JPH08176198A - 新規なクロマトグラフイー分離条件を用いるα−１プロテイナーゼ阻害剤の精製 - Google Patents
新規なクロマトグラフイー分離条件を用いるα−１プロテイナーゼ阻害剤の精製Info
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- JPH08176198A JPH08176198A JP7233228A JP23322895A JPH08176198A JP H08176198 A JPH08176198 A JP H08176198A JP 7233228 A JP7233228 A JP 7233228A JP 23322895 A JP23322895 A JP 23322895A JP H08176198 A JPH08176198 A JP H08176198A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 タンパク質含有水性溶液からα−１ ＰＩを
精製する方法の提供。 【解決手段】 不活性（又は変性）α−１ ＰＩを含む
他のタンパク質類が媒体（又はイオン交換樹脂）に結合
するのに対して、活性α−１ ＰＩが該媒体（又は該イ
オン交換樹脂）に結合しないことを確保するのに十分な
ｐＨ、イオン強度及びタンパク質濃度の条件下で、陽イ
オン樹脂クロマトグラフィー媒体を用いる通液型クロマ
トグラフィーによる方法。
精製する方法の提供。 【解決手段】 不活性（又は変性）α−１ ＰＩを含む
他のタンパク質類が媒体（又はイオン交換樹脂）に結合
するのに対して、活性α−１ ＰＩが該媒体（又は該イ
オン交換樹脂）に結合しないことを確保するのに十分な
ｐＨ、イオン強度及びタンパク質濃度の条件下で、陽イ
オン樹脂クロマトグラフィー媒体を用いる通液型クロマ
トグラフィーによる方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は一般にタンパク質の
精製に関する。本発明は、詳細には、活性α−１ＰＩが
カラムに結合しないが、汚染タンパク質は結合するよう
な条件下で陽イオン交換によって血漿画分からα−１プ
ロテイナーゼ阻害剤を精製する方法に関する。
精製に関する。本発明は、詳細には、活性α−１ＰＩが
カラムに結合しないが、汚染タンパク質は結合するよう
な条件下で陽イオン交換によって血漿画分からα−１プ
ロテイナーゼ阻害剤を精製する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】α−１プロテイナーゼ阻害剤（α−１
ＰＩ）は約５５，０００ダルトンの分子量を有する糖タ
ンパク質である。α−１ ＰＩは、例えばトリプシン、
キモトリプシン、膵臓エラスターゼ、皮膚コラゲナー
ゼ、レニン、ウロキナーゼのようなプロテイナーゼ類の
阻害剤であり、そして多形核リンパ球のプロテアーゼ類
の阻害剤である。現在、α−１ ＰＩは肺中のリンパ球
エラスターゼの阻害剤としての治療上の用途を有する。
このプロテアーゼの機能は外来タンパク質を破壊するこ
とである。エラスターゼ活性を調節するのに十分な量の
α−１ ＰＩが存在しない場合には、エラスターゼは肺
組織を破壊する。やがて、このアンバランスは慢性の肺
組織損傷及び気腫を生じさせる。α−１ ＰＩの補給は
このタイプの気腫の治療に成功裏に用いられてきてい
る。
ＰＩ）は約５５，０００ダルトンの分子量を有する糖タ
ンパク質である。α−１ ＰＩは、例えばトリプシン、
キモトリプシン、膵臓エラスターゼ、皮膚コラゲナー
ゼ、レニン、ウロキナーゼのようなプロテイナーゼ類の
阻害剤であり、そして多形核リンパ球のプロテアーゼ類
の阻害剤である。現在、α−１ ＰＩは肺中のリンパ球
エラスターゼの阻害剤としての治療上の用途を有する。
このプロテアーゼの機能は外来タンパク質を破壊するこ
とである。エラスターゼ活性を調節するのに十分な量の
α−１ ＰＩが存在しない場合には、エラスターゼは肺
組織を破壊する。やがて、このアンバランスは慢性の肺
組織損傷及び気腫を生じさせる。α−１ ＰＩの補給は
このタイプの気腫の治療に成功裏に用いられてきてい
る。
【０００３】現在、α−１ ＰＩの需要は入手可能な供
給を超えている。α−１ ＰＩ遺伝子は微生物、細胞系
及びヒツジ中に移されて発現されてきた。しかしなが
ら、満足できる組換え産物はいまだ生産されていない。
ヒト血漿が治療用α−１ ＰＩのいまだ唯一の承認され
た給源である。α−１ ＰＩは代償療法に用いられ、そ
して長期間にわたって規則的に患者に与えられる。痕跡
量の不純物が患者の免疫応答を刺激し得るので、治療を
成功させるには高純度の産物が不可欠である。α−１
ＰＩの給源である血漿は限られているので、α−１ Ｐ
Ｉを高純度に精製する方法が必要になる。高収率でかつ
高純度でα−１ ＰＩを提供する実用的な方法は今日ま
で得られていない。
給を超えている。α−１ ＰＩ遺伝子は微生物、細胞系
及びヒツジ中に移されて発現されてきた。しかしなが
ら、満足できる組換え産物はいまだ生産されていない。
ヒト血漿が治療用α−１ ＰＩのいまだ唯一の承認され
た給源である。α−１ ＰＩは代償療法に用いられ、そ
して長期間にわたって規則的に患者に与えられる。痕跡
量の不純物が患者の免疫応答を刺激し得るので、治療を
成功させるには高純度の産物が不可欠である。α−１
ＰＩの給源である血漿は限られているので、α−１ Ｐ
Ｉを高純度に精製する方法が必要になる。高収率でかつ
高純度でα−１ ＰＩを提供する実用的な方法は今日ま
で得られていない。
【０００４】ヒト血漿からα−１ ＰＩを精製する種々
の方法が記載されている。Ｂｏｌｌｅｎら、米国特許第
４，６２９，５６７号明細書（１９８６）は、酵母、大
腸菌及びヒト血漿からα−１ ＰＩを精製するために５
つの異なるクロマトグラフィー工程を用いている。５つ
の工程は、ＤＥＡＥイオン交換、チオール−ジスルフィ
ド交換、ヘパリンアフィニティー、亜鉛−キレートクロ
マトグラフィー及びアミノヘキシル・イオン交換を含
む。純度と収率のデータは示されていない。
の方法が記載されている。Ｂｏｌｌｅｎら、米国特許第
４，６２９，５６７号明細書（１９８６）は、酵母、大
腸菌及びヒト血漿からα−１ ＰＩを精製するために５
つの異なるクロマトグラフィー工程を用いている。５つ
の工程は、ＤＥＡＥイオン交換、チオール−ジスルフィ
ド交換、ヘパリンアフィニティー、亜鉛−キレートクロ
マトグラフィー及びアミノヘキシル・イオン交換を含
む。純度と収率のデータは示されていない。
【０００５】Ｎｏｖｉｋａら、Ｇｅｍａｔｏｌ．Ｔｒａ
ｎｓｆｕｚｉｏｌ．３４：４６−５０（１９８９）は、
血液製品の製造の際の副生成物からの単離方法を報告し
ている。彼らはアフィニティー、ＤＥＡＥセルロース、
及びゲル瀘過クロマトグラフィーを用いている。純度と
収率のデータは得られていない。
ｎｓｆｕｚｉｏｌ．３４：４６−５０（１９８９）は、
血液製品の製造の際の副生成物からの単離方法を報告し
ている。彼らはアフィニティー、ＤＥＡＥセルロース、
及びゲル瀘過クロマトグラフィーを用いている。純度と
収率のデータは得られていない。
【０００６】Ｐｏｄｉａｒｅｎｅら、Ｖｏｐｒ．Ｍｅ
ｄ．Ｋｈｉｍ．３５：９６−９９（１９８９）は、モノ
クローナル抗体を用いるアフィニティークロマトグラフ
ィーを使用してヒト血漿からα−１ ＰＩを単離する、
単一工程手法を報告している。２０％の収率でα−１
ＰＩ活性は６１．１倍増大した。
ｄ．Ｋｈｉｍ．３５：９６−９９（１９８９）は、モノ
クローナル抗体を用いるアフィニティークロマトグラフ
ィーを使用してヒト血漿からα−１ ＰＩを単離する、
単一工程手法を報告している。２０％の収率でα−１
ＰＩ活性は６１．１倍増大した。
【０００７】Ｂｕｒｎｏｕｆら、Ｖｏｘ．Ｓａｎｇ．５
２，２９１−２９７（１９８７）は、血漿上清Ａ（コー
ン（Ｃｏｈｎ）の画分ＩＩ ＋ ＩＩＩに等しい）から
出発し、ＤＥＡＥクロマトグラフィー及びサイズ排除ク
ロマトグラフィーを用いて、８０〜９０％の純度の（Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥによる）α−１ ＰＩを製造し、純度を
３６倍増大させた。上清Ａからの回収率は６５〜７０％
であった。
２，２９１−２９７（１９８７）は、血漿上清Ａ（コー
ン（Ｃｏｈｎ）の画分ＩＩ ＋ ＩＩＩに等しい）から
出発し、ＤＥＡＥクロマトグラフィー及びサイズ排除ク
ロマトグラフィーを用いて、８０〜９０％の純度の（Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥによる）α−１ ＰＩを製造し、純度を
３６倍増大させた。上清Ａからの回収率は６５〜７０％
であった。
【０００８】Ｈｅｉｎｆら、Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．
Ｊ．９：１６Ｓ−２０Ｓ（１９９０）は、出発物質とし
てコーンの画分ＩＶ−１を用い、そしてポリエチレング
リコールによる分別沈殿及び引き続いてＤＥＡＥセファ
ロース（商標）上の陰イオンクロマトグラフィーを利用
する方法を述べている。最終生成物は４５％の収率で得
られ、約６０％の純度を有する。
Ｊ．９：１６Ｓ−２０Ｓ（１９９０）は、出発物質とし
てコーンの画分ＩＶ−１を用い、そしてポリエチレング
リコールによる分別沈殿及び引き続いてＤＥＡＥセファ
ロース（商標）上の陰イオンクロマトグラフィーを利用
する方法を述べている。最終生成物は４５％の収率で得
られ、約６０％の純度を有する。
【０００９】Ｄｕｂｉｎら、Ｐｒｅｐ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．２０：６３−７０（１９９０）は２工程クロマトグ
ラフィー精製を示している。最初にα−１ ＰＩ、ＣＩ
阻害剤、α−１ 抗キモトリプシン及びインター−α−
トリプシン阻害剤をブルー・セファロース（Ｂｌｕｅ
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（商標）から溶離し、次にα−１
ＰＩをゲル瀘過で精製した。純度と収率のデータは得ら
れていない。
ｍ．２０：６３−７０（１９９０）は２工程クロマトグ
ラフィー精製を示している。最初にα−１ ＰＩ、ＣＩ
阻害剤、α−１ 抗キモトリプシン及びインター−α−
トリプシン阻害剤をブルー・セファロース（Ｂｌｕｅ
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（商標）から溶離し、次にα−１
ＰＩをゲル瀘過で精製した。純度と収率のデータは得ら
れていない。
【００１０】Ｂａｌｌｉｅｕｘらは、４−フェニルブチ
ルアミン・アフィニティークロマトグラフィー、陽イオ
ン交換そして最後に免疫アフィニティー工程を用いて、
化膿啖からα−１ ＰＩとプロテイナーゼ−３の複合体
を精製した（Ｂａｌｌｉｅｕｘ，Ｂ．Ｅ．ら，Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １５９：６３−７０（１
９９３））。陽イオン交換工程で用いた緩衝液のｐＨは
７．０であった。用いた条件下では、ほとんどの啖タン
パク質は樹脂に結合したが、α−１ ＰＩ及びプロテイ
ナーゼ−３は結合することなく通過した。
ルアミン・アフィニティークロマトグラフィー、陽イオ
ン交換そして最後に免疫アフィニティー工程を用いて、
化膿啖からα−１ ＰＩとプロテイナーゼ−３の複合体
を精製した（Ｂａｌｌｉｅｕｘ，Ｂ．Ｅ．ら，Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １５９：６３−７０（１
９９３））。陽イオン交換工程で用いた緩衝液のｐＨは
７．０であった。用いた条件下では、ほとんどの啖タン
パク質は樹脂に結合したが、α−１ ＰＩ及びプロテイ
ナーゼ−３は結合することなく通過した。
【００１１】Ｊｏｒｄａｎら、米国特許第４，７４９，
７８３号明細書（１９８８）は、ウイルス不活化工程の
後に、製剤中の生物学的に不活性なタンパク質をアフィ
ニティークロマトグラフィーで除去する方法を記述して
いる。タンパク質の天然型と変性型間の分離は、アフィ
ニティー樹脂に対する天然タンパク質の生物学的活性に
基づくのであって、天然タンパク質と変性タンパク質間
の物理的相違に基づくものではなかった。
７８３号明細書（１９８８）は、ウイルス不活化工程の
後に、製剤中の生物学的に不活性なタンパク質をアフィ
ニティークロマトグラフィーで除去する方法を記述して
いる。タンパク質の天然型と変性型間の分離は、アフィ
ニティー樹脂に対する天然タンパク質の生物学的活性に
基づくのであって、天然タンパク質と変性タンパク質間
の物理的相違に基づくものではなかった。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】これらの方法のいずれ
も、精製工程として、低ｐＨ、低塩濃度及び中程度のタ
ンパク質濃度での強陽イオン樹脂による通液型（ｆｌｏ
ｗ ｔｈｒｏｕｇｈ）クロマトグラフィーを用いていな
い。意外なことに、このような条件下で、活性α−１
ＰＩのみがカラムを流れる。クロマトグラフィーカラム
により９０％の収率を達成しそして陽イオンカラムに２
回かけた後に約９５％の純度が達成するように、方法の
手はずを決めることができる。本発明は、大規模で、高
純度でかつ高収率でヒト血漿からα−１ ＰＩを精製す
る改良された方法を提供する。
も、精製工程として、低ｐＨ、低塩濃度及び中程度のタ
ンパク質濃度での強陽イオン樹脂による通液型（ｆｌｏ
ｗ ｔｈｒｏｕｇｈ）クロマトグラフィーを用いていな
い。意外なことに、このような条件下で、活性α−１
ＰＩのみがカラムを流れる。クロマトグラフィーカラム
により９０％の収率を達成しそして陽イオンカラムに２
回かけた後に約９５％の純度が達成するように、方法の
手はずを決めることができる。本発明は、大規模で、高
純度でかつ高収率でヒト血漿からα−１ ＰＩを精製す
る改良された方法を提供する。
【００１３】用語の定義 「活性α−１ ＰＩ」又は「天然α−１ ＰＩ」は、試
験管内でのエラスターゼアッセイでエラスターゼ活性の
阻害を示すα−１ ＰＩを意味する。
験管内でのエラスターゼアッセイでエラスターゼ活性の
阻害を示すα−１ ＰＩを意味する。
【００１４】「不活性α−１ ＰＩ」又は「変性α−１
ＰＩ」は、試験管内でのエラスターゼアッセイでエラ
スターゼ活性に対して効果を生じないα−１ ＰＩを意
味する。
ＰＩ」は、試験管内でのエラスターゼアッセイでエラ
スターゼ活性に対して効果を生じないα−１ ＰＩを意
味する。
【００１５】「高度に精製された」は２０％未満の汚染
タンパク質を含むことを意味する。「不活性α−１ Ｐ
Ｉを実質的に含まない」は１０％未満の不活性α−１
ＰＩを含むことを意味する。
タンパク質を含むことを意味する。「不活性α−１ Ｐ
Ｉを実質的に含まない」は１０％未満の不活性α−１
ＰＩを含むことを意味する。
【００１６】「不活性ウイルス類を実質的に含まない」
は、認められているウイルス不活化工程（例えば、低温
殺菌又は化学処理）に供されたために、低減された活性
ウイルス含量を有することを意味する。一般に、このこ
とは少なくとも対数約４のモデルウイルス力価の低減を
意味する。
は、認められているウイルス不活化工程（例えば、低温
殺菌又は化学処理）に供されたために、低減された活性
ウイルス含量を有することを意味する。一般に、このこ
とは少なくとも対数約４のモデルウイルス力価の低減を
意味する。
【００１７】すべての伝導率測定は２５℃でなされた。
【００１８】
【課題を解決するための手段】本発明は、タンパク質含
有水性溶液からα−１ ＰＩを精製する方法であって、
不活性（又は変性）α−１ ＰＩを含む他のタンパク質
類が媒体（又はイオン交換樹脂）に結合するのに対し
て、活性α−１ ＰＩが該媒体（又は該イオン交換樹
脂）に結合しないことを確保するのに十分なｐＨ、イオ
ン強度及びタンパク質濃度の条件下で、陽イオン樹脂ク
ロマトグラフィー媒体を用いる通液型クロマトグラフィ
ーによる方法である。好適な実施態様において、方法は
以下の工程を含む： (1) タンパク質溶液を約≦１０ ｍｍｈｏ／ｃｍのイ
オン強度に透析又は透析瀘過し； (2) 溶液のｐＨを約≦６．０に調整し； (3) タンパク質溶液を約≦１０ ｍｇタンパク質／ｍ
Ｌに調整し； (4) 溶液を、陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂を
通過させ；そして (5) クロマトグラフィーの通過液画分を精製α−１
ＰＩとして回収する。
有水性溶液からα−１ ＰＩを精製する方法であって、
不活性（又は変性）α−１ ＰＩを含む他のタンパク質
類が媒体（又はイオン交換樹脂）に結合するのに対し
て、活性α−１ ＰＩが該媒体（又は該イオン交換樹
脂）に結合しないことを確保するのに十分なｐＨ、イオ
ン強度及びタンパク質濃度の条件下で、陽イオン樹脂ク
ロマトグラフィー媒体を用いる通液型クロマトグラフィ
ーによる方法である。好適な実施態様において、方法は
以下の工程を含む： (1) タンパク質溶液を約≦１０ ｍｍｈｏ／ｃｍのイ
オン強度に透析又は透析瀘過し； (2) 溶液のｐＨを約≦６．０に調整し； (3) タンパク質溶液を約≦１０ ｍｇタンパク質／ｍ
Ｌに調整し； (4) 溶液を、陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂を
通過させ；そして (5) クロマトグラフィーの通過液画分を精製α−１
ＰＩとして回収する。
【００１９】本発明はヒト血漿からα−１ ＰＩを精製
する改良された方法である。この方法は、低イオン強度
緩衝液によるｐＨ≦６．０での陽イオン交換クロマトグ
ラフィーを含む。精製α−１ ＰＩを含む通過液画分を
回収する。陽イオン交換クロマトグラフィーはα−１
ＰＩに特異的であり、そしてこれを、コーン（Ｃｏｈ
ｎ）の画分ＩＶ−１懸濁液からの直接的な２工程精製方
法（陽イオン交換カラム及び引き続く第２の陽イオン交
換カラム）として、実際に用いることができる。
する改良された方法である。この方法は、低イオン強度
緩衝液によるｐＨ≦６．０での陽イオン交換クロマトグ
ラフィーを含む。精製α−１ ＰＩを含む通過液画分を
回収する。陽イオン交換クロマトグラフィーはα−１
ＰＩに特異的であり、そしてこれを、コーン（Ｃｏｈ
ｎ）の画分ＩＶ−１懸濁液からの直接的な２工程精製方
法（陽イオン交換カラム及び引き続く第２の陽イオン交
換カラム）として、実際に用いることができる。
【００２０】この手法は十分に多方面に適用できるの
で、陽イオンクロマトグラフィーは、コーンの画分流出
液 II + III、コーンの画分ＩＶ−１ペースト（現在、
好適な出発物質）及び精製α−１ ＰＩの範囲に及ぶ、
どのような数の出発物質にも働くであろうし、そしてな
お実質的に精製された生成物を生じさせる。
で、陽イオンクロマトグラフィーは、コーンの画分流出
液 II + III、コーンの画分ＩＶ−１ペースト（現在、
好適な出発物質）及び精製α−１ ＰＩの範囲に及ぶ、
どのような数の出発物質にも働くであろうし、そしてな
お実質的に精製された生成物を生じさせる。
【００２１】製薬学的製剤の大規模製造用のオプション
として、ウイルス不活化を含む多種の追加的工程を加え
て、収率を最適化し、ウイルス安全性を改良しそして規
制コンプライアンスを確保することができる。これらの
工程を含むことができるが、これらに限定されるもので
はない： (1) 弱イオン交換樹脂（ＤＥＡＥ）による最初のクロ
マトグラフィー； (2) 強陰イオン交換樹脂（ＱＡＥ）による最初のクロ
マトグラフィー； (3) 風乾又は溶液中での低温殺菌のいずれかを利用す
るウイルス不活化； (4) あり得るウイルス汚染物を除去するためのウイル
ス除去瀘過； (5) ウイルス不活化のための、例えば溶剤洗浄剤処理
のような化学処理；及び (6) 陽イオンクロマトグラフィーに先立って、出発物
質を部分的に精製するための沈殿工程。
として、ウイルス不活化を含む多種の追加的工程を加え
て、収率を最適化し、ウイルス安全性を改良しそして規
制コンプライアンスを確保することができる。これらの
工程を含むことができるが、これらに限定されるもので
はない： (1) 弱イオン交換樹脂（ＤＥＡＥ）による最初のクロ
マトグラフィー； (2) 強陰イオン交換樹脂（ＱＡＥ）による最初のクロ
マトグラフィー； (3) 風乾又は溶液中での低温殺菌のいずれかを利用す
るウイルス不活化； (4) あり得るウイルス汚染物を除去するためのウイル
ス除去瀘過； (5) ウイルス不活化のための、例えば溶剤洗浄剤処理
のような化学処理；及び (6) 陽イオンクロマトグラフィーに先立って、出発物
質を部分的に精製するための沈殿工程。
【００２２】タンパク質の荷電基を変えることにより、
ｐＨはイオン交換クロマトグラフィーにおいて重要な役
割を果たす。それはクロマトグラフィー樹脂に対するタ
ンパク質の結合挙動を、非結合から結合に、或いはその
逆に変える。本発明に用いられる強陽イオン樹脂リガン
ドは、樹脂ビーズに直接結合しているか或いは短い炭素
を主とする鎖を介して結合しているスルホネート基（−
ＳＯ3 -）である。リガンドは１〜１４のｐＨ領域を通じ
て負電荷を有する。所定のｐＨでタンパク質の純有効表
面電荷が負である場合には、タンパク質は遅滞なくカラ
ムを流れる。一般に、溶液のｐＨがそのｐＩより高い場
合にはタンパク質は負電荷を有する。
ｐＨはイオン交換クロマトグラフィーにおいて重要な役
割を果たす。それはクロマトグラフィー樹脂に対するタ
ンパク質の結合挙動を、非結合から結合に、或いはその
逆に変える。本発明に用いられる強陽イオン樹脂リガン
ドは、樹脂ビーズに直接結合しているか或いは短い炭素
を主とする鎖を介して結合しているスルホネート基（−
ＳＯ3 -）である。リガンドは１〜１４のｐＨ領域を通じ
て負電荷を有する。所定のｐＨでタンパク質の純有効表
面電荷が負である場合には、タンパク質は遅滞なくカラ
ムを流れる。一般に、溶液のｐＨがそのｐＩより高い場
合にはタンパク質は負電荷を有する。
【００２３】良好に特性決定されたヒト血漿中の２種類
のタンパク質はα−１ ＰＩ及びアルブミンであり、こ
れらはそれぞれ４．８及び５．３の平均ｐＩを有する。
両タンパク質はｐＨ５．４５で負に荷電されてなければ
ならず、かつ、陽イオン交換カラムを流れなければなら
ない。意外なことに、低塩濃度及びｐＨ５．４５で、ア
ルブミン及び変性（又は不活性）α−１ ＰＩは樹脂に
結合し、そして天然（又は活性）α−１ ＰＩのみがカ
ラムを流れることを、これらの実験は示している。α−
１ ＰＩについてのこの観察は、タンパク質のｐＩのみ
ならずその３次構造がイオン交換において重要であるこ
とを示唆している。α−１ ＰＩの天然型が明らかに負
に荷電した表面を与えるのに対して、変性型の表面はよ
り正に荷電され得る。したがって、変性タンパク質は幸
運にも陽イオン樹脂に結合する。α−１ ＰＩの天然型
は、より高いｐＨでより相当安定である。安定性と陽イ
オン交換クロマトグラフィーによるα−１ ＰＩの精製
の両者を考慮した場合、ｐＨ５．４５が実際上最低のｐ
Ｈとなる。
のタンパク質はα−１ ＰＩ及びアルブミンであり、こ
れらはそれぞれ４．８及び５．３の平均ｐＩを有する。
両タンパク質はｐＨ５．４５で負に荷電されてなければ
ならず、かつ、陽イオン交換カラムを流れなければなら
ない。意外なことに、低塩濃度及びｐＨ５．４５で、ア
ルブミン及び変性（又は不活性）α−１ ＰＩは樹脂に
結合し、そして天然（又は活性）α−１ ＰＩのみがカ
ラムを流れることを、これらの実験は示している。α−
１ ＰＩについてのこの観察は、タンパク質のｐＩのみ
ならずその３次構造がイオン交換において重要であるこ
とを示唆している。α−１ ＰＩの天然型が明らかに負
に荷電した表面を与えるのに対して、変性型の表面はよ
り正に荷電され得る。したがって、変性タンパク質は幸
運にも陽イオン樹脂に結合する。α−１ ＰＩの天然型
は、より高いｐＨでより相当安定である。安定性と陽イ
オン交換クロマトグラフィーによるα−１ ＰＩの精製
の両者を考慮した場合、ｐＨ５．４５が実際上最低のｐ
Ｈとなる。
【００２４】イオン交換樹脂とタンパク質溶液の間の平
衡は、溶液のイオン強度、タンパク質濃度、ｐＨ及び樹
脂上の特異的なリガンドにより影響される。Ｙａｍａｍ
ｏｔｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２
５：１３７３−１３９１（１９８３）は、低タンパク質
濃度で、溶液のイオン強度の関数としての分配係数に関
連する半実験式を述べている。式は次のとおりである： Ｋ ＝ Ａ（Ｉ）B ＋ Ｋcrt 式中、Ｋは分配係数を表し、Ａ及びＢは実験的定数を表
し、Ｉは溶液のイオン強度を表し、そしてＫcrtは静電
相互作用が無視できる高イオン強度におけるタンパク質
の分配係数を表す。異なるタンパク質の分配係数は、所
定のイオン強度で異なる。したがって、種々のタンパク
質は、同一条件下で異なる速度で移動する。これを、こ
のクロマトグラフィーにおけるタンパク質分離に適用す
る。低塩濃度では、添加工程中にほとんどのタンパク質
の移動速度は樹脂に結合することにより遅れる。そのユ
ニークな表面電荷特性により、天然α−１ ＰＩはカラ
ムを通過する。通過液緩衝液のイオン強度が増大する場
合には、他のタンパク質と樹脂との相互作用が変わり、
そしてより高いパーセンテージのタンパク質がカラムを
流れるであろう。したがって、溶液のイオン強度を増大
させると、カラムを流れるα−１ ＰＩの純度が低減す
るであろう。
衡は、溶液のイオン強度、タンパク質濃度、ｐＨ及び樹
脂上の特異的なリガンドにより影響される。Ｙａｍａｍ
ｏｔｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２
５：１３７３−１３９１（１９８３）は、低タンパク質
濃度で、溶液のイオン強度の関数としての分配係数に関
連する半実験式を述べている。式は次のとおりである： Ｋ ＝ Ａ（Ｉ）B ＋ Ｋcrt 式中、Ｋは分配係数を表し、Ａ及びＢは実験的定数を表
し、Ｉは溶液のイオン強度を表し、そしてＫcrtは静電
相互作用が無視できる高イオン強度におけるタンパク質
の分配係数を表す。異なるタンパク質の分配係数は、所
定のイオン強度で異なる。したがって、種々のタンパク
質は、同一条件下で異なる速度で移動する。これを、こ
のクロマトグラフィーにおけるタンパク質分離に適用す
る。低塩濃度では、添加工程中にほとんどのタンパク質
の移動速度は樹脂に結合することにより遅れる。そのユ
ニークな表面電荷特性により、天然α−１ ＰＩはカラ
ムを通過する。通過液緩衝液のイオン強度が増大する場
合には、他のタンパク質と樹脂との相互作用が変わり、
そしてより高いパーセンテージのタンパク質がカラムを
流れるであろう。したがって、溶液のイオン強度を増大
させると、カラムを流れるα−１ ＰＩの純度が低減す
るであろう。
【００２５】また、塩濃度は、例えばＮａ+のような陽
イオンを樹脂上の水素イオンで逆に交換することによ
り、溶離液のｐＨを変える。塩濃度を上げると、樹脂か
ら溶離液により多くのＨ+が移動し、その結果溶離液の
ｐＨが低下する。したがって、最初のタンパク質溶液を
平衡緩衝液で限外瀘過する場合には、添加溶液のイオン
強度は平衡緩衝液と等しいか或いはわずかに高くなるは
ずである。添加中に、ｐＨは同一のままに残るか或いは
ほんのわずか低下するはずである。添加後に、平衡緩衝
液を洗浄液として使用すると、イオン強度が低下してｐ
Ｈが高くなり得る。したがって、ｐＨを維持するため
に、この洗浄液に、わずかに高いイオン強度の緩衝液を
用いることができる。
イオンを樹脂上の水素イオンで逆に交換することによ
り、溶離液のｐＨを変える。塩濃度を上げると、樹脂か
ら溶離液により多くのＨ+が移動し、その結果溶離液の
ｐＨが低下する。したがって、最初のタンパク質溶液を
平衡緩衝液で限外瀘過する場合には、添加溶液のイオン
強度は平衡緩衝液と等しいか或いはわずかに高くなるは
ずである。添加中に、ｐＨは同一のままに残るか或いは
ほんのわずか低下するはずである。添加後に、平衡緩衝
液を洗浄液として使用すると、イオン強度が低下してｐ
Ｈが高くなり得る。したがって、ｐＨを維持するため
に、この洗浄液に、わずかに高いイオン強度の緩衝液を
用いることができる。
【００２６】上述したように、また、高タンパク質濃度
は樹脂に結合したタンパク質の平衡に影響を及ぼす。タ
ンパク質濃度が増大する場合には、吸着等温式は通常飽
和曲線を示す（Ｙａｍａｍｏｔｏら、”Ｉｏｎ Ｅｘｃ
ｈａｎｇｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ Ｐ
ｒｏｔｅｉｎｓ”，１９８８，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａ
ｐｈｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｅｒｉｅｓ）。したがっ
て、結合の飽和レベルに近づくときに、結合した不純物
の総量は最大値に達する。最大値に達した後には、試料
のタンパク質濃度が増大するにつれて、カラムを通過す
る不純物の相対的パーセンテージは増大する。したがっ
て、タンパク質濃度は、不純物の吸着曲線の直線領域に
入るほど十分に低い場合に最適である。
は樹脂に結合したタンパク質の平衡に影響を及ぼす。タ
ンパク質濃度が増大する場合には、吸着等温式は通常飽
和曲線を示す（Ｙａｍａｍｏｔｏら、”Ｉｏｎ Ｅｘｃ
ｈａｎｇｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ Ｐ
ｒｏｔｅｉｎｓ”，１９８８，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａ
ｐｈｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｅｒｉｅｓ）。したがっ
て、結合の飽和レベルに近づくときに、結合した不純物
の総量は最大値に達する。最大値に達した後には、試料
のタンパク質濃度が増大するにつれて、カラムを通過す
る不純物の相対的パーセンテージは増大する。したがっ
て、タンパク質濃度は、不純物の吸着曲線の直線領域に
入るほど十分に低い場合に最適である。
【００２７】タンパク質は溶液のｐＨを緩衝化する傾向
があるので、タンパク質濃度はまた溶離液のｐＨに影響
を及ぼす。クロマトグラフィー媒体に結合することによ
りタンパク質は溶液から選択的に除去されるので、溶液
の緩衝能自体（すなわち、ｐＨ）が変わる。ｐＨ変動は
カラムに吸着されているタンパク質の相対パーセンテー
ジに依存するので、クロマトグラフィーに対する影響は
複雑である。吸着は、カラムの流形、溶液の緩衝能、タ
ンパク質混合物の変性した性質及び種々のタンパク質の
競争的結合により、影響を受ける。
があるので、タンパク質濃度はまた溶離液のｐＨに影響
を及ぼす。クロマトグラフィー媒体に結合することによ
りタンパク質は溶液から選択的に除去されるので、溶液
の緩衝能自体（すなわち、ｐＨ）が変わる。ｐＨ変動は
カラムに吸着されているタンパク質の相対パーセンテー
ジに依存するので、クロマトグラフィーに対する影響は
複雑である。吸着は、カラムの流形、溶液の緩衝能、タ
ンパク質混合物の変性した性質及び種々のタンパク質の
競争的結合により、影響を受ける。
【００２８】より高タンパク質濃度を添加すると、陽イ
オン交換カラムは、陽イオン交換カラムの充填が進行す
るにつれて溶離液中のｐＨの連続的な上昇をもたらすこ
とが、我々の実験で示されている。増大したｐＨはα−
１ ＰＩの純度を低下させる。一般にはより希釈された
タンパク質の溶液がα−１ ＰＩ精製クロマトグラフィ
ーのためのより良い出発物質であるが、大規模に精製す
るために陽イオン交換カラムの充填を増大させるために
は、不純物曲線及びｐＨ効果の許容し得る範囲内でより
高い濃度を用いることができる。
オン交換カラムは、陽イオン交換カラムの充填が進行す
るにつれて溶離液中のｐＨの連続的な上昇をもたらすこ
とが、我々の実験で示されている。増大したｐＨはα−
１ ＰＩの純度を低下させる。一般にはより希釈された
タンパク質の溶液がα−１ ＰＩ精製クロマトグラフィ
ーのためのより良い出発物質であるが、大規模に精製す
るために陽イオン交換カラムの充填を増大させるために
は、不純物曲線及びｐＨ効果の許容し得る範囲内でより
高い濃度を用いることができる。
【００２９】
実施例１ 好適な実施の形態 我々の好適な実施態様では、強陽イオン交換カラムにか
けるのに先立って、コーンの画分ＩＶ−１（Ｆｒ．ＩＶ
−１）懸濁液からα−１ ＰＩを部分的に精製するため
に、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いる。比活性
によるとコーンの画分ＩＶ−１懸濁液は約１０％のα−
１ ＰＩである。他の血漿画分と同様に、ＩＶ−１懸濁
液は、種々のタンパク質、例えばリポタンパク質、免疫
グロブリン、グロブリン、メタプロテイン等を含む。リ
ポタンパク質は特別の問題を生じさせる。それらがクロ
マトグラフィー樹脂に結合する場合には、それらを除去
するのが困難であり、そして樹脂の孔を塞ぎ、樹脂ベッ
ドを加圧することができる。また、タンパク質残渣が樹
脂上に蓄積するので結合能が低減する。Ｆｒ．ＩＶ−１
懸濁液からリポタンパク質及び他の不純物を除去するた
めに、強イオンクロマトグラフィーの代わりに、第１の
工程としてＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーを用
いる。ＤＥＡＥ充填条件はリポタンパク質の主要部分が
カラムに結合することなく、通過するような条件であ
る。ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーのα−１
ＰＩ溶離条件はα−１ ＰＩについて９５〜１００％の
回収率を得るように選択される。
けるのに先立って、コーンの画分ＩＶ−１（Ｆｒ．ＩＶ
−１）懸濁液からα−１ ＰＩを部分的に精製するため
に、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いる。比活性
によるとコーンの画分ＩＶ−１懸濁液は約１０％のα−
１ ＰＩである。他の血漿画分と同様に、ＩＶ−１懸濁
液は、種々のタンパク質、例えばリポタンパク質、免疫
グロブリン、グロブリン、メタプロテイン等を含む。リ
ポタンパク質は特別の問題を生じさせる。それらがクロ
マトグラフィー樹脂に結合する場合には、それらを除去
するのが困難であり、そして樹脂の孔を塞ぎ、樹脂ベッ
ドを加圧することができる。また、タンパク質残渣が樹
脂上に蓄積するので結合能が低減する。Ｆｒ．ＩＶ−１
懸濁液からリポタンパク質及び他の不純物を除去するた
めに、強イオンクロマトグラフィーの代わりに、第１の
工程としてＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーを用
いる。ＤＥＡＥ充填条件はリポタンパク質の主要部分が
カラムに結合することなく、通過するような条件であ
る。ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーのα−１
ＰＩ溶離条件はα−１ ＰＩについて９５〜１００％の
回収率を得るように選択される。
【００３０】ＩＶ−１懸濁液を≧５ ｍｍｈｏ／ｃｍの
伝導率でかつｐＨ８．０に調整した。次にタンパク質溶
液をＤＥＡＥ樹脂上にかける。α−１ ＰＩを、２０ｍ
Ｍ第二リン酸ナトリウム及び９５ｍＭ 塩化ナトリウ
ム、ｐＨ８．０で溶離した。ＤＥＡＥ溶離液を、２０
ｍＭ第一リン酸ナトリウム及び５ｍＭ 塩化ナトリウ
ム、ｐＨ６．５で透析瀘過する。透析瀘過した溶離液を
ｐＨ５．４５に調整し、次に強陽イオン樹脂上にかけ
る。α−１ ＰＩはカラムを流れる。通過液をｐＨ７．
０に調整し、そして０．１５Ｍ 塩化ナトリウムを添加
する。
伝導率でかつｐＨ８．０に調整した。次にタンパク質溶
液をＤＥＡＥ樹脂上にかける。α−１ ＰＩを、２０ｍ
Ｍ第二リン酸ナトリウム及び９５ｍＭ 塩化ナトリウ
ム、ｐＨ８．０で溶離した。ＤＥＡＥ溶離液を、２０
ｍＭ第一リン酸ナトリウム及び５ｍＭ 塩化ナトリウ
ム、ｐＨ６．５で透析瀘過する。透析瀘過した溶離液を
ｐＨ５．４５に調整し、次に強陽イオン樹脂上にかけ
る。α−１ ＰＩはカラムを流れる。通過液をｐＨ７．
０に調整し、そして０．１５Ｍ 塩化ナトリウムを添加
する。
【００３１】この時点で所望であれば、α−１ ＰＩを
凍結することができる。ウイルス不活化のために、必要
であればα−１ ＰＩ溶液を解凍し、６０ｍＭ ヒスチ
ジン及び５ｍＭ 塩化カルシウムでｐＨ６．５に調整
し、次に凍結乾燥する。次に凍結乾燥物を８０℃で７２
時間加熱して、ウイルスを不活化する。次に凍結乾燥物
を精製水に溶解し、そして３７％（ｗ／ｖ）スクロース
及び０．３８Ｍ シトレートを安定剤として添加する。
エンベロープをもつウイルスに対する溶剤洗浄剤処理と
して、リン酸０．３％トリ−ｎ−ブチル（ＴＮＢＰ）及
び０．２％コール酸ナトリウムを添加する。３０℃で３
時間インキュベーションした後、ＴＮＢＰ及びコール酸
塩を透析瀘過で除去する。
凍結することができる。ウイルス不活化のために、必要
であればα−１ ＰＩ溶液を解凍し、６０ｍＭ ヒスチ
ジン及び５ｍＭ 塩化カルシウムでｐＨ６．５に調整
し、次に凍結乾燥する。次に凍結乾燥物を８０℃で７２
時間加熱して、ウイルスを不活化する。次に凍結乾燥物
を精製水に溶解し、そして３７％（ｗ／ｖ）スクロース
及び０．３８Ｍ シトレートを安定剤として添加する。
エンベロープをもつウイルスに対する溶剤洗浄剤処理と
して、リン酸０．３％トリ−ｎ−ブチル（ＴＮＢＰ）及
び０．２％コール酸ナトリウムを添加する。３０℃で３
時間インキュベーションした後、ＴＮＢＰ及びコール酸
塩を透析瀘過で除去する。
【００３２】ウイルス不活化した溶液を２０ｍＭ 第一
リン酸ナトリウム及び５ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ
６．５で透析瀘過する。透析瀘過した溶液のｐＨを５．
４５に調整し、そして第２の強陽イオン樹脂カラム上に
かけて、残存するいずれの汚染物も除去しそしてウイル
ス不活化工程で変性したα−１ ＰＩも除去する。α−
１ ＰＩの天然型はカラムを流れる。回収した通過液の
ｐＨを７．０に調整し、０．１５Ｍ 塩化ナトリウムを
添加し、さらなるウイルス不活化工程として１５μＭフ
ィルターを通過させる。他のタンパク質を実質的に含ま
ない、高度に精製されたα−１ ＰＩ（〉９５％）を製
造する。ＤＥＡＥクロマトグラフィーにより、リポタン
パク質が除去され、そしてα−１ ＰＩ純度が２０％に
増大する。第１の陽イオンカラム処理は約９０％の回収
率で約６０〜７０％の純度のα−１ＰＩを生じさせた。
第２の陽イオンカラム処理は最終生成物としての９５％
の純度を達成する。陰イオンカラムを１Ｍ ＮａＣｌ及
び１Ｍ ＮａＯＨで洗浄して、結合タンパク質を除去す
る。２つの陽イオンカラムに結合したタンパク質を、１
Ｍ 塩化ナトリウム及び引き続いて１Ｍ 水酸化ナトリ
ウムで除去する。
リン酸ナトリウム及び５ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ
６．５で透析瀘過する。透析瀘過した溶液のｐＨを５．
４５に調整し、そして第２の強陽イオン樹脂カラム上に
かけて、残存するいずれの汚染物も除去しそしてウイル
ス不活化工程で変性したα−１ ＰＩも除去する。α−
１ ＰＩの天然型はカラムを流れる。回収した通過液の
ｐＨを７．０に調整し、０．１５Ｍ 塩化ナトリウムを
添加し、さらなるウイルス不活化工程として１５μＭフ
ィルターを通過させる。他のタンパク質を実質的に含ま
ない、高度に精製されたα−１ ＰＩ（〉９５％）を製
造する。ＤＥＡＥクロマトグラフィーにより、リポタン
パク質が除去され、そしてα−１ ＰＩ純度が２０％に
増大する。第１の陽イオンカラム処理は約９０％の回収
率で約６０〜７０％の純度のα−１ＰＩを生じさせた。
第２の陽イオンカラム処理は最終生成物としての９５％
の純度を達成する。陰イオンカラムを１Ｍ ＮａＣｌ及
び１Ｍ ＮａＯＨで洗浄して、結合タンパク質を除去す
る。２つの陽イオンカラムに結合したタンパク質を、１
Ｍ 塩化ナトリウム及び引き続いて１Ｍ 水酸化ナトリ
ウムで除去する。
【００３３】実施例２ 本実施例では、コーンの画分流出液 II + IIIを出発物
質とした。それを、５℃で２０ｍＭ 第１リン酸ナトリ
ウム及び５ｍＭ 第１塩化ナトリウム、ｐＨ６．５で透
析瀘過し、アルコールを除去してイオン強度を低下させ
た。次に溶液のｐＨを５．４５に調整し、そして既に平
衡化した強陽イオン交換カラムにかけた。α−１ ＰＩ
に有意に富む画分として通過液を回収した。出発物質中
の汚染タンパク質は陽イオン交換カラム上に保持され
た。
質とした。それを、５℃で２０ｍＭ 第１リン酸ナトリ
ウム及び５ｍＭ 第１塩化ナトリウム、ｐＨ６．５で透
析瀘過し、アルコールを除去してイオン強度を低下させ
た。次に溶液のｐＨを５．４５に調整し、そして既に平
衡化した強陽イオン交換カラムにかけた。α−１ ＰＩ
に有意に富む画分として通過液を回収した。出発物質中
の汚染タンパク質は陽イオン交換カラム上に保持され
た。
【００３４】陽イオン交換カラムを１回通過させた後、
α−１ ＰＩを、コーンの画分流出液 II + III中の他
のタンパク質から実質的に精製した。ＳＤＳ−ＰＧＡＥ
によると、通過液の純度は８２％α−１ ＰＩであっ
た。比活性は、全タンパク質１ｍｇ当たり０．０３ｍｇ
のエラスターゼ阻害活性から全タンパク質１ｍｇ当たり
０．５９ｍｇのエラスターゼ阻害活性へと、２０倍増大
した。
α−１ ＰＩを、コーンの画分流出液 II + III中の他
のタンパク質から実質的に精製した。ＳＤＳ−ＰＧＡＥ
によると、通過液の純度は８２％α−１ ＰＩであっ
た。比活性は、全タンパク質１ｍｇ当たり０．０３ｍｇ
のエラスターゼ阻害活性から全タンパク質１ｍｇ当たり
０．５９ｍｇのエラスターゼ阻害活性へと、２０倍増大
した。
【００３５】実施例３ 本実施例では、出発物質として市販の部分的に精製した
α−１ ＰＩ（プロラスチン（Ｐｒｏｌａｓｔｉｎ）
（商標）、Ｍｉｌｅｓ，Ｉｎｃ．社）を用いた。プロラ
スチン（商標）は０．１Ｍ ＮａＣｌ及び０．０２Ｍ
リン酸ナトリウムでｐＨ７．０に緩衝化されている。α
−１ ＰＩの濃度は約３０ｍｇ／ｍＬであり、そしてタ
ンパク質濃度は約６０ｍｇ／ｍＬである。アルブミンは
典型的には全タンパク質の１２％であり、そしてＩｇＡ
は典型的には約１ｍｇ／ｍＬ（全タンパク質の２．５
％）で存在する。プロラスチン（商標）を５ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ及び２０ｍＭ 第１リン酸ナトリウムで透析瀘過し
て、イオン強度を低下させた。溶液のｐＨを５．４５に
下げ、タンパク質濃度を５．３ｍｇ／ｍＬに低減し、そ
して溶液を強陽イオン交換カラムにかけた。通過液を精
製したα−１ ＰＩとして回収し、そしてこれは、ＳＤ
Ｓ−ＰＧＡＥによるとα−１ ＰＩの単量体及び二量体
のみ（それぞれ９５．４％及び４．６％のタンパク質）
を示した。次に溶液を０．１５Ｍ ＮａＣｌでｐＨ７．
０に安定化し、そして瀘過し又は濃縮した後、凍結乾燥
して安定な最終生成物を得た。
α−１ ＰＩ（プロラスチン（Ｐｒｏｌａｓｔｉｎ）
（商標）、Ｍｉｌｅｓ，Ｉｎｃ．社）を用いた。プロラ
スチン（商標）は０．１Ｍ ＮａＣｌ及び０．０２Ｍ
リン酸ナトリウムでｐＨ７．０に緩衝化されている。α
−１ ＰＩの濃度は約３０ｍｇ／ｍＬであり、そしてタ
ンパク質濃度は約６０ｍｇ／ｍＬである。アルブミンは
典型的には全タンパク質の１２％であり、そしてＩｇＡ
は典型的には約１ｍｇ／ｍＬ（全タンパク質の２．５
％）で存在する。プロラスチン（商標）を５ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ及び２０ｍＭ 第１リン酸ナトリウムで透析瀘過し
て、イオン強度を低下させた。溶液のｐＨを５．４５に
下げ、タンパク質濃度を５．３ｍｇ／ｍＬに低減し、そ
して溶液を強陽イオン交換カラムにかけた。通過液を精
製したα−１ ＰＩとして回収し、そしてこれは、ＳＤ
Ｓ−ＰＧＡＥによるとα−１ ＰＩの単量体及び二量体
のみ（それぞれ９５．４％及び４．６％のタンパク質）
を示した。次に溶液を０．１５Ｍ ＮａＣｌでｐＨ７．
０に安定化し、そして瀘過し又は濃縮した後、凍結乾燥
して安定な最終生成物を得た。
【００３６】結合タンパク質画分を溶離し、そしてＳＤ
Ｓ−ＰＧＡＥで電気泳動にかけた。クーマシーブルーで
可視化された４４％のタンパク質はα−１ ＰＩ分子量
領域内であった。この画分をエラスターゼ阻害活性アッ
セイしたところ、α−１ ＰＩ活性は示されなかった。
このことは、このバンドのタンパク質が不活化α−１Ｐ
Ｉであることを示唆する。
Ｓ−ＰＧＡＥで電気泳動にかけた。クーマシーブルーで
可視化された４４％のタンパク質はα−１ ＰＩ分子量
領域内であった。この画分をエラスターゼ阻害活性アッ
セイしたところ、α−１ ＰＩ活性は示されなかった。
このことは、このバンドのタンパク質が不活化α−１Ｐ
Ｉであることを示唆する。
【００３７】上記実施例を次の表に要約する。
【００３８】
【表１】
【００３９】上記の説明により、タンパク質精製の当業
者は変法に想到するであろうと考えられる。したがっ
て、上記の実施例は具体例としてのみ解釈されるべきで
あり、本発明の範囲は上記の特許請求の範囲によっての
み制限されるものと意図される。
者は変法に想到するであろうと考えられる。したがっ
て、上記の実施例は具体例としてのみ解釈されるべきで
あり、本発明の範囲は上記の特許請求の範囲によっての
み制限されるものと意図される。
【００４０】本発明の主な特徴及び態様は以下の通りで
ある。
ある。
【００４１】１． α−１プロテイナーゼ阻害剤及び他
のタンパク質類を含む水性溶液中の、該α−１プロテイ
ナーゼ阻害剤を精製する方法であって、(A) 該活性α
−１プロテイナーゼ阻害剤はイオン交換樹脂に結合しな
いが該溶液中の他のタンパク質類は結合するように、該
水性溶液中のｐＨ、イオン強度及びタンパク質濃度を調
整する工程；及び(B) 該溶液を、該イオン交換樹脂を
通過させ、そして通過液中のα−１プロテイナーゼ阻害
剤を回収する工程、を含んでなる該方法。
のタンパク質類を含む水性溶液中の、該α−１プロテイ
ナーゼ阻害剤を精製する方法であって、(A) 該活性α
−１プロテイナーゼ阻害剤はイオン交換樹脂に結合しな
いが該溶液中の他のタンパク質類は結合するように、該
水性溶液中のｐＨ、イオン強度及びタンパク質濃度を調
整する工程；及び(B) 該溶液を、該イオン交換樹脂を
通過させ、そして通過液中のα−１プロテイナーゼ阻害
剤を回収する工程、を含んでなる該方法。
【００４２】２．工程(A)の水性溶液のｐＨが約６．０
未満であるか或いは等しい上記１記載の方法。
未満であるか或いは等しい上記１記載の方法。
【００４３】３．水性溶液のイオン強度が約１０ｍｍｈ
ｏ／ｃｍ未満であるか或いは等しい上記１記載の方法。
ｏ／ｃｍ未満であるか或いは等しい上記１記載の方法。
【００４４】４．水性溶液のタンパク質濃度が約１０ｍ
ｇ／ｍＬ未満であるか或いは等しい上記１記載の方法。
ｇ／ｍＬ未満であるか或いは等しい上記１記載の方法。
【００４５】５．工程が一回より多く実施される上記１
記載の方法。
記載の方法。
【００４６】６．精製工程間に溶液に対してウイルス不
活化工程が実施される上記５記載の方法。
活化工程が実施される上記５記載の方法。
【００４７】７．該ウイルス不活化が約６０℃より高い
か或いはそれと等しい温度で、約１０時間より多いか或
いは等しい時間で、α−１プロテイナーゼ阻害剤を加熱
することを含んでなる上記６記載の方法。
か或いはそれと等しい温度で、約１０時間より多いか或
いは等しい時間で、α−１プロテイナーゼ阻害剤を加熱
することを含んでなる上記６記載の方法。
【００４８】８．該ウイルス不活化が化学剤を添加する
ことを含んでなる上記６記載の方法。
ことを含んでなる上記６記載の方法。
【００４９】９．該ウイルス不活化が溶液にリン酸トリ
−ｎ−ブチル及び洗浄剤を添加することを含んでなる上
記８記載の方法。
−ｎ−ブチル及び洗浄剤を添加することを含んでなる上
記８記載の方法。
【００５０】１０． 活性ウイルス類を実質的に含有せ
ず、不活性α−１プロテイナーゼ阻害剤を実質的に含有
せず、そして全タンパク質１ｍｇ当たり少なくとも約
０．９ｍｇのエラスターゼ阻害活性を有する活性α−１
プロテイナーゼ阻害剤を含んでなる、高度に精製したα
−１プロテイナーゼ阻害剤調製物。
ず、不活性α−１プロテイナーゼ阻害剤を実質的に含有
せず、そして全タンパク質１ｍｇ当たり少なくとも約
０．９ｍｇのエラスターゼ阻害活性を有する活性α−１
プロテイナーゼ阻害剤を含んでなる、高度に精製したα
−１プロテイナーゼ阻害剤調製物。
【００５１】１１．α−１プロテイナーゼ阻害剤の純度
が９０％より高い上記１０記載の調製物。
が９０％より高い上記１０記載の調製物。
【００５２】１２．製薬学的に許容できるキャリアー中
の上記１０記載の産物。
の上記１０記載の産物。
【図１】本発明に従いα−１ ＰＩを精製するための、
一般的なＣｏｈｎ（コーン）の分別法、画分から誘導さ
れたタンパク質、並びに２つの出発物質［コーンの画分
ＩＶ−１並びにコーンの流出液 II & III］を説明する
フローチャートである。
一般的なＣｏｈｎ（コーン）の分別法、画分から誘導さ
れたタンパク質、並びに２つの出発物質［コーンの画分
ＩＶ−１並びにコーンの流出液 II & III］を説明する
フローチャートである。
【図２】我々のα−１ ＰＩ精製方法の好適な工程を示
すフローチャートである。
すフローチャートである。
【図３】従来技術と比べた場合の本発明の方法による純
度及び比活性の改良を説明する棒グラフである。
度及び比活性の改良を説明する棒グラフである。
Claims (2)
- 【請求項１】 α−１プロテイナーゼ阻害剤及び他のタ
ンパク質類を含む水性溶液中の、該α−１プロテイナー
ゼ阻害剤を精製する方法であって、 (A) 該活性α−１プロテイナーゼ阻害剤はイオン交換
樹脂に結合しないが該溶液中の他のタンパク質類は結合
するように、該水性溶液中のｐＨ、イオン強度及びタン
パク質濃度を調整する工程；及び (B) 該溶液を、該イオン交換樹脂を通過させ、そして
通過液中のα−１プロテイナーゼ阻害剤を回収する工
程、を含んでなる該方法。 - 【請求項２】 活性ウイルス類を実質的に含有せず、不
活性α−１プロテイナーゼ阻害剤を実質的に含有せず、
そして全タンパク質１ｍｇ当たり少なくとも約０．９ｍ
ｇのエラスターゼ阻害活性を有する活性α−１プロテイ
ナーゼ阻害剤を含んでなる、高度に精製したα−１プロ
テイナーゼ阻害剤調製物。
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