen. Medens den kendte teknik har hævdet at fremstille høj trensede eller næsten homogene IL-2-præparater, viser erfaringen, at når materiale, som angives at være enkeltbåndsmateriale ved SDS-PAGE analytisk elektrophorese, 25 anvendes som udgangsmateriale i den her omhandlede HPLC-fremgangsmåde på en methyl- eller octylsøjle, opspaltes båndet i et stort antal proteinspidser, som ikke er forbundet med IL-2-aktiviteten. På grundlag af sådanne iagttagelser antages det, at sådanne præparater ikke er mere end 10% rene, og de kan i nogle tilfælde endog være mindre 30 end 1% rene.

Tests med delvis rensede IL-2-præparater, der stammer fra Jurkat-FHCRC-cellelinien, viser, at det delvis rensede lymphokin ikke får friske periferale blodlymfocyter til at formere sig, men inducerer formering i T-lymfocytpopulationer, der forinden er stimuleret med 35 lectiner eller specifikke antigener. Endvidere viste delvis renset

DK 165412 B

8 humant IL-2 sig at opretholde formeringen af ikke alene humane antigen-specifikke effektor-T-celler, men også museantigen-specifikke effektor-T-celler. Således har selv delvis renset Jurkat-FHCRC-dannet humant IL-2 vist sig at være et nyttigt reagens til anvendelse ved 5 dyrkning af klonale humane og muse-T-celler med forskellige antigener og effektorspecifikationer og er nu faktisk en handelsvare til sådanne anvendelser. Homogent IL-2 ifølge opfindelsen kan naturligvis anvendes på tilsvarende måde.

Opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående eksempel.

10 EKSEMPEL

IL-2-fremstilling H33HJ-JAI-celler (ATCC nr. CRL-8163, deponeret den 26. august 1982), som er en klon af Jurkat-FHCRC-stamcellelinien, blev dyrket i RPMI 1640 medium beriget med 10% føtalt kalveserum, 50 U/ml penicillin, 50 15 pg/ml streptomycin, 50 /tg/ml gentamycin og 300 /ig/ml frisk L-glutamin ved 37® G i fugtig atmosfære med 5% CO2 i luft. Celler ved mætnings-tæthed (8-10 x 10^ celler/ml) blev høstet, centrifugeret og gensuspenderet i frisk RPMI 1640 medium uden serum, men indeholdende 50 U/ml penicillin, 50 /ig/ml streptomycin, 50 /tg/ml gentamycin og 300 20 /ig/ml frisk L-glutamin. Cellerne blev gensuspenderet til en koncentration på 2 x 10^ celler/ml og stimuleret ved tilsætning af 1 volumenprocent PHA og 10 ng/ml phorbolmyristinacetat (PMA). Efter 24 timers inkubation ved 37°C i fugtig atmosfære med 5% CO2 i luft, blev de inducerede celler høstet og centrifugeret, og supernatanten blev 25 holdt tilbage som råt udgangsmateriale.

I pulje samlede supernatanter fra 3 celledyrkninger (nr. 1-3), der hver omfattede 900 ml, 900 ml og 1050 ml eller ialt 2850 ml supernatant, idet det i pulje samlede materiale havde en samlet aktivitet på 7,125 x 10^ enheder bestemt ved det af Gillis et al., J. Immunol.

30 120, 1978, s. 2027, beskrevne assay, blev behandlet ved gradvis tilsætning af tørt ammoniumsulfat til 85%'s mætning under nænsom omrøring. Tilsætning af ammoniumsulfat til udfældning foretoges i

DK 165412B

9 løbet af 12 timer. Da opløsningen havde nået 85%'s mætning, fortsattes den nænsomme omrøring ved 4°C i yderligere 24 timer. Det protein, der fandtes i supernatanten, blev pelleteret ved 30 minutters centrifugering ved 10.000 x G. Supernatanterne blev dekanteret og kastet 5 bort. Pellet'en blev gensuspenderet til 40 ml med 2 gange destilleret sterilt vand, og den resulterende opløsning indeholdt 205.000 U/ml IL-2 eller i alt 8,2 x 10^ enheder.

Yderligere forsøg blev udført som opsummeret nedenfor i tabel 1.

Tabel 1 10 Forsøg Supernatant- Aktivitet i puljen Enheder i alt nr. volumen (ml) (U/ml) x 10^ 4 1200 -\ 6500 9,425 15 5 250- 6 1200 S 6500 12,35

7 700 J

DK 165412B

10

Tabel 1 fortsat

Forsøg Gensuspensions- Aktivitet Samlet aktivitet nr. volumen (ml) (TJ/ml) (lj x ΙΟ**) 5 4 55 200.000 11 5 6 80 163.840 13,107 10 7

Ionbytningschromatografi på CM Biogel A-søjle CM Biogel A blev ækvilibreret i 0,05 M NaCl-HEPES, pH-værdi 5,5.

Søjlen (100 ml) blev pakket, hvorefter der tilsattes 100 ml 0,005 M 15 NaCl-HEPES, pH-værdi 5,5, der indeholdt 10% føtalt kalveserum. Dette blev gjort for at blokere ikke-specifikke bindingssteder, som kunne binde humant-IL-2-aktivitet. Serumproteiner, der blev bundet til søjlen, blev derefter bortelueret ved tilsætning af 500 ml 0,5 M NaCl-HEPES, pH-værdi 5,5. Søjlen blev derefter genækvilibreret med 20 1000 ml 0,05 M NaCl.

Kombinerede gensuspensioner af ammoniumsulfatudfældet protein, der omfattede forsøg 1-5 som beskrevet ovenfor, blev hældt på CM-søjlen.

Søjlen blev derefter vasket med 200 ml 0,05 M NaCl-HEPES, pH-værdi 5,5. En 500 ml saltgradient, der gik fra 50 mM til 0,5 M NaCl-HEPES, 25 pH-værdi 5,5, blev derefter hældt på søjlen. Efter gradientpåføringen blev søjlen vasket med 200 ml 0,5 M NaCl-HEPES, pH-værdi 5,5, for at sikre, at alt bundet IL-2 faktisk var blevet elueret fra søjlen. Der vandtes fraktioner på hver 5 ml. Hver 3. fraktion blev undersøgt for IL-2-aktivitet. Spidsaktiviteten blev bestemt, og de aktive fraktio-

DK 165412B

11 ner blev samlet i pulje. Man fik således en pulje på 36 ml med en aktivitet på 983.040 U/ml eller en samlet aktivitet på 35,39 x 10^ enheder.

Ved et andet CM-sej leforsøg med de gensuspenderede ammoniumsulfat-5 bundfald fra de i pulje samlede forsøg 6 og 7 som beskrevet ovenfor fik man i pulje samlede fraktioner med et volumen på 215 ml, en aktivitet på 80.000 U/ml og en samlet aktivitet på 17,2 x 10^ enheder. En 130 ml portion fra dette forsøg blev samlet med de 36 ml fra det første forsøg, hvilket gav 166 ml råt IL-2 med en samlet 10 aktivitet på 10,4 x 10^ enheder, da det måltes efter fremstillingen.

Reversfase HPLC med octylsøjle

Portion A, der vandtes som beskrevet ovenfor, blev i sin helhed pumpet direkte på en 9,4 x 250 mm Protesil Magnum 9 Octyl-søjle (Whatman Separations Inc., Clifton, New Jersey). Søjlen blev derefter 15 vasket med 50 ml 0,9 M eddikesyre/0,2 M pyridinpuffer, pH-værdi 4,0.

Eluering af proteinerne blev udført med en gradient af n-propanol 0-60% (v/v) i løbet af 8 timer i 0,9 M eddikesyre/0,2 M pyridinpuffer, pH-værdi 4. Et automatisk fluorescensdetektorsystem, der anvendte fluorescamin, overvågede proteinet i søjleeffluenterne. Udbyttet af 20 biologisk aktivitet var 7,13 x 106 enheder (ca. 70%).

Reversfase HPLC med diphenylsøjle

Fraktionerne, der indeholdt hovedspidserne af aktivitet opnået fra octylsøjlen, blev samlet i pulje, fortyndet i forholdet 1:1 (v/v) med 0,9 M eddikesyre/0,2 M pyridin, pH-værdi 4,0, og pumpet over på en 25 4,6 x 250 mm Whatman Protesil Diphenyl-søjle. Proteiner blev elueret med en 20-60% (v/v) n-propanolgradient i 0,9 M eddikesyre/0,2 M pyridinpuffer, pH-værdi 4,0, i løbet af 6,5 timer. Denne fremgangsmåde gav en symmetrisk spids, der faldt sammen med IL-2-aktivitet.

Udbyttet af aktivitet i dette trin var højere end 60%. Den essentiel-30 le homogenitet af materialet blev bekræftet ved analytisk SDS-PAGE elektrophorese og todimensional gelelektrophorese, der gav henholdsvis et enkelt bånd og en enkelt plet. Det således vundne homogene,

DK 165412 B

12 humane IL-2 havde en specifik aktivitet på ca. 1,4 x 10^ U/mg og et isoelektrisk punkt på 5,68.

Prøver af dette materiale blev underkastet aminosyreanalyse, der blev udført med fluorescamindetektion (jfr. Stein et al., Arch. Biochem.

5 Biophys. 155, 1973, s. 203). Polypeptidet blev hydrolyseret i 24 timer og 48 timer ved 104°C i konstant kogende HC1 indeholdende 0,1% thioglycolsyre. Resultaterne er vist nedenfor i tabel 2:

Tabel 2 10 24 timer 24 timer 48 timer IL-2's aminosyre - sammensætning

Asp 12,3 11,8 11,8 12

Thr 8,6 9,6 7,4 10 15 Ser 7,5 5,2 7,3 8

Glu 18,3 15,4 16,0 16-17

Pro 9,7 10,7 - 8-9

Gly 7,5 6,3 10,8 8

Ala 7,5 6,0 8,4 7 20 Cys 4-5*

Val 5,0 5,5 5,2 6

Met 4,3 3,3 3,1 4

Ile 5,0 7,5 6,3 7

Leu 13,7 19,4 16,0 16

Claims (6)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af humant interleukin 2 i homogen form, kendetegnet ved, at A. en opløsning af råt humant interleukin 2 lades passere gennem en 20 reversfase højtryksvæskechromatografisøj le, der indeholder methyl- eller octylgrupper, som er covalent bundet til silicagel, idet det humane interleukin 2 holdes tilbage på søjlen, søjlen elueres under HPLC-betingelser med en konventionel gradient af et med vand blandbart solvent, og fraktioner, som udviser humant interleukin 2-aktivi-25 tet samles i pulje, kombineret med, at B. de i pulje samlede aktive fraktioner fra trin A lades passere gennem en reversfasehøjtryksvæskechromatografisøj le, der indeholder DK 165412B diphenylgrupper covalent bundet til silicagel, idet det humane interleukin 2 holdes tilbage på søjlen, søjlen elueres under HPLC-betingelser med en konventionel gradient af et med vand blandbart solvent, og fraktioner, der udviser humant interleukin 2-aktivitet samles i 5 pulje, og trin A og/eller trin B eventuelt gentages.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det vundne homogene humane interleukin 2 er karakteriseret ved en specifik aktivitet på cå. 1,4 x 10^ U/mg, et isoelektrisk punkt på ca. 5,68 og en aminosyresammensætning som 10 følger: Asp 12 Ala 7 Tyr 3 Thr 10 Cys 4-5 Phe 5 Ser 8 Val 6 His 4 Glu 16-17 Met 4 Lys 8

15 Pro 8-9 Ile 7 Arg 4 Gly 8 Leu 16

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at søjlen i trin A er en octylsøjle.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, 20 kendetegnet ved, at silicagelen i octylsøjlen har en porestørrelse på ca. 150 Å og i diphenylsøjlen en porestørrelse på ca. 300 Å.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at pufferen i trin A og B er 0,9 M ed-25 dikesyre/0,2 M pyridin, pH-vardi 4,0.

5 Arg 3,9 3,9 7,5 4 I alt 130-133 * 24 timers hydrolyse på en separat prøve

10 Sekvensanalyse gav følgende interne partielle aminosyresekvens: Ile-Leu-Asn-Gly-Ile-Asn-Asn-Tyr-Lys-Asn-Pro-Lys-Leu-Thr. Denne sekvens er konsistent med stillingerne 44-57 hos den formodede humane IL-2-sekvens foreslået af Taniguchi et al., Nature 302, 1983, s. 305-310, fra klonet cDNA.

15 PATENTKRAV

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det rå humane interleukin 2 stammer fra inducerede, dyrkede humane maligne celler.