JP5064558B2 - 免疫グロブリン精製 - Google Patents
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Description
タンパク質及び特に免疫グロブリンは今日の医学ポートフォリオにおいて重要な役割を果たしている。ヒトでの適用のために、全ての治療用タンパク質は別個の基準を満たさなければならない。ヒトへの生物製剤の安全性を確実にするために、重篤な危害を引き起こす核酸、ウイルス、及び宿主細胞タンパク質を特に除去しなければならない。これらの規制上の規格を満たすために、1つ又はそれ以上の精製工程が製造プロセスの後に続かなければならない。とりわけ、純度、処理量、及び収率が、適切な精製プロセスを決定する際に重要な役割を果たす。
本発明は、免疫グロブリン精製の分野における複数の局面を含む。一局面は、以下の工程:単量体型の免疫グロブリンが陽イオン交換物質に結合しない条件下で単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを含む水性緩衝化溶液を陽イオン交換物質に適用すること、及び陽イオン交換物質との接触後に溶液から単量体型の免疫グロブリンを回収することを含む免疫グロブリンを精製するための方法である。一実施態様において、前記工程はフロースルー様式で操作されるクロマトグラフィー工程である。
本発明は、以下の工程:単量体型の免疫グロブリンが陽イオン交換物質に結合しない条件下で単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを含む水性緩衝化溶液を陽イオン交換物質に適用すること、及び陽イオン交換物質との接触後、即ちその除去後に溶液又は上清から単量体型の免疫グロブリンを回収することを含む免疫グロブリンを精製するための方法を含む。
a)単量体型の免疫グロブリンが陽イオン交換物質に結合しない条件下で単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを含む水性緩衝化溶液を陽イオン交換物質に適用すること、及び陽イオン交換物質との接触後に溶液から単量体型の免疫グロブリンを回収すること
を含む。
b)免疫グロブリンが陰イオン交換物質に結合しない条件下で単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを含む水性緩衝化溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに適用すること、及び水性緩衝化溶液として陰イオン交換カラムのフロースルーから単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを回収すること、及び
a)単量体型の免疫グロブリンが陽イオン交換物質に結合しない条件下で単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを含む工程b)において得られた水性緩衝化溶液を陽イオン交換物質に適用すること、及び陽イオン交換物質との接触後に溶液から単量体型の免疫グロブリンを回収すること
を含む。
a)単量体型の免疫グロブリンが陽イオン交換物質に結合しない条件下で単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを含む水性緩衝化溶液を陽イオン交換物質に適用すること、及び陽イオン交換物質との接触後に溶液から単量体型の免疫グロブリンを回収すること、及び
c)免疫グロブリンが陰イオン交換物質に結合しない条件下で単量体型の免疫グロブリンを含む工程a)の水性緩衝化溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに適用すること、及び陰イオン交換クロマトグラフィーカラムのフロースルーから単量体型の免疫グロブリンを回収すること
を含む。
d)免疫グロブリンがアフィニティーカラムに結合する条件下で単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを含む水性緩衝化溶液をアフィニティーカラムに適用すること、及び水性緩衝化溶液としてアフィニティーカラムから単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを回収すること、及び
b)場合により、免疫グロブリンが陰イオン交換物質に結合しない条件下で単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを含む工程d)において得られた水性緩衝化溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに適用すること、及び水性緩衝化溶液として陰イオン交換カラムのフロースルーから単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを回収すること、及び
a)単量体型の免疫グロブリンが陽イオン交換物質に結合しない条件下で単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを含む工程d)において得られたか又は工程b)において得られた水性緩衝化溶液を陽イオン交換物質に適用すること、及び陽イオン交換物質との接触後に溶液から単量体型の免疫グロブリンを回収すること
をこの順序で含む方法である。
a)単量体型の免疫グロブリンが陽イオン交換物質に結合しない条件下で単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを含む水性緩衝化溶液を膜陽イオン交換物質に適用すること、膜陽イオン交換物質のフロースルーから単量体型の免疫グロブリンを回収することを含む、フロースルー様式で操作されるクロマトグラフィー工程
を含む。
b)免疫グロブリンが陰イオン交換物質に結合しない条件下で単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを含む水性緩衝化溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに適用すること、及び水性緩衝化溶液として陰イオン交換カラムのフロースルーから単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを回収することを含む、フロースルー様式で操作されるクロマトグラフィー工程
を含む。
c)免疫グロブリンが陰イオン交換物質に結合しない条件下で単量体型の免疫グロブリンを含む工程a)において得られた水性緩衝化溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに適用すること、及び陰イオン交換クロマトグラフィーカラムのフロースルーから単量体型の免疫グロブリンを回収することを含む、フロースルー様式で操作されるクロマトグラフィー工程
を含む。
d)免疫グロブリンがアフィニティーカラムに結合する条件下で単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを含む水性緩衝化溶液をアフィニティーカラムに適用すること、及び水性緩衝化溶液としてアフィニティーカラムから単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを回収することを含む、結合及び溶出の様式で操作されるクロマトグラフィー工程
を含む。
材料及び方法:
調整プロテインA溶出物:
抗(IL−13Rα1)抗体(以下、mAb IL13という、例えば、国際公開第2006/072564号参照)及び抗Her2抗体(以下、mAb Her2という、例えば、米国特許第5,677,171号参照)を、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーを用いる第1工程において精製した。
分子ふるいクロマトグラフィー:
樹脂:TSK 3000(Tosohaas)
カラム:300×7.8mm
流速:0.5ml/分
緩衝液:pH7.0に調節した250mM塩化カリウムを含む200mMリン酸カリウム
波長:280nm
DNA閾値システム:例えば、Merrick, H., and Hawlitschek, G., Biotech Forum Europe 9 (1992) 398-403を参照のこと。
mAb IL13の単量体型への精製 − 条件の比較
mAb IL13の単量体型への精製において、様々な条件を評価した。
mAb IL13の単量体型への精製 − 膜の比較
実施例1において得られた結果は一般的に適用可能であり、そしてそれを膜陽イオン交換物質Sartobind(商標)S(75cm2膜面積、Sartorius AG, Gottingen, Germany)に適用した。Mustang(商標)Sのための好ましい条件、即ち、伝導率5.8mS/cm、pH6.5を、Sartobind(商標)物質にも適用した。mAb IL13を含むサンプル物質は1.34mg/mlのタンパク質濃度を有し、免疫グロブリンの94.8%が単量体型であり、そして免疫グロブリンの5.2%が凝集型であった。実施例1において報告するように、サンプル物質を膜に適用した。精製プロセスの結果を表3にまとめる。
mAb Her2の単量体型への精製 − 膜の比較
調整プロテインA溶出物は、7.61g/lのmAb Her2濃度を有し、純度は98.8%であった。凝集型の免疫グロブリンを、mAb Her2溶液を37℃に3日間加熱することにより産生/取得した。溶液は、加熱処置後、加熱処置したサンプル中に存在する低分子量物質を考慮しないで、単量体型の免疫グロブリンを99.0%及び凝集型の免疫グロブリンを1.0%含んでいた。調整プロテインA溶出物を、実験前にウイルス不活化し、そして0.2μmポアサイズフィルターを通してろ過した。1.03mg/mlのタンパク質濃度への希釈、pH及び伝導率の調節後、溶液を膜陽イオン交換物質Sartobind(商標)S及びCにそれぞれ適用した。伝導率の調節を、NaCl(5mol/l)の添加により行った。結果を表5及び6に示す。
プロテインA、DNA及びHCP含量の分析
実施例2において得られた画分を、プロテインA、DNA、及びHCP含量について分析した。結果を表7及び8に与える。
Claims (7)
- 単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを含む溶液から単量体型の免疫グロブリンを得るための方法であって、該方法が以下の工程:
a)単量体型の免疫グロブリンの少なくとも90%が陽イオン交換物質に結合しない条件下で単量体型及び凝集型の免疫グロブリンを含む水性緩衝化溶液を陽イオン交換物質に適用すること、及び陽イオン交換物質との接触後に溶液から単量体型の免疫グロブリンを回収することを含み、
ここで、工程a)はフロースルー様式で操作されるクロマトグラフィー工程であり、陽イオン交換物質はMustangS(登録商標)であり、そして
溶液はpH5.5〜pH6.5のpH値を有し、そして工程a)の水性緩衝化溶液は4.8〜5.8mS/cmの伝導率を有すること;または
溶液はpH5.5のpH値を有し、そして工程a)の水性緩衝化溶液は5.8〜6.8mS/cmの伝導率を有すること
を特徴とする方法。 - 工程a)において陽イオン交換物質が膜陽イオン交換物質であることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- フロースルーからの単量体型の免疫グロブリンの回収が、沈殿、塩析、限外ろ過、ダイアフィルトレーション、凍結乾燥、アフィニティークロマトグラフィー、又は濃縮溶液を得るための溶媒容積低下より選択される方法によることを特徴とする、請求項1〜2のいずれか一項記載の方法。
- 回収が、限外ろ過、凍結乾燥、又は溶媒容積低下によることを特徴とする、請求項3記載の方法。
- 水性緩衝化溶液がリン酸もしくはその塩、クエン酸もしくはその塩、又はヒスチジンもしくはその塩を含む溶液であることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- 水性緩衝化溶液が塩化ナトリウム又は塩化カリウムを含むことを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
- クロマトグラフィー工程がカラムクロマトグラフィー又はカセットクロマトグラフィーであることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
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