JPH0244480B2 - - Google Patents

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JPH0244480B2
JPH0244480B2 JP58168492A JP16849283A JPH0244480B2 JP H0244480 B2 JPH0244480 B2 JP H0244480B2 JP 58168492 A JP58168492 A JP 58168492A JP 16849283 A JP16849283 A JP 16849283A JP H0244480 B2 JPH0244480 B2 JP H0244480B2
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F Hoffmann La Roche AG
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Description

【発明の詳細な説明】 インターロイキン２（IL―２）は、リンパ球の
反応性をモジユレートすることができる可溶性蛋
白質であつて、従来は、マウス、ラツト又はヒト
のリンパ球細胞を、たとえば植物凝集素（PHA）
及びコンカナバリンＡ（Con Ａ）のような分裂促
進剤によつて刺激することにより製造されてい
る；たとえばギリス（Gillis）ら〔Nature268，
154（1977）；J.Immunol.120，2027（1978）；ibid.
124，1954（1980）；ibid.125，2570（1980）〕参照。 マウス、ラツト及びヒトの正常なＴ―リンパ球
から精製したIL―２は、(1)胸腺細胞有糸分裂誘
発の顕著な増進；(2)抗原特異性ヘルパー又はキラ
―Ｔ細胞系列の長期試験管内増殖の助長；及び(3)
ヌードマウス脾臓細胞の培養物中の細胞毒性Ｔリ
ンパ球（CTL）反応性及びプラク（plaque）形
成性細胞応答の誘発、を包含する種々のタイプの
生物学的活性を持続することが認められている。
それ故、IL―２のこれらの確認された生物学的
活性は、IL―２が免疫応答を高め且つ免疫欠損
Ｔ細胞母集団（ヌードマウス脾臓細胞）を細胞及
び体液性免疫の正常な水準まで回復させるために
有用であることを示している。その上、これらの
結果はIL―２生産及び応答が迷入性免疫の臨床
的な診断において有用と思われる免疫学的機能の
重要なパラメータであることを示唆している。更
にまた、ヒトIL―２が抗原特異性ヒト、マウス
及びラツトキラーＴ細胞の試験管内増殖を可能と
するという事実は、研究試薬としてのヒトIL―
２の重要性を強調するものである。 しかしながら、レクチン刺激したヒトの脾臓及
び末梢血液リンパ球調整培地からのヒトIL―２
の生産は多くの著者によつて報告されているけれ
ども、これらの生産源及び方法は低濃度のIL―
２を与え、きわめて僅かな量のヒトIL―２活性
しか取得できないために、IL―２を含有する大
量の調整培地の分別を伴なうIL―２の精製を必
要とする。その結果として、生体内実験のため又
は最終的な分子のキヤラクタリゼーシヨンを有効
に研究するために十分な量の濃縮したヒトIL―
２を入手することはできなかつた。Gillis及び
Watson〔J.Exp.Med.152，1709〜19（1980）〕は、
場合によつてはたとえばフオルボル（phorbol）
ミリスチン酸アセテート（PMA）のようなフオ
ルボルエステルの存在における、たとえばPHA
のようなＴ細胞分裂促進剤による、たとえば
Jurkat―FHCRC系列のような悪性腫瘍細胞系列
の誘発によるヒトIL―２の生産を報告している。
IL―２の部分的な精製は、硫酸アンモニウム沈
殿／透析、ゲル過クロマトグラフイ
（Sephadex Ｇ―100）、イオン交換クロマトグラ
フイー（DEAEセルロース）；平床等電集束法及
び分析的ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（SDS―PAGE）を包含する方
法によつて行なわれた。IL―２の生物学的活性
の大部分は、約14000ドルトンの分子量を有する
蛋白質帯（ゲル上に認められる９〜16の分離帯の
中の一つ）から電気泳動的に溶離された。相当す
る開示については、Frank et al.，J.Immunol.
127，2361（1981）、及びWatson et al.，
Lymphokines６，95（1982）をも参照すべきであ
る。 Mier及びGallo〔J.Immunol.128，1122（1982）；
Lymphokines６，137（1982）〕は、反復的な陰イ
オン交換クロマトグラフイーとゲル濾過操作後の
最後の段階としてのプレパラテイブSDSゲル電気
泳動を用いる“ほとんど均質な物質”を与えるた
めの、正常なリンパ球からのIL―２の精製につ
いて報告している。彼らの製品は、SDS―PAGE
において13000、ゲル過において20〜25000の分
子量と6.8の等電点を有していた。この物質は−
70℃においてすらきわめて不安定であつて、活性
を持続するためにはウシの血清アルブミン
（BSA）又はポリエチレングリコールの添加を必
要とした。 StadlerとOppenheim〔Lymphokies６，117
（1982）〕は末梢血液単核細胞、扁桃線及び脾臓細
胞から精製したIL―２について報告しているが、
これはカラムクロマトグラフイー、ゲル過及び
電気集束後に電荷の不均一性を示した。6.5，7.2
及び8.2のpIを有する３荷電種が認められたが、
この不均一性は恐らくはグリコシル化の程度の相
異に基づくものと考えられた。 最後に、Robb及びSmith〔Mol.Immunol.18，
1087〜94（1981）〕はヒトのＴ―白血病細胞系列ジ
ヤーカツト（JURKAT）からTCGF（＝IL―２）
を単離したが、これは電荷と大きさが均一であつ
た。同じ結果はRobbらによつてJ.Exp.Med.184，
1455〜74（1981）においても報告されている。 本発明は、多重逆相高性能液体クロマトグラフ
イー（HPLC）処理を用いて均質に精製される誘
発したヒトの悪性細胞から誘導したヒトIL―２
に関する。 すなわち、本願発明は、 (1) 均質な状態であり、 (2) Ａ 粗製のヒトインターロイキン２の溶液を
シリカゲルに共有結合したメチル又はオクチ
ル基を含有する逆相高性能カラム中に通し、
それによつて該ヒトインターロイキン２を該
カラムにより保持させ、該カラムをHPLC条
件下に緩衝したｎ―プロパノール０〜60％
（容量／容量）傾斜展開液によつて溶離しそ
してヒトインターロイキン２活性を示す画分
を集める工程と、 Ｂ 上記工程Ａ）からの集めた活性画分をシリ
カゲルに共有結合したジフエニル基を含有す
る逆相高性能カラム中に通し、それによつて
該ヒトインターロイキン２を該カラムによつ
て保持させ、該カラムをHPLC条件下に緩衝
したｎ―プロパノール20〜60％（容量／容
量）傾斜展開液によつて溶離しそしてヒトイ
ンターロイキン２活性を示す画分を集める工
程 の組合わせからなる方法により得ることができる
ものであり、 (3) 逆相HPLCにおいてインターロイキン２活性
に一致する特性ピークを示し、 (4) SDS―PAGE電気泳動において単一のバンド
を示し、そして (5) 二次元ゲル電気泳動において単一のスポツト
を示す ことを特徴とするＴもしくはＢ細胞系列、Ｔリン
パ腫細胞系列または末梢血液リンパ球から誘導さ
れる材料から得ることができるヒトインターロイ
キン２活性物質を提供するものである。 なお、本発明において、上記工程Ａ）とＢ）の
組合わせからなる方法により得ることができるも
のという表現は、必ずしも該方法によつて製造さ
れるもののみに限定されず、均質な状態であり且
つ上記(3)，(4)及び(5)に示す性状のヒトインターロ
イキン２活性物質を与える限り、他の如何なる方
法によつて得られたものをも包含するものであ
る。 かくして、本発明のヒトインターロイキン２活
性物質は、本発明書に具体的に記載された方法に
よつて製造された均質なヒトインターロイキン２
活性物質に限定されるものではなく、他の如何な
る適当な方法によつて製造される如何なる起源か
らの均質なヒトインターロイキン２活性物質をも
包含するものである。 本発明の均質なIL―２製品を製造するために
使用しうる方法は、粗製のIL―２調製物を逆相
メチル又はオクチル結合シリカHPLCカラム中に
通じ、緩衝液中のｎ―プロパノール傾斜展開液
（gradient）を用いて蛋白質を溶出し且つプール
した活性画分を逆相ジフエニル結合シリカHPLC
カラム中に通じることから成る。使用する粗製の
調製物が比較的低力価のものである場合には、均
質とする精製を達成するために１回以上のHPLC
段階を繰返す必要があるかも知れない。 粗製のIL―２調製物は、たとえば、ヒトの白
血病及びリンパ腫細胞のような悪性のヒトの腫瘍
細胞を、試験管内で、種々の添加剤で補つた血清
含有培地中で培養することによつて容易に調製す
ることができる。培養物を、たとえばPHAのよ
うなＴ細胞分裂促進剤によつて刺激し、それによ
つてIL―２を含有する上澄液を生ぜしめる。培
養後一定時間、すなわち約24時間ののちに、上澄
液を集めて更に濃縮した状態とするためにIL―
２を精製する。たとえばPMAのようなフオルボ
ルエステルを、単独で又はたとえばPHAあるい
はコンＡ（ConA）のようなＴ細胞分裂促進剤と
組合わせて、誘発剤として使用することにより、
IL―２の生産を増進することもまた望ましいこ
とである。これ以上の詳細についてはGillis et
al.，J.Exp.Med.152，1709（1980）を参照すると
よい。 粗製のヒトIL―２の生産において用いること
ができる細胞系列には各種のＴ及びＢ細胞系列並
びに各種のＴリンパ腫細胞系列が包含される。こ
れらの細胞系列は、自然発生、ウイルス感染の何
れかによつて、又は化学的発ガン物質によつて生
ぜしめる。そのために好適な細胞系列は、Gillis
らによつてJurkart―FHCRC白血病ヒトＴ細胞
系列として同定されており、H33HJ―JAIと命名
したこの系列のサブ―クローン（sub―clone）を
用いることがもつとも好ましい。本発明の方法は
末梢血液リンパ球から誘導されるIL―２の精製
に使用することもできる。 上記の細胞系列と組合わせて粗製のヒトIL―
２を製造するために用いられる培地は、たとえば
Dulbeccoの修飾Eagle培地、RPMI培地及び
Clickの培地のような、市販の培地から成るもの
とすることができる。単独で又は組合わせて培地
に添加することのできる添加剤には、ペニシリ
ン、ストレプトマシン、ゲンタマイシン、新鮮な
Ｌ―グルタミン、HEPES緩衝剤、NaHCO3、牛
の胎児の血清（FCS）又は正常なヒトの血清が包
含される。細胞の初期細胞密度は、特にJurkat
―FHCRC細胞を用いる場合には、５×105細
胞／ml〜１×107細胞／ml、もつとも好ましくは
約１×106細胞／mlの範囲にすべきである。 培養条件は約35〜38℃の範囲の温度、7.0〜7.4
の範囲のPH及び空気中の約５乃至10％の二酸化炭
素の、湿つた雰囲気である。0.5〜2.0容量％の範
囲、好ましくは１容量％のPHA分裂促進剤濃度
を用いるとよい。 悪性のヒト細胞を植物分裂促進剤によつて刺激
することによつて生産されるIL―２の量は時間
によつて異なる。IL―２の最高水準はPHAによ
る刺激後24時間に到達する。細胞培養物生産過程
をモニターするため又は精製過程をモニターする
ためのIL―２の分析には、Ｔ細胞系列増殖を誘
発するための試料の能力の評価が包含される。Ｔ
細胞増殖はトリチウム化チミジンの結合を測定す
ることによつて決定される。１単位の活性を、50
％の最高チミジン結合と誘発するＴ細胞培養中に
存在するμl数と定義する。この分析法についての
具体的詳細はGillis et al.，J.Immunol.120，
2027（1978）中に記載されている。 本発明のHPLC精製段階を遂行するための適当
な出発材料の調製は、収穫した誘発細胞を遠心分
離することによつて誘導したIL―２含有上澄液
を85％飽和までの硫酸アンモニウムの添加によつ
て沈殿させることを包含する。このような添加は
穏やかに撹拌しながら上澄液に乾燥した硫酸アン
モニウムを徐々に添加することによつて行なわれ
る。沈殿のための硫酸アンモニウムの添加は長時
間、たとえば12時間かけて行なう。85％飽和に達
したら、冷時の穏やかな撹拌を一定時間継続す
る。沈殿した蛋白質を遠心分離によつてペレツト
状とし、このペレツトを２回蒸留した無菌の水中
に再び懸濁させる。 一別法の局面において、再懸濁した粗製IL―
２をイオン交換クロマトグラフイーにかける。そ
のための適当なカラムはCM Biogel Ａ樹脂
（LKB―Produkter，Bromma，Sweden）であ
る。カラムはIL―２含有試料を加える前に樹脂
上の非特異性結合部位を封鎖するためにウシ胎児
血清溶液で前処理することが好ましい。カラムか
らの溶離は緩衝した塩傾斜展開液を用いて行なわ
れる。そのために適当な傾斜展開液は、PH5.5の
HEPES中の50mM〜0.5M NaClである。0.5M
NaCl―HEPES、PH5.5による最終洗浄は、全IL
―２活性の溶離を確実にするために用いることが
できる。 上記のイオン交換クロマトグラフイー段階から
集めた活性画分は、本発明の方法の局面を成す
HPLC処理のための好適出発材料を提供するもの
である。別の実施態様においては、硫酸アンモニ
ウム処理から十分に高い力価の上澄液を取得する
ことができる場合に、この材料を最初のHPLCカ
ラム工程で直接に使用することが可能である。し
かしながら、このような局面においては、生成物
IL―２における本質的な均質性を達成するため
に、１又は２回のHPLC処理を繰返すことが必要
であろう。 本発明の方法において使用するHPLC処理は、
少なくとも約150Åの細孔径を有する逆相メチル、
オクチル又はジフエニル結合シリカカラムを使用
する。本発明の実施において使用するために適す
る逆相HPLCカラムは市販製品である。そのため
に特に好適なものはWhatman Separations
Inc.，Clifton，N.J.，USAから市販されている
Protesil系列のカラムである。 かくして、たとえば、Whatman
Protesil300Methylは、８ミクロンの平均粒度に
分別してある300Å細孔径シリカゲルの表面に珪
素―酸素―珪素結合によつて共有結合したトリメ
チルシリル基から成るカラムである。同様に、
Whatman Protesil Magnum9Octylカラムは、
150Å細孔径シリカゲルに共有結合したオクチル
基を有しており、一方、Whatman Protesil
Diphenylカラムは、300Åシリカゲルの表面に共
有結合したジフエニル基を有している。 HPLCカラムからの蛋白質の溶離はこの分野で
公知の方式で行なうことができる。本発明の方法
の最初のHPLC処理において用いるメチル又はオ
クチルカラムからの結合蛋白質の除去のために適
する溶離手順は、水と混和性の低級アルカノー
ル、好ましくはｎ―プロパノールの次第に濃度の
増大する傾斜展開液の使用を包含する。そのため
の好適な傾斜展開液は、PH4.0のピリジン―酢酸
中の０〜60％容量／容量傾斜液である。 アルカノール傾斜展開液が20〜60％容量／容量
であることを除けば、第二段階で用いるジフエニ
ルカラムに関しても、類似の溶離条件を用いるこ
とができる。溶離した蛋白質は、この分野で公知
の検出系によつて、たとえば、Kenny et.al.，
Methods Enzymol78，435（1981）に記載された
自動化螢光検出装置を使用して具合良くモニター
することができる。 ２段階において又は低力価粗製物を用いる場合
には、第一及び／又は第二段階の一回以上の繰返
しによつてHPLC処理段階を遂行したのちに、単
一の対称的な生物活性ピークとしての均質性にま
で精製されたIL―２を良好な収率で取得するこ
とができる。 均質なIL―２を調製することができれば、こ
の分子のアミノ酸組成の決定が始めて可能とな
る。一方、この情報はアミノ酸配列の決定に帰因
するが、それもまた、ヒトIL―２遺伝子のクロ
ーニング及び臨床試験のため並びに究極的にこの
物質の広汎な医療使用のための大量の純粋な組換
えIL―２の最終的な生産を助けるために重要で
ある。その上、均質なIL―２の入手が可能とな
れば、誘発工程の間にIL―２と共に生じること
が知られている多くのリンホカイン種の混入の恐
れなしに、その活性についての正確な生物学的研
究が可能となる。従来から高度に精製した又はほ
とんど均質なIL―２調製品の製造が特許請求さ
れているけれども、SDS―PAGE分析的電気泳動
において単一バンドの材料であることが示された
材料をメチル又はオクチルカラムによる本発明の
HPLC工程における出発材料として用いるとき
は、バンドがIL―２の活性に関係することがな
い多数の蛋白質ピークに分割される。このような
観察に基づいて、このような調製物は10％以下の
純度であり、場合によつては１％未満の純度であ
ることすらあるものと思われる。 Jurkat―FHCRC細胞系列から誘導した部分的
に精製したIL―２調製物による試験によれば、
部分的に精製したリンホカインは、新鮮な末梢血
液リンパ球の増殖を生じさせないことを示した
が；予めレクチン又は特異性抗原によつて刺激し
たＴ―リンパ球集団における増殖は誘発する。そ
の上、部分的に精製したヒトIL―２はヒト抗原
特異性効果Ｔ―細胞のみならず、ネズミ抗原特異
性効果Ｔ細胞の増殖をも維持することが認められ
た。かくして、ジヤーカツト―FHCRC生産ヒト
IL―２は、部分的に精製したものすら、各種の
抗原及び効果器特異化を伴なうクローナルヒト及
びネズミＴ―細胞の増殖における使用に対して有
用であることが認められ、且つ実際に現在このよ
うな用途のための商業製品となつている。本発明
の均質IL―２は、いうまでもなく、同様な方法
で使用することができる。 本発明の方法及び製品を以下の実施例によつて
更に説明する。 実施例 IL―２生産 H33HJ―JAI細胞（ATCCNo.CRL―8163、
1982年８月26日寄託）、すなわち親Jurkat―
FHCRC細胞系列のクローン、を10％のウシ胎児
血清、50U／mlのペニシリン、50μｇ／mlのスト
レプトマイシン、50μｇ／mlのゲンタマイシン及
び300μｇ／mlの新鮮なＬ―グルタミンで補つた
RPMI1640培地中で、37℃で空気中の５％CO2の
湿らした雰囲気中で増殖させた。飽和密度におけ
る細胞（８〜10×105細胞／ml）を収穫し、遠心
分離し且つ血清は含有しないが50U／mlのペニシ
リン、50μｇ／mlのストレプトマイシン、50μ
ｇ／mlのゲンタマイシン及び300μｇ／mlの新鮮
なＬ―グルタミンを含有する新鮮なRPMI1640培
地中に再懸濁させた。細胞を２×106細胞／mlの
濃度に再懸濁して、容量で１％のPHAと10nｇ／
mlフオルボルミリスチン酸アセテート（PMA）
の添加によつて刺激した。空気中の５％CO2の湿
らした雰囲気中で37℃で24時間培養したのち、誘
発した細胞を収穫し、遠心分離し且つ上澄液を粗
出発材料として保存した。 それぞれ900ml、900ml及び1050ml、すなわち全
体で2850mlの上澄液から成る３細胞培養実験（実
験番号１〜３）から集めた上澄液、Gillis et al.，
J.Immunol，120，2027（1978）の分析によつて測
定するときに7.125×106単位の全活性を有する集
めた材料を、穏やかな撹拌と共に85％飽和までの
乾燥硫酸アンモニウムの段階的な添加によつて処
理した。沈殿のための硫酸アンモニウムの添加は
12時間にわたつて行なつた。溶液が85％飽和に達
したとき、穏やかな撹拌を４℃で更に24時間継続
した。上澄液中に存在する蛋白質を10000XGに
おける30分の遠心分離によつてペレツト状とし
た。上澄液を傾瀉して捨てた。ペレツトを２回蒸
留した無菌の水40mlに再懸濁すると、かくして得
られた溶液は205000U／mlのIL―２すなわち全体
で8.2×106単位を含有していた。 更に下記第１表に要約するような実験を行なつ
た。 【表】 CM Biogel Ａカラム上のイオン交換クロマト
グラフイー CM Biogel ＡをPH5.5の0.05M NaCl―
HEPES中で平衡化した。このカラム（100ml）
に流し入れ、次いで10％のFCSを含有する
0.005M NaCl―HEPES、PH5.5、100mlをカラム
に加えた。これはヒトIL―２活性を拘束するお
それのある非特異性結合部位を封鎖するために行
なつた。次いでカラムに結合した血清蛋白質を
500mlの0.5M NaCl―HEPES、PH5.5、の添加に
よつて溶出した。次いでカラムを1000mlの0.05M
NaClによつて再平衡化した。 前記のような実験１〜５を包含する硫酸アンモ
ニウム沈殿の合わせた再懸濁物をCMカラムに加
えた。次いでカラムを200mlの0.05M NaCl―
HEPES、PH5.5、で洗浄した。次いで、50mMか
ら0.5Mに至るNaCl―HEPES、PH5.5、500ml塩傾
斜展開液をカラムに加えた。傾斜液の添加後にカ
ラムを200mlの0.5M NaCl―HEPES、PH5.5、で
洗浄して全部の結合IL―２を実際にカラムから
確実に溶出した。それぞれ５mlの画分を取得し
た。３画分おきにIL―２活性について分析した。
ピーク活性を決定して活性画分を集めた。このよ
うにして983040U／mlの活性すなわち35.39×106
単位の全活性を有する36mlのプール液を得た。 上記のようにしてプールした実験６及び７から
の再懸濁した硫酸アンモニウムによる第二のCM
カラム実験は、215mlの容量、80000U／mlの活性
及び17.2×106単位の全活性を有するプールした
画分を与えた。この実験の130mlの部分を第一の
実験から由来する36mlと合わせて、調製時に分析
するとき全体で10.4×106単位を有する166mlの粗
製IL―２を得た。 オクチルカラムによる逆相HPLC 上記のようにして取得したロツトＡを、9.4×
250mm Protesil Magnum9Octylカラム
（Whatman Separations Inc.，Clifton，N.J.）
上に直接に送入した。次いでこのカラムを50mlの
0.9M酢酸／0.2Mピリジン、PH4.0緩衝液で洗浄し
た。蛋白質の溶離は0.9M酢酸／0.2MピリジンPH
４緩衝剤中でｎ―プロパノール０〜60％（容量／
容量）の傾斜展開液を用いて８時間行なつた。フ
ルオレスカミンを用いる自動化螢光検出装置によ
つてカラム流出液中の蛋白質をモニターした。生
物学的活性の回収は7.13×106単位（約70％）で
あつた。 ジフエニルカラムによる逆相HPLC オクチルカラムから取得した活性の主ピークを
含有する画分を集め、0.9M酢酸／0.2Mピリジ
ン、PH4.0、を用いて１：１（容量／容量）に希釈
したのち、4.6×250mm Whatman Protesil
Diphenylカラム上に送入した。0.9M酢酸／0.2M
ピリジン、PH4.0、緩衝剤中の20〜60％（容量／
容量）ｎ―プロパノール傾斜展開液を用いて6.5
時間にわたつて蛋白質を溶出した。この手順は
IL―２活性と一致する対称的ピークを与えた。
この段階における活性の回収率は60％を起えた。
この材料の本質的な均質性を分析用SDS―PAGE
電気泳動及び２次元ゲル電気泳動によつて確認し
たが、これらは、それぞれ、単一帯と単一のスポ
ツトを与えた。このようにして取得した均質なヒ
トIL―２は約1.4×109U／mgの比活性及び5.68の
pIという比活性を有していた。 この材料の試料をフルオレスカミン検出
（Stein et al.，Arch.Biochem.Biophys.155，203
〔1973〕参照）によつて行なうアミノ酸分析にか
けた。ポリペプチドを0.1％のチオグリコール酸
を含有する定常的に沸とうしているHCl中で104
℃において24及び48時間加水分解した。 【表】 分解
配列分析は、下記の内部部分的アミノ酸配列を
与えた： Ile―Leu―Asn―Gly―Ile―Asn―Asn―Tyr
―Lys―Asn―Pro―Lys―Leu―Thr この配列は、クローンcDNAから、Taniguchi
et al.，Nature302，305〜310（1983）によつて提
案された、推定的なヒトIL―２配列の44〜57位
と一致する。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ (1) 均質な状態であり、 (2) Ａ 粗製のヒトインターロイキン２の溶液を
    シリカゲルに共有結合したメチル又はオクチ
    ル基を含有する逆相高性能カラム中に通し、
    それによつて該ヒトインターロイキン２を該
    カラムにより保持させ、該カラムをHPLC条
    件下に緩衝したｎ―プロパノール０〜60％
    （容量／容量）傾斜展開液によつて溶離しそ
    してヒトインターロイキン２活性を示す画分
    を集める工程と、 Ｂ 上記工程Ａからの集めた活性画分をシリカ
    ゲルに共有結合したジフエニル基を含有する
    逆相高性能カラム中に通し、それによつて該
    ヒトインターロイキン２を該カラムによつて
    保持させ、該カラムをHPLC条件下に緩衝し
    たｎ―プロパノール20〜60％（容量／容量）
    傾斜展開液によつて溶離しそしてヒトインタ
    ーロイキン２活性を示す画分を集める工程 の組合わせからなる方法により得ることがで
    きるものであり、 (3) 逆相HPLCにおいてインターロイキン２活性
    に一致する特性ピークを示し、 (4) SDS―PAGE電気泳動において単一のバンド
    を示し、そして (5) 二次元ゲル電気泳動において単一のスポツト
    を示す ことを特徴とするＴもしくはＢ細胞系列、Ｔリン
    パ腫細胞系列または末梢血液リンパ球から誘導さ
    れる材料から得ることができるヒトインターロイ
    キン２活性物質。 ２ Ａ 粗製のヒトインターロイキン２の溶液を
    シリカゲルに共有結合したメチル又はオクチル
    基を含有する逆相高性能カラム中に通し、それ
    によつて該ヒトインターロイキン２を該カラム
    により保持させ、該カラムをHPLC条件下に緩
    衝したｎ―プロパノール０〜60％（容量／容
    量）傾斜展開液によつて溶離しそしてヒトイン
    ターロイキン２活性を示す画分を集める工程
    と、 Ｂ 上記工程Ａからの集めた活性画分をシリカゲ
    ルに共有結合したジフエニル基を含有する逆相
    高性能カラム中に通し、それによつて該ヒトイ
    ンターロイキン２を該カラムによつて保持さ
    せ、該カラムをHPLC条件下に緩衝したｎ―プ
    ロパノール20〜60％（容量／容量）傾斜展開液
    によつて溶離しそしてヒトインターロイキン２
    活性を示す画分を集める工程 の組合わせからなることを特徴とする。 (a) 均質な状態であり、 (b) 逆相HPLCにおいてインターロイキン２活
    性に一致する特性ピークを示し、 (c) SDS―PAGE電気泳動において単一のバン
    ドを示し、そして (d) 二次元ゲル電気泳動において単一のスポツ
    トを示す ＴもしくはＢ細胞系列、Ｔリンパ腫細胞系列ま
    たは末梢血液リンパ球から誘導される材料から得
    ることができるヒトインターロイキン２活性物質
    の製造方法。 ３ 工程Ａにおけるカラムがオクチルカラムであ
    る特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４ オクチルカラム中のシリカゲルが約150Åの
    細孔径を有し、且つジフエニルカラム中のシリカ
    ゲルが約300Åの細孔径を有する特許請求の範囲
    第３項記載の方法。 ５ 工程Ａ及びＢにおける緩衝液が0.9M酢酸／
    0.2Mピリジン、PH4.0である特許請求の範囲第４
    項記載の方法。 ６ 粗製のヒトインターロイキン２が、誘発し培
    養したヒトの悪性細胞から誘導される材料から得
    られる特許請求の範囲第２項記載の方法。
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