JPH0361440B2

JPH0361440B2 -

Info

Publication number: JPH0361440B2
Application number: JP56188898A
Authority: JP
Inventors: Ikuo Ueda; Joji Notani; Choji Yamada; Akira Nagayoshi; Shizuka Arakawa
Original assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1981-11-24
Filing date: 1981-11-24
Publication date: 1991-09-19
Also published as: JPS5889196A

Description

【発明の詳細な説明】この発明はインターフエロンの新規な精製法に
関するものである。

この発明者等はインターフエロンの精製法につ
いて種々研究の結果、高収率で高純度のインター
フエロンの精製法を見い出し、さらに鋭意研究の
結果、この発明を完成した。

この発明の方法は、インターフエロンを酸エタ
ノール分別沈でん法で精製する操作において、イ
ンターフエロン水溶液を、約PH3.5のチオシアン
酸カリウム・エタノール溶液に加え、インターフ
エロンのチオシアン酸カリウム・エタノール溶液
を得ることを特徴とするインターフエロンの精製
法である。

好ましくは、粗製インターフエロン水溶液を強
酸性陽イオン交換体で処理し、次いで、得られた
インターフエロン含有分画にトリクロル酢酸を加
え、次いで得られた沈でんをアルカリ水に溶解
し、透析後、透析内液をチオシアン酸カリウム塩
析に付し、次いで、得られた沈でんをアルカリ水
に溶解し、ゲル過後が、得られたインターフエ
ロン含有分画を限外過に付し、次いで得られた
限外過残留液を多孔性ガラス粒子に接触させ、
次いで多孔性ガラス粒子に吸着したインターフエ
ロンをチオシアン酸カリウム溶液で溶出し、次い
で得られたインターフエロン含有分画を弱酸性に
調整し、生ずる沈でんをアルカリ水に溶解し、ゲ
ル過後、得られたインターフエロン含有分画を
限外過に付し、次いで得られた限外過残留液
を前記の酸エタノール分別沈でん法に付し、得ら
れたインターフエロン含有分画を透析することか
らなるインターフエロンの精製法である。

この発明の精製法の対象である粗製インターフ
エロン水溶液としては、例えば白血球、リンパ芽
球様細胞、その他の樹立株細胞系等のヒトインタ
ーフエロン産生細胞の培養液、マウスインターフ
エロン産生細胞の培養液、マウスインターフエロ
ン産生臓器のホモジネート、インターフエロン産
生能を付与された微生物の培養液などの他、これ
らから部分精製したインターフエロン含有水溶液
が挙げられる。

この発明の精製法で用いられる強酸性陽イオン
交換体としては、例えばスルホ基、スルホエチル
基、スルホプロピル基等のスルホ基を官能基とし
て有する架橋デキストラン、アガロース、セルロ
ースなどが含まれ、その代表例としては、SP−
セフアデツクスＣ−25（SP−Sephadex Ｃ−25、
商標、フアルマシア社製）等のスルホプロピル基
を有する架橋デキストランが挙げられる。

この発明の精製法では、まず粗製インターフエ
ロン水溶液を上記の強酸性陽イオン交換体で処理
するが、処理に先立ち、粗製インターフエロン水
溶液のPHを弱酸性に、好ましくはPH２〜４に調整
しておくのが望ましく、次いでこの粗製インター
フエロン水溶液を強酸性陽イオン交換体にカラム
式またはバツチ式で接触させ、インターフエロン
を強酸性陽イオン交換体に吸着させる。吸着され
たインターフエロンを溶出することは、該強酸性
陽イオン交換体を中性ないしアルカリ性の水溶
液、好ましくは弱アルカリ性の緩衝液に接触させ
ることにより行なわれる。

このようにして得られたインターフエロン含有
分画にトリクロル酢酸を加え、インターフエロン
を沈でんさせる。この際、トリクロル酢酸は約２
〜５％最終濃度となるように加えれば、インター
フエロンは十分に沈でんする。

次に生じた沈でんをアルカリ水に溶解する。こ
の際、用いられるアルカリ水としては水酸化ナト
リウム水溶液、炭酸水素ナトリウム水溶液が繁用
される。このアルカリ水を液性が約PH７〜８にな
る程度に加えれば、インターフエロンを含有する
沈でんは容易に溶解する。

次いで得られたインターフエロン溶液を透析す
る。用いられる透析チユーブとしては通常の透析
用セルロースチユーブでよく、透析外液としては
約PH7.0〜8.0程度の緩衝液が繁用され、必要に応
じ、シユークロース、マンニトール等の安定剤を
これに含有せしめてもよい。透析時間は約12〜48
時間程度で十分である。

次いで得られた透析内液をチオシアン酸カリウ
ム塩析に付す。このチオシアン酸カリウム塩析は
インターフエロンを精製するためのチオシアン酸
カリウム塩析の通常の方法と同様にして行なわれ
る。すなわち、該透析内液にチオシアン酸カリウ
ムを約0.5M最終濃度となるように添加溶解し、
次いで塩酸、硫酸等の鉱酸で液性を約PH３〜４に
調整すると、インターフエロンが沈でんしてく
る。

次いで得られた沈でんにアルカリ水を加え、溶
解する。この際のアルカリ水としては水酸化ナト
リウム水溶液、炭酸水素ナトリウム水溶液等が繁
用され、インターフエロン含有沈でんを溶解する
ためのアルカリ水の量は液性が約PH７〜８程度に
なる程度で十分である。

次に、得られたインターフエロン溶液をゲル
過に付す。用いられるゲル過剤としては分子量
約１万〜10万の物質を精製できるゲルであればよ
く、ゲルの基材としては架橋デキストラン、ポリ
アクリルアミド、アガロース等が挙げられ、好ま
しいものとしては、例えば、セフアクリルＳ−
200（Sephacryl Ｓ−200、商標、フアルマシア社
製）等のＮ，N′−メチレンビスアクリルアミド
とアリルデキストランの架橋体が挙げられる。ゲ
ル過剤の平衡化およびゲル過剤からインター
フエロンの溶出のためには、PH４〜９、好ましく
はPH７〜８の水溶液が用いられるが、その中で
も、例えばシユークロース等の糖類または糖アル
コールなどの安定剤を含有する緩衝液が繁用され
る。ゲル過は高分子物質の精製に適用される通
常のゲル過操作法により行なわれる。

ゲル過後、得られたインターフエロン含有分
画を限外過に付す、この際使用される限外過
膜としては、分画分子量約５千〜10万程度の多糖
類を基材とするものが用いられ、その例として
は、例えば、ダイアフローメンブレンYM5、
YM10、YM30（商標、アミコン社製）等の限外
過膜が繁用される。この限外過の操作は高分
子物質の精製に適用される限外過の常法により
行なえばよい。

次いで得られた限外過残留液を多孔性ガラス
粒子にカラム式またはバツチ式で接触させる。こ
こで用いられる多孔性ガラス粒子としては、例え
ばコントロールド・ポア・グラス（Controlled
pore glass）CPG10（商標、エレクトロヌクレオ
ニクス社製）等が繁用される。多孔性ガラス粒子
に吸着したインターフエロンはチオシアン酸カリ
ウム溶液により、溶出される。溶離剤として使用
されるチオシアン酸カリウム溶液はPH５〜９、好
ましくは約PH８の液性で0.75M以上の濃度のチオ
シアン酸カリウムを含有する緩衝液が繁用され
る。

次いで、得られたインターフエロン含有分画を
弱酸性に調整し、生ずる沈でんを上記と同様のア
ルカリ水に溶解する。この溶液を次にゲル過に
付す。ここで行なわれるゲル過は前記のゲル
過と同様にして行なえばよい。

ゲル過後、得られたインターフエロン含有分
画を限外過に付す、ここで行なわれる限外過
も前記の限外過と同様にして行なえばよい。

次いで得られた限外過残留液を酸エタノール
分別沈でん法に付す。この酸エタノール分別沈で
ん法とは、例えば、ジヤーナル・オブ・ゼネラ
ル・ビロロジー（Journal of General
Virology）第39巻第541〜543頁（1978年）記載
のケイ・カンテル（K.Cantell）氏により創案さ
れたインターフエロンの部分精製法のことであ
り、インターフエロン水溶液にチオシアン酸カリ
ウムを添加溶解し、次に液性を約PH3.5に調整し、
インターフエロンを沈でんせしめ（チオシアン酸
カリウム塩析）、この沈でんをエタノールに溶解
し、得られたインターフエロンのチオシアン酸カ
リウム・エタノール溶液の液性をPH5.5およびPH
5.8に変化せしめ、それぞれ生ずる不純物の沈で
んを除去し、ついで該エタノール溶液の液性をPH
8.0に調整し、インターフエロンを沈でんせしめ、
部分精製インターフエロンを採取することからな
る方法である。上記方法において、チオシアン酸
カリウム塩析で生じたインターフエロンの沈でん
はかなりの量のチオシアン酸カリウムを含有し、
これをエタノールに溶解せしめることは、例え
ば、京都府赤十字血液センター発行の技術情報第
３巻第５号（1978年９月20日発行）第26頁右欄の
「2.エタノールに溶解」の項第１〜第14行に、「あ
らかじめ95％エタノールと組織破砕用ワーリング
ブレンダーを−20℃のフリーザーで冷却してお
く。ロダンカリ塩析で得られた沈渣を−20℃エタ
ノール4000ml（粗インターフエロンの1/5量）に
溶解する。容易には溶解しないので沈渣をまず少
量の−20℃エタノールでほぐし、ブレンダー（冷
却済）で５秒づつ４回計20秒程度撹拌し溶解せし
める。理由はさだかではないが、この５秒４回が
重要だと、係の女性はストツプウオツチを見なが
らブレンダのスイツチを断続していた。」と記載
の通り、容易ではなく、所望のインターフエロン
のチオシアン酸カリウム・エタノール溶液を得る
には、この方法では特殊な操作と熟練を要し、イ
ンターフエロンの工業的製造工程として適当では
ない。そこで、この発明者等は従来の酸エタノー
ル分別法の改良について鋭意研究の結果、上記の
酸エタノール分別沈でん法において、チオシアン
酸カリウム塩析を行ない、生じた沈でんをエタノ
ールに溶解させる工程に換え、直接、インターフ
エロン水溶液を約PH3.5のチオシアン酸カリウ
ム・エタノール溶液に加え（好ましくは滴下し）、
インターフエロンのチオシアン酸カリウム・エタ
ノール溶液を得、この溶液を用いて、上記と同様
に分別沈でん操作を行なつても、インターフエロ
ンが精製できることを見い出した。この方法によ
れば、特殊な操作および熟練も要せず、きわめて
簡単にインターフエロンのチオシアン酸カリウ
ム・エタノール溶液を得ることができ、インター
フエロンの工業的製造にとつて好適な工程であ
る。

酸エタノール分別沈でん法により得られたイン
ターフエロン含有分画はさらに透析により精製さ
れる。この透析の操作も上記で述べた透析の操作
と同様にして行なわれる。

なお、この精製法の上述の全工程はインターフ
エロンの失活を避けるため、低温、例えば、４℃
で行なうのがよい。

次に実施例によりこの発明の精製法を説明す
る。なお、実施例中のインターフエロンの活性
は、水泡性口炎ウイルス（Vesicular Stomatitis
Virus）の人のFL細胞を用い細胞変性効果
（CPE）抑制法〔例えば、最新医学第29巻４号
（1974年）第660〜664ページ参照〕で測定した。

実施例 (1) ヒトリンパ芽球様細胞〔ナマルバ
（Namalva）株〕の培養液にセンダイウイルス
をかけてインターフエロンを産生させた後、PH
２でセンダイウイルスを不活化し、遠心分離し
て得た粗製インターフエロン水溶液〔蛋白質含
量：37.1ｇ、インターフエロン総活性：54.6×
10⁶IU、インターフエロン比活性：1.47×
10²IU／mg・蛋白質PH3.5〕を４℃でマクルバイ
ン（Mcllvaine）クエン酸−リン酸緩衝液（PH
3.5）で平衡化したSP−セフアデツクスＣ−25
3.6中に入れ、一夜ゆつくりと撹拌する。こ
の混合液をグラスフイルターにより４℃で吸引
過する。液はすてる。過したSP−セフ
アデツクスＣ−25を平衡化に用いた緩衝液1.8
で２回洗浄する。液はすてる。洗浄した
SP−セフアデツクスＣ−25にマクルバインク
エン酸−リン酸緩衝液（PH7.8）1.2を加え、
ゆつくりと撹拌する。４℃で撹拌下、4N水酸
化ナトリウム水溶液を滴下してPH7.8に調整し、
２時間ゆつくりと撹拌する。その後４℃でグラ
スフイルターにより吸引過して、液を得
る。さらに、過したSP−セフアデツクスＣ
−25をマクルバインクエン酸−リン酸緩衝液
（PH7.8）1.2を用いて上記と同様の操作で２
回溶出し、過する。PH7.8で溶出した液
（4.5）を合し、これに４℃で撹拌下、70％ト
リクロロ酢酸346mlを１時間で滴下し５％トリ
クロロ酢酸濃度となるようにする。その後、１
時間、４℃で撹拌し、次いで４℃、7000r.p.m
で20分間遠心分離する。得られた沈でんに４℃
で水を加え撹拌し、飽和炭酸水素ナトリウム溶
液を滴下してPH7.0〜7.5に調整して溶解する。
この溶解液348mlをセルロースチユーブに入れ、
0.015M塩化ナトリウム含有0.01Mリン酸緩衝
液（PH7.0）30で一夜透析する。透析後４℃、
9000r.p.mで20分間遠心分離し、上清を得る。
上清に４℃で水252mlを加え、全量を600mlにす
る。４℃で撹拌下、チオシアン酸カリウム29.2
ｇを添加溶解し、0.5Mチオンシアン酸カリウ
ム濃度にする。その後４℃で撹拌下、1N塩酸
をゆつくりと滴下し、PH3.5に調整する。４℃
で１時間撹拌後、４℃、9000r.p.mで10分間遠
心分離する。沈でんに４℃で少量の水と飽和炭
酸水素ナトリウム水溶液を加え、撹拌し、1N
塩酸または、1N水酸化ナトリウムでPH7.0〜7.5
に調整する。４℃で１時間撹拌した後４℃、
15000r.p.mで20分間遠心分離して沈でんを除去
する。

上清液を、0.5％シユークロース、0.02M塩
化ナトリウム含有の0.02Mリン酸緩衝液（PH
7.4）で平衡化したセフアクリルＳ−200スーパ
ーフアイン（Superfine）2500mlを２本のカラ
ム（カラムサイズ：５×77cmおよび５×51cm）
を塩化ビニールチユーブで接続して作成したカ
ラムに2.1ml／分の流速でゲル過を行う。通
液開始後1549ml〜2128ml目の溶出液を集める。
これを限外過膜、ダイアフローメンブレン
YM10（76mm）を用いて４℃窒素加圧下（４
Kg／cm²以下）で限外過する。限外過残留液
量は14.2mlでインターフエロン総活性44.7×
10⁶IUを含有し、インターフエロン比活性は
1.07×10⁵IU／mg蛋白質、精製度は730倍、回収
率は、81.9％である（以下、この限外過残留
液を“部分精製インターフエロン溶液”と称す
る）。

(2) 上記と同様にして精製したインターフエロン
含有液の凍結（−80℃）試料を37℃の温水中で
融解する。これを10000r.p.mで15分間遠心分離
する。上清液は、84mlで蛋白質含量819mg、イ
ンターフエロン総活性2.0×10⁸IUを含有し、比
活性は2.4×10⁵IU／mg蛋白質である。上清液を
４℃で0.01Mのリン酸緩衝液（PH7.2）で平衡
化した多孔性ガラス粒子、コントロールド・ポ
ア・グラスCPG−10（350〓、200〜400メツシ
ユ、５×22cm）のカラムに、0.5ml／分で流す。
平衡化に用いたのと同じ緩衝液（2130ml）を用
いて、流速2.5ml／分で洗浄した後、0.1Mトリ
ス酢酸緩衝液（PH8.0、3520ml）を用いて流速
１ml／分で洗浄する。次に0.75Mのチオシアン
酸カリウムを含む0.1Mトリス酢酸緩衝液（PH
8.0、1320ml）を用いて、流速１ml／分で溶出
する。溶出開始後630〜1100mlの溶出液（470
ml）を集める。

これに、４℃撹拌下に、6N塩酸を加えPH3.5
とした後、30分間撹拌する。ついで、４℃、
7000r.p.mで、30分間遠心分離する。沈でんに、
飽和炭酸水素ナトリウム溶液0.5ml及び水４ml
を４℃で加え、沈でんを溶解する。

この溶解液（4.5ml）を、0.5％シユークロー
ス含有の0.02Mリン酸緩衝液（PH7.4）で平衡
化したセフアクリルＳ−200スーパーフアイン
（1.6×90cm、180ml）のカラムに、流速0.15
ml／分で流し、４℃でゲル過を行なう。通液
開始後、90.3〜150.5ml目の溶出液を集める。
溶出液を限外過膜YM10（43mm）を用いて、
４℃で限外過して濃縮する。

−20℃でチオシアン酸カリウムを飽和し、
1N塩酸でPH3.5としたエタノール80mlを、−20
℃で冷却下撹拌する。このチオシアン酸カリウ
ム・エタノール溶液に、限外過残留液５mlに
1N塩酸を加え、PH3.5に調整した溶液を85分間
要して徐々に滴下する。−20℃で20分撹拌後、−
10℃〜−５℃、3000r.p.mで20分間遠心分離す
る。沈でんを除き、上清液に、４℃撹拌下
0.1N水酸化ナトリウム水溶液を、115分かけて
加えPH5.5とする。４℃で20分撹拌した後、０
℃3000r.p.mで、20分間遠心分離する。沈でん
を除いた後、上清液に、４℃撹拌下0.1N水酸
化ナトリウム水溶液を30分間を要して加え、PH
5.8とする。４℃で20分間撹拌した後、０℃、
3000r.p.mで、20分間遠心分離する。沈でんを
除いた後、上清液に、４℃撹拌下0.1N水酸化
ナトリウム水溶液を40分を要して加えPH8.0と
する。４℃で20分間撹拌した後、０℃、3000r.
p.mで20分間遠心分離する。上清を除いた後、
沈でんに、0.5％マンニトールを含む0.01Mリ
ン酸緩衝液（PH7.4）50mlを加え、沈でんを、
溶解する。溶解液を、0.5％マンニトールを含
む0.01Mリン酸緩衝液（PH7.4、８）を用い
て、４℃で１夜透析する。透析した後の液量
は、52mlで蛋白質含量4.8mgインターフエロン
総活性13.5×10⁷IUを含有し、インターフエロ
ン比活性2.8×10⁷IU／mg蛋白質であり、上記部
分精製インターフエロン溶液からの精製率は
117倍で回収率は67.5％であり、粗製インター
フエロン溶液からのインターフエロンの精製率
は19000倍で、回収率は54.7％である。

Claims

【特許請求の範囲】１インターフエロンを酸エタノール分別沈でん
法で精製する操作において、インターフエロン水
溶液を、約PH3.5のチオシアン酸カリウム・エタ
ノール溶液に加え、インターフエロンのチオシア
ン酸カリウム・エタノール溶液を得ることを特徴
とするインターフエロンの精製法。２粗製インターフエロン水溶液を強酸性陽イオ
ン交換体で処理し、次いで、得られたインターフ
エロン含有分画にトリクロル酢酸を加え、得られ
た沈でんをアルカリ水に溶解し、透析後、透析内
液をチオシアン酸カリウム塩析に付し、次いで、
得られた沈でんをアルカリ水に溶解し、ゲル濾過
後、得られたインターフエロン含有分画を限外濾
過に付し、次いで得られた限外濾過残留液を多孔
性ガラス粒子に接触させ、次いで多孔性ガラス粒
子に吸着したインターフエロンをチオシアン酸カ
リウム溶液で溶出し、次いで得られたインターフ
エロン含有分画を弱酸性に調整し、生ずる沈でん
をアルカリ水に溶解し、ゲル濾過後、得られたイ
ンターフエロン含有分画を限外濾過に付し、次い
で得られた限外濾過残留液を酸エタノール分別沈
でん法で精製する操作において、限外濾過残留液
を約PH3.5のチオシアン酸カリウム・エタノール
溶液に加え、インターフエロンのチオシアン酸カ
リウム・エタノール溶液を得、これを分別沈でん
法に付し、得られたインターフエロン含有分画を
透析することを特徴とする特許請求の範囲第１項
記載のインターフエロンの精製法。