JPS58159420A - インタ−ロイキン２の精製法 - Google Patents
インタ−ロイキン２の精製法Info
- Publication number
- JPS58159420A JPS58159420A JP57043352A JP4335282A JPS58159420A JP S58159420 A JPS58159420 A JP S58159420A JP 57043352 A JP57043352 A JP 57043352A JP 4335282 A JP4335282 A JP 4335282A JP S58159420 A JPS58159420 A JP S58159420A
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- JP
- Japan
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- interleukin
- solution
- porous glass
- adsorbed
- glass beads
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
インターロイギン２（以下、ｌ−Ｉ Ｌ−２−１と略記
する。）はヒト、マウス等ｔこ存で１−する免疫伝達因
子てあり、生体内でＴ ’） ７パ球増殖、キラーＴす
Ｉ Ｌ−２の有用性は広く認識されている。
する。）はヒト、マウス等ｔこ存で１−する免疫伝達因
子てあり、生体内でＴ ’） ７パ球増殖、キラーＴす
Ｉ Ｌ−２の有用性は広く認識されている。
このよう１こして得られる粗Ｉ Ｌ−２は、一般ｅこ、
低濃度であり、ＩＬ−２の他ｒこ細胞由来、培養液由来
、また添加物由来の多くの夾雑物を含んでいるため、特
ｒこ医薬として実用Ｖこ供するためには、ＩＬ−２を精
製することが不可欠といえる。
低濃度であり、ＩＬ−２の他ｒこ細胞由来、培養液由来
、また添加物由来の多くの夾雑物を含んでいるため、特
ｒこ医薬として実用Ｖこ供するためには、ＩＬ−２を精
製することが不可欠といえる。
ＩＬ−２の精製法はいくつか報告されている。
米国ＮＩＨのガロらは、人末梢血中のリンパ球の産生じ
たＩＬ−２を塩析、イオン交換クロマト（ＤＥＡＥ−セ
ファローズ）を行なった後、ポリエチレングリコールを
０．１％含有するトリス塩酸バフファー（０，１Ｍ、
ｐＨ８，０）でゲル濾過クロマドグラフィー（クル１〜
ロゲルＡＣＡ５４ ）ｒこより精製した。彼らは、微
量タンパつてあるＩＬ−２がカラム、樹脂等にこ吸着等
ｅこ上り失活し易いため、ゲルで・過では安定剤として
緩衝液中Ｖこポリエチレングリコールを添加したが、そ
れで４）培養液？こλ、１し精製度４００倍のｌ Ｌ
−２を回収率９％でしか得られていない。（Ｒ，Ｃ，Ｇ
ａ１ｌｏ ｃｌ ａｌ−＋Ｐｒｏｃ、 Ｎａ１１．
Ａｃｏｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ 、７７、
６１３４（＋９８０ ） しかし、この方法は、精製の初期でイオン交換樹脂処理
１こ供するため、まず透析等の脱塩操作をすること等、
大規模に行うためＶこは、操作性の複／Ａ′１１さ等て
必ずしも適しておらず、また、得られたｌ Ｌ −２の
回収率も低い。また、電気泳動５ＤＳ−１）Δ〇 ｌｉ
を用いた精製ては、ザソブル中の界面活性剤・ドデン
ルスルホン酸すトリウム（ＳＤＳ）を除去することがは
なはだ難しく、臨床用に適さない。
たＩＬ−２を塩析、イオン交換クロマト（ＤＥＡＥ−セ
ファローズ）を行なった後、ポリエチレングリコールを
０．１％含有するトリス塩酸バフファー（０，１Ｍ、
ｐＨ８，０）でゲル濾過クロマドグラフィー（クル１〜
ロゲルＡＣＡ５４ ）ｒこより精製した。彼らは、微
量タンパつてあるＩＬ−２がカラム、樹脂等にこ吸着等
ｅこ上り失活し易いため、ゲルで・過では安定剤として
緩衝液中Ｖこポリエチレングリコールを添加したが、そ
れで４）培養液？こλ、１し精製度４００倍のｌ Ｌ
−２を回収率９％でしか得られていない。（Ｒ，Ｃ，Ｇ
ａ１ｌｏ ｃｌ ａｌ−＋Ｐｒｏｃ、 Ｎａ１１．
Ａｃｏｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ 、７７、
６１３４（＋９８０ ） しかし、この方法は、精製の初期でイオン交換樹脂処理
１こ供するため、まず透析等の脱塩操作をすること等、
大規模に行うためＶこは、操作性の複／Ａ′１１さ等て
必ずしも適しておらず、また、得られたｌ Ｌ −２の
回収率も低い。また、電気泳動５ＤＳ−１）Δ〇 ｌｉ
を用いた精製ては、ザソブル中の界面活性剤・ドデン
ルスルホン酸すトリウム（ＳＤＳ）を除去することがは
なはだ難しく、臨床用に適さない。
また、ギリスら（Ｓ、 Ｇ１１ｌｉｓ ｅｌａｌ、。
Ｊ 、 Ｉｍｍｕｎｏ ｌ 、 ±２４（４）
１９５４（１９８０））およびライヒら（Ｅ、 Ｒｅ１
ｃｈ ｅｌａｌ、＋ Ｊ、 Ｅｘｐ。
１９５４（１９８０））およびライヒら（Ｅ、 Ｒｅ１
ｃｈ ｅｌａｌ、＋ Ｊ、 Ｅｘｐ。
Ｍｅｄ、１５４，４２２（１９８１））も、ヒト、マウ
ス、ラットＩ Ｌ −２の精製β塁視濾過、イオン交換
、各種電気泳動等はぼ同様な方法を用いているが、同じ
欠点を有し、大量の試ｔ：Ｉ調製ンこけ適さない。
ス、ラットＩ Ｌ −２の精製β塁視濾過、イオン交換
、各種電気泳動等はぼ同様な方法を用いているが、同じ
欠点を有し、大量の試ｔ：Ｉ調製ンこけ適さない。
その他、ブラウンら（Ｊｏｒａｎａｌ ｏｆ １ｍｍｕ
ｎｏｌａｇｉ−ｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ ３３ 、 ３
３７−３５０（１９８０） ）も、マウス、ラット牌
臓から産生させたｌ Ｌ −２を塩析、ゲル濾過ｅこよ
って精製を行っているが、精製度が低（（１００倍）、
また大規模に行うｅこはゲル嬶過クロマトゲラフィート
こかける容量″が多すぎるなどの欠点をもつ。
ｎｏｌａｇｉ−ｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ ３３ 、 ３
３７−３５０（１９８０） ）も、マウス、ラット牌
臓から産生させたｌ Ｌ −２を塩析、ゲル濾過ｅこよ
って精製を行っているが、精製度が低（（１００倍）、
また大規模に行うｅこはゲル嬶過クロマトゲラフィート
こかける容量″が多すぎるなどの欠点をもつ。
本発明者らは、１１、−２の大１い−Ｗｊｉ製法な＠立
すべく鋭意研究をおこなった結果、多孔ｊ１カラスビー
ズ（Ｃｏｎ１：ｒｏｌｌｅｄ −Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ
）を吸着体として用いる方法が、■ＩＬ−２の回収率
か高い、Ｑ）脱塩工程が簡略化できる、（３）吸着担体
が少惜で−むため、取扱い液量が増えないなど、経済性
および効率性の高い方法であることを見出し、本発明を
完成した。
すべく鋭意研究をおこなった結果、多孔ｊ１カラスビー
ズ（Ｃｏｎ１：ｒｏｌｌｅｄ −Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ
）を吸着体として用いる方法が、■ＩＬ−２の回収率
か高い、Ｑ）脱塩工程が簡略化できる、（３）吸着担体
が少惜で−むため、取扱い液量が増えないなど、経済性
および効率性の高い方法であることを見出し、本発明を
完成した。
本発明方法によれば、多孔質ガラスピーズ（以下、「Ｃ
ＰＧ」と略記することがある。）は単独で用いてもよい
。また、必要１こ応し他の生体高分子精製法、即ちイオ
ン交換、ゲル濾過、疎水性樹脂等のクロマトグラフィー
または電気泳動とＣＰＧを組合せて用いてもよい。この
よう？こすれば容易？こ高い純度のＩＬ−２かえられる
３、マ、ラット、マウス由来でもよく、また遺伝子工学
的手法で産生されるＩ Ｌ −２培養上清にも当然適用
可能であると考えられる。ＩＬ−２産生用培地は、血清
培地でも無血７Ｎ培地でもよい。
ＰＧ」と略記することがある。）は単独で用いてもよい
。また、必要１こ応し他の生体高分子精製法、即ちイオ
ン交換、ゲル濾過、疎水性樹脂等のクロマトグラフィー
または電気泳動とＣＰＧを組合せて用いてもよい。この
よう？こすれば容易？こ高い純度のＩＬ−２かえられる
３、マ、ラット、マウス由来でもよく、また遺伝子工学
的手法で産生されるＩ Ｌ −２培養上清にも当然適用
可能であると考えられる。ＩＬ−２産生用培地は、血清
培地でも無血７Ｎ培地でもよい。
本発明ｔこよる精製の詳細を以下ｒこ述べる。
まず、蛋白質などの夾雑物を含むＩＬ−２溶液をｐＨ５
〜１０、好ましくはｐＨ６，６〜８．５で多孔質グラス
ビーズに接触させてＩＬ−２をこれに吸着させる。この
溶液としては、培養液、膜性等ｒこよる濃縮液、塩析？
こよる蛋白沈澱物を再溶解し ５− たもの、あるいは粗精製ＩＬ−２溶液てあってもよい。
〜１０、好ましくはｐＨ６，６〜８．５で多孔質グラス
ビーズに接触させてＩＬ−２をこれに吸着させる。この
溶液としては、培養液、膜性等ｒこよる濃縮液、塩析？
こよる蛋白沈澱物を再溶解し ５− たもの、あるいは粗精製ＩＬ−２溶液てあってもよい。
なお、吸着の際のｌ Ｌ −２溶液のイオン強度は、吸
着Ｐこあまり大きな影響をケーえないが、Ｎ ａ Ｃｌ
ａ度で１．０Ｍ以上Ｆこなると非吸ｉ ＩＩ−−２の
量が増加するため、０．５ＭＭ以が望ましい。
着Ｐこあまり大きな影響をケーえないが、Ｎ ａ Ｃｌ
ａ度で１．０Ｍ以上Ｆこなると非吸ｉ ＩＩ−−２の
量が増加するため、０．５ＭＭ以が望ましい。
このようｅこして吸着させたＩ Ｌ −２は、例えば、
次のような溶出液て溶出される。すなわち、（Ｉ）エチ
レングリコール、グリセリン等を１−９９ ％好ましく
は２０〜９０係含んだ緩衝液。なお、ここにこ緩衝液は
、通常用いられるバッファーてあればいずれてもかまわ
ず、ｐ ｉ（領域もＩ ｌ−−２が安定な領域てあれば
よい。（２） （ｉ７゜なお、ここＶこ酸のｐＨは１．
０〜５．０、好ましくは１．５〜３，５である。
次のような溶出液て溶出される。すなわち、（Ｉ）エチ
レングリコール、グリセリン等を１−９９ ％好ましく
は２０〜９０係含んだ緩衝液。なお、ここにこ緩衝液は
、通常用いられるバッファーてあればいずれてもかまわ
ず、ｐ ｉ（領域もＩ ｌ−−２が安定な領域てあれば
よい。（２） （ｉ７゜なお、ここＶこ酸のｐＨは１．
０〜５．０、好ましくは１．５〜３，５である。
溶出液は、そのｐＨがこの範囲のものであれば、いずれ
の酸を用いてもかまわない。また、（３）−十 −ｖ
＋ ＣＮＳ ＋Ｉ ＋Ｂｒ ＋ＣｌＯ４＋Ｉ−＋
＋Ｃａ ＋アルギルアンモニウムイオン等の塩類の溶
液もしくはこれらの塩類を含む緩衝液などの溶液を用い
てもよい。この場合、塩類の濃度は０．１ Ｍ以−１−
好ま ６− しくけ０．４〜１．０Ｍてあれば」、い。
の酸を用いてもかまわない。また、（３）−十 −ｖ
＋ ＣＮＳ ＋Ｉ ＋Ｂｒ ＋ＣｌＯ４＋Ｉ−＋
＋Ｃａ ＋アルギルアンモニウムイオン等の塩類の溶
液もしくはこれらの塩類を含む緩衝液などの溶液を用い
てもよい。この場合、塩類の濃度は０．１ Ｍ以−１−
好ま ６− しくけ０．４〜１．０Ｍてあれば」、い。
浴出方法自体は通常の方法でよく、ＩＬ−２を吸着した
Ｃ Ｐ Ｇを上記溶出液で洗うこと１こよってもてきる
１、 上記の操作ｅこまってえられたＩ Ｌ −２溶液は、そ
のまままたはこれより膜濃縮、塩析などで分画して適当
なＩＬ−２の用途にこ供する。あるいは、所望Ｅこより
、そのようなＩ Ｌ −２溶液はそのまままたは同様の
処理ののち１こ、更にこ各種の樹１旨を使用するクロマ
トグラフィー処理等１こ付することＥこより、その純度
をさら１こトげることができる。
Ｃ Ｐ Ｇを上記溶出液で洗うこと１こよってもてきる
１、 上記の操作ｅこまってえられたＩ Ｌ −２溶液は、そ
のまままたはこれより膜濃縮、塩析などで分画して適当
なＩＬ−２の用途にこ供する。あるいは、所望Ｅこより
、そのようなＩ Ｌ −２溶液はそのまままたは同様の
処理ののち１こ、更にこ各種の樹１旨を使用するクロマ
トグラフィー処理等１こ付することＥこより、その純度
をさら１こトげることができる。
ＣＰＧ処理と組合せて用いるクロマトグラフィー用樹脂
としては、ゲル接遇の場合は、分子量分画の範囲が数千
から子方程度のものであればいずれであってもよく、イ
オン交換樹脂の場合も、カルボキンメチル（ＣＭ）など
の陽イオン交換系であってもジエチルアミノエチル（Ｄ
ＥＡＥ ） セルロースなどの陰イオン交換系であっ
てもよい。
としては、ゲル接遇の場合は、分子量分画の範囲が数千
から子方程度のものであればいずれであってもよく、イ
オン交換樹脂の場合も、カルボキンメチル（ＣＭ）など
の陽イオン交換系であってもジエチルアミノエチル（Ｄ
ＥＡＥ ） セルロースなどの陰イオン交換系であっ
てもよい。
本発明のＣＰＧ処理は、その他、フェニルセファロース
等の疎水性イオン交換樹脂ｅこよるカラムクロマトグラ
フィーや電気泳動と組合ぜてもよい。
等の疎水性イオン交換樹脂ｅこよるカラムクロマトグラ
フィーや電気泳動と組合ぜてもよい。
特ｔこ、ＣＰＧｒこよるカラノ・りｐ７トグラフイーと
ゲル濾過カラムクロマＩ・グラフィーとの組合ぜｅこよ
るＭ４製法（両カラムクロマトグラフィーはどちらを先
１こ行ってもよい。）では、高純度のｌ Ｌ−２かえら
れる。なお、不発明方法１こおけるＣＰＧｔこよるノＪ
うｌいクロマトグラフィーＱよ、吸着物質をＣＰＧとす
る以外は、−・般のカラムクロマトグラフィー１３おけ
る技法を採用して行なうとよい。
ゲル濾過カラムクロマＩ・グラフィーとの組合ぜｅこよ
るＭ４製法（両カラムクロマトグラフィーはどちらを先
１こ行ってもよい。）では、高純度のｌ Ｌ−２かえら
れる。なお、不発明方法１こおけるＣＰＧｔこよるノＪ
うｌいクロマトグラフィーＱよ、吸着物質をＣＰＧとす
る以外は、−・般のカラムクロマトグラフィー１３おけ
る技法を採用して行なうとよい。
因み１こ、例えば、ヒトＩ Ｌ −２の場合、この組合
せによって行なった例では、えられた精製物は、下記の
ギリスらの方法で測定して５ＸＩＯ’〜１０６ｕ ｎ
１ｔ ／ ｍｙの活性を示し、電気泳動（５ＤＳ−ＰＡ
ＧＥ ）で分子量＋ ５．０００ダルトノの蛋白質であ
り、分子量２５． ＯＯＯダルトン以上の夾到１物を含
んでいなかった。
せによって行なった例では、えられた精製物は、下記の
ギリスらの方法で測定して５ＸＩＯ’〜１０６ｕ ｎ
１ｔ ／ ｍｙの活性を示し、電気泳動（５ＤＳ−ＰＡ
ＧＥ ）で分子量＋ ５．０００ダルトノの蛋白質であ
り、分子量２５． ＯＯＯダルトン以上の夾到１物を含
んでいなかった。
なお、ＩＬ−２の活性測定はキリスらの方法（Ｓ、 Ｇ
１１ｌｉｓ ｅｔ ａｌ、＋ Ｊ、 Ｅｘｐ、 Ｍｅ
ｄ、＋ １５２ ＋１７０９（１９８０））ｔこよっ
た。
１１ｌｉｓ ｅｔ ａｌ、＋ Ｊ、 Ｅｘｐ、 Ｍｅ
ｄ、＋ １５２ ＋１７０９（１９８０））ｔこよっ
た。
１、 ｓ ｏ ｏ ｕｎｔｔ／＋＋ｌ）をホロファイバ
ーＨＩＰ５（アミコン社製）ｅこより濃縮し、容量を４
００ｒｘｌにした後、固形硫安２４０１を加え飽和硫安
濃度の８５％ｔこしてＴＬ−２を含む蛋白質を沈澱させ
た。その後遠心分離（６，００Ｏｒｐｍ ３０分間）ｔ
こよって蛋白を分離した。
ーＨＩＰ５（アミコン社製）ｅこより濃縮し、容量を４
００ｒｘｌにした後、固形硫安２４０１を加え飽和硫安
濃度の８５％ｔこしてＴＬ−２を含む蛋白質を沈澱させ
た。その後遠心分離（６，００Ｏｒｐｍ ３０分間）ｔ
こよって蛋白を分離した。
分離した蛋白を、ｐ Ｈが７．６であり、０．２Ｍの塩
化すトリウムを含む０．１ Ｍ ）リスヒドロキシアミ
ノメタン−塩酸（トリス−塩酸）緩衝液２６６ｍ１ｆこ
溶解した。
化すトリウムを含む０．１ Ｍ ）リスヒドロキシアミ
ノメタン−塩酸（トリス−塩酸）緩衝液２６６ｍ１ｆこ
溶解した。
このｒＬ−２浴液を多孔質ガラスピーズ（コンドロール
ドポアーグラスＣＰＧ−１０、孔径３５０Ａ、１２０−
２００メツシユ、Ｅｌｅｃｔｒｏ −Ｎｕｃｌｅｏｎｉ
ｃｓ 社製） のカラム（カラムサイズは１６闘径×
１５０朔、容量３０ｍ／）ｒこ通液し、 ９− １ Ｌ −２を吸着させた。なお、この多孔質ガラスピ
ーズのカラムは、あらかじめ、０．４ Ｍ ＮａＣ１を
含んだ０．Ｉ Ｍ ｌ−リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，６
）て充分平衡化しておいたものである。
ドポアーグラスＣＰＧ−１０、孔径３５０Ａ、１２０−
２００メツシユ、Ｅｌｅｃｔｒｏ −Ｎｕｃｌｅｏｎｉ
ｃｓ 社製） のカラム（カラムサイズは１６闘径×
１５０朔、容量３０ｍ／）ｒこ通液し、 ９− １ Ｌ −２を吸着させた。なお、この多孔質ガラスピ
ーズのカラムは、あらかじめ、０．４ Ｍ ＮａＣ１を
含んだ０．Ｉ Ｍ ｌ−リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，６
）て充分平衡化しておいたものである。
その後、０．４ Ｍ ＮａＣ１ｔ（含んだＯ，ＩＭｌ・
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）２００ｍ／を通液し、
カラム内を洗浄した後、２．ＯＭ ＮａＣｌを含むＯ，
１Ｍｌリス−塩酸緩衝液（＋）Ｈ７，６）１３３３％エ
チレングリコールを含んだ緩衝液（２，０Ｍ Ｎ、ｉｃ
ｌを含む０．１ Ｍ ） ！ｌ ス塩酸緩衝液、ｐＨ７
，６） ＋ ５０ｍｅてＩＬ−２を溶固１させた。
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）２００ｍ／を通液し、
カラム内を洗浄した後、２．ＯＭ ＮａＣｌを含むＯ，
１Ｍｌリス−塩酸緩衝液（＋）Ｈ７，６）１３３３％エ
チレングリコールを含んだ緩衝液（２，０Ｍ Ｎ、ｉｃ
ｌを含む０．１ Ｍ ） ！ｌ ス塩酸緩衝液、ｐＨ７
，６） ＋ ５０ｍｅてＩＬ−２を溶固１させた。
敢
溶Ｗ曲線は、図ＩＩこ示した。
３０分で遠心分離し、上清を除いたあと、２０ｍｅの０
．０５ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）ｒこ溶解させた
。塩析操作でのＩ １．、−２の活性低下はほとんどみ
られなかった。
．０５ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）ｒこ溶解させた
。塩析操作でのＩ １．、−２の活性低下はほとんどみ
られなかった。
えられたｌ Ｌ−２溶液をゲル濾過カラムクロマトグラ
フィー１こ供した。樹脂としては、セファデー １０− ノ９ｙ、Ｇ ］ ００ （Ｓｗｅｄｅｎ ファルマ／
γ祖製）、カラムは４４祁Φ×９ Ｑ Ｃｎ＋のものを
用いた。ゲル４（Ｑ過カラノ・の平ＮＡｉ化ｒこは、１
．２５〜４の塩化すトリウド 用い、溶出の際ｒｒ−も同ｌ−２緩衝液を用いた。流速
３４ｍｅ／ｈｒｏ 分子用のｌＩｌ ５ｆは、Ｏｒａ
ｌｂｕｍｉｎ ＋Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｒこよ
った。
フィー１こ供した。樹脂としては、セファデー １０− ノ９ｙ、Ｇ ］ ００ （Ｓｗｅｄｅｎ ファルマ／
γ祖製）、カラムは４４祁Φ×９ Ｑ Ｃｎ＋のものを
用いた。ゲル４（Ｑ過カラノ・の平ＮＡｉ化ｒこは、１
．２５〜４の塩化すトリウド 用い、溶出の際ｒｒ−も同ｌ−２緩衝液を用いた。流速
３４ｍｅ／ｈｒｏ 分子用のｌＩｌ ５ｆは、Ｏｒａ
ｌｂｕｍｉｎ ＋Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｒこよ
った。
なお、ケルｄｌｔＩ過カラムク１コマトクラソイーの浴
出曲線は図２トこ示した。
出曲線は図２トこ示した。
えられたヒｌ− Ｉ Ｌ−２は、ケルｇ過カラムクＩｆ
ｆ−ｚ ｌ・クラフィー（セファデックスＧ１００）て
分子ｉｉＬ＋ ５． ０ ０ ０ − １ ８． ０
０ ０ ’ｌ ル） ンＦ： ｊｉ′ｉ− −−− ノ
ヒークをボし、また等電点電気泳動（ Ｓｗｅｄｅｎ
ファルマノア相製、１１３１＝； ３ ０ ０ ０
）しこよる分析ではｐ１７．８〜８．０ ＋ ７．０
＋ ６．５をノ」くす成分を含んでいた。さらに、Ｓｔ
）Ｓ−ＰＡＧＥ 電気泳動（ Ｓｗｅｄｅｎ ファ
ルト−フンアン１：ｉ！Ｊ， ＧＥ−４ １１ ））こ
よる分４フｉては１４．０００と１ ６． Ｏ Ｏ Ｏ
ダルトンな中心した多成分からなることを示し、分子溝
２ ５、 ０ ０ ０ダルトン以上の夾竹タンパク質は
含んでいなかった。
ｆ−ｚ ｌ・クラフィー（セファデックスＧ１００）て
分子ｉｉＬ＋ ５． ０ ０ ０ − １ ８． ０
０ ０ ’ｌ ル） ンＦ： ｊｉ′ｉ− −−− ノ
ヒークをボし、また等電点電気泳動（ Ｓｗｅｄｅｎ
ファルマノア相製、１１３１＝； ３ ０ ０ ０
）しこよる分析ではｐ１７．８〜８．０ ＋ ７．０
＋ ６．５をノ」くす成分を含んでいた。さらに、Ｓｔ
）Ｓ−ＰＡＧＥ 電気泳動（ Ｓｗｅｄｅｎ ファ
ルト−フンアン１：ｉ！Ｊ， ＧＥ−４ １１ ））こ
よる分４フｉては１４．０００と１ ６． Ｏ Ｏ Ｏ
ダルトンな中心した多成分からなることを示し、分子溝
２ ５、 ０ ０ ０ダルトン以上の夾竹タンパク質は
含んでいなかった。
精製の結果は表１１３示した。
表 １
表ＩＶこおいて、蛋白濃度はＢｉｏｒａｃｌ 社製の
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｙｅ Ｋｉｔを用いイ決定したもの
てあり、また精製度は、培養上清の比活性で各精製段階
のＩＬ−２の溶液の比活性を除した値である。
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｙｅ Ｋｉｔを用いイ決定したもの
てあり、また精製度は、培養上清の比活性で各精製段階
のＩＬ−２の溶液の比活性を除した値である。
実施例２
コンカナ・・す／Ａて刺激したＪｕｒｋａｔＸ細胞から
産生さねたｌ Ｌ−２水溶ｉ＆（蛋白濃度０．１７ｍ９
／ゴ、比活１’ｌ ２ ６ ０ ｕｎｉｔ ７ｍｇ）
２ ３ ０ ｍｌを８ｍＭのリン酸第−・カリウムと水
酸化ナトリウムてｐ Ｈ７、２Ｖこ調整し、実施例１て
用いたと同じ多孔質カラスピースを充填したカラノー
（ １ ６ｍｍＸ ３ ５ｍｍ、ベッド体積７ ｍｌ
） ｋこ通液しヒトｌ ＋− − ２を吸着させた。な
お、カラムレ゛よ０．０ ２ Ｍのリン酸緩？４［ｊ液
（ ｐＨ ７．２ ）で平衡化しておいたもの。
産生さねたｌ Ｌ−２水溶ｉ＆（蛋白濃度０．１７ｍ９
／ゴ、比活１’ｌ ２ ６ ０ ｕｎｉｔ ７ｍｇ）
２ ３ ０ ｍｌを８ｍＭのリン酸第−・カリウムと水
酸化ナトリウムてｐ Ｈ７、２Ｖこ調整し、実施例１て
用いたと同じ多孔質カラスピースを充填したカラノー
（ １ ６ｍｍＸ ３ ５ｍｍ、ベッド体積７ ｍｌ
） ｋこ通液しヒトｌ ＋− − ２を吸着させた。な
お、カラムレ゛よ０．０ ２ Ｍのリン酸緩？４［ｊ液
（ ｐＨ ７．２ ）で平衡化しておいたもの。
Ｉ Ｌ − ２を吸着させた後、０．０ ２ Ｍ リン
酸緩衝液（ ｐＨ ７．２ ）を５０ｍｅ通液し、その
後、０．２ Ｍ塩化すトリウムを含んたグリノン−塩酸
緩向液（ ｐＨ ２．１ ） ５ ０ｍｇで吸着したｌ
Ｌ−２を溶固（させた。
酸緩衝液（ ｐＨ ７．２ ）を５０ｍｅ通液し、その
後、０．２ Ｍ塩化すトリウムを含んたグリノン−塩酸
緩向液（ ｐＨ ２．１ ） ５ ０ｍｇで吸着したｌ
Ｌ−２を溶固（させた。
精製度１９倍、回収率６０係、比活性２５００ｕｎ ｉ
ｔ １ｍｇ。
ｔ １ｍｇ。
実施例３
実施例１で用いたヒトＩＩ、−２産生培養液と同様にし
て得らねたヒｌ− ］ Ｌ − ２産生培養液２１５ｍ
ｌ （蛋白濃度０．６ ８ ｍｇ／ ｍｅ 、比活性３
６ ２ ｕｎｉｔ／−１ ３ − ｍｙ ）を実施例２て用いたと同じ多孔質ノＪラスヒー
ズを充填したカラム（サイズ、ベット゛体積、平価化も
同実施例ｅこ同じ。）１３通液し、１１。−２を吸着さ
せ、０．０ ２ Ｍリン酸緩衝液（ ｐＨ ７．２ ）
５ ０ｍｇて洗浄後、０．１ Ｍ ＋・リス−酢酸緩
衝液（ｐＨ８、０）５０＋＋＋ｌて更に洗浄し、樹脂１
こ吸着した夾４”１１蛋白の一部を溶出させた。
て得らねたヒｌ− ］ Ｌ − ２産生培養液２１５ｍ
ｌ （蛋白濃度０．６ ８ ｍｇ／ ｍｅ 、比活性３
６ ２ ｕｎｉｔ／−１ ３ − ｍｙ ）を実施例２て用いたと同じ多孔質ノＪラスヒー
ズを充填したカラム（サイズ、ベット゛体積、平価化も
同実施例ｅこ同じ。）１３通液し、１１。−２を吸着さ
せ、０．０ ２ Ｍリン酸緩衝液（ ｐＨ ７．２ ）
５ ０ｍｇて洗浄後、０．１ Ｍ ＋・リス−酢酸緩
衝液（ｐＨ８、０）５０＋＋＋ｌて更に洗浄し、樹脂１
こ吸着した夾４”１１蛋白の一部を溶出させた。
次ｔこ０．Ｉ Ｍ ｌ−リスー酢酸緩征■液（ ｐＨ
８．０ ）ｒこ０、７ ５ Ｍのチオンアン酸カリウム
を加えた溶出液３０ｍｌてｌ ｌ− − ２を溶離させ
た。
８．０ ）ｒこ０、７ ５ Ｍのチオンアン酸カリウム
を加えた溶出液３０ｍｌてｌ ｌ− − ２を溶離させ
た。
精製度１４倍、回収率８０％、比活性１５５０ｕｎｉｔ
／ｍＷ。
／ｍＷ。
実施例４
人血液中のＴ Ｉ）ツバ球より産生させたヒｌ− １
１−２溶液（ベセスク・リザーチ・ラボラドリース社製
、蛋白濃度０．８２■／ ｍｅ、比活性１２２ｕｎｉｔ
／ｍｇ） ５ ０ ０ ｍｌを０．０ ２ Ｍリン酸緩
衝液（ ｐ）＋ ７．２ ）で平衡化させた多孔質ツノ
ラスピースのカラム（＋６ｍΦＸ７５ｍｍ：ペソＦ体Ｗ
４＋５ｍｅ）− １ ４ − １こ通液し、ヒトＩＬ−２を吸着させ、０．０２ Ｍυ
ノ酸緩衝ｉ＆（ｐＨ７，２） Ｉ ＯＯｍｅて洸浄し、
更にθ、１Ｍ＋−リスー酢酸緩衝液（ｐＨ８，０）１０
Ｏｍｅて洗浄［−た６３ その後、 ０．７５ Ｍチオ／アン酸）Ｊ ｊＪウム
を含んたＯ、ＩＭｌ−ＩＪスス−酸緩衝液５０ｒｎ／！
を溶出液としてヒトＩ Ｌ −２を溶離させる。
１−２溶液（ベセスク・リザーチ・ラボラドリース社製
、蛋白濃度０．８２■／ ｍｅ、比活性１２２ｕｎｉｔ
／ｍｇ） ５ ０ ０ ｍｌを０．０ ２ Ｍリン酸緩
衝液（ ｐ）＋ ７．２ ）で平衡化させた多孔質ツノ
ラスピースのカラム（＋６ｍΦＸ７５ｍｍ：ペソＦ体Ｗ
４＋５ｍｅ）− １ ４ − １こ通液し、ヒトＩＬ−２を吸着させ、０．０２ Ｍυ
ノ酸緩衝ｉ＆（ｐＨ７，２） Ｉ ＯＯｍｅて洸浄し、
更にθ、１Ｍ＋−リスー酢酸緩衝液（ｐＨ８，０）１０
Ｏｍｅて洗浄［−た６３ その後、 ０．７５ Ｍチオ／アン酸）Ｊ ｊＪウム
を含んたＯ、ＩＭｌ−ＩＪスス−酸緩衝液５０ｒｎ／！
を溶出液としてヒトＩ Ｌ −２を溶離させる。
精製助１３．５倍、回収率５５９ｂ。
実施例５
市販の→ノールｌ Ｌ −２溶液（株式会拐１−１本抗
体研究所製Ｉ ＴＣＧＦ−Ｍｌ １、蛋白濃度０５２
ｍ！／／ ｍｅ 、比活性２５０ｕ旧＋７ｍｌ！ ）
１７５ ｍｌを、実施例２て述べた方法で平衡化させた
多孔質カラスビーズのカラム（＋６陥ΦＸ４（１ｍｍ％
ヘノｉ・体積８ ｍｌ ） ｋこ通液し、４ノルｌ
＋−−２を吸着させ、つついて０．０２ Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７，２） ５ Ｏｍｅで洗浄した。
体研究所製Ｉ ＴＣＧＦ−Ｍｌ １、蛋白濃度０５２
ｍ！／／ ｍｅ 、比活性２５０ｕ旧＋７ｍｌ！ ）
１７５ ｍｌを、実施例２て述べた方法で平衡化させた
多孔質カラスビーズのカラム（＋６陥ΦＸ４（１ｍｍ％
ヘノｉ・体積８ ｍｌ ） ｋこ通液し、４ノルｌ
＋−−２を吸着させ、つついて０．０２ Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７，２） ５ Ｏｍｅで洗浄した。
次ｆｌ ２．ＯＭ ＮａＣ１を含んだ０．１Ｍ＋−リス
−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）ｔこ、エチレ／グリコール
を３３チまで力１１えた溶出液４０ｍ１を用いて、ザル
ＩＬ−２を溶離させた。
−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）ｔこ、エチレ／グリコール
を３３チまで力１１えた溶出液４０ｍ１を用いて、ザル
ＩＬ−２を溶離させた。
精製度８８倍、回収率９０％。
実施例６
市販のマウス＋Ｌ−２溶液（ヘセスタリ＠Ｊ−チラホラ
トリーズ製、蛋白濃度０．７８ｍｇ／ｍｅ、比活性１２
Ｂ ｕｎｉｔ／ｍｊ７ ） ２５ Ｏｍｅを実施（夕
１１２で述べた方法で平衡化させた多孔質ガラスヒース
のカラム（１６扉Φ×４０肝、ベッド体積８ ｍｅ ）
Ｙこ通液し、マウスｌ Ｌ −２を吸着させ、つづい
て０．０２Ｍ’Ｊン酸緩衝液（ｐｉ１７．２ ） ５
Ｏｍｅて洗浄した。
トリーズ製、蛋白濃度０．７８ｍｇ／ｍｅ、比活性１２
Ｂ ｕｎｉｔ／ｍｊ７ ） ２５ Ｏｍｅを実施（夕
１１２で述べた方法で平衡化させた多孔質ガラスヒース
のカラム（１６扉Φ×４０肝、ベッド体積８ ｍｅ ）
Ｙこ通液し、マウスｌ Ｌ −２を吸着させ、つづい
て０．０２Ｍ’Ｊン酸緩衝液（ｐｉ１７．２ ） ５
Ｏｍｅて洗浄した。
次ｅこ、０．５ Ｍ ＮａＣｌを含んだ０．１Ｍグリン
ンーＨχ 塩酸バッファー（ｐｌ（２，２） ４ Ｏｍｅを溶離液
として通液し、マウスＩＬ−２を溶離させた。
ンーＨχ 塩酸バッファー（ｐｌ（２，２） ４ Ｏｍｅを溶離液
として通液し、マウスＩＬ−２を溶離させた。
精製度１７゜５倍、回収率７５％。
実施例７
実施例１で用いた培養液と同様にこＩ〜で得られた培養
液１，０００ ｍｅ （蛋白濃度０．５４ｍｇ／ｍｅ、
比活１１−４５０ ｕ旧ｔ ／ｍｙ ） ｒこ固彩硫安
５９６７を加え、飽和硫安濃度の８５％ｌこしてヒトＩ
Ｌ−２を含む蛋白質を沈澱させた。その他遠心分１ｍｆ
（６，０００ｒｐｍ ３０分間）＋こよって分外した蛋
白を、０．０１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）４
０ｍｅｌこ溶解した。このＩＩ、−２溶液を透析チュー
ブ（５ｐｅｃ ｔｒｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ １ｎ
ｄｕｓｔｉｒｅｓ ｉｌＨ製５ｐｅｃｔｒａｐｏｒ３
）中ｔこ入れ、０．０１ Ｍ ＋リスー塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，６） ３ を中で１晩透析し、イオン強度、ｐ
Ｈを調整した。
液１，０００ ｍｅ （蛋白濃度０．５４ｍｇ／ｍｅ、
比活１１−４５０ ｕ旧ｔ ／ｍｙ ） ｒこ固彩硫安
５９６７を加え、飽和硫安濃度の８５％ｌこしてヒトＩ
Ｌ−２を含む蛋白質を沈澱させた。その他遠心分１ｍｆ
（６，０００ｒｐｍ ３０分間）＋こよって分外した蛋
白を、０．０１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）４
０ｍｅｌこ溶解した。このＩＩ、−２溶液を透析チュー
ブ（５ｐｅｃ ｔｒｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ １ｎ
ｄｕｓｔｉｒｅｓ ｉｌＨ製５ｐｅｃｔｒａｐｏｒ３
）中ｔこ入れ、０．０１ Ｍ ＋リスー塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，６） ３ を中で１晩透析し、イオン強度、ｐ
Ｈを調整した。
得られた液を同じ緩衝液で平衡化させたＤＥＡＥ−セフ
ァローズｃＬ−６Ｂ（ファルマノア社製）のカラム（カ
ラムサイズ１６咽ΦＸｌ７５ｍｍ、ベッド体積３５ｒｎ
ｔ）ｔこ流速＋５ｍｅ１時で通液し、ヒトＩＬ−２を吸
着させた。その後−Ｆ記の同じ緩衝液て洗浄した後、０
．０６ Ｍ ＋・’）スー塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）
ｌ ＯＯｗｌてヒトＩＬ−２を溶離させた。
ァローズｃＬ−６Ｂ（ファルマノア社製）のカラム（カ
ラムサイズ１６咽ΦＸｌ７５ｍｍ、ベッド体積３５ｒｎ
ｔ）ｔこ流速＋５ｍｅ１時で通液し、ヒトＩＬ−２を吸
着させた。その後−Ｆ記の同じ緩衝液て洗浄した後、０
．０６ Ｍ ＋・’）スー塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）
ｌ ＯＯｗｌてヒトＩＬ−２を溶離させた。
精製度３５倍、回収率４５％。
以十ノようＥこまず第１王程としてイオン交換り−１７
− ロマトグラフイー処理ｔこイ・１して得られた粗精製ヒ
トｌ Ｌ −２溶液１こ塩化すトリウム２．３３９を加
えＮａＣ１濃度を０．４ Ｍとした溶液１００＋＋＋ｇ
を０．４ ＭＮａＣｌ を含む０．０６ Ｍ ）リス塩
酸緩衝液（ｐ ＋−＋７．６）て平衡化させた実施例１
で述へた多孔質カラスビーズのカラム（＋０．ΦＸ２６
ｇ１Ｘ２６ｇ１ペフｍｌ ） ｔこ通液した。通液後、
０．４ Ｍ ＮａＣｌを含む０．０６ Ｍ ｌ−リス−
塩酸緩衝液（Ｉ）Ｈ７，６）１５＋ｕＪて洗浄し、更１
こ０．７ Ｍ ＮａＣｌを含む００６Ｍ ＋−リス−塩
酸緩衝液（ｐＨ７，６） ｌＯｍｅて洗浄した。
− ロマトグラフイー処理ｔこイ・１して得られた粗精製ヒ
トｌ Ｌ −２溶液１こ塩化すトリウム２．３３９を加
えＮａＣ１濃度を０．４ Ｍとした溶液１００＋＋＋ｇ
を０．４ ＭＮａＣｌ を含む０．０６ Ｍ ）リス塩
酸緩衝液（ｐ ＋−＋７．６）て平衡化させた実施例１
で述へた多孔質カラスビーズのカラム（＋０．ΦＸ２６
ｇ１Ｘ２６ｇ１ペフｍｌ ） ｔこ通液した。通液後、
０．４ Ｍ ＮａＣｌを含む０．０６ Ｍ ｌ−リス−
塩酸緩衝液（Ｉ）Ｈ７，６）１５＋ｕＪて洗浄し、更１
こ０．７ Ｍ ＮａＣｌを含む００６Ｍ ＋−リス−塩
酸緩衝液（ｐＨ７，６） ｌＯｍｅて洗浄した。
その後、１．５ Ｍ ＮａＣｌを含むＯ，１Ｍｌ□リス
ー塩酸緩衝液（ｐｉ−１８，０）Ｆこ３０％グリセリン
を加えた溶離液］ Ｏｍｅでヒトインターロイキン−２
を溶出させた。
ー塩酸緩衝液（ｐｉ−１８，０）Ｆこ３０％グリセリン
を加えた溶離液］ Ｏｍｅでヒトインターロイキン−２
を溶出させた。
第２工程１こおける精製度９．５倍、回収率７５係、第
１、第２王程ｅこよる精製は、精製度３３２．５、回収
率３３％。
１、第２王程ｅこよる精製は、精製度３３２．５、回収
率３３％。
−１８−
図１は、ＣＰＣ；カラ１１クロマトクラフィーｅこよる
溶出曲線で、実線は溶削液の２８０ ｎｍ ｆこおける
吸光率、点線は溶離液のＩＩ−−２？；占性を示す。 図２は、ゲル接遇カラムクロ′２トゲラフイーの溶出曲
線で、実線は溶削液の２８０ｎｒｎｔこおける吸光度、
点線は溶ｎ液のｌ Ｌ −２活性を示す。なお、ｌフラ
クションはＩｌ、５ｍ／である。 特１１出願人 味の素株式会社 −１９＝
溶出曲線で、実線は溶削液の２８０ ｎｍ ｆこおける
吸光率、点線は溶離液のＩＩ−−２？；占性を示す。 図２は、ゲル接遇カラムクロ′２トゲラフイーの溶出曲
線で、実線は溶削液の２８０ｎｒｎｔこおける吸光度、
点線は溶ｎ液のｌ Ｌ −２活性を示す。なお、ｌフラ
クションはＩｌ、５ｍ／である。 特１１出願人 味の素株式会社 −１９＝
Claims (1)
- （１） イノクーロイキ／・２を含む溶液を多孔質カ
ラスヒーズｔこ接触させてインターロイギ／２をこれに
吸ｒ、させ、ついて溶出液で多孔″ｅ１カラスピースか
ら吸着したインク−■】・イキン２を脱離溶菌させろこ
とを’ｔ！ｉ徴とするインターロイキン２の精製法。 ＜・２） イノターロイギン２な含む溶液な多孔′員
カラスピース１こよるカラノ、り１コマトゲラフイー処
理とゲル岡過カラノ・クロマトグラフィー処理と１こイ
・１することな特徴とするインターロイギン２の精製法
、。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57043352A JPS58159420A (ja) | 1982-03-18 | 1982-03-18 | インタ−ロイキン２の精製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57043352A JPS58159420A (ja) | 1982-03-18 | 1982-03-18 | インタ−ロイキン２の精製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58159420A true JPS58159420A (ja) | 1983-09-21 |
Family
ID=12661455
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57043352A Pending JPS58159420A (ja) | 1982-03-18 | 1982-03-18 | インタ−ロイキン２の精製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58159420A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5970620A (ja) * | 1982-09-16 | 1984-04-21 | エフ・ホフマン―ラ ロシユ アーゲー | 均質なヒトインタ−ロイキン２及びその製造方法 |
| JPH07233082A (ja) * | 1983-12-23 | 1995-09-05 | F Hoffmann La Roche Ag | 免疫学的疾患治療用医薬組成物 |
| JP2008202820A (ja) * | 2007-02-16 | 2008-09-04 | Yamaha Livingtec Corp | レンジフード |
| JP2018082715A (ja) * | 2013-05-06 | 2018-05-31 | 日立化成株式会社 | 標的分子を捕捉するためのデバイス及び方法 |
| US11028443B2 (en) | 2015-08-31 | 2021-06-08 | Showa Denko Materials Co., Ltd. | Molecular methods for assessing urothelial disease |
-
1982
- 1982-03-18 JP JP57043352A patent/JPS58159420A/ja active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5970620A (ja) * | 1982-09-16 | 1984-04-21 | エフ・ホフマン―ラ ロシユ アーゲー | 均質なヒトインタ−ロイキン２及びその製造方法 |
| JPH0244480B2 (ja) * | 1982-09-16 | 1990-10-04 | Efu Hofuman Ra Roshu Unto Co Ag | |
| JPH07233082A (ja) * | 1983-12-23 | 1995-09-05 | F Hoffmann La Roche Ag | 免疫学的疾患治療用医薬組成物 |
| JP2008202820A (ja) * | 2007-02-16 | 2008-09-04 | Yamaha Livingtec Corp | レンジフード |
| JP2018082715A (ja) * | 2013-05-06 | 2018-05-31 | 日立化成株式会社 | 標的分子を捕捉するためのデバイス及び方法 |
| US10697001B2 (en) | 2013-05-06 | 2020-06-30 | Hitachi Chemical Co., Ltd. | Devices and methods for capturing target molecules |
| US11028443B2 (en) | 2015-08-31 | 2021-06-08 | Showa Denko Materials Co., Ltd. | Molecular methods for assessing urothelial disease |
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