CS395391A3 - Homogeneous human interleukin 2, process of its preparation and apharmaceutical composition based thereon - Google Patents

Description

Λ'ίΤΖ'-ί/ ' Homogenní humánní interleukin 2, způsob jeho výroby a farmaceu-tický přípravek na jeho bázi

Oblast technikyI

Vynález se týká homogenního humánního interleukinu 2, způ-sobu jeho výroby a farmaceutického přípravku na jeho bázi.

Dosavadní stav techniky

Humánní interleukin 2 (IL-2) je rozpustný protein, kterýje schopen modulovat reaktivitu lymfocytŮ. V minulosti se vyrá-běl stimulací myších, krysích nebo humánních lymfocytových bu-něk mitogenem, jako je fytohemaglutinin (PHA) a konkanavalin. A(Con A); viz například Gillis a další, Nátuře 268, 154 (1977);.· J. Immunol. 120, 2 027 (1978); J. Xmmunol. 124, 1 954 (1980); J. Immunol. 125, 2 570 (1980). IL-2 získaný purifikací z myších, krysích a humánních nor- ¢, málních T-lymfocytů si zachovává různé- typy biologické aktivity,jako je 1. výrazné povzbuzení mitogenese thymocytů, 2. promocedlouhodobé "in vitro” proliferace pomocných nebo zabíječských(helper, killer) linií T-buněk specifických vůči antigenu a 3.indukce reaktivity cytotoxických T-lymfocytů (CTL) a plakotvor-né odpovědi buněk v kulturách slezinových buněk nahé myši. Sho-ra uvedené druhy biologické účinnosti IL-2 ukazují, že IL-2 jeužitečný při zvyšování imunologické odpovědi a při regeneraci .p buněčné a humorální imunity populací imunologicky deficientních t T-buněk (slezinové buňky nahé myši) na normální úroveň. Dále - tyto výsledky naznačují, že produkce IL-2 a odpověS na něj jsou důležitými parametry imunologických funkcí, které mohou být uži-tečné při klinické diagnóze aberantní imunity. Ze skutečnosti,že humánní IL-2 umožňuje "in vitro" proliferaci antigenspecific-kých humánních, myších a krysích zabíječských T-buněk, je zřejmádůležitost humánního IL-2 jako činidla pro další výzkum. 2 Několika autory byla sice popsána produkce humánního IL-2v médiích modifikovaných humánními, s.lezinovými nebo perifernímikrevními lymfocyty stimulovanými lektinem, za použití těchtozdrojů a technik se však dosáhne jen nízkých koncentrací IL-2. Při purifikaci IL-2 je proto nutno frakcionovat velké objemyupraveného média obsahujícího IL-2 a přesto se získá jen veliceniz_ká^ aktivita humánního IL-2. V důsledku^toho nejsou až dosuddostupná dostatečná množství koncentrovaného humánního IL-2 anipro experimenty "in vivo",. ani pro efektivní studie jeho výsled-né molekulární charakterizace. .

Gillis a Watson /J. Exp. Med., 152, 1 709 - 1 719 (1980)/popisují produkci humánního IL-2 indukcí' linie**maligních neoplas-tických buněk, jako je linie Jurkat - FHCRC T-buněčným mitogenem,jako je PHA, popřípadě v přítomnosti esteru forbolu, jako je-forbol myristoacetát (PMA). částečné purifikace IL-2 bylo dosa-ženo postupem zahrnujícím srážení síranem amonným a dialýzu,gelovou filtrační chromatografii (SEPHADEX G-100), ionexovouchromatografii (DEAE celulóza), isoelektrickou fokusaci v plo-chém loži a analytickou elektroforézu na polyakrylamidovém geluobsahujícím natriumdodecylsulfát (SDS - PAGE). Většina biologickéaktivity IL-2 byla elektroforeticky eluována z proteinového pásu(jednoho z devíti až Šestnácti separátních pásů pozorovanýchna gelu), Získaný produkt měl molekulovou hmotnost přibližně14 000 d (viz také Frank a další, J. Immunol. 127, 2 361 (1981)a Watson a další, Lymphokines 6, 95 (1982)) .

Mier a Gallo (J. Immunol. 128, 1122 (1982); Lymphokines6, 137 (1982)) referovali o purifikaci IL-2 z normálních lymfo-cytů a údajně získali "téměř homogenní materiál" za použití pre-parativní elektroforézy na SDS-gelu, jakožto posledního stupně,zařazeného po chromatografii na anexu a gelové filtraci. Jejichprodukt měl molekulovou hmotnost 13 000 podle SDS-PAGÉ a 20 000až 25 000 podle gelové filtrace a isoelektrický bod 6,8. Tatolátka byla velmi nestálá i při -70°C a pro zachování účinnostivyžadovala přídavek hovězího sérového albuminu (BSA) nebo poly-ethylenglykolu. 3

Stadler a Oppenheim (Lymphokines 6, 117 (1982)) popisujíIL-2 přečištěný z periferních krevních jednojaderných buněk,tonzilárních a slezinových buněk. Získaný produkt vykazuje popurifikaci sloupcovou chromatografií, gelovou filtrací a elektro-fokusací nábojovou heterogenitu. Byly zjištěny tři různě nabitédruhy ε hodnotami pí 6,5; 7,2 a 8,2. Tato heterogenita je při-pisována rozdílu ve stupni glykosylace.

Konečně, Robb a Smith (Mol. Immunol. 18, 1087 - 1094 (1981))izolovali TCGF (tj. IL-2) z buněčné linie T-leukemických buněkJURKAT. Tento produkt byl homogenní, pokud se týče náboje a veli-kosti molekul. Stejného výsledku údajně dosáhli také Robb a dal-ší (J. Exp. Med. 184, 1455 - 1474 (1981)·).

Podstata vynálezu Předmětem vynálezu je humánní interleukin 2, který se vyzna-čuje tím, ze je homogenní.

Nový. humánní interleukin 2 podle tohoto vynálezů je možnovyrobit kombinovaným postupem tak, že se 4 A. Roztok surového humánního interleukinu 2 vede sloupcempro vysokovýkonovou chrornátografi'i— na-reversní-fáz i~r~který-obsa—huje methylskupiny nebo oktylskupiny kovalentně vázané k silika-gelu, načež se humánní interleukin 2, který se na tomto sloupcizachytí, eluuje za podmínek HPLC tlumeným roztokem n-propanolu s koncentračním gradientem 0 až 60 % objemových a spojí se frakcevykazující aktivitu humánního interleukinu 2; načež se B. spojené frakce získané ve stupni A vedou sloupcem provysokovýkonovou chromatografií na reversní fázi, který obsahujedifenylskupiny kovalentně vázané k silikagelu, načež se humánníinterleukin 2, který se na tomto sloupci zachytíjěluuje za pod-mínek HPLC tlumeným roztokem n-propanolu s koncentračním gradi-entem 20 až 60 % objemových a spojí se frakce vykazující aktivi-tu humánního interleukinu 2; 4 a popřípadě se opakuje stupeň A a/nebo B. Předmětem vynálezu je také farmaceutický přípravek, kterýse vyznačuje tím, že jako účinnou látku obsahuje homogenní hu-mánní interleukin 2 a dále obsahuje farmaceuticky vhodné ředid-lo nebo nosič.

Vynález se týká humánního IL-2 získaného z indukovaných”" ' ~ humánních maligních buněk, který se purifikuje až do homogen-ního stavu za použití několika stupňů vysokovýkonové kapalino-vé chromatografie na reversní fázi. Postup použitý pro výrobuhomogenního IL-2 podle tohoto vynálezu se provádí tak, že sesurový preparát obsahující IL-2 vede přes sloupec pro HPLC sreversní fází, který obsahuje methylskupiny nebo oktylskupinyvážené k oxidu křemičitému, zachycený protein se eluuje n-pro- ’ panolovým gradientem v pufru, frakce, které jsou podle zkoušení ·* aktivní se spojí a vedou sloupcem pro HPLC s reversní fází, kte-rý obsahuje difenylskupiny vážené k oxidu křemičitému. V těch .případech, kdy má výchozí surový preparát poměrně nízký titr, s může být nutné opakovat jeden nebo více HPLC-stupňů, aby se pu-rifikace dovedla až do stavu homogenity. \

Surové preparáty IL-2 se snadno získají kultivací malig-ních humánních neoplastických buněk, jako jsou buňky humánníleukemie a lymphoma, postupem prováděným "in vitro" v médiuobsahujícím sérum, které je doplněno různými přísadami. Kulturase stimuluje mitogenem T-buněk, jako je PHA, za vzniku super-natantu obsahujícího IL-2. Po určité době, tj. přibližně po 24hodinách od inkubace se supernatant oddělí a purifikací zpracu-je na produkt o vyšší koncentraci IL-2. Pro zvýšení produkceIL-2 je také vhodné použít esteru forbolu, jako PMA, jako indukč-ního činidla, a to bud samotného nebo v kombinaci s mitogenemT-buněk, jako je PHA nebo Con A. Další podrobnosti jsou uvedenyv Gillis a další, J. Exp. Med. 152, 1709 (1980)). 5

Jako buněčné linie, kterých je možno použít pro produkcisurového.humánního IL-2, je možno uvést různé linie T a B-buněk,jakož i různé linie buněk T-lymphoma. Buněčné linie se získajíbud na základě spontánního výskytu, virové infekce nebo za použi-tí chemického karcinogenu. Přednostní buněčnou linii pro tentoúčel identifikovali Gillis a další jako buněčnou linii leukemic-kých humánních T-buněk Jurkat-FHCRC. Největší přednost se dávápoužití subklonu této linie s označením H33HJ-JAI. Způsobu podlevynálezu je také možno použít pro purifikaci IL-2 pocházejícíhoz periferních krevních lymfocytů.

Kultivační médium používané pro produkci surového humánníhoIL-2 ve spojení sé shora uvedenými buněčnými liniemi může býttvořeno obchodně dostupnými médii,, jako je Dulbeccem modifiko-vané Eaglovo médium, médium RPMI a Clickovo médium.: Z přísad,které je možno ke kultivačními médiu přidávat,. a€ již jednotlivěnebo v kombinaci, je možno uvést penicilín, streptomycin, gentamy-cin, čerstvý L-glutamin, pufr HEPES, hydrogenuhličitan sodný,fetální telecí sérum (FCS) nebo normální humánní sérum. Počáteč-ní hustota buněk, zvláště pokud se používá buněk Jurkat-FHCRC,by měla být řádově 5.105 az 1.107, nejvýhodněji asi Ι,.ΙΟθ buněkna mililitr.

Kultivace se provádí za těchto podmínek: teplota přibližně35 až 38°C, pH v rozmezí do 7,0 do 7,4, vlhká atmosféra obsahu^jící přibližně 5 až 10 % oxidu uhličitého ve vzduchu. Může sepoužívat koncentrace mitogenu PHA v rozmezí od 0,5 do 2,0 %,přednostně 1 % objemového.

Množství IL-2 produkovaného stimulací maligních humánníchbuněk rostlinným mitogenem se s časem mění. Špičkových hodnotIL-2 se dosáhne přibližně po -16 až 24 hodinách po stimulaci PHA.Stanovení IL-2, které se provádí za účelem monitorování produkcebuněčné kultury nebo monitorování purifikačního postupu se prová-dí tak, že se zjistí schopnost vzorku indukovat přoliferaci linieT-buněk. Proliferace T-buněk se stanovuje na základě měření 6 - inkorporace tritiovaného thymidinu. Jedna jednotka aktivity je definována jako počet yUl přítomných v jímce s kulturou T-buněk, který indukuje 50 % maximální inkorporace thymidinu. Specifické .· podrobnosti tohoto zkušebního postupu jsou uvedeny v J. Immunol. 120, 2 027 (1978), Gillis a další.

Vhodná výchozí látka pro HPLC purifikační stupně podle to-hoto' vynáíezu^še^Víská" ^sTáž^ímTčL^^^obsaženěfío^v supernlTtaňtu,- 'který byl získán odstředěním sklizených indukovaných buněk. Srá-žení se provádí síranem amonným až do stavu 85% nasycení. Přitomse suchý síran amonný postupně přidává za mírného míchání k super-natantu. Přidávání síranu amonného za účelem precipitace se prová-dí v průběhu dlouhé doby, například 12 hodin. To_dosažení stupně nasycenosti 85 % se v mírném míchání pokračuje ještě další,dobu jí za chladu. Vysrážený protein se peletizuje odstředěním a peletyse resuspendují ve sterilní redestilované vodě. . ’Γ 1 Při jednom alternativním postupu se resuspendovaný surovýIL-2 podrobí ionexové chromatografii. Jako vhodný sloupec pro . » tento účel je možno uvést pryskyřici CM Biogel A (výrobce LKB- . ·.$ -Producter, Bromma, Švédsko).. Přednostně se sloupec předběžně ošetří roztokem fetálniho telecího séra, aby se zablokovala ne-specifická vazebná místa v pryskyřici před aplikací vzorku obsa-hujícího IL-2. Eluce ze sloupce se provádí pufrovaným roztokemsoli s koncentračním gradientem. Vhodný gradient pro tento účelje 50 mM až 0,5 M NaCl v HEPES o hodnotě pH 5,5. Závěrečné promy-tí se provede 0,5M roztokem chloridu sodného v HEPES o pH 5,5,aby se zajistila eluce veškeré aktivity IL-2. *1

Spojené aktivní frakce získané ve shora uvedeném stupnij ionexové chromatografie představují přednostní výchozí látku pro HPLC postupy prováděné podle tohoto vynálezu. Pokud se zestupně srážení síranem amonným získá supernatant s dostatečněvysokým titrem, může se této látky alternativně přímo použítv prvním stupni HPLC podle vynálezu. V tomto případě však můžebýt pro získání v podstatě homogenního Il-2-produktu nutné opa-kovat jeden nebo oba HPLC stupně. 7 Při HPLC stupních postupu podle tohoto vynálezu se používásloupce silikagelu s reversní fází obsahujícího navázané methylo-vé, oktylové, nebo difenylové skupiny, který má velikost pórůpřednostně alespoň asi 15 nm. Vhodné sloupce pro HPLC na reversnífázi, kterých je možno použít při provádění způsobu podle vynále-zu, jsou běžně k dostání na trhu. Zvláště se k tomuto účelu hodířada sloupců Protesil (výrobce Whatmann Separations lne. Clifton,N.J., USA.

Tak například, Whatmann Protesil 300 Methyl je sloupec,obsahující trimethylsilylskupiny kovalentně vázané prostřednictvímvazeb křemík-kyslík-křemík k povrchu silikagelu s póry o průměru30 nm, přičemž z tohoto silikagelu byla vytříděna frakce o střed-ní velikosti částic 8yum. Podobně, Whatman Protesil Magnum 9 Octylje sloupec obsahující oktylskupiny kovalentně· vážené k silikagelus póry o průměru 15 nm. Whatman Protesil Diphenyl je sloupecobsahující difenylskupiny kovalentně vázané k povrchu silikagelus póry o průměru 30 nm. ' Eluce proteinů ze sloupců pro HPLC.se.může.provádět, o soběznámými způsoby v tomto oboru. Jako vhodný eluční postup proodstraňování vázaných proteinů ze sloupce obsahujícího kovalent-ně vázané methylové nebo oktylové skupiny, kterého se používáv prvním stupni HPLC při způsobu podle tohoto vynálezu, je možno uvést eluci ní"žkým-alkanolem ve slněsi~s~vodou_za_použití~gra—- dientu s postupně vzrůstající koncentrací tohoto alkoholu. Jakoalkoholu se přednostně používá n-propanolu. Přednostní gradientpro tento účel je gradient 0 až 60 % objemových alkoholu ve smě-si pyridin-kyselina octová o pH 4,0.

Podobných elučních podmínek se může použít i v případě elu-ce z difenylového sloupce použitého ve druhém stupni způsobupodle vynálezu -s tím rozdílem, že alkanolový gradient je 20 až60"% objemových. Eluovaný protein je možno účelně monitorovatpomocí detekčních systémů, které jsou v tomto oboru známy, na-příklad za použití automatizovaného fluorescenčního detekčníhosystému, který popsali Kenny a další v Methods Enzymol*78, 435(1981). 8

Po provedení HPLC stupňů při způsobu podle vynálezu, at,již se jedná o dva následné stupně nebo pokud se použije suro-viny s nízkým titrém, o sekvenci stupňů zahrnující jedno nebovíce opakování prvního a/nebo druhého stupně, se získá IL-2 purifikovaný do stavu homogenity, což se projevuje jediným sy-metrickým pikem bioaktivity. IL-2 se přitom získá v dobrém vý-těžku. Příprava homogenního IL-2 umožňuje poprvé stanovit amino-kyselinové složení jeho molekuly. Tato informace může vést kestanovení sekvence aminokyselin, jejíž známost je důležitá proklonování humánního genu IL-2 a následující produkci velkéhomnožství čistého rekombinantního IL-2 pró kliničké pokusy. Ko-nečným cílem je možnost širokého medicinálního nasazení tétolátky. Dostupnost homogenního IL-2 umožní provést přesné biolo-gické studie jeho účinnosti, jejichž výsledky nebudou ovlivněnykontaminací .IL-2 četnými lymfokiny, o nichž je známo, že vznika-jí jako vedlejší produkty při produkci IL-2 indukčním postupem. V dosavadním stavu techniky již sice byla popsána příprava vyso-ce čistých nebo téměř homogenních IL-2 preparátů, zkušenost všakukázala, že když se takový, materiál, vykazující údajně jediný páspři analytické elektroforéze SDS-PAGE, použije jako výchozílátka pro HPLC postup na methylovém nebo oktylovém sloupci, roz-štěpí se tento pás na velký počet proteinových píků, které ne-jsou spojeny s aktivitou IL-2. Na základě těchto pozorování sepředpokládá, že čistota takových známých přípravků není vyššínež 10 % a v některých případech může být dokonce nižší než 1 %. V tomto popisu a nárocích se pod výrazem "homogenní inter-leukin 2" rozumí humánní interleukin 2, který neobsahuje jinésloučeniny či proteiny, které aktivitu interleukinu 2 nevykazují.Přednostní postup pro přípravu humánního interleukinu 2 podlevynálezu spočívá v purifikaci za použití pracovních stupňů HPLC.Tím se získá preparát vykazující jediný symetrický pík aktivityIL-2. Tento preparát zároveň poskytuje jediný pás‘ nebo jedinouskrvrnu při analytické elektroforéze SDS-PAGE, nebo při dvouroz-měrné gelové elektroforéze. 9

Zkoušky s částečně purifikovanými IL-2 přípravky získanýmiz buněčné linie Jurkat-FHCRC ukázaly, že částečně purifikovanýlymfokin nezpůsobuje proliferaci čerstvých periferních krevníchlymfocytů, ale indukuje proliferaci v populacích T-lymfocytů,které byly předběžně stimulovány lektiny nebo specifickými anti-geny. Dále bylo zjištěno, Že zčásti purifikovaný humánní IL-2si zachovává schopnost proliferace nejen u humánních antigen-spe-cifických efektorových T-buněk, ale také antigen-specifickýchefektorových T-buněk hlodavců Muridae. Humánní IL-2 produkovanýbuněčnou linií Jurkat-FHCRC, přestože je purifikován pouze částečně, se stal užitečným činidlem pro použití při pěstování klonál-ních humánních T-buněk a T-buněk Muridae s různými antigenya různými specifickacemi efektorů a pro taková'použití se veskutečnosti stal. obchodním produktem. Homogenní IL-2 podle to-hoto vynálezu je samozřejmě možno používat podobným způsobem. * »·.’.·

Vynález se blíže popsán v následujícím příkladu provedení.Tento příklad má pouze ilustrativní charakter a rozsah vynálezuv žádném ohledu neomezuje. Příklady provedeni vynálezu -P-ř—í—k—1-a-d—-----

Produkce IL-2

Buňky H33HJ-JAI {ATCC č. CRL-81-63, vzorek uložen 26. srpna19 82) , což je klon rodičovské buněčné linie Jurkat-FHCRC, senechají růst v médiu RPMI 1 640, doplněném o 10 % fetálního tele-cího séra, 50 U/ml penicilinu, 50/Ug/ml streptomycinu, 50/Ug/mlgentamycinu a 300yug/ml čerstvého L-glutaminu, pří teplotě 37°Cve vlhké atmosféře obsahující 5 % oxidu uhličitého ve vzduchu.Když buněčná hmota dosáhne hustoty odpovídající nasycení {8 až10.105buněk/ml) provede se jejich sklizení. Buňky se odstředía resuspendují y čerstvém médiu RPMI 1 640, které neobsahuje 10 sérum, ale obsahuje 50 U/ml penicilinu, 50/Ug/ml streptomycinu,50/ug/ml gentamycinu a 300/ug/ml čerstvého L-glutaminu. Buňkyse resuspendují na koncentraci 2.10^ buněk/ml a stimulují sepřídavkem 1 % objemového PHA a 10 ng/ml forbol myristo-acetátu{PMA). Po 24 hodinách inkubace při 37°C ve vlhké atmosféře obsa-hújící 5 % oxidu uhličitého ve vzduchu, se indukované buňky sklidía odstředí. Zachycené supernatanty se považují za surovou vý- chozí látku.

Ke spojeným supernatantům ze 3 šarží buněčných kultur (č. 1až 3) o objemu 900, 900 a 1 050 ml, tedy o celkovém objemu2 850 ml, jejichž celková aktivita měřená podle stanovení, kte-ré popsali Gillis a další, J. Immunol. 120, 2 .{1978) , činí g 7,125.10 jednotek , se za mírného míchání postupně přidává su-chý síran amonný až do 85% nasycení. Srážení přidáváním síranuamonného se provádí po dobu 12 hodin. Když se dosáhne 85% nasy-cení roztoku, pokračuje se v míchání při 4°C dalších 24 hodin.Protein obsažený v supernatantu se peletizuje třicetiminutovýmodstředováním při 10 000 g. Supernatanty se dekantují a zahodí.Peleta se resuspenduje v redestilované sterilní vodě na celkovýobjem 40 ml. Vzniklý roztok obsahuje 205 000 U/ml IL-2 nebo cel- g kem 8,2.10 jednotek.

Provedou se též další pokusy, které jsou sumarizovány vtabulce I. - 11 -

Celkový ob-sah (akti-fivita)(U. 10 ) 11 13,107 Aktivita (U/ml) 200 000 i o . CD fH Objem re- suspenze (ml) 55 08 •>1 — > 0X0aí <e <-iη ω · CD X □u o — in (M xr K o LTJ ω * (N iH fí! -flj 4-> C -H — 00! o o Q) > i—In-«-t 6 0 -P 0.Λ! D M (0 ·*" U 1 VD <0 Objem su-pernatantu(ml) 1 200 250 1 200 700 Pokus č. v m t£> . r- 12

Ionexová chromatografie na sloupci CM Biogel A CM Biogel A se ekvilibruje v 0,05M NaCl-HEPES o pH 5,5. Na-plní se kolona (100 ml) a potom se na sloupec působí 100 ml0,005M NaCl-HEPES o pH 5,5, který obsahuje 10 % FCS. Tato operacese provádí proto, aby se zablokovala nespecifická vazebná místa,která by potom mohla vázat aktivitu humánního IL-2. Sérové pro-teiny, které se na sloupec navážou, se potom eluují 500 ml 0,5MNaCl-HEPES o pH 5,5.. . Potom se sloupec reekvilibruje pomocí1 000 ml 0,05M roztoku chloridu sodného.

Na CM sloupec se aplikují spojené resuspenze proteinu vy-sráženého síranem amonným z pokusů 1 až ‘5, popěných výše. Po-tom se sloupec promyje 200 ml 0,05M NaCl-HEPES o pH 5,5. Dálese na sloupec aplikuje 500 ml solného gradientu od 50mM do 0,5MNaCl-HEPES o pH 5,5. Po aplikaci gradientu se sloupec promyje200 ml 0,5M NaCl-HEPES o pH 5,5, aby se zajistilo, že všechenvázaný IL-2 byl ze sloupce skutečně eluován. Zachycují se 5mlfrakce. H každé 3. frakce se zkouší aktivita IL-2. Stanoví semaximální aktivita a aktivní frakce se spojí. Tak se získá cel-kem 36 ml eluátu o aktivitě 983 040 U/ml. Celková aktivita činí35,39.10^jednotek (U) . Při dalším pokusu na CM sloupci s resuspendovaným precipi-tátem získaným srážením síranem amonným (spojený produkt z poku-sů 6 a 7) se získají spojené frakce o celkovém objemu 215 mla aktivitě 80 000 U/ml a celkové aktivitě IL-2 17,2.10^U. 130 mltěchto spojených frakcí se smíchá s 36 ml spojených frakcí zprvního pokusu. Tak se získá 166 ml surového IL-2 o celkovém :í obsahu (aktivitě) 10,4.10^U. HPLC na reversní fázi na oktylovém sloupci Dávka A získaná shora uvedeným způsobem se celá přímo na- čerpá do kolony o rozměrech 9,4.250 mm obsahující Protesil Mag- num 9 Oktyl Column (Whatmann Separations lne., Clifton, N.J. 13 USA). Potom se sloupec promyje 50 ml roztoku kyseliny octové(0,9M) a pyridinu (0,2M), tedy tlumičem o pH 4,0. Eluce pro-teinů se provádí n-propanolovým gradientem od 0 do 60 % obje-mových v pufru obsahujícím kyselinu octovou v 0,9M koncentracia pyridin v 0,2M koncentraci, jehož pH « 4. Eluce se provádí8 hodin. Monitorování proteinu v eluátu vytékajícím z kolonyse provádí pomocí automatizovaného fluorescenčního detekčníhosystému za použití fluoreskaminu. Regeneruje se 7,13.10θ jedno-tek biologické aktivity (přibližně 70 %) . HPLC na reversní fáze na difenylovém sloupci

Frakce obsahující hlavní maxima aktivity, které byly získá-ny z oktylového sloupce, se spoji a zředí 1 : 1 (objemově) roz-.tokem kyseliny octové (0,9M) a pyridinu (0,2M) o pH 4,0 a čerpa-jí do kolony o rozměrech 4,6x250 mm obsahující náplň WhatmannProtesil Diphenyl. Proteiny se eluují n-propanolovým gradientem(20 až 60 % objemových) v pufru o pH 4,0, který je tvořen roz-tokem kyseliny octové (0,9M) a pyridinu (0,2M). Eluce se provádí 6,5 hodiny. Tímto postupem se získá.symetrický'pík, který jev souladu s aktivitou IL-2. Regenerace aktivity v tomto stupnije vyšší než 60 %. Skutečnost, že získaná látka je v podstatěhomogenní, se potvrdí analytickou elektroforézou SDS-PAGE a dvou-.r.ozměrnou_gelO-V-QU elektroforézou. Při první z těchto analytickýchmetod se získá jediný pás, a při druhá jediná skvrna. Takto zís-kaný homogenní humánní IL-2 vykazuje specifickou aktivitu přibliž 9 ně 1,4.10 U/mg a hodnotu pí 5,68.

Vzorky této látky se podrobí analýze, na aminokyseliny,která se provádí za použití fluoreskaminové detekce (viz Stein ,a další, Arch. Biochem. Biophys., 155, 203 (1973)). Polypeptidse hydrolyzuje 24 a 48 hodin při 104°C ve stále vroucí kyseliněchlorovodíkové obsahující Q',1 % thioglykolové kyseliny. Výsledkyjsou souhrnně uvedeny v následující tabulce II. 14 aminokyselin 24 hodin 24 hodin '48 hodin v IL-2Í_ 133 r- * 1 O en ΠΊ n..... —-)- 1 w (\ o co to ffl co Γ' T7 \D TT Γ» (0 P) |Ω V o tr F"[ fM e φ x F-f u

CO m O 00 ΤΓ tN iH m o. CM «Κ *. *» h. *» » i-t P* r- VD i o o m n o w TP rH ιΉ fH fH v o> ffi ιή *··***» w,y vv «Ο v r*· p» ''« ·> «*.; *!

CD to tsi Γ* PQ o ιΛ m ΙΛ ,«cr r- fM co Ό σ> r-l tň iň o o Λΰ ιη m r* σι fH m CO PD fH 1—1 w rH m o if> r*i t" in in r\i co r" co ot t"· r*· o η o Γ' -5T to *»*·*·* h. «,

Λ ’Τ 1Λ N V 0Ί <3>Γ~ ť*í í» r' 0. ti ti 3 0 >1 co m i—I -u Φ 3 tl Φ to to σ 0} X 0) I—I tl i—! i-d to 0 H 0) •H z* tl < “ IQ U ct □ < u > S M . fr« cu zz < 24-ti hodinová hydrolýza na separátním vzorku. 15

Sekvenováním se'dospěje k následující vnitřní částečné sek-venci aminokyselin:

Ile-Leu-Asn-Gly-Ile-Asn-Asn-Tyr-Lys-Asn-Pro-Lys-Leu-Thr

Tato sekvence je konzistentní s polohami .44 až 57 údajné sekvence »humánního IL-2, kterou navrhli Taniguchi a další (Nátuře 302, ' ř 305 - 310 (1983)) , kterýžto IL-2 byl získán z klonované cDNA.

Claims (5)

1. f « — ·- 16 -

   *4* ~7λ3Γ«·0 V j Á-31Ví. >a vhp. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Humánní interleukin 2 v homogenní formě.
2. 2. Humánní interleukin 2 podle’ nároku 1, se 9 .„.akti_vitotu.pr.ibližně_l,_4.1.0„ U/mq. . ; . i? s pec i f
3. 3. Humánní interleukin 2 podle nároku 1 nebo nároku 2, jehož9 specifická aktivita je asi 1,4.10 U/mg, pí asi 5,68, který zahr-nuje sekvenci aminokyselin zahrnující následující aminokyseliny: Asp 12 Ala 7 Tyt 3 Thr 10 Cys 4-5 Phe 5 Ser 8 Val 6 His 4 Glu 16-17 Met 4 Lys 8 Pro 8-9 Ile 7 Arg 4 Gly 8 Leu 16.
4. 4. Humánní interleukin 2 podle kteréhokoliv z nároku 1 až 3,připravitelný tak, že se A. Roztok surového humánního interleukinu 2 vede sloupcempro vysokovýkonovou chromatografii na reversní fázi, který obsa-huje methylskupiny nebo oktylskupiny kovalentne vázané k silika-gelu, načež se humánní interleukin 2, který se na tomto sloupcizachytí, eluuje za podmínek HPLC tlumeným roztokem n-propanolu s koncentračním gradientem 0 až 60 % objemových a spojí se frakcevykazující aktivitu humánního interleukinu 2; načež se B. spojené frakce získané ve stupni A vedou sloupcem provysokovýkonovou chromatografii na reversní fázi, který obsahujedifenylskupiny kovalentne vázané k silikagelu, načež se humánníinterleukin 2, který se na tomto sloupci zachytí, eluuje za pod-mínek HPLC tlumeným roztokem n-propanolu s koncentračním gradi-entem 20 až 60 % objemových a spojí se frakce vykazující aktivi-tu humánního interleukinu 2; 17 a popřípadě se opakuje stupeň A a/nebo B.
5. 5. Farmaceutický přípravek, vyznačující se jj;t í m , ze kromě farmaceuticky vhodného ředidla nebo nosiče obsa-· */huje jako účinnou látku homogenní humánní interleukin 2 podle kte- 'rréhokoliv z nároků 1 až 4. . * MP-1314-91-HO 1,fc